Señalización en Preacondicionamiento Isquémico...

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA DE POSTGRADO

Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de

Isquemia-Reperfusión Hepática en la Rata

Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biomédicas

PAMELA ROMANQUE ULLOA

Directores de tesis: Dr. Luis A. Videla C.

Dr. Mario O. Uribe M.

Santiago, Chile 2007

ÍNDICE GENERAL

_________________________________________________________________________________________________ Señalización en Preacondicionamiento Isquémico en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata

Doctorado en Ciencias Biomédicas - Facultad de Medicina - Universidad de Chile

i

ÍNDICE GENERAL

Nº Sección

PAG

ÌNDICE GENERAL i

ÍNDICE DE TABLAS vi

ÍNDICE DE FIGURAS vii

LISTA DE ABREVIATURAS xi

RESUMEN xv

ABSTRACT xvii

I INTRODUCCIÓN 1 1.1 Aspectos generales 1

1.1.1 Hepatotoxicidad y estrés oxidativo 1

1.1.2 Daño por isquemia-reperfusión y relevancia clínica 2

1.2 Mecanismos de daño por isquemia-reperfusión 3

1.2.1 Fases del daño por isquemia-reperfusión 4

1.3 Factores que participan en el daño secundario a isquemia-reperfusión 6

1.3.1 Pérdida de la homeostasis del calcio (Ca+2) 6

1.3.2 Generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) 6

1.3.3 Cambios en la microcirculación 7

1.3.4 Activación de las células de Kupffer 8

1.3.5 Activación de factores del complemento 8

ÍNDICE GENERAL



ii

Nº Sección

PAG

1.3.6 El óxido nítrico en isquemia-reperfusión (.NO) 9

1.3.7 Antioxidantes en isquemia-reperfusión 11

1.4 Factores de transcripción (NF-κB) y reprogramación de la expresión

génica en situaciones de estrés oxidativo

12

1.5 Preacondicionamiento isquémico 13

1.6 Respuestas hepatoprotectoras gatilladas por el preacondicionamiento

isquémico

15

1.6.1 Señales de supervivencia antiapoptótica y antioxidantes mediadas por

TNF-α

15

1.6.2 Respuesta de fase aguda y proteínas de shock térmico 16

1.7 Importancia biomédica 18

II HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 20 2.1 HIPÓTESIS 20

2.2 OBJETIVOS GENERALES 20

2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 21

III METODOLOGÍA 23 3.1 Animales de experimentación 23

3.2 Protocolo quirúrgico 23

3.3 Grupos experimentales 25

3.3.1 Modelo de daño por isquemia-reperfusión 25

3.3.2 Modelo de maniobra de preacondicionamiento isquémico 26

3.3.3 Modelo de ventana tardía del preacondicionamiento isquémico 26

3.4 Parámetros de daño hepático 27

3.4.1 Evaluación de histopatología hepática 27

3.4.2 Determinación de la actividad de transaminasas plasmáticas 27

3.4.3 Determinación de la actividad deshidrogenasa láctica (LDH) plasmática 28

3.5 Parámetros de estrés oxidativo 28

3.5.1 Determinación de contenido de glutatión total 28

3.5.2 Determinación de oxidación de proteínas hepáticas 29

ÍNDICE GENERAL



iii

Nº Sección

PAG

3.6 Determinación de niveles de citoquinas 30

3.7 Evaluación de la actividad de unión al ADN de factores de transcripción 30

3.7.1 Preparación de extractos nucleares 30

3.7.2 Electroforesis en geles de retardo EMSA (Electrophoresis mobility shift

assay) para NF-κB, AP-1 y HSF-1

31

3.7.2.1 Alineamiento de los oligonucleótidos de ADN 31

3.7.2.2 Marcación de oligonucleótidos 31

3.7.2.3 Ensayo EMSA 32

3.8 Evaluación de los niveles de proteínas relacionadas con la supervivencia

celular

32

3.8.1 Ténica de Western blot 32

3.8.1.1 Preparación de las muestras 32

3.8.1.2 Electroforésis en condiciones desnaturantes (PAGE-SDS) 33

3.8.1.3 Western blot 33

3.9 Técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa para

expresión de iNOS

35

3.9.1 Extracción de ARN 35

3.9.2 Síntesis de ADN a partir del ARN obtenido 35

3.9.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 36

3.10 Análisis de imágenes 37

3.11 Expresión de resultados y análisis estadístico 37

IV RESULTADOS 38 4.1 CARACTERIZACIÓN DE UN MODELO DE DAÑO POR ISQUEMIA-

REPERFUSIÓN

38

4.1.1 Evaluación de parámetros de daño heopatico en animales sometidos a

isquemia-reperfusión y controles

38

4.1.2 Evaluación histopatológica del hígado 40

4.1.3 Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en

animales sometidos a isquemia-reperfusión y controles

44

ÍNDICE GENERAL



iv

Nº Sección

PAG

4.1.4 Cinética de unión al ADN de NF-κB en animales sometidos a isquemia-

reperfusión y controles

47

4.2 CARACTERIZACIÓN DE LA MANIOBRA DE

PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO

48

4.2.1 Evaluación de parámetros de daño hepático en animales sometidos a la

maniobra preacondicionante y controles: actividad de transaminasas

plasmáticas

50

4.2.2 Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en

animales sometidos a la maniobra preacondicionante y controles

51

4.3 FASE TARDÍA DEL PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO 52

4.3.1 Evaluación de parámetros de daño hepático en animales sometidos a

preacondicionamiento isquémico y controles

52

4.3.1.1 Evaluación de la actividad de transaminasas plasmáticas 53

4.3.1.2 Evaluación de la actividad de LDH plasmática 55

4.4 Evaluación del efecto del pretratamiento con antioxidantes sobre el

preacondicionamiento isquémico

58

4.5 Evaluación de niveles de citoquinas séricas en animales sometidos a

preacondicionamiento isquémico y controles

61

4.6 Evaluación de la actividad de factores de transcripción en animales

sometidos a preacondicionamiento isquémico y controles

65

4.7 Evaluación de los niveles de proteínas relacionadas con citoprotección

en animales sometidos a preacondicionamiento isquémico y controles

72

V DISCUSIÓN 77 5.1 Modelo de daño por isquemia-reperfusión 78

5.1.1 Daño hepático en isquemia-reperfusión 78

5.1.2 Estrés oxidativo hepático en isquemia-reperfusión 79

5.1.3 Activación del factor de transcripción NF-κB en isquemia-reperfusión 80

5.2 Maniobra de preacondicionamiento isquémico y segunda ventana de

protección del preacondicionamiento isquémico

82

ÍNDICE GENERAL



v

Nº Sección

PAG

5.3 Daño y estrés oxidativo en el preacondicionamiento isquémico tardío 83

5.4 Maniobra preacondicionante y estrés oxidativo subletal 84

VI CONCLUSIONES 96 VII PROYECCIONES 98 VIII REFERENCIAS 101

ÍNDICE DE TABLAS



vi

INDICE DE TABLAS Nº Título PAG

1 Efectos celulares de la isquemia 3

2 Acciones del óxido nítrico 9

3 Descripción de la composición de las soluciones de preservación más

utilizadas

11

4 Histopatología hepàtica en el modelo de daño por isquemia reperfusión 41

5 Estímulos y respuestas a NF-κB 80

ÍNDICE DE FIGURAS



vii

ÍNDICE DE FIGURAS

Nº Título

PAG

1 Fase temprana del daño por isquemia-reperfusión 4

2 Fase tardía del daño por isquemia-reperfusión 5

3 Ventanas de protección del preacondicionamiento isquémico 15

4 Respuesta de genes de fase aguda mediada por citoquinas 16

5 Efecto de los distintos niveles de especies reactivas del oxígeno

sobre la respuesta celular

18

6 Clip de Schwartz y visión esquemática del modelo de isquemia

hepática parcial en el hígado de rata

24

7 Diseño experimental 27

8 Actividad de transaminasas séricas en animales sometidos a 60

minutos de isquemia y reperfusión de 0 a 72 h

39

9 Actividad de Lactato Deshidrogenasa plasmática en animales

sometidos a 60 minutos de isquemia y tiempos de reperfusión

variables

40

10 Tinción con Hemotoxilina-eosina de cortes de hígado de ratas

sometidas a isquemia y reperfusión temprana

42

11 Tinción con Hemotoxilina-eosina de cortes de hígado de ratas

sometidas a isquemia y reperfusión tardía

43

ÍNDICE DE FIGURAS



viii

Nº Título

PAG

12 Contenido de derivados carbonilos, producto de oxidación de

proteínas en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia

45

13 Contenido de Glutatión total en hígado de ratas sometidas a 60

minutos de isquemia

45

14 Velocidad de caída de 2 a 20 horas del contenido de Glutatión total

en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia

46

15 Índice de estrés oxidativo de 2 a 70 horas en hígado de ratas

sometidas a 60 minutos de isquemia:

47

16 Efecto de 60 minutos de isquemia sobre la actividad de unión al

ADN de NF-κB hepático durante la reperfusión

48

17 Niveles de transaminasas séricas en animales sometidos a PI 24 h

antes de la isquemia prolongada

49

18 Niveles de transaminasas séricas en animales sometidos a

maniobra de preacondicionamiento isquémico y controles

50

19 Parámetros de estrés oxidativo en animales sometidos a maniobra

de preacondicionamiento isquémico y controles

52

20 Actividad de ALT sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes

de la isquemia prolongada

54

21 Actividad de AST sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes


55

22 Actividad de LDH sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes


56

23 Oxidación de proteínas hepáticas en animales sometidos a PI 72

horas antes de la isquemia prolongada

57

24 Contenido de glutatión total en animales sometidos a PI 72 horas


57

25 Indice de estrés oxidativo en animales sometidos a PI 72 horas


58

ÍNDICE DE FIGURAS



ix

Nº Título

PAG

26 Efecto del pretratamiento con NAC sobre las transaminasas séricas

de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia

prolongada durante la reperfusión temprana

60

27 Efecto del pretratamiento con NAC sobre las transaminasas séricas

de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia

prolongada durante la reperfusión tardía.

61

28 Niveles de TNF-α sérico en animales sometidos a PI 72 horas antes


62

29 Niveles de IL-6 sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes


63

30 Niveles de IL-1β sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes


63

31 Niveles de IL-10 sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes


64

32 Efecto del PI sobre la activación de NF-κB en animales sometidos a

isquemia y reperfusión temprana

66

33 Efecto del PI sobre la activación de NF-κB en animales sometidos a

isquemia y reperfusión tardía

67

34 Efecto del PI sobre la activación de AP-1 en animales sometidos a


68

35 Efecto del PI sobre la activación de AP-1 en animales sometidos a


69

36 Efecto del PI sobre la activación de HSF-1 en animales sometidos a


70

37 Efecto del PI sobre la activación de HSF-1 en animales sometidos a


71

38 Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de

NF-kB, AP-1 y HSF-1 en animales sometidos a isquemia durante la

reperfusión temprana y tardía

72

ÍNDICE DE FIGURAS



x

Nº Título

PAG

39 Efecto del PI sobre los niveles de fibrinógeno hepático 73

40 Efecto del PI sobre los niveles de haptoglobina hepática 74

41 Efecto del PI sobre los niveles de HO-1 hepática 75

42 Efecto del PI sobre los niveles de HSP 70 hepática 75

43 Efecto del PI sobre los niveles de ARNm de iNOS hepática 76

44 Segunda ventana de protección del preacondicionamiento

isquémico

88

LISTA DE ABREVIATURAS



xi

LISTA DE ABREVIATURAS ADA Desaminasa de adenosina

ALT o ALAT Alanina amino transferasa

AMPc AMP cíclico

ANP Atrial natriuretic peptide, péptido atrial natriurético

AP-1 Activator protein-1

APS Persulfato de amonio

AST o ASAT Aspartato amino transferasa

ATP Adenosina trifosfato

bcl-2 B-cell lymphoma 2

BPB Azul de bromofenol

CaM Calmodulina

CAT Catalasa

C/EBP CCAAT enhancer binding protein

CO Monóxido de carbono

CXC Quimioquinas

dATP, dGTP,

dCTP, dTTP

trifosfato de desoxiadenosina, trifosfato de desoxiguanidina,

trifosfato de desoxicitidina, trifosfato de desoxitimidina

DEPC Dietilpirocarbonato

DNPH 2,4-dinitrofenilhidrazina

DTT Ditiotreitol




xii

DTNB Ácido 55'-dithiobis-(2-nitrobenzoico)

EDRF Endothelium Derived Relaxant Factor

EDTA ácido etilendiaminotetracético

ELISA Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay

EMSA Electroforetic mobility shift assay

ET Endotelina

FADD Fas-associated deathdomain

FAD dinucleótido de flavina y adenina oxidado

FMN mononucleótido de flavina

GC Guanilil ciclasa

GdCl3 Cloruro de gadolinio

GMPc GMP cíclico

GOT Transaminasa glutámico oxalacética

GPT Transaminasa glutámico pirúvica

Groα Corepresor transcripcional de la familia Groucho

GSH Glutatión reducido (gamaglutamil-cisteinil-glicina)

GSSG Glutatión oxidado

HIF-1 Hypoxia-inducible factor 1

H2O2 Peróxido de hidrógeno

HO-1 Heme-oxigenasa-1

HSE Heat shock element

HSF-1 Heat shock factor-1

Hsp Heat shock protein

ICAM Intercellular adhesión molecule

IκB Inhibidor de NF-κB

IKK Kinasa de IκB

IL Interleuquina

INF Interferón

i.p. intraperitoneal

IPF Initial poor function




xiii

IR Isquemia-reperfusión

i.v. Intravenosa

JNK/SAPK Kinasa N-terminal de c-jun o proteína kinasa activada por estrés

LDH Lactato deshidrogenasa

LIF Leucemia inhibitory factor

L-NAME N (G)-nitro-L-arginina metil ester

LPS Lipopolisacárido

MAPK Proteínas quinasas activadas por mitógenos

MCP-1 Monocyte chemotactic protein-1

MIP-1α Macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP- 1 alpha)

mosm Miliosmoles

MPI Maniobra de preacondicionamiento isquémico

MPO Mieloperoxidasa

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido

NF-κB Nuclear factor -κB •NO Monóxido de nitrógeno u óxido nítrico

NAC N-acetil cisteína

NF-κB Nuclear factor κB

NOC-9 Donante de .NO 1-(N-metil-N-[6-(N-etilamoniohexil)amino])-

diazen-1-ium-1,2-diolato

NOS Óxido nítrico sintasa

eNOS o NOS3 NOS endotelial

iNOS o NOS2 NOS inducible

mtNOS NOS mitocondrial

nNOS o NOS1 NOS neuronal

NOX Familia de NADPH oxidasas

ONOO- Anión peroxinitrito •OH Radical hidróxilo

O2•- anión superóxido

p38 MAPK




xiv

p50 NF-κB1

p53 Proteína supresora de tumor

p65 RelA

PCNA Proliferating cell nuclear antigen

PKC Proteína kinasa C

PMN Polimorfonuclear (polimorfonucleares)

PMSF fenil-metil-sulfonil-fluoruro

PNF Primary non function

RORα Retinoic acid receptor-related orphan receptor alpha

ROS Especies reactivas del oxígeno

RXR Retinoic acid receptor

s.c. subcutánea

SOD Superóxido dismutasa

Sp1 Specificity protein 1 transcription factor

STAT Signal transducers and activators of transcription factors

SVP Segunda ventana de protección

TBE Tampón tris, ácido bórico y EDTA

TBS Tampón tris-salino

TCA Ácido tricloroacético

TCR T cell receptor

THO Trasplante hepático ortotópico

TK Tirosina kinasa

TEMED N,N,N´,N´-tetra-metiletilenediamina

TLR4 Toll like receptor 4

TNF-α Factor de necrosis tumoral-α

TNFR Receptor de TNF

TRAF Tumor necrosis factor receptor-associated factors

VDR Vitamin D receptor

XD Xantina deshidrogenasa

XO Xantina oxidasa

RESUMEN/ABSTRACT

_____________________________________________________________________________________________

Señalización en Preacondicionamiento Isquémico Tardío en un Modelo de Isquemia Reperfusión Hepática en la Rata Doctorado en Ciencias Biomédicas – Facultad de Medicina - Universidad de Chile

xv

RESUMEN El daño por Isquemia-Reperfusión (IR) es un fenómeno de acentuación del

daño celular en un órgano isquémico después del reestablecimiento del flujo

sanguíneo. En el hígado va asociado a la cirugía que se realiza bajo exclusión

vascular, al trasplante del órgano y a estados de shock o trauma con compromiso

multisistémico. La isquemia induce un estado proinflamatorio que aumenta la

vulnerabilidad del tejido durante la reperfusión. Cursa en dos fases: temprana y

tardía, que se asocian a la activación de las células de Kupffer y a la llegada,

infiltración y activación de linfocitos polimorfonucleares, respectivamente. La

exposición a un período breve de isquemia previo a un período de isquemia más

prolongado, resulta en protección tisular; fenómeno que se conoce como

preacondicionamiento isquémico (PI). El PI otorga dos ventanas de protección:

temprana y retardada. La fase protectora retardada o segunda ventana de

protección (SVP) del PI no se ha descrito en el hígado. Los objetivos de este

estudio fueron: (i) desarrollar un modelo de IR hepática parcial en la rata, (ii)

determinar la existencia de la SVP del PI en el hígado, (iii) evaluar el efecto del

pretratamiento con antioxidantes sobre el PI y (iv) comprobar la aparición de

respuestas protectoras dependientes del factor de transcripción redox sensible

NF-κB inducidas por el PI. Se realizó PI a ratas Sprague Dawley machos, para lo

cual se las sometió a un período de 10 minutos de isquemia 72 horas antes de la

isquemia prolongada (60 minutos). El PI fue precedido una hora antes de una

dosis de NAC o su vehículo. Se obtuvieron muestras de sangre y tejido durante la

RESUMEN/ABSTRACT

_____________________________________________________________________________________________


xvi

reperfusión de 0 a 72 horas para los animales de los grupos que caracterizaron el

modelo de daño por IR y a las 3 y/o 20 horas de reperfusión post isquemia

prolongada, para los animales sometidos a PI+IR.

El modelo de daño por IR con 60 minutos de isquemia hepática parcial en la

rata, que se describe en este estudio, presenta dos fases: temprana y tardía, que

coinciden en los marcadores enzimáticos e histológicos de daño. El factor de

transcripción NF-κB tiene un comportamiento bifásico durante el período post-

reperfusión de 0 a 72 horas que sigue a 60 minutos de isquemia. Se comprobó la

existencia de la SVP en el hígado y ésta se caracteriza por: (i) una disminución de

la actividad sérica de AST, ALT y LDH, y (ii) una disminución en el estrés

oxidativo tisular hepático. Durante la SVP se encontró disminución de los niveles

séricos de citoquinas proinflamatorias y activación temprana de NF-κB, además de

modulación de la respuesta de fase aguda y disminución de la expresión del

mARN de iNOS. El pretratamiento con antioxidante no modifica la protección

mediada por el PI.

Se concluye la existencia de la SVP en el hígado, ventana que se

desarrollaría al menos después de 48 horas del estímulo preacondicionante. La

protección desencadenada por el PI tardío no dependería de la generación de

ROS durante la isquemia breve o preacondicionante y cursaría con disminución de

la respuesta inflamatoria y modulación de la respuesta de fase aguda, entre otros

efectores.

RESUMEN/ABSTRACT

_____________________________________________________________________________________________


xvii

ABSTRACT

Ischemia-reperfusion (IR) injury is the augmentation of the cellular damage

in ischemic tissue after reperfusion. Liver IR is related to surgery performed under

vascular exclusion, organ transplantation, multisistemic trauma and shock.

Ischemia induces a pro-inflammatory state which increases tissue susceptibility to

damage during reperfusion. IR injury has an early and a late phase, the first

depending mainly upon Kupffer cell activation and the later on PMN invasion,

permeation and activation.

Exposure to a brief period of ischemia induces tolerance to subsequent

longer ischemia, phenomenon known as ischemic preconditioning. (IP). IP

provides two windows of protection, early and delayed. The late phase of IP or

second window of protection (SWOP) has not been described in the liver. The aims

of this study were: (i) to develop a model of partial liver IR in the rat, (ii) to

determine the existence of the late phase of IP in the liver, (iii) to evaluate the

effect of antioxidant pretreatment over IP and (iv) to check if IP triggers redox

sensitive NF-κB mediated-responses. Male Sprague Dawley rats underwent 10

minutes of ischemia or sham surgery 72 hours prior 60 minutes of ischemia.

Treatment with NAC or its vehicle was administered 1 hour before PI. Serum and

tissue samples were taken 0 to 72 horas to IR liver injury groups and at 3 and/or 20

hours of reperfusion to IP+IR groups.

Partial liver injury with 60 minutes of ischemia has an early and a late phase,

determined by enzimatic and histologic injury markers. Transcription factor NF-κB

behaves biphasically during 0-72 reperfusion hours period after 60 minutes of

RESUMEN/ABSTRACT

_____________________________________________________________________________________________


xviii

ischemia. SWOP develops in liver and it is characterized by (i) decrease in serum

levels of AST, ALT, LDH, and (ii) reduction of liver tissue oxidative stress status.

Throughout SWOP it was found a decrease in pro-inflammatory cytokines levels

in serum and early activation of NF-κB, in addition to modulation of acute phase

response and lower levels of iNOS mRNA. PI was not abolished by NAC

pretreatment.

In conclussion, data presented confirm the existence of SWOP in the liver,

that is not dependent upon IP-generated ROS, being associated with a diminution

in the inflammatory response and modulation of acute phase response.

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


1

I.- INTRODUCCIÓN

1.1- Aspectos generales

1.1.1- Hepatotoxicidad y estrés oxidativo

La hepatotoxicidad es un fenómeno multifactorial 1, 2 en el que pueden

concurrir mecanismos tales como una excesiva generación de radicales libres y

otros agentes oxidantes1-3, pérdida del potencial antioxidante celular 4 alteraciones

metabólicas y/o energéticas1, 2, y modificación de la actividad de células no

parenquimáticas del sinusoide hepático 5. Algunos de estos mecanismos

incrementan el estado de estrés oxidativo tisular, desbalance que puede gatillar

mecanismos asociados con el daño y muerte celular 6. En estas condiciones el

hígado puede (i) alcanzar un punto de no retorno en el que se induce la muerte

celular por la incapacidad de compensar adecuadamente las alteraciones

inducidas1, o (ii) reprogramar la expresión génica de las células sobrevivientes

con remodelación o regeneración celular 7.

Las células parenquimáticas o hepatocitos conforman el 90% de la masa

hepática y el 65% del número de células. Existen tres tipos principales de células

no parenquimáticas, las células: del endotelio sinusoidal, estrelladas y de Kupffer;

éstas últimas constituyen los macrófagos residentes en el hígado, representando

el 80% de los macrófagos del organismo 7, 8. Las células tienen la capacidad de

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


2

regular varias etapas dentro de la secuencia ADN-proteína. La iniciación de la

transcripción constituye uno de los mecanismos de control más importantes 9. Si

bien el estrés oxidativo actúa como mecanismo citotóxico 6, algunas formas

radicalarias del oxígeno (O2), como el peróxido de hidrógeno (H2O2) pueden

activar factores de transcripción que regulan una amplia variedad de genes

involucrados en la promoción de señales de muerte o supervivencia celular 9.

1.1.2.- Daño por isquemia-reperfusión y relevancia clínica

Existen numerosas situaciones en las que puede ocurrir isquemia, falta o

disminución del flujo sanguíneo a un órgano, y con ello disminución del aporte de

O2 y nutrientes al tejido. El daño por IR es un fenómeno de acentuación del daño

celular en un órgano isquémico después del reestablecimiento del flujo de O2 10, 11.

Los mecanismos de daño asociados a IR participan en la patogenia de situaciones

clínicas como el infarto miocárdico, accidente cerebrovascular, traumatismos

mayores, algunas cirugías, y shock de diverso origen 11.

En el hígado, el daño por IR está asociado al trasplante, cirugía hepática

resectiva o de reconstrucción vascular y trauma 12. En aquellas cirugías que

precisan de exclusión vascular para controlar la hemorragia, ésta se realiza a

través del clampeo de la arteria hepática y la vena porta (Maniobra de Pringle).

Esta oclusión puede ser continua (ej. 30 minutos durante la transección hepática)

o intermitente (ej. oclusión durante 10 minutos y reperfusión durante 5 minutos

antes de la re-oclusión) El clampeo continuo expone al hígado a mayor tiempo de

isquemia, lo que se relaciona con la severidad del daño por IR, mientras que el

clampeo intermitente, si bien se asocia a mayor pérdida de sangre, tiene una

menor incidencia de falla hepática postquirúrgica 13.

En el caso del trasplante hepático, al momento de procurar el órgano se

perfunde con una solución de preservación fría, y se mantiene a 4º C hasta el

momento de la implantación en el receptor, período de tiempo que se denomina

de preservación o isquemia fría. La isquemia fría prolongada (mayor a 12 horas)

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


3

es un factor de riesgo significativo para la falla primaria del injerto (primary non-

function, PNF), disfunción primaria del injerto (initial poor function, IPF) y rechazo

agudo post trasplante. En algunos de estos casos se requiere con urgencia un

retrasplante 13.

Considerando el déficit en el número de donantes de órganos para el

trasplante y el aumento de patologías que determinan injertos subóptimos, como

la esteatósis hepática, que son particularmente susceptibles al daño, la

importancia del estudio de los mecanismos y potenciales maniobras protectoras

contra el daño por IR en el hígado genera gran interés en la comunidad científica y

médica.

1.2.- Mecanismos de daño en isquemia-reperfusión

La isquemia prolongada se asocia a una variedad de cambios metabólicos y

ultraestructurales en la célula (Tabla 1) 14-17.

Efectos celulares de la isquemia Alteración del potencial de membrana Alteración de la distribución de iones intracelulares (↑Ca++ y Na+ intracelular) Aumento del volumen celular Desorganización del citoesqueleto Acumulación de hipoxantina Disminución de ATP, fosfocreatina y glutatión Acidosis celular

En condiciones de isquemia prolongada ocurren cambios funcionales que

incluyen (i) la disminución de la fosforilación oxidativa y de las bombas de

membrana dependientes de ATP, con la consiguiente entrada de calcio, sodio y

agua a la célula, (ii) el catabolismo del ATP que lleva a la acumulación de

hipoxantina con generación de especies reactivas del O2 (ROS) con la reentrada

del O2, (iii) la promoción de la expresión de productos génicos proinflamatorios

(moléculas de adhesión de leucocitos, citoquinas) y agentes bioactivos

Tabla 1: Efectos celulares de la isquemia

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


4

(endotelina, tromboxano A2) a nivel endotelial y (iv) la represión de los productos

de algunos genes protectores [óxido nítrico sintasa (NOS) constitutiva,

trombomodulina] y agentes bioactivos [prostaciclina, óxido nítrico (.NO)]. Así, la

isquemia induce un estado proinflamatorio que aumenta la vulnerabilidad del tejido

durante la reperfusión 15.

1.2.1.- Fases del daño por isquemia-reperfusión

El daño hepático secundario a la IR involucra dos fases bien caracterizadas.

La fase temprana, que comprende desde el inicio de la reperfusión hasta la 3a-4a

horas, está asociada a la activación de las células de Kupffer con producción de

ROS, activación de factores del complemento y el reclutamiento y activación de

linfocitos residentes (Figura 1) 14-16.

La fase tardía comprende alrededor de 6-24 horas posteriores y es

dependiente de la llegada, infiltración y activación de linfocitos polimorfonucleares

(PMN) 16. En esta fase, las citoquinas proinflamatorias, principalmente factor de

necrosis tumoral-α (TNF-α), la interleuquina (IL)-6 e IL-1, quimioquinas, y factores

del complemento liberados durante la reperfusión temprana son los responsables

Isquemia-reperfusión

Activación de la célula de Kupffer

TNF-α IL-1β

ROS IL-6, IL-10, IL-13, SLP,

Antioxidantes

Activación PMN sistémicos

Acumulación PMN en

sinusoides

Reclutamiento y activación de

leucocitos Activación C

C5a

Activación hepatocitos y

EC

Expresión de moléculas de

adhesión

Rolling y adherencia de

PMN

Daño hepatocitos

y EC

ROS intracelulares

PAF CXC C5a

Figura 1: Fase temprana del daño por isquemia-reperfusión.

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


5

del reclutamiento de PMN (Figura 2) 15-17. La infiltración de PMN en el hígado

perpetúa y amplifica el daño por la liberación adicional de mediadores como ROS,

TNF-α y proteasas 18. Si el daño endotelial es severo la migración transendotelial

de los neutrófilos ocurre fácilmente, sin embrago, ella requiere de la participación

de moléculas de adhesión como ICAM-1 si el daño es de menor magnitud, cuya

expresión aumenta en los hepatocitos en respuesta al TNF-α, IL-1 e interferón-γ

(INF-γ) 18.

La vía principal de generación de ROS en los neutrófilos involucra a la

NADPH oxidasa. Aunque la liberación de radical O.-2 y la subsiguiente dismutación

a H2O2 constituyen los principales oxidantes que se forman durante esta etapa, la

activación concomitante de mieloperoxidasa resulta en la formación de ácido

hipocloroso como un potente oxidante adicional 16.

