Sarró, M. Biología molecular aplicada al biodeterioro. 2010

8/7/2019 Sarr, M. Biologa molecular aplicada al biodeterioro. 2010

1/13

4

Patrimonio Cultural de Espaa

10

Patrimonio e innovacin


2/13

www.mcu.es

www.060.es

Edita: SECRETARA GENERAL TCNICA

Subdireccin Generalde Publicaciones, Informacin y Documentacin

De los textos y las fotografas: sus autoresNIPO: 551-10-081 -7ISSN: 1889-3104

MINISTERIO DE CULTURA


3/13

ngeles Gonzlez-SindeMinistra de Cultura

Mercedes E. del Palacio TascnSubsecretaria de Cultura

ngeles AlbertDirectora General de Bellas Artes y Bienes Culturales

MINISTERIODE CULTURA


4/13

4

4

Patrimonio Cultural de

Espaa

2010

Sumario

REVISTA PATRIMONIO CULTURAL DE ESPAAREVISTA PATRIMONIO CULTURAL DE ESPAA

DIRECTORAlfonso Muoz Cosme

CONSEJO DE DIRECCINMara DomingoAntonio J. SnchezLorenzo Martn

CONSEJO DE REDACCINIsabel ArgerichIrene ArroyoRoco BruquetasSoledad DazGuillermo Enrquez de SalamancaAdolfo GarcaAlberto HumanesConcha MartnMara Jess SnchezAndrs SerranoMara Pa TimnPablo JimnezBlanca SantamarinaCelia Diego

Paloma Ballesteros

COMIT CIENTFICOCaterina Bon ValsassinaDirectora del Istituto Centrale per i l RestauroGiacomo ChiariDirector cientfico de The Getty Conservation InstituteRosa M EsbertCatedrtica de Petrologa de la Universidad de OviedoLuz de Lourdes HerbertCoordinadora Nacional de Conservacin del Patrimonio Cultural.INAH. MXICO DF.Alberto de TagleDirector del departamento de Investigacin del NetherlandsInstitute for Cultural Heritage

PORTADADetalle de un barrido con un equipo de fluorescenc ia de rayos Xen una escultura gnea policromadaFotografa: Toms Antelo

CONTRAPORTADARadiografa de una figura de la Arqueta de Banyoles, Girona. Espaa.Fotografa: Toms Antelo

DISEO GRFICO ORIGINALLeona

MAQUETACINMilk comunicacin

DISTRIBUCIN Y VENTAAbdn Terradas, 7. 28015 MadridTel. 34 91 543 93 66. Fax 34 91 549 34 18

INTERCAMBIOBiblioteca del IPCE.Calle Pintor El Greco, 4. Ciudad Universitaria. 28040 MadridTels. 91 550 44 36 y 91 550 44 39

PVP

28 euros, cada nmero, ms gastos de envo


5/13

57

Biologa molecular aplicada al estudio delbiodeterioro causado por microorganismosy la conservacin de bienes culturalesMara Isabel Sarr MorenoCentro Nacional de Investigacin sobre la Evolucin Humana (CENIEH)[email protected]

Licenciada en Biologa por la Universidad Complutense de Madrid y doctora por la Universidad Politcnica deMadrid. En la actualidad es Gestora Tcnica de Laboratorios en el Centro de Investigacin sobre la EvolucinHumana (CENIEH). Cuenta con un amplio currculo en lo que se refiere al estudio de biodeterioro de Patrimo-nio por tcnicas de biologa molecular participando en diversos proyectos de investigacin junto con el IPCE yotras instituciones, entre los que hay que destacar los estudios de biodeterioro en cuevas con arte rupestre. Co-mo consecuencia de ello ha participado en cursos, congresos y es poseedora de diferentes publicaciones entrelas que se cuenta M. Isabel Sarr et al . (2005). Biodeterioration of the Lions Fountain at the Alhambra Palace,Granada (Spain). Building and Enviroment on line , Septiembre (2005). Clave: A. Microbiologa y biologa mo-lecular aplicada al patrimonio en el IPHE Mara Isabel Sarr Moreno, Irene Arroyo Marcos (2008). Revista Bie-nes Culturales n8,pp 197-210.

Irene ArroyoInstituto del Patrimonio Cultural de Espaa (IPCE)[email protected]

Doctora en Biologa desde 1990. Conservadora Cientfica de Patrimonio desde 1988, ao que ingres en el IPCEdel Ministerio de Cultura hasta la actualidad, anteriormente fue profesora de biologa en el Colegio Universita-rio Cardenal Cisneros y laboral del nivel 1 en el Real jardn Botnico del CSIC. Ha publicado varios artcu los enrevistas nacionales e internacionales entre las que se encuentra The Role of Fungi in the Deterioration of Movi-ble and inmovible Cultural heritage en e-conservation magacine n9 pp.40-50, http//www e-conservationline.COM/content/view/748 2009. Ha impartido numerosos cursos siendo el ms reciente el titulado Estudio cien-tfico de materiales ptros para su conservacin. Biodeterioro de materiales ptreos celebrado en La AntiguaGuatemala en 2010 y, participa en diversos proyectos de investigacin en colaboracin con o tros organismos.

