Reproducción Asistida en Bovino usando Ovum Pick-Up (OPU ... · " Espontánea in vitro"...
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ReproducciReproduccióón Asistida en Bovino n Asistida en Bovino usando usando OvumOvum PickPick--Up (OPU) y Up (OPU) y
FecundaciFecundacióón n In VitroIn Vitro
Dpto. de Reproduccion Animal y ConservaciDpto. de Reproduccion Animal y Conservacióón n de Recursos Zoogende Recursos Zoogenééticosticos
INIA INIA -- MadridMadrid
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INDICEINDICE
•• IntroducciIntroduccióónn•• AplicaciAplicacióón del n del OvumOvum PickPick--UpUp•• Problemas asociadosProblemas asociados
–– Intervalo de sesiIntervalo de sesióónn–– PrePre--estimulaciestimulacióónn–– Equipo para el OPU Equipo para el OPU –– TTéécnica de recogida de ovocitoscnica de recogida de ovocitos
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ImpactoImpacto de de laslas TecnologTecnologííasas de de ReproducciReproduccióónn AsistidaAsistida
MejoraMejora ReproductivaReproductiva
I.A.I.A.
FIVFIV
TransgTransgéénesisnesis
ClonaciClonacióónn
MOETMOET
SexajeSexaje OPUOPU
5 transferable embryos/ flush= 50 freezable embryos/donor/year=30 calves born after ET
2 OPU/week=150 embryos/year=70 calvesCan be used different bull @ each batch of oocytesEmbryos can be produced during 2nd and 3rd month of pregnancy
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FIV/Ovum pick up• Obtención de ovocitos de ovarios de animales
vivos.
• Se puede acceder a animales de alta calidad.– Podemos colectar ovocitos repetidamente, incluso en
estado de preñez.
• Cuando la alta calidad genética del donante estáunida a un buen laboratorio de FIV – podemos producir alta cantidad de embriones de alta calidad.è Eficaz en mejora genética.
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vOPU no requiere que el animal tenga un ciclo reproductivo normal. Cuando se usa conjuntamente con técnicas de FIV, se acorta el intervalo generacional y aumenta la mejora genética maternal produciendo más progenie que por métodos convencionales.
vEl éxito del OPU se mide mediante la tasa de recuperación de ovocitos expresando el porcentaje sobre el total de folículos aspirados.
Ø La tasa de recuperación está influenciada por:
üAspiración al vacío
üPre-tratamiento hormonal de animales
üFrecuencia de punción
üEstado del ciclo: estro
üExperiencia del operador
Ovum Pick Up
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Etapas del Ovum Pick Up
Anestesia localTécnico con equipo de
OPU Colecta OPU
TE el día 7Aisla y clasifica ovocitos y embriones
FIV
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OPUObtención de ovocitos
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Diagrama de OPU
Grado 1-2 Grado 3-4
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Adaptado de Rizos, 2007
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Los complejos cúmulos-ovocito (COCs) se clasificaron en 4 categorías morfológicas:
Ø (1) Rodeados de numerosas capas de células del cúmulo compactas
Ø (2) Rodeados de 2 a 3 capas de células del cúmulo compactas
Ø (3) Ovocitos denudados
Ø (4) Capas celulares expandidas
RecuperaciRecuperacióón de ovocitos n de ovocitos y clasificaciy clasificacióónn
Adaptado de Rizos, 2007
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División %Blastocistos %
80
20
0
40
60
Ward et al. (1999)
Morfología de los ovocitos
Adaptado de Rizos, 2007
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maduración
Desarrollo embrionario
fecundación
DivisiónBlastocisto
Producción de Embriones In Vitro
¿?
