SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DE VINOS, CON CAPACIDAD PARA PRODUCIR COMPUESTOS DE...
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TRABAJO FINAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE LICENCIADO EN
BIOTECNOLOGÍA
Universidad Nacional de Tucumán
Facultad de Bioquímica Química y Farmacia
SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DE VINOS, CON
CAPACIDAD PARA PRODUCIR COMPUESTOS DE AROMA.
María Luz CardozoEstudiante
Dra. María Cristina Manca de NadraDirectora
Dra. Fabiana M. SaguirCo-directora
2006
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AGRADECIMIENTOS
A mi Directora de Trabajo Final, Dra. María Cristina Manca de
Nadra, quien me brindó la oportunidad de trabajar bajo su dirección y con
su experiencia y capacidad supo guiarme a lo largo de este trabajo,
brindándome sus conocimientos científicos.
A mi Co-Directora, Dra. Fabiana Saguir, que estuvo siempre
presente brindándome consejos y aportando toda su experiencia y
conocimiento durante este Trabajo.
Al personal docente de la Cátedra de Microbiología General,
porque nunca dudaron en ayudarme, compartiendo sus conocimientos y su
calidez humana conmigo.
A mis queridos compañeros de trabajo final: Daniela, Julieta,
Belén, Matías y Daniel, por su invalorable compañía en aquellos largos días de
ensayos.
A mis queridos padres, que me brindaron su amor incondicional,
sus sacrificios sin desmayos y su aliento permanente a través de estos años
difíciles para que pudiera llegar a ser lo que soy.
A Javier por el amor, comprensión, consejos, compañía y ayuda
incondicional que me brindó a lo largo de estos años.
A mis hermanas Gabriela y Agustina, quienes siempre estuvieron
estimulándome durante todos mis estudios.
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Las investigaciones de este trabajo final dieron lugar a las siguientes
comunicaciones en reuniones científicas
1- V JORNADAS CIENTÍFICAS Y ENCUENTRO DE JÓVENES
INVESTIGADORES, “AUGUSTO PALAVECINO” . TUCUMÁN,
ARGENTINA (2004)
“AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE VINOS DE ESTANTE.”
Cardozo M. L., Saguir F.M. y Manca de Nadra M.C.
2- XXII JORNADAS CIENTÍFICAS DE LA ASOCIACION DE
BIOLOGIA DE TUCUMÁN. TUCUMÁN, ARGENTINA (2005)
“SELECCIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DE VINOS
CON POTENCIALIDADES PARA PRODUCIR COMPUESTOS DE
AROMA.”
Saguir F. M., Cardozo M. L., Manca de Nadra M. C.
3- VI JORNADAS CIENTÍFICAS Y ENCUENTRO DE JÓVENES
INVESTIGADORES, “AUGUSTO PALAVECINO” . TUCUMÁN,
ARGENTINA (2005)
“CARACTERIZACIÓN DE -GLUCOSIDASA Y α-
ARABINOFURANOSIDASA EN CEPAS DE Oenococcus oeni y
Pediococcus pentosaceus AISLADAS DE VINOS.”
Cardozo M. L., Saguir F.M. y Manca de Nadra M.C.
PREMIO: “Primera Mención en el área CIENCIAS APLICADAS”.
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INDICE
Pag.
Generalidades…………………………………………………6-8
Introducción…………………………………………………..10-15
Objetivos……………………………………………………....16-19
Materiales y Métodos…………………………………..…....20-27
Resultados y Discusión...................................................28-72
Conclusiones…………………………………………....…...73-75
Bibliografía……………………………………………….......76-87
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Generalidades
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Características generales de las bacterias lácticas
Las bacterias lácticas (BL) son microorganismos Gram (+), catalasa
(-), inmóviles, no esporulantes (Pardo y col., 1992). No poseen nitrato
reductasa ni citrocromo oxidasa. No licuan la gelatina. No producen indol y
solamente algunas especies hidrolizan fácilmente la caseína. Son
débilmente lipolíticas. Fermentan azúcares produciendo ácido láctico como
principal y a veces único producto final. Poseen requerimientos
nutricionales complejos (Fugelsang, 1997; Jackson, 1994; Manca de Nadra
y col, 2003). Saguir y Manca de Nadra (1997, 2002) demostraron en cepas
de Oenococcus oeni aisladas de vinos argentinos que requieren un
mínimo de cuatro aminoácidos para crecer y que algunas de ellas
requieren 19 aminoácidos.
Tradicionalmente, el hombre ha utilizado las BL para elaborar productos
alimenticios fermentados y para su conservación, heredando por generaciones
la tecnología de la fermentación.
Las BL presentan características especiales que favorecen su uso en la
industria alimenticia: no son patógenas, acidifican rápidamente el medio de
cultivo impidiendo la proliferación de microorganismos patógenos como
Salmonella, Staphylococcus o Pseudomonas, producen sustancias
antimicrobianas y pueden mejorar el valor nutritivo de los alimentos a través de
su actividad proteolítica. Los géneros Streptococcus, Leuconostoc y
Lactobacillus son los más usados en este campo.
- 6 -
Género Lactobacillus
Se presentan en forma de bastones largos y delgados o cortos y curvos,
generalmente agrupados en cadenas. Tienen metabolismo homofermentativo,
con producción de más de 85% de ácido láctico a partir de glucosa o
heterofermentativo, con producción de ácidos láctico, acético y CO. Los
isómeros del ácido láctico producido pueden ser: DL, L(+) o D(-) dependiendo
de la cepa.
Género Pediococcus
Se presentan en forma de cocos en tétradas. Poseen metabolismo
homofermentativo con el ácido láctico como principal producto final (Axelsson,
1998; Garvie, 1986). Se describen como la bacteria láctica, acidófila,
homofermentativa, que se divide alternativamente en dos direcciones
perpendiculares para formar tétradas (Simpson y Taguchi, 1995).
Oenococcus oeni
Se presentan en forma de cocos agrupados en cadenas. Son
quimiorganótrofos. Requieren para crecer jugo de tomate (Garvie, 1986) o jugo
de uva (Dicks y col., 1995). La temperatura óptima de crecimiento está
comprendida entre 20-30ºC. Tienen metabolismo heterofermentativo. Producen
a partir de hexosas ácido D(-) láctico, etanol y CO2. Algunas cepas pueden
formar ácido acético en lugar de etanol. Se distinguen principalmente por su
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capacidad para transformar el ácido L-málico en ácido láctico L(+), crecer a
bajos pH (3,0 – 4,8) y en presencia de 10% de etanol.
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Introducción
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Las bacterias lácticas y su implicancia en la calidad del vino.
En el proceso de vinificación, el mosto de uva es fermentado a etanol,
CO2 y compuestos de aroma por las levaduras, proceso conocido como
fermentación alcóholica.
El ácido L-málico es decarboxilado a ácido L(+) láctico por las BL o
bacterias malolácticas, proceso conocido como fermentación maloláctica
(FML), y que tiene lugar, generalmente, una vez concluida la fermentación
alcohólica (Pardo y col., 1992).
Al final de la fermentación alcohólica las levaduras se lisan, liberan
nutrientes y comienza la multiplicación de las BL hasta alcanzar la población
necesaria y suficiente para desencadenar la fermentación maloláctica, 106
UFC/ml. Este proceso, que reduce la acidez del vino con el concomitante
incremento del pH, le confiere suavidad, estabilización biológica y contribuye a
la complejidad aromática del producto final (Davis y col. 1985; Davis y col.,
1988; Henick-Kling 1993). La fermentación maloláctica es considerada muy
importante para la elaboración de la mayoría de los vinos tintos de calidad y
actualmente de vinos blancos.
