Separación de poblaciones celulares

Diferenciación de las células sanguíneas a partir de células madre de médula ósea

Células del sistema inmune

Poblaciones celulares en sangre entera

LeucocitosCélulas nucleadasSe producen en medula ósea (humanos a un ritmo de 80 millones por minuto)Se pueden reconocer por sus propiedades de tinción y su estructura interna

No granulosos

•Linfocito•Heterogeneidad morfologica, 6-10um.•Citoplasma basófilo muy escaso.•Puede tener granulaciones escasas •Nucleo redondo, oval o ligeramente escotado, se tiñe de color violeta y estructura compacta.

•Monocito•Citoplasma basófilo.•Tiene numerosas granulaciones pequeñas y distribuidas regularmente (no se ven con aumentos bajos)• Nucleo lobulado en forma de herradura, violeta claro, no compacto

Leucocitos polimorfonucleares

•Neutrófilo•Citoplasma acidófilo color rosa pálido (con eosina ácida se tiñe de amarillo).•Tiene granulaciones neutrofílicas chicas , regularmente distribuidas, abundantes; pueden ser primarios o secundarios•Nucleo multilobulado•10-20um de diametro

Tienen una vida media de 2-3 diasEn humanos constituyen el 60-70% de los leucocitos totales de la sangre.No muestran ninguna especificidad para los antígenos pero desempeñan un Importante papel en la inflamación aguda

•Eosinófilo•Citoplasma acidófilo con granulaciones acidófilas grandes, menos númerosas que en neutrofilos, distribución regular y muyrefringentes•Núcleo bilobulado en forma de anteojos, violeta oscuro y compacto.

•Basófilo•Citoplasma acidófilo o antófilo (no toma colorante)•granulaciones basófilas grandes,poco númerosas, distribución irregular de color azul violeta intensos.•Núcleo lobulado, puede ser bisegmentado, violeta oscuro y compacto

Basófilo

Tinción de leucocitos en frotis

Extendido de sangre en portaobjeto, dejar secar

Coloración ideal: May Grunwald (azul de metileno/eosina)

Tiñé citoplasma y granulaciones

Giemsa (azul de metileno/eosina y azur)

Tiñé el núcleo

Sangre periférica

Neonatos 1año Adultos

Neutrófilos en banda 9% 600-3000 3% 50-700 2 -8 % 1800-7000

Neutrófilos 52% 3300-17000 28% 1800-4600 46 - 66 % 0-700

Eosinófilos 2 % 20-850 3 % 50-700 1 - 5 % 0-450

Basófilos 0 % 0-640 0 % 0-200 0 -1 % 0-200

Linfocitos 31 % 2000-11000 61 % 4000-10500 20 - 40 % 1000-4800

Monocitos 6 % 400-3100 6 % 50-1100 2 - 10 % 100-800

Punción cardíaca

Frotis

Fórmula leucocitaria (en humanos)

Tipos celulares

Neutrófilos

Linfocitos

BasófilosEosinófilos

Monocitos

En rata, el % de linfocitos es mayor al de neutrófilos (la relación se invierte)

Fórmula leucocitaria1. Para determinar el porcentaje de los diferentes tipos celulares se cuenta un

número fijo de células por frotis (por ejemplo 100), diferenciando los tipos celulares siguientes: linfocito, macrófago y granulocitos.

2. La diferenciación celular se basa en la relación del tamaño núcleo/citoplasma, la morfología del núcleo y la coloración que adquiere el citoplasma.

3. Barrer el preparