Universidad de Chile

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Laboratorio de Microbiología

Rol del sistema de secreción tipo seis (T6SS) codificado en la

isla SPI-19 de Salmonella enterica serovares Enteritidis y

Gallinarum, en la interacción con macrófagos

Memoria para optar al título de Bioquímico

Juan Cristóbal Jiménez Romaguera

Directora de Memoria

Dra. Lucía Inés Contreras Osorio

Santiago, Chile

Julio 2010

ii

Esta tesis fue financiada por el Proyecto Anillo de Investigación en Ciencia

y Tecnología ADI 08/2006

iii

Agradecimientos

Agradezco especialmente a la Dra. Inés Contreras, la Dop, por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio. También por las enseñanzas, por todo el cariño y confianza durante estos dos años y medio. A la comisión revisora integrada por el Dr. Davor Cotorás y el Dr. Javier Puente por sus críticas constructivas que ayudaron a la elaboración de este escrito A la Profesora Mercedes Zaldívar, por el cariño y por los datos históricos que acompañaron nuestros almuerzos en el laboratorio. A Sergio, por su ayuda y apoyo en este trabajo, por su amistad y por todas las conversaciones futbolístico-musicales-misceláneas de estos años de trabajo. A Cliff, por la risa del día a día y por ayudarme siempre a ver mis resultados desde otro punto de vista A Javier Carter, por enseñarme gran parte de lo que sé sobre el trabajo en laboratorio, y por transmitirme su rigurosidad y perseverancia a la hora de trabajar. A Anilei Hoare, por su gran cariño, amistad y enseñanza. También por toda la ayuda y capacitación en el mundo de las células nucleadas. A Carlos Blondel, por ser la mente maestra detrás de este trabajo, y detrás de todo lo que empiece con T y termine en 6SS. También por su amistad y por enseñarme a reír incluso tras los experimentos mas desastrosos. A todos aquellos que me han acompañado en estos años de laboratorio: Denisse, Mara, Pía, Chechi y Carola, por los buenos momentos vividos durante congresos, cursos y el día a día, haciendo de estos años una gran experiencia. A la Cata y Camila, por su cariño y amistad, A David, Bernardo y Lorenzo por los buenos momentos y la simpatía entregada. A la Sra. Natividad Aguilar y a Luis Sarmiento por su excelente disposición y ayuda que hicieron más fácil el trabajo de laboratorio Al Núcleo Científico Se'P, Fernando, Yerko, Ernesto, Iván, César y Pato, por su amistad durante todos estos años de carrera y por hacer gratos estos años de estudio. A mis amigos Javier, Páme, Blanca, Rodrigo y Ricardo, por su gran cariño y amistad durante estos años universitarios, y por los muchos por venir. A Carlos Wilson, por su apoyo e incombustible amistad. A Cony por su paciencia, cariño y amor. Por hacer de cada día un momento especial. A mi familia, por su apoyo, cariño y comprensión. Y a todos los profesores que han cambiado mi forma de razonar durante estos años de Universidad.

iv

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL iv

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS vii

RESUMEN ix

SUMMARY xi

ABREVIATURAS xiii

1. INTRODUCCION 1

2. MATERIALES Y METODOS 10

2.1. Reactivos. 10

2.2. Cepas Bacterianas. 12

2.3. Plasmidios. 13

2.4. Partidores utilizados. 13

2.5. Medios y condiciones de cultivo. 14

2.5.1. Cultivo bacteriano. 14

2.5.2. Cultivo celular. 14

2.6 Ensayos de Western Blot. 15

2.6.1. Preparación de muestras de proteínas. 15

2.6.2. Electroforesis SDS-PAGE. 16

2.6.3. Transferencia y bloqueo. 16

2.6.4. Inmunodetección por quimioluminiscencia. 17

2.6. Ensayos de infección in vitro. 17

2.7.1. Ensayos de supervivencia intracelular de cepas de S.Gallinarum y

S. Enteritidis en macrófagos murinos RAW 264.7. 17

v

2.7.2. Ensayos de viabilidad celular. 18

2.7.3. Ensayos de Citotoxicidad. 19

2.7.4. Ensayos de invasión de células epiteliales HeLa. 20

2.7.5. Análisis Estadístico. 21

2.8. Construcción de la fusión traduccional GFP. 21

2.8.1. Obtención del producto de PCR para la mutagénesis. 21

2.8.2. Mutagénesis. 23

2.9. Electroforesis en geles de agarosa. 24

2.10. Microscopía de epifluorescencia. 24

3. RESULTADOS

3.1. S. Gallinarum y S. Enteritidis producen componentes del T6SS. 26

3.2. Los genes de SPI-19 no participan en la internalización de S. Gallinarum

y S. Enteritidis por macrófagos murinos. 27

3.3 Los genes de la isla SPI-19 participan en la sobrevida de S. Gallinarum

a tiempos tardíos de infección en macrófagos murinos. 28

3.4 Los genes codificados en SPI-19 no participan en la muerte celular.

de macrófagos murinos RAW 264.7. 32

3.5. El T6SS de S. Gallinarum se expresa al interior de macrófagos. 33

3.5.1. Construcción de la fusión traduccional vgrG::GFP. 33

3.5.2. La proteína VgrG se expresa a partir de tiempos tempranos en la

infección de macrófagos RAW 264.7. 35

3.6. Los genes codificados en SPI-19 no participan en la invasión de células HeLa. 39

vi

3. DISCUSION 41

4. CONCLUSIONES 48

5. BIBLIOGRAFIA 49

vii

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en la presente Tesis. 12

Tabla 2. Plasmidios utilizados en la presente Tesis. 13

Tabla 3. Partidores utilizados en la presente Tesis. 13

Figura 1. Esquema de la organización genética de la isla SPI-19 de Salmonella. 7

Figura 2. Análisis de la producción de componentes del T6SS de S. Gallinarum

y S.Enteritidis in vitro. 26

Figura 3 Internalización neta de cepas de S. Gallinarum y S. Enteritidis por

macrófagos RAW 264.7. 28

Figura 4. Cinética de sobrevida de cepas de S. Gallinarum y S. Enterititids al

interior de macrófagos RAW 264.7. 29

Figura 5. Sobrevida de cepas de S. Gallinarum al interior de macrófagos RAW 264.7. 30

Figura 6. Sobrevida de cepas de S. Enteritidis al interior de macrófagos RAW 264.7. 30

Figura 7. Sobrevida de la mutante ∆clpV de S. Gallinarum. 31

Figura 8. Viabilidad de células RAW 264.7 tras 20 horas de infección. 32

Figura 9. Análisis de la citotoxicidad de cepas de S. Enteritidis y S. Gallinarum. 33

Figura 10. Construcción de la fusión vgrG::GFP. 34

Figura 11. Emisión de Fluorescencia de la cepa S. Gallinarum vgrG::GFP. 36

Figura 12. Emisión de Fluorescencia de la fusión vgrG::GFP al infectar macrófagos

RAW 264.7 por 45 min. 37

Figura 13. Emisión de Fluorescencia de la fusión vgrG::GFP tras 2 horas de infección de

macrófagos RAW 264.7. 38

viii

Figura 14. Emisión de Fluorescencia de la fusión vgrG::GFP tras 20 horas de infección de

macrófagos RAW 264.7. 38

Figura 15. Porcentaje de invasión en células HeLa por cepas de S.Enteritidis

y S. Gallinarum. 39

Figura 16. Emisión de Fluorescencia de la fusión VgrG::GFP tras 8 horas post-invasión

de células HeLa. 40

ix

RESUMEN

Salmonella Enteritidis y Salmonella Gallinarum son dos patógenos importantes para el

hospedero aviar. El primero causa infecciones silentes en aves de postura, lo que le

permite infectar los huevos y tras el consumo de éstos, llegar al hospedero humano. El

segundo, causa en el ave un cuadro de gastroenteritis severa y posterior tifoidea aviar,

generando graves consecuencias económicas y productivas. Previamente, mediante

herramientas bioinformáticas, identificamos una nueva isla de patogenicidad no

caracterizada en cuatro serotipos distintos de Salmonella, entre ellos Gallinarum y

Enteritidis. Esta fue nombrada isla de patogenicidad 19 de Salmonella (SPI-19), y

codificaría para un sistema de secreción tipo VI (T6SS), un sistema de secreción de

proteínas el cual se encuentra ampliamente distribuido entre las bacterias Gram negativo.

S. Gallinarum posee codificado en la SPI-19 todos los genes esenciales para un T6SS

funcional, mientras que S. Enteritidis posee una versión trunca de la isla, y sólo posee

algunos genes del T6SS. Este sistema cumpliría una serie de funciones en los procesos

patogénicos dependiendo de la bacteria, y hasta el momento se ha descrito su

participaciòn en adherencia, invasión, citotoxicidad y proliferación intracelular. Al analizar

filogenéticamente el T6SS codificado en SPI-19 se descubrió que se encontraba cercano

a los sistemas codificados en bacterias como Vibrio cholerae y Aeromonas hydrophila. En

estos patógenos ya se ha descrito un rol del T6SS en la interacción con células del

sistema inmune, particularmente en la sobrevida y citotoxicidad en líneas celulares de

macrófagos. Debido a que la capacidad de Salmonella para sobrevivir dentro de

macrófagos es un proceso fundamental para su diseminación sistémica y colonización de

órganos blanco, en esta memoria se propuso determinar el papel que cumple el T6SS

codificado en SPI-19 en la interacción con macrófagos murinos. Para esto se estudió la

x

capacidad de sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de mutantes en genes

estructurales y efectores del T6SS. A su vez, se analizó la capacidad citotóxica de estas

cepas. Los resultados muestran que mutantes de S. Gallinarum presentan una

supervivencia menor a tiempos tardíos de infección. En S. Enteritidis la mutante para SPI-

19 no presenta una disminución significativa de la sobrevida. En ambos serotipos no se

presentan cambios en la citotoxicidad. También se estudió la expresión en la infección de

macrófagos del efector VgrG mediante una fusión con el fluoróforo GFP. Esto reveló una

rápida expresión de la fusión, lo que sugiere que el contacto bacteria-macrófago gatilla la

expresión del efector. Estos resultados demuestran que la isla SPI-19 codifica para un

T6SS funcional, que participa en un proceso esencial de la infección por Salmonella.

xi

SUMMARY

Salmonella Enteritidis and Salmonella Gallinarum are two pathogens of the avian host.