Aromas de jugos y bebidas fermentadas. Efecto de las bacterias lácticas
En jugos de frutas y bebidas fermentadas las sustancias aromáticas
contribuyen significativamente a la calidad del producto final. El aroma
producido es consecuencia de propiedades tecnológicas y reacciones
bioquímicas, entre las cuales la fermentación es un proceso clave.
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Las BL pueden tener diferentes efectos sensoriales sobre las bebidas
fermentadas, produciendo compuestos volátiles que modifican favorablemente
los aromas frutales o compuestos que deterioran los sabores del producto final
(Bartowsky y col., 2002a, b; Boido y col., 2002; de Revel y col., 1999; Maicas y
col., 1999; Henick-Kling, 1995; Laurent y col., 1994).
Los productos con aromas a ácido láctico como resultado de la actividad
fermentativa de las BL o con sabor mantecoso debido a la formación de
diacetilo u otros compuestos dicarbonílicos han sido muy estudiados en
bebidas fermentadas (Bartowsky y Henschke, 2004; de Revel y col., 1989;
Bertrand, 1981). Se ha demostrado que BL, especialmente aquellas
pertenecientes a los géneros Leuconostoc y Lactobacillus le otorgan al jugo de
manzana, sabor mantecoso, a ácidos orgánicos y producen el hinchamiento de
los envases por formación de CO2 (Tajchakavit y col., 1998).
Compuestos aromáticos volátiles agradables pueden ser producidos a
partir del catabolismo de aminoácidos a través de reacciones de
transaminación, deshidrogenación, decarboxilación y reducción (Maicas y col.,
1999) o pueden ser liberados a partir de precursores glicoconjugados
presentes en las frutas (Boulanger y col., 1999; Winterhalter y col., 1997;
Williams y col., 1982a). Se ha demostrado la presencia de compuestos
glicoconjugados en papaya (Schwab y col.,1989), uva (Wirth y col., 2001;
Gunata y col., 1985), damasco, durazno y ciruela (Krammer y col., 1991). Estos
compuestos se encuentran principalmente en el jugo de las frutas más que en
la piel y pulpa (Wilson y col., 1986).
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Sustancias glicoconjugadas y su relación con el aroma del vino
El aroma del vino es consecuencia principalmente de compuestos
aromáticos volátiles derivados de las uvas que incluyen monoterpenos, C13-
norisoprenoides, derivados bencénicos y alcoholes alifáticos. Estos
compuestos pueden encontrarse en forma libre o ser liberados a partir de los
precursores glicoconjugados cuya fracción glicosídica pueden ser
monoglucósidos o disacáridos glicosilados, con glucosa sustituida por -L-
arabinofuranosil, -L-rhamnosopyranosil, -D-xilopiranosil o -apiofuranosil
(Winterhalter y col., 1997; Williams y Francis, 1996; Marinos y col., 1994).
Fig. 1. Precursores glicoconjugados presentes en uvas ( Williams, 1993).
Los compuestos glicoconjugados pueden ser hidrolizados por acción
química o por efecto de enzimas producidas por microorganismos. La hidrólisis
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ácida puede ocurrir muy lentamente durante el almacenamiento debido al bajo
pH del medio (Sefton y col. 1998) o puede ser inducida por calentamiento.
Estos procesos pueden deteriorar la calidad del vino ocasionando cambios
indeseables en la estructura de los aglicones y modificando sus aromas
(Gunata, 1984; Williams y col., 1982b). Por el contrario, la hidrólisis enzimática
rompe el enlace glicosídico sin alterar el aglicon (Williams, 1993; Cordonnier y
col, 1974).
La hidrólisis enzimática de los glicósidos disacáridos involucra la
liberación secuencial en dos etapas, de las unidades de azúcares . En una
primera etapa se hidrolizan los glicósidos disacáridos mediante la acción de
glicosidasas específicas como -L-arabinofuranosidasa, -L-
rhamnopiranosidasa, β-apiofuranosidasa. Luego el aglicon (compuesto volátil)
es liberado de la β-D-glucosa por acción de la enzima β-D-glucosidasa (Gunata
y col., 1988).
Existe poca información con respecto a las actividades glicosidasas de
BL involucradas en la elaboración del vino (Maicas y col., 1999). Por lo tanto
cepas específicas de BL adaptadas a las condiciones locales de elaboración
del vino y con cualidades para llevar a cabo la fermentación maloláctica
podrían representar una fuente de glicosidasas para actuar bajo las
condiciones físico-químicas de la vinificación optimizando la complejidad
aromática del producto final. Emplear BL para producir compuestos de aromas
en bebidas fermentadas presenta ventajas con respecto a las levaduras y
frutas. Las glicosidas de las BL son más efectivas que las glicosidasas de
frutas (Gueguen y col., 1997; Aryan y col., 1987) o levaduras en condiciones de
fermentación. Al ser inoculadas concluida la fermentación alcohólica, el medio
- 13 -
es más estable que el mosto y presentan menos actividades enzimáticas no
deseadas que las levaduras.
- 14 -
Objetivo
- 15 -
Investigar la capacidad de cepas de bacterias lácticas aisladas
de vinos argentinos para sintetizar enzimas glicosídicas que
actúen sobre compuestos no aromáticos glicoconjugados ,
normalmente presentes en el medio natural, produciendo
compuestos volátiles de aromas .
- 16 -
Objetivos específicos
- 17 -
Aislamiento de bacterias lácticas de vinos
argentinos.
Identificación fenotípica de las bacterias lácticas
aisladas, en base a morfología celular, coloración de Gram, pruebas
fisiológicas y bioquímicas.
Los parámetros de crecimiento, fase lag,
velocidad de crecimiento, tiempo de generación y concentración
celular final.
Determinación de las actividades de enzimas
relacionadas con la producción de compuestos aromáticos volátiles
derivados de precursores glicoconjugados, normalmente presentes
en frutas:
- Actividad -glucosidasa
- Actividad -arabinofuranosidasa
Evaluación de las actividades enzimáticas en
diferentes condiciones de cultivos.
Evaluación de las actividades enzimáticas en
suspensiones celulares, sobrenadantes de cultivos y extractos
libres de células.
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Caracterización físico química de las actividades
enzimáticas. Efecto de parámetros que influyen en la elaboración
de bebidas fermentadas:
o pH, Temperatura, etanol
Materiales y Métodos
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Muestras
- Vino sin filtrar ni clarificar de Cafayate-Salta.
- Vino artesanal patero de Cafayate-Salta.
- Vino fino tinto de Mendoza de góndola de supermercado de Tucumán.
Medios de cultivo
- PCA: con la siguiente composición en g/l: peptona de caseína, 5;
extracto de levadura, 2,5; glucosa, 1; agar-agar, 14. pH 7 (Martley y col.,
1970) .
- MRS: se utiliza como medio basal (de Man y col., 1960) con la
siguiente composición en g/l: glucosa, 20; peptona, 10; extracto de carne,
10; extracto de levadura, 5; ortofosfato mono potasio, 2; acetato de sodio,
5; citrato de amonio, 2; sulfato de magnesio.7H2O, 0,20; sulfato de
manganeso.4H2O, 0,30; y tween 80, 1,1 ml. El pH se ajusta a 5,5, 6,5 y 4,8
para las cepas de Lactobacillus hilgardii, Pediococcus pentosaceus y
Oenococcus oeni, respectivamente.
- MRS modificado: Medio basal suplementado con 10% de jugo de
uva.
- Jugo de uva: se extrae de uvas cosechadas en la región de
Cafayate, Salta y se clarifica por centrifugación. El jugo, pH 4,7, se
suplementa con 5 g/l de extracto de levaduras.
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Los medios PCA y MRS se esterilizan en autoclave durante 20 min a
121ºC. El medio jugo de uva se esteriliza en autoclave hasta alcanzar
121ºC y se apaga inmediatamente.