Resumen:Los procesos de biodeterioro estn producidos por la interaccin de seres vivos y los materiales sobre los que sedesarrollan. Los microorganismos juegan un papel primordial en los procesos de biodeterioro ya que pueden en-contrarse casi en cualquier hbitat de la tierra. El patrimonio cultural por tanto tambin est expuesto a la coloni-zacin microbiana. Los mtodos tradicionales de microbiologa, basados en tcnicas de cultivo han proporciona-do importante pero limitada informacin sobre la diversidad microbiana en muestras naturales, siendo las tcni-cas de biologa molecular las que estn aportando nueva informacin y ms completa sobre los microorganismosque estn involucrados en procesos de biodeterioro de patrimonio. El conocimiento de estas tcnicas ha permiti-do disear estrategias para la conservacin y proteccin del patrimonio en beneficio de futuras generaciones. Elpresente artculo describe algunas de las tcnicas punteras que se emplean en este mbito y algunas que puedentener futuras aplicaciones.

Palabras clave:Biologa molecular, biodeterioro, microorganismos, patrimonio cultural, conservacin.

Abstract:The biodeterioration processes are produced by the interaction of organisms and the materials where they deve-lop. Microorganisms play a critical role in biodeterioration processes because we can find us in every kind of habitaton Earth. The cultural heritage is affected by microbial colonization. While classical microbiological methods baseson culturing procedures have provided important, but limited information on the microbial diversity samples, novelmolecular technicques have been extremely valuable, giving us new and more complete information of microbiotainvolved in the biodeterioration of cultural heritage. The knowledge of these techniques have allowed the desing ofstrategies for conserving and protecting the cultural heritage for the benefit of future generations. This review des-cribes the state-of-the-art of application of molecular methods to the analysis of cultural assets and provides near-future perspectives in biodeterioration studies.

Key Words:Molecular Biology, biodeterioration, microorganism, cultural heritage, conservation.


6/13

58

IntroduccinIntroduccin

Las estrategias dirigidas a la conservacin y proteccin de obras de arte y monumentos se estn adaptando r-pidamente a las nuevas tcnicas de biologa molecular especialmente aquellas que pretenden la deteccin demicroorganismos y la identi cacin de los microorganismos que constituyen biopelculas.

La Biologa Molecular es la disciplina cient ca que tiene como objetivo el estudio de los procesos que se desa-rrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular. La biologa molecular concierne principalmente

al entendimiento de las interacciones de los diferentes sistemas de la clula, lo que incluye muchsimas rela-ciones, entre ellas las del ADN con el ARN, la sntesis de protenas, el metabolismo, y el cmo todas esas inte-racciones son reguladas para conseguir un a nado funcionamiento de la clula.

Una biopelcula o bio lm es un ecosistema microbiano organizado, conformado por uno o varios microorga-nismos asociados a una super cie viva o inerte, con caractersticas funcionales y estructuras complejas. Estetipo de conformacin microbiana ocurre cuando las clulas planctnicas se adhieren a una super cie o sus-trato, formando una comunidad, que se caracteriza por la excrecin de una matriz extracelular adhesiva pro-tectora. Una biopelcula puede contener aproximadamente un 15% de clulas y un 85% de matriz extracelu-lar. Esta matriz generalmente est formada de exopolisacridos, que forman canales por donde circulan agua,enzimas, nutrientes, y residuos. All las clulas establecen relaciones y dependencias: viven, cooperan y se co-munican a travs de seales qumicas ( quorum sensing ), que regulan la expresin de genes de manera diferen-te en las distintas partes de la comunidad, como un tejido en un organismo multicelular.

El patrimonio cultural implica a las diferentes obras de arte o monumentos que tienen inters ya sea por suimportancia prehistrica, histrica o social. En muchos casos este patrimonio, como consecuencia del medioambiente al que est expuesto puede sufrir alteraciones asociadas al paso del tiempo y que podemos enume-rar como procesos fsicos, qumicos y biolgicos. El ltimo de estos factores es al que hace referencia el biode-terioro, y la presencia de diversos organismos (organismos macroscpicos y/o microscpicos) sobre las super- cies de los elementos de patrimonio a conservar generarn a su vez alteraciones fsico y/o qumicas relacio-nadas directamente con su metabolismo y/o crecimiento.

Arriba.rbol filogentico de las formas de vida basado en la subunidad menor del gen que codifica para el ARN ribosmico (ARNr).En el rbol filogentico se remarcan aquellos que incluyen organismos macroscpicos: animales y plantas, mientras que el restode los organismos representados en el rbol son microorganismos.


7/13

59

La clasi cacin actual de las formas de vida basadas en el ADN de la subunidad menor del ribosoma, ha per-mitido dividir el mundo viviente en tres grandes dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. Si observamos la ima-gen anterior vemos que la mayora de los seres son unicelulares, es decir, se engloban dentro de los que sonmicroorganismos. Slo dos pequeas ramas superiores del rbol estn representadas por organismos multi-celulares y macroscpicos, que seran las plantas y los animales.

Frente a la gran diversidad y versatilidad metablica que presentan los microorganismos, se debe destacarla elevada diversidad espec ca o de microorganismos diferentes que existe en nuestro planeta y su ubicui-

dad. Por esta razn y por la necesidad de comprender cmo afecta al deterioro de nuestro patrimonio, laidenti cacin de microorganismos involucrados en estos procesos es el primer y necesario paso para enten-der el efecto de la presencia de stos sobre los diversos recursos culturales. El segundo paso consistira en di-lucidar las propiedades funcionales de esos microorganismos y si juegan algn papel en los procesos de de-terioro. El tercer y ltimo paso consistira en la utilizacin de la informacin recopilada para concebir estra-tegias para conservar y proteger las obras de arte o monumentos de la colonizacin microbiana y los efec-tos que producen.

La estrategia seguida para el estudio del biodeterioro aplicado, que persigue el conocimiento de las poblacionesmicrobianas en el patrimonio histrico-artstico, ha sido, como en otros contextos, la utilizacin de tcnicas mi-crobiolgicas tradicionales, que incluyen el aislamiento de las poblaciones microbianas y su cultivo en laborato-rio. Estas tcnicas tienen la ventaja de poder obtener algunos cultivos puros en laboratorio, lo que permite estu-diar las propiedades metablicas individualizadamente y determinar el papel de ese organismo en los procesosde biodegradacin y/o bioprecipitacin. No obstante, los mtodos tradicionales cuentan con una serie de des-ventajas, entre ellas que tan slo una pequea parte (incluso menos del 1% de la poblacin) de los microorganis-mos pueden ser cultivados. Esto es debido a que en muchos casos las condiciones ptimas de crecimiento de losmicroorganismos, especialmente los ambientales que son los que nos interesan, incluyendo sus requerimien-tos nutricionales son desconocidos. A ello se le suma el elevado porcentaje de microorganismos, que formandoparte de comunidades naturales se encuentran en estado inactivo o con una actividad metablica limitada (DE-LONG, 2001; HUGENHOLTZet alli , 1998; WARDet alli , 1990). Gran nmero de estudios proponen salvar estas li-mitaciones mediante la aplicacin de tcnicas independientes de cultivo que permiten detectar esos microorga-nismos en muestras naturales.

Estas tcnicas independientes de cultivo nos vuelven de nuevo al concepto de Biologa Molecular, porque sonestas tcnicas las que se vienen empleando con xito para la deteccin de microorganismos en ambientes na-turales. Algunas de estas tcnicas estn basadas en ladeteccin de cidos nucleicos, teniendo en cuenta laespeci cidad del cdigo gentico, el anlisis de las se-cuencias de ADN o ARN de los microorganismos nospermitir la diferenciacin de un organismo dentrode una comunidad compleja compuesta por varioscientos de microorganismos diferentes. Este tipo deestudios ha revelado que la diversidad microbiana enla Tierra es mucho mayor que lo que previamente secrea (LAIZet alli , 2003; HUGENHOLTZet alli , 1998;WARDet alli , 1990). Como consecuencia, el conoci-miento actual de la enorme diversidad microbiana

que interviene en los procesos de alteracin del pa-trimonio ha desplazado a la visin clsica de que slounos pocos microorganismos eran los causantes delbiodeterioro de obras de arte o monumentos y ellosirve y servir de ayuda para disear estrategias paracontrolar la colonizacin microbiana y de conserva-cin preventiva (GONZLEZ y SAIZ-JIMNEZ, 2008;SARRet alli , 2008).Una vez visto el potencial deluso de las tcnicas de Biologa Molecular se pretenderealizar una enumeracin y explicacin de las diver-sas tcnicas que se estn empleando para el estudiodel biodeterioro del patrimonio cultural y las posibles

perspectivas futuras.

Abajo. Figura 2. Principio de la reaccin en cadena de la poli-merasa (PCR) detallando los pasos que intervienen en la re-accin. Paso 1. Desnaturalizacin de la doble cadena de ADNmediante el incremento de la temperatura a 90-95C. Pa-so 2. Hibridacin de los cebadores y las cadenas de ADN se-paradas. La temperatura de hibridacin puede variar en fun-cin de la especificidad de reaccin que se quiera conseguirentre 40-70C. Paso 3. Extensin de las cadenas de ADN enformacin por la enzima Taq-polimerasa (temperatura habi-tual 72C). Estos tres pasos se repiten en un nmero de cilosdeterminado que suele ser de 35 ciclos, con ello se consigueproducir mltiples copias del ADN de partida.


8/13

60

Tcnicas de anlisis de cidos nucleicosTcnicas de anlisis de cidos nucleicos

El desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) a principios de los aos ochenta ha revolucio-nado la investigacin biolgica. Los cebadores (o primers ) son oligonucletidos sintticos que se unen espe-c camente a sitios seleccionados del ADN permitiendo a la enzima Taq-polimerasa la replicacin en presen-cia de dNTPs. Dado que la replicacin se realiza siempre en la misma direccin de la cadena de ADN (del ex-tremo 5 al 3) se requiere un cebador diferente para cada cadena. stos se conocen como cebadores forward (F) yreverse (R).

La capacidad para ampli car espec camente partes del genoma posibilita la produccin de sondas gnicas para de-tectar gneros y especies microbianas y sus actividades. La manipulacin de la secuencia de los cebadores y/o de lascondiciones de hibridacin en la PCR nos permite cambiar su especi cidad haciendo posible que un mismo ceba-dor nos sirva para detectar un grupo general de organismos o que por el contrario limitemos los microorganismos

detectados. Se pueden emplear cebadores para genes del ribosoma bacteriano, (generalmente de la subunidad 16Sen procariotas y la 18S en eucariotas, en hongos tambin se emplean los ITS) para determinar de qu organismo setrata o nos permitir realizar anlisis logenticos, para detectar genes de la lipasa y detectar organismos capaces dedegradar grasas, para detectar genes de la celulasa e identi car microorganismos implicados en la degradacin de lacelulosa y as un sinfn de posibilidades en funcin de nuestro objetivo. La deteccin del ARNm en las clulas, en lu-gar del ADN, nos permite saber si los genes estn activos y determinar que organismos estn interviniendo realmen-te en procesos de biodeterioro por ejemplo, para ello se emplea la denominada RT-PCR (transcriptasa inversa-PCR).

Una de las principales ventajas, con respecto a los mtodos tradicionales, es que una pequea muestra (


9/13

61

mo de conformacin de cadena sencilla) (SCHEERERet alli , 2009; SUIHKOet alli , 2007) y como la DGGE (elec-troforesis en gel con gradiente desnaturalizante) (LANDYet alli , 2008), han demostrado la presencia de orga-nismos desconocidos hasta la fecha en materiales afectados de biodeterioro.

Una vez se haya identi cado una regin espec ca del ADN (sonda) para un nuevo organismo se puede apli-car la tcnica de FISH (hibridacin in situ con sondas uorescentes) para visualizar las clulas en su hbitatnatural y observar su distribucin dentro de una biopelcula (CAPITTELLIet alli , 2007; MLLERet alli , 2001),por ejemplo.

La identi cacin a nivel de gnero o especie se puede lograr idealmente mediante la determinacin de basesde la secuencia de ADN ampli cado, por secuenciacin del ADN y posterior comparacin con las secuenciasdepositadas en la base de datos pblica del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), a su vez, podemos deposi-tar nuestras secuencias. Uno de los problemas de estas bases es que son limitadas y que en muchos casos, es-pecialmente de hongos y cianobacterias, an no son lo su cientemente completas, aun as representan unaherramienta muy til en el estudio e identi cacin de miscroorganismos.

Nuevas estrategias relacionadas con tcnicas de anlisis de cidos nucleicosNuevas estrategias relacionadas con tcnicas de anlisis de cidos nucleicos

En la conservacin de patrimonio, en muchos casos como se ha apuntado anteriormente, el tamao de mues-tra que puede ser obtenido para los anlisis es muy pequeo y el empleo de tcnicas no destructivas es la tc-nica deseada siempre que sea posible (URZ et alli , 2003; URZ y LEO, 2001). Estas restricciones han hechoque se desarrollen nuevos mtodos de ampli cacin de fragmentos de ADN. Mientras que en la PCR estn-dar una mnima cantidad de ADN es necesaria, cuando estamos frente a muestras ambientales nos podemosencontrar con el problema de que existen gran cantidad de inhibidores (como los cidos hmicos) que inter- eren en la PCR de manera que en algunos casos no hace posible la ampli cacin. Un primer paso para evi-tar estas interferencias es el uso de kit de extraccin de ADN espec cos que nos retiren los inhibidores, peroen muchos casos, y teniendo en cuenta la poca muestra de la que disponemos esto no da buenos resultados.Por ello se ha desarrollado un procedimiento en dos pasos para la ampli cacin de ADN de muestras natura-les. El proceso cuenta con un primer paso en el que se realiza en una ampli cacin no espec ca usando hex-meros al azar y 29 ADN-polimerasa. En el segundo paso el ADN generado en el paso anterior se emplea co-mo ADN molde para una segunda PCR empleando cebadores espec cos del 16S ARNr. Con ello se ha conse-guido que a pesar de existir inhibidores en la muestra natural obtenida se obtengan mejores resultados quecon la tcnica tradicional.

Arriba. Desarrollo del procedimiento en dos pasos para la amplificacin de ADN de muestras naturales. (A) Modificacin delprotocolo estndar. (B) Amplificacin no especfica usando hexmeros al azar y 29 ADN-polimerasa a temperatura constante.(C) Realizacin de PCR habitual, con cebadores especficos empleando como ADN molde el obtenido en el paso B.Fotografa: GONZLEZet alli, 2005.


10/13

62

ClonacinClonacin

La clonacin en trminos de biologa molecular no es ms que la obtencin de mltiples copias de secuen-cias de ADN, en este caso la diferencia con la PCR es que el ADN se inserta en una clula husped medianteel empleo de vectores que son plsmidos, y la clula husped es la encargada de realizar las mltiples copiasde ese ADN. Esta tcnica tiene interesantes aplicaciones en el estudio logentico de comunidades microbia-nas aplicado al estudio de biodeterioro de patrimonio (Sarr et alli, 2006; Schabereiter-Gurtner et alli, 2001).

Anlisis de comunidadesAnlisis de comunidadesEl biodeterioro hace referencia a la interaccin entre los organismos vivos y los materiales a los que generanel dao localizados en ambientes naturales. La importancia del anlisis de estas comunidades en su conjunto,como se ha hecho en algunos de los ejemplos citados en el apartado anterior, se debe a que los organismos nose encuentran aislados en la naturaleza sino formando parte de comunidades complejas.

Otras tcnicas que han abordado este anlisis son tcnicas de anlisis de cidos grasos de fosfolpidos de mem-brana. Esto se realiza mediante cromatografa de gases y espectrometra de masas (GC-MS), dndonos informa-cin sobre las cantidades y tipos de microorganismos presentes en una comunidad. Las llamadas huellas de ci-dos grasos, permiten la deteccin cuantitativa de grupos espec cos de microorganismos en una muestra am-biental. Sin embargo, las tcnicas de extraccin y separacin son bastante tediosas y an no se han determinadolos marcadores de cidos grasos fosfolipdicos (PLFA) para todos los grupos de organismos causantes de deterioro.

Si se dispone de las tcnicas de ampli cacin de ADN por PCR se puede estudiar mediante mtodos de anlisis co-mo la DGGE antes mencionada o la TGGE (electroforesis en gel con gradiente de temperatura). Ambas tcnicas per-miten la separacin de fragmentos de ADN con misma longitud y diferente secuencia de bases en un gel de poliacri-lamida. La concentracin de reactivos desnaturalizantes (formamida y urea), en el primer caso, y la variacin de latemperatura en el segundo caso har que las dos hebras de ADN se separen en el gel en funcin de su secuencia debases. Se evita la separacin completa de las dos hebras durante su migracin en el gel mediante una cola GC quese incluye en el proceso de PCR en uno de los extremos del ADN ampli cado. As, el ADN total de una poblacin am-biental, puede ampli carse empleando un par de cebadores y el ADN ampli cado de los diferentes organismos pre-sentes puede separarse en funcin de su secuencia de bases en un gel de DGGE/TGGE (PEPEet alli , 2010; PIARet alli, 2009). Las bandas separadas en el gel pueden cortarse y emplear ese ADN, que pertenecer a un microorganis-

mo de poblacin mixta de partida, para ampli carlo y se-cuenciarlo o clonarlo si es necesario. Todo ello permiterealizar una determinacin rpida de la diversidad, e in-cluso en algunos casos de las identidades de algunos deestos microorganismos. La comparacin de las secuen-cias obtenidas en las bases del NCBI y su estudio loge-ntico puede indicarnos el grado de relacin existenteentre los organismos que tenemos en la comunidad y surelacin con otros organismos.

El anlisis mediante enzimas de restriccin se basa enel uso de enzimas que reconocen secuencias espec casdel ADN y cortan este por esos puntos. El ADN proceden-

te de una muestra ambiental tratado con enzimas de res-triccin dar lugar a fragmentos de restriccin de diferen-te tamao y en diferente cantidad que pueden ser visuali-zados mediante electroforesis en gel. Este patrn de ban-das nos permite diferenciar entre diferentes poblaciones.Un mtodo derivado de este es el anlisis de polimor s-mos en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP,Restriction fragment Lenght Polymorphism ) (KANGet alli ,2010; DUPONTet alli , 2006). En todos los casos estos m-todos pueden resultar difciles de interpretar.

Las diversas actividades de la comunidad microbia-

na se pueden investigar mediante el aislamiento y la

Abajo.Esquema del protocolo seguido para la obtencin decopias de ADN mediante la tcnica de clonacin a travsdel uso de plsmidos.


