RESISTENCIA DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE PAPAYA AL VIRUS DE LA MANCHA ANULAR DE LA PAPAYA
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RESISTENCIA DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE PAPAYA AL VIRUS DE LA MANCHA ANULAR DE LA PAPAYAUNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLASESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
Andrea CevallosDarío Trujillo
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Virus de la mancha anular de la papaya: PRSV
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Introducción PRSV en todos los
países productores
Manejo: control vectores y malezas, y eliminación de plantas
Transgénicos de papaya en Hawai, Tailandia, Brasil.
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Pasos para obtención del transgénico Construcción del plásmido Cultivo de plantas in vitro Transformación de plantas Regeneración de plantas Verificación de introducción del plásmido Evaluación de líneas resistentes
Se pretende obtener un transgénico en base a resistencia por cubierta proteica
No se sabe si la resistencia es por proteínas o RNA
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Construcción del plásmido
Origen de replicación
Borde derecho
Gen reportero GUS
Gen de la cubierta proteica del virus
Gen de resistencia a kanamicina
Borde izquierdo
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Cultivo de plantas in vitro
Siembra en medio de inducción
Embriones somáticos
Semillas de papaya
Callos embriogénicos
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Transformación de plantas
Pasar embriones a medio con kanamicina
+Bombardeo a embriones somáticos
Recubrir a las partículas de tungteno con el vector pSA1006
Después de 14 días pasar a otro medio con kanamicina
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Regeneración de plantas
Callos sobrevivientes a kanamicina regenerados
Cortar y transferir a medio de enraizamiento
Sembrar plantas enraizadas en sustrato y aclimatar
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Verificación de introducción del plásmido
Análisis fluorimétrico de GUS
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Verificación de introducción del plásmido
Análisis PCR Análisis RT- PCR (en tiempo real)
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Verificación de introducción del plásmido
DNA
Transferencia Western
Transferencia Southern
Proteínas
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Resultados y discusión
8 líneas se regeneraron (G1, G2, T1, T2, T4, T5, T6 y T7)
En el análisis PCR todas las líneas muestran el gen de la cubierta proteica (CP), excepto la línea T1.
La línea G2 muestra una parte del gen CP truncada de 0,8 kb
Análisis PCR
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Resultados y discusión
Transferencia Southern
La línea G2 muestra una deleción del gen CP
Solo líneas G1 y T2 tienen una copia simple del gen CP, el resto de líneas tienen reordenamientos.
Transferencia Southern
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Resultados y discusión
Transferencia Western: se verifica expresión de proteínas gen CP
Solo líneas G1 y T2 resultaron positivo Estas líneas no son resistentes al PRSV Se descarta que resistencia en este
transgénico esta mediada por las proteínas
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Resultados y discusión
Resumen análisis Solo línea G2 muestra resistencia a la inoculación del virus
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Plantas de papaya transgénicas y no transgénicas
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Gracias por su atención
…PREGUNTAS??