Procesamiento de las muestras de vinos para aislamiento
Las muestras de vinos se centrifugan a 4000 g 20 min. El pellet se resuspende en solución fisiológica y se realizan diluciones sucesivas. 0,1 ml de la dilución correspondiente se siembra en medio PCA para el aislamiento de aerobios totales, medios MRS y MRS modificado agar pH 4,8 y 6,5 para el aislamiento de bacterias lácticas. Se adiciona 1,3 μg/ml de pimaricina a los medios de cultivos MRS y MRS modificado para inhibir el desarrollo de células eucariotas. Los medios de cultivos se incuban a 30ºC durante 10 días. Los medios MRS y MRS modificado se incuban en condiciones de microaerofilia. Se seleccionan colonias al azar de cada muestra para su posterior identificación. Las colonias Gram positiva y catalasa negativa se clasifican como BL y se identifican por métodos fenotípicos.
Identificación fenotípica de bacterias lácticas
Las BL se caracterizan en base a morfología celular, pruebas
fisiológicas y bioquímicas:
- Actividad catalasa. Se adiciona agua oxigenada a suspensión celular
del microorganismo en estudio. La reacción positiva se determina por aparición
de burbujas como consecuencia de la descomposición del peróxido de
hidrógeno.
- Producción de NH3 a partir de arginina. Se siembran los
microorganismos en medio arginina y se incuba a temperatura óptima de
crecimiento. Si el microorganismo hidroliza el aminoácido se visualiza la
producción de NH3 con reactivo de Nessler .
- Producción de CO2 a partir de glucosa en medio agarizado de Gibson
(Gibson y Abdel - Malek, 1945). La producción de gas se determina por
- 21 -
aparición de grietas en el medio agarizado, indicando que el microorganismo
posee metabolismo heterofermentativo. El resultado negativo corresponde a
metabolismo homofermentativo.
- Tipo de isómero de ácido láctico producido, D, L o D-L. Se determina
por método enzimático (Kit de Boheringer, Alemania).
- Pruebas de fermentación de azúcares en medio líquido con campana
de Durham y el indicador de pH púrpura de bromo cresol. Si el microorganismo
presenta metabolismo fermentativo vira el color del indicador de púrpura a
amarillo por acidificación del medio. La producción de gas se observa por
formación de burbuja en la campana de Durham.
- Crecimiento a diferentes temperaturas de incubación y pH.
Microorganismos
Lactobacillus hilgardii 5w, Oenococcus oeni X2L, m y ST y Pediococcus
pentosaceus 12p aislados de vinos argentinos (Strasser de Saad y Manca de
Nadra, 1987; Manca de Nadra y Strasser de Saad, 1987).
Mantenimiento de cultivos
Los cultivos puros sin desarrollar se mantienen en medio MRS a 4º C
por cortos períodos de tiempo (1 a 3 meses). Para sembrar los medios, los
cultivos bacterianos en medio MRS se incuban a 30ºC durante 20-30 h para
iniciar el desarrollo y se activan por sucesivas transferencias a medio fresco.
Preparación del inóculo y condiciones de crecimiento
- 22 -
Los cultivos provenientes de medio MRS modificado se cosechan al final
de fase exponencial de crecimiento, se lavan con agua destilada estéril y
resuspenden en un volumen adecuado de agua estéril para alcanzar una
D.O.560nm= 1,0. La suspensión celular se utiliza para sembrar los medios de
prueba.
Estimación del crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano se determina espectrofotométricamente a 560
nm en espectrofotómetro Bausch & Lomb 20 y se cuantifica por el método de
las diluciones sucesivas. Las muestras se toman a intervalos de 2-4 h en fases
de crecimiento exponencial y estacionaria en las distintas condiciones de
ensayo.
Determinación de actividades -glucosidasa y -arabinofuranosidasa
Las actividades glicosidasas se miden por método colorimétrico de
acuerdo a lo descrito por D’Incecco y col. (2004) usando p-nitrofenil--D-
glucopiranósido (Sigma cat no. N7006) y p-nitrofenil--L-arabinofuranósido
(Sigma cat no. N3641) como sustratos para -glucosidasa y -
arabinofuranosidasa, respectivamente.
Las células se cultivan en medios MRS, MRS modificado y jugo de uva a
30C, se cosechan a mitad y final de fase exponencial y fase estacionaria de
crecimiento y se resuspenden en buffer acetato de sodio 0,1M pH 5,1. La
mezcla de reacción compuesta por : 50 l de la suspensión celular,
sobrenadante de cultivo o extracto libre de células cosechados a distintos
tiempos de incubación, 250 l de buffer acetato de sodio (0.1 M, pH 5.1) y 300
- 23 -
l del sustrato (1 mM en buffer acetato de sodio 0.1 M, pH 5.1), se incuba a
37ºC durante 30 min. La reacción se detiene por adición de 400 l de solución
de carbonato de sodio 1 M. El p-nitrofenol liberado se mide
espectrofotométricamente a 400 nm.
La actividad específica se expresa como nmoles de p-nitrofenol liberado
por hora por miligramo de peso seco celular.
Preparación de extracto libre de células
Células provenientes de 800 ml de cultivo se cosechan en mitad o
final de fase exponencial de crecimiento según corresponda, se centrifugan
y se lavan 2 veces con buffer acetato de sodio 0,1 M pH 5,1. Luego se
resuspenden en cantidad necesaria del mismo buffer para obtener una
suspensión de células al 30% (p/v). Las células se rompen por sonicación
usando prensa French (French Pressure Cell Press, ThermoSpectronic,
FA-078).
Determinación de las condiciones óptimas de las actividades enzimáticas
- pH: 3,5; 5,1 y 6,5.
- Temperatura: 20, 30 y 37°C
- Tiempo de incubación: 30, 60 y 120 min.
- Concentración de etanol: 8 y 12%
Determinación de proteínas
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La determinación de proteínas en los extractos libres de células se
realiza utilizando el Método de Bradford (Bradford, 1976).
Determinación de glucosa
Glucosa residual se determina en sobrenadantes de cultivo, por el
método de glucosa oxidasa, Kit de Wiener (Rosario, Argentina).
Determinaciones de pH
Las medidas de pH se realizaron con pH-metro Instrumentalia S. A.
Reproducibilidad
Los ensayos se realizan por triplicado, dos veces.
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Resultados y Discusión
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Aislamiento e identificación
de bacterias lácticas de vinos
Argentinos
Pocas bacterias son capaces de crecer en vino debido a las desfavorables condiciones físico-químicas y bajo contenido de nutrientes del medio. Las bacterias acéticas y BL son los microorganismos más frecuentemente aislados. Las BL principalmente encontradas corresponden a Oenococcus, Pediococcus y Lactobacillus siendo Oenococcus oeni la especie mejor adaptada para sobrevivir a las condiciones de bajo pH y alta concentración alcohólica del vino.
- 27 -
Aislamiento de microorganismos de vino artesanal
De la muestra de vino artesanal se aíslan 8 y 6 colonias de medios
PCA y MRS pH 6,5, respectivamente. No se observa desarrollo en medio
MRS pH 4,8. En Tabla 1 se clasifican las colonias aisladas provenientes de
medio PCA en 7 grupos de acuerdo a la morfología celular, coloración de
Gram, actividad catalasa y capacidad para fermentar glucosa. La mayoría
de los aislados corresponden a bacterias Gram positivas, catalasa
positivas (62,5%). El aislado del grupo 5 presenta además estructura
refringente y se confirma la formación de espora con la coloración especial
de Shaeffer - Fulton. Sólo el aislado perteneciente al grupo 1 se identifica
como BL. Los aislados del grupo 6 y 7 se clasifican como enterobacterias.
Tabla 1. Microorganismos aislados de vino artesanal en medio PCA
Grupo MorfologíaColoración
de Gram
Actividad
catalasa
Fermentación
de glucosa
1 Cocobacilos, cadenas cortas + - +
2 Cocos en pares
o agrupados
+ + +/gas
3 Bacilos, cadenas cortas + + -
4 Cocos, largas cadenas + + Débil
5 Bacilos, cadenas cortas + + Débil
6 Bacilos en cadenas - + -
- 28 -
7 Bacilos en cadenas - + +
En Tabla 2 se clasifican en 4 grupos las colonias aisladas
provenientes de medio MRS pH 6,5 de acuerdo a morfología celular,
coloración de Gram y pruebas bioquímicas. Los grupos 1 y 2 están
constituidos por dos aislados y los 2 grupos restantes por uno. El grupo 1 esta
formado por levaduras. Las características de los aislados del grupo 2
coinciden con las del grupo 2 provenientes del medio PCA. En ambos casos
corresponden a cocos dispuestos en pares o agrupados en forma irregular,
coloración de Gram y actividad catalasa positivas. El microorganismo del grupo
3 presenta propiedades que son características de un contaminante que se
aísla frecuentemente en aguas de desecho de bodegas. Solamente el aislado
del grupo 4 se identifica como BL y en base a su morfología celular típica de
cocos en tetradas se identificaría como perteneciente al género Pediococccus.
Tabla 2. Microorganismos aislados de vino artesanal en medio MRS*
Grupo MorfologíaColoración
de Gram
Actividad
catalasa
Fermentación
de glucosa
1 Levadura + ND ND
2 Cocos en pares
o agrupados +
+ + /gas
3 Bacilos, cadenas cortas + + +
4 Cocos en tetradas + - +
*pH 6,5.
- 29 -
ND: no determinado
En Tabla 3 se indican las pruebas realizadas a los microorganismos
del grupo 4. Los resultados coinciden con aquellos obtenidos por miembros
del género Pediococcus, lo que confirmaría su identificación.
Tabla 3. Características de los microorganismos del grupo 4.
pH Temperatura Cl Na
4,2 7,5 8,5 35°C 40°C 50°C 4% 6,5% 18%
- + + + + - + + -
Aislamiento de microorganismos de vino sin filtrar ni clarificar
De la muestra de vino sin filtrar ni clarificar sembrada en medio PCA
se obtienen recuentos significativamente mayores que los determinados en
vino artesanal filtrado y clarificado. En esta condición se alcanza una
concentración celular final de 1,2 x 105 UFC/ml.
De medio MRS modificado adicionado con pimaricina, pH 6,5, se
seleccionan al azar colonias blancas lenticulares, Gram positivas, catalasa
negativas con morfología celular de cocos en tetradas, típica del género
Pediococcus para su posterior identificación (Tabla 4).
De medio MRS modificado adicionado con pimaricina, pH 4,8, luego
de 7 a 10 días de incubación a 30°C, se seleccionan al azar colonias
puntiformes y blanquecinas, Gram positivas, catalasa negativas con
morfología de células esféricas o lenticulares dispuestas en largas
cadenas, características de la especie Oenococccus oeni. Se las cultiva en
- 30 -
medio líquido MRS modificado pH 4,8 para su posterior identificación
(Tabla 4).
Los resultados de la Tabla 4 indican que los microorganismos sfc1 y
sfc2 corresponderían a Pediococcus sp. sobre la base que crecen a pH 6,5
y 30ºC, producen amoníaco a partir de arginina, utilizan glucosa por la via
homofermentativa y forman ácido L-láctico. Las aislados comprendidos
entre sfc3 y sfc17 corresponderían a Oenococcus oeni sobre la base que
crecen a 30ºC y pH 4,8, no hidrolizan arginina, producen gas a partir de
glucosa como consecuencia de su metabolismo heterofermentativo y el
isómero D del ácido láctico. Además crecen en presencia de 10% etanol,
fermentan fructosa y glucosa con producción de gas en medio líquido
(datos no mostrados en Tabla 4).
Tabla 4. Características de bacterias lácticas aisladas de vino sin filtrar ni clarificar
Aislado
Pruebas diferenciales
Crecimiento a NH3 de
Arginina
D/L
láctico
Glucosa
pH TemperaturaÁcido Gas
4,8 6,5 9 30°C 45°C
sfc1 + + – + – + L + –
sfc2 + + – + – + L + –
sfc3 + – – + – – D + +
sfc4 + – – + – – D + +
sfc5 + – – + – – D + +
sfc6 + – – + – – D + +
sfc7 + – – + – – D + +
sfc8 + – – + – – D + +
sfc9 + – – + – – D + +
- 31 -
sfc10 + – – + – – D + +
sfc11 + – – + – – D + +
sfc12 + – – + – – D + +
sfc13 + – – + – – D + +
sfc14 + – – + – – D + +
sfc15 + – – + – – D + +
sfc16 + – – + – – D + +
sfc17 + – – + – – D + +
En conclusión, de vino fino de estante no se aíslan microorganismos.
De vino artesanal se aíslan principalmente microorganismos
contaminantes Gram +, catalasa +.
De vino sin filtrar ni clarificar se aíslan Pediococcus sp. y
Oenococcus oeni.
De los microorganismos aislados, se seleccionan la cepa de
Oenococcus oeni sfc5 y Pediococcus sp para realizar estudios
relacionados con la producción de aromas.
- 32 -
Crecimiento de bacterias lácticas
- 33 -
a
5,5
7,5
9,5
11,5
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (h)
Lo
g U
FC
/ml
b
3
3,5
4
4,5
5
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (h)
pH
en medios MRS y MRS modificado
Crecimiento y modificación de pH de cepas de Oenococcus oeni en
medio MRS
- 34 -
Fig. 2. Crecimiento de Oenococcus oeni (a) y modificación de pH (b) en medio
MRS. Cepas: m (Δ), ST (■), X2L (▲) y sfc5 ().
La Figura 2a muestra el crecimiento de las cepas de Oenococcus
oeni m, ST, X2L y sfc5 en medio MRS. La cepa m desarrolla con velocidad
de crecimiento de 0,25 h-1 y una concentración celular final de 2,5 x 1012
UFC/ml mientras que las cepas ST y X2L desarrollan con velocidad de 0,24
h-1 y 0,21 h-1 y alcanzan una concentración celular final de 1,6 x 1012 y 1,3 x
1012 UFC/ml, respectivamente. Oenococcus oeni sfc5 crece más lentamente
que el resto de las cepas estudiadas (0,10 h -1), alcanzando la fase
estacionaria en 100 h de incubación con concentración celular final de 6,3 x
1011 UFC/ml.
Saguir y Manca de Nadra (1997, 2002) demostraron en Oenococcus
oeni m, ST, X2L y L2 que la cepa m presentó el menor número de
requerimientos en aminoácidos esenciales. Este resultado explicaría su mejor
respuesta de crecimiento. El menor desarrollo de la cepa sfc5 podría estar
relacionada con falta de adaptación al medio de cultivo de laboratorio,
considerando que fue aislada recientemente durante este estudio.
El pH inicial de 4,8 disminuye a valores entre 3,5 y 3,8 aproximadamente en todos los casos (Fig. 2b), como resultado de sus metabolismos heterofermentativos. Los valores se relacionan con las velocidades de crecimiento determinadas en los diferentes cultivos.
Utilización de glucosa en medio MRS por cepas de Oenococcus oeni
Tabla 5. Variación de glucosa residual durante el crecimiento de cepas de
Oenococcus oeni en medio MRS.