11/13

63

ampli cacin del ARNm presente (o del ARN total).En este caso el uso de microarrays de ADN es proba-ble que pueda ser de gran utilidad. Los microarraysson conjuntos ordenados de diversas sondas de ADN jadas a una super cie pequea (el microchip), demanera que en un microchip podemos fijar hasta90.000 sondas. Esta tcnica se est empleando pa-ra caracterizar la estructura y funcin de comunida-

des complejas (FRIEND y STOUGHTON, 2002) y po-dran tener un gran potencial en el estudio del bio-deterioro.

Sondas de cidos pptido-nucleicosSondas de cidos pptido-nucleicos

Los cidos pptido nucleicos (PNA) son compuestosque en algunos aspectos son anlogos a los oligonu-cletidos, pero que di eren en la estructura. En los ci-dos pptido nucleicos, el esqueleto de desoxirribosade los oligonucletidos se ha reemplazado por un es-queleto que tiene enlaces peptdicos. Cada subunidadtiene unida una base natural o no natural. Uno de talesesqueletos se construye de unidades repetidas de N-(2-aminoetil) glicina unidas a travs de enlaces amida.

El PNA se une tanto al ADN como al ARN para formar dplex de PNA/ADN o PNA/ARN. Los dplex de PNAADN o PNA/ARN resultantes estn unidos con mayor a nidad que los correspondientes dplex de ADN/ADNo ADN/ARN, como se demuestra por sus mayores temperaturas de fusin Tm. Adems de aumentar la a ni-dad, tambin se ha demostrado que el PNA se une al ADN con una mayor especi cidad. Los PNA se unen tan-to a ADN de una sola cadena como a ADN de doble cadena. Se ha observado que dos cadenas de PNA se pue-den unir a un ADNdc. Otra ventaja del PNA en comparacin con los oligonucletidos es que su esqueleto depoliamida no se reconoce por nucleasas ni proteasas y, por lo tanto, es resistente a la degradacin enzimtica.

Debido a sus propiedades, se sabe que los PNA son tiles en varias aplicaciones diferentes. Como los PNA tie-nen una unin ms fuerte y una mayor especi cidad que los oligonucletidos, son de gran utilidad como son-das en clonacin, procedimientos de transferencia y en aplicaciones tales como hibridacin in situ con uores-cencia (FISH) (PERRY-OKEEFEet alli , 2001) o en microarrays. Tambin se han usado PNA para detectar mu-taciones puntuales en ensayos basados en PCR ( jacin por PCR).

Su potencial uso para el estudio de biopelculas mediante sondas y FISH puede ser de gran ayuda en el estudiode procesos de biodeterioro de materiales.

ProtemicaProtemica

La comparacin de secuencias de protenas, en vez de ADN, es un enfoque alternativo para la identi cacinde actividades relevantes en los organismos que causan deterioro. La protemica es el estudio a gran escala

de las protenas, en particular de su estructura y funcin. Las protenas son partes vitales de los organismosvivos, ya que son los componentes principales de las rutas metablicas de las clulas. El proteoma es la dota-cin completa de protenas, incluyendo las modi caciones hechas a un conjunto particular de protenas, pro-ducidas por un organismo o sistema. Esto vara con el tiempo y con requisitos diferentes, o debido al estrs,que sufre una clula o un organismo. La descripcin del proteoma permite, por tanto, tener una imagen din-mica de todas las protenas expresadas, en un momento dado y bajo determinadas condiciones concretas detiempo y ambiente. El estudio y comparacin sistemticos del proteoma en diferentes situaciones metabli-cas permite identi car aquellas protenas cuya presencia, ausencia o alteracin se correlaciona con determi-nados estadios siolgicos y nos permite conocer la actividad celular en ese momento. Dichas protenas se co-nocen con el nombre genrico de biomarcadores. Slo se necesita conocer la secuencia del sitio activo de laenzima para obtener un resultado apasionante, que indique que un organismo aislado de una muestra parti-cular tiene la informacin gentica necesaria para degradar un determinado sustrato (KUCKOVA et alli , 2009

a y b). Los COG (conjuntos de grupos ortlogos de protenas) codi cados en los genomas de varios microorga-

Arriba.Imagen de un gel de DGGE con muestras ambientales en laque est representado el gradiente de formamida y urea emplea-do (30-60%). Cada banda del gel indica una secuencia de ADNdiferente (Tm1, Tm 2, y Tm 3, en el ejemplo del la ilustracin). Suposicin en el gel depender de su secuencia de nucletidos y sutemperatura de fusin (Tm:melting temperature ). Las bandasque aparecen en la zona de mayor gradiente de desnaturaliza-cin son hebras de ADN que se han abierto por completo y que-dan retenidas en el gel por la cola GC que impide que la doble he-bra se abra completamente y disminuyen drsticamente su mo-vilidad electrofortica en el gel.