Expresión en EC VCAM/ICAM

PMN activados en los sinusoides y vénulas

EXTRAVASACIÓN

Adherencia a hepatocitos

Expresión ICAM en hepatocitos

TNF IL-1

ROS proteasas

ROS

CXC Productos de la

lipoperoxidación

Figura 2: Fase tardía del daño por isquemia-reperfusión

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


6

1.3.- Factores que participan en el daño secundario a IR

Si bien los mecanismos precisos que conducen al daño por IR no han sido

elucidados, existe evidencia sustancial respecto de la participación de diversos

factores.

1.3.1.- Pérdida de la homeostasis del calcio (Ca+2)

Uno de los primeros factores implicados en la patogenia de la lesión por IR

fue el nivel de Ca+2, ya que se acumula en los tejidos postisquémicos y el uso de

bloqueadores de los canales de Ca+2 disminuye la lesión 19-22. El mecanismo a

través del cual se relaciona el aumento del Ca+2 intracelular con el daño involucra

tanto la activación de enzimas hidrolíticas dependientes de Ca+2 (fosfolipasas,

proteasas, nucleasas) como el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa

mitocondrial con la consecuente disminución del nivel de ATP 23, 24.

1.3.2.- Generación de especies reactivas del oxígeno (ROS)

Las ROS se generan durante el metabolismo aeróbico celular y son

neutralizados por diversos mecanismos antioxidantes. La inflamación, hiperoxia,

radiaciones, metales pesados y diversos xenobióticos aumentan la generación de

ROS, condiciones que al lograr el desbalance entre los procesos antioxidantes y

prooxidantes favoreciendo estos últimos, inducen el fenómeno de estrés oxidativo

citotóxico 25.

Fisiológicamente entre el 1-3% de la utilización del O2 produce ROS 19.

Estos pueden provocar daño a las membranas celulares por la peroxidación de los

ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos, fenómeno producido

preferentemente por O.-2 o por el radical hidroxilo (OH.), aunque también los

radicales peróxidos e hidroxilos derivados de ácidos grasos poseen actividad

oxidante y, por tanto, capacidad de ampliar el efecto lesivo. El daño de la

membrana puede afectar la integridad de la célula o sus organelos

comprometiendo seriamente la función celular 6. El estrés oxidativo puede,

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


7

además, dañar otras moléculas eseciales, tales como proteínas y ADN,

produciendo alteraciones en algunos aminoácidos y degradación de proteínas

oxidadas, y desde daño a ruptura del material genético 6.

Durante la IR se ha detectado la formación de ROS en forma directa e

indirecta 26, 27. Ellas han sido relacionadas con el daño generado ambas fases del

daño por IR 28, 29, y el uso de antioxidantes como α-tocoferol 30, alopurinol 11 y las

enzimas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) 31 atenúan este daño.

Entre las fuentes generadoras de ROS potenciales en el hígado se cuentan

(i) la transformación, mediada por proteasas dependientes de Ca+2, de la xantina

deshidrogenasa en xantina oxidasa, que en presencia de O2 durante la reperfusión

oxida a la hipoxantina a ácido úrico con generación del anión superóxido (O.-2) y

peróxido de hidrógeno (H2O2) 23, 32, 33. (ii) La actividad NADPH oxidasa presente en

las células de Kupffer y fagocitos hepáticos, cuya inhibición bloquea la generación

de ROS y la patología hepática asociada a la ingesta de alcohol 34. (iii) La

producción de .NO por las NOS hepáticas y su posible conversión en peroxinitrito,

ambas especies reactivas del nitrógeno (RNS) 25.

1.3.3.- Cambios en la microcirculación

El flujo a un órgano isquémico no se reestablece completamente después

de liberar una oclusión vascular 14. Las modificaciones en la microcirculación

durante la isquemia o reperfusión inicial del tejido llevan a áreas que no se

prefunden después del reestablecimiento del flujo al órgano, fenómeno que se

conoce como no-reflujo (no-reflow) 35. Estos cambios incluyen aumento de

volumen celular con protrusión al lumen de los vasos, adherencia de leucocitos,

agregación plaquetaria, acumulación de fluido intracelular y vasoconstricción 14.

La falla microcirculatoria podría ser el fenómeno inicial que llevaría al no-

reflujo, con la liberación de citoquinas proinflamatorias, formación tapones

sinusoidales de neutrófilos y otras células, e inducción de un estado de estrés

oxidativo. Este fenómeno parece estar mediado por la lesión del endotelio

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


8

sinusoidal y desbalance entre las moléculas vasodilatadoras y vasoconstrictoras,

como endotelina (ET) y .NO que se producen en el proceso de IR 16.

1.3.4.- Activación de las células de Kupffer

Durante la reperfusión temprana las células de Kupffer se activan

exhibiendo cambios morfológicos como aumento de volumen, protrusión a los

sinusoides y citoplasma vacuolado, lo que reduce el lumen sinusoidal, y contribuye

al fenómeno de no-reflujo 35, 36. La célula de Kupffer activada libera mediadores

proinflamatorios como TNF-α, IL-6, IL-1 y prostaglandinas, agentes

antiinflamatorios como la IL-10 e IL-13 y ROS, principalmente H2O2 y O.-2, por

acción de la NOX-2. La activación de la célula de Kupffer modula el daño inicial

tanto en isquemia fría 37 como en isquemia caliente 38.

A través de quimioluminiscencia, se ha determinado una respuesta

respiratoria temprana, alrededor de los 30 minutos de reperfusión, seguido de una

disminución y un nuevo aumento entre las 4 a 12 horas de reperfusión. Ambas

fases del daño por IR se modifican al agregar Cloruro de Gadolinio (GdCl3),

aunque menormente la fase tardía, lo que implica la generación de ROS por otros

tipos celulares, además de la célula de Kupffer 39.

1.3.5.- Activación de factores del complemento

El sistema del complemento también se activa en IR, lo que se estableció

en 1993 40, siendo particularmente importantes los factores C3a, C5a, iC3b y C5b-

9. C5a se une al receptor C5aR en PMN, monocitos y macrófagos y aumenta la

adhesividad de los neutrófilos, provocando su agregación y estimulando la

producción de ROS 8. Además de estimular los leucocitos y la quimiotaxis, C5a

amplifica la respuesta inflamatoria al inducir la producción de MCP-1 (methyl-

accepting chemotaxis proteins), TNF-α, IL-6 e IL-1 23. C5b e iC3b también pueden

alterar la homeostasis vascular e iC3b participa en la adhesión de los leucocitos al

endotelio vascular vía integrina β2, CD11b-CD18 (Mac-1) 23.

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


9

El complemento es un mediador crítico en la amplificación de la respuesta

inflamatoria, y la intervención de su cascada de activación atenúa el daño por IR.

El tratamiento con un inhibidor de C1, que actúa a nivel de la vía clásica, aumenta

el número de sinusoides perfundidos y disminuye la agregación de leucocitos y

plaquetas 41, mientras que el uso de un antagonista del receptor de C5a disminuye

la mortalidad, el daño hepático y los niveles de TNF-α, MPO y la infiltración de

PMN en un modelo de IR parcial 42. En pacientes receptores de injerto en

trasplante hepático ortotópico (THO) los niveles séricos de C3a y C5b aumentan

durante la reperfusión temprana (120 minutos). El alza, sin embargo, fue similar

con tiempos de isquemia fría breves (<12 horas) versus prolongados (>12 horas) 43 por lo que la importancia biológica y su utilidad clínica no se han determinado

1.3.6.- El óxido nítrico (.NO)

El .NO se forma a partir de L-arginina por la acción de enzimas NOS, que

comprenden 3 isoformas, una inducible que se expresa principalmente bajo

condiciones patológicas (iNOS, NOS2), y dos constitutivas: eNOS (NOS3) y nNOS

(NOS1), que se expresan en endotelio y en sistema nervioso, respectivamente. El .NO cumple múltiples funciones fisiológicas y patológicas como mediador intra e

intercelular en procesos de inmunomodulación, neurotransmisión y regulación del

tono vascular (Tabla 2) 44-46.

Blanco Respuesta Guanilil ciclasa (GC) Elevación de cGMP GC en Plaquetas Inhibición de la agregación GC en Músculo liso Relajación Leucocitos Inhibición de NADPH oxidasa y activación de la sintasa de prostaglandinas Radicales peroxi-lipídicos

Posible efecto antioxidante y consecuentemente anti ateroesclerótico

Radicales superóxido Atrapamiento de radicales superóxido con formación de peroxinitrito Metaloproteínas A altas concentraciones (1-5 μM) inhibición de citrocromo c oxidasa y otras

enzimas que contienen hierro

Tabla 2: Acciones del óxido nítrico (NO o Monóxido de Nitrógeno)

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


10

La modificación del diámetro de los vasos sanguíneos está regulado por

agentes vasoconstrictores, como las aminas biogénicas, y vasodilatadores, como .NO, producidos en las células endoteliales 47. La acción de .NO sobre el tono

vascular se ejerce a través de cGMP que desencadena una cascada de eventos

que llevan a la reducción del tono muscular 47. Las acciones del .NO pueden

mediar el daño por ya sea por una acción relajadora a nivel de células estrelladas

o participación en la adhesión de los neutrófilos al endotelio y en la agregación

plaquetaria 48.

El .NO se asocia a la apoptosis de forma dual. A concentraciones

fisiológicas la apoptosis se inhibe por nitrosilación de caspasa 3, efecto asociado

a la inhibición de la liberación de citocromo c por bloqueo del clivaje de Bcl-2

(caspasa 3-dependiente). A niveles altos el .NO actúa induciendo apoptosis, lo que

podría estar mediado por peroxinitrito, el cual modificaría la permeabilidad

mitocondrial con la consecuente liberación de citocromo c, y provocaría daño al

DNA con la consiguiente activación de PARS [poly (ADP-ribose) synthase] 48.

En el hígado eNOS regula el flujo sanguíneo produciendo .NO en respuesta

a vasodilatadores dependientes del endotelio o estrés mecánico (shear stress o

estrés de cizallamiento), pero no participa en la regulación del flujo portal total, si

no más bien a nivel de sinusoide, regulando la distribución local de la perfusión y

la presión portal 48. iNOS se ha identificado en macrófagos, células epiteliales y

estrelladas, hepatocitos, y colangiocitos. Produce mayor cantidad de .NO en

comparación con eNOS y no es una enzima alostérica, por lo que manifiesta su

actividad hasta que es degradada. La falta de regulación fina y la gran cantidad de .NO que produce iNOS sugieren que este exceso de .NO puede llevar a daño

hepático 48, además de que la actividad de iNOS está prácticamente ausente en el

hígado normal y se gatilla en respuesta a inflamación y estrés oxidativo 49.

En IR, el .NO protegería a los hepatocitos y células endoteliales contra la

lesión, efecto que parece estar mediado por la vasodilatación inducida y represión

de la expresión de moléculas de adhesión y selectina–E a nivel endotelial 48-49. La

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


11

expresión de iNOS y el aumento de .NO secundario en el injerto hepático se han

correlacionado con rechazo post THO 50, aunque los niveles séricos de .NO

monitorizados en humanos, intra y postoperatorio de THO, aumentaron y no se

asociaron con patología postoperatoria 28. Los niveles de .NO según se presenten

en el injerto del donante o en el receptor podrían explicar este resultado

aparentemente contradictorio.

1.3.7.- Antioxidantes en isquemia-reperfusión

Se ha observado que los niveles de antioxidantes endógenos caen durante

la reperfusión, lo cual probablemente se debe a su degradación, secundaria al

aumento de la actividad radicalaria. Antioxidantes enzimáticos (SOD) y no

enzimáticos (alopurinol, NAC y α-tocoferol) atenúan el daño por IR 12, 28.

Algunas de las soluciones de preservación que se utilizan en el trasplante

de órganos también contienen antioxidantes, que participan en la prevención o

minimización del daño por isquemia fría. (Tabla 3) 51, 52.

Wisconsin ViaSpan® EuroCollins

Celsior®HTK - Custodiol®

pH 7.4 7.02 - 7.2 Osmolaridad 320 mosm/l 370 mosm/kg 360 mosm/kg 310 mosm/kg Na - Na+ = 85 mmol/l Na+ = 100 mmol/l NaCl = 15,0 mmol/l K KOH = 5.61 g/l K+ = 40 mmol/l K+ = 15 mmol/l KCl = 9,0 mmol/l Cl - Cl- 15 41.5 - Anión Cl : 50 mEq Mg MgSO4 = 1.23 g/l - Mg+2 = 13 mmol/l MgCl = 4,0 mmol/l Ca - - Ca +2 = 0.26 mmol/l CaCl = 0,015 mmol/l Otros iones K2PO4 = 3.4 g/l PO4

-2 = 57.5 mmol/l - - HCO3

- = 10 mmol/l Glucosa - Glucosa 3.5 % - - Aminoácidos - - Histidina = 30 mmol/l Cetoglutarato = 1,0 mmol/l - Glutamato = 20 mmol/l Histidina = 180,0 mmol/l Triptófano = 2,0 mmol/l Glutatión Glutatión = 0.922 g/l - Glutatión = 3 mmol/l - Otros Adenosina = 1.34 g/l - Manitol = 60 mmol/l Manitol =30,0 mmol/l

Alopurinol = 0.136

g/l Lactobionato = 80

mmol/l Rafinosa = 17.83 g/l Lactona = 35.83 g/l

Tabla 3: Descripción de la composición de las soluciones de preservación más utilizadas

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


12

1.4.- Factores de transcripción (NF-κB) y reprogramación de la expresión

génica en situaciones de estrés oxidativo

El factor de transcripción NF-κB es un factor dimérico que se encuentra en

el citoplasma retenido por la proteína inhibidora IκB 53. Diferentes vías de

transducción de señales activan a NF-κB, vía degradación de IκB, liberación del

dímero p50p65 activo y su traslocación al núcleo, con la activación de los genes

que contienen los sitios de unión a proteínas Rel (sitios κB) 53. La relación entre el

estrés oxidativo y la estimulación de la expresión génica está apoyada por la

activación del NF-κB, evidenciada por el aumento significativo en su capacidad de

unión al DNA en situaciones de estrés oxidativo 53, 54.

En IR fría se ha observado que NF-κB tiene un patrón de activación

bifásico, con un pico temprano entre los 30 minutos y 3 horas de reperfusión y un

segundo pico a las 9-12 horas de reperfusión. Durante la fase temprana, la

activación de NF-κB se asocia al aumento en la expresión de citoquinas

proinflamatorias IL-1β, IL-6 y TNF-α, lo que no ocurre durante la fase tardía

donde, por otra parte, la inhibición de la activación de NF-κB resulta en un mayor

daño en el tejido, lo que sugiere un rol dual para este factor de transcripción 55.

Otros factores de transcripción redox sensibles incluyen a AP-1 y entre los

genes de respuesta temprana que O.-2 y H2O2 pueden inducir se cuentan c-jun y

c-fos 9. Algunos mediadores capaces de generar ROS como factores de

crecimiento, TNFα y angiotensina activarían a AP-1 a través de éstos 53. La

activación de AP-1 por algunos mitógenos, ésteres de forbol, RUV, shock térmico,

IR, radiaciones y algunos fármacos también podría ser mediada por ROS, ya que

la activación ejercida por ellos es inhibida por antioxidantes como NAC 9.

Otros genes cuya activación o modulación por ROS ha sido descrita, y que

podrían participar en la respuesta a IR, incluyen los de la heme oxigenasa,

endotelina-1, eNOS y del factor de estrés térmico (Heat shock factor, HSF) 56, 57.

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


13

1.5.- Preacondicionamiento isquémico

Varios órganos responden a la exposición a períodos breves de isquemia u

otros estímulos citotóxicos aumentando su resistencia a un estímulo citotóxico

posterior de mayor duración o severidad, fenómeno denominado

preacondicionamiento. El preacondicionamiento isquémico (PI) se ha descrito en

miocardio, cerebro, intestino, e hígado y consiste en breves períodos de isquemia,

seguidos de reperfusión, previo al insulto isquémico prolongado 58-63.

El clampeo intermitente y el PI otorgan una protección similar ante períodos

de isquemia de 75 minutos, siendo superior el primero cuando el período de

isquemia es más prolongado (120 minutos), aunque con mayor incidencia de

hemorragia entre los ciclos de IR 64. El PI hepático se evidencia con períodos de

isquemia de hasta 90 minutos y un período único de IR breve es suficiente para

inducir hepatoprotección 27. La duración de las fases del ciclo de PI es relevante

en el gatillamiento de los mecanismos que median la protección, ya que períodos

de isquemia de 2, 15, 20 y 30 minutos no son efectivos, mientras que períodos de

isquemia de 5 a 10 minutos sí lo son 27.

En donantes de órganos que han sufrido de paro cardiorrespiratorio (PCR),

que podría considerarse como PI no planificado, la sobrevivencia y función de los

injertos son comparables a aquéllos provenientes de donantes

hemodinámicamente estables, con niveles de transaminasa menores en los

pacientes con antecedentes de PCR 65.

Si bien la técnica del PI ha generado gran interés en el área clínica, no ha

logrado desplazar el uso estándar del clampeo intermitente y se ha utilizado con

reservas en ensayos clínicos. Al momento del planteamiento de esta tesis 66, la

información disponible de ensayos clínicos con PI era escasa 26, 67, 68.

Actualmente, la búsqueda en pubmed con la entrada human liver ischemic

preconditioning arroja 72 resultados: 16 corresponden a ensayos clínicos con PI

en resección o trasplante hepático, y el resto a revisiones que ponderan la utilidad

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


14

práctica y aplicabilidad de la técnica. El año 2000 se publicó la primera

comunicación de PI utilizado en clínica 26, lo que se hizo con un número limitado

de pacientes en los cuales se obtuvo resultados favorables con disminución de

transaminasas séricas en los pacientes preacondicionados antes de la isquemia

durante la resección hepática. El año 2003 se publicó el primer ensayo clínico

aleatorio, que incluyó 100 pacientes, estudio realizado en Suiza 68. En el período

2004-2006, se han publicado 14 artículos, realizados por distintos grupos con

resultados contradictorios 69, 70. La mayoría de los trabajos, sin embargo,

comunican resultados favorables en términos de atenuación del daño generado

por IR 69, 71, 72, aunque la población que potencialmente se beneficiaría de ésta

técnica tendría características particulares. El acento de la investigación en los

distintos grupos ha estado en identificar mediadores y efectores relacionados con

la hepatoprotección, pero la naturaleza de los mecanismos que median la

protección del PI no ha sido esclarecida.

Así como el daño secundario a IR cursa en una etapa temprana y una

tardía, el PI otorga dos marcos temporales de protección, que difieren en sus

mecanismos. La ventana temprana de protección transcurre desde los primeros

minutos de reperfusión hasta 2 a 3 horas posteriores 16. La ventana tardía, descrita

claramente en el corazón, y de menor intensidad respecto de la ventana temprana,

se hace evidente a las 12-24 horas y dura por 2 a 3 días 73. Conceptualmente la

diferencia fundamental entre el preacondicionamiento temprano y la segunda

ventana de protección (SVP) o preacondicionamiento tardío es que, mientras que

en el primer caso el estímulo preacondicionante precede inmediatamente al

período de isquemia prolongado, en el segundo caso el estímulo

preacondicionante está separado por horas de la isquemia letal (Figura 3) 75. La

segunda ventana de protección o fase protectora tardía - retardada del PI se ha

descrito claramente en el corazón 73, pero en el hígado no se han publicado

experiencias en las cuales el período de preacondicionamiento isquémico no

preceda inmediatamente a la isquemia prolongada.

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


15

En la hepatoprotección por el PI pueden concurrir varios mecanismos: (i) la

preservación del nivel de ATP por activación de la quinasa dependiente de AMP 76; (ii) la inducción de sistemas antioxidantes [efecto protector simulado por

glutatión reducido 76]; (iii) el aumento moderado en los niveles de TNF-α 77; (iv) la

liberación de .NO [efecto protector eliminado por la inhibición de NOS y simulado

por donantes de .NO o L-arginina 61]; y (v) mayores niveles de adenosina 61. Este

último mecanismo es dependiente de la síntesis de .NO y ocurriría por activación

del receptor A2 predominantemente, ya que la administración de un antagonista

competitivo revierte los efectos protectores 61, 69, 77, 78.

1.6.- Respuestas hepatoprotectoras gatilladas por el PI

1.6.1.- Señales de supervivencia antiapoptóticas y antioxidantes, mediadas

por TNF-α

Dentro de las respuestas potenciales responsables de la hepatoprotección

que otorga el PI, están las señales de supervivencia mediadas por TNF-α. Si bien

la activación del receptor del TNF-α 1 (TNFR1) se asocia a apoptosis mediada

por caspasas, TNF-α a través de TRAF-2 (TNFR associated factor 2) también

induce la activación de los factores de transcripción NF-κB y AP-1 34. Entre los

genes regulados por NF-κB algunos codifican proteínas necesarias para la

supervivencia celular, como las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, la iNOS que

Figura 3: Ventanas de protección del preacondicionamiento isquémico 75

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


16

contribuye a la nitrosilación e inhibición de caspasa 3 79-80 y la SOD mitocondrial

que bloquea la citotoxicidad inducida por TNF-α y la activación de caspasa 3 81.

1.6.2.- Respuesta de fase aguda y proteínas de shock térmico

La respuesta de fase aguda es una reacción de defensa del organismo

frente a diversas agresiones con el fin restringir el área de daño, y eliminar o aislar

el agente tóxico 82. El hígado es uno de los principales órganos involucrados en la

respuesta de fase aguda y uno de los componentes precoces de esta respuesta

es la estimulación coordinada de la síntesis y secreción hepática de proteínas de

fase aguda 83. IL-1β, TNF-α e IL-6 son los más potentes inductores de la síntesis

de proteínas de fase aguda en los hepatocitos. Las células endoteliales y las

células de Kupffer pueden actuar como amplificadores intrahepáticos de la

respuesta al producir IL-6, TNF-α e IL-1 82.

El patrón de inducción de proteínas de fase aguda puede ser subdividido en

Tipo I (Proteína C reactiva en humanos, haptoglobina y hemopexina en ratas) y

Tipo II (varias cadenas de fibrinógeno y α2-macroglobulina en ratas y haptoglobina,

hemopexina en humanos). Los genes tipo I contienen regiones de respuesta a NF-

κB, AP-1 y factores de la familia C/EBP, mientras que los genes de proteínas de

fase aguda tipo II contienen elementos de respuesta para la familia de factores

STAT y C/EBP (Figura 4) 82.

Figura 4: Respuesta de genes de fase aguda mediada por citoquinas

Citoquinas tipo IL-1 (IL-1β, TNF-α)

Citoquinas tipo IL-6 (IL-6,

LIF, OSM)

Vía esfingomielinas

a/ceramida

Vía MAPK

Vía JAK/STAT

NF-κB AP-1 (fos/jun)

C/EBPβ STAT3/5

Genes de proteínas de fase aguda Tipo I Genes de proteínas de fase aguda Tipo II

I.- INTRODUCCIÓN

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17

La vía IL-6 - STAT3 regula la expresión de genes de fase aguda, en

particular participan en la activación de la transcripción de los genes de α2-

macroglobulina y haptoglobina. El efecto de TNF-α e IL-1 indica que estas

citoquinas actuarían en forma combinada para regular la expresión de hemopexina

y haptoglobina, probablemente a través de NF-κB 84.

Durante el período postisquémico la respuesta de fase aguda es similar a

aquwlla inducida por un foco inflamatorio extrahepático, aunque en el período

temprano de la reperfusión el hígado sintetiza preferentemente hsp 70 - hsp 89 85.

La familia hsp 70 es la más abundante y conocida dentro de las proteínas de

estrés. En las células normales su presencia es mínima, pero son rápidamente

inducidas en respuesta al calor, etanol, metales pesados, entre otros. Las ROS

que se producen durante la reperfusión también pueden activar los genes de

respuesta al calor (heat shock genes) 86. 4-Hidroxinonenal tiene el mismo efecto

que el shock de calor al promover la unión de HSF (heat shock factor) a HSE (heat

shock element) 85.

Se postula que el estado antioxidante modula la expresión de proteínas de

estrés. En linfocitos de individuos pretratados con antioxidantes y sometidos a

shock de calor en presencia de un generador de radicales libres [(2,2’-azo-bis (2-

amidinopropano)] se observó aumento de la síntesis de hsp 105, hsp 90, hsp 70 y

hsp 40, y una disminución en la síntesis de hsp 32 (HO-1) 87.La enzima heme

oxigenasa (HO) cataliza el corte del α-mesocarbono de la Fe-protoporfirina-IX

dando como productos biliverdina, hierro libre divalente y monóxido de carbono

(CO). HO-2 se expresa en el hígado normal y sería inducida por estrés oxidativo,

mientras que HO-1 se expresa en situaciones de estrés y tiene sitios de unión en

su DNA para AP-1, NF-κB y elementos de respuesta para hipoxia, estrés térmico,

metales pesados e IL-6. HO-1 podría ser hepatoprotectora en IR a través de varias

de sus acciones: (i) controla los niveles intracelulares de hem libre (prooxidante),

(ii) produce biliverdina (antioxidante), (iii) mejora la perfusión vía liberación de CO

y (iv) induce la síntesis de ferritina 88. En este contexto, se ha demostrado que el

daño mediado por linfocitos T depende de la sobreexpresión de HO-1 en el

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


18

modelo de trasplante hepático 89, y que la sobreexpresión lograda por la

transferencia del gen de HO-1 protege al riñón e hígado del daño por IR en el

trasplante 90.

1.7.- Importancia biomédica

A causa de su metabolismo único y relaciones con el tracto gastrointestinal,

el hígado es un blanco importante de la toxicidad de drogas, xenobióticos y estrés

oxidativo 91. La diversidad de mecanismos que median la hepatotoxicidad, que

varían de acuerdo al agente citotóxico, plantean un desafío permanente para

dilucidar estas vías y desarrollar nuevos fármacos o nuevas estrategias que

minimicen el daño 91.

En el caso del estrés oxidativo, al concepto clásico establecido de que las

especies reactivas participan en vías que desencadenan daño 6, se agrega un

nuevo concepto, en el cual el nivel de estrés oxidativo determina los eventos

ulteriores, sean sobrevivencia o muerte celular 92 (Figura 5)

Si durante la isquemia breve que constituye el estímulo preacondicionante

en el PI se genera una baja cantidad de especies reactivas del oxígeno 93, a través

de la modifiación de la activación de factores redox sensibles, éstas pueden

determinar reprogramación génica relacionada con señales de sobrevivencia

celular 94. En el caso del preacondicionamiento temprano, las señales que gatillan

la protección probablemente corresponden a mediadores preformados, ya que el

estímulo preacondicionante precede inmediatamente a la isquemia letal. En el

caso del PI tardío, donde el estímulo preacondicionante precede en horas a la

Baja dosis Dosis intermedia Dosis alta

Especies reactivas del oxígeno

Mitogénesis Proliferación

Arresto crecimiento

Envejecimiento

Muerte celular

Apoptosis Necrosis

Figura 5: Efecto de los niveles de especies reactivas del oxígeno 92

I.- INTRODUCCIÓN

_____________________________________________________________________________________________


19

isquemia letal, de existir la SVP en el hígado, estas señales corresponderían

probablemente a mediadores neoformados que determinarían un fenotipo

tolerante del tejido a la isquemia posterior.

El descubrimiento de estas señales puede llevar a desarrollar

intervenciones que minimicen el daño asociado a IR cuando éste es inevitable

(cirugía o trasplante), o para mejorar las condiciones de injertos marginales que

actualmente son descartados (esteatósis, PCR prolongado) 93.

El determinar la existencia de la SVP en el hígado implicaría establecer un

marco temporal durante el cual se pueden realizar las intervenciones que resulten

en protección. Indudablemente, el hecho de someter a cualquier órgano al

estímulo isquémico mecánico, entendiendo éste como un período de clampeo

breve, lo que implica llevar al sujeto a cirugía en dos ocasiones, no plantea ningún

beneficio ni desde el punto de vista práctico ni desde el punto de vista del riesgo

quirúrgico. La finalidad del PI es, indudablemente, describir el mecanismo y

encontrar los mediadores, señales intermediarias o efectores que permitan su uso,

simulando el efecto protector que se encuentra con la maniobra mecánica.

II.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

_____________________________________________________________________________________________


20


2.1.- HIPÓTESIS:

EL PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO INDUCE UNA SEGUNDA

VENTANA DE PROTECCIÓN EN EL HÍGADO, QUE ES DEPENDIENTE DE LAS

ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO QUE SE GENERAN DURANTE LA

MANIOBRA PREACONDICIONANTE, DETERMINANDO LA ACTIVACIÓN DEL

FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN REDOX SENSIBLE NF-KB Y LA APARICIÓN DE

RESPUESTAS HEPATOPROTECTORAS

2.2.- OBJETIVOS GENERALES

1. Desarrollar el modelo de IR hepática en la rata y caracterizar la curva de

daño y estrés oxidativo que sigue a un período de 60 minutos de

isquemia.

2. Comprobar la existencia de la ventana tardía del PI en el modelo de daño

por IR hepático en la rata y determinar que en la segunda ventana de

protección se produzca (i) menor daño hepatocelular y (ii) menor estrés

oxidativo hepático.


_____________________________________________________________________________________________


21

3. Comprobar la desaparición de la respuesta hepatoprotectora otorgada por

la ventana tardía del preacondicionamiento isquémico al suprimir la

generación de especies reactivas del oxígeno durante el

preacondicionamiento.

4. Determinar la activación del factor de transcripción nuclear kappa B

durante la ventana tardía de protección del PI, y correlacionar esta

activación con menor daño hepático y la aparición de respuestas

hepatoprotectoras.