- 35 -
b
3
3,5
4
4,5
5
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
pH
a
5,5
7,5
9,5
11,5
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Lo
g U
FC
/ml
Glucosa residual (g/l)
Tiempo Cepas
X2L ST m sfc5
0 20 20 20 20
Exponencial a 14,5 14,3 14,8 15,8
Estacionaria b 12,4 11,6 10,1 13,1 a Mitad de fase exponencial; b Inicio de fase estacionaria.
En mitad de fase exponencial de crecimiento los microorganismos
consumen entre 5,7 y 4,2 g/l de glucosa. El consumo del azúcar incrementa a
valores comprendidos entre 9,1 y 6,9 g/l al final del crecimiento (Tabla 5). La
menor velocidad y concentración del carbohidrato utilizado por la cepa sfc5
coincide con los menores parámetros de crecimientos alcanzados por este
microorganismo .
La disminución de pH inicial de los medios de cultivos (Fig. 2 b) se
relaciona directamente con el consumo del carbohidrato y la producción de
ácidos orgánicos como consecuencia de sus metabolismos fermentativos.
Los altos niveles de glucosa residual obtenidos al final del crecimiento
microbiano sugiere que la fermentación se detuvo por el bajo pH del medio y
no por pérdida del sustrato carbohidrato.
Crecimiento y modificación de pH de cepas de Oenococcus oeni en
medio MRS modificado
- 36 -
Fig. 3. Crecimiento de Oenococcus oeni (a) y modificación de pH (b) en
medio MRS modificado. Cepas: m (Δ), ST (■), X2L (▲) y sfc5 ().
La Figura 3a muestra el crecimiento de las cepas de Oenococcus
oeni m, ST, X2L y sfc5 en medio MRS modificado. En esta condición las
cepas de Oenococcus oeni desarrollan con velocidades de crecimiento 54,5,
57,1, 48, 39% superiores que en medio basal para m, ST, X2L y sfc5,
respectivamente. Este comportamiento estaría relacionado con el aporte
adicional de fuentes de carbono y energía del jugo natural al medio complejo .
Las concentraciones celulares finales son similares a las determinadas en
medio MRS.
El pH inicial de 4,8 disminuye a valores comprendidos entre 3,5 y 3,8
aproximadamente (Fig. 3b). Los valores se relacionaron con las
velocidades de crecimiento determinadas en los diferentes cultivos.
Utilización de glucosa en medio MRS modificado por cepas de
Oenococcus oeni
Tabla 6. Variación de glucosa residual durante el crecimiento de cepas de
Oenococcus oeni en medio MRS modificado.
Glucosa residual (g/l)
Tiempo Cepas
X2L ST m sfc5
0 20,8 20,8 20,8 20,8
Exponencial a19,2 18,2 18,1 19,5
- 37 -
b
3,5
4,5
5,5
6,5
0 10 20 30 40 50 60Tiempo (h)
pH
a
4
6
8
10
12
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (h)
Lo
g U
FC
/ml
Estacionaria b17,5 16,9 16,3 17,8
a: Mitad de fase exponencial; b: Inicio de fase estacionaria.
El consumo final de glucosa varía entre 3,7 y 2,2 g/l. La mayor utilización
del azúcar corresponde a la cepa m y la menor a la cepa sfc5. En esta
condición, se alcanzan valores finales de glucosa residual superiores que en
medio MRS (Tabla 6). Este hecho estaría relacionado con el aporte adicional
de azúcares del jugo de uva al medio complejo.
La disminución del pH en los medios de cultivos (Fig. 3b) se relaciona
directamente con el consumo del carbohidrato y el metabolismo fermentativo
de las cepas de Oenococcus oeni.
Crecimiento y modificación de pH de Pediococcus pentosaceus 12p y
Pediococcus sp. en medio MRS
- 38 -
Fig. 4. Crecimiento de Pediococcus pentosaceus 12p () y Pediococcus
sp.(•) (a) y modificación de pH (b) en medio MRS.
La Figura 4a muestra el crecimiento de la cepa de Pediococcus
pentosaceus 12p y Pediococcus sp. en medio MRS.
La cepa 12p alcanza la fase estacionaria en 45 h de incubación a
30°C con una velocidad de crecimiento de 0,43 h-1 y una concentración
celular final de 4 x 1011 UFC/ml. Pediococcus sp. crece más lentamente
con una velocidad de 0,39 h-1 y alcanza una concentración celular final de 1 x
1011 UFC/ml.
El pH inicial, 6,5 desciende a 3,8 y 3,9 para Pediococcus pentosaceus
12p y Pediococcus sp., respectivamente (Fig 4b). Los valores se correlacionan
con las velocidades de crecimientos.
La adición de jugo de uva 10% al medio basal no modifica
significativamente los parámetros de crecimientos en ambos microorganismos.
Utilización de glucosa en medio MRS por Pediococcus pentosaceus 12p y
Pediococcus sp.
Tabla 7. Variación de glucosa residual durante el crecimiento de
microorganismos pertenecientes al género Pediococcus en medio MRS.
- 39 -
Glucosa residual (g/l)
Tiempo
Pediococcus
pentosaceus
12p
Pediococcus
sp.
0 20 20
Exponencial a14,9 13
Estacionaria b11,4 9,1
a
6
7
8
9
10
11
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
Lo
g U
FC
/ml
b
3.5
4
4.5
5
5.5
6
0 5 10 15 20 25 30Tiempo (h)
pH
a: Mitad de fase exponencial; b: Inicio de fase estacionaria.
En fase exponencial las microorganismos utilizan entre el 25,5 y 35% de
la glucosa inicial. Al final del crecimiento 43 y 54,5 % de la concentración inicial
de azúcar son consumidos por Pediococcus pentosaceus 12p y Pediococcus
sp, respectivamente.
La disminución de pH en los medios de cultivos (Fig. 3 b) se relaciona
directamente con el consumo del carbohidrato y el metabolismo
homofermentativo de estas bacterias.
Crecimiento y modificación de pH de Lactobacillus hilgardii 5w en medio
MRS y MRS modificado
- 40 -
Fig. 5. Crecimiento de Lactobacillus hilgardii 5w (a) y modificación de pH
(b). Medios MRS (), MRS modificado (■).
La Figura 5a muestra el crecimiento de Lactobacillus hilgardii 5w en
medios MRS y MRS modificado. En medio basal el microorganismo
desarrolla con velocidad similar que en el mismo medio enriquecido con jugo
de uva. En ambas condiciones alcanza una concentración celular final de 6,3 x
1010 UFC/ml.
El pH inicial disminuye aproximadamente a 4,0 al final del crecimiento
microbiano en ambas condiciones de cultivo (Fig. 5b)
Utilización de glucosa en medios MRS y MRS modificado por
Lactobacillus hilgardii 5w
Tabla 8. Variación de glucosa residual durante el crecimiento de Lactobacillus
hilgardii 5w en medio MRS y MRS modificado
a: Mitad de fase exponencial; b: Inicio de fase estacionaria
- 41 -
Glucosa residual (g/l)
Tiempo Lactobacillus hilgardii 5w
MRS MRS mod
0 20 20,8
Exponencial a16,2 16,8
Estacionaria b11,8 13,7
En medio MRS y MRS modificado el microorganismo consume 41 y 31,5
% de la glucosa inicial al final del crecimiento, respectivamente. El consumo
final de glucosa es menor en el medio enriquecido con jugo de uva que en
medio basal (Tabla 8).
La disminución del pH se relaciona con el consumo del carbohidrato y el
metabolismo fermentativo del microorganismo.
En conclusión, en medio MRS las cepas de Oenococcus oeni
consumen menos glucosa y desarrollan con menor velocidad específica de
crecimiento que los Pediococcus y Lactobacillus.
La adición del jugo de uva al medio basal estimula significativamente
el crecimiento de las cepas de Oenococcus oeni, al aportar nutrientes para
sus complejos requerimientos nutricionales.