12/13

64

nismos representan rutas funcionales, tales como los de reparacin de ADN o transporte de iones y se puedenencontrar en las bases de datos pblicas del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG).

La protemica es una ciencia relativamente reciente. Para su despegue de nitivo, ha sido necesaria la consoli-dacin de nitiva de la espectrometra de masas como tcnica aplicada al anlisis de molculas biolgicas y elcrecimiento exponencial en el nmero de entradas correspondientes a genes y/o protenas en las bases de da-tos. Esto, combinado con el empleo de potentes mtodos de fraccionamiento y separacin de pptidos y pro-tenas como el 2D-PAGE (electroforesis de poliacrilamida de dos dimensiones) (KANGet alli , 2009) y la croma-tografa lquida de alta resolucin (HPLC), ha permitido consolidar la protemica, desde mediados de los aosnoventa del siglo pasado, como ciencia para el anlisis masivo de protenas.

Perspectivas y estrategias futurasPerspectivas y estrategias futuras

Las tcnicas de biologa molecular se estn adaptando rpidamente a las estrategias planteadas desde el mbi-to de la proteccin del patrimonio. Los mtodos moleculares han revelado la enorme diversidad existente. Ac-tualmente 52 divisiones de bacterias (excluyendo las arqueobacterias) han sido descubiertas, 26 de las cualesslo han podido determinarse por tcnicas moleculares. En muchos casos hay depositadas en las bases de da-

tos pblicas mltiples secuencias de un mismo gnero de las cuales tan slo unas pocas han podido ser descri-tas taxonmicamente. Considerando que las tcnicas de cultivo an son requeridas para el estudio de la sio-loga y metabolismo celular, es fcil entender la complementariedad de las dos aproximaciones. La combina-cin de las tcnicas de biologa molecular y las de microbiologa tradicional lejos de hacerse competencia cola-boran en un mismo objetivo, facilitar el estudio de las comunidades microbianas naturales, incluyendo aque-llas que estn involucradas en procesos de biodeterioro del patrimonio. Todo ello contribuir de forma deci-siva a lo largo de los prximos aos al desarrollo de estrategias para la conservacin de nuestro patrimonio.

Bibliografa

CAPPITELLI, F.; PRINCIPI, P.; PEDRAZZANI, R.; TONIOLO, L. y SORLINI, C. (2007): Bacterial and fungal deterioration of the MilanCathedral marble treated with protective synthetic resins, Science of The Total Environment , 385(1-3): 172-181.

Arriba.(A) Esquema del proceso de produccin de microarrays. (B) Esquema del procedimiento de uso de los microarrays.


13/13

65

DE PAOLIS, M.R. y LIPPI, D. (2008): Use of metabolic and molecular methods for the identi cation of a Bacillus strain isolated frompaper affected by foxing, Microbiological Research , 163(2): 121-131.

DELONG, E.F. (2001): Microbial seascapes revisited,Current Opinion in Microbiology , 4: 290-295.

DUPONT, J.; DENNETIRE, B.; JACQUET, C.L. y ROQUEBERT, M.-F. (2006): PCR-RFLP of ITS rDNA for the rapid identi cationnicillium subgenus Biverticillium species,Revista Iberoamericana de Micologa , 23(3): 145-150.

FRIEND, S. y STAOUGHTON, R.B. (2002): The magic of microarrays,Scienti c American , 286: 34-41.GONZALEZ, J.M.; PORTILLO, M.C. y SAIZ-JIMENEZ, C. (2005): Multiple displacement ampli cation as a pre-PCR reaction to procdif cult to amplify samples and low copy number sequences from natural environments, Environmental Microbiology 7:1024-1028.

GONZLEZ, J.M. y SIZ-JIMNEZ, C. (2008): Diversidad microbiana y biodeterioro en la conservacin del Patrimonio. En:La Cien-cia y el Arte. Ciencias experimentales y conservacin del Patrimonio Histrico . Instituto del Patrimonio Histrico Espaol. Ministeriode Cultura. Cap 4: 183-189.

HUGENHOLTZ, P.; GOEBEL, B.M. Y PACE, N.R. (1998): Impact of Culture-independent studies on the emerging phylogenetic viewof bacterial diversity, Journal of Bacteriology , 180: 4765-4774.

KANG, Y.; PREWITT, L.; DIEHL, S. y NICHOLAS D. (2010): Screening of basidiomycetes and gene expression of selected lignin modifying enzymes of Phlebia radiata during biodeterioration of three wood types, International Biodeterioration & Biodegradation InPress, Corrected Proof, Available online 14 July 2010.

KANG, Y.; PREWITT, L. y DIEHL, S. (2009): Proteomics for biodeterioration of wood (Pinus taeda L.): Challenging analysis by 2-DPAGE and MALDI-TOF/TOF/MS,International Biodeterioration & Biodegradation , 63(8): 1036-1044.