2.3.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Evaluar el grado de injuria hepatocelular a través de histología,

determinación de niveles de transaminasas GPT y GOT plasmáticas y

determinación de liberación de LDH al plasma en animales sometidos a IR

hepática precedida o no de un período de preacondicionamiento

isquémico.

2. Evaluar el grado de estrés oxidativo tisular, a través de la medición del

nivel de oxidación de proteínas y contenido de glutatión total en tejido

hepático sometido a IR precedida o no de un período de

preacondicionamiento isquémico.

3. Caracterizar la maniobra de PI para encontrar la ventana temporal a la

cual es posible realizar preacondicionamiento isquémico que resulte en

hepatoprotección frente a un período de isquemia de 60 minutos realizado

con posterioridad.

4. Comprobar la existencia de la ventana tardía del preacondicionamiento

isquémico en el hígado, a través de la confirmación de la disminución de

parámetros de daño hepático (niveles de GOT, GPT, LDH e histología

hepática) en suero o tejido de animales sometidos a un período de


_____________________________________________________________________________________________


22

preacondicionamiento isquémico, versus suero o tejido de animales no

preacondicionados.

5. Determinar la activación del factor de transcripción NF-κB, durante la

ventana tardía de protección del preacondicionamiento por IR, a través del

aumento de la actividad de unión al ADN (ensayo de EMSA). y comparar

el nivel de activación del factor de transcripción mencionado en animales

preacondicionados versus no preacondicionados.

6. Determinar la activación de otros factores de transcripción redox

sensibles, tales como AP-1 y HSF, durante la ventana tardía de protección

del preacondicionamiento por IR, a través del aumento de la actividad de

unión al ADN (ensayo de EMSA). y comparar el nivel de activación de

estos factores de transcripción en animales preacondicionados versus no

preacondicionados.

7. Determinar los niveles séricos de citoquinas que participan en la

respuesta inflamatoria y que se relacionan con la vía de transducción de

señales a través de NF-κB.

8. Determinar la expresión de proteínas que participan en la respuesta a

estrés y que pueden resultar en hepatoprotección (HO-1, HSP 70, iNOS),

al tiempo de máxima actividad de unión al ADN de NF-κB.

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


23

III.- METODOLOGÍA

3.1.- Animales de experimentación

Se utilizaron ratas Sprague Dawley, machos, 150 -180 gramos de peso

(Bioterio Central, ICBM, Facultad de Medicina). Los animales fueron mantenidos

con una dieta sólida estándar (Alimentos Champion S.A. Santiago) y agua ad

libitum, con temperatura ambiental controlada y ciclos de luz/oscuridad de 12

horas.

3.2.- Protocolo quirúrgico La cirugía fue realizada con técnica aséptica, de acuerdo a modelos

descritos de isquemia-reperfusión hepática en la rata 95, 96.

Durante los primeros meses de implementación de la técnica la mortalidad

fue de hasta 80% intra o postoperatoria. Para aumentar la sobrevivencia se

modificaron diversos aspectos: anestesia, homeostasis de la temperatura, técnica

quirúrgica, hidratación intra y post operatoria, manipulación del órgano durante el

intraoperatorio y prevención de infecciones, logrando finalmente sobrevivencia del

100% y valores de transaminasas consistentes dentro de los grupos. Este

protocolo, que es el que se describe a continuación, fue el que se utilizó en todos

los experimentos realizados.

Los animales fueron anestesiados con Zoletil® 50, (Clorhidrato de

tiletamina, 25 mg/ml, Clorhidrato de zolazepan 25 mg/ml, Laboratorios Virbac,

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


24

Carros, Francia), 1 ml/kg peso corporal. La cirugía se realizó sobre un calentador

tipo “slide warmer” (Barnstead Internacional, TermoFisher Scientific, USA) para

asegurar homeostasis de la temperatura, la que se controló durante el curso del

procedimiento. Se realizó incisión media supra e infraumbilical, hasta exponer las

vísceras, las que se desplazaron con gasa embebida en suero fisiológico, para

visualizar la tríada portal. Utilizando tórulas de algodón para tracción-

contratracción se expuso la bifurcación del pedículo hepático que irriga los lóbulos

superior medio y lateral izquierdo, lugar en el que se ubicó el clip tipo Schwartz

(Fine Science Tools, North Vancouver, Canada) (Figura 6).

Figura 6: Clip de Shwartz y esquema del modelo de isquemia hepática parcial en el hígado de rata

El período de preacondicionamiento isquémico se definió como 10 min de

isquemia seguida de reperfusión según protocolo.

Durante la isquemia o su simulación, la pared abdominal se afrontó con

puntos de seda 3-0. Una vez concluida la isquemia, se retiró el clip, se cerró la

cavidad abdominal con puntos totales, se pinceló con clorhexidina y se administró

suero fisiológico (1% del peso corporal en cc, sc). Se dejó a los animales en

recuperación en jaulas separadas con acceso libre al agua y comida hasta el

tiempo de reperfusión correspondiente según el protocolo.

Al final del protocolo se realizó la eutanasia del animal. Previa anestesia

con Pentotal sódico 50 mg/Kg ip, se procedió a:

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


25

- Obtener muestra de sangre (3 ml) por punción de cava infrahepática, la cual

fue centrifugada a 1085 g por 10 min. El suero obtenido fue guardado en

alícuotas de 300 μl a -20° C.

- Lavar hígado, vía porta, con amortiguador Tris (Tris KCl 0.67 M, pH 7.2) En

estas muestras de tejido isquemizado lavado se realizó determinación de

contenido de glutatión total y nivel de oxidación de proteínas.

- Obtener muestras de tejido hepático sin lavar. Se guardó una muestra de los

lóbulos isquemizados, previa congelación en nitrógeno líquido, a -80° C y un

corte del lóbulo medio en formalina amortiguada en PBS para su posterior

inclusión en parafina, corte y teñido para histología.

Todos los procedimientos realizados en esta tesis que incluyen

experimentación con animales cuentan con la aprobación del Comité de Bioética

de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. (CBA # 077 FMUCH)

3.3.- Grupos experimentales: De acuerdo a los diferentes modelos

analizados se conformaron los siguientes grupos experimentales:

3.3.1.- Modelo de daño por isquemia-reperfusión:

• Grupo A: ISQUEMIA-REPERFUSIÓN (IR). Se mantuvo el clampeo

hepático (isquemia) por 60 min y se realizó reperfusión de 0 a 72 horas,

obteniéndose muestras de sangre y tejido a las 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 y

72 horas post reperfusión. (Figura 7A)

• Grupo B: CONTROL DE OPERACIÓN SIMULADA (Sham). Simulación de

isquemia seguida de 0 a 72 horas (Figura 7B)

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


26

3.3.2.- Modelo de maniobra de preacondicionamiento isquémico

• Grupo C: MANIOBRA PI (MPI). Se mantuvo el clampeo (isquemia) por 10

min, y se realizó reperfusión de 0 a 72 horas, obteniéndose muestras de

sangre a las 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 horas y de tejido lavado a las 2, 4, 6,

8, 12, y 24 horas. (Figura 7C)

• Grupo D: SHAM MANIOBRA (Sham MPI). Simulación de isquemia seguida

de 0 a 72 horas con muestreos a tiempos similares (Figura 7D)

3.3.3.- Modelo de ventana tardía del preacondicionamiento isquémico

Se realizó la maniobra de PI (10 min de isquemia) seguida de 72 horas de

reperfusión previo al período de isquemia de 60 min Posteriormente se realizó

reperfusión por 3 y/o 20 horas. Algunos grupos fueron inyectados con NAC 0.5

g/kg peso corporal (Sigma, St. Louis, USA) o su vehículo 1 hora antes de

realizarse la maniobra PI.

• Grupo E: PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO (PI+IR): maniobra

preacondicionante 72 horas antes de la isquemia de 60 min seguida de 3 ó

20 horas post reperfusión (Figura 7E)

• Grupo F: SIN PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO O DAÑO POR IR

(Sham+IR): simulación de maniobra preacondicionante 72 horas antes de

la isquemia de 60 min seguida de 3 ó 20 horas post reperfusión (Figura 7F)

• Grupo G: PREACONDICIONAMIENTO SIN DAÑO POR IR (PI+Sham):

maniobra preacondicionante 72 horas antes de la simulación de isquemia

de 60 min y toma de muestras a las 3 ó 20 horas (Figura 7G)

• Grupo H: H.- CONTROL DE OPERACIÓN SIMULADA (Sham): simulación

de la maniobra preacondicionante 72 horas antes de la simulación de la

isquemia de 60 min y toma de muestras a las 3 ó 20 horas (Figura 7H)

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


27

Figura 7: Diseño experimental

3.4.- Parámetros de daño hepático: 3.4.1.- Evaluación de histopatología hepática: Se utilizó microscopía óptica

para analizar cortes de hígado previamente fijados en formalina amortiguada en

PBS (10%) incluidos en parafina y teñidos con hematoxilina-eosina 97. Los cortes

fueron analizados por un patólogo de forma ciega e informados de acuerdo a la

presencia de inflamación, hemorragia, fibrosis, necrosis, apoptosis y

citoarquitectura del tejido, factores que se evaluaron en forma cualitativa (+ a +++)

3.4.2.- Determinación de actividad de transaminasas plasmáticas: la

determinación de la actividad de transaminasas séricos se realizó con los kits

Enzyline® ALAT/GPT 20 Monoréactif IVD y Enzyline® ASAT/GOT 20 Monoréactif

IVD (Biomerieux® 69280 Marcy l´Etoile. France). La determinación se basa en

incubar la muestra con una mezcla de substratos (ácido α-cetoglutárico con

alanina o ácido aspártico) El ácido oxaloacético o pirúvico que se produce se

acopla a un segundo sistema enzimático en presencia de NADH. La segunda

reacción es catalizada por la enzima deshidrogenasa málica (para AST) o láctica

PI Reperfusión 3 o 20 h Isquemia 60 min72 horas

PI 3 o 20 h Simulación Isquemia 60min

72 horas

3 o 20 h

Reperfusión 3 o 20 h

NAC o

vehículo

NAC o vehículo

NAC o vehículo

Simulación PI

Simulación Isquemia 60min

72 horas

NAC o

vehículo Simulación PI

Isquemia 60 min72 horas

PI Reperfusión 0 a 72 horas

Simulación PI 0 a 72 horas

Isquemia 60 min Reperfusión 0 a 72 horas

Simulación Isquemia 60 min

0 a 72 horas

A B C D

E F G H

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


28

(para ALT) con la formación de ácido málico o láctico, respectivamente. La tasa de

consumo del NADH por esta segunda reacción se mide espectrofotométricamente

a 340 nm utilizando su coeficiente de extinción molar (ε = 6.22 mM-1 cm-1) 98 lo que

da una estimación indirecta de la actividad transaminasa presente en la muestra.

3.4.3.- Determinación de la actividad de deshidrogenasa láctica (LDH) plasmática: se determinó el nivel de LDH en plasma a través de la oxidación de

NADH en presencia del sustrato piruvato, cuya tasa de desaparición se midió

espectrofotométricamente a 340 nm utilizando el coeficiente de extinción molar del

NADH (ε = 6.22 mM-1 cm-1), estimando de esta manera la actividad de la enzima.

3.5.- Parámetros de estrés oxidativo 3.5.1.- Determinación del contenido de glutatión total: el contenido de glutatión

se determinó de acuerdo a la técnica descrita por Tietze 99 con las modificaciones

descritas por Anderson 100. Este ensayo cíclico tiene lugar en dos pasos. En el

primero de ellos el GSH en presencia de DTNB se oxida:

2 GSH + DTNB GSSG + TNB

Y en un segundo paso la enzima glutatión reductasa cataliza la reacción:

GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+

Siendo:

GSH: forma reducida del glutatión.

GSSG: forma oxidada del glutatión.

DTNB: 5.5-dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico).

TNB: 5-thio-2-ácido nitrobenzoico.

NADPH: forma reducida del fosfato del dinucleótido de nicotinamida y de adenina.

NADP+: forma oxidada del fosfato del dinucleótido de nicotinamida y de adenina.

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


29

El contenido total de glutatión puede estimarse a partir de la producción de

TNB que se determina a 412 nm. Para las mediciones se utilizaron 40 mg de

hígado homogenizados en hielo en HClO4 0,5M. El homogenizado se centrifugó a

2445 g por 10 min El sobrenadante ácido se neutralizó con K3PO4 1,75 M y se

centrifugó por 10 min a 3020 g. Se diluyó una alícuota de este sobrenadante y se

realizó la medición a 412 nm en presencia de DTNB, NADPH y Glutatión

reductasa.

3.5.2.- Determinación de oxidación de proteínas hepáticas: Se determinó la

formación de derivados carbonilos como índice de oxidación de proteínas,

utilizando el método descrito por Reznick y Packer 101, que corresponde a un

método espectrofotométrico que detecta la reacción de la 2,4-dinitrofenilhidrazina

(DNPH) (Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA) con derivados carbonilos de

las proteínas, para formar derivados proteína hidrazona. Para las mediciones se

utilizó 200 mg de hígado, homogenizados en 3 ml de un tampón fosfato de potasio

50 mM, pH 7,4, digitonina 0,1 %, EDTA 1 mM, PMSF 40 μg/ml, leupeptina 5 μg/ml,

pepstatina 7 μg/ml y aprotinina 5 μg/ml. Luego de incubar por 15 min a

temperatura ambiente, se centrifugó a 6000 g por 20 min Un ml del sobrenadante

obtenido se trató con 4 ml de DNPH 10 mM y otro volumen equivalente de

sobrenadante se trató con 4 ml de HCl 2,5 M. Ambos tubos se incubaron 1 hora a

temperatura ambiente, en oscuridad y con agitación cada 15 min, se adicionó 5 ml

de ácido tricloroacético (TCA) 20 %, incubando en hielo por 10 min y

posteriormente se centrifugó a 6000 g/10 min Las muestras fueron tratadas

nuevamente con TCA y los precipitados resultantes fueron lavados 3 veces con 4

ml de etanol-etilacetato (1/1 v/v) para remover DNPH libre y lípidos contaminantes,

centrifugando por 6000 g/10 min El precipitado se resuspendió en 2 ml de urea 6

M, pH 2,3. El contenido de derivados carbonilos se calculó utilizando la

absorbancia máxima obtenida del espectro de absorción (350-390 nm) de las

muestras tratadas con DNPH, utilizando el coeficiente de extinción molar del

DNPH (22.000 M-1 cm-1) Los resultados se expresaron en nm carbonilos/mg de

proteínas totales. El contenido de proteínas de las muestras se calculó a partir de

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


30

la absorbancia a 280 nm de muestras precipitadas con HCl 2,5 M y disueltas en

urea 6 M pH 2,3, utilizando como estándar una solución de albúmina de bovino (1

mg/ml).

3.6.- Determinación de niveles séricos de citoquinas: Se realizó mediante

ELISA utilizando los siguientes kits BIOSOURCE (Camarillo. CA. USA): Rat TNF-α

ELISA Kit Catalog KRC3012, Rat IL-10 ELISA Kit Catalog KRC0102, Rat IL-6

ELISA Kit Catalog KRC0062 y Rat IL-1β Kit Catalog KRC0012. Los ensayos se

realizaron de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La densidad óptica se

midió a 450 nm en un lector Bio-Rad® 550 (Bio-Rad Laboratorios, Hercules, CA,

USA). Las muestras que contenían niveles altos de citoquinas fueron diluidas y se

repitió su lectura para asegurar que estaban dentro de la curva estándar. Las

mediciones se realizaron en duplicado y los resultados corresponden al promedio

expresado en pg/ml.

3.7.- Evaluación de la actividad de unión al ADN de factores de transcripción (activación) 3.7.1.- Preparación de extractos nucleares: Se prepararon con la técnica

descrita por Deryckere y Ganon 102. El pellet obtenido después de la última

centrifugación (3020 g/5 min) fue resuspendido en 100-500 μL de solución B

(glicerol 25 %, Hepes 20 mM pH 7,9, NaCl 420 mM, MgCl2 1,2 mM, EDTA 0,2 mM,

DTT 0,5 mM, PMSF 0,5 mM, benzamidina 2mM y 5 μg/ml de pepstatina,

leupeptina y aprotinina) e incubado en hielo por 20 min y el lisado nuclear obtenido

se centrifugó por 15 seg. El sobrenadante, que contiene las proteínas de unión a

ADN, fue congelado en nitrógeno líquido y almacenado a –80º C. La

concentración de proteínas del extracto nuclear se determinó utilizando el reactivo

de Bradford (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 103.

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


31

3.7.2.- Electroforesis en geles de retardo EMSA (Electrophoretic Mobility

Shift Assay) para NF-κB, AP-1 y HSF-1

3.7.2.1.- Alineamiento de los oligonucleótidos de ADN: Se utilizaron los

siguientes oligonucleótidos:

Para NF-κB: (a) 5’-GAT CTC AGA GGG GAC TTT-3’ y (b) 5’- CTC GGA AAG TCC CCT

CTG-3’ Para AP-1: (a) 5’-CGC TTG ATG AGT CAG-3’ y (b) 5’-TAC TCA GTC GGC CTT-3’ Para

HSF-1: (a) 5’-GAT CCT TCT GGG AAT TCC-3’ y (b) 5’-GAT CTA GGA ATT CCC AGA-3’

(Invitrogen life technologies, Carlsbad, California, USA).

Para cada reacción a 5 nm del oligonucleótido correspondiente (a y b), pre-

incubados a 70°C por 10 min, se adicionó NaCl 2M estéril (concentración final 300

mM) y se incubó a 37°C por 10 min y luego a 0° por 10 min Luego de adicionar 2,5

volúmenes de etanol absoluto e incubar 1 hora a -20°C, se centrifugó por 15700

g/10 min, se eliminó el sobrenadante y el pellet (lavado una vez con etanol 70 %),

se dejó reposar 1 hora a -20°C antes de centrifugar 15700 g/10 min El pellet, que

corresponde al ADN, se dejó secar a temperatura ambiente, y se resuspendió en

NaCl 150 mM, lo que deja a los oligonucleótidos alineados en una concentración 1

μg/μL.

3.7.2.2.- Marcación de oligonucleótidos: Se preparó un medio de reacción que

contenía 0,5 μL de oligonucleótido alineado, 10 μL de tampón 10x para ADN

polimerasa I (Klenow), 0,5 μL de dNTP 5 mM (dATP, dGTP, dTTP), 2,5 μL de

[α32P] dCTP (Perkin Elmer Life Sciences Inc. Boston, MA, USA), H2O y 1 μL de

ADN polimerasa I (Promega, Madison WI, USA), al cual, luego de incubar 10 min

a temperatura ambiente, se agregó 1 μL de dCTP 4 mM, incubando 5 min a

temperatura ambiente. Posterior a la adición de 60 μL de STE (NaCl 0,1 M, Tris-

HCl 10 mM, pH 8,0 y EDTA 1 mM pH 8,0) se realizó una filtración en columna G-

50 Sephadex para purificar el ADN (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA). Se

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


32

registró el número de cuentas por minuto (cpm) de 1 μL del oligonucleótido

marcado, el cual debe ser mayor a 100.000.

3.7.2.3.- Ensayo EMSA: Se preparó un medio de reacción que contenía tampón

de diálisis nuclear (Hepes 25 mM pH 7,9, EDTA 0,1 mM pH 8,0, KCl 40 mM,

glicerol 10%, DTT 1 mM, NaF 0,1 mM), tampón 10x footprinting (Hepes 250 mM

pH 7,6, MgCl2 50 mM, KCl 340 mM), poli (dI:dC) 2 mg/ml, oligonucleótido

marcado, NP-40 0,1% y NaCl 150 mM. A 10 μL de este medio (mix) se adicionó

10 μL de extracto nuclear (0,8 μg/μL) incubando en hielo por 15 min. Luego se

agregó 4 μL de azul de bromofenol (BPB) 0,2%/Ficoll 20%, y se mezcló

inmediatamente antes de aplicarlo a un gel de poliacrilamida 6 % (50:1;

acrilamida:bisacrilamida). El gel fue pre-corrido por 1 hora, con recirculación del

tampón de corrida (Tris, ácido bórico y EDTA 0,5 M pH 8,0) 0,5x y la electroforesis

de las muestras se realizó a 100 V por 4 horas a 4°C. Los geles se fijaron en

etanol 20% y ácido acético glacial 10% por 15 min, se secaron al vacío por 1 hora

a 80ºC y posteriormente se expusieron a una película Fuji ( Fuji Photo Film Co.,

Ltd., Tokyo).

3.8.- Evaluación de los niveles de proteínas relacionadas con la supervivencia celular: Para conocer los niveles tisulares hepáticos de

fibrinógeno, haptoglobina, HO-1 y HSP 70 se utilizó el ensayo de Western Blot.

3.8.1- Técnica de Western Blot: 3.8.1.1.- Preparación de las muestras: Los extractos citosólicos hepáticos fueron

preparados por la técnica descrita por Deryckere y Ganon 102. Se utilizó 100 a 500

mg de tejido congelado a –80ºC, transferido a un mortero para ser pulverizado con

nitrógeno líquido, luego se homogeneizó manualmente con 5 ml de solución A

[IGEPAL CA-630 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (NP-40) 0,6%, NaCl

150 mM, Hepes 10 mM pH 7,9, EDTA 1 mM, fenil-metil-sulfonil-fluoruro (PMSF)

0,5 mM], se transfirió a un tubo de 15 ml y se centrifugó por 15 segundos a 480 g.

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


33

El sobrenadante obtenido se incubó en hielo por 5 min y posteriormente se

centrifugó a 3020 g/5 min. El sobrenadante de esta centrifugación (citosol), se

congeló en nitrógeno líquido y se guardó a –80ºC. La concentración de proteínas

del extracto citosólico se determinó utilizando reactivo de Bradford (Bio-Rad

Laboratories, Hercules, CA, USA) 103.

3.8.1.2.- Electroforesis en condiciones desnaturantes (PAGE-SDS): Las

proteínas presentes en el extracto tisular obtenido fueron separadas en un gel

SDS-PAGE 14%, según el método descrito por Laemmli 104. Se cargó 20 μL de

una mezcla que contenía 80 μg de proteína previamente desnaturadas a 100ºC y

tampón de muestra (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, glicerol 20%, SDS 4%, β-

mercaptoetanol 0,5% y azul de bromofenol (BPB) 0,1%). Los geles estaban

formados por un gel separador que contenía tampón Tris-HCl/SDS 0,4% pH 8,8,

Acrilamida 30%/Bisacrilamida 0,8%, persulfato de amonio (APS) 10% y N,N,N´,N´-

tetra-metiletilenediamina (TEMED, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), y

un gel concentrador formado por tampón Tris-HCl/SDS 0,4% pH 6,8, Acrilamida

30%/Bisacrilamida 0,8%, APS 10% y TEMED. Cada experimento se realizó

cargando en uno de los pocillos 10 μL de estándar de peso molecular preteñido

(Gibco BRL BenchMark Protein Ladders, Life Technologies Inc., USA). La

electroforesis se realizó en una cámara Protean II mini gel (Bio-Rad Laboratories,

Hercules, CA, USA) a 150 V por una hora en tampón de electroforesis (SDS 0,5%,

glicina 1 M, tris base 125 mM).

3.8.1.3.- Western blot: Se utilizó el protocolo descrito por Towbin y col. 105. Las

proteínas separadas por electroforesis en condiciones desnaturantes, se

transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema semi-seco

Fastblot (Whatman Biometra®, Göttingen, Alemania) a 4 mA por cm2 de

membrana por 20 min, utilizando un tampón de transferencia (tris base 25 mM,

glicina 150 mM, metanol 10%). Finalizada la transferencia, la membrana se

bloqueó con leche (Svelty®, Nestlé Chile S.A.) al 5%p/v en TBS 1% durante 1h a

III.- METODOLOGÍA

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34

temperatura ambiente, y se lavó 3 veces por 10 con TBS-Tween 20 0,1%. Luego

del lavado la membrana se incubó con el anticuerpo primario correspondiente:

- Fibrinógeno (Anticuerpo policlonal de conejo, Número de catálogo A-0080 y

Haptoglobina (Anticuerpo policlonal de conejo, Número de catálogo A-0030

(DakoCytomation, Dinamarca)

- HSP-70 (Anticuerpo monoclonal de ratón, Número de catálogo sc-24 y HO-1

(Anticuerpo policlonal de conejo, Número de catálogo sc-10789, Santa Cruz

Biotechnology, CA, USA)

La incubación con el anticuerpo primario se realizó a una dilución de 1:1000 a 4ºC

durante toda la noche. Luego de la incubación la membrana se lavó 3 veces por

10 a 15 min con TBS-Tween 20 0.1% y posteriormente se incubó con un segundo

anticuerpo, Anti –ratón o anti -conejo, conjugado con la peroxidasa de rábano

picante (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, USA), durante 1 hora a temperatura

ambiente. La membrana se lavó con TBS-Tween 20 0.1% 2 veces por 10 a 15 min

y finalmente se lavó con TBS durante 15 min. Como sistema de detección se

utilizó el kit quimioluminiscente “SuperSignal®West Pico Chemiluminescent”

(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, USA), utilizando una solución de trabajo que

contenía solución luminol/enhancer y solución peróxido estable, en una relación

1:1. La membrana se dejó por 1 minuto con la solución de trabajo y

posteriormente se expuso a una película de rayos X (Fuji Photo Film Co., Ltd.,

Tokyo). El análisis de las bandas obtenidas se realizó densitométricamente

utilizando el programa ScionImage (Scion Corporation, Frederick MA, USA).

Como control de carga se utilizó la detección de β-actina con un

anticuerpo monoclonal en dilución 1:1000 (ICN Biomedicals, Inc., Ohio, USA),

incubando por una hora a temperatura ambiente.

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


35

3.9.- Técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa para expresión de iNOS 3.9.1.- Extracción de ARN: El ARN hepático total se extrajo utilizando TRIzol®

(Invitrogen Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA). Se homogeneizó 100 mg

de tejido hepático con 1 ml de TRIzol®, el homogeneizado fue incubado en hielo

por 5 min, se centrifugó a 14.000pm durante 5 min y la fase superior del

centrifugado se transfirió a un tubo adicional al cual se agregó 200 μL de

cloroformo, para luego agitar enérgicamente. Posteriormente se incubó en hielo

por 3 min, se centrifugó a 15700 g por 15 min y la fase acuosa se transfirió a otro

tubo al cual se adicionó 0,5 ml de isopropanol, se mezcló por inversión y se incubó

a temperatura ambiente durante 10 min, centrifugando luego a 15700 g por 10

min. El precipitado obtenido se resuspendió con 200 μL de H2O tratada con

dietilpirocarbonato (DEPC) y se agregó 20 μL de LiCl 8 M, luego se incubó en

hielo seco por una hora, se centrifugó a 15700 g por 30 min a 4ºC. El

sobrenadante fue eliminado, y la pelleta obtenida se resuspendió en 100 μL de

H2O – DEPC. A continuación se adicionó 10 μL de acetato de sodio 3 M y 200 μL

de etanol absoluto (100%), se incubó en hielo seco por 30 min, centrifugando a

15700 g durante 15 min. Luego se agregó a la pelleta 100 μL de etanol 80%,

incubando a –20ºC por 30 min, se centrifugó durante 15 min, se eliminó el

sobrenadante y se dejó secar el precipitado para luego resuspenderlo con 50 μL

de H2O – DEPC y cuantificar espectrofotométricamente el ARN obtenido a 260

nm, y confirmar la estabilidad de su estructura mediante electroforesis en gel de

agarosa 1%.

3.9.2.- Síntesis de ADN a partir del ARN obtenido: Para ello se utilizó

hexanucleótidos al azar (random primers), preparando una mezcla (partidor-ARN)

que contenía 5 μg de ARN total, hexanucleótidos al azar (50 ng/μL) y dNTP 10

mM. Luego cada una de las muestras se incubó a 65 ºC durante 5 min, y se

transfirieron a hielo por al menos 1 minuto. A cada mezcla primer-ARN se le

adicionó 9 μL de la mezcla de reacción que contenía tampón de transcriptasa

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


36

reversa 10x, MgCl2 50 mM, DTT 0,1 M y un inhibidor de ribonucleasa, luego se

incubó a 25ºC por 2 min, agregando posteriormente 50 unidades de transcriptasa

reversa (Superscript® II ARNse H- Reverse Transcriptase, Invitrogen Life

Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA) a cada tubo, se mezcló e incubó a 25ºC

durante 10 min. Los tubos se transfirieron a 42ºC y se incubaron a esta

temperatura por 50 min; la reacción se detuvo incubando a 70ºC por 15 min, luego

de lo cual los tubos se colocaron en hielo. El producto obtenido correspondía a

ADNc total, el cual se utilizó posteriormente como molde para los análisis por

PCR.