- 42 -
Actividades glicosidasas en
bacterias lácticas cultivadas en
medios MRS y MRS modificado
- 43 -
El aroma del vino es consecuencia, principalmente, de componentes
volátiles derivados de las uvas (C13-norisoprenoides, monoterpenos, etc) que
pueden ser liberados por acción enzimática a partir de precursores
glicoconjugados no aromáticos, cuya fracción glicosídica puede ser un
monoglucósido o disacáridos glicosilados, con glucosa sustituida por -L-
arabinofuranosil, -L-rhamnosopyranosil, -D-xilopiranosil o -apiofuranosil.
Actividad β-glucosidasa en bacterias lácticas
Se investiga la actividad enzimática en suspensiones celulares,
sobrenadantes de cultivo y extractos libres de células de las cepas de
Oenococcus oeni X2L, ST, m, sfc5, Pediococcus pentosaceus 12p,
Pediococcus sp. y Lactobacillus hilgardii 5w. No se encuentra actividad en
sobrenadantes de cultivos, ni en extractos libres de células de los
microorganismos analizados.
Las actividades enzimáticas solo se detectan en las suspensiones
celulares con actividades específicas que varían de 100 a 14410 nmoles/mg/h.
Los valores más altos de actividad específica β-glucosidasa corresponden, en
general, a suspensiones celulares provenientes de mitad de fase exponencial
- 44 -
de crecimiento y medio MRS. Las cepas de Oenococcus oeni ST y X2L
presentan las mayores actividades específicas. Las actividades específicas de
Pediococcus pentosaceus 12p también son significativas, alcanzando valores
máximos de 5586 nmoles/mg/h. Los valores de actividad especifica de
Pediococcus sp. aislada durante este estudio, son comparables a los
determinados en Pediococcus pentosaceus 12p. Los valores más bajos de
actividades enzimáticas específicas corresponden a las suspensiones celulares
de la cepa de Oenococcus oeni sfc5, también aislada durante este estudio y
Lactobacillus hilgardii 5w (Tabla 9).
Tabla 9. Actividad específica -glucosidasa en suspensiones celulares de
bacterias lácticas.
Actividad especifica (nmoles/mg/h)
Microorganismo
Fase de Crecimiento
Mitad exponencial Final exponencial Estacionaria
MRS MRSmod MRS MRSmod MRS MRSmod
Oenococcus
oeni
X2L 13910 9286 6867 5888 5120 2630
ST 14410 12747 9917 3088 5628 4154
m 7350 5080 4150 2550 2220 2590
sfc5 204 221 235 100 203,4 255,9
Pediococcus
pentosaceus
12p 5586 4296 3183 3598 2719 4095
Pediococcus
sp.
3086 2056 3279 2265 3426 2389
Lactobacillus hilgardii
5w 914 686 738 477 429 429
- 45 -
Los resultados sugieren que la actividad específica β-glucosidasa varía
en función de la especie, Oenococcus oeni presenta los valores más altos, y
cepas. Similares resultados fueron descriptos por Grimaldi y col. (2005b),
Barbagallo y col. (2004) y Mansfield y col. (2002). La composición del medio y
fase de crecimiento también influyen sobre los resultados obtenidos. El medio
MRS modificado estimula el crecimiento de las cepas de Oenococcus oeni (Fig.
3a) pero no favorece la actividad específica β-glucosidasa.
Actividad -arabinofuranosidasa en bacterias lácticas
Se investiga la actividad enzimática en suspensiones celulares,
sobrenadantes de cultivos y extractos libres de células de las cepas de
Oenococcus oeni X2L, ST, m, sfc5, Pediococcus pentosaceus 12p,
Pediococcus sp. y Lactobacillus hilgardii 5w. No se encuentra actividad en
sobrenadantes de cultivos, ni en extractos libres de células de los
microorganismos analizados.
Seis de las siete BL analizadas presentan actividad -
arabinofuranosidasa en suspensiones celulares con valores de actividades
específicas que varían de 9 a 1679 nmoles/mg/h, menores que los obtenidos
para la enzima β-glucosidasa. Las máximas actividades específicas -
arabinofuranosidasa corresponden a las suspensiones celulares provenientes
del medio MRS enriquecido con jugo de uva y final de fase exponencial. Estos
resultados difieren de aquellos encontrados para la enzima β-glucosidasa. Las
suspensiones celulares de Pediococcus pentosaceus 12p y Pediococcus sp.
- 46 -
presentan los valores más altos. En las cepas de Oenococcus oeni X2L y ST
éstos también son significativos (Tabla 10).
Los microorganismos aislados durante este trabajo del vino sin filtrar ni
clarificar, presentan actividades especificas -arabinofuranosidasa opuestas.
No se determina actividad en Oenococcus oeni sfc5 mientras que en
Pediococcus sp. los valores son comparables a los encontrados en
Pediococcus pentosaceus 12p (Tabla 10).
Actividad especifica (nmoles/mg/h)
Microorganismo
Fase de crecimiento
Mitad exponencial Final exponencial Estacionaria
MRS MRSmod MRS MRSmod MRS MRSmod
Oenococcus oeni
X2L 933 1036 1102 1481 998 1220
ST 697 941 1081 600 980
m 97 89 51
sfc5
Pediococcus pentosaceus
12p 613 1679 349 1031
Pediococcus sp.
305 1518 9 867
Lactobacillus hilgardii
5w 753 846 345 372
Tabla 10. Actividad específica -arabinofuranosidasa en suspensiones
celulares de BL.
Las experiencias realizadas en sobrenadantes libres de células y
extractos libres de células, no permitieron determinar las actividades
- 47 -
enzimáticas. En el primer caso indicaría que no son liberadas al medio. En el
segundo caso podría relacionarse a ubicación de las enzimas en pared.
Barbagallo y col. (2004) demostraron en 6 cepas de Oenococcus oeni
que la actividad enzimática estuvo ausente en sobrenadantes de cultivos.
Mansfield (2002) describió que la actividad β-glucosidasa sólo estuvo presente
en células enteras de Oenococcus oeni.
Las actividades enzimáticas β-glucosidasa y -arabinofuranosidasa
varían en función del microorganismo, fase de crecimiento y composición del
medio de cultivo.
Las cepas de Oenococcus oeni X2L y ST, Pediococcus pentosaceus
12p y Pediococcus sp. presentan las mayores actividades específicas β-
glucosidasa y -arabinofuranosidasa, respectivamente .
Seleccionamos las cepas de Oenococcus oeni ST y Pediococcus
pentosaceus 12p para estudios de caracterización físico-química de las
enzimas glicosídicas.
- 48 -
Actividades glicosídicas de
Pediococcus pentosaceus 12p y
Oenococcus oeni ST cultivados en
jugo de uva.
- 49 -
b
3
3,5
4
4,5
5
0 20 40 60 80 100Tiempo (h)
pH
a
6
7
8
9
10
11
12
13
0 20 40 60 80 100Tiempo (h)
Lo
g U
FC
/ml
Evaluamos el crecimiento y las actividades de las enzimas glicosídicas
de los microorganismos seleccionados en jugo de uva enriquecido con 5 g/l de
extracto de levadura.
Crecimiento de Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p en
medio jugo de uva suplementado con extracto de levadura.
Fig. 6. Crecimiento de Oenococcus oeni ST (■) y Pediococcus
pentosaceus 12p () (a) y modificación de pH (b) en medio natural.