The first causes asymptomatic infections in chickens, infecting eggs and thus reaching the

human host. The later causes a severe gastroenteritis and fowl typhoid in chickens,

generating economic and productive consecuences. Using bioinformatic tools we

previously identified a new, uncharacterized pathogenicity island in four different

Salmonella serotypes, Gallinarum and Enteritidis among them. The island was named

Salmonella pathogenicity island 19 (SPI-19). This island contains genes that could encode

for a type six secretion system (T6SS), a protein secretion system found in a vast amount

of Gram negative bacteria. S. Gallinarum has all the esential genes for a functional T6SS

encoded in SPI-19. S. Enteritidis, however, has a smaller, truncated version of the island

that possesses only some T6SS genes. This secretion system has been involved in a

series of pathogenic processes in different bacteria, like adherence, invasion, cytotoxicity

and intracellular proliferation. Phylogenetic analysis of SPI-19 revealed it lies in the D

group of the Bingle classification, like Vibrio cholerae and Aeromonas hydrophila. The

T6SS of this pathogens has already been involved in survival inside macrophages and

cytotoxicity. Since the ability of Salmonella to survive inside macrophages is an essential

feature for the establishment of the systemic infection and organ colonization, in this work

we aimed to unravel the role played by the T6SS encoded in SPI-19 in the interaction of

Salmonella with macrophages. To this end, we studied the ability of mutants in structural

genes and effectors of the T6SS to survive inside RAW 264.7 murine macrophages.

Results reveal that T6SS plays a role in S. Gallinarum survival at late times of infection. S.

Enteritidis didn't show significative changes in survival between wild type and SPI-19

mutant. None of the mutants studied showed changes in their citotoxic potential. We also

xii

studied the expression of the T6SS effector VgrG inside macrophages, using a VgrG::GFP

fusion. The reporter protein was quickly expressed after infection of macrophages,

suggesting that cell to cell contact triggers VgrG expression. This results show that the

SPI-19 encodes a functional T6SS, and that this secretion system is involved in a essential

process of Salmonella infection.

xiii

ABREVIATURAS

AL Agar Luria

Amp Ampicilina

°C Grados Celsius

CL Caldo Luria

Cm Cloranfenicol

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

h Horas

kb Kilobases

kDa KiloDaltons

Kan Kanamicina

L Litros

min Minutos

MOI Multiplicidad de infección

nm Nanómetros

DO Densidad óptica

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PBS Amortiguador fosfato salino

PVDF Fluoruro de polivinilideno

SDS Dodecilsulfato de sodio

s Segundos

SFB Suero fetal bovino

SPI Salmonella pathogenicity island

TBS Amortiguador Tris salino

V Volts

1

1. INTRODUCCIÓN

Salmonella enterica es una especie de la familia Enterobacteriaceae que comprende

cientos de serovares. Son patógenos capaces de causar un amplio rango de

enfermedades, desde gastroenteritis hasta infecciones sistémicas. El tipo de enfermedad

causada es dependiente del serovar de Salmonella, de la especie y del estado

inmunológico del hospedero infectado (Galan, 2001).

Distintos serovares de Salmonella son objeto de estudio debido a que causan

infecciones de importancia tanto en el ámbito de la salud pública como en el ámbito

económico y productivo. Uno de ellos es Salmonella. Enteritidis, la cual es capaz de

infectar aves de postura, produciendo una infección asintomática y crónica en la que la

bacteria coloniza el oviducto, generando la posterior contaminación de los huevos. El

consumo de estos provoca en el ser humano un cuadro de enterocolitis con diarrea, fiebre

y dolor abdominal. Actualmente, S. Enteritidis ha desplazado a S. Typhimurium como la

primera causa de salmonellosis asociada a alimentos reportada en el mundo (Guard-

Petter y cols., 2001; Roberts y Sockett, 1994). Incluso en Chile, este serotipo aparece

actualmente como el aislado con mayor frecuencia, dejando atrás a S. Typhi (Fica y cols.,

2001; Prado y cols., 2002). Otro serotipo de interés es Salmonella Gallinarum, que a

diferencia de S. Enteritidis no genera una infección asintomática en las aves, sino que

causa tifoidea aviar, una enfermedad de alto impacto económico debido a los elevados

índices de morbilidad, mortalidad y disminución de la producción de huevos en las aves

de postura infectadas (Proux y cols., 2002). Ésta se caracteriza por ser una infección

sistémica, donde la bacteria es capaz de colonizar el hígado y el bazo, generando una

consecuente hepatoesplenomegalia, anemia y septicemia (Chappell y cols., 2009).

2

Se postula que existe una similitud entre los mecanismos moleculares de virulencia

utilizados por S. Enteritidis y S. Gallinarum en aves y los utilizados por S. Typhimurium

para causar una enfermedad sistémica en el ratón. En este modelo el ciclo infectivo se

inicia con el consumo de agua o alimentos contaminados con la bacteria. Esta es capaz

de resistir el pH ácido presente en el estómago para luego acceder al intestino delgado.

En la zona distal del íleo, Salmonella alcanza el subepitelio por trancitosis a través de

células M y a través de la invasión del tejido epitelial intestinal. Una vez en el subepitelio,

la bacteria es fagocitada por macrófagos, generando una respuesta inflamatoria,

eliminación de la bacteria y necrosis de la mucosa, lo que desencadena la diarrea

inflamatoria. Aquellas bacterias que son capaces de sobrevivir y proliferar al interior de los

células del sistema inmune alcanzan los nódulos linfáticos mesentéricos y entran a la

circulación, logrando la diseminación sistémica. Al comparar con el modelo aviar, las

diferencias se presentan fundamentalmente en la estructura y organización inmunológica

del sistema gastrointestinal. La invasión de Salmonella ocurre en la ceca, que

corresponde a un ciego que se prolonga a partir del íleo distal, previo al colon. Además,

en el intestino delgado del ave no se presentan nódulos linfáticos distintivos sino

agregados linfáticos difusos. También hay presencia de células M, pero no está

comprobada su acción en la infección por Salmonella. Pese a esto, al igual que en los

mamíferos, la sobrevida al interior de los macrófagos en el modelo aviar es un proceso

clave para el establecimiento efectivo de la infección sistémica y posterior colonización de

órganos (Chappell y cols, 2009).

La capacidad de Salmonella de sobrevivir al interior de los macrófagos se basa en su

habilidad de evitar las rutas degradativas intracelulares para posteriormente establecer un

nicho replicativo. El ingreso al interior de los macrófagos puede generarse ya sea por

3

fagocitosis de la bacteria por el macrófago o mediante invasión por la bacteria. Esta,

luego de ser internalizada, queda contenida en la vacuola llamada Salmonella Containing

Vacuole (SCV). La vacuola sufre un proceso inicial de maduración, esto es, la adquisición

de una serie de proteínas que dirigen su destino intracelular hacia las vías degradativas.

Durante los primeros 45 minutos una vacuola se vuelve pequeña y estrecha, adquiere

proteínas marcadoras de endosomas tempranos, como la GTPasa Rab5 y proteínas

encargadas de la acidificación del fagolisosoma como la vATPasa. Luego la SCV pasa

por la maduración tardía, donde adopta proteínas que la dirigirán definitivamente a su

fusión con el lisosoma. Es en esta etapa donde la bacteria puede modificar el

fagolisosoma, desviando la vacuola hacia una localización perinuclear. Esto sucede hasta

las 4 horas posterior a la fagocitosis. A esta altura las bacterias que han logrado sobrevivir

son capaces de modificar la vacuola para hacerla un lugar apto para la proliferación. A

continuación se produce la fusión de endosomas con la SCV lo que genera un crecimiento

de la vacuola en forma de filamentos, llamados Salmonella induced filaments (Sif)

(Bakoswski y cols, 2008; Brummell y cols, 2004). De esta forma la bacteria sobrevive y

prolifera dentro de los macrófagos, y dentro de estos puede diseminarse sistémicamente

en el hospedero.

La participación de grupos de genes obtenidos por transferencia horizontal es clave

para los procesos patogénicos de Salmonella. Estas agrupaciones genéticas pueden ser

identificadas debido a sus diferencias respecto al resto de los genes codificados en el

cromosoma bacteriano. Las diferencias comúnmente incluyen: cambios en la composición

nucleotídica (contenido G + C), diferencias de preferencia codogénica, asociación con

elementos genéticos móviles y/o genes de tRNA (Gal-Mor y Finlay, 2006). Estas

características evidencian que estas agrupaciones génicas pudieron ser transferidas de

4

forma horizontal a lo largo de la evolución, de una especie a otra. A estas agrupaciones

se les denomina islas genómicas. De forma particular, a las islas genómicas que poseen

genes de virulencia se les denomina islas de patogenicidad (Hacker & Kaper, 2000). El

estudio de islas de patogenicidad es fundamental para dilucidar los mecanismos

moleculares que median la patogénesis bacteriana. En el caso de Salmonella, estos se

encuentran dentro de las llamadas islas de patogenicidad de Salmonella (SPI, del inglés

Salmonella Pathogenicity Islands). En nuestro laboratorio se han realizado una serie de

estudios para la búsqueda de islas genómicas conservadas en diversos serovares de

Salmonella, que pudieran codificar genes importantes para su virulencia.

Comúnmente dentro de las islas de patogenicidad de Salmonella se pueden

encontrar genes que codifican para sistemas de secreción. De forma general, los

sistemas de secreción son un grupo diverso de complejos protéicos de membrana, que

forman sistemas de inyección capaces de transferir factores de virulencia desde la

bacteria a las células del hospedero (Gauthier y cols., 2003). Estos factores son proteínas

capaces de modular la respuesta del hospedero a favor de la bacteria. Particularmente,

en bacterias Gram negativo se habían descrito cinco tipos (1 al 5) de sistemas de

secreción. En Salmonella existen dos sistemas de secreción claves para la patogenicidad.

Un sistema de secreción tipo tres (T3SS) codificado en la SPI-1, el cual permite a la

bacteria ingresar al interior de células epiteliales o macrófagos gracias a la inyección de

efectores que remodelan el citoesqueleto de actina en la zona de la membrana

plasmática. El segundo, otro T3SS codificado en la SPI-2, que permite modificar la

vacuola fagocítica mediante efectores protéicos, como se mencionó anteriormente,

permitiendo la sobrevida de la bacteria al interior de macrófagos (Bakoswski y cols, 2008;

Brummell y cols, 2004).