Adaptado de Rizos, 2007
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Maduración (MIV)• Espontánea in vitro• Maduración nuclear
– Reanudación de la meiosis– Profase I - Metafase II (=ovulación)
• Maduración citoplásmica– Migración de gránulos corticales (bloquean la
poliespermia)– Redistribución de orgánulos
• 24 h en 5% CO2 en aire, 39° C
Adaptado de Rizos, 2007
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Grado 1 y 2
Grado 3 y 4
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Antes de la maduración Después de la maduraci ón
1er corpúsculo polar
MIV durante 24 h
39o C, 5% CO2
Adaptado de Rizos, 2007
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Fecundación (FIV)
• Descongelar el semen• Capacitación - heparina• Selección espermática
– Swim-up– Gradiente de densidad de Percoll
• 0.5-1 millón spz/ml• Co-cultivo durante 24 h en 5% CO2 en aire
Adaptado de Rizos, 2007
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con Swim-up
0.25 ml semen+
1 ml medio
Con Percoll
Antes de centrifugar Después de centrifugar
Separación espermática
Adaptado de Rizos, 2007
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Zigoto
FIV durante 24h
39o C, 5% CO2
Adaptado de Rizos, 2007
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Cultivo (CIV)Determina la calidad embrionaria:
• Atmósfera de humedad saturada • Medio definido vs co-cultivo vs cultivo in vivo• Suero • 5% CO2 + 5% O2 + 90% N2• Período más largo in vitro (~7 días)
Adaptado de Rizos, 2007
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Día 2 Día 3 Día 4 Día 5
Día 6 Día 7 Día 8 - 9
Adaptado de Rizos, 2007
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El origen de los ovocitos en OPU-IVF
• Ovocitos de folículos de tamaño >2mm– Intervalo de sesión de OPU
• Ovocitos más homogéneos que con MOET o FIV, debido a las sesiones repetidas se eliminan los folículos dominantes y atrésicos– Los ovocitos de FIV se recogen de folículos en cada
fase del desarrollo.– Los ovocitos de MOET han sufrido una fase dominante
y un desarrollo preovulatorio final.
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SOV
OPU
Matadero2
3
4
5
6
7
8
15
Tamaño del folículo (mm)
Fase folicular
Folículo preovulatorio
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Procesos que afectan a OPU-IVF
• Intervalo de sesión• Pre-estimulación con FSH• Equipo de OPU • Técnica de recogida de ovocitos
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Intervalo de sesionesEfecto del intervalo entre las sesiones de OPU en la calidad del ovocito y la posterior
tasa de producción in vitro de embriones (Merton et al. 2003).
10.5b0.97b4.02595
14.1a1.29a3.925922-5
13.5c0.09.1a4877
17.1b0.306.6b5024
19.7a0.667.2a51633-4
Embriones/ ovocitos (%)
Índice calidad ovocito
Ovocitos/ sesión (n)
Sesiones1
(n)Intervalo
(días)Esquema
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Pre-estimulación con FSHEfecto de la pre-estimulación con FSH en los resultados de OPU-IVP (Merton 2003)
1.0c16.3b58.55.9cNo2 veces/semanaLunes-Jueves
3.3b26.0a65.613.2b+1 vez/2 semanas
1.5a19.960.47.8aNo2 veces/semanaLunes-Jueves
Embriones por
sesión (n)
Embriones/Ovocitos
(%)
División(%)
Ovocitos/Sesión (n)
Trata.FSH1Periodo
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Colectas ultrasonogr áficas sobre vacas gestantes SOV(P<0.001)
Tratamiento % Colectados Ovocitos/vaca % División
+40 mg FSH 43 10.8+5.3 67 a
+20 mg FSH 28 1.7+0.7 40 b
Control 19 0.3+0.2 0 c
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Equipo de OPU
• La técnica de OPU es realizada por una o dos personas.– Técnico – manipula el ovario– Asistente – realiza la punción folicular
• Ambas personas afectan significativamente a la cantidad de COCs recogidos
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Técnica de recogida de ovocitos
• El número de ovocitos recogidos por animal dependen del técnico y la ruta utilizada.
– mediante aspiración: 32 ovocitos GI y II– mediante OPU: 8 ovocitos GI y II
• Estas diferencias son principalmente debidas a la baja resolución del ecógrafo para OPU comparado con el ojo humano.
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20.843.1721-2Ex vivo por aspiración
37.582.5402-10In vivo por OPU
Obtención de blastocistos %
Tasa de división %
Numero total de ovocitos
Tamaño del Folículo (mm)
Método de colecta de
ovocitos (n=6)
Efecto del tamaño folicular en la tasa de producción in vitro de embriones usando OPU seguida de la aspiración de los ovocitos restantes después de morir el donante
(Merton, 2003).