3.9.3.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): En un tubo estéril se

preparó una mezcla de reacción (amplificación) que contenía tampón 10x PCR,

MgCl2 50 mM, dNTP 10 mM, mezcla de partidores específicos para el gen de

iNOS (sentido 5´- CAA-CAA-CAC-AGG-ATG-ACC-CTA-A- 3´ y antisentido 5´-

GGT-AGG-TTC-CTG-TTG-TTT-CTA-T -3´) (Invitrogen Life Technologies,

Carlsbad, CA, USA), ADN polimerasa Taq (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad,

CA, USA) y ADN molde (sección 9.2.2). La mezcla fue incubada en un

termociclador a 94ºC por 3 min para desnaturalizar completamente el ADN molde,

se realizaron 30 ciclos de PCR que consistieron en 30 segundos de

desnaturalización a 94ºC, 45 segundos de alineamiento a 59ºC y la extensión por

30 segundos a 72ºC. Además se hizo elongación adicional incubando por 10 min

adicionales a 72ºC y luego la reacción se mantuvo a 4ºC. El producto del PCR se

mantuvo a –20ºC. Las muestras se analizaron por electroforesis en geles de

agarosa, visualizados mediante tinción con bromuro de etidio y posteriormente

fotografiados. En todas las reacciones se utilizó el estándar classic II 18S de 324

pb (QuantumARN® 18S InteARNl Standards, Ambion Inc., Austin TX, USA) como

estándar interno de normalización. Las bandas del amplificado fueron analizadas

utilizando el programa Scion Image.

.

III.- METODOLOGÍA

_____________________________________________________________________________________________


37

3.10.- Análisis de imágenes: Las bandas obtenidas en los ensayos de EMSA

(sección) Supershift (sección) y Western blot (sección) se analizaron

densitométricamente con el programa Scion Image. (http://www.scioncorp.com).

Los resultados obtenidos se expresaron como unidades densitométricas

arbitrarias.

3.11.- Expresión de resultados y análisis estadístico: Los resultados obtenidos

en los experimentos se expresaron como el promedio de 3 a 8 determinaciones,

más menos la desviación estándar o el error estándar de la media. Para

determinar si las diferencias entre los distintos grupos experimentales eran

estadísticamente significativas se aplicó el test t de Student o las pruebas de

ANOVA unifactorial, seguida del test de Newman-Keuls, ambas con un nivel de

significación de 5 % (GraphPad Prism™ versión 4.0, GraphPad Software, Inc,

SanDiego, CA, USA).

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


38

IV.- RESULTADOS

4.1.- CARACTERIZACIÓN DE UN MODELO DE DAÑO POR ISQUEMIA-REPERFUSIÓN

4.1.1.- Evaluación de parámetros de daño hepático en animales sometidos a isquemia-reperfusión y controles: transaminasas plasmáticas y LDH De las muestras de sangre obtenidas a distintos tiempos de reperfusión

después de 60 minutos de isquemia se obtuvo suero para la determinación

espectrofotométrica de la actividad de ALT, AST y LDH.

En el caso de ALT, (Figura 8A) se observó que la actividad aumenta desde

la primera hora de reperfusión, alcanzando un nivel máximo de aproximadamente

15 veces su valor basal a las 4 y 6 horas. Los valores caen a las 8 horas y

aumentan nuevamente a partir de las 12 horas alcanzando un valor máximo a las

20 horas (15 veces el valor normal), para volver a niveles basales a partir de las

24 horas de reperfusión. De acuerdo al análisis estadístico el aumento es

significativo a las 4, 6 y 20 horas con respecto a los valores control (p<0,001) y

con respecto a los valores registrados a las 0, 48 y 72 horas de reperfusión

(p<0,05). No existe una diferencia estadísticamente significativa al comparar los

valores máximos entre sí. (p>0,05). AST presenta un patrón de aumento similar a

ALT (Figura 8B), registrándose valores significativamente aumentados en

comparación con sus controles a las horas 1, 6, 8 y 20 (p<0,05). El promedio de

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


39

los valores hallados a las horas 1, 6 y 8 corresponde a aumentos de 10 veces el

valor normal, mientras que el promedio de los valores registrados a las 20 horas

corresponde a 20 veces el valor normal, siendo éste el punto máximo dentro de

estas curva vs 1, 2, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 horas (p<0,05).

Figura 8: Actividad de transaminasas séricas en animales sometidos a 60 minutos de isquemia y reperfusión de 0 a 72 h: La actividad de transaminasas se expresa en unidades internacionales por litro (U/l)

versus el tiempo en horas. Los resultados representan el promedio ± D.S para 4 a 8 animales por tiempo de

reperfusión experimental. En A se muestran los valores de Alanina Amino Transferasa Sérica (ALT o GPT) y

en B los valores de Aspartato Amino Transferasa (AST o GOT). La significancia de las diferencias entre los

valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de ANOVA

unifactorial seguida del test de Newman-Keuls. La significancias se muestran con las letras a y b: A, ap< 0,001

AST IR vs AST Sham (4, 6, 20), bp< 0,05 vs 0, 48, 72 h; B, ap< 0,05 AST IR vs AST Sham (1, 6, 8, y 20), b p<

0,05 vs 1, 2, 6, 8, 12, 24, 48 y 72 h .

La actividad de LDH (Figura 9) aumenta rápidamente a partir de la primera

hora de reperfusión (alrededor de 25 veces su valor basal) alcanzando niveles

máximos en los puntos correspondientes a la 2da y 4ta horas de reperfusión

(p<0,05 respecto de los controles). Los valores disminuyen entre la 8va y 12ma

horas y aumentan entre las 18 y 20 horas post isquemia (p<0,05). A las 24 horas

los valores vuelven al basal y se mantienen en valores control hasta las 72 horas

de reperfusión.

U/l

Actividad de ALT post 60 min de isquemia

0 10 20 0

500

1000

1500

2000

48 72

IR Sham

Tiempo de reperfusión (h)

a,b a,b

a,b

U/l

Actividad de AST post 60 min de isquemia

0 10 200

500

1000

1500

2000

48 72

IR Sham

Tiempo reperfusion (h)

aa

a,b

a

A B

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


40

Figura 9: Actividad de Lactato Deshidrogenasa plasmática en animales sometidos a 60 minutos de isquemia y tiempos de reperfusión variables: La actividad de LDH se expresa en unidades internacionales

por litro de suero (U/l) versus el tiempo en horas. Los resultados representan el promedio ± D.S para 4 a 8

animales por tiempo de reperfusión experimental. La significancia de las diferencias entre los valores

promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial

seguida del test de Newman-Keuls La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas

sometidas a isquemia (IR) versus animales con control de operación simulada (sham) se muestra con la letra

a: p<0,05 a las 2, 6, 18 y 20 horas de reperfusión.

4.1.2.- Evaluación histopatológica del hígado La evaluación histológica se realizó en cortes de tejido que fueron obtenidos

de una sección del lóbulo hepático derecho isquemizado. En cada tiempo de

reperfusión se analizaron al menos dos placas histológicas. Los resultados se

presentan en la Tabla 4 y en las Figuras 10 y 11.

Al analizar la Tabla 4, se observa que los signos inflamatorios aparecen

tempranamente después de la isquemia (1 hora) y que, tanto la presencia de PMN

como el grado de necrosis van aumentando conforme aumenta el tiempo de

reperfusión, siendo más intenso a las 4, 6 y 20 horas de reperfusión. Después de

las 24 horas de reperfusión tanto los signos inflamatorios como la necrosis son

más leves o no se observan. Podría decirse que, al tener en cuenta que a las 8 y

12 horas el daño que se describe es comparativamente menor, el comportamiento

del daño histológico también podría seguir una curva bifásica, sin embargo, la

0 10 200

1000

2000

3000

48 72

LDH IR

LDH Sham

Tiempo de reperfusión

Actividad de LDH post 60 minutos de isquemia

a

a

a

a

a=p<0.05 vs

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


41

descripción no permite un análisis cuantitativo del daño ni la comparación en

términos estadísticos.

Tiempo Arquitectura Fibrosis Inflamación Vena

Central Espacio Porta Necrosis

0 Normal (-) Linfo. periportales + + VP + (-)

1 Normal (-) Linfo. periportales +

PMN + sinusoidales

++ a +++ VP + (-)

2 Normal (-) (-) + (-) (-)

4 Normal (-) PMN ++, tumefacción,

puentes de necrosis

++ VP ++ ++ en zona 2,

periportal y

pericapsular

6 Distorsionada (-) PMN ++, tumefacción

y focos de inflamación

sinusoidal

+ Tumefacción

periportal

+ a ++ pericentral

y periportal

8 Normal (-) PMN leve + VP + (-)

12 Distorsionada (-) + inflamación y

tumefacción en zona

2

+/- VP y Disse + + zona 2,

periportal y

pericentral

18 Distorsionada (-) + + (-) ++

20 Distorsionada (-) +++ extensa en zona

2, PMN +++

+ Disse ++ ++ en zona 2,

pericentral y

periportal

24 Normal (-) + + (-) (-)

48 Normal (-) (-) leve (-) (-)

72 Normal (-) Linfo. leve espacio

porta

(-) Disse y

linfácticos +

(-)

Tabla 4: Histología del hígado sometido a isquemia. Se presenta una descripción promedio de al menos dos

cortes por tiempo de reperfusión, consignando la presencia o ausencia (-) de los parámetros y su intensidad de +

a +++. Se informa la apariencia de la citoarquitecura del tejido, presencia de fibrosis, inflamación y necrosis,

apariencia de la Vena (VP) y Espacio Porta y dilatación de la Vena Central

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


42

Figura 10: Tinción con Hemotoxilina-eosina de cortes de hígado de ratas sometidas a isquemia y

reperfusión temprana. Tiempos de reperfusión de A, 1 hora (200X); B, 2 horas (400X); C, 4 horas

(200X) y D, 6 horas (200X).

En las Figuras 10 y 11 se muestran ejemplos de cortes de tejido hepático

sometido a isquemia a distintos tiempos de reperfusión. En la Figura 10 A se

muestra un corte obtenido 1 hora post-isquemia, la citoarquitectura está

conservada, no hay necrosis ni inflamación, y sólo se observa hemorragia leve. En

B (2h reperfusión), el tejido también tiene un aspecto normal. C, que corresponde

a 4h de reperfusión, muestra un mayor grado de inflamación con presencia de

PMN periportales y en la zona 2, donde además se observan además focos de

necrosis mientras que en D (6h reperfusión) también se observa inflamación

intensa, tumefacción y algunos focos de necrosis.

En la Figura 11 se muestran tiempos de reperfusión más prolongados,

siendo A un corte obtenido a las 18 horas, en el que se aprecian focos de necrosis

e inflamación, que también se observa en B (20h reperfusión) que exhibe focos de

necrosis extensos, hemorragia y alteración de la arquitectura del tejido. En las

muestras obtenidas a las 48 y 72 horas de reperfusión (C y D, respectivamente) el

A

D C

B

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


43

tejido ha recuperado su arquitectura normal, se observa hemorragia leve, pero no

se aprecian focos de necrosis ni presencia de infiltrado inflamatorio.

La evaluación histológica del hígado muestra que 60 minutos de isquemia

provocan inflamación, disrupción de la arquitectura normal y necrosis del tejido,

signos que se pueden observar temprano en la reperfusión (a partir de la primera

hora) pero que son más intensos alrededor de las 4ta, 6ta, 18va y 20ma horas de

reperfusión.

Figura 11: Tinción con Hemotoxilina-eosina de cortes de hígado de ratas sometidas a isquemia y

reperfusión tardía. Tiempos de reperfusión de A, 18 horas (200X); B, 20 horas (200X); C, 48 horas

(200X) y D, 72 horas (200X).

En el modelo que se presenta los parámetros de daño analizados coinciden

en demostrar el curso bifásico del daño por isquemia-reperfusión. La fase

temprana, de acuerdo a la actividad de transaminasas, se extiende desde la

primera hasta la sexta horas de reperfusión, mientras que LDH muestra daño

entre las horas 2da y 4ta. En la histología hepática se observaron signos de

inflamación desde la primera hora de reperfusión, con focos más extensos de

A

D C

B

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


44

necrosis en la 4ta y 6ta horas de reperfusión. Se determina para este modelo una

fase temprana de daño por IR que va desde el inicio de la reperfusión (1 h) hasta

la 6ta hora, y se elige, como un punto intermedio dentro de esta fase, la tercera

hora de reperfusión como punto para evaluar la estrategia de protección del PI

dentro de la reperfusión temprana.

En este modelo, durante la reperfusión tardía (más de 6 horas) tanto la

elevación de las enzimas ALT y AST, LDH como los parámetros de inflamación,

distorsión de la arquitectura tisular y necrosis en la histología, coinciden en

mostrar mayor daño alrededor de la 18va-20ma horas de reperfusión, por lo que

dentro de la fase tardía del daño por IR se eligió las 20 horas como punto en el

cual se evaluará la estrategia hepatoprotectora del PI.

4.1.3.- Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en animales sometidos a isquemia-reperfusión y controles Los parámetros de estrés oxidativo tisular se determinaron en muestras de

hígado lavado a las 2, 20, 48 y 72 horas de reperfusión. A través de los métodos

descritos en la sección 3.5 se midió la presencia de modificaciones en las

proteínas debidas a la acción de los ROS y el contenido de GSH en el tejido.

En la Figura 12 se observa la presencia de derivados carbonilos en algunos

aminoácidos de las proteínas hepáticas, los que aumentan significativamente a las

20 horas de reperfusión, lo que demuestra un mayor nivel de estrés oxidativo

tisular a ese tiempo. A otros tiempos de reperfusión (2, 48 y 72 horas) no existen

diferencias significativas en el contenido de carbonilos en el tejido hepático de los

animales sometidos a isquemia y los animales del grupo control.

El contenido GSH se determinó a través del método de Tietze en muestras

de hígado exento de sangre (Figura 13). Se observa que hay una disminución en

el contenido de GSH tanto en los animales sometidos a isquemia como en los

animales control a las 20 h post-reperfusión. Esta disminución es significativa al

compararla con los resultados obtenidos a las 2 h en el grupo IR y a las 72 h en

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


45

ambos grupos, lo que implica que el estrés quirúrgico per se disminuye los niveles

de GSH. La recta de descenso en el grupo sometido a IR tiene una pendiente

mayor vs el grupo control, por lo que se calculó la velocidad de depleción del

Glutatión en ambos grupos entre la 2da y la 20ma horas (Figura 14).

Figura 12: Contenido de derivados carbonilos, producto de oxidación de proteínas en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia: Los niveles de carbonilos se expresan como nanomoles de carbonilo

por miligramos de proteína, los resultados representan el promedio ± D.S. para 4 a 6 animales por grupo

experimental. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas sometidas o no a

isquemia fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls: a p<0,05

vs IR 20 h

Figura 13: Contenido de Glutatión total en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia: Los

resultados se expresan como μmoles de Glutatión por gramo de hígado y representan el promedio ± D.S para

4 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas

sometidas a isquemia y sometidas a operación simulada (sham) fue determinada por las pruebas de ANOVA

unifactorial y test de Newman-Keuls: a p<0,05 vs IR 20 h; b p<0,05 vs Sham 20 h.

Presencia de grupos carbonilos en proteínas hepáticas post 60 minutos de isquemia

0 20 40 60 800

1

2

3

4

5

6

7

8

9

a: p<0.05 vs IR 20h

a

a

a

a

aa

a


nmol

es c

arbo

nilo

s/m

g pr

otei

na

Sham

IR

sham

IR

Contenido de glutatión total en tejido hepático

0 20 40 60 800.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

a: p<0.05 vs IR 20h

a,b

a,b

a,b

b: p<0.05 vs Sham 20hTiempo de reperfusión (h)

μmol

/g h

ígad

o

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


46

Figura 14: Velocidad de depleción de Glutatión entre las 2 y 20 horas de reperfusión del contenido de en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia: Los resultados se expresan como μmoles de

Glutatión por gramo de hígado y representan el promedio ± D.S para 4 a 6 animales por grupo experimental.

La significancia de la diferencia entre los animales IR vs Sham fue determinada por el test t de Student para

datos no pareados (p<0,05)

La diferencia en la velocidad de depleción resultó estadísticamente

significativa al comparar los grupos IR vs Sham, lo que indica que la disminución

de GSH es más rápida en los animales sometidos a isquemia. Es decir, el estrés

quirúrgico y la recuperación postoperatoria (que implica menor consumo de

alimento) determinan una caída en GSH en ambos grupos, pero la tasa de

consumo de GSH es mayor en los animales sometidos a isquemia, lo que se

traduce en mayor velocidad de consumo de Glutatión.

Como parámetro adicional para estimar el estrés oxidativo tisular se calculó

la razón entre los contenidos de proteínas oxidadas y de GSH, lo que constituye

un índice de estrés oxidativo parcial, ya que relaciona un parámetro indicativo de

actividad prooxidante, con otro de connotación antioxidante. El índice de estrés

oxidativo (Figura 15) fue significativamente mayor en animales sometidos a

isquemia a las 20 y 48 h de reperfusión.

60 minutos de isquemia provocan un estado de estrés oxidativo tisular que

es objetivado por los parámetros obtenidos a las 20 y 24 h de reperfusión, valores

que vuelven a rangos normales a las 48 h post-reperfusión.

Depleción de GSH (2-20h reperfusión)

-0.15

-0.05

0.05

0.15

Sham IR

μ m

oles

GSH

/h/g

r hí

gado

* p<0.05

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


47

Figura 15: Índice de estrés oxidativo entre las 2 y 72 horas de reperfusión en hígado de ratas sometidas a 60 minutos de isquemia: Los resultados se expresan como la relación entre los contenidos de

proteínas oxidadas y de GSH y representan el promedio ± D.S para 3-14 animales por grupo experimental. La

significancia de la diferencia entre el índice de estrés oxidativo en los animales IR vs Sham fue determinada

con el test de ANOVA unifactorial seguido del test de Newman-Keuls ap<0,05.

4.1.4.- Cinética de la actividad de unión a ADN de NF-κB en animales

sometidos a isquemia-reperfusión y controles Se evaluó la actividad de unión al ADN del factor de transcripción nuclear

NF-κB en extractos nucleares obtenidos de muestras de hígado sometido a

isquemia y distintos tiempos de reperfusión (Figura 16).

En la Figura 16 se observa que NF-κB se activa temprano dentro de la

reperfusión en el tejido hepático de animales sometidos a isquemia y que esta

activación es transitoria (2da a 6ta horas), volviendo al nivel basal a partir de la 8va

hora de reperfusión. Se muestra en azul como un parámetro de comparación el

nivel de activación de NF-κB que se logra con LPS, siendo la activación que se

logra con IR similar. La actividad de unión al ADN aumenta nuevamente a partir de

la 12ma hora, siendo significativa con respecto a los niveles basales a las 18, 20,

24, 48 y 72 horas.

Índice de estrés oxidativo

0 25 50 750

1

2 sham

IR


a

a

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


48

Actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en tejido hepáticopost 60 minutos de isquemia

0 10 200

10

20

30

40

50

60

48 72Tiempo de reperfusión (h)

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

aaa

a

a

a: p<0.05 vs basal

a

1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C

Grupos experimentales (tiempo de reperfusión en horas post isquemia)

NF-κB

A

B

Basal

IRLPS

Actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en tejido hepáticopost 60 minutos de isquemia

0 10 200

10

20

30

40

50

60


Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

aaa

a

a

a: p<0.05 vs basal

a

1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C


NF-κB

A

B Actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en tejido hepáticopost 60 minutos de isquemia

0 10 200

10

20

30

40

50

60


Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

aaa

a

a

a: p<0.05 vs basal

a

1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C


NF-κB

A

B Actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en tejido hepáticopost 60 minutos de isquemia

0 10 200

10

20

30

40

50

60


Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

aaa

a

a

a: p<0.05 vs basal

a

1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C


NF-κB

1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C


1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C1 2 4 6 8 12 18 24 48 72 C


NF-κB

A

B

Basal

IRLPS

Basal

IRLPS

Figura 16: Efecto de 60 minutos de isquemia sobre la cinética de unión al ADN de NF-κB hepático

durante la reperfusión. A. EMSA utilizando la secuencia consenso para NF-κB (sección 3.7.2). B. Los

resultados están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas

de A y representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las

diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las

pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,05 vs control.

4.2.- CARACTERIZACIÓN DE LA MANIOBRA DE PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO

Para identificar la Segunda Ventana de Protección del PI (SVP) se realizó

una isquemia breve, de acuerdo a lo descrito por la mayoría de los autores en el

PI hepático, de 10 minutos de isquemia y se esperó 24 horas de reperfusión (de

acuerdo a los trabajos de SVP en miocardio) antes de someter al tejido a la

isquemia prolongada. Los resultados que se obtuvieron, sin embargo, no fueron

positivos y los animales que fueron sometidos al PI tuvieron mayor elevación en

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


49

las transaminasas séricas que los animales a los que se les sometió a una

operación simulada (sham) en lugar de la maniobra preacondicionante, diferencia

que además resultó estadísticamente significativa en el caso de AST (Figura 17).

Figura 17: Actividad de transaminasas séricas en animales sometidos PI 24 h antes de la isquemia prolongada. La actividad de transaminasas se expresa en U/l. Los resultados representan el promedio ± D.S

n=3-6. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia

fue determinada por t de Student para datos no pareados. La significancia de las diferencias entre los valores

promedio de ratas sometidas a isquemia (IR) versus animales con control de operación simulada *p< 0,05

Este resultado se repitió con intervalos de 15 y 20 horas entre la maniobra

preacondicionante y la isquemia prolongada. Se infiere que en el caso del hígado

el intervalo de tiempo que separa la maniobra preacondicionante de la isquemia

letal debería ser más prolongado, ya que los intervalos de tiempo que resultan

exitosos en el corazón, probablemente no son suficientes para que el tejido se

recupere de la primera isquemia y ésta resulta en un daño mayor al sobrevenir el

segundo período de isquemia. Con el objetivo de definir este intervalo de tiempo

se caracterizó la maniobra de preacondicionamiento isquémico en el hígado de

rata.

*

Actividad de AST en animales sometidos a PI con una ventana de 24 horas previo 60 minutos de isquemia

0

250

500

750

1000

1250

IR 3 PI + IR 30

100

300

500

700

900

Actividad de ALT en animales sometidos a PI con una ventana de 24 horas previo 60 minutos de isquemia

IR 3 PI + IR 3

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


50

4.2.1.- Evaluación de parámetros de daño hepático en animales sometidos a la maniobra preacondicionante: actividad de transaminasas plasmáticas

Se sometió a los animales a 10 minutos de isquemia seguidos de reperfusión

de 0 a 72 horas y se obtuvo muestras de sangre para determinación de las

transaminasas ALT y AST.

Figura 18: Actividad de transaminasas séricas en animales sometidos a maniobra de preacondicionamiento isquémico y controles. La actividad de transaminasas se expresa en U/l (Niveles de

AST en A y actividad de ALT en B). Los resultados representan el promedio ± D.S para 3 a 6 animales por

tiempo de reperfusión experimental. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas

control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de

Newman-Keuls. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas sometidas a isquemia

(IR) versus animales con control de operación simulada (sham) se muestran con las letras a, b y c.

La Figura 18 muestra que la maniobra de preacondicionamiento isquémico

(MPI) produce una elevación en la actividad de transaminasas séricas AST y ALT,

alza que es significativa al compararla con los animales sometidos al control de

operación simulada, aunque el procedimiento per se también provoca alzas

enzimáticas leves. En el caso de AST (Figura 18 A) la elevación de la

concentración sérica en animales sometidos a MPI es de alrededor de 6 veces el

nivel basal (alrededor de 50 U/l), alcanzando la elevación máxima a las 2 y 6 horas

de reperfusión y volviendo a los basales después de las 48 horas. ALT (Figura 18

B) aumenta también a las 2 y 6 horas, pero menos de 3 veces su valor normal,

volviendo al nivel basal después de las 48 horas. Si bien la concentración sérica

de ambas enzimas aumenta significativamente después de 10 minutos de

a: p< 0.001 MPI vs Sham b: p< 0.001 MPI 48 vs MPI 2, 6, 8 c: p<0.05 Sham 48 vs Sham 4

Actividad de AST post maniobra de PI

0 10 20 30 40 50 60 70

50

150

250

MPI Sham MPI


U/ a b a

c a: p< 0.05 MPI vs Sham b: p<0.05 MPI 48 vs MPI 2, 6

Actividad de ALT post maniobra de PI

0 10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100

120

MPI Sham MPI


U/

a a

b

A B

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


51

isquemia, ésta elevación es mucho menor al compararla con la elevación

enzimática que se produce después de 60 minutos de isquemia. A las 24 horas de

reperfusión, que fue el tiempo de ventana que se ensayó inicialmente entre la MPI

y la isquemia prolongada, la actividad de transaminasas persiste levemente

elevada.

4.2.2.- Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en animales sometidos a la maniobra preacondicionante y controles Se tomaron muestras de tejido hepático lavado a distintos tiempos post 10

minutos de isquemia y se determinó el contenido de GSH y nivel de oxidación de

proteínas.

Las proteínas oxidadas aumentaron significativamente en los animales

sometidos a isquemia a las 6 horas de reperfusión (Figura 19 A). El contenido de

Glutatión en los animales sometidos a isquemia muestra una tendencia a la caída

a las 4 y 6 horas, que no resultó estadísticamente significativa (Figura 19 B). El

índice de estrés oxidativo, la razón entre proteínas oxidadas y GSH, tiene un

aumento significativo a las 6 horas de reperfusión (Figura 19 C).

Se concluye que 10 minutos de isquemia provocan daño hepático y

aumento en el estado de estrés oxidativo tisular, ambos leves, que tienen un punto

máximo a las 6 horas de reperfusión. Los parámetros de daño hepático vuelven al

nivel basal después de las 48 horas de reperfusión, mientras que los parámetros

de estrés oxidativo sufren un alza tan leve que no es evidenciable más allá de las

24 horas de reperfusión con los ensayos utilizados. Se elige un período de 72

horas como intervalo entre la maniobra de PI y la isquemia prolongada para

buscar la SVP del PI.

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


52

Figura 19: Parámetros de estrés oxidativo en animales sometidos a MPI y controles. A) Contenido de

derivados carbonilo, B) Contenido de Glutatión total e C) Índice de estrés oxidativo en hígado de ratas

sometidas a 10 minutos de isquemia. Los resultados representan el promedio ± D.S. para 4 animales por

grupo experimental. Los resultados correspondientes a los animales sometidos a control de operación

simulada (Sham) fueron normalizados. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de ratas

sometidas (MPI) o no (Sham) a la maniobra fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida

del test de Newman-Keuls a p<0,05.

4.3.- FASE TARDÍA DEL PREACONDICIONAMIENTO ISQUÉMICO

4.3.1.- Evaluación de parámetros de daño hepático en animales

sometidos a PI y controles Se realizó una maniobra de PI (MPI) que consistió en 10 minutos de

isquemia. En los animales en que no se realizó MPI, se hizo una laparotomía de

las mismas características, sin la colocación de clamp (Sham). 72 horas después

del PI los animales fueron reintervenidos y se les sometió a un período de

isquemia, que se denominó isquemia prolongada o letal, de 60 minutos. Los

0 2 4 6 8 10 12 14

0.5

1.0

1.5Sham

MP

Reperfusión (h)

Contenido relativo de GSH

0 2 4 6 8 10 12 14

1

2

3

Sham MP

a

Contenido relativo de carbonilos en proteínas

Reperfusión (h)

A

0 2 4 6 8 10 12 14

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

ShamMPI

a

Reperfusión (h)

Índice relativo POX/GSH

B

C

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


53

parámetros correspondientes a daño hepático fueron evaluados a las 3 y 20 horas

de reperfusión, que corresponden a puntos representativos de las fases temprana

y tardía del daño por IR de acuerdo a lo descrito en la sección 4.1 del modelo de

daño por IR.

4.3.1.1.- Evaluación de actividad de transaminasas plasmáticas Se determinó la actividad de las transaminasas ALT y AST en suero

obtenido a partir de muestras de sangre a las 3 y 20 horas post isquemia

prolongada.

Los controles utilizados corresponden a animales que fueron sometidos a

dos cirugías simuladas (Sham) o a PI sin isquemia (PI + Sham) con 3 o 20 horas

post quirúrgicas. Ambos controles presentaron resultados similares en los dos

tiempos de reperfusión (3 y 20 h), por lo que se agruparon en un grupo Sham y un

grupo PI + Sham, independientemente del tiempo de reperfusión. Asimismo, los

grupos Sham y PI + Sham no mostraron diferencias estadísticas entre sí en

ninguno de los marcadores de daño, lo que indica que los resultados obtenidos no

se deben a la maniobra preacondicionante per se, por lo que los resultados

obtenidos en los grupos sometidos a isquemia y preacondicionamiento isquémico,

fueron comparados con los resultados obtenidos en el grupo Sham. En la Figura

20 A se presentan los resultados de ALT. Se observa que ésta tuvo un alza

significativa con 60 minutos de isquemia en los animales que no fueron sometidos

a PI de 728±408 U/l a las 3 horas post-isquemia (Sham+IR 3) y de 913±871 a las

20 horas post-isquemia (Sham+IR 20). Al aplicar el PI 72 horas antes de la

isquemia prolongada, éste resulta en hepatoprotección, disminuyendo los valores

de ALT a 487±299 y 294±104, a las 3 y 20 horas respectivamente (grupos PI+IR 3

y PI+IR 20). La protección obtenida es estadísticamente significativa en la fase

tardía del daño, aunque en la fase temprana aparece una tendencia. Se graficó la

diferencia de los promedios de transaminasas obtenidos en los distintos grupos

(control vs daño y daño vs protección) y el cambio porcentual de ALT obtenido con

el PI en la fase temprana y tardía, lo que se muestra en el panel B de la Figura 20.

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


54

El porcentaje de disminución de ALT obtenido a las 3 horas post isquemia es de

27%, mientras que a las 20 horas la disminución que se obtiene con el PI sobre el

daño es de 56%.

Figura 20: Actividad de ALT sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. La actividad de ALT se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados

representan el promedio ± SEM para 7 a 15 animales por grupo experimental. En el panel A se muestran los

valores de ALT de animales controles, preacondicionados y no preacondicionados evaluados a las 3 o 20

horas de reperfusión. Los resultados se muestran en conjunto, pero los grupos comparados fueron: (Sham vs

Sham+IR 3 vs PI+IR 3) y (Sham vs Sham+IR 20 vs PI+IR 20). La significancia de las diferencias entre los

valores promedio de los grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de

Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a, b y c: a p< 0,01 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham, c p<0,05 vs

Sham+IR 20. En el panel B se muestra la el porcentaje de modificación del daño que se obtiene a las 3 o 20

horas con el PI.

En la Figura 21 A se presentan los resultados de AST. Se observa que ésta

tuvo un alza significativa con 60 minutos de isquemia de 1013±208 U/l a las 3 y de

984±929 a las 20 horas post-isquemia. Al realizar PI éste resulta en

hepatoprotección, disminuyendo los valores de ALT a 729±282 y 294±104, a las 3

y 20 horas respectivamente (PI+IR 3 y PI+IR 20). La protección obtenida es

estadísticamente significativa en la fase tardía del daño. Nuevamente la protección

que se obtiene es cuantitativamente mayor a las 20 horas. En el panel B se

muestra el cambio porcentual de ALT obtenido con el PI a las 3 o 20 horas. Se

observa que el porcentaje de disminución de AST a las 3 horas post-isquemia es

de 28%, mientras que a las 20 horas la disminución que se obtiene con el PI es de

70%.

-500

-250

250

500

Modificación de ALT 3 vs 20

Daño

Protección

0

3 h

20 h

56% 27%

B

0

250

500

750

1000

1250

U/l

Niveles de ALT durante la reperfusión temprana y tardía en animales sometidos a PI

3 h 20 h

PI +IR 20

Sham+IR 20

Sham

PI+shamSham+ IR 3

PI +IR 3

a

a

b

c

A

U/l

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


55

Figura 21: Actividad de AST sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. La actividad de AST se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados


valores de AST de animales controles, preacondicionados y no preacondicionados evaluados a las 3 o 20




Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a, b y c: a p< 0,01 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham, c p<0,05 vs

PI+IR 20. En el panel B se muestra el porcentaje de modificación del daño que se obtiene a las 3 o 20 horas

con el PI.

4.3.1.2.- Evaluación de la actividad de LDH plasmática Como un parámetro adicional de daño se evaluó la actividad de LDH sérica

en los animales sometidos a PI en muestras de sangre obtenidas a las 3 ó 20

horas de reperfusión post isquemia prolongada.

En la Figura 22 A se observa que LDH aumenta significativamente con 60

minutos de isquemia (p<0,001) a 1810±395 en la reperfusión temprana y a

1376±860 en la reperfusión tardía y que se logra una disminución significativa de

LDH sérico con el PI en el grupo evaluado durante la reperfusión tardía 555± 139

(p<0,05), disminución que no es observable durante la reperfusión temprana. En

efecto, el porcentaje de disminución de LDH a las 3 horas post-isquemia es de

21%, mientras que a las 20 horas la disminución con el PI es de 40% (Figura 22

B).

PI +IR 20

Sham+IR 20

Sham

PI+shamSham+ IR 3

PI +IR 3

Niveles de AST durante la reperfusión temprana y tardía en animales sometidos a PI

0

250

500

750

1000

1250 U

/l

20 h 3 h

a a

c

b

Modificación de AST 3 vs 20

Daño

Protección

-1000

0

1000

3 h

20 h

70% 28%

A B

U/

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


56

Figura 22: Niveles de LDH sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. La actividad de LDH se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados


valores de ALT de animales controles, preacondicionados y no preacondicionados evaluados a las 3 o 20




Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a y b: a p< 0,001, bp<0,05 vs Sham+IR 20 vs Sham. En el

panel B se muestra el porcentaje de modificación del daño que se obtiene a las 3 o 20 horas con el PI.

4.3.2.- Evaluación de parámetros asociados al estrés oxidativo hepático en animales sometidos a PI y controles

En el análisis del modelo de daño se observó que un período de isquemia

de 60 minutos aumentaba los niveles de proteínas oxidadas en el tejido hepático a

las 20 horas de reperfusión, el contenido de Glutatión no se modificaba versus

animales Sham, pero sí la velocidad de consumo de éste, que era mayor en los

animales sometidos a isquemia (sección 4.1.2). Para determinar si el PI modifica

el estado de estrés oxidativo tisular que provocan 60 minutos de isquemia, de

acuerdo a lo descrito para el modelo de daño por IR (sección 4.1.2) se evaluó el

contenido de Glutatión total y de proteínas oxidadas en animales sometidos a PI e

isquemia durante la reperfusión tardía.

Las proteínas oxidadas aumentaron significativamente en los animales

sometidos a isquemia a las 20 horas de reperfusión (Figura 23, p<0,05 vs Sham).

Al realizar PI 72 horas antes de la isquemia la oxidación de proteínas disminuye

PI +IR 20

Sham+IR 20

Sham

PI+shamSham+ IR3

PI +IR 3

20 h

Niveles de LDH durante la reperfusión temprana y tardía en animales sometidos a PI

0

500

1000

1500

2000 U

/l

3 h

Modificación de LDH 3 vs 20

Daño

Protección

0

3 h

20 h

B

-

100

200

21% 40%

A

U/

a a

a

b

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


57

en comparación con el nivel encontrado en los animales isquemizados y no

preacondicionados (p<0,01)

Figura 23: Oxidación de proteínas hepáticas en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada: Los niveles de carbonilos se expresan como nanomoles de carbonilo por miligramos de proteína,

los resultados representan el promedio ± SEM. para 5 a 10 animales por grupo experimental. La significancia

de las diferencias entre los valores promedio de los grupos experimentales fue determinada por las pruebas

de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls. ap<0,05 vs Sham, bp<0,01 vs Sham+ IR 20.

Figura 24: Contenido de Glutatión total en hígado de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada: Los resultados se expresan como μmoles de Glutatión por gramo de hígado y

representan el promedio ± D.S para 4 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias

entre los valores promedio de ratas sometidas a isquemia y sometidas a operación simulada (sham) fue

determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls y el test t de Student

para valores no pareados. Se indica sobre cada punto con la letras a: a p<0,05 vs Sham

Presencia de grupos carbonilos en proteínas de tejido hepático de animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía

Sha Sham+IR PI+IR 0

1

2

nmol

es c

arbo

nilo

/mg a

b

Contenido de glutatión total en tejido de animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía

Sha Sham+IR PI+IR 0

1

2

3

4

5

6

μ m

oles

GSH

/g

a

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


58

En la Figura 24 se presentan los resultados de contenido de GSH, el cual

disminuye significativamente en los animales sometidos a isquemia sin PI y se

observa una clara tendencia a la recuperación como efecto del PI previo al período

de isquemia de 60 minutos. Al aplicar el test de ANOVA sin embargo, esta

diferencia no resultó significativa.

El índice de estrés oxidativo se presenta en la Figura 25. Éste aumentó

significativamente en los animales sometidos a isquemia sin PI (p<0,001 vs Sham)

y se recupera retornando a los niveles obtenidos en los animales control con el PI

(p<0,05 vs PI+IR 20)

Figura 25: Índice de estrés oxidativo en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. Los resultados se expresan como la relación entre los contenidos de proteínas oxidadas y de

GSH y representan el promedio ± D.S para 3-14 animales por grupo experimental. La significancia de la

diferencia entre el índice de estrés oxidativo en los animales IR vs Sham fue determinada con el test de

ANOVA unifactorial seguido del test de Newman-Keuls ap<0,05

4.4.- Evaluación del efecto del pretratamiento con antioxidante sobre el preacondicionamiento isquémico. En la hipótesis se planteó que la hepatoprotección lograda con el PI

dependería de las ROS generadas durante la MPI las que gatillarían vías de

protección redox sensibles que modificarían el patrón celular de expresión de

proteínas a nivel transcripcional favoreciendo aquellas relacionadas con vías de

sobrevivencia celular. Una vez lograda la protección mediante el PI se pretrató a

los animales, una hora antes de la MPI con un antioxidante (NAC 0,5 mg/g peso

corporal). Se esperaba que el NAC aboliera la síntesis de ROS durante MPI, en

Indice de estrés oxidativo en animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía

Sham Sham+IR 20 PI+IR 200.

0.

1.

1.

2.

2. a

b

PO

X/G

SH

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


59

consecuencia, el efecto protector y que por lo tanto, los animales pretratados con

NAC mostrarían niveles de transaminasas similares a los animales no sometidos a

PI. Los resultados de este ensayo se muestran en las Figuras 40 y 41.

En la Figura 26 se presenta la actividad de ALT y AST obtenida durante la

reperfusión temprana. Al administrar NAC o su vehículo PBS y hacer los controles

de cirugía simulada (NAC Sham o PBS Sham) la actividad de las transaminasas

no se modifica al compararla con los valores controles Sham realizados

previamente. Al pretratar los animales con NAC o su vehículo y someter a los

animales a 60 minutos de isquemia, sin la realización de preacondiconamiento

isquémico previo, la actividad de transaminasas, tanto ALT (panel superior) como

AST (panel inferior) se mantienen elevados (alrededor de 1000 U/l). Esta alza es

significativa al compararla con los dos grupos controles (p<0,001), es decir, NAC

no interviene en el daño provocado por 60 minutos de isquemia. El tratamiento con

NAC se realizó 1 hora antes de la MPI o su simulación, esto es, 73 horas antes de

la isquemia prolongada. Asimismo, el pretratamiento con NAC no modificó el

efecto del preacondiconamiento isquémico, y tanto el grupo tratado con NAC como

el grupo tratado con PBS que fueron sometidos a PI y luego a isquemia de 60

minutos mostraron niveles mas bajos de transaminasas en relación a su control de

daño (no sometido a PI, p>0,01) y no mostraron diferencias significativas entre sí

(p>0,05). Es decir, el pretratamiento con antioxidantes no evita la hepatoprotección

mediada por el PI.

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


60

Figura 26: Efecto del pretratamiento con NAC sobre las transaminasas séricas de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada durante la reperfusión temprana. La actividad de

transaminasas se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados representan el promedio

± SEM para 4 a 7 animales por grupo experimental. En el panel superior se muestran los valores de ALT y en

el panel inferior los de AST. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de los grupos fue

determinada por las pruebas de ANOVA bifactorial seguida del test de Bomferroni.

Al evaluar el efecto del pretratamiento con antioxidantes sobre la

hepatoprotección lograda con el PI durante la reperfusión tardía (Figura 27) los

resultados obtenidos son muy similares a aquellos que se obtuvieron durante la

reperfusión temprana: NAC o PBS no modifican la actividad de transaminasas que

se obtiene en los controles, no alteran el daño generado por 60 minutos de

isquemia ni evitan el efecto hepatoprotector de 10 minutos de isquemia 72 horas

antes de la isquemia prolongada.

Efecto de NAC sobre los niveles de ALT durante la reperfusión temprana

0

250

500

750

1000

1250 NAC Sham

PBS Sham

NAC Sham+IR 3

PBS Sham+IR 3

NAC PI+IR 3

PBS PI +IR 3 U

/l

Efecto de NAC sobre los niveles de AST durante la reperfusión temprana

0

250

500

750

1000

1250

U/l

p>0,05

p>0,05

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


61

Figura 27: Efecto del pretratamiento con NAC sobre las transaminasas séricas de animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada durante la reperfusión tardía. La actividad de

transaminasas se expresa en unidades internacionales por litro (U/l). Los resultados representan el promedio

± SEM para 4 a 7 animales por grupo experimental. En el panel superior se muestran los valores de ALT y en

el panel inferior los de AST. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de los grupos fue

determinada por las pruebas de ANOVA bifactorial seguida del test de Bomferroni.

4.5.- Evaluación de los niveles de citoquinas séricas en animales sometidos a PI y controles:

Se estimó los niveles séricos de citoquinas TNF-α, IL-6, IL-10 e IL1β a

través del ensayo de ELISA en animales sometidos a PI previo a un período de

isquemia de 60 minutos.

En la Figura 28 se muestra que los niveles de TNF-α aumentan en forma

significativa con un período de isquemia de 60 minutos, elevándose tres veces su

valor basal durante la reperfusión temprana y al doble de su valor basal durante la

p>0,05

p>0,05

Efecto de NAC sobre los niveles de ALT durante la reperfusión tardía

0

250

500

750

1000

1250

U/l

Efecto de NAC sobre los niveles de ALT durante la reperfusión tardía

0

250

500

750

1000

1250

U/l

NAC Sham

PBS Sham

NAC Sham+IR 20

PBS Sham+IR 20

NAC PI+IR 20

PBS PI +IR 20

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


62

reperfusión tardía (p<0,01 vs Sham). Con el PI los valores de TNF-α vuelven a su

nivel basal, cambio que es significativo en ambas fases de la reperfusión (p<0,05).

Figura 28: Niveles de TNF-α sérico en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia

prolongada. Los niveles de TNF-α se expresan en picogramos de TNF-α por ml de suero. Los resultados

representan el promedio ± SEM para 8-12 animales por grupo experimental. Se muestran los valores de TNF-

α durante la reperfusión temprana (panel A) y tardía (panel B). La significancia de las diferencias entre los


Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a y b: a p< 0,01 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham+IR 3 ó 20.

La modificación de los niveles séricos de IL-6 se muestra en la Figura 29,

en la que se observa que durante la reperfusión temprana (panel A) aumenta

alrededor de 2.5 veces su valor basal y que el PI provoca un aumento aún mayor

a este tiempo de reperfusión de alrededor de 4 veces su valor basal. Durante la

reperfusión tardía (panel B), al observar la escala en el eje de las Y y compararla

con el panel A se aprecia que todos los grupos presentan niveles mucho menores

de IL-6 que van desde 60±37 en el grupo control a 121±82 en el grupo de daño

versus los valores que se encuentran durante la reperfusión temprana que van

desde 265±135 que es el valor que presenta el grupo control a: 1121±3430, valor

del grupo protegido. En el panel B se observa que en ambos grupos, de daño y

protección, los niveles de IL-6 aumentan significativamente sobre el basal (p<0,05

vs Sham), pero que no hay diferencias significativas entre ambos (p>0,05).

Sham Sham + IR 20 PI + IR 20 0

50

100

150

200

250

pg T

NF-α

/ml s

uero

Niveles séricos de TNF-α durante la reperfusión temprana

Sham Sham + IR 3 PI + IR 30

100

200

300

400

500

pg T

NF-α

/ml s

uero

a

b

a

b

Niveles séricos de TNF-α durante la reperfusión tardía

B A

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


63

Figura 29: Niveles de IL-6 sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. Los niveles de IL-6 se expresan en picogramos de IL-6 por ml de suero. Los resultados representan el

promedio ± SEM para 8-12 animales por grupo experimental. Se muestran los valores de IL-6 durante la

reperfusión temprana (panel A) y tardía (panel B). La significancia de las diferencias entre los valores

promedio de los grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-

Keuls, lo que se muestra con las letras a y b. A: a p< 0,01 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham+IR; B: a<0,05 vs

Sham.

Figura 30: Niveles de IL-1β sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. Los niveles de IL-1β se expresan en picogramos de IL-1β por ml de suero. Los resultados

representan el promedio ± SEM para 8-12 animales por grupo experimental. Se muestran los valores de IL-1β

durante la reperfusión temprana (panel A) y tardía (panel B). La significancia de las diferencias entre los


Newman-Keuls, lo que se muestra con las letras a y b. B: a p< 0,05 vs Sham, b p< 0,05 vs Sham+IR 20.

IL-1β es otra de las citoquinas que se han involucrado en la respuesta

inflamatoria al daño por IR. En la Figura 30 se observa que durante la reperfusión

temprana ni la IR ni el PI provocan cambios significativos en los niveles séricos de

IL-1β respecto de los niveles séricos de la citoquina encontrados en animales

sometidos a la cirugía simulada, mientras que durante la reperfusión tardía el


0

25

50

75

100

125

150Niveles séricos de IL-6 durante la reperfusión temprana

pg IL

-6/m

l de

suer

o Niveles séricos de IL-6 durante la reperfusión tardía


5

10

15

pg IL

-6/m

l de

suer

o

a

b

a a

A B


2

5

7

10

Niveles séricos de IL-1β durante la reperfusión temprana

pg IL

-1β

/ml s

uero

Niveles séricos de IL-1β durante la reperfusión tardía


1

2

pg IL

-1β/

ml

A B

a

b

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


64

grupo IR exhibe niveles significativamente más elevados comparados con los

controles (p<0,05 vs Sham) y el PI resulta en una recuperación de estos niveles a

valores cercanos a los encontrados en los controles (p<0,05 vs Sham+IR 20).

IL-10 por su parte participaría controlando la extensión del daño por IR

gracias a sus propiedades antiinflamatorias. En el modelo expuesto, sin embargo,

los niveles de IL-10 durante la reperfusión temprana fueron significativamente más

bajos en los animales sometidos a PI vs los animales sometidos a IR sin PI

(p<0,01, Figura 31 A), mientras que en el grupo Sham durante la reperfusión

temprana los niveles de esta citoquina fueron indetectables a través del ensayo

aplicado. Durante la reperfusión tardía se observa una tendencia en el grupo PI a

presentar niveles séricos de IL-10 similares a los encontrados en los animales

Sham, pero las diferencias no fueron significativas entre los grupos (Figura 31 B).

Figura 31: Niveles de IL-10 sérica en animales sometidos a PI 72 horas antes de la isquemia prolongada. Los niveles de IL-10 se expresan en picogramos de IL-10 por ml de suero. Los resultados

representan el promedio ± SEM para 8-12 animales por grupo experimental. Se muestran los valores de IL-6

durante la reperfusión temprana (panel A) y tardía (panel B). La significancia de las diferencias entre los

valores promedio de los grupos fue determinada en A por el test t de Student y en B por las pruebas de

ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls, lo que se muestra con las letra a: a p< 0,01 vs

Sham+IR 3.

Niveles séricos de IL-10 1h durante la reperfusión tardía


25

50

75

100

125

pg IL

-10/

ml s

uero

Sham + IR 3 PI + IR 3 0

50

100

150 Niveles séricos de IL-10 1h durante la reperfusión temprana

pg IL

-10/

ml d

e su

ero

a

A B

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


65

4.6.- Evaluación de la activación de factores de transcripción en animales sometidos a PI y controles

Se evaluó la actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en

hígado de animales sometidos a preacondicionamiento isquémico e isquemia con

3 o 20 horas de reperfusión.

En la Figura 32 se muestran los resultados correspondientes al análisis

densitométrico de las bandas obtenidas en geles de EMSA. En el panel A se

muestra una fotografía de uno de los cuatro geles analizados, se aprecian bandas

de mayor densidad en los carriles correspondientes al tejido de animales

sometidos a PI, lo que significa mayor unión de la proteína al oligonucleótido, que

en este caso, correspondía a la secuencia de consenso de NF-κB. En el panel B

se presenta el gráfico que representa densidad relativa en unidades

densitométricas versus grupos experimentales. En animales sometidos a IR sin la

maniobra preacondicionante (Sham+IR 3) la activación del factor de transcripción

estadísticamente diferente al compararla con la actividad de unión al ADN

obtenida para animales con simulación de cirugía (Sham). En los animales

sometidos a PI la actividad de unión al ADN de NF-κB fue mayor al compararla

con los animales Sham (p<0,05 y con los animales Sham+IR 3 (p<0,01).

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


66

Figura 32: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de NF-κB en animales

sometidos a isquemia y reperfusión temprana. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso

para NF-κB (sección 3.7.2) S=Sham. B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los




pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,01 vs Sham, bp<0,05 vs Sham+IR

3.

Durante la reperfusión tardía la activación de NF-κB se presenta en la

Figura 33. En el panel A se observa una fotografía de ejemplo de lo obtenido en

los geles de EMSA, si bien hay una leve tendencia a mayor activación en el

hígado de animales sometidos a PI previo a la isquemia prolongada, la mayoría de

las bandas aparecen tenues, lo que implica baja actividad de NF-κB, que es

similar en todos los grupos. En B se presenta el gráfico de la densidad relativa de

las bandas analizadas en unidades densitométricas por grupos experimentales. En

el tejido de los animales sometidos a IR con la maniobra preacondicionante (PI+IR

20) hay una tendencia a mayor activación de NF-κB. Sin embargo, en el análisis

estadístico estas diferencias no fueron significativas (p>0,05). Por lo tanto el

Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB animales sometidos a PI durante la reperfusión temprana


1

2

3

4

5

6

7

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

NF-κB

S S S IR 3 IR 3 IR 3 IR 3 PI-IR3 PI-IR 3 PI-IR 3 Grupos experimentales A

B

a, b

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


67

preacondicionamiento isquémico durante la SVP sobre 60 minutos de isquemia

aumenta la activación de NF-κB sólo durante la reperfusión temprana.

NF-κB

S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR 20

Grupos experimentales

Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción NF-κB en animales sometidos a PI durante la reperfusión tardía


25

50

75

100

125

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

arbi

trar

ias

B

A

NF-κB


Grupos experimentales



25

50

75

100

125

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

arbi

trar

ias



25

50

75

100

125

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

arbi

trar

ias

B

A

Figura 33: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de NF-κB en animales

sometidos a isquemia y reperfusión tardía. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso para

NF-κB (sección 3.7.2) S=Sham B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los resultados

están expresados en unidades densitométricas arbitrarias que resultan del análisis de las bandas de A y

representan el promedio ± D.S. para 3 a 6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias

entre los valores promedio de ratas control y sometidas a isquemia fue determinada por las pruebas de

ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls p>0,05.

En la introducción se comentó que tanto el daño mediado por IR como la

protección desencadenada por el PI son procesos complejos que dependen de

múltiples mecanismos, utilizan para la señalización varias vías de transducción de

señales en forma simultánea y potencialmente ejercen su efecto a través de más

de un efector final. Bajo esta premisa se evaluó la activación de otros factores de

transcripción que se han relacionado con el daño mediado por IR y con las vías de

señalización en el tejido hepático: AP-1 y HSF-1

En la Figura 34 se muestra una de las fotografías de los geles obtenidos en

el EMSA de AP-1 (panel A) y el gráfico del análisis densitométrico de las bandas

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


68

(panel B). En la fotografía se aprecia que las bandas aparecen más densas en los

carriles correspondientes al tejido hepático de animales sometidos a isquemia sin

preacondicionamiento como en aquellos a los que se les sometió a PI 72 horas

antes de la isquemia letal, mientras que en el tejido de los animales no sometidos

a isquemia prácticamente no hay activación de AP-1. Al hacer el análisis

densitométrico gráfico (panel B) se observó que la activación de AP-1 aumenta

significativamente con la isquemia a las 3 horas de reperfusión (p<0,01) y con el PI

más isquemia (p<0,05) sin embargo la diferencia entre estos dos grupos no fue

estadísticamente significativa.

Figura 34: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de AP-1 en animales sometidos a isquemia y reperfusión temprana. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso

para AP-1 (sección 3.7.2). S=Sham B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los




pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,01 vs Sham, bp<0,05 vs Sham.

Durante la reperfusión tardía la activación de AP-1 sigue siendo mayor en

los animales sometidos a isquemia, con o sin PI previo (Figura 35, panel A); sin

embargo, en el grupo de PI no todas las bandas mostraron densidades altas a

Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción AP-1 durante la reperfusión temprana en animales sometidos a PI


2

5

7

10

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

b

a

B

S S S IR 3 IR 3 IR 3 PI-IR3 PI-IR 3 PI-Grupos experimentales

AP-1

A

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


69

diferencia de los animales del grupo IR. Al realizar el análisis densitométrico (panel

B) el promedio de los valores demuestra que la activación de AP-1 es mayor en el

tejido de los animales sometidos a IR sin PI (Sham+IR 20) versus los animales

control (p<0.01), mientras que en el tejido de los animales sometidos a PI esta

activación disminuye a niveles aún menores que los encontrados en los animales

control (p<0,05) siendo también esta diferencia significativa al comparar este

grupo (PI+IR 20) con el grupo no protegido (p<0.001).

AP-1

Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción AP-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI


25

50

75

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

a

b, c


Grupos experimentalesA

B

AP-1



25

50

75

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

a

b, c



25

50

75

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas



25

50

75

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

a

b, c



B

Figura 35: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de AP-1 en animales sometidos a isquemia y reperfusión tardía. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso para

AP-1 (sección 3.7.2) S=Sham B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los resultados




ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,01 vs Sham, bp<0,05 vs Sham, cp<0,0001 vs

Sham+IR 20

AP-1, por lo tanto, a diferencia de NF-κB tiende a disminuir el nivel de

activación gracias al PI lo que se hace significativo durante la reperfusión tardía.

En la Figura 36 se presentan los resultados para HSF-1 durante la

reperfusión temprana. Si bien hay una tendencia a una menor activación del factor

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


70

en el tejido de los animales sometidos a isquemia, estas diferencias no fueron

significativas respecto del grupo control (p>0,05).

Figura 36: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de HSF-1 en animales sometidos a isquemia y reperfusión temprana. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso

para HSF-1 (sección 3.7.2) S=Sham B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los




pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls p>0,05.

Durante la reperfusión tardía en el grupo correspondiente al daño (Figura

37, Sham+IR 20) la activación de HSF-1 disminuye, es decir, la unión de la

proteína al ADN es menor que los niveles que se encontraron en el grupo control.

El efecto del preacondicionamiento isquémico es retornar estos niveles de

activación a los niveles que se encontraron en el grupo control.

HSF-1

S S S S IR 20 IR 20 IR 20 IR 20 PI-IR20 PI-IR 20 PI-IR


B Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción HSF-1

en animales sometidos a PI durante la reperfusión temprana

Sham PI + IR 0

1

2

3

4

5

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

Sham + IR 3

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


71

Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción HSF-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI


10

20

30

40

50U

nida

des

dens

itom

étric

as

a

b

HSF-1



B Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción HSF-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI


10

20

30

40

50U

nida

des

dens

itom

étric

as

a

b

Evaluación de la actividad de unión al ADN del factor de transcripción HSF-1 durante la reperfusión tardía en animales sometidos a PI


10

20

30

40

50U

nida

des

dens

itom

étric

as

a

b

HSF-1



B

Figura 37: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de HSF-1 en animales sometidos a isquemia y reperfusión temprana. A. Fotografía de EMSA utilizando la secuencia consenso

para HSF-1 (sección 3.7.2). B. Gráfico del análisis densitométrico por grupo experimental. Los resultados




ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls a p<0,05 vs Sham, bp<0,05 vs Sham+IR 20.

Para visualizar los cambios ocurridos a nivel de activación de factores de

transcripción se graficó la razón obtenida entre el promedio del grupo sometido a

isquemia o a isquemia previo preacondiconamiento y su control Sham respectivo.

Se expresan los resultados en número de veces versus grupo experimental y

factor de transcripción (Figura 38), se indica con una línea punteada que atraviesa

1 en el eje de las Y el nivel de activación basal, que en este caso corresponde a lo

encontrado en Sham. Se indica con ∗ los cambios que resultaron significativos en

el test estadístico originalmente aplicado (Figuras 32 al 37), siendo esta

agrupación un ejercicio para visualizar los cambios en conjunto. El nivel de

activación de NF-κB aumenta durante la reperfusión temprana con el PI previo a

un período de isquemia de 60 minutos y no se modifica significativamente en el

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


72

resto de los grupos. AP-1, que presenta los mayores cambios respecto de su

basal, aumenta con isquemia a las 3 y a las 20 horas y con el PI a las 3 horas.

Durante la fase tardía de la reperfusión la activación de AP-1 disminuye con el PI.

HSF-1 no presenta cambios significativos durante la fase temprana de la

reperfusión (3 horas) y disminuye su nivel de activación con la isquemia de 60

minutos y con el PI retorna a niveles más cercanos al basal.

Figura 38: Efecto del preacondicionamiento isquémico sobre la activación de NF-κB, AP-1 y HSF-1 en

animales sometidos a isquemia durante la reperfusión temprana y tardía Gráfico de las modificaciones

sufridas en la actividad de los factores de transcripción. Los resultados representan la razón entre el promedio

en unidades densitométricas arbitrarias que presentaron los grupos IR o PI para los distintos factores y tiempo

y el promedio de su control Sham y están expresadas como número de veces sobre la activación control

(Nivel activación control=1) versus factor de transcripción.

4.7.- Evaluación de los niveles de proteínas relacionadas con la citoprotección en animales sometidos a PI y controles Se evaluó los niveles proteicos (Western blot) o la expresión de mARN (RT-

PCR) de algunas de las proteínas que podrían participar como efectoras en la

respuesta desencadenada por el PI durante la reperfusión tardía.

Modificación de la activación de factores de transcripción NF-κB, AP-1 y HSF-1 durante la reperfusión temprana y tardía

NF-κB

Nivel de activación

control

HSF-1 AP-1

PI +IR 20

PI +IR 3

Sham+ IR 3

Sham+IR 20

Núm

ero

de v

eces

0

1

2

3

4

5

∗

∗

∗

∗

∗ ∗∗

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


73

En la Figura 39 se muestra en el panel A una fotografía de uno de los geles

de Western blot utilizados para la determinación de los niveles de fibrinógeno.