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Recientemente se ha descrito la existencia de un nuevo sistema de secreción, el

cual fue llamado sistema de secreción tipo seis (T6SS) (Pukatzki y cols., 2006). Este

sistema presenta variabilidad en su contenido genético en las distintas especies que lo

poseen, pero a su vez contiene una serie de genes esenciales que se encuentran

conservados en la mayoría de los T6SS descritos. Uno de estos genes es el que codifica

para la proteína Hcp (Proteína corregulada con Hemolisina), la cual es capaz de formar

anillos hexaméricos que pueden polimerizar in vitro para formar tubos (Mougous y cols.,

2006). Además, presenta homología a nivel de secuencia con la proteína gp19,

componente de la cola del fago T4. Estas evidencias apuntan a HCP como la proteína

que formaría el canal por el cual ocurriría la secreción. Otra proteína de interés es VgrG

(Proteína con repeticiones valina-glicina), la cual presenta similitudes estructurales con el

complejo de aguja del bacteriófago T4, encargado de perforar la pared bacteriana. Por

esto, se postula que VgrG estaría ubicada en el extremo del tubo conformado por HCP y

perforaría la membrana de la célula hospedera para permitir la secreción (Pukatzki y cols,

2006). Otro gen esencial es aquel que codifica para ClpV, proteína de la familia Clp de

ATPasas AAA+, la que se caracteriza por acoplar el proceso hidrólisis de ATP con el

despliegue de proteínas blanco. Por esto a ClpV se le atribuye una función en el

ensamblaje de la maquinaria de secreción. Se ha demostrado que su actividad es crucial

para el funcionamiento del T6SS (Schlieker y cols., 2005, Mougous y cols., 2006.) y que

esta función la ejercería mediante el remodelamiento del complejo formado por las

proteínas VipA y VipB, las cuales generan una estructura cilíndrica, que recubriría como

una vaina el tubo formado por la proteína Hcp (Bonemann y cols., 2009). Otras proteínas

fundamentales del sistema son las proteínas IcmF y DotU, homólogas a genes

estructurales del sistema de secreción tipo IV, y que formarían parte del anclaje del T6SS

a la membrana de la bacteria.

6

Pese a que todos estos genes representan elementos centrales del sistema de

secreción, también existen diferencias en estos componentes entre una especie y otra.

Por ejemplo, algunas especies poseen más de un gen para las proteínas Hcp y VgrG y

existen además proteínas VgrG que poseen extensiones C-terminales con dominios

efectores. A estas se les ha llamado proteínas VgrG evolucionadas (Pukatzki y cols.

2007). Algunos ejemplos son el dominio con actividad de entrecruzamiento de actina de

Vibrio cholerae y el dominio con actividad ADP-ribosilasa de Aeromonas hydrophila

(Pukatzki y cols. 2007, Suarez y cols. 2010). La presencia de estos dominios adicionales

ha hecho que ciertos autores formulen que, más que un sistema de secreción, el T6SS

funcionaría como un punzón que perforaría la membrana del hospedero, lo cual permitiría

exponer la proteína VgrG con su dominio adicional en el citosol de la célula blanco,

pudiendo así ejercer este dominio un efecto tóxico sobre el hospedero.

Pese a que existe un creciente aumento en el número de publicaciones sobre el

tema, el mecanismo por el cual acciona este sistema no ha sido claramente dilucidado, y

su función varía entre especies. Hasta el momento, diversas publicaciones lo han

relacionado en procesos tan variados como invasión celular (Schlieker y cols., 2005),

replicación intracelular (de Bruin y cols., 2007), escape del fagosoma (Barker y cols.,

2009), adherencia, formación de biopelículas (Enos-Berlage y cols., 2005), toxicidad hacia

otras bacterias (Hood y cols., 2010) y virulencia en una serie de modelos de infección

animal y vegetal (Cascales, 2008; Pukatzki y cols., 2008).

En nuestro laboratorio, se realizó una búsqueda de posibles islas genómicas que

poseyeran genes del T6SS en genomas de diversos serovares de Salmonella que no

habían sido investigados aún. El análisis bioinformático reveló la existencia de un T6SS

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hipotético codificado en una isla genómica presente sólo en los serovares Agona, Dublin,

Gallinarum y Enteritidis. Esta isla se encuentra en una región del cromosoma donde

ocurrieron numerosos reordenamientos adyacentes a genes que codifican para tRNAs de

serina. Al ser genes pertenecientes a un sistema posiblemente involucrado en virulencia,

esta isla fue denominada como SPI-19 (Blondel y cols., 2009). Al analizar detalladamente

la isla, se observó que S. Enteritidis posee una isla de menor tamaño, en la cual faltan

ciertos genes fundamentales del hipotético T6SS y que por lo tanto podría ser no

funcional (Figura 1).A diferencia de lo anterior, en la isla SPI-19 de los otros serovares

podemos reconocer genes que codifican para los componentes esenciales del T6SS:

ClpV, las proteínas Hcp-1, Hcp-2 y VgrG, entre otros componentes estructurales del

complejo como IcmF y DotU.

Al estar ampliamente distribuidos en distintas especies gracias a procesos de

transferencia horizontal, los distintos T6SS presentan distintos porcentajes de similitud y

distintas historias evolutivas. Estos sistemas de secreción se han caracterizado

filogenéticamente, ordenándolos en grupos o familias (Bingle y cols., 2008; Boyer y cols.,

2009). Al analizar la homología de los genes de SPI-19 con genes presentes en los

Figura 1. Esquema de la organización genética de la isla SPI-19 de Salmonella. En

color se muestran los genes que codifican para componentes conocidos del T6SS.

8

genomas de otras especies bacterianas, encontramos que estos genes poseen una alta

similitud con el T6SS descrito en Escherichia coli O157:H7, por lo cual nuestro T6SS

corresponde al grupo D de la clasificación de Bingle y el grupo I de la clasificación de

Boyer. Dentro de este grupo también están presentes los T6SS de otras bacterias

patógenas como Vibrio cholerae, Aeromonas hydrophila y Burkholderia mallei. En estas

tres bacterias se ha demostrado que el T6SS cumple un rol esencial en patogenicidad,

particularmente participando en la sobrevida y proliferación al interior de líneas celulares

de macrófagos murinos, y procesos de citotoxicidad hacia estos (Pukatzki y cols., 2007;

Ma y cols., 2009; Suarez y cols., 2010; Burtnick y cols., 2010). Sin embargo, estas tres

bacterias poseen proteínas VgrG evolucionadas, a diferencia de la proteína VgrG común

encontrada en SPI-19. De todas formas no es raro pensar que el T6SS de SPI-19 pudiera

cumplir una función similar, debido a la homología con los T6SS de estas bacterias, y ya

que la sobrevida al interior de los macrófagos es una propiedad fundamental para que

Salmonella establezca una infección sistémica del hospedero, como lo causa S.

Gallinarum en aves.

Por otro lado, aunque la SPI-19 de S. Enteritidis no posea todos los genes

requeridos para el ensamblaje del T6SS, no se puede descartar que los genes

remanentes de la isla tengan una función en patogenicidad. Resultados recientes de

nuestro laboratorio han demostrado que el gen SEN1001 de este serovar, presente en

SPI-19, cumple un rol en patogenicidad, ya que mutantes para este gen presentan una

menor sobrevida en un modelo de infección sistémica en ratón (Silva, resultados no

publicados). Esto explicaría, en parte, por qué ciertos genes de la SPI-19 original aún se

conservan en S. Enteritidis, en vez de producirse la escisión completa de la isla.

9

De acuerdo a lo anterior se planteó la siguiente Hipótesis:

El T6SS codificado en la isla SPI-19 participa en la infección de macrófagos por

serovares de Salmonella

Objetivo general

Evaluar si el T6SS y otros genes codificados en SPI-19 cumplen un papel en la

interacción de S. Gallinarum y S. Enteritidis con macrófagos de ratón

Objetivos específicos

1.- Evaluar si el T6SS codificado en SPI-19 participa en la sobrevida intracelular y

toxicidad de Salmonella en macrófagos murinos.

2.- Determinar el efecto de la interacción de S. Gallinarum con macrófagos murinos sobre

la expresión de componentes del T6SS codificado en SPI-19.

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2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Reactivos

De Difco Laboratories (Detroit, MI, EEUU) se obtuvo: triptona, extracto de levadura, Bacto-

Agar.

De Fermentas (Hanover, MD, EEUU) se obtuvo: Estándar de peso molecular GeneRuler

de 1Kb.

De Gibco BRL (Grand Island, NY, EEUU) se obtuvo: dodecilsulfato de sodio (SDS), Tris-

HCl, acrilamida, bisacrilamida, bromuro de etidio, agarosa.

De Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EEUU) se obtuvo: Partidores

De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, EEUU) se obtuvo: Azul de Tripán 0,4%.

De Merck Química Chilena Soc. Ltda. se obtuvo: cloruro de sodio, glicerol, ácido

clorhídrico, isopropanol, formaldehído, acetato de sodio, etanol absoluto.

De Nunc International (Rochester, NY, EEUU) se obtuvo: placas desechables de 6 y 48

pocillos para cultivo celular

De Omega Bio-Tek se obtuvo: kit de extracción plasmidial E.Z.N.A Plasmid Miniprep.

11

De Pierce Biotechnology (Rockford, IL, EEUU) se obtuvo: Sustrato quimioluminiscente

SuperSignal West-Pico, película de exposición CL-XPosure.

De Promega (Madison, WI, EEUU) se obtuvo: Go-Taq DNA polimerasa, dNTPs, kit de

medición de la liberación de la enzima LDH Citotox 96.

De Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA, EEUU) se obtuvo: Anticuerpo

secundario anti IgG de ratón conjugado a peroxidasa.

De Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EEUU) se obtuvo: kanamicina, ampicilina,

cloranfenicol, arabinosa, β-mercaptoetanol, azul de bromofenol, xileno-cianol, persulfato

de amonio (APS), N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED), tricina, ácido etilendiamino-

tetraacético (EDTA), filtros Millipore 0,25 µm.

De Thermo Scientific HyClone (Waltham, MA, EEUU) se obtuvo: Dulbecco's Modified

Eagle Medium (DMEM, High glucose), suero fetal bovino (SFB), PBS 10x.

De Vector Laboratories (Burlingame, CA, EEUU) se obtuvo: Medio de montaje Vectashield

con DAPI.

12

2.2 Cepas Bacterianas

Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en la presente Tesis

Cepa Genotipo/Fenotipo relevante Fuente o referencia

S. Gallinarum 287/91 Cepa silvestre Stock del laboratorio

S. Gallinarum ΔclpV ΔclpV::frt C. Blondel

S. Gallinarum Δhcp2 Δhcp2::frt C. Blondel

S. Gallinarum ΔvgrG ΔvgrG::frt C. Blondel

S. Gallinarum ΔSPI-19 ΔSG1023-SG1055::frt C. Blondel

S. Gallinarum ΔclpV/clpV ΔclpV::frt , pGEM clpV C. Blondel

S. Gallinarum hcp1-3xFLAG Fusión epitopo FLAG en extremo 3'

del gen

C. Blondel

S. Gallinarum hcp2-3xFLAG KanR, Fusión epitopo FLAG en

extremo 3' del gen

C. Blondel

S. Gallinarum vgrG-3xFLAG KanR, Fusión epitopo FLAG en

extremo 3' del gen

C. Blondel

S. Gallinarum vgrG::GFP vgrG::GFP, pmCherry Este trabajo

S. Enteritidis PT4 Cepa silvestre fagotipo PT4 Stock del laboratorio

S. Enteritidis ΔSPI-19 ΔSEN0995-SEN1010::frt C. Blondel

S. Enteritidis hcp1-3xFLAG Fusión epitopo FLAG en extremo 3'

del gen

C. Blondel

13

2.3 Plasmidios.

Tabla 2. Plasmidios utilizados en la presente Tesis.

Plasmidio Características Fuente o

referencia

pKD46 bla PBAD bet exo pSC101 oriTs, AmpR Datsenko y

Wanner, 2000

pGEM-clpV pGEM-T easy que posee clonado el gen clpV, AmpR C. Blondel

p3174 Vector que posee copia del gen GFPmut3 Gerlach y cols.,

2007

pmCherry Posee el fluoróforo mCherry bajo expresión

constitutiva, AmpR

C. Marolda

2.4 Partidores

Tabla 3. Partidores utilizados en la presente Tesis.

SG1044_GFP_fwd CAGCAGGATGACCCCGATCCATCGGATCTGATCATGTACA

GTAAAGGAGAAGAACTTTTC

SG1044_blatem_rev CCCGGTGGCTCCTGCTGTAGTCCGGTATTCATTATGTTAT

CGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

K1 CAGTCATAGCCGAATAGCCT

ISX-G CACTTGAGGTCCAATCCGGG

Subrayadas las zonas que alinean con plasmidio p3174

14

2.5 Medios de cultivo.

2.5.1 Cultivo bacteriano

Las bacterias se cultivaron a 37°C en forma aeróbica en caldo Luria (CL, triptona

10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, cloruro de sodio 5 g/L), o en caldo Luria NaCl 0,3 M.

Los cultivos en medio sólido se llevaron a cabo en placas de agar Luria (AL) (CL

suplementado con 15 g/L de Bacto agar). Aquellas cepas que tenían plasmidios de

replicación termosensible (pKD46) se incubaron a 30°C. Los antibióticos se utilizaron a las

siguientes concentraciones finales: ampicilina (Amp) 100 µg/mL, kanamicina (Kan) 50

µg/mL, cloranfenicol (Cm) 20 µg/mL.

2.5.2 Cultivo celular

Los macrófagos de origen murino RAW 264.7 se mantuvieron en botellas de

cultivo con medio DMEM suplementado con 10% SFB en un incubador a 37°C con 5%

CO2. El medio de cultivo se cambió por medio fresco cada 2 a 3 días. El día previo a cada

ensayo las células se soltaron de la botella con un rastrillo para cultivo celular, se lavaron

con PBS estéril y se resuspendieron en medio fresco, para ser contadas usando una

cámara de Neubauer. Finalmente, se sembraron en una placa de 48 pocillos a una razón

de 2,5 x 105 células por pocillo, para que formaran una monocapa con una confluencia de

80 a 100%.

Las células HeLa se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 8% SFB.

Para remover las células, se sustituyó el medio de cultivo por 1 mL de una solución

15

Tripsina-EDTA al 0,25%. Se incubó a 37°C por 2-5 min y se soltaron las células por

agitación. Luego se agregó 4 mL de medio suplementado para inactivar la tripsina y las

células se contaron en una cámara de Neubauer mezcladas en razón 1:1 con solución de

azul de Tripán.

2.6 Ensayos de Western Blot.

2.6.1 Preparación de muestras de proteínas.

Las cepas bacterianas se cultivaron en 5 mL de CL a 37 °C durante toda la noche.

Estos cultivos se utilizaron para inocular CL NaCl 0,3 M fresco (inoculado a una razón de

1:1.000), agregando los antibióticos correspondientes y se incubó a 37 °C con agitación.

Cuando las bacterias alcanzaron la fase de crecimiento exponencial temprana (DO600 0,3-

0,4) se centrifugaron alícuotas del cultivo a 10.000 x g por 2 min. Se eliminó el

sobrenadante, y se procedió a pesar el precipitado obtenido. Luego, se resuspendió el

precipitado en 10 µL de tampón de carga de proteínas (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8; SDS

2%, Glicerol 10%, Azul de Bromofenol 0,01%, B-mercaptoetanol 5%) por cada mg de

peso. Las muestras se hirvieron durante 10 min, y se almacenaron a -20 °C hasta su

utilización.

16

2.6.2 Electroforesis SDS-PAGE

Los geles de poliacrilamida se prepararon en una cámara mini-Protean III (BioRad)

de acuerdo a la siguiente Tabla:

Gel resolutivo 12% Gel Concentrador 4%

H20 1600 μL 1450 μL

Glicerol 50% 125 μL --

Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 SDS 0,4% 1250 μL --

Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 SDS 0,4% -- 630 μL

Acrilamida 30% 2000 μL 430 μL

TEMED 4 μL 4 μL

PSA 10% 40 μL 15 μL

Primero se cargó la mezcla del gel resolutivo y se cubrió con 200 µL de

isopropanol. Una vez polimerizada la mezcla, se retiró el isopropanol y se cargó la mezcla

del gel concentrador. Se utilizó tampón de corrida para proteínas (Glicina 1,44%, Tris

0,3%, SDS 0,1%) y se cargaron 5 µL de las muestras de proteínas. La electroforesis se

realizó a voltaje constante de 100 V, hasta que el tampón de carga llegara al final del gel.

17

2.6.3 Transferencia y bloqueo.

Se realizó la transferencia desde un gel SDS-PAGE a una membrana de PVDF en

una cámara Mini Trans-Blot de BioRad. La membrana de PVDF se activó en metanol por

15 s para luego sumergirla en H2O destilada. La transferencia se realizó con tampón de

transferencia (Glicina 1,44%, Tris 0,3%, SDS 0,01% y Metanol 20%) por 65 min a 230 mA.

La membrana luego de ser transferida se bloqueó con 50 mL de una solución de leche

descremada 5% en TBS (Tris 25 mM pH 8, NaCl 125 mM) y se agitó suavemente por 90

min a temperatura ambiente.

2.6.4 Inmunodetección por quimioluminiscencia

La membrana se incubó con el primer anticuerpo ANTI-FLAG M2 diluido 1:10.000

en TBS 4° C durante 2 h en agitación a temperatura ambiente. Luego de cinco lavados de

5 min en TBS Tween 0,05%, la membrana se incubó con el segundo anticuerpo anti-ratón

conjugado con peroxidasa de rábano diluido 1:20.000 en TBS, a temperatura ambiente

por 2 h en agitación. Para la detección se utilizó el sustrato quimioluminiscente

SuperSignal West-Pico, con exposición en película CL-Xposure.

18

2.7 Ensayos de infección in vitro

2.7.1. Ensayos de supervivencia intracelular de cepas de S.Gallinarum y S.

Enteritidis en macrófagos murinos RAW 264.7

El ensayo utilizado se basó en el protocolo descrito por Schwan y cols. (2000). Los

macrófagos se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% SFB a 37°C en un

incubador con 5% CO2. Para el ensayo, aproximadamente 2,5 x 105 células se sembraron

por pocillo, en una placa de 48 pocillos. Previo a la infección, las cepas bacterianas fueron

crecidas toda la noche a 37 °C en CL con agitación. El día del ensayo se inocularon en 5

mL de CL (dilución 1:30) y se crecieron hasta una DO600=0.6 aproximadamente. Los

volúmenes necesarios para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 10 bacterias

por célula para S. Gallinarum y de 50 bacterias por célula para S. Enteritidis se diluyeron

en medio DMEM suplementado con 10% SFB. Los macrófagos se lavaron con PBS y se

pusieron en contacto con las bacterias por 45 min. Una vez terminado este tiempo, se

considera el tiempo 0 de infección. Los pocillos se lavaron con PBS y las células se

incubaron a 37°C con medio suplementado con Gentamicina (100 µg/mL). A los tiempos

0, 2, 4, 6 y 20 h se procedió a lavar con PBS un triplicado de cada cepa ensayada, y se

lisaron las células con desoxicolato de sodio 0,5% en PBS. Diluciones seriadas en CL de

estos lisados se sembraron en placas de AL para el conteo de bacterias viables (unidades

formadoras de colonia, UFC). Se calculó el porcentaje de sobrevida según la siguiente

ecuación:

19

Posteriormente se calcularon los porcentajes relativos de sobrevida para cada

cepa, al comparar con la cepa silvestre.

2.7.2 Ensayos de viabilidad celular

Para el ensayo se sembraron aproximadamente 1,5 x 106 células por pocillo en

una placa de 6 pocillos. El experimento se realizó de igual manera al ensayo de invasión,

pero a las 20 h de infección se procedió a soltar las células de la placa mediante el uso de

un rastrillo, y se contó el número de células viables en una cámara de Neubauer

mezcladas en razón 1:1 con solución de azul de Tripán 0,4%.

2.7.3 Ensayos de Citotoxidad

Se utilizó el kit Citotox 96 para medir la citotoxicidad de las distintas cepas en

estudio hacia macrófagos RAW 264.7. Este kit mide la actividad de la enzima lactato

deshidrogenasa (LDH) liberada al medio de cultivo. Se sembraron placas de 96 pocillos

con 30.000 células por pocillo el día anterior. Al menos 20 h después se procedió a

realizar un ensayo de infección de macrófagos como fue descrito anteriormente,

ensayando cada cepa por cuadruplicado. Además se dejó una serie de pocillos sin

infectar, para realizar la medición de la liberación espontánea de LDH al medio de cultivo.

A las 19 h de infección se agregó una solución de lisis 10x a 4 pocillos sin infectar, los

cuales representan en la medición de actividad un 100% de liberación de LDH. A las 20 h

de infección se tomó el sobrenadante de las células infectadas, las células sin infectar y

20

de las células lisadas, y se transfirieron a otra placa de 96 pocillos. Además, se agregaron

100 µL de cultivo fresco a 4 pocillos, para medir la absorbancia del medio de cultivo.

Luego se procedió a agregar el reactivo de citotoxicidad, y se incubó a temperatura

ambiente, alejado de la luz durante 30 min. Una vez cumplido este tiempo se agregó la

solución de detención de la reacción y se midió la absorbancia de las muestras en un

lector de placas a 562 nm. Para calcular la citotoxicidad de cada cepa se restó el valor de

la absorbancia del medio de cultivo a cada uno de los valores y luego se utilizó la

siguiente ecuación:

2.7.4 Ensayos de invasión de células epiteliales HeLa

Se diseñó un ensayo basado en el método descrito por Hoare y cols. (2006). Se

cultivaron las bacterias hasta fase exponencial tardía (DO600 de 0,6-0,7) a partir de un

cultivo 1:50 para S. Enteritidis y 1:30 para S. Gallinarum sembrado desde un pre inóculo

crecido durante toda la noche. Para aumentar la invasividad de las cepas de S.

Gallinarum, éstas se crecieron en CL NaCl 0,3 M. Se sedimentaron las bacterias, se

lavaron con PBS y se resuspendieron en medio DMEM 8% SFB. Luego se agregó un

inóculo de 100 µL de la suspensión sobre monocapas de células HeLa previamente

lavadas con PBS, considerando una MOI de aproximadamente 10 UFC/célula. Se

conservó una alícuota de cada inóculo para realizar un recuento de las UFC totales

agregadas. Cada cepa se ensayó por triplicado. Las placas se incubaron a 37°C para

permitir la invasión bacteriana. El tiempo de invasión fue de 30 min para S. Enteritidis y de

21

45 min para S. Gallinarum. Posteriormente, las bacterias extracelulares adheridas a la

monocapa se eliminaron mediante tres lavados con PBS suplementado con 100 µg/mL de

Gentamicina y posterior incubación por 1 hr en medio suplementado con suero y 50

µg/mL de Gentamicina. Luego de este tiempo las células se lisaron con 100 µl de

desoxicolato de sodio al 0,5% por 5 min a 37°C. Sobre este volumen se agregó 900 µl de

LB para llevar a una dilución de 10-1 y realizar a partir de ésta las diluciones adecuadas

para plaquear en AL y contar las UFC intracelulares.

La invasión se calculó como el porcentaje de bacterias intracelulares respecto al

inóculo inicial:

2.7.5 Análisis Estadístico

Los ensayos de sobrevida, invasión y citotoxicidad se realizaron al menos tres

veces en triplicado para cada cepa ensayada. Los análisis estadísticos de estos ensayos

se realizaron con el software Graphpad Prism, utilizando el test de una vía ANOVA y el

post-test Dunnet, que permite comparar las diferencias entre las mutantes y la cepa

silvestre.

2.8 Construcción de la fusión traduccional GFP

2.8.1 Obtención del producto de PCR para la mutagénesis

22

Se uso el método descrito por Gerlach y cols. (2007). Se utilizaron partidores de 50

pb, cuyos extremos 5' contenían 30 nucleótidos idénticos a las regiones que flanquean el

gen a mutar. Por otra parte, el extremo 3' de los partidores contenía 20 nucleótidos

(subrayados en las secuencias, ver tabla 3) cuya secuencia apareaba con aquella

presentes en el plasmidio p3174. A partir del plasmidio se amplificó el gen sin promotor y

sin secuencia de unión al ribosoma para el fluoróforo GFPmut3 en conjunto con un

cassette de resistencia para kanamicina., según la siguiente reacción de PCR:

Concentración inicial 1x (μL) C final

H2O 32,7

Tampón Go-Taq (5x) 10 1x

MgCl2 (25mM) 3 1,5 mM

dNTPs (10 mM c/u) 1 0,2 mM c/u

Partidor 1 (25 μM) 1

Partidor 2 (25 μM) 1

Go-Taq 0,3

DNA plasmidial 1

Final 50

Protocolo de amplificación:

23

95ºC 2 min

95ºC 30 s

55ºC 30 s 33 ciclos

72ºC 1,5 min

72ºC 10 min

20ºC 10 min

2.8.2 Mutagénesis

El producto PCR obtenido anteriormente se transformó por electroporación en células

competentes de una cepa de S. Gallinarum que poseía el plasmidio pKD46, el cual

contiene los genes de la recombinasa del fago lambda. Luego de transformar se incubó a

37°C por 2 h, para permitir la recombinación de los productos y la posterior expresión del

cassette de resistencia. Luego se plaquearon las bacterias, se seleccionaron las bacterias

resistentes y se comprobó la inserción del cassette mediante PCR utilizando partidores

que aparean en zonas externas a la inserción, según el siguiente protocolo:

Concentración inicial 1x (μL) C final

H2O 11,1

24

Tampón Go-Taq (5x) 0,4 1x

MgCl2 (25mM) 1,6 2 mM

dNTPs (10 mM c/u) 0,4 0,2 mM c/u

Partidor 1 (25 μM) 0,4

Partidor 2 (25 μM) 0,4

Go-Taq 0,1

Suspensión bacteriana 2,0

Final 20

Protocolo de amplificación:

95ºC 2 min

95ºC 30 s

55ºC 30 s 30 ciclos

72ºC 1,5 min

72ºC 10 min

20ºC 10 min

2.9. Electroforesis en geles de agarosa.

25

Los geles se prepararon usando agarosa a concentraciones entre 0,7 % y 1,5 %

en tampón TAE (Tris-acetato 40 mM pH 8,0, EDTA 1 mM). Las muestras de DNA a

analizar se mezclaron con el volumen adecuado de tampón Blue II 10X (glicerol 20% (v/v),

azul de bromofenol 0,25% (p/v), xilencianol 0,25% (p/v), EDTA 0,1 M) antes de ser

cargadas en el gel. La electroforesis se realizó a 100 V constantes y luego el gel se tiñó

por 5 min en una solución de bromuro de etidio (5 µg/mL). Las bandas de DNA se

visualizaron y se fotografiaron sobre un transiluminador UV.

2.10 Microscopía de epifluorescencia

Se prepararon muestras para su observación al microscopio de epifluorescencia

de la siguiente manera: luego de lavar y soltar las células, estas se sembraron en

cubreobjetos de 25 mm de diámetro en placas de 6 pocillos. Para células RAW 264.7 se

sembraron 375.000 células por pocillo y para células HeLa se sembraron 240.000 células

por pocillo. Luego de al menos 20 h se procedió a lavar los cubreobjetos y a infectar con

la cepa de S. Gallinarum vgrG::GFP pmCherry. Los ensayos de infección se realizaron de

forma similar a los descritos anteriormente. Luego, a distintos tiempos de infección se

lavaron las células con PBS y posteriormente se fijaron al agregar una solución de PBS

4% formaldehído durante 20 min a temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron con

PBS los cubreobjetos y se montaron en portaobjetos en medio de montaje Vectashield

con el fluoróforo DAPI. Los cubreobjetos se pegaron al portaobjeto y se guardaron las

muestras a 4 ºC hasta su visualización en microscopio de epifluorescencia.

26

3. RESULTADOS

3.1 S. Gallinarum y S. Enteritidis producen componentes del T6SS

Se investigó la capacidad de S. Gallinarum y S. Enteritidis para producir ciertos

componentes del T6SS. Para esto se utilizaron las cepas de S. Gallinarum hcp1-FLAG,

hcp2-FLAG y vgrG-FLAG, y la cepa hcp1-FLAG de S. Enteritidis. Estas poseen la fusión

del epítopo FLAG a los genes correspondientes para así visualizar la proteína mediante

Western Blot. Las cepas se crecieron en CL 0,3 M NaCl, condición en la cual estos genes

presentan una mayor actividad transcripcional (Blondel, resultados no publicados). Como

se muestra en la Figura 2 se detectó la producción de las proteínas Hcp1, Hcp2 y VgrG,

cuyos pesos moleculares concuerdan con los tamaños esperados de 20, 22 y 82 kDa,

respectivamente.

Figura 2. Análisis de la producción de componentes del T6SS de S. Gallinarum y S. Enteritidis

in vitro. Western Blot de muestras de proteína obtenidas de cepas crecidas en CL NaCl 0,3 M. La

inmunodetección se realizó con el anticuerpo FLAG. Con flechas se muestran las proteínas en

estudio.

27

3.2 Los genes de SPI-19 no participan en la internalización de S. Gallinarum y

S. Enteritidis por macrófagos murinos.

Para estudiar la participación del T6SS de SPI-19, o de otros genes presentes en

esta isla, en la interacción con macrófagos se utilizaron distintas cepas mutantes

construidas en nuestro laboratorio. Estas cepas fueron mutadas mediante la técnica de

Red swap descrita por Datsenko y Wanner (2000). Cada marco de lectura o región de

interés fue reemplazada mediante recombinación alélica por un cassette de resistencia a

antibiótico, el cual posteriormente fue escindido. Esto genera una deleción en el gen de

interés sin efectos polares sobre la expresión de los genes aledaños. Para S. Gallinarum

se utilizaron las mutantes en los componentes vgrG y hcp2, ya que ambos ejercerían

funciones efectoras y estructurales. También una mutante en el gen de la ATPasa clpV y

una mutante completa de la isla. La mutación de los efectores nos permite inactivar el

posible efecto del T6SS y la mutación en la ATPasa permite impedir el ensamblaje del

sistema. La mutación completa de la isla inhibe cualquier efecto que pudieran provocar los

genes contenidos en ella. En S. Enteritidis, ya que no posee todos los genes para

conformar un T6SS funcional, se estudió la mutante de la isla SPI-19 completa.