- 50 -
La Figura 6a muestra el crecimiento de las cepas de Oenococus oeni
ST y Pediococcus pentosaceus 12p en medio jugo de uva, pH 4,7. La cepa
12p desarrolla con velocidad específica de crecimiento de 0,17 h-1 y una
concentración celular final de 7,4 x 1011 UFC/ml mientras que la cepa ST
desarrolla con velocidad de 0,18 h-1 y alcanza concentración celular
aproximadamente 1 ciclo logarítmico mayor que la cepa 12p (6,3 x 1012
UFC/ml). La mejor respuesta de crecimiento de Oenococcus oeni ST con
respecto a Pediococcus pentosaceus 12p podría estar relacionado con el pH
inicial del medio, 4.7, óptimo para el crecimiento de Oenococcus oeni pero no
para Pediococcus pentosaceus.
En esta condición las cepas ST y 12p de Oenococcus oeni y
Pediococcus pentosaceus desarrollan con velocidades de crecimiento 31,3% y
56,3% menores que en medio MRS, respectivamente.
El pH inicial de 4,7 disminuye a valores entre 3,3 y 3,7 aproximadamente
(Fig. 6b). Los valores se relacionan con las velocidades de crecimiento
determinadas en las diferentes condiciones de cultivos.
Utilización de glucosa por Oenococcus oeni ST y Pediococcus
pentosaceus 12p en medio jugo de uva.
Tabla 11. Variación de glucosa residual de Oenococcus oeni ST y
Pediococcus pentosaceus 12 p durante su crecimiento en medio jugo de uva.
- 51 -
Glucosa residual (g/l)
Tiempo
Microorganismo
Oenococcus oeni
ST
Pediococcus
pentosaceus 12p
0 18,37 18,37
Exponencial a17,04 17,31
Estacionaria b16,35 14,75
a Mitad de fase exponencial; b Inicio de fase estacionaria.
La Tabla 11 muestra la variación de glucosa residual durante las
distintas fases de crecimiento de las cepas de Oenococcus oeni ST y
Pediococcus pentosaceus 12 p en medio jugo de uva.
En mitad de fase exponencial de crecimiento los microorganismos
consumen aproximadamente 1 g/l de glucosa. El consumo del azúcar
incrementa a valores comprendidos entre 2,02 y 3,6 g/l al final del crecimiento
microbiano, menores que los determinados en medio MRS para ambas
bacterias. Posiblemente la utilización de otros azúcares, como fructosa,
normalmente presentes en el medio natural inhibe su consumo. Se ha
demostrado que algunas BL prefieren fructosa más que glucosa para crecer
(Gardner y col., 2001).
La disminución de pH inicial de los medios de cultivos (Fig. 6b) se
relaciona directamente con el consumo del carbohidrato .
- 52 -
Actividad β-glucosidasa y α-arabinofuranosidasa en Oenococcus
oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p
Tabla 12. Actividad específica -glucosidasa en suspensiones celulares de
Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p provenientes de medio
jugo de uva.
Actividad específica (nmoles/mg/h)
Microorganismo EnzimaMitad de fase
exponencial
Final de fase
exponencial
Fase
estacionaria
Oenococcus
oeni
ST
-glucosidasa 3770 2325 2282
-arabinofuranosidasa 1226 658 344
Pediococcus
pentosaceus
12p
-glucosidasa 2539 657 321
-arabinofuranosidasa 4086 99 ─
No se encuentra actividad enzimática en sobrenadantes de cultivos, ni
en extractos libres de células.
- 53 -
Se determina actividad -glucosidasa y -arabinofuranosidasa en las
suspensiones celulares de ambas cepas con valores de 321 a 3770 y de 99 a
4086 nmoles/mg/h, respectivamente. Las actividades específicas enzimáticas
máximas se obtienen siempre en mitad de fase exponencial de crecimiento
(Tabla 12). Este resultado no coincide con aquellos obtenidos para la enzima
-arabinofuranosidasa en las suspensiones celulares provenientes de medios
MRS y MRS modificado, donde la actividad enzimática es máxima al final de
fase exponencial.
Las cepas de Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p
presentan la máxima actividad específica -glucosidasa y -
arabinofuranosidasa, respectivamente (Tabla 12). En esta condición, las
actividades específicas -glucosidasa son menores que en las suspensiones
celulares provenientes de los medios MRS. Grimaldi y col., 2000 y 2005
demostraron en Oenococcus oeni el efecto inhibitorio de glucosa y fructosa
sobre la actividad de estas enzimas. Por otro lado la menor disposición de
nutrientes del medio natural con respecto al medio de laboratorio podría afectar
la producción de las enzimas y consecuentemente sus actividades. Similar
resultado fue descripto por McMahon y col (1999). No obstante, es importante
destacar que la cepa ST muestra considerables valores de actividad específica
β-glucosidasa.
La actividad específica -arabinofuranosidasa de la cepa 12p en medio
natural es mayor que en medio MRS modificado, demostrando que el jugo de
uva estimula la actividad enzimática.
- 54 -
Caracterización físico química
de las enzimas
- 55 -
Los microorganismos seleccionados se siembran y cosechan en
aquellas condiciones donde las actividades específicas son máximas. En
medio MRS y mitad de la fase exponencial para la caracterización de la enzima
-glucosidasa y en medio MRS modificado y final de la fase exponencial para
la caracterización de la actividad -arabinofuranosidasa.
Efecto de pH, temperatura y tiempo de incubación sobre la actividad β-
glucosidasa en Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p.
Las actividades específicas -glucosidasa son máximas para ambas
cepas a 30ºC y a pH 5,1 y 6.5 para las cepas ST y 12p, respectivamente (Fig.
7a,b). Estos resultados coinciden con los valores de temperatura y pH óptimos
para sus crecimientos.
En Oenococcus oeni ST a pH 6,5 y 3,5 se producen pérdidas del 36,87 y
76,38 % de la actividad específica, respectivamente. Sin embargo, es
importante destacar que a pH ácidos no hay pérdida total de actividad y el valor
obtenido es significativo. En Pediococcus pentosaceus 12p a pH 3,5 la pérdida
de actividad específica corresponde al 68,74% (Fig. 7a). Se ha demostrado que
- 56 -
a
0
5000
10000
15000
20000
25000
O.o.ST P.p. 12p
Ac
t.e
sp
. (n
mo
les
/mg
/h)
■ 3,5, 37ªC,30min, ■ 5,1; 37ºC; 30 min ■ 6,5; 37ºC; 30 min
b
0
5000
10000
15000
20000
25000
O.o.ST P.p. 12p
Act
.esp
. (n
mo
les/
mg
/h)
■20ºC, pH 5,1; 30 min ■30ºC, pH 5,1; 30 min ■37ºC, pH 5,1; 30 min
c
0
5000
10000
15000
20000
25000
O.o.ST P.p. 12p
Ac
t.e
sp
.(n
mo
les
/mg
/h)
■30 min; 37ºC; pH5,1■ 60 min; 37ºC; pH5,1 ■120 min; 37ºC; pH5,1
el pH es un factor de inhibición sobre las actividades glicosidasas de las
levaduras (Rosi y col, 1994; Grimaldi y col.,2000).
A 20ºC se observa pérdida de actividad específica en la cepa ST
(aproximadamente del 36%). Sin embargo el valor obtenido continúa siendo
elevado (Fig. 7b).
- 57 -
Fig. 7. Efecto del pH (a), temperatura (b) y tiempo de incubación (c) sobre
las actividades específicas β-glucosidasa de Oenococcus oeni ST y
Pediococcus pentosaceus 12p.
La propiedad de la cepa ST de presentar actividad específica -
glucosidasa bajo las condiciones enológicas (pH bajo y 20ºC) es muy
significativa desde el punto de vista tecnológico.
El tiempo de incubación no afecta significativamente la actividad
enzimática en la cepa de Oennococcus oeni ST. En Pediococcus pentosaceus
12p incrementa proporcionalmente en función del tiempo de incubación (Fig.
7c).
Efecto del pH, temperatura y tiempo de incubación sobre la actividad -
arabinofuranosidasa en Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus
12p.