Como control se utilizó la expresión de actina. Se observa que hay una tendencia

al aumento de la expresión de fibrinógeno con IR, cambio que no resultó

significativo, y una disminución de la expresión de la proteína en el tejido de

animales sometidos a PI (p<0,05 vs Sham+IR 20).

Niveles de fibrinógeno en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico y reperfusión tardía

Sham Sham + IR 20 PI + IR 200.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

a

Fibrinógeno

Actina

S S PI-IR20 PI-IR 20 IR 20 IR 20


B Niveles de fibrinógeno en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico y reperfusión tardía


0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

a

Fibrinógeno

Actina

S S PI-IR20 PI-IR 20 IR 20 IR 20


B

Figura 39. Efecto del PI sobre los niveles de fibrinógeno hepático. A, Western blot para la detección de

fibrinógeno en muestras de hígado de ratas. B, análisis densitométrico de A. Los resultados representan el

promedio ± S.E.M. para 3 -6 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias entre los

valores promedio de los distintos grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del

test de Newman-Keuls (p<0.05): ap<0,05 vs Sham+IR 20.

La expresión de haptoglobina se presenta en la Figura 40. Los niveles de

expresión de esta proteína variaron significativamente entre los distintos grupos

experimentales durante la reperfusión tardía, lo que se observa como un aumento

en la expresión de haptoglobina en el grupo preacondicionado (1.19±0.22),

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


74

significativa versus el grupo sometido a isquemia y no preacondicionado

(0.77±0.46), que no tuvo diferencias significativas con el grupo Sham (0.98±0.19).


0.5

1.0

1.5

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

Niveles de haotoglobina en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico

Haptoglobina

Actina

S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20


B


0.5

1.0

1.5

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas


0.5

1.0

1.5

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

Niveles de haotoglobina en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico

Haptoglobina

Actina



Haptoglobina

Actina



B

Figura 40. Efecto del PI sobre los niveles de haptoglobina hepática. A, Western blot para la detección de

haptoglobina en muestras de hígado de ratas. B, análisis densitométrico de A. Los resultados representan el

promedio ± S.E.M. para 5-10 animales por grupo experimental. La significancia de las diferencias entre los

valores promedio de los distintos grupos fue determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del

test de Newman-Keuls (p<0,05) ap<0,05 vs Sham+IR 20.

Los niveles de HO-1 (Figura 41) no presentaron diferencias significativas

entre los grupos experimentales, la dispersión de los resultados fue pequeña y los

promedios de 7 a 17 animales por grupo experimental, expresados en unidades

densitométricas, fueron de 0,77±0,19 para el grupo control, 0,78±0,17 Sham + IR

20 y 0,8±0,15 para el grupo sometido a la MPI antes de la isquemia prolongada.

Los niveles de HSP-70 encontrados en el tejido de animales sometidos a

isquemia sin PI aumentaron significativamente versus el control de cirugía

simulada (Figura 42, panel B). El nivel de expresión de HSP 70 volvió al nivel

basal al someter el tejido al PI 72 horas antes de la isquemia prolongada.

a

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


75

Figura 41. Efecto del PI sobre los niveles de HO-1 hepática. A, Western blot para la detección de HO-1 en

muestras de hígado de ratas. B, análisis densitométrico de A. Los resultados representan el promedio ±

S.E.M. n= 7-17. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de los distintos grupos fue

determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls (p<0,05).

Niveles de HSP 70 en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico


0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

a

b

HSP 70

Actina

S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20


B Niveles de HSP 70 en tejido hepático de animales sometidos apreacondicionamiento isquémico


0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

a

b

HSP 70

Actina

S S IR20 IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20 PI-IR 20


B

Figura 42: Efecto del PI sobre los niveles de HSP 70 hepática. A, Western blot para la detección de HSP

70 en muestras de hígado de ratas. B, análisis densitométrico de A. Los resultados representan el promedio ±

S.E.M n=4-9. La significancia de las diferencias entre los valores promedio de los distintos grupos fue

determinada por las pruebas de ANOVA unifactorial seguida del test de Newman-Keuls lo que se muestra con

las letras a y b: ap<0,05 vs Sham, bp<0,05 vs Sham+IR 20.

Niveles de HO-1 en tejido hepático de animales sometidos a preacondicionamiento isquémico y reperfusión tardía

Sham Sham+IR 20 PI+IR 200.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

HO-1

Actina



B

IV.- RESULTADOS

_____________________________________________________________________________________________


76

La expresión de iNOS se estimó a través de la medición de los niveles de

ARN con la técnica de RT-PCR. En ensayos previos en nuestro laboratorio se

había intentado estimar la expresión de la proteína iNOS a través de Western blot

sin resultados positivos.

En la Figura 43 se observa que la banda correspondiente al ARN de iNOS

solamente es observable en los carriles correspondientes al tejido hepático de los

animales sometidos a IR sin PI previo. En el resto de los grupos prácticamente no

se observó la presencia de la banda. Este ensayo se realizó en dos animales por

grupo experimental, por lo que no fue posible obtener significancia estadística, sin

embargo, este resultado se repitió en todas las repeticiones realizadas (4) por lo

que es esperable que al repetir el ensayo para un n mayor en cada grupo esta

tendencia se mantenga.

18S

C CN CC IR 20 IR 20 PI-IR 20 PI+IR 20 S S


iNOS

Niveles de mARN de iNOS en tejido hepático de animalessometidos a preacondicionamiento isquémico


0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

B

18S

C CN CC IR 20 IR 20 PI-IR 20 PI+IR 20 S S


iNOS



0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas



0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Uni

dade

s de

nsito

mét

ricas

B

Figura 43. Efecto del PI sobre los niveles de ARNm de iNOS hepática. A, RT-PCR utilizando partidores

específicos para iNOS. Control ARN 18 S B, Los resultados representan el promedio ± S.E.M. para 2 animales

por grupo experimental.

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


77

V.- DISCUSIÓN

En el hígado el daño por IR constituye un problema clínico importante que

afecta el resultado de las cirugías que se realizan bajo exclusión vascular y el

pronóstico del trasplante del órgano 13. El objetivo de este estudio fue determinar

la existencia y efectividad de la maniobra protectora del preacondicionamiento

isquémico en un marco temporal no descrito previamente para este órgano: la fase

tardía o segunda ventana de protección del preacondicionamiento isquémico. Se

implementó un modelo de isquemia reperfusión hepática parcial en la rata, se

determinó el marco temporal adecuado para obtener la hepatoprotección tardía a

través de la caracterización de la maniobra preacondicionante de 10 minutos de

isquemia y se analizó esta segunda ventana de protección en el hígado a través

de parámetros de daño hepático,parámetros de estrés oxidativo tisular, niveles de

citoquinas séricas relacionadas con la respuesta a IR, activación de los factores de

transcripción NF-κB, AP-1 y HSF-1 y la respuesta de algunas de las proteínas que

tienen elementos de respuesta para dichos factores de transcripción.

Se evaluó la respuesta de esta segunda ventana de protección al

pretratamiento con antioxidantes y se estableció que la hepatoprotección en este

marco temporal no se modifica con el pretratamiento con NAC una hora antes de

la MPI, es decir, la SVP sería independiente de las especies reactivas del oxígeno

que se generan durante la maniobra preacondicionante.

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


78

5.1.- Modelo de daño por isquemia-reperfusión

5.1.1.- Daño hepático en isquemia-reperfusión

El modelo de daño por IR con 60 minutos de isquemia que se describe en

este trabajo se comporta de acuerdo a lo publicado por otros grupos 15, 16,

presentando una curva bifásica de daño. Clásicamente estas fases se han

identificado como las fases de daño temprana y tardía, la fase temprana

comprende desde el inicio de la reperfusión hasta la tercera-cuarta hora y la fase

tardía desde la sexta hora de reperfusión hasta las 24 horas posteriores 17. En el

modelo presentado la fase temprana de daño se extiende desde la 1ra hasta la 6ta

hora de reperfusión. Se caracteriza por un alza de las enzimas ALT, AST y LDH y

va asociada a cambios morfológicos tales como dilatación de la vena central,

infiltrado inflamatorio de PMN y aparición de focos de necrosis después de la 4ta

hora (Figuras 8, 9 y 10). La fase tardía se concentra alrededor de la 18va-20ma

horas de reperfusión, presenta alza de transaminasas, LDH, focos de necrosis e

inflamación más extensos y distorsión de la citoarquitectura del tejido hepático

(Figuras 8, 9 y 11). Después de las 24 horas de reperfusión comienzan a disminuir

la actividad sérica de transaminasas y LDH llegando a niveles basales a las 48

horas de reperfusión. Las diferencias sutiles en el inicio y duración de ambas fases

de daño pueden ser a causa de las diferentes cepas de animales utilizadas (cepas

más sensibles) 105, al tiempo de isquemia (45, 60 o 90 minutos) y a otros

parámetros tales como el ayuno previo 107,108 y la hidratación intra y postoperatoria,

lo que se comprobó durante el desarrollo del modelo, tiempo durante el cual la

modificación de estos factores llevó a mejorar la tasa de sobrevivencia y a la

estandarización de los parámetros de daño. Inicialmente, por ejemplo, con 90

minutos de isquemia y sin hidratación intra ni postoperatoria la mortalidad de los

animales fue cercana al 50% (datos no publicados); mientras que la cirugía de 60

minutos practicada en animales alimentados disminuye el daño en alrededor de un

70% en términos de actividad de transaminasas. No obstante los detalles técnicos,

el modelo logrado exhibe claramente dos fases en términos de marcadores de

daño hepático. Este modelo, previamente no disponible estandarizadamente o

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


79

comunicado de tal manera por otros grupos en el país, permite evaluar otras

técnicas de hepatoprotección diferentes del preacondicionamiento isquémico.

En la placas histológicas analizadas a los distintos tiempos de reperfusión

no se encontró signos morfológicos sugerentes de apoptosis y durante los últimos

años la mayoría de los grupos que trabajan en el tema coinciden en que la muerte

celular que ocurre secundariamente al daño por IR sería mayoritariamente a

través de necrosis celular y que la vía apoptótica no daría cuenta más que de un

pequeño porcentaje de este daño 109. Una falencia en este punto es la ausencia de

un parámetro cuantitativo para estimar el daño tisular. La reevaluación de las

placas con asignación de puntajes, como el índice HAI (Histology Activity Index) 110, puede ser de utilidad; aunque es un índice creado para estimar la actividad de

hepatitis crónica asintomática. En el caso del miocardio, por ejemplo, la

estimación del tamaño del infarto es un parámetro confiable, reproducible y que se

correlaciona con los niveles de enzimas y el pronóstico funcional del tejido post-

infarto 111 y constituye el estándar para estimar el daño tisular post isquémico.

Actualmente no existe un parámetro de esta naturaleza en el hígado y uno de los

argumentos en contra del PI estima que aún con la disminución de transaminasas,

esto no se correlaciona necesariamente con un mejor funcionamiento o pronóstico

del órgano en el paciente 112.

5.1.2.- Estrés oxidativo hepático en isquemia-reperfusión

Se ha definido el estrés oxidativo como una condición de desbalance entre

la de generación de especies prooxidantes y su consumo por los mecanismo de

defensa antioxidante, a favor de los primeros 6. Esta condición lleva al deterioro

oxidativo de moléculas esenciales tales como lípidos, proteínas, carbohidratos y

ácidos nucleicos, que conducen a alteraciones estructurales y funcionales en la

célula y los tejidos.

En este estudio 60 minutos de isquemia producen un incremento en la

oxidación de proteínas, indicador de la condición prooxidante, a la 20va hora de

reperfusión posterior a la isquemia (Figura 12). Este aumento en el daño oxidativo

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


80

podría estar mediado por ROS generadas durante la fase temprana, cuya fuente

principal serían las células de Kupffer activadas, como se ha descrito en otros

modelos 113.

El aumento en el nivel de proteínas oxidadas no es significativo en otros

puntos de la curva de reperfusión, lo que puede significar que: (i) la cantidad de

ROS generadas no es suficiente para generar daño oxidativo en las proteínas, (ii)

que la muerte celular, que se objetiva en los cortes histológicos, está eliminando

aquellas células que resultaron muy dañadas, o (iii) que las mismas proteínas

carboniladas están siendo eliminadas por proteólisis 114. Durante las horas

posteriores a las 20 horas, además de la necrosis celular, es probable que se

gatillen mecanismos de defensa que protejan al tejido de una oxidación masiva.,

entre ellos la recuperación de los niveles de Glutatión que contribuye a reducir las

ROS (Figura 13). El contenido de Glutatión total, sin embargo, disminuye de igual

manera en animales sometidos a isquemia como en los animales sometidos a la

cirugía de simulación, aunque con mayor velocidad entre la 2da y la 20ma hora en

los primeros (Figuras 13 y 14) lo que indica una tasa de consumo mas alta. Un

indicador más sensible del estado de estrés oxidativo a través de éste parámetro

podría ser la relación Glutatión oxidado/Glutatión reducido. Inicialmente se intentó

esta medición con un método fluorimétrico que utiliza OPT y NEM 115, pero sin

resultados satisfactorios, por lo que actualmente se explora un ensayo más

sensible que pueda ser utilizado en el futuro.

Aunque el contenido de Glutatión total no haya mostrado diferencias entre

ambos grupos, al calcular un índice asociado al EO, que corresponde a la razón

entre los contenidos de derivados carbonilos de proteínas y de GSH en el hígado,

se encuentra un aumento en dicho índice en el grupo de animales sometidos a

isquemia a las 20 horas de reperfusión, con respecto a los controles (Figura 15).

Este efecto es esperable, ya que si aumenta el indicador de la condición

prooxidante (oxidación de proteínas) y disminuye el indicador de los mecanismos

de defensa antioxidante (Glutatión total) se produce una condición de EO

hepático, y además es un índice de estrés oxidativo tisular ampliamente utilizado

en investigación.

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


81

5.1.3.- Activación del factor de transcripción NF-κB en isquemia-reperfusión

Al evaluar el efecto de una hora de isquemia sobre la actividad de unión a

ADN del factor transcripcional NF-κB, como mecanismo involucrado en la

generación del daño por IR, se observó un aumento moderado en relación a un

control positivo (LPS) en la actividad de unión de NF-κB a la secuencia de

consenso desde la 2da a la 6ta horas de reperfusión y un segundo aumento más

prolongado y mayor que el que se alcanza con LPS desde la 18va hora hasta las

72 horas de reperfusión (Figura 16).

Como se mencionó previamente NF-κB es un factor de transcripción clave

en la modulación de la respuesta inflamatoria. En la Tabla 5 se exponen algunos

estímulos que son capaces de activar NF-κB, así como algunas de las proteínas

cuyos genes son controlados por este factor de transcripción 116.

Estímulos que activan NF-κB Proteínas reguladas por NF-κB

Citoquinas: TNF-α, IL-1β, IL-17 Activadores de PKC: ésteres de forbol,

PAF ROS: H2O2, ozono Virus: rinovirus, EBV, CMV, adenovirus,

virus influenza Estimulos inmunes: fitohemaglutinina, Ac

anti CD3, antígenos Otros : LPS, RUV

Citoquinas: TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-6, GM-CSF, M-CSF, G-CSF

Quimioquinas: IL-8, MIP-1α, MCP-1, Gro α, β y γ, eotaxina.

Enzimas: iNOS, COX-2, LP-5, PLA2 Moléculas de adhesión: ICAM-1, VCAM-1,

E-selectina Receptores: IL-2 (cadena α), TCR

(cadena β) IκBα, bcl-2, bcl-X

Tabla 5: estímulos y respuestas a NF-κB

En IR, como se dijo, se ha encontrado que NF-κB exhibe un perfil de

activación bifásico, lo que concuerda con los resultados expuestos. Las maniobras

tendientes a disminuir el nivel de activación de NF-κB con el uso de IL-10 117,

Sulfasalazina 118, pirrolidin-ditiocarbamato 118 o sobre-expresión de IκBα 119 han

resultado exitosas en disminuir la activación de NF-κB inducida por IR, el daño

hepático, la infiltración de neutrófilos y los niveles de TNF-α , CXC e ICAM-1.

Los estímulos capaces de activar NF-κB que se generan durante la IR

incluyen ROS y TNF-α, mientras que la curva bifásica puede deberse a control de

la síntesis de su propio inhibidor (IκBα) y síntesis de proteínas antioxidantes que

V.- DISCUSIÓN

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82

contribuirían a disminuir los ROS haciendo que la primera fase de la activación

sea relativamente breve y autolimitada. El proceso de daño por IR, sin embargo,

se amplifica con la llegada de PMN y nueva producción de ROS y citoquinas

proinflamatorias lo que causaría el segundo aumento de la activación de NF-κB.

5.2.- Maniobra de preacondicionamiento isquémico y segunda ventana de protección del PI.

En el PI clásico, la maniobra preacondicionante precede inmediatamente a

la isquemia prolongada y resulta en protección. El uso de diversos agonistas como

adenosina, bradiquinina, opioides y catecolaminas gatillan el mismo efecto a

través de la unión a receptores de membrana acoplados a proteína G 75. En 1993

se describió la existencia de una ventana de protección que se desarrollaba 12 a

24 horas después del estímulo preacondicionante inicial: la segunda ventana de

protección (SVP) 120.

A diferencia del preacondicionamiento temprano que es de corta duración,

extendiéndose solamente por alrededor de 2-3 horas, la SVP se desarrolla en

forma más tardía pero protege alrededor de 48-96 horas, aunque la magnitud de la

protección sería menor y los mecanismos involucrados diferentes 121 (Figura 3)

Esta segunda fase del PI no se había descrito hasta ahora en el hígado y en los

primeros intentos se buscó esta ventana en un marco temporal similar al que se

había descrito para el corazón, sin embargo a las 15, 20 o 24 horas después del

estímulo preacondicionante no se encontró protección (Figura 17), y

probablemente la isquemia prolongada en este caso se estaba realizando en el

período en el cual el efecto protector temprano se agotó y el fenotipo descrito

como tolerante a la isquemia que caracteriza a la fase tardía del PI aún no se

desarrolla (caída antes de la meseta correspondiente a la SVP en Figura 3). Al

analizar la actividad de transaminasas séricas de los animales sometidos a 10

minutos de isquemia, lo que se definió como la maniobra preacondicionante, se

V.- DISCUSIÓN

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83

encontró que había un alza leve y temprana, lo que se recuperaba después de las

48 horas y que la MPI provocaba estrés oxidativo tisular leve alrededor de la 6ta

hora después de la maniobra. La isquemia prolongada, entonces, debió realizarse

al menos 48 horas después de la maniobra preacondicionante. Se eligió 72 horas

inicialmente, para que la realización de la isquemia prolongada coincidiera con el

desarrollo pleno de la protección durante la SVP y esto arrojó resultados

satisfactorios, es términos de disminución de parámetros de daño hepático.

Es posible inducir la SVP en el hígado, la se desarrolla en forma más tardía

al compararlo con el corazón, no alrededor de 12-24 horas, sino que al menos 48

horas después del estímulo preacondicionante. Este fenómeno no ocurre

solamente con el PI, en el caso del preacondicionamiento farmacológico

recientemente se reportó que una dosis de T3 administrada 48 horas antes de un

período de isquemia de 60 minutos en la rata resulta en hepatoprotección

confirmado la existencia de la SVP en el hígado, que sería inducible a través de

isquemia o fármacos 122.

Entre los factores que pueden influenciar el marco temporal en el que se

encuentra la SVP en los distintos órganos está la cantidad de ROS que es capaz

de generar un estímulo dado, lo que va en relación a la tasa metabólica y

defensas antioxidantes presentes en un tejido, (cantidad de mitocondrias vs

contenido de Glutatión total, por ejemplo, en este caso) y la irrigación colateral que

hace que la reperfusión ocurra de forma más o menos completa 16, 123.

5.3.- Daño y estrés oxidativo en el preacondicionamiento isquémico tardío

Al realizar la isquemia prolongada alrededor de 72 horas después de la

maniobra preacondicionante, entonces, se obtiene una disminución en los

parámetros de daño hepático AST, ALT y LDH. Como un parámetro de daño

adicional, se obtuvieron muestras y placas para el análisis histológico cuyo

resultado está pendiente al momento de escribir esta tesis. El resultado de la

maniobra se evaluó durante la reperfusión temprana (a las 3 horas de reperfusión)

y tardía (a las 20 horas de reperfusión) lo que da cuenta de la influencia de la

V.- DISCUSIÓN

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84

maniobra protectora en ambas fases del daño por IR. La disminución de

transaminasas que se logra es mayor en este último punto, en relación al alza

obtenida en el mismo punto (Figuras 20 y 21).

El nivel de estrés oxidativo tisular se evaluó a las 20 horas de reperfusión,

ya que de acuerdo a los resultados obtenidos con el modelo de daño este fue el

único punto en el que se pudo objetivar un aumento de los parámetros de estrés

oxidativo tisular. Al realizar PI el nivel de oxidación de las proteínas disminuye,

retornando a los niveles basales y también se recupera el contenido de Glutatión

total, disminuyendo con ambos el índice de estrés oxidativo (Figuras 23, 24 y 25).

Ambos hallazgos coinciden con lo reportado con la MPI aplicada dentro del

contexto de la primera ventana de protección, o preacondicionamiento temprano 10, 13, 16.

5.4.- Maniobra preacondicionante y estrés oxidativo subletal

Las especies reactivas del oxígeno participan en ambas fases del daño por

IR, y por lo tanto, una de las primeras estrategias terapéuticas fue el uso de

antioxidantes. α-tocoferol 30 y alopurinol 11 y atrapadores de ROS como las SOD 31y CAT 31, atenúan el daño secundario a IR. Algunas de las soluciones de

preservación que se utilizan en el trasplante de órganos, como la solución de

Wisconsin (Tabla 3) también contienen agentes antioxidantes que previenen el

daño por preservación o isquemia fría.

El Glutatión es el tiol de bajo peso molecular más abundante de las células

animales y participa de manera central en las defensas antioxidantes del

organismo contra ROS. La biodisponibilidad de cisteína es el factor limitante en la

síntesis de Glutatión y n-acetilcisteína (NAC) es un precursor efectivo, es decir, la

mayoría de los efectos antioxidantes de NAC estarían mediados por la síntesis de

GSH 124 NAC también es capaz de atrapar ROS directamente y se ha postulado

que también podría inhibir la activación de los neutrófilos, y participar como

agente vasodilatador, disminuyendo el número de sinusoides 124.

V.- DISCUSIÓN

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85

En clínica, NAC se utiliza en las intoxicaciones agudas por paracetamol y

otras drogas, ya que la mayoría de las drogas se detoxifican a través de su

conjugación con Glutatión. Experimentalmente se ha utilizado para atenuar el

daño por IR en distintos modelos. En un modelo de IR hepática y shock por

hipovolemia la administración de NAC 150 mg/kg en dos dosis antes del inicio de

la isquemia y de la reperfusión respectivamente, disminuyó significativamente la

actividad sérica de ALT, AST y LDH después de 1 hora de reperfusión 125.

Similares resultados se obtuvieron con una infusión continua de NAC de 10

mg/Kg/h después de 7 horas de reperfusión. En este trabajo se comunica que

NAC mantiene la frecuencia cardiaca cercana al basal, disminuye la actividad de

ALT, aumenta la microcirculación y la oxigenación tisular (medidas por

espectroscopia infrarroja) y mejora el aclarado de indocianina verde 126. Otros

grupos han reportado que NAC disminuye efectivamente el daño por IR

disminuyendo la actividad y expresión de metaloproteinasas 127, disminuyendo la

agregación de plaquetas y aumentando los niveles de cAMP en tejido isquémico 128 o inhibiendo el aumento de VCAM e ICAM circulantes después de la

reperfusión en receptores de OLT 129; sin embargo, algunos grupos también han

reportado la ausencia de efectos positivos al pretratar con NAC, aunque se ha

discutido que el uso de la vía im afectaría la disponibilidad de NAC para el uso

tisular.

En el mecanismo de daño por IR las especies reactivas del oxígeno

participarían iniciando y amplificando el daño, por lo cual una de las primeras

estrategias utilizadas fue el tratamiento con antioxidantes. Las ROS, sin embargo,

al estar presentes en baja cantidad podrían gatillar señales de sobrevivencia

celular y este concepto se planteó y se probo para la ventana temprana del PI

aplicado previo a preservación fría e isquemia caliente: en el primer modelo de PI

temprano se aplicó un período de 10 minutos de isquemia seguidos de 15 minutos

de reperfusión, previo a la preservación fría del hígado en la solución de

Wisconsin por 30 horas. El pretratamiento con NAC revirtió los efectos benéficos

del PI que se habían objetivado en términos de atenuación del daño hepático y

V.- DISCUSIÓN

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86

disminución de signos sugerentes de apoptosis 129. En el modelo de IR caliente

se utilizó un período de 75 minutos de isquemia en ratón, precedido de PI de

10/15 minutos y se pretrató a los animales con una dosis única de NAC de 100

mg/kg ip 3 horas antes del PI, evaluándose el daño a la 3ra hora de reperfusión. Se

encontró que el PI disminuía el daño generado por IR y que nuevamente NAC

abolía este efecto, adicionalmente en este mismo trabajo el uso de hidroperóxido

de tert-butilo 15 minutos antes de la isquemia letal simula el efecto del PI, mientras

que el tratamiento con NAC antes del hidroperóxido impide la hepatoprotección 93.

En los modelos descritos en el párrafo anterior, no se informa de los niveles

de NAC previo al inicio de la IR y el pretratamiento se realiza 3 horas antes del

inicio de la isquemia correspondiente a la maniobra o a la isquemia prolongada,

considerando que la vida media de NAC es de alrededor de 2,5 horas 130, se

descarta que el efecto protector sobre la IR se deba a NAC y no a la maniobra de

PI a través de los controles quienes recibieron el vehículo de NAC y resultaron

igualmente beneficiados de la maniobra de PI, sin embargo no se sugiere una

explicación para este fenómeno, aunque el uso del hidroperóxido de tert-butilo

simula el PI y su efecto es abolido por NAC. Es posible que la protección de NAC

sea dosis dependiente y que con dosis pequeñas el efecto antioxidante sea

consumido por las ROS generadas durante los 10 minutos de isquemia.

En nuestro estudio el pretratamiento con NAC se realizó con una dosis de

500 mg/kg peso corporal 1 hora antes de la maniobra preacondicionante, es decir,

73 horas antes de la isquemia prolongada. El pretratamiento con NAC no impide

el efecto hepatoprotector del PI durante la segunda ventana de protección.

Rüdiger y cols 75 establecieron en su trabajo que el PI temprano

dependería de las ROS generadas durante la MPI, pero no se evaluó la SVP de

esa maniobra. En nuestro trabajo sólo se evaluó la SVP, por lo tanto no se

establece si se reproduciría un resultado como el comunicado por estos autores al

evaluar el PI temprano. No obstante, con estos antecedentes y los resultados

expuestos en esta tesis, NAC bloquea el efecto protector del

preacondicionamiento isquémico temprano, pero no modifica el

preacondicionamiento isquémico tardío, lo que sugiere que la etapa temprana del

V.- DISCUSIÓN

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87

PI estaría mediada por las ROS generadas durante la isquemia breve mientras

que el desarrollo de la SVP dependería de la generación de otro u otros

mediadores.

En el hígado no hay a la fecha disponibles en la literatura otros trabajos

relacionados con la SVP ni con el estrés oxidativo subletal como mecanismo que

medie el efecto protector del PI, pero en el miocardio el uso de un antioxidante

como melatonina 131 o atrapadores de especies reactivas del oxígeno como SOD o

CAT 132 no limitan el efecto protector del PI (cuando la isquemia prolongada

sucede inmediatamente a la MPI). El pretratamiento con vitamina E 150 mg/kg

limita el tamaño del infarto en conejos sometidos a isquemia a través de los

canales KATP y cGMP, pero conserva el beneficio del PI 133. Estos hallazgos

establecen que además de las ROS, existen otros gatilladores capaces de

desencadenar el efecto protector del PI.

El miocardio es uno de los órganos donde se ha estudiado más

extensamente la SVP y para organizar los hallazgos de los diversos artículos

dentro de la respuesta fisiológica del órgano al estímulo preacondicionante se ha

dividido a los factores involucrados en: (i) gatilladores, que serían las moléculas de

aparición temprana, que serían las responsables de desencadenar el efecto

protector del estímulo preacondicionante (ROS, .NO, adenosina), (ii) mediadores

de la respuesta, que incluyen las vías de transducción de señales involucradas

(MAPK, JAK, PTKs) y los factores de transcripción que se activan o modifican su

respuesta en presencia del estímulo preacondicionante (NF-κB, STAT), y (iii) los

genes que en respuesta a estos factores de transcripción son responsables de la

aparición de productos (proteínas) que participan como efectores finales (HSPs,

iNOS, SOD) 134.

En este trabajo se determinaron algunos de éstos elementos, los que junto

a la información disponible adaptada de 134 constituyen la Figura 45. En el corazón

se ha planteado que los gatillantes iniciales del PI serían ROS, .NO y adenosina 134. En nuestro trabajo se sugiere que ROS podría descartarse como gatillador

inicial de la respuesta protectora durante la SVP en el hígado. Tanto .NO como

adenosina pueden ser potenciales promotores de esta respuesta.