Para analizar si el T6SS o los genes presentes en SPI-19 afectaban la

internalización de Salmonella, se comparó la cantidad neta de bacterias que ingresa a los

macrófagos a los 45 min de infección. Como se muestra en la Figura 3, todas las cepas

en estudio son internalizadas en similar medida. Por ende, ni el T6SS ni los genes

presenten en SPI-19 participan en el proceso de internalización.

28

3.3 Los genes de la isla SPI-19 participan en la sobrevida de S. Gallinarum a

tiempos tardíos de infección en macrófagos murinos

Para determinar los tiempos a los cuales se estudiaría la sobrevida intracelular de

S. Gallinarum y S. Enteritidis, y el posible papel de los genes de la isla SPI-19 en este

proceso, se realizaron ensayos de sobrevida en la línea celular de macrófagos murinos

RAW 264.7, recuperando bacterias a las 0, 2, 4, 6 y 20 h post infección. Como se muestra

en la Figura 4A, S. Gallinarum presentó una proliferación inicial hasta las 4 horas de

infección, tras lo cual se produjo una disminución drástica en la sobrevida, llegando hasta

alrededor de un 10% a las 20 h de infección. No se observaron diferencias entre el

porcentaje de bacterias viables de la cepa silvestre y la mutante ∆clpV hasta el tiempo de

20 h. La cepa silvestre y la mutante para la isla SPI-19 de S. Enteritidis presentaron un

patrón similar de proliferación y muerte al exhibido por las cepas S. Gallinarum (Figura

4B), y las diferencias de sobrevida se observaron al tiempo de 20 h. A partir de estos

Figura 3 Internalización neta de cepas de S. Gallinarum y S. Enteritidis por

macrófagos RAW 264.7. Se realizaron ensayos de infección de macrófagos y se

recuperaron las bacterias intracelulares tras 45 min de internalización. Resultados

corresponden al promedio de al menos tres ensayos independientes realizados en

triplicado. Las barras representan el error estándar.

A B

29

ensayos se estableció estudiar la sobrevida de las mutantes para los genes de SPI-19 a

un tiempo temprano (6 h de infección) y un tiempo tardío (20 h de infección).

Al analizar la sobrevida intracelular de S. Gallinarum a las 6 h de infección (Figura

5A), no se presentaron cambios significativos en la sobrevida de las mutantes de los

genes puntuales del T6SS o de la isla SPI-19 completa. A las 20 h en cambio (Figura

5B), se presentaron cambios considerables en la viabilidad de todas las mutantes, las

cuales presentaron hasta un 50% menos de viabilidad que la cepa silvestre.

Figura 4. Cinética de sobrevida de cepas de S. Gallinarum y S. Enteritidis al interior de

macrófagos RAW 264.7. Se realizaron dos ensayos independientes de infección de

macrófagos en triplicado. Se recuperaron bacterias a distintos tiempos de infección y se

calculó el porcentaje de sobrevida a partir de las bacterias recuperadas al t = 0 de infección.

A B

30

En S. Enteritidis, en cambio, no se observaron cambios significativos a ninguno de

los tiempos estudiados (Figura 6). Por ende, los genes remanentes del T6SS presentes

en SPI-19 de S. Enteritidis no tendrían un rol en la sobrevida al interior de macrófagos.

Figura 6. Sobrevida de cepas de S. Enteritidis al interior de macrófagos RAW 264.7. A)

Sobrevida a las 6 h de infección B) Sobrevida a las 20 h de infección. Se realizaron ensayos

de infección de macrófagos y se recuperaron las bacterias intracelulares a los tiempos

indicados de infección. Se calculó el porcentaje relativo de sobrevida a partir de la sobrevida

de la cepa silvestre para cada ensayo. Los resultados corresponden al promedio de al menos

cuatro ensayos independientes realizados en triplicado. Las barras representan el error

estándar obtenido.

Figura 5. Sobrevida de cepas de S. Gallinarum al interior de macrófagos RAW 264.7. A)

Sobrevida a las 6 h de infección B) Sobrevida a las 20 h de infección. Se realizaron ensayos de

infección de macrófagos y se recuperaron las bacterias intracelulares a los tiempos indicados de

infección. Se calculó el porcentaje relativo de sobrevida a partir de la sobrevida de la cepa silvestre

para cada ensayo. Los resultados corresponden al promedio de al menos cuatro ensayos

independientes realizados en triplicado. Las barras representan el error estándar. Valores

estadísticamente significativos por el test de ANOVA y post test de Dunnett están indicados con un

asterisco. (* = P < 0,05 ; ** = P < 0,01)

A B

A B

31

Cuando se complementó la ausencia del gen clpV con el gen clonado en un

plasmidio multicopia (Figura 7) se restauró la capacidad de sobrevida a las 20 h, al

comparar con las cepas silvestre y mutante para clpV transformadas con el plasmidio

vacío. Esto comprobó que los defectos de sobrevida se deben a la ausencia en la función

de la proteína clpV, y por ende del T6SS, y no a un efecto producido por el proceso de

mutación por recombinación alélica, o a posibles recombinaciones ocasionadas al eliminar

el cassette de resistencia. Estos resultados apuntan a que el T6SS codificado en la SPI-

19 S. Gallinarum es funcional, y participa en la sobrevida intracelular en macrófagos a

tiempos tardíos.

Figura 7. Sobrevida de la mutante clpV de S.

Gallinarum. Se realizaron ensayos de infección de

macrófagos y se recuperaron las bacterias

intracelulares a las 20 horas de infección. Se calculó el

porcentaje relativo de sobrevida respecto a la sobrevida

de la cepa silvestre para cada ensayo. Se presentan el

promedio de al menos cuatro ensayos independientes

realizados en triplicado. Las barras representan el error

estándar obtenido. Valores estadísticamente

significativos (P < 0,01) por el test de ANOVA y post

test de Dunnett están indicados con un asterisco

32

3.4 Los genes codificados en SPI-19 no participan en la muerte celular de

macrófagos murinos RAW 264.7

Para determinar si los productos génicos de SPI-19 tienen propiedades citotóxicas

sobre los macrófagos infectados, se realizaron ensayos de viabilidad celular usando un

protocolo similar al de los ensayos de sobrevida, pero en el cual a las 20 h de infección se

soltaron los macrófagos desde sus pocillos para posteriormente evaluar su viabilidad

mediante conteo en cámara Neubauer con azul de Tripán. En la Figura 8 se muestran los

resultados obtenidos para estos ensayos. No se observan diferencias significativas de

viabilidad celular al infectar con cepas silvestres o cepas mutantes de S. Gallinarum y S.

Enteritidis.

Para evaluar en forma cuantitativa el posible efecto citotóxico del T6SS, se utilizó

el kit Promega Citotox 96, el cual mide la concentración de la enzima LDH liberada al

medio de cultivo, la cual sólo es liberada de la célula al producirse procesos de lisis o

Figura 8. Viabilidad de células RAW 264.7 tras 20

horas de infección. Se infectaron macrófagos con

distintas cepas de S. Gallinarum y S. Enteritidis. Se

evaluó la viabilidad de las células infectadas

mediante conteo en cámara de Neubauer tras 20

horas de infección. Se calculó el porcentaje relativo

de sobrevida a partir de la viabilidad de los

macrófagos sin infectar para cada ensayo. Se

muestra el promedio de tres experimentos

independientes. Las barras representan el error

estándar.

33

necrosis celular. Se realizaron ensayos de sobrevida en macrófagos RAW 264.7 de las

cepas en estudio, y a las 20 horas de infección se tomaron alícuotas del medio de cultivo

para la medición. Como se muestra en la Figura 9, no hubo diferencias en la lisis de los

macrófagos infectados por las cepas silvestres y mutantes de S. Enteritidis y S.

Gallinarum. Por ende, los genes de SPI-19 y el T6SS codificado en esta isla no tendrían

un rol citotóxico hacia macrófagos murinos.

3.5. El T6SS de S. Gallinarum se expresa al interior de macrófagos.

3.5.1. Construcción de la fusión traduccional vgrG::GFP.

Para estudiar si el T6SS de S. Gallinarum se expresa dentro de macrófagos se

realizó una fusión de la proteína VgrG con la proteína verde fluorescente (GFP) mediante

el método descrito por Gerlach y colaboradores (2007). VgrG fue escogida ya que la

expresión de esta proteína se encuentra normalmente apagada en cultivo en CL (Blondel,

resultados no publicados). Además, debido a que otras proteínas VgrG poseen

extensiones C-terminales, la adición de GFP en esta región de VgrG de S. Gallinarum

Figura 9. Análisis de la citotoxicidad de cepas

de S. Enteritidis y S. Gallinarum. Se evaluó la

citotoxicidad de distintas cepas mediante la

medición de la liberación de la enzima LDH al

medio de cultivo. Se infectaron macrófagos con

las cepas indicadas y se tomaron muestras del

sobrenadante tras 20 horas de infección. Se

presenta el promedio de cuatro experimentos

independientes realizados en cuadruplicado. Las

barras representan el error estándar.

34

probablemente no afectaría la actividad normal de este componente del T6SS. Para

obtener la proteína de fusión, se insertó el gen para el fluroróforo GFPmut3 mediante

recombinación homóloga en el extremo C-terminal de la proteína VgrG (Figura 10A).

Para esto se amplificó el gen de GFPmut3 y el cassette de resistencia a Kanamicina

(aminglicósido 3’-fosfotransferasa, aph) con partidores con una extensión homóloga a la

zona a mutar. El producto obtenido se transformó en una cepa de S. Gallinarum que

posee el plasmidio pKD46. Este producto recombina con el gen vgrG presente en el

cromosoma gracias a la acción de la recombinasa presente en el plasmidio pKD46, dando

como resultado la fusión GFP en la zona 3' del gen. Las mutantes recombinantes se

seleccionaron por resistencia a Kanamicina.

Figura 10. Construcción de la fusión vgrG::GFP. A) Esquema representativo de los productos

utilizados para la construcción de la fusión. 1) Diagrama del proceso de amplificación del gen para

GFP y cassette de resistencia a Kanamicina a partir del plasmidio p3174 2) Producto PCR

obtenido para la mutación. 3) Contexto genético del gen vgrG en SPI-19. 4) Contexto genético

luego de la recombinación. B) PCR de comprobación de la mutación. El carril 1 corresponde a la

cepa silvestre, y el resto de los carriles a clones seleccionados del proceso de mutación.