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Observaciones finales
1.53OPU después de pre-estimulación (FSH)a 2-semanas de intervalo
31 OPU (2/semana) a intervalos de 2 y 3 días
21OPU (2/semana) a intervalos de 3 y 4 días
1.15.5MOET, superovulación retirando el Fol Dominante
15MOET, superovulación normal
0.230.7Ciclo natural, IA y flushing el Día 7
Por semanaPor sesión
Número de embrionesTratamiento antes de la colecta de ovocitos
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Diámetro folicular y tasa de recuperación de ovocitos después de repetidas sesiones de OPU en vacas lecheras (Rizos et al. Datos no publicados)
1265.251.623.874.63010.00.00.00.716.383.1
873.6310.337.951.71960.00.00.511.225.562.8
1184.92022.977.12900.00.30.34.533.861.0
622.586.4543.5501841.10.54.313.034.846.2
TotalPor novillaZV*3-41-2n Total>1714-1611-138-105-72-4
Número de Ovocitos .
Grado Ovocitario(%)
Diámetro Folicular (mm), (%)
* zona pelúcida vacía
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La aspiración al vacío se expresa nor malmente en milímetros de mercurio y varia ent re 40 y 400 mm Hg.
La aspiración exacta en la punta de la aguja depende de:
v la construcción del dispositivo de OPU
v la longitud y el di ámetro del sistema de tubos
v el diámetro de la aguja
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Diseño Experimental
• Seleccionamos cuatro presiones al vacío diferentes
• Como control tomamos la aspiración manual con una aguja y una jeringa
• Los parámetros registrados para evaluar la capacidad de desarrollo de los ovocitos fueron: – Tasa de recuperación– Grado de ovocitos recuperados– Nº de blastocistos obtenidos
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El aumento de presión al vacío baja la tasa de recuperación
0
10
20
30
40
50
60
70
%
% Recovered 69.4 68.2 60.3 52.2 65.4
30 50 70 90 Manual
a ab
c
a
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5/22/2009
La producción de blastocistos decrece con el grado de los ovocitos
0
5
10
15
20
25
%
Bl. Yield 21.73 10.32 0.5 0.2
Class 1 Class 2 Class 3 Class 4
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5/22/2009
Ovocitos de Grado 1
0
10
20
30
40
50
60
70
% of total recovered.
Class 1 61 42.3 27.1 17.7 57.5
30 50 70 90 Manual
a
b
c
a
d
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Ovocitos de Grado 2
0
10
20
30
40
50
60
70
% of total recovered.
Class 2 25.4 35.5 31.3 29.1 26.3
30 50 70 90 Manual
ab ab a a
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Ovocitos de Grado 3
0
10
20
30
40
50
60
70
% of total recovered.
Class 3 5.9 12.6 32.7 45.9 9.3
30 50 70 90 Manual
ab
c
d
b
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Ovocitos de Grado 4
0
10
20
30
40
50
60
70
% of total recovered.
Class 4 7.7 9.6 8.9 7.3 6.9
30 50 70 90 Manual
a aa a a
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Nº Blastocistos/Ovario decrece con la presión excepto a 50mm Hg
0
0.5
1
1.5
2
Blastocysts /ovary
Day 8 bl/ovary 1.33 1.88 0.67 0.37 1.44
30 50 70 90 Manual
a
a
b
a
b
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Resumen
• Presión de 30-50mm Hg:n Aumenta la calidad del ovocito
n Aumenta la producción de blastocistos
• Presión de 70-90mm Hg:nDisminuye la tasa de recuperación
nDisminuye la producción de blastocistos
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Conclusiones• Intervalo de sesiones: 3 – 4 días
• Pre estimulación con FSH: incrementa el numero de embriones obtenidos por sesión.
• Pre estimulación en gestantes: + 40 mg de FSH
• Técnico y técnica: incrementa la colecta de ovocitos
• Tamaño folicular mas adecuado: de 2 a 10 mm de diámetro
• Presión de aspiración óptima: de 30 – 50 mm Hg