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


88

Figura 45: Segunda ventana de protección del preacondicionamiento isquémico. Adaptación 134

En nuestros resultados, además, se sugiere que la expresión de iNOS

estaría disminuída en los animales preacondiconados, lo que determinaría un nivel

de .NO más cercano a los niveles basales, donde .NO podría participar como una

molécula señal y no, en exceso, ir a la formación de RNS. Respecto de otros

mediadores iniciales como catecolaminas u opiodes, se sabe que el hígado

expresa receptores para ambos, y que en el caso de los opioides, estos podrían

participar en el desarrollo de fibrosis 162, sin embargo, el parénquima hepático, que

Día 1

Días 2-4

ESTRÉS SUBLETAL Isquemia breve, hipoxia, ejercicio, shock térmico

PC FARMACOLÓGICO Endotoxina, citoquinas, ROS, adenosina,

agonistas de adenosina, agonistas de receptores opioides, alcohol, hormona

tiroídea, agonistas adrenérgicos, donantes de NO Gatilladores de SVP

(NO, ROS, adenosina, opioides,

catecolaminas)

Activación de kinasas (MAPK, Src, PKCε, p38, PTKs,

JAK1/2)

Modificación de la activación de factores de transcripción

(NF-κB, AP-1, STAT, HSF-1)

TRANSCRIPCIÓN GÉNICA

Mediadores de SVP iNOS, COX2, aldosa

reductasa, HO-1, HSPs, MnSOD, canales KATP

PROTECCIÓN

Transducción de señales

Modificaciones post-traduccionales Src, PTKs, MAPKs

Estímulo preacondicionante

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


89

es el tejido predominante, deriva de una capa embriológica diferente de la que

origina el sistema nervioso y las uniones neuromusculares, por lo que es posible

que no participen en forma determinante en la respuesta del tejido hepático al

estrés.

En este trabajo no se realizó estudios de vías de activación que conducen a

la respuesta protectora (Activación de kinasas), lo que ocurriría durante el primer

día post estímulo preacondicionante. La modificación de la activación de factores de transcripción, en este caso, se realizó 75 y 92 horas, es decir alrededor de 3-

4 días post estímulo preacondicionante, estableciéndose que NF-κB aumenta

significativamente su actividad de unión al ADN a las 75 horas post MPI en

animales preacondicionados, y se mantiene en niveles similares a lo encontrado

en IR a las 92 horas post MPI.

NF-κB se ha asociado al daño en IR, especialmente durante la fase

temprana, pero NF-κB también controla genes antiapoptóticos y asociados a la

regeneración celular, lo que podría asociarse al cambio de la cinética de activación

que se vislumbra con el PI 135-137. Se ha comunicado en otros trabajos que el PI se

asocia a activación de NF-κB inmediatamente después de la maniobra

preacondicionante y a las 24 horas de reperfusión, lo que se acompañó de

menores niveles de transaminasas, menor actividad MPO, menor daño histológico

y menor expresión de ICAM-1 y TNF-α 136. Previamente Teoh y colaboradores

también encontraron mayor activación de NF-κB en animales preacondicionados a

los 30 minutos de reperfusión.

AP-1, como otro factor de transcripción que modifica su actividad post MPI,

aumenta en forma importante como respuesta a IR en ambas fases y recupera el

nivel de activación de los controles con el PI durante la reperfusión tardía, aunque

se observa una tendencia a ese comportamiento durante la reperfusión temprana

(Figuras 34 y 35). La activación de AP-1 en respuesta a la IR y su relación con

mayor daño y muerte celular en el hígado se habían comunicado previamente. En

estos trabajos la isquemia intermitente o el uso de citoquinas antiinflamatorias

disminuían la activación de AP-1 y con ello el daño 137, 138. En un modelo de IR en

ratas Wistar se observó que la inhibición de JNK se relaciona con una mejoría en

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


90

los parámetros de daño hepático, disminución de la activación de caspasa-3,

disminución de la liberación de citocromo C y de la lipoperoxidación 139.

La activación del factor de transcripción HSF-1 muestra una tendencia a

disminuir durante la reperfusión temprana en IR y PI, pero en este último grupo se

recupera durante la reperfusión tardía. En el preacondicionamiento farmacológico

del hígado se ha encontrado que HSF-1 se activa en forma temprana, pero su

activación no va acompañada de mayor expresión de HSPs 140. Otros grupos han

reportado que la activación de HSF-1 estaría más bien relacionada con la

isquemia, prolongándose muy brevemente durante la reperfusión 141 y que la

respuesta al shock de calor comparte algunas, pero no todas las características de

la respuesta a IR 142.

Un punto importante que plantea proyección para los resultados

presentados es hacer la determinación de la activación de los factores de

transcripción en forma más temprana post MPI, de manera de estimar las

modificaciones que sufren en el primer día post estímulo preacondicionante.

Dentro de los mediadores o efectores finales potenciales de la SVP en el

hígado que se encontraron dentro de los resultados presentados, y que se

modificarían en respuesta al cambio en la cinética de activación de los factores de

transcripción involucrados en la respuesta protectora incluyen:

Modificación de los niveles de citoquinas séricas: el daño por IR cursa con un

aumento en los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias, tales como TNF-α

e IL-1β 16. Durante la fase temprana la fuente de producción más importante de

estas citoquinas serían las células de Kupffer. La producción temprana de TNF-α

es un evento cardinal, aunque no es el único evento responsable de la

amplificación inflamatoria en el desarrollo del daño por IR. En ratones TNF-α -/-

ambas fases del daño por IR se atenúan y la lesión se reestablece al inyectar

TNF-α 77. Durante el daño por IR también se producen citoquinas

antiinflamatorias, tales como IL-10 e IL-13. Del balance que exista entre los niveles

de estas citoquinas depende, en parte, la extensión del daño tisular. En el PI lo

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


91

lógico sería encontrar una disminución en los mediadores proinflamatorios y un

aumento en los mediadores antiinflamatorios, lo que daría cuenta de menor

cantidad de quimioquinas, menor exposición de moléculas de adhesión, menor

infiltración de PMN y consecuentemente menor daño tisular.

En los resultados expuestos TNF-α aumenta en forma significativa en el

daño por IR al evaluarlo durante la reperfusión temprana (triplica el valor

encontrado en los animales Sham) y tardía (duplica el valor de Sham) y disminuye

recuperando los niveles basales en los animales preacondicionados en ambos

tiempos de reperfusión evaluados (Figura 30). TNF-α es una citoquina pleiotrópica

que produce varias respuestas relacionadas con inflamación y respuesta

inmunológica.

TNF-α media el reclutamiento de neutrófilos a través de quimiotaxis, induce

fagocitosis, adherencia al endotelio, generación de ROS, mayor expresión de

moléculas de adhesión en el endotelio, síntesis de otras citoquinas y quimioquinas

proinflamatorias y tiene en su gen sitios de unión para NF-κB, CRE, ATF-2 y AP-1

entre otros factores de transcripción que controlan su síntesis 143. El PI temprano,

sin embargo, es dependiente de la presencia de TNF-α y en ratones TNF-α -/- no

es posible realizarlo 77.

El rol dual de TNF-α puede ser ejercido a través de la acción predominante

sobre TNFR1 o TNFR2 de acuerdo la cantidad de citoquina presente en el medio y

la presencia de otras moléculas mediadoras o efectoras de la respuesta IR.

TNFR1 sería el receptor que mediaría la mayoría de las acciones relacionadas con

inflamación y muerte celular en IR 146. TNF-α se une rápidamente y de forma más

estable a TNFR1 que a TNFR2, que además es activado en forma más eficiente

por la forma de TNF-α unida a membrana que por la forma soluble. La afinidad se

ha estudiado in vitro con resultados disímiles que además pueden estar sesgados

por el hecho de que la gran mayoría de los investigadores han utilizado la forma

soluble de TNF-α 145. La función de TNFR2 en la respuesta fisiológica aún no está

clara, pero se ha reportado que en algunas líneas celulares tiene un rol

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


92

predominantemente proliferativo y de modulación de la apoptosis inducida por

TNF-α 145.

Los niveles de IL-6 (Figura 31) aumentan tanto en IR como en PI,

alcanzando niveles más altos en la reperfusión temprana en este último grupo y

exhibiendo niveles similares en ambos grupos durante la reperfusión tardía. El gen

de IL-6 tiene elementos de respuesta para AP-1, glucocorticoides, SER y NF-κB,

además responde a factores peptídicos como TNF-α e IL-2 y a agentes que

aumentan los niveles de AMPc. Su principal fuente son los macrófagos y sus

acciones incluyen, además de su rol en la producción de inmunoglobulinas y

proliferación de linfocitos y timocitos, la capacidad de inducir una amplia variedad

de proteínas tales como fibrinógeno, haptoglobina, α1-antitripsina, proteína C

reactiva y proteína amiloide sérica A que participan en la respuesta de fase aguda 146.

TNF-α e IL-6 son componentes importantes de las vías de señalización que

llevan a la regeneración hepática. Tempranamente TNF-α induce la producción de

IL-6 y la activación los factores de transcripción NF-κB, STAT3 AP-1 y C/EBP 5.

En el caso del PI tardío el TNF-α generado durante la maniobra preacondicionante

podría cumplir con este rol. El potencial terapéutico de IL-6 ya ha sido utilizado en

algunos modelos 147 y además de participar en la respuesta de fase aguda, se ha

comunicado que solamente las dosis más altas de IL-6 (500 μg/kg) previenen

efectivamente la necrosis por IR y que este efecto estaría mediado, al menos en

parte, por la activación de STAT3, la inducción de la síntesis de HSP70 y la

disminución del stress del retículo. Este nuevo elemento se ha relacionado

recientemente con el daño mediado por IR 148 y tiene relación con la cantidad de

proteínas no plegadas que aparecen como respuesta al stress en células

secretoras, como el hepatocito 149.

IL-1β no se modifica durante la reperfusión temprana con IR ni PI vs los

controles, lo que sugiere que su contribución como citoquina proinflamatoria es

más importante durante la reperfusión tardía (Figura 32). A las 20 horas de

reperfusión esta citoquina se encuentra elevada en los animales sometidos a IR y

V.- DISCUSIÓN

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93

disminuye con el PI, lo que sumado al efecto del PI sobre los niveles de TNF-α

sugiere que uno de los mecanismos de hepatoprotección mediados por el PI tardío

es la disminución de citoquinas proinflamatorias.

Así como disminuyen los niveles de citoquinas proinflamatorias, se

esperaba que durante la SVP el PI provocara un aumento de citoquinas

antiinflamatorias. Otros autores han comunicado que la disminución de IL-1β que

se observa en el PI temprano estaría mediado por un aumento de IL-10 150.

En nuestros resultados los niveles de IL-10 se encuentran más elevados en

los animales sometidos a IR sin PI durante la reperfusión temprana (Figura 33).

Los niveles encontrados en los animales sometidos a PI son menores, mientras

que los niveles de los animales controles son indetectables con el ensayo.

No es posible descartar el rol antiinflamatorio de IL-10 como un factor

contribuyente al efecto hepatoprotector durante la SVP, y puede ser que los

cambios de observen más temprano post MPI.

Modificación de la respuesta de fase aguda: fibrinógeno es una de las

proteínas de fase aguda, participa en la coagulación, trombosis y probablemente

esta involucrado en el desarrollo de estenosis posquirúrgicas, siendo un factor

clave en los procesos en los cuales ocurre la formación de trombos o coágulos

asociados al endotelio 151. La falla microvascular y el fenómeno de no-reflow han

sido señalados como uno de los mecanismos centrales en el daño por IR 15. El PI

provoca una caída en el nivel de fibrinógeno hepático durante la reperfusión tardía

(Figura 39). El uso de estrategias que modifican la fibrinolisis, como heparina de

bajo peso molecular 152 o antitrombina 153 atenúan el daño por IR.

El fibrinógeno se secreta como un dímero cuyas subunidades estas

compuestas por tres polipéptidos codificados en distintos grupos de genes que

contienen elementos de respuesta para IL-6, pero que además contienen

elementos de respuesta para otros factores como el Retinoic Acid Receptor

(RXR), el Retinoid Acid Receptor-Related Orphan Receptor α (RORα) y el

receptor farnesoide 154, 155. La etapa limitante en la síntesis de fibrinógeno sería la

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


94

formación del complejo, para lo cual los tres péptidos que forman cada subunidad

deben ser sintetizados en cantidades equivalentes. Aunque en nuestro modelo se

haya encontrado una elevación en los niveles de IL-6 esto por sí solo no es

suficiente para controlar la síntesis coordinada del complejo fibrinógeno, lo que

puede explicar que los niveles de fibrinógeno se encuentren disminuidos.

Dentro de las proteínas de respuesta a shock térmico (heat shock proteins,

HSPs) se evaluó HSP32 que corresponde a la enzima HO-1 y HSP70. HO-1 es

una enzima de estrés que tiene en su ADN sitios unión para AP-1, NF-κB y

elementos de respuesta para hipoxia e IL-6, entre otros 156. En el PI temprano HO-

1 participa como efector en la hepatoprotección que se logra, lo que se ha

observado en hígados normales y esteatósicos durante la reperfusión temprana (6

horas) pero predominantemente en la reperfusión tardía (20 horas). El tratamiento

con geranilgeranilacetona (GGA) actúa como inductor de HO-1 y produce un

efecto comparable al del PI. Tanto GGA como PI lograrían este efecto a través de

la activación de PKC. La inducción de HO-1 en este modelo, especialmente en los

hígados esteatósicos en los que la inducción es mayor, es esencial para lograr la

protección ya que el uso de inhibidores de HO-1 previo al PI revierte el efecto

protector de éste 157.

En nuestro modelo los niveles de HO-1 no mostraron cambios entre los

diversos grupos en el tiempo de reperfusión evaluado, lo que no descarta la

participación de esta enzima, lo cual podría ser observable en otros tiempos de

reperfusión. La activación de HO-1 con cobalto protoporfirina (Co-PP) también

resulta en hepatoprotección, una de las vías que podría estar involucrada en la

activación de HO-1 en el PI es la vía de Toll like receptor 4 (TLR4), el que

recientemente se ha relacionado como uno de los receptores que se activarían

tempranamente en el daño por IR. La administración de Co-PP suprime la vía de

TLR4 mediada por INF-γ, lo que se acompaña de menor daño hepatocelular,

menores niveles séricos de citoquinas proinflamatorias y activación de HO-1 158.

V.- DISCUSIÓN

_____________________________________________________________________________________________


95

HSP70 por su parte aumenta en IR y recupera su nivel basal con el PI. Esta

proteína también tendría un rol dual, ya que se ha comunicado que aumenta en

respuesta a IR 159, pero su inducción disminuye el daño hepático 160 o facilita la

recuperación posquirúrgica 161. La función de HSP70 sería participar como

chaperona en el plegamiento de proteínas, sin embargo el mecanismo involucrado

en la respuesta a IR no está claro. Es posible que la respuesta mediada por

HSP70 sea más importante bajo ciertas condiciones, distintas de las que se

presentan en este modelo. En el modelo de Kuboki 160, por ejemplo, se utilizan 90

minutos de isquemia en ratón y animales HSP70-/- para elucidar su rol, mientras

que Massip-Salcedo y cols 157 comunican que el aumento de HSP70 relacionado

con la protección sería muy temprano y mas importante en animales con hígado

graso.

La expresión de iNOS muestra una tendencia al aumento en IR y a la

disminución en PI (Figura 39). Si bien .NO es un vasodilatador y podría mejorar la

perfusión postisquemia, un exceso de .NO, como el que produce iNOS que no

tiene regulación alostérica puede llevar al daño hepático y a la producción de

peroxinitrito 48. La generación de .NO que actuaría como citoprotector en el PI

temprano estaría determinada por un aumento en la expresión de eNOS 162 por lo

que los resultados presentados podrían complementarse con la determinación de

la actividad NOS y los niveles de eNOS, adicionalmente la utilización de

antagonistas de eNOS podría orientar el trabajo en términos de determinar si el .NO originado por esta enzima podría participar como un gatillador en la SVP

hepática.

Siguiendo con esta línea, la determinación directa de ROS generados en la

MPI y su eliminación por NAC confirmarían lo que aquí se sugiere: que las ROS

no participan como un gatillador importante para la inducción de la SVP. El uso de

otro tipo de antioxidantes o atrapadores, que eliminen ROS en otro

compartimento celular o a través de otro mecanismo, apoyaría los resultados

obtenidos en este trabajo.

VI.- CONCLUSIONES

_____________________________________________________________________________________________


96

VI.- CONCLUSIONES

1. El modelo de daño por IR con 60 minutos de isquemia presenta dos fases,

una fase temprana entre la 1 y 6ta y una fase tardía alrededor de las 18va-

20ma horas de reperfusión. La elevación de los distintos parámetros de daño

hepático coinciden temporalmente en estas fases (AST, ALT y LDH) y

concuerdan con el daño histopatológico.

2. El factor de transcripción NF-κB tiene un comportamiento bifásico durante

el período post-reperfusión de 0 a 72 horas que sigue a 60 minutos de

isquemia.

3. Diez minutos de isquemia constituyen una maniobra preacondicionante

efectiva al mediar una ventana de 72 horas entre dicha maniobra y la

isquemia prolongada. El marco temporal en el que es posible encontrar la

SVP en el hígado difiere del marco temporal descrito para el corazón.

4. Es posible inducir la SVP a través de PI en el hígado y en los animales

sometidos a PI previo a la isquemia prolongada se encontró: (i) una

disminución en el daño hepático estimado a través de la actividad de AST,

ALT y LDH, y (ii) una disminución en el estrés oxidativo tisular estimado a

través del contenido de Glutatión total, nivel de oxidación de proteínas e

índice de estrés oxidativo.

VI.- CONCLUSIONES

_____________________________________________________________________________________________


97

5. El PI tardío no esta mediado por las especies reactivas del oxígeno que se

generan durante la maniobra preacondicionante y la SVP dependería de un

gatillador diferente de ROS.

6. El PI tardío ejerce su efecto hepatoprotector a través de: (i) la disminución

de los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias (TNF-α e IL-1β), (ii) el

aumento de los niveles séricos de IL-6 durante la reperfusión temprana, (iii)

la activación temprana de NF-κB, (iv) la disminución de la activación de

AP-1 y (v) la recuperación de la activación de HSF-1 durante la reperfusión

tardía.

7. Algunas respuestas hepatoprotectoras que gatilla el PI dependientes de

estos factores de transcripción incluyen: (i) el aumento de los niveles de

haptoglobina, (ii) la disminución en los niveles de fibrinógeno, (iii) la

disminución en los niveles HSP70 y (iv) la disminución de los niveles de

mRNA de iNOS.

8. Los niveles de HO-1 no se modifican con el PI durante la reperfusión tardía.

VII.- PROYECCIONES

_____________________________________________________________________________________________


98

VII.- PROYECCIONES

________________________________________________________

Este trabajo comprueba la existencia de la segunda ventana de protección

del preacondicionamiento isquémico en el hígado, lo que conceptualmente

significa la posibilidad de trabajar con intervenciones realizadas varias horas antes

de llevarse a cabo la isquemia prolongada. La existencia de este marco

temporal posibilita el ensayo de otras maniobras preacondicionantes distintas de la

isquemia tales como la hipoxia, el shock térmico, la hipotermia y drogas

hepatotóxicas en dosis pequeñas. El modelo desarrollado para este estudio se

presenta como reproducible y confiable; y se comporta de acuerdo a lo descrito

por varios grupos en la literatura, lo que permitirá experimentar con las

intervenciones previamente mencionadas .

El uso del PI, pese a los resultados promisorios que ha arrojado en diversos

estudios experimentales, no ha logrado posicionarse como una técnica atractiva

para el uso clínico. Algunas de las razones que se sugieren para explicar la

escasa proyección clínica del PI en el hígado, considerando el alto impacto que

ha tenido la técnica en el estudio del infarto miocárdico, pueden ser que: (i) la

prevalencia de la patología asociada a IR hepática es menor vs la patología

cardiaca que cursa con IR, (ii) no existe un parámetro único de laboratorio para

estimar el pronóstico del órgano o el injerto en respuesta a la maniobra (como lo

es el tamaño del infarto en el corazón) y (iii) la realización del PI mecánico en el

hígado no está exento de riesgo pues el clampeo repetido de la tríada portal se

VII.- PROYECCIONES

_____________________________________________________________________________________________


99

asocia a mayor incidencia de hemorragia y necesidad de transfusiones 75, el

estudio del PI, por lo tanto, debe estar enfocado no a su utilización clínica en

forma directa, sino a la identificación de los mecanismos subyacentes

responsables de la protección que puedan ser simulados a través de tratamiento

con fármacos, anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, transferencia de genes

hepatoprotectores u hormonas.

A futuro, es necesaria la incorporación de un parámetro funcional, como la

excreción de bilirrubina, la síntesis de albúmina o la depuración de colorantes

pueden contribuir a establecer una relación morfológica-funcional en los modelos

de IR que permita establecer con un examen de sangre periférica, el pronóstico

del paciente o del injerto en clínica.

La ausencia de resultados satisfactorios que han comunicado algunos

grupos con el uso del PI 82 puede relacionarse con la complejidad de la maniobra

en términos técnicos y mecanísticos, y la aparentemente limitada ventana de

tiempo que provee para realizar la intervención temprana. La SVP, en ese sentido,

aparece como una alternativa más flexible en la que la simulación de la maniobra

de PI se puede gatillar a nivel de promotor, estimulación de vías de transducción

de señales o efector final.

A nivel de efectores finales, las citoquinas pro y anti-inflamatorias (o sus

antagonistas y agonistas) tienen potencial clínico ya que la disponibilidad de

citoquinas recombinantes humanas, pese a su elevado costo, posibilita su uso en

pacientes. Para la utilización clínica de las citoquinas en este contexto, sería

importante contar con curvas cinéticas completas que permitan estimar el

comportamiento global en la respuesta fisiológica, más allá de estimaciones

puntuales, lo que permitiría elegir el momento y dosis adecuadas para el

tratamiento.

Así como se determinó la cinética de activación de NF-κB post-reperfusión,

la realización de curvas similares para los otros factores de transcripción incluidos

VII.- PROYECCIONES

_____________________________________________________________________________________________


100

(AP-1, HSF-1) o no en este estudio (HIF-1, STAT3) permitirá estimar con mayor

certeza los cambios que se produzcan con las maniobras protectoras y de esa

manera acercarse a una interpretación de los resultados mas cercana al fenómeno

biológico.

En este estudio se han descrito algunos de los eventos asociados a la

respuesta mediada por PI en la SVP, como disminución de citoquinas

proinflamatorias, disminución de algunas proteínas relacionadas con la respuesta

de fase aguda y activación de NF-κB. Si las vías de transducción de señales que

median estos eventos son similares a las descritas para el PI temprano: p38

MAPK, Akt, ERK; y si hay vías y efectores adicionales que participen en la

respuesta mediada por SVP es un asunto que queda por explicar.

Tanto la IR como el PI son fenómenos complejos regulados a múltiples

niveles y que dependen no sólo de la cantidad y variedad de factores y vías

involucrados, sino que también de la temporalidad de los eventos. La regulación

cruzada y la participación de otros elementos no abordados en el presente

estudio, como el Ca++ , la mitocondria y los canales dependientes de ATP podrán

contribuir a completar el cuadro de manera de permitir intervenciones innovadoras,

pero a la vez efectivas, reproducibles y seguras. Es nuestra opinión que el futuro

del preacondicionamiento hepático está en el preacondiconamiento farmacológico,

ya sea incorporado como elemento adicional en la dieta, pretratamiento hormonal 139, farmacológico o génico (en el caso de pacientes) o como componente de

soluciones de preservación, en el caso de los injertos.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


101

VIII.- REFERENCIAS

________________________________________________________________________

1. Videla LA, Fernández V, Carrión Y, Azzalis LA, Bainy ACD & Junqueira VBC.

Biochemical mechanism in hepatotoxicity: oxidative stress induced by xenobiotics

and hormonal changes. J Braz Assoc Adv Sci, 47: 385-394, 1995.

2. Videla LA. Energy metabolism, thyroid calorigenesis, and oxidative stress:

functional and cytotoxic consequences. Redox Report, 5: 265-275, 2000.

3. Comporti M. Three models of free radical-induced cell injury. Chem-Biol

Interactions, 72: 1-56, 1987.

4. Ishikawa T, Akerboom TPM & Sies H. Role of key defense systems in target organ

toxicity. Target Organ Toxicity (Cohen GM, ed) CRC Press: Boca Ratón 1: 129-

143, 1986.

5. Winwood PJ & Arthur MJP. Kupffer cells and endothelial cells. Liver Growth and

Repair (Strain A. & Diehl AM, eds), Chapman & Hall: London, pp: 482-511, 1998.

6. Sies H. Biochemistry of oxidative stress. Angew Chem Int Ed Engl, 25: 1058-1071,

1986.

7. Camandola S, Aragno M, Cutrín JC, Tamango E, Danni O & Chiarpotto E. et al.

Liver AP-1 activation due to carbon tetrachloride is potentiated by 1,2-

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


102

dibromoethane but is inhibited by α-tocopherol or gadolinium chloride. Free Radic

Biol Med, 26: 1108-1116, 1999.

8. Arumugam TV, Shiels IA, Woodruff TM, Granger DN, Taylor SM. The role of the

complement system in ischemia-reperfusion injury. Shock, 21:401-409, 2004.

9. Sen CK. & Packer L. Antioxidant and redox regulation of gene transcription.

FASEB J, 10: 709-720, 1996.

10. Teoh N, Dela Pena A & Farell G. Hepatic ischemic preconditioning in mice is

associated with activation of NF-κB, p38 kinase, and cell cycle entry. Hepatology,

36: 94-102, 2002.

11. Nordström G, Seeman T & Hasselgren P. Beneficial effect of allopurinol in liver

ischemia. Surgery, 97: 679-683, 1985.

12. Serracino-Inglott F, Habib NA & Mathie RT. Hepatic ischemia-reperfusion injury.

Am J Surg 181: 160-166, 2001

13. Banga NR, Homer-Vanniasinkam S, Graham A, Al-Mukhtar A, White SA, Prasad

KR. Ischaemic preconditioning in transplantation and major resection of the liver.

Br J Surg. May, 92::528-538 2005.

14. Collard CD, Lekowski R, Jordan JE, Agah A & Stahl GL. Complement activation

following oxidative stress. Mol Immunol, 36: 941-948, 1999.

15. Jaeschke H. Molecular mechanism of hepatic ischemia-reperfusion injury and

preconditioning. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 284: G15-G26, 2003.

16. Cutrín JC, Perrelli MG, Cavalieri B, Peralta C, Roselló Catafau J & Poli G

Microvascular disfunction induced by reperfusion injury and protective effect of

ischemic preconditioning. Free Radic Biol Med, 33: 1200-1208, 2002.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


103

17. Jaeschke H, Farhood A & Smith W. Neutrophils contribute to ischemia/reperfusion

injury in rat liver in vivo. FASEB J, 4: 3355-3359, 1990.

18. Lichtman SN, Lemasters JJ. Role of cytokines and cytokine-producing cells in

reperfusion injury to the liver. Semin Liver Dis, 19:171-187 1999.

19. Nauta RJ, Tsimoyiannis E, Uribe M, Walsh DB, Miller D, Butterfield A. The role of

calcium ions and calcium channel entry blockers in experimental ischemia-

reperfusion-induced liver injury. Ann Surg, 213: 137-142, 1991.

20. Strubelt O & Younes M. The involvement of extracellular calcium in hypoxic injury

to the isolated rat liver. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 61: 327-222, 1988.

21. Ar'Rajab A, Ahren B, Bengmark S. Improved liver preservation for transplantation

due to calcium channel blockade. Transplantation, 51: 965-967, 1991.

22. De-Broin E, Urata K, Giroux L, Lepage R, Huet P-M. Effect of calcium antagonists

on rat liver during extended cold preservation-reperfusion. Transplantation, 63:

1547-1554, 1997.

23. Mc Cord JM. Oxigen-derived free radicals in postischemic tissue injury. New Engl

J Med, 312: 159-163, 1985.

24. Cheung JY, Bonventre JV, Malis CD & Leaf A. Calcium and ischemic injury. New

Engl J Med, 314: 1670-1676, 1986.

25. Videla LA, Fernández V. Biochemical aspects of cellular oxidative stress. Arch Biol

Med Exp, 21: 85-92. 1988.

26. Clavien PA, Yadav S, Sindram D, Bentley RC. Protective effects of ischemic

preconditioning for liver resection performed under inflow occlusion in humans. Ann

Surg, 232:155-162, 2000.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


104

27. Peralta C., Prats N., Xaus C., Gelpí E. & Roselló-Catafau J. Protective effect of

liver ischemic preconditioning on liver and lung injury induced by hepatic ischemia-

reperfusion in the rat. Hepatology 30: 1481-1489, 1999.

28. Nauta R, Tsimoyiannis E, Uribe M, Walsh D, Miller D & Butterfield A. Oxygen-

derived free radicals in hepatic ischemia and reperfusion injury in the rat. Surg

Gynecol Obst, 171: 120-125, 1990.

29. Battista S, Mengozzi G, Bar F, Cerutti E, Pollet C, Torchio M, Biasi F, Cavalli G,

Salizzoni M, Poli G & Molino G. Nitric oxide level profile in human liver

transplantation. Dig Dis Sci, 47: 528-534, 2002.

30. Marubayashi S, Kiyohiko D, Ochi K & Kawasaki T. Role of free radicals in ischemic

rat liver cell injury: Prevention of damage by α-tocopherol administration. Surgery,

99: 184-191, 1986

31. Younes M & Strubelt O. The involvement of reactive oxygen species in hypoxic

injury to rat liver. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 59: 369-381, 1988.