A B

35

Se realizó un PCR de colonias para detectar aquellas que tuvieran la inserción en

el lugar correcto del genoma. Como se muestra en el diagrama (Figura 10A), para el PCR

se utiliza un partidor que alinea con el cassette de resistencia (K1) y otro partidor que

aparea con una zona de la isla SPI-19 (Isx-G). De esta forma se generará producto en

aquellas cepas que contengan la inserción. En la Figura 10B, se muestra un PCR donde

el primer carril corresponde a la cepa silvestre, y el resto de los carriles a mutantes

seleccionadas tras la mutagénesis. A partir de esto se decidió utilizar el clon del carril 3

para los siguientes experimentos.

3.5.2. La proteína VgrG se expresa a partir de tiempos tempranos de la infección de

macrófagos RAW 264.7

Una vez obtenida la cepa mutante se transformó con el plasmidio pmCherry, el

cual codifica el fluoróforo mCherry, que se expresa de forma constitutiva, permitiendo

visualizar a la bacteria en color rojo. Al observar una muestra de bacterias al microscopio

de epifluoresencia (Figura 11) se aprecia que tras cultivar en CL o tras 45 minutos de

incubación en medio DMEM 10% SFB no hay expresión de la proteína VgrG::GFP. Esto

comprueba que en las condiciones iniciales del ensayo de sobrevida la expresión de este

gen del T6SS se mantiene apagada.

A

36

Se realizaron ensayos de infección de macrófagos adheridos a cubreobjetos de

vidrio, y se fijaron muestras a distintos tiempos de infección. Tal como en los ensayos de

sobrevida, tras los 45 minutos iniciales de internalización se procedió a cambiar el medio

de cultivo por medio de cultivo suplementado con Gentamicina, tras una serie de lavados

con PBS con Gentamicina. De esta manera, todas las bacterias que se observan al

microscopio son aquellas que lograron ser internalizadas por los macrófagos. Como se ve

en la Figura 12, luego de 45 minutos de internalización ya se observó la expresión de la

fusión VgrG::GFP. Además se observan agrupaciones de bacterias sobre los macrófagos.

Este gran número de bacterias puede corresponder tanto a bacterias internalizadas como

a bacterias que han permanecido adheridas tras los lavados. Cuando se observan al

microscopio las bacterias presentes en el medio de cultivo tras los 45 min de

internalización, la mayoría de ellas no presenta fluorescencia verde (Figura 12C). Esto

sugiere que se requiere del contacto entre la bacteria y el macrófago, o de la

internalización, para gatillar la expresión de vgrG.

Figura 11. Emisión de Fluorescencia de la cepa S. Gallinarum vgrG::GFP.

A) Bacteria cultivada en CL durante 2 h, a partir de un pre-inóculo crecido durante la noche.

B) Bacteria incubada 45 min en medio DMEM tras crecimiento de 2 h en CL

A B

37

A partir de las 2 horas de infección sólo se observaron una o dos bacterias por

macrófago, las cuales expresan la proteína quimérica (Figura 13). Este mismo escenario

se repitió a las 20 h de infección (Figura 14). Al tiempo tardío también se pudo apreciar

que las bacterias toman una posición perinuclear, posición característica de la SCV en

esta etapa de la infección.

Figura 12. Emisión de Fluorescencia de la fusión vgrG::GFP al infectar macrófagos RAW

264.7 por 45 min. Se infectaron macrófagos con la cepa de S. Gallinarum vgrG::GFP, y se fijó

la muestra tras 45 min. A) Expresión de la proteína VgrG::GFP, del fluoróforo mCherry y

marcación del núcleo de los macrófagos. B) Expresión de la proteína VgrG::GFP y microscopía

de contraste de la muestra. C) Medio de cultivo tras los 45 min de infección. La mayoría de las

bacterias no expresan la fusión.

A

B

C

38

Figura 13. Emisión de Fluorescencia de la fusión vgrG::GFP tras 2 horas de infección de

macrófagos RAW 264.7. Se infectaron macrófagos con la cepa de S. Gallinarum vgrG::GFP

por 45 min, luego se cambió el medio por uno suplementado con Gentamicina. Tras 2 horas,

las muestras se fijaron. A) Expresión de la proteína VgrG::GFP, del fluoróforo mCherry y

marcación del núcleo de los macrófagos. B) Expresión de la proteína VgrG::GFP y microscopía

de contraste de la muestra.

Figura 14. Emisión de Fluorescencia de la fusión vgrG::GFP tras 20 horas de de infección

de macrófagos RAW 264.7. Se infectaron macrófagos con la cepa de S. Gallinarum vgrG::GFP

por 45 min, luego se cambió el medio por uno suplementado con Gentamicina. Tras 20 horas, las

muestras se fijaron. A) Expresión de la proteína VgrG::GFP, del fluoróforo mCherry y marcación

del núcleo de los macrófagos. B) Expresión de la proteína VgrG::GFP y microscopía de contraste

de la muestra.

A

B

A

B

39

3.7. Los genes codificados en SPI-19 no participan de la invasión de células HeLa

Debido a que ha sido reportado que otros T6SS están involucrados en procesos

de invasión celular, se probó si las mutantes presentaban una invasividad disminuida en

un modelo de invasión de células epiteliales. Para esto se utilizó la línea celular HeLa, ya

que es una de más utilizadas para estudiar la invasión bacteriana de células epiteliales in

vitro. Como se muestra en la Figura 15, tanto para S. Enteritidis como para S. Gallinarum

se demostró que no hay un rol del T6SS u otros genes de SPI-19 en el proceso de

invasión.

Se estudió también la expresión de la proteína de fusión en un modelo de invasión

de células HeLa. Pese a que el T6SS no demostró un efecto sobre la invasión, no se

podía descartar un posible efecto en los procesos de sobrevida y proliferación intracelular.

Las células HeLa se fijaron después de 8 post-invasión. Como se observa en la Figura

16, en algunos campos aislados se detectaron bacterias que expresaban la proteína de

fusión, lo que indicaría una posible función del T6SS en la sobrevida bacteriana al interior

Figura 15. Porcentaje de invasión en células HeLa

por cepas de S. Enteritidis y S. Gallinarum. Se

infectaron células HeLa con cepas de S. Enteritidis y S.

Gallinarum durante 30 min y luego se cambió el medio

por uno suplementado con Gentamicina. Se recuperaron

las bacterias intracelulares tras una hora de cultivo en

Gentamicina. Se calculó el porcentaje de invasión

respecto a la cantidad de bacteria inoculada por cada

pocillo. Se presentan resultados de tres experimentos

independientes realizados en triplicado. Las barras

representan el error estándar.

40

de células epiteliales, o que el estímulo que induce la expresión es común en ambos

modelos celulares.

Figura 16. Emisión de Fluorescencia de la fusión vgrG::GFP tras 8 horas post-invasión

de células HeLa. Se infectaron células HeLa con la cepa de S. Gallinarum vgrG::GFP por 45

min, luego se cambió el medio por uno suplementado con Gentamicina. Tras 8 horas, las

muestras se fijaron. A) Expresión de la proteína VgrG::GFP, del fluoróforo mCherry y

marcación del núcleo de las células HeLa. B) Expresión de la proteína VgrG::GFP y

microscopía de contraste de la muestra.

A

B

41

4. DISCUSIÓN

El sistema de secreción tipo VI (T6SS) es un sistema de inyección de proteínas

recientemente identificado y al igual que otros sistemas de secreción bacterianos, juega

un rol en la translocación de efectores protéicos desde la bacteria a las células blanco del

hospedero infectado (Pukatzki y cols, 2006). Este sistema participa en una gama de

procesos relacionados con patogenicidad y su función varía de especie a especie, a

veces encontrándose similitud de función dentro de los distintos grupos filogenéticos en

los cuales se encuentra clasificado. En esta memoria se estudió la contribución que

otorga el T6SS codificado en la isla de patogenicidad 19 de Salmonella enterica (SPI-19)

a la sobrevida intracelular y citotoxicidad hacia la línea celular de macrófagos RAW 264.7.

Dentro de los distintos serotipos que poseen esta isla analizamos el comportamiento de

los serovares Gallinarum y Enteritidis.

Los resultados indican que el T6SS de SPI-19 cumple un rol en la sobrevida de S.

Gallinarum a tiempos tardíos de infección, ya que la deleción de un gen estructural del

sistema de secreción (clpV) o la deleción de posibles efectores (hcp2, vgrG) produce una

disminución de la capacidad de sobrevivir al interior de macrófagos murinos.

Consecuentemente, el fenotipo silvestre se recupera cuando se complementa la deleción

del gen clpV, ATPasa que cumpliría un rol esencial en el ensamblaje del sistema. Estos

resultados representan una evidencia genética de que este sistema de secreción es

funcional y que participa en el proceso de infección de macrófagos. Inesperadamente, las

cepas mutantes en genes puntuales de SPI-19 exhibieron una sobrevida menor que la

cepa mutante para la isla completa. Esto podría explicarse debido a que la remoción de

un sólo gen podría generar tanto una pérdida de función del sistema como un estrés

42

debido al desbalance o acumulación de los componentes protéicos del sistema, muchos

de los cuales se unirían a la membrana citoplasmática. En S. Enteritidis, que posee una

SPI-19 truncada, la deleción de la isla no generó un efecto claro en la sobrevida, lo cual

sugiere la necesidad de un T6SS íntegro y funcional, y no sólo la presencia de algún

efector para generar el fenotipo visto en macrófagos.

Sorpresivamente, los resultados de este trabajo demuestran que el T6SS de SPI-

19 no participa en procesos de muerte celular o de citotoxicidad en el modelo estudiado,

efecto que sí ha sido descrito para otros T6SS genéticamente emparentados, como los

presentes en Vibrio cholerae y Aeromonas hydrophila (Pukatzki y cols., 2007, Suárez y

cols., 2010). Esto puede deberse, en parte, a la ausencia de una extensión C-terminal en

la proteína VgrG, característica que poseen ciertas bacterias con T6SS citotóxicos. No se

puede descartar, de todas maneras, que otras proteínas de función desconocida

codificadas en la SPI-19 puedan acoplarse o ser secretadas al T6SS produciendo otros

efectos. El estudio comprensivo, mediante herramientas genéticas y bioquímicas, de los

genes presentes en la isla podría a futuro evidenciar la presencia de otros efectores y

posibles funciones del sistema de secreción.