KUCKOVA, S.; HYNEK, R. y KODICEK, M. (2009): Application of peptide mass mapping on proteins in historical mortars,Jour-nal of Cultural Heritage , 10(2): 244-247. (a).

KUCKOVA, S.; CRHOVA, M.; VANKOVA, L.; HNIZDA, A.; HYNEK, R. y KODICEK, M. (2009): Towards proteomic analysis of miteins in historical building materials, International Journal of Mass Spectrometry, 284(1-3): 42-46. (b).

LAIZ, L.; GONZALEZ, J.M. y SAIZ-JIMENEZ, C. (2003): Microbial communities in caves: Ecology, physiology, and effects on palythic paintings. In: Koestler R.J., Koestler V.R., Charola A.E., Nieto-Fernandez F.E. (eds)Art, biology, and conservation: Biodeterio-ration of works of art. The Metropolitan Museum of Art , New York pp 210-225.

LANDY, E.T.; MITCHELL, J.I.; HOTCHKISS, S. y EATON, R.A. (2008): Bacterial diversity associated with archaeological waterlogwood: Ribosomal RNA clone libraries and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE),International Biodeterioration & Biode-gradation , 61(1): 106-116.

MLLER, E.; DREWELLO, U.; DREWELLO, R.; WEISSMANN, R. y WUERTZ S. (2001): In situ analysis of bio lms on historic wiglass using confocal laser scanning microscopy. Journal of Cultural Heritage , 2(1): 31-42.

PEPE, O.; SANNINO, L.; PALOMBA, S.; ANASTASIO, M.; BLAIOTTA, G.; VILLANI, F. y MOSCHETTI, G. (2010): Heterotrophorganisms in deteriorated medieval wall paintings in southern Italian churches, Microbiological Research , 165(1): 21-32.

PERRY-OKEEFE, H.; RIGBY, S.; OLIVEIRA, K.; SRENSEN, D.; STENDER, H., COULL, J. y HYLDIG-NIELSEN, J.J. (2001)cation of indicator microorganisms using a standardized PNA FISH method, Journal of Microbiological Methods , 47(3): 281-292.

PIAR, G.; RIPKA, K.; WEBER, J. y STERFLINGER, K. (2009): The micro-biota of a sub-surface monument the medieval chapel St. Virgil (Vienna, Austria),International Biodeterioration & Biodegradation , 63(7): 851-859.

SARR, M.I. y ARROYO, I. (2008): Microbiologa y biologa molecular aplicada al patrimonio en el IPHE, Revista Bienes Cultura-les, 8: 197-210.

SARR, M.I.; GARCA, A.M.; RIVALTA, V. M.; MORENO, D. A. y ARROYO, I. (2006): Biodeterioration of the Lions Fountain at thhambra Palace, Granada (Spain), Building and Environment , 41(12): 1811-1820.

SCHABEREITER-GURTNER, C.; PINAR, G.; LUBITZ, W. y ROLLEKE, S. (2001): An advanced molecular strategy to identify baccommunities on art objects, Journal of Microbiological Methods , 45: 77-87.

SCHABEREITER-GURTNER, C.; PINAR, G.; LUBITZ, W. y ROLLEKE, S. (2001): An advanced molecular strategy to identify bac

communities on art objects, Journal of Microbiological Methods , 45(2): 77-87.SCHEERER, S.; ORTEGA-MORALES, O. y GAYLARDE, C. (2009): Chapter 5: Microbial Deterioration of Stone Monuments,Advan-ces in Applied Microbiology , 66: 97-139.

SUIHKO, M.-L.; ALAKOMI, H.-L.; GORBUSHINA, A.; FORTUNE, I.; MARQUARDT, J. y SAARELA, M. (2007): Characterizatiobic bacterial and fungal microbiota on surfaces of historic Scottish monuments, Systematic and Applied Microbiology , 30(6): 494-508.

URZ, C. y DE LEO, F. (2001): Sampling with adhesive tape strips: an easy and rapid method to monitor microbial colonization onmonument surfaces, Journal Microbiological Methods , 44:1-11.

URZ, C.; DE LEO, F.; DONATO, P. y LA CONO, V. (2003): Study of microbial communities colonizing hypogean monument surfa-ces using destructive and non-destructive sampling methods. In: KOESTLER R., KOESTLER V.H., CHAROLA A.E., NIETO-FERNADEZ F.E. (eds)Art, biology, and conservation: biodeterioration of works of art. The Metropolitan Museum of Art New York , pp 316-325.

WARD, D.M.; WELLER, R. y BATESON, M.M. (1990): 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community, Nature , 345: 63-65.

Sarró, M. Biología molecular aplicada al biodeterioro. 2010

Documents

Transcript of Sarró, M. Biología molecular aplicada al biodeterioro. 2010