32. Takei Y, Marzi I, Kauffman FC, Currin RT, Lemasters JJ, Thurman RG. Increase in

survival time of liver transplants by protease inhibitors and a calcium channel

blocker nisoldipine. Transplantation, 50: 14-20, 1990.

33. McCord JM Oxygen-derived radicals: a link between reperfusion injury and

inflammation. Fed Proc, 46: 2402-2406, 1987.

34. Jaeschke H. Xanthine oxidase-induced oxidant stress during hepatic ischemia-

reperfusion: are we coming full circle after 20 years? Hepatology, 36: 761- 763,

2002.

35. Pretto Jr. E. A. Reperfusion injury of the liver. Transpl Proc, 23: 1912-1914, 1991.

36. Lemasters J.J., Ji S. & Thurman R.G. Centrilobular injury following hypoxia in

isolated perfused rat liver. Science 213: 661-663, 1981.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


105

37. Shibuya H., Ohkonchi N., Seya K. & Satomi S. Kupffer cells generate superoxide

anions and modulate reperfusion injury in rat liver alter cold preservation.

Hepatology, 25: 356-360, 1997.

38. Lentsch AB, Kato A, Yoshidome H, McMasters KM & Edwards MJ. Inflammatory

mechanisms and therapeutic strategies for warm ischemia/reperfusion injury.

Hepatology, 32: 169-173, 2000.

39. Cutrín JC, Boveris A., Zingaro B., Corvetti G. & Poli G. In situ determination by

surface chemiluminnescence of temporal relationships between evolving warm

ischemia-reperfusion injury in rat liver and phagocyte activation and recruitment.

Hepatology, 31: 622-632, 2000.

40. Jaeschke H, Farhood A, Bautista AP, Spolarics Z, Spitzer JJ. Complement

activates Kupffer cells and neutrophils during reperfusion after hepatic ischemia.

Am J Physiol, 264:G801-809, 1993

41. Heijnen BH, Straatsburg IH, Padilla ND, Van Mierlo GJ, Hack CE, Van Gulik TM.

Inhibition of classical complement activation attenuates liver ischaemia and

reperfusion injury in a rat model. Clin Exp Immunol, 143:15-23, 2006.

42. Arumugam TV, Woodruff TM, Stocks SZ, Proctor LM, Pollitt S, Shiels IA, Reid RC,

Fairlie DP, Taylor SM. Protective effect of a human C5a receptor antagonist

against hepatic ischaemia-reperfusion injury in rats. J Hepatol, 40:934-941, 2004.

43. Schmidt A, Tomasdottir H, Bengtsson A. Influence of cold ischemia time on

complement activation, neopterin, and cytokine release in liver transplantation.

Transplant Proc, 36:2796-2798, 2004.

44. Knowles RG. Nitric oxide synthases. The Biochemist, 16: 3-6, 1994.

45. Darley-Usmar V. & Radomski M. Free radicals in the vasculature: The good, the

bad and the ugly. The Biochemist, 16: 15-18, 1994.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


106

46. Knowles R.G. & Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J, 298:

249-258, 1994.

47. Bogdan C. Nitric oxide and the regulation of gene expression. Trends Cell Biol, 11:

66-75, 2001.

48. Clemens MG. Nitric oxide in liver injury. Hepatology, 30: 1-5, 1999.

49. Inoue T, Kwon A-H, Oda M, Kaibori M, Kamiyama Y, Nishizawa M, Ito S &

Okumura T. Hypoxia and heat inhibit inducible nitric oxide synthase gene

expression by different mechanisms in rat hepatocytes. Hepatology, 32: 1037-

1044, 2000.

50. Yamaguchi Y, Okabe K, Matsumura F, Akisuki E, Matsuda T, Ohshiro H, Liang J,

Yamada S, Mori K & Ogawa M. Peroxynitrite formation during hepatic allograft

rejection. Hepatology, 29: 777-784, 1999.

51. Janssen H, Janssen PH, Broelsch CE. Celsior solution compared with University of

Wisconsin solution (UW) and histidinetryptophan-ketoglutarate solution (HTK) in

the protection of human hepatocytes against ischemia-reperfusion

injury.Transplant International, 16: pp. 515–522, 2003.

52. Southard JH. The right solution for organ preservation. North Am Pharmacother, 2:

1-4, 2004.

53. Bauerle PA. & Baltimore D. NF-κB: ten years after. Cell, 87: 13-20, 1996.

54. Fernandez V, Tapia G, Varela P, Romanque P, Cartier-Ugarte D, Videla LA.

Thyroid hormone-induced oxidative stress in rodents and humans: a comparative

view and relation to redox regulation of gene expression. Comp Biochem Physiol C

Toxicol Pharmacol, 142:231-239, 2006.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


107

55. Takahashi Y, Ganster RW, Gambotto A, Shao L, Kaizu T, Wu T, Yagnik GP, Nakao

A, Tsoulfas G, Ishikawa T, Okuda T, Geller DA & Murase N. Role of NF-κB on liver

cold ischemia-reperfusion injury. Am J Gastrointest Liver Physiol, 283: G1175-

G1184, 2002

56. Dalton TP, Shertzer HG, Puga A. Regulation of gene expression by reactive

oxygen. Ann Rev Pharmacol Toxicol, 39: 67-101, 1999.

57. Allen RG. & Tresini M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radic Biol Med,

28: 463-499, 2000.

58. Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of

lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation, 74:1124-1136, 1986.

59. Soncul H, Öz E & Kalaycioglu S. Role of ischemic preconditioning on ischemia-

reperfusion injury of the lung. Chest, 115: 1672-1677, 1999.

60. Konturek S, Brzozowski T, Pajdo R, Konturek P, Kwiecien S, Sliwowski Z, Pawlik

M, Ptak A, Drozdowicz D & Hahn E. Gastric preconditioning induced by short

ischemia: the role of prostaglandins, nitric oxide and adenosine. Med Sci Monit, 7:

610-621, 2001.

61. Peralta C, Hotter G, Closa D, Gelpí E, Bulbena O & Roselló-Catafau J. Protective

effect of preconditioning on the injury associated to hepatic ischemia-reperfusion in

the rat: Role of nitric oxide and adenosine. Hepatology, 35: 934-937, 1997.

62. Murry CE, Jennings RB & Reimer KA. Preconditioning with ischemia delay in lethal

injury in ischaemic myocardium. Circulation, 74: 1124-1136, 1986.

63. Miura T, Miura T, Kawamura S, Goto M, Sakamoto J, Tsuchida A, Matsuzaki M,

Shimamoto K. Effect of protein kinase C inhibitors on cardioprotection by ischemic

preconditioning depends on the number of preconditioning episodes. Cardiovasc

Res, 37:700-709, 1998.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


108

64. Rüdiger HA, Koo-J K, Sindram D, Riehle HM & Clavien PA. Comparison of

ischemic preconditioning and intermittent and continuous inflow occlusion in the

murine liver. Ann Surg, 235: 400-407, 2002.

65. Totsuka E, Fung JJ, Urakami A, Moras N, Ishii T, Takahashi K, Narumi S,

Hakamada K & Sasaki M. Influence of donor cardiopulmonary arrest in human liver

transplantation: possible role of ischemic preconditioning. Hepatology, 31: 577-580,

2000.

66. Romanque U P, Uribe M M, Videla LA. Molecular mechanisms in liver ischemic-

reperfusion injury and ischemic preconditioning. Rev Med Chil, 133:469-476, 2005.

67. Ji XQ, Li CL, Yang JC, Liu XG, Wang ML, Liu ZQ, Lin JH. Application of ischemic

preconditioning before hepatic vascular exclusion for resection of hepatocellular

carcinoma Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 24:66-71, 2004.

68. Clavien PA, Selzner M, Rudiger HA, Graf R, Kadry Z, Rousson V, Jochum W. A

prospective randomized study in 100 consecutive patients undergoing major liver

resection with versus without ischemic preconditioning. Ann Surg, 238:843-852,

2003.

69. Jassem W, Fuggle SV, Cerundolo L, Heaton ND, Rela M. Ischemic preconditioning

of cadaver donor livers protects allografts following transplantation.

Transplantation, 81:169-174, 2006.

70. Azoulay D, Lucidi V, Andreani P, Maggi U, Sebagh M, Ichai P, Lemoine A, Adam

R, Castaing D. Ischemic preconditioning for major liver resection under vascular

exclusion of the liver preserving the caval flow: a randomized prospective study. J

Am Coll Surg, 202(2):203-211, 2006

71. Chouker A, Martignoni A, Schauer RJ, Rau HG, Volk A, Heizmann O, Dugas M,

Messmer K, Peter K, Thiel M. Ischemic preconditioning attenuates portal venous

plasma concentrations of purines following warm liver ischemia in man. Eur Surg

Res, 37:144-152, 2005.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


109

72. Barrier A, Olaya N, Chiappini F, Roser F, Scatton O, Artus C, Franc B, Dudoit S,

Flahault A, Debuire B, Azoulay D, Lemoine A. Ischemic preconditioning modulates

the expression of several genes, leading to the overproduction of IL-1Ra, iNOS,

and Bcl-2 in a human model of liver ischemia-reperfusion. FASEB J, 19(12):1617-

1626, 2005.

73. Bolli R. The late phase of preconditioning. Cir Res, 87: 972-983, 2000.

74. Peralta C., Closa D., Xaus C., Gelpí E., Roselló-Catafau J. & Hotter G. Hepatic

preconditioning in rats is defined by a balance of adenosine and xanthine.

Hepatology, 28: 768-773, 1998.

75. Cohen MV, Baines CP, Downey JM. Ischemic preconditioning: from adenosine

receptor to KATP channel. Annu Rev Physiol, 62:79-109, 2000.

76. Carini R, Albano E. Recent insights on the mechanisms of liver preconditioning.

Gastroenterology, 125(5):1480-1491, 2003.

77. Teoh N, Leclercq I, Dela Pena A & Farell G. Low-dose TNF-α protects against

hepatic ischemia-reperfusion injury in mice: implications for preconditioning.

Hepatology, 37: 118-128, 2003.

78. Schauer RJ, Gerbes AI, Vonier D, Op den Winkel M, Fraunberger P & Bilzer M.

Induction of cellular resistance against Kupffer cell-derived oxidant stress : a novel

concept of hepatoprotection by ischemic preconditioning. Hepatology, 37:286-295,

2003.

79. Arch RH., Gedrich RW. & Thompson CB. Tumor necrosis factor receptor-

associated factors (TRAFs)-a family of adapter proteins that regulates life and

death. Gen Dev, 12:2821-2830, 1998.

80. De Nadai C, Sestili P, Cantoni O, Lièvremont J, Sciorati C, Barsacchi R, Moncada

S, Meldolesi J & Clementi E. Nitric oxide inhibits tumor necrosis-α-induced

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


110

apoptosis by reducing the generation of ceramide. Proc Natl Acad Sci, 97: 5480-

5485, 2000.

81. Manna SK., Zhang HJ., Yan T., Oberley LW. & Agarwal BB. Overexpression of

manganese superoxide dismutasa suppresses tumor necrosis factor-induced

apoptosis and activation of nuclear transcription factor-κB and activated protein-1.

J Biol Chem, 273: 13245-13254, 1998

82. Ramadori G & Christ B. Cytokines and the hepatic acute-phase response. Sem

Liver Dis, 19:141-155, 1999.

83. Gruys E, Toussaint MJM, Niewold TA, Koopmans SJ. Acute phase reaction and

acute phase proteins. J Zhejiang Univ Sci, 6B:1045-1056, 2005

84. Baumann H, Morella KK, Wong GH. TNF-alpha, IL-1 beta, and hepatocyte growth

factor cooperate in stimulating specific acute phase plasma protein genes in rat

hepatoma cells. J Immunol, 151:4248-4257, 1993.

85. Bernelli-Zazzera A., Cairo G., Schiaffonati L. & Tacchini L. Stress proteins and

reperfusion stress in the liver. Ann NY Acad Sci, 663:120-124, 1992.

86. Malhi H, Gores GJ, Lemasters JJ. Apoptosis and necrosis in the liver: a tale of two

deaths? Hepatology, 43:S31-S44, 2006.

87. Peng J, Jones GL & Watson K. Stress proteins as biomarkers of oxidative stress:

effects of antioxidant supplements. Free Radic Biol Med, 28:1598-1606, 2000.

88. Bauer M. & Bauer I. Heme oxygenase-1: redox regulation and role in the hepatic

response to oxidative stress. Antioxid Redox Signal, 4: 749-767, 2002.

89. Shen X-D, Ke B, Zhai Y, Amersi F, Gao F, Anselmo DM, Busuttil RW & Kupiec-

Weglinski JW. CD154-CD40 T-cell costimulation pathway is required in the

mechanism of hepatic ischemia/reperfusion injury, and its blockade facilitates and

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


111

depends on Heme oxygenase-1 mediated cytoprotection. Transplantation, 74:315-

319, 2002.

90. Blydt-Hansen TD., Katori M., Lassman C., Ke B., Coito AJ., Iyer S., Buelow R.,

Ettenger R., Bussutil RW. & Kupiec- Weglinski JW. Gene transfer-induced local

Heme oxygenase-1 overexpression protects rat kidney transplants from

ischemia/reperfusion injury. J Am Soc Nephrol, 14:1-13, 2003.

91. Jaeschke H., Gores GJ., Cederbaum AJ., Hinson JA., Pessayre D. & Lemasters

JJ. Mechanisms of hepatotoxicity. Toxicol Sci, 65:166-176, 2002.

92. Martindale JL & Holbrook NJ. Cellular response to oxidative stress: signaling for

suicide and survival. J Cell Physiol, 192:1-15, 2002.

93. Rudiger HA, Graf R, Clavien PA. Sub-lethal oxidative stress triggers the protective

effects of ischemic preconditioning in the mouse liver. J Hepatol, 39:972-977, 2003.

94. Dufour JF. & Redaelli C. Survival pathways and preconditioning in liver

transplantation. Transpl Immunol, 9:239-41, 2002.

95. Nauta R, Uribe M, Walsh D, Tsimoyiannis E, Miller D & Butterfield A.

Histopathologic correlates of murine hepatic ischemic reperfussion injury: evidence

from a chronic in vivo model. J Invest Sur, 1:155-162, 1988.

96. Nauta R, Uribe M, Tsimoyiannis E, Walsh D, Miller D & Butterfield A. Description of

a chronic in-vivo murine model for the study of warm hepatic ischemia/reperfusion

injury. Surg Res Comm, 6:241-246, 1989.

97. Junge B, Carrión Y, Bosco C, Galleano M, Puntarulo S, Tapia G, Videla LA.

Effects of iron overload and lindane intoxication in relation to oxidative stress,

Kupffer cell function, and liver injury in the rat. Toxicol App Pharmacol, 170:23-28,

2001.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


112

98. Henry L. Serum transaminase levels in liver disease. J Clin Pathol, 12:131-137,

1959.

99. Tietze F. Enzymatic method for quantitative determination of nanogram amounts of

total and oxidized glutathione: application to mammalian blood and other tissues.

Anal Biochem, 27: 502-552, 1969.

100. Anderson ME. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological

samples. Methods Enzymol, 113:548-55, 1985.

101. Reznick AZ & Parker L. Oxidative damage to proteins. Spectrophotometric

methods for carbonyl assay. Methods Enzymol, 233:357-363, 1994.

102. Deryckere F & Gannon F . A One-Hour Minipreparation Techinique for Extraction

DNA-Binding Proteins from Animal Tissues. Biotechniques, 16: 405, 1994.

103. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem,

72:248-254, 1976.

104. Laemmli UK. Cleavage of estructural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature 227:680-685, 1970

105. Towbin H, Staehlin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.

Proc Natl Acad Sci, 76:4350-4354, 1979.

106. Kulkarni SG, Duong H, Gomila R, Mehendale HM. Strain differences in tissue

repair response to 1,2-dichlorobenzene. Arch Toxicol, 70:714-723, 1996.

107. Frederiks WM, Fronik GM, Marx F, James J. Influence of nutritional state on

ischemic damage in rat liver. Liver, 5:342-347, 1985.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


113

108. Van Hoorn DE, Boelens PG, van Middelaar-Voskuilen MC, Nijveldt RJ, Prins H,

Bouritius H, Hofman Z, M'rabet L, van Leeuwen PA, van Norren K. Preoperative

feeding preserves heart function and decreases oxidative injury in rats. Nutrition,

21:859-866, 2005.

109. Jaeschke H, Lemasters JJ. Apoptosis versus oncotic necrosis in hepatic

ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology, 125:1246-1257, 2003.

110. Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowitz N, Kiernan TW,

Wollman J. Formulation and application of a numerical scoring system for

assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology,

1:431435, 1981.

111. Tiyyagura SR, Pinney SP. Left ventricular remodeling after myocardial infarction:

past, present, and future. Mt Sinai J Med, 73:840-851, 2006.

112. Azoulay D, Del Gaudio M, Andreani P, Ichai P, Sebag M, Adam R, Scatton O, Min

BY, Delvard V, Lemoine A, Bismuth H, Castaing D. Effects of 10 minutes of

ischemic preconditioning of the cadaveric liver on the graft's preservation and

function: the ying and the yang.Ann Surg, 242:133-139, 2005.

113. Jaeschke H, Bautista AP, Spolarics Z, Spitzer JJ. Superoxide generation by

neutrophils and Kupffer cells during in vivo reperfusion after hepatic ischemia in

rats. J Leukoc Biol, 52:377-382, 1992.

114. Stadtman ER. Metal ion-catalyzed oxidation of protein: biochemical mechanism

and biological consequences. Free Rad Biol 9, 315-325, 1990.

115. Hissin P, Hilf R. A Fluorometric method for determination of oxidized and reduced

glutathione in tissues. Anal. Biochem. 74, 214-226, 1976.

116. Barnes PJ, Karin M. Nuclear factor-kappa B: a pivotal transcription factor in chronic

inflammatory diseases. N Engl J Med 336: 1066-1071, 1997

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


114

117. Yoshidome H, Kato A, Edwards MJ, Lentsch AB. Interleukin-10 suppresses hepatic

ischemia/reperfusion injury in mice: implications of a central role for nuclear factor

kappaB. Hepatology, 30:203-208, 1999.

118. Matsui N, Kasajima K, Hada M, Nagata T, Senga N, Yasui Y, Fukuishi N, Akagi M.

Inhibiton of NF-kappaB activation during ischemia reduces hepatic

ischemia/reperfusion injury in rats. J Toxicol Sci, 30:103-110, 2005.

119. Suetsugu H, Iimuro Y, Uehara T, Nishio T, Harada N, Yoshida M, Hatano E, Son

G, Fujimoto J, Yamaoka Y. Nuclear factor kappa B inactivation in the rat liver

ameliorates short term total warm ischaemia/reperfusion injury. Gut 54, 835-842,

2005.

120. Kuzuya T, Hoshida S, Yamashita N, Fuji H, Oe H, Hori M, Kamada T, Tada M.

Delayed effects of sublethal ischemia on the acquisition of tolerance to ischemia.

Circ Res, ;72:1293-1299, 1993.

121. Pasupathy S, Homer-Vanniasinkam S. Ischaemic preconditioning protects against

ischaemia/reperfusion injury: emerging concepts. Eur J Vasc Endovasc Surg,

29:106-115, 2005.

122. Ferrnández V, Castillo I, Tapia G, Romanque P, Uribe-Echevarria S, Uribe M,

Cartier-Ugarte D, Santander G, Vial MT, Videla LA. Thyroid hormone

preconditioning: protection against ischemia-reperfusion liver injury in the rat.

Hepatology, 45:170-177, 2007.

123. Bejma J, Ramires P, Ji LL. Free radical generation and oxidative stress with ageing

and exercise: differential effects in the myocardium and liver. Acta Physiol Scand.

169:343-351, 2000.

124. Aitio ML. N-acetylcysteine -- passe-partout or much ado about nothing? Br J Clin

Pharmacol, 61:5-15, 2006.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


115

125. Portella AO, Montero EF, Poli de Figueiredo LF, Bueno AS, Thurow AA, Rodrigues

FG. Effects of N-acetylcysteine in hepatic ischemia-reperfusion injury during

hemorrhagic shock. Transplant Proc, 36:846-848, 2004.

126. Glantzounis GK, Yang W, Koti RS, Mikhailidis DP, Seifalian AM, Davidson BR.

Continuous infusion of N-acetylcysteine reduces liver warm ischaemia-reperfusion

injury. Br J Surg, 91:1330-1339, 2004.

127. Chen CF, Leu FJ, Chen HI, Wang D. Oxygen radicals and matrix

metalloproteinases mediate reperfusion liver injury. Transplant Proc, 37:4547-

4549, 2005.

128. Smyrniotis V, Arkadopoulos N, Kostopanagiotou G, Theodoropoulos T, Theodoraki

K, Farantos C, Kairi E, Paphiti A. Attenuation of ischemic injury by N-acetylcysteine

preconditioning of the liver. J Surg, 129:31-37, 2005.

129. Sindram D, Rudiger HA, Upadhya AG, Strasberg SM, Clavien PA. Ischemic

preconditioning protects against cold ischemic injury through an oxidative stress

dependent mechanism. J Hepatol, 36:78-84, 2002.

130. Pendyala L, Creaven PJ. Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of N-

acetylcysteine, a potential chemopreventive agent during a phase I trial. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev, 4:245-251, 2001.

131. Andreadou I, Iliodromitis EK, Mikros E, Bofilis E, Zoga A, Constantinou M, Tsantili-

Kakoulidou A, Kremastinos DT. Melatonin does not prevent the protection of

ischemic preconditioning in vivo despite its antioxidant effect against oxidative

stress. Free Radic Biol Med, 37:500-510, 2004.

132. Iwamoto T, Miura T, Adachi T, Noto T, Ogawa T, Tsuchida A, Iimura O. Myocardial

infarct size-limiting effect of ischemic preconditioning was not attenuated by oxygen

free-radical scavengers in the rabbit. Circ, 83:1015-1022, 991.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


116

133. Andreadou I, Iliodromitis EK, Tsovolas K, Aggeli IK, Zoga A, Gaitanaki C,

Paraskevaidis IA, Markantonis SL, Beis I, Kremastinos DT. Acute administration of

vitamin E triggers preconditioning via K(ATP) channels and cyclic-GMP without

inhibiting lipid peroxidation. Free Radic Biol Med, 41:1092-099, 2006.

134. Stein AB, Tang XL, Guo Y, Xuan YT, Dawn B, Bolli R. Delayed adaptation of the

heart to stress: late preconditioning. Stroke, 35:2676-2679, 2004.

135. Li XC, Ma YF, Wang XH. Role of NF-kappaB as effector of IPC in donor livers

before liver transplantation in rats. Transplant Proc, 38:1584-1587, 2006.

136. Glanemann M, Strenziok R, Kuntze R, Munchow S, Dikopoulos N, Lippek F,

Langrehr JM, Dietel M, Neuhaus P, Nussler AK.. Ischemic preconditioning and

methylprednisolone both equally reduce hepatic ischemia/reperfusion injury.

Surgery, 135:203-214, 2004.

137. Crenesse D, Laurens M, Gugenheim J, Heurteaux C, Cursio R, Rossi B, Schmid-

Alliana A. Intermittent ischemia reduces warm hypoxia-reoxygenation-induced

JNK(1)/SAPK(1) activation and apoptosis in rat hepatocytes. Hepatology, 34:972-

978, 2001.

138. Takeuchi D, Yoshidome H, Kato A, Ito H, Kimura F, Shimizu H, Ohtsuka M, Morita

Y, Miyazaki M. Interleukin 18 causes hepatic ischemia/reperfusion injury by

suppressing anti-inflammatory cytokine expression in mice. Hepatology, 39:699-

710, 2004.

139. Uehara T, Bennett B, Sakata ST, Satoh Y, Bilter GK, Westwick JK, Brenner DA.

JNK mediates hepatic ischemia reperfusion injury. J Hepatol, 42:850-859, 2005.

140. Kiemer AK, Gerbes AL, Bilzer M, Vollmar AM. The atrial natriuretic peptide

and cGMP: novel activators of the heat shock response in rat livers. Hepatology,

35: 88-94, 2002.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


117

141. Tacchini L, Cairo G, De Ponti C, Massip M, Rosello-Catafau J, Peralta C. Up

regulation of IL-6 by ischemic preconditioning in normal and fatty rat livers:

association with reduction of oxidative stress. Free Radic Res, 40:1206-1217,

2006.

142. Tacchini L, Radice L, Bernelli-Zazzera A. Differential activation of some

transcription factors during rat liver ischemia, reperfusion, and heat shock. J Cell

Physiol, 180:255-62, 1999.

143. Aggarwal BB, Samanta A, Feldmann M. TNF-α.. Cytokine reference on-line. 2000

144. Tian Y, Jochum W, Georgiev P, Moritz W, Graf R, Clavien PA. Kupffer cell-

dependent TNF-alpha signaling mediates injury in the arterialized small-for-size

liver transplantation in the mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Mar 21,

103:4598-4603, 2006.

145. Mac Ewan DJ. TNF receptor subtype signalling: Differences and cellular

consequences. Cell Signal, 14:477-492, 2002.

146. Matsuda T, Hirano T. IL-6. Cytokine reference on-line. 2000

147. Camargo CA Jr, Madden JF, Gao W, Selvan RS, Clavien PA. Interleukin-6 protects

liver against warm ischemia/reperfusion injury and promotes hepatocyte

proliferation in the rodent. Hepatology, 26:1513-1520, 1997.

148. Emadali A, Nguyen DT, Rochon C, Tzimas GN, Metrakos PP, Chevet E. Distinct

endoplasmic reticulum stress responses are triggered during human liver

transplantation. J Pathol, 207:111-118, 2005.

149. Tiberio L, Tiberio GA, Bardella L, Cervi E, Cerea K, Dreano M, Garotta G, Fra A,

Montani N, Ferrari-Bravo A, Callea F, Grigolato P, Giulini SM, Schiaffonati L.

Mechanisms of interleukin-6 protection against ischemia-reperfusion injury in rat

liver. Cytokine, 34:131-142, 2006.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


118

150. Serafin A, Rosello-Catafau J, Prats N, Gelpi E, Rodes J, Peralta C. Ischemic

preconditioning affects interleukin release in fatty livers of rats undergoing

ischemia/reperfusion. Hepatology, 39:688-698, 2004.

151. Fuss C, Palmaz JC, Sprague EA. Fibrinogen: structure, function, and surface

interactions. J Vasc Interv Radiol, ;12:677-682, 2001.

152. Harada N, Okajima K, Uchiba M. Dalteparin, a low molecular weight heparin,

attenuates inflammatory responses and reduces ischemia-reperfusion-induced liver

injury in rats. Crit Care Med, 34:1883-1891, 2006.

153. Kurata M, Okajima K, Kawamoto T, Uchiba M, Ohkohchi N.

Antithrombin reduces reperfusion-induced hepatic metastasis of colon cancer cells.

World J Gastroenterol, 12:60-65, 2006.

154. Chauvet C, Bois-Joyeux B, Fontaine C, Gervois P, Bernard MA, Staels B, Danan

JL. The gene encoding fibrinogen-beta is a target for retinoic acid receptor-related

orphan receptor alpha. Mol Endocrinol, 19:2517-2526, 2005.

155. Anisfeld AM, Kast-Woelbern HR, Lee H, Zhang Y, Lee FY, Edwards PA. Activation

of the nuclear receptor FXR induces fibrinogen expression: a new role for bile acid

signaling. J Lipid Res, 46:458-468, 2005.

156. Bauer M. & Bauer I. Heme oxygenase-1: redox regulation and role in the hepatic

response to oxidative stress. Antioxid Redox Signal, 4: 749-767, 2002.

157. Massip-Salcedo M, Casillas-Ramirez A, Franco-Gou R, Bartrons R, Ben Mosbah I,

Serafin A, Rosello-Catafau J, Peralta C. Heat shock proteins and mitogen-activated

protein kinases in steatotic livers undergoing ischemia-reperfusion: some answers.

Am J Pathol, 168:1474-1485, 2006.

158. Tsuchihashi S, Zhai Y, Fondevila C, Busuttil RW, Kupiec-Weglinski JW. HO-1

upregulation suppresses type 1 IFN pathway in hepatic ischemia/reperfusion injury.

Transplant Proc, 37:1677-8, 2005.

VIII.- REFERENCIAS

_____________________________________________________________________________________________


119

159. Xu X, Ye Q, Xu N, He X, Luo G, Zhang X, Zhu J, Zhang Y, Nilsson-Ehle P. Effects

of ischemia-reperfusion injury on apolipoprotein M expression in the liver.

Transplant Proc, 38:2769-2773, 2006.

160. Kuboki S, Schuster R, Blanchard J, Pritts TA, Wong H, Lentsch AB. Role of heat

shock protein 70 in hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Am J Physiol

Gastrointest Liver Physiol. EN PRENSA

161. Boeri D, Dondero F, Storace D, Maiello M, Pasqualini M, Pellicci R. Heat-shock

protein 70 favours human liver recovery from ischaemia-reperfusion. Eur J Clin

Invest, 33:500-504, 2003.

162. Ebrahimkhani MR, Kiani S, Oakley F, Kendall T, Shariftabrizi A, Tavangar SM,

Moezi L, Payabvash S, Karoon A, Hoseininik H, Mann DA, Moore KP, Mani AR,

Dehpour AR. Naltrexone, an opioid receptor antagonist, attenuates liver fibrosis in

bile duct ligated rats. Gut, 55:1606-1616, 2006.

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