Estudios de nuestro laboratorio han demostrado que el T6SS codificado en SPI-19

tiene un rol en la infección in vivo de pollos White Leghorn (Blondel y cols., resultados no

publicados) Particularmente, mutantes en el gen clpV o en la isla completa presentan una

colonización disminuida del íleo, la ceca, hígado y bazo. En esta memoria demostramos

que la mutación en clpV no afecta la invasión de células epiteliales HeLa, por lo cual el

defecto en la colonización de las cepas mutantes no se podría atribuir a una deficiencia en

la invasión celular. Diversos reportes indican que la colonización del tejido intestinal en el

43

modelo aviar por S. Gallinarum sucede de forma distinta al de los modelos mamíferos de

infección. Puntualmente, se propone que S. Gallinarum, que es un serovar

particularmente hipoinvasivo, ingresaría al lumen intestinal gracias a la acción fagocítica

del tejido linfático asociado al intestino (en inglés, GALT) y no por su capacidad de invadir

células (Lowry y cols., 1999; Barrow y cols., 2000). Consecuentemente, mutantes de S.

Gallinarum en la isla SPI-1, donde se encuentran codificados los genes requeridos para la

invasión celular, son capaces de colonizar los tejidos del ave de forma similar a la cepa

silvestre. En cambio, la acción de los genes de la isla SPI-2, involucrados en la sobrevida

intracelular, es indispensable para la colonización de la ceca, hígado y bazo, y posterior

establecimiento de la tifoidea aviar (Jones y cols., 2001). Nuestros resultados en este

trabajo indican la importancia del T6SS para la sobrevida a tiempos tardíos en células

fagocíticas. Un impedimento en la funcionalidad de este sistema en el modelo in vivo se

podría ver reflejado en una sobrevida disminuida en el tejido linfático, generando la

consecuente colonización deficiente del tejido gastrointestinal y otros órganos internos

observada en la infección de pollos.

¿Cuál es el efecto a nivel molecular que estaría generando el T6SS para permitir

una mejor sobrevida de S. Gallinarum? Para evaluar las posibilidades, hay que analizar

los procesos a los cuales se enfrenta la bacteria desde el momento de su entrada al

macrófago y la temporalidad de estos. Algunos de los primeros eventos que debe evadir

la bacteria tras ser internalizada a la vacuola que contiene Salmonella (SCV) es el

estallido oxidativo, generado por la acción de las enzimas NADPH oxidasa e iNOS.

Posteriormente ocurre la acidificación de la vacuola por la acción de la vATPasa. Luego

de 3 a 4 horas, las bacterias que han sobrevivido deben modificar la vacuola, para que

ésta sea un lugar apto para la replicación. Esto lo logran primero modificando la

44

localización subcelular de la vacuola a una zona perinuclear, donde luego se produce el

remodelamiento mediante fusión a vesículas de la ruta exocítica de la célula infectada

(Brumell y cols. 2004, Bakowski y cols., 2008). Los procesos tardíos, posteriores a la

sobrevida y proliferación inicial de Salmonella al interior de los macrófagos, son bastante

menos entendidos. Los mecanismos por los cuales la bacteria persiste tiempos largos

dentro de macrófagos y posteriormente escapa de éstos para proceder a la colonización

de órganos blanco, no se comprenden a cabalidad. Se sabe que efectores secretados por

el sistema de secreción tipo III de la SPI-2 pueden causar una serie de procesos de

muerte celular programada en la célula infectada, tales como apoptosis, piroptosis y

autofagia (Fink y Cookson, 2007; Birmingham y cols., 2006). También se ha descrito

recientemente un nuevo tipo de muerte gatillada por Salmonella, llamado oncosis en el

cual las células fagocíticas pasan por un proceso de hinchazón y posterior lisis, lo que

permitiría el escape de la bacteria (Sano y cols., 2007). Los T6SS de otras bacterias han

sido extensivamente relacionados con procesos tardíos al interior de macrófagos: en

Francisella tularensis el T6SS participa en la replicación intracelular y escape del

fagosoma (Barker y cols., 2009), en Burkholderia mallei mutantes en componentes del

T6SS presentan una proliferación disminuida a tiempos tardíos y perturbaciones en la

movilidad intracelular tras escapar del fagosoma (Burtnick y cols., 2010) y en Edwardsiella

tarda, mutantes en este sistema presentan una proliferación disminuida en órganos

inmunes (Wang y cols., 2009). El T6SS de SPI-19 podría estar cumpliendo un rol similar,

ya sea en la proliferación intracelular, en el escape del fagosoma o del macrófago mismo.

Lamentablemente, el modelo de estudio utilizado en este trabajo no permite diferenciar si

este sistema contribuye a la sobrevida o a la proliferación de Salmonella o ambos

procesos, sino sólo permite evaluar la cantidad neta de bacterias presentes al interior del

macrófago. En el caso del escape del fagosoma, Salmonella es reconocidamente un

45

patógeno de vida vacuolar y no citosólica. Sin embargo, reportes recientes han cambiado

este paradigma, mostrando que ciertas poblaciones vacuolares de Salmonella son

capaces de escapar y vivir en el citosol. Sin embargo, esto sería sólo beneficioso para la

bacteria al ocurrir en una célula epitelial, donde el citoplasma es un lugar apto para la

replicación. En el caso del macrófago, el citoplasma es un ambiente inhóspito y

bactericida (Bakoswki y cols., 2008).

Otro proceso en el cual podría participar la bacteria es en la perturbación de la

respuesta inmune e inflamatoria. Si analizamos la acción de otros T6SS filogenéticamente

emparentados, como aquellos contenidos dentro del grupo D de la clasificación de Bingle,

aparte del comportamiento citotóxico hacia macrófagos, se ha demostrado una

perturbación de los procesos inflamatorios y de la liberación de interleuquinas. Por

ejemplo, en el caso de Vibrio cholerae, la infección de ratones con la cepa silvestre

produce inflamación del intestino delgado acompañada de infiltración celular y una alta

expresión de la interleuquina IL-1β. Al mutar la proteína VgrG o su extremo C-terminal,

desaparece el efecto inflamatorio ya que la infiltración celular y la expresión de IL-1 β

disminuye significativamente (Ma y Mekalanos., 2010). Otra bacteria con un T6SS

emparentado, Helicobacter hepaticus, genera una respuesta totalmente contraria. Esta

bacteria está presente normalmente en la microflora intestinal de los mamíferos. La acción

del T6SS de H. hepaticus disminuye los procesos inflamatorios, inhibiendo la expresión de

una serie de interleuquinas y sus receptores en un modelo de células epiteliales. Esto

permitiría a la bacteria colonizar de forma benigna el tracto intestinal, sin ser atacada por

el sistema inmune (Chow y Mazmanian, 2010). A diferencia de otros serotipos de

Salmonella, S. Gallinarum no genera un gran proceso inflamatorio a nivel intestinal,

debido en parte a la ausencia de la proteína constituyente del flagelo, la flagelina. Esta

46

molécula es rápidamente detectada por las células del sistema inmune innato, a través de

receptores de tipo Toll TLR5. Se piensa que esto permite a S. Gallinarum pasar

mayormente indetectada durante el proceso de invasión intestinal, para luego una vez

lograda la colonización sistémica, generar un proceso altamente inflamatorio y nocivo en

los órganos internos del ave. Entonces, un rol pro-inflamatorio para el T6SS de S.

Gallinarum debería ser estudiado en los procesos de colonización de hígado y bazo de

aves.

Mediante ensayos de microscopía de fluorescencia se detectó la expresión de la

proteína VgrG al interior de macrófagos. Pese a que el fenotipo presentado por las

mutantes del T6SS no se observó hasta tiempos tardíos de infección, la expresión de

VgrG es detectable a tiempos muy tempranos de infección, presumiblemente debido al

contacto bacteria-célula eucarionte, o al proceso de internalización de la bacteria por el

macrófago. No es raro que proteínas de los sistemas de secreción se transloquen al

citosol y persistan durante muchas horas ejerciendo su función, como las proteínas

secretadas por el sistema de secreción tipo III de la SPI-2 que cumplen roles en la

localización perinuclear de la SCV (Bakowski y cols., 2008). La expresión del T6SS

debido al contacto célula-célula concuerda con reportes de que los reguladores del

sistema de secreción tipo III de Burkholderia pseudomallei BsaN (homólogo a la proteína

InvF de Salmonella) y BprC (homólogo de la proteína YijO de Salmonella) activan la

expresión del sistema de secreción tipo VI (Wen Sun y cols., 2010). El T3SS-3 de

Burkholderia es homólogo al T3SS de SPI-1 de Salmonella, el cual es requerido para la

invasión celular. Es sabido que el contacto con células epiteliales es suficiente para

gatillar la secreción de efectores de la SPI-1 (Zierler y Galán, 1995), por lo cual este

suceso podría gatillar en consecuencia la expresión del T6SS de SPI-19. Determinar el

47

tiempo preciso de la translocación al citoplasma y el efecto que genera en la célula

infectada la proteína VgrG permitirían acotar los posibles procesos en los cuales

participaría el T6SS durante la infección de macrófagos y otros tejidos. Esto, en

consecuencia, nos permitiría entender de mejor forma el aporte de este sistema de

secreción a los procesos infectivos de S. Gallinarum en el modelo aviar.

Futuros esfuerzos en la investigación del T6SS de SPI-19 deberían apuntar a la

caracterización de otros efectores, la búsqueda de proteínas reguladoras de la expresión,

la determinación de posibles eventos proinflamatorios y el efecto del sistema de secreción

en el desarrollo de tifoidea en el modelo aviar.

48

5. CONCLUSIONES

1. S. Gallinarum y S. Enteritidis son capaces de producir in vitro componentes

del T6SS codificado en SPI-19.

2. El efector del T6SS de S. Gallinarum VgrG se expresa a tiempos tempranos

de infección de macrófagos RAW 264.7 y al invadir células HeLa.

3. El T6SS de S. Gallinarum participa en la sobrevida a tiempos tardíos al

interior de macrófagos RAW 264.7.

4. El T6SS de S. Gallinarum no tiene un efecto de citotóxico hacia macrófagos

RAW 264.7.

5. El T6SS de S. Gallinarum no participa en la invasión de células epiteliales

HeLa.

6. Los genes de SPI-19 de S. Enteritidis no participan en la sobrevida al

interior de macrófagos RAW 264.7, ni tienen un efecto citotóxico hacia

éstos.

7. Los genes de SPI-19 de S. Enteritidis no participan en la invasión de células

epiteliales HeLa.

49

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