Las actividades específicas -arabinofuranosidasa son
significativamente afectadas por pH. En Oenococcus oeni ST ésta es mayor a
pH 3,5 con respecto a valores superiores . En Pediococcus pentosaceus 12p
solo se detecta actividad -arabinofuranosidasa a pH 5,1 (Fig. 8a). Las
actividades específicas -arabinofuranosidasa son máximas a 30 y 37ºC para
las cepas de Oenococcus oeni ST y Pediococcus pentosaceus 12p
respectivamente. A 20ºC desciende 41,9 y 70% en las cepas ST y 12p
respectivamentel. Sin embargo el valor obtenido para la cepa ST continúa
- 58 -
c
0
500
1000
1500
2000
2500
O.o.ST P.p. 12p
Ac
t. E
sp
. (n
mo
les
/mg
/h)
■30 min; 37ºC; pH5,1■ 60 min; 37ºC; pH5,1 ■120 min; 37ºC; pH5,1
■ 3,5, 37ªC,30min, ■ 5,1; 37ºC; 30 min ■ 6,5; 37ºC; 30 min
■20ºC, pH 5,1; 30 min ■30ºC, pH 5,1; 30 min ■37ºC, pH 5,1; 30 min
a
0
500
1000
1500
2000
2500
O.o. ST P.p. 12p
Ac
t.e
sp
. (n
mo
les
/mg
.h)
b
0
500
1000
1500
2000
2500
O.o. ST P.p. 12p
Ac
t.e
sp
. (n
mo
les
/mg
.h)
siendo significativo (Fig. 8b). En la cepa ST se observa pérdida total de
actividad -arabinofuranosidasa en 120 min de incubación (Fig. 8c).
Fig. 8. Efecto del pH (a), temperatura (b) y tiempo de incubación (c) sobre
la actividad -arabinofuranosidasa.
- 59 -
En conclusión, los resultados demuestran que Oenococcus oeni ST
presenta actividades específicas β-glucosidasa y -arabinofuranosidasa en las
condiciones de temperatura y pH empleadas en la elaboración del vino.
Específicamente la enzima -arabinofuranosidasa incrementa su actividad a
pH 3,5 con respecto a valores superiores.
Efecto de etanol sobre las actividades β-glucosidasa y α-
arabinofuranosidasa en Oenococcus oeni ST y Pediococcus
pentosaceus 12p.
A pH 5,1 y 20°C, en la cepa Oenococcus oeni ST las actividades
específicas -glucosidasa y -arabinofuranosidasa se reducen 78% y 82%,
respectivamente en presencia de 8% de etanol. Cuando la concentración de
etanol incrementa al 12% no se observan modificaciones significativas (Fig.
9a,b) y se determinan valores de actividad específica de 2296 y 225
nmoles/mg.h para -D-glucosidasa y -arabinofuranosidasa, respectivamente.
Similar resultado fue demostrado en una cepa comercial de Oenococcus oeni
por Barbagallo y col., (2004). El etanol actúa como inhibidor de las enzimas
glicosídicas (Sánchez-Torres y col., 1998; Grimaldi y col., 2000; Spagna y col.,
2002).
- 60 -
a
0
100
200
300
O.o. ST P.p.12p
Ac
t.e
sp
. Re
lati
va %
b
0
100
200
300
400
500
600
700
O.o. ST P.p.12p
Ac
t.e
sp
. Re
lati
va %
■sin etanol; ■ 8% etanol; ■12% etanol
Fig. 9. Efecto de la adición de 8 y 12% de etanol sobre la actividad β-
glucosidasa (a) y -arabinofuranosidasa (b) en Oenococcus oeni ST y
Pediococcus pentosaceus 12p.
Mezcla de reacción, pH 5,1 se incuba a 20ºC 30 minutos.
La cepa 12p de Pediococcus pentosaceus presenta resultados
diferentes. La adición de 8 o 12% de etanol a la mezcla de reacción aumenta
significativamente las actividades glicosídicas a pH 5,1 y 20°C. En presencia
de la mayor concentración de alcohol, las actividades específicas -D-
glucosidasa y -arabinofuranosidasa aumentan 2,5 y 7 veces, respectivamente
(Fig. 9a,b). Pemberton y col. (1980) demostraron que el etanol incrementa la
velocidad de reacción al actuar como aceptor de un intermediario glicosílico
clave (glicosil-catión. Esta propiedad se relaciona con el mayor carácter
nucleofílico del alcohol que del agua. La concentración de etanol no modifica
significativamente los resultados obtenidos (Fig. 9a,b), contrariamente a lo
determinado por Williams (1993), Grimaldi y col. (2000, 2005a y 2005b).
- 61 -
Los resultados demuestran que el etanol influye estimulando o
disminuyendo las actividades glicosidasas según el microorganismo en estudio
y que su efecto no es dependiente de la concentración empleada.
En Pediococcus pentosaceus 12p las actividades enzimáticas
específicas incrementan significativamente, indicando que esta cepa aumenta
las potencialidades para hidrolizar compuestos glicoconjugados en medios
alcohólicos.
- 62 -
CONCLUSIONES
- 63 -
En vino artesanal sin filtrar ni clarificar se determina el mayor
número de microorganismos aislados y se identifican cepas pertenecientes
a la especie Oenococcus oeni y al género Pediococcus.
Se detecta actividad -glucosidasa y -arabinofuranosidasa en las
suspensiones celulares de las bacterias lácticas analizados. Las actividades
específicas -glucosidasa son superiores a las actividades específicas -
arabinofuranosidasa.
Las actividades específicas varían en función de la especie, fase de
crecimiento y composición del medio de cultivo.
Las máximas actividades específicas -glucosidasa corresponden a
células de Oenococcus oeni provenientes de medio MRS y cosechadas en
mitad de fase exponencial de crecimiento.
Las máximas actividades específicas -arabinofuranosidasa
corresponden a células de Pediococcus pentosaceus provenientes de medio
jugo de uva y cosechadas a mitad de fase exponencial de crecimiento.
Las actividades específicas -glucosidasa y -arabinofuranosidasa
son máximas a 30ºC y significativas a 20ºC, temperatura normalmente
empleada en vinificación.
- 64 -
Las actividades especificas -glucosidasa son máximas a pH óptimos
de crecimientos en ambos microorganismos. En Oenococcus oeni ST
continúa siendo significativa a pH 3,5.
La actividad específica -arabinofuranosidasa es máxima a pH 3,5 en
Oenococcus oeni. En Pediococcus pentosaceus 12p sólo se detecta ésta
actividad a pH 5,1.
Los resultados demuestran que en las condiciones de pH y
temperatura empleadas durante la vinificación la cepa de Oenococcus oeni
ST presenta las mayores potencialidades para producir compuestos de
aromas a partir de precursores glicoconjugados.
En presencia de etanol incrementan las actividades enzimáticas
específicas de Pediococcus pentosaceus 12p. Este resultado demuestra la
propiedad beneficiosa de este microorganismo para hidrolizar compuestos
glicosilados en medios alcohólicos como el vino.
- 65 -
Los resultados preliminares obtenidos durante este trabajo de Tesina son
importantes para una primera selección de BL aisladas de vinos argentinos con
potencialidad para producir compuestos que optimicen el aroma del producto
final a partir de precursores glicoconjugados, normalmente presentes en el
medio natural.
Dado el valor tecnológico de la investigación realizada y sus posibilidades de
aplicación, es importante continuar las investigaciones determinando las
actividades enzimáticas en medio vino con el fin de establecer sus influencias
sobre el aroma y color del producto final.
Además, es necesario que en la selección de cepas para conducir
fermentaciones específicas, se incorpore la capacidad de aportar compuestos
de aroma como criterio adicional de óptimas condiciones tecnológicas.
- 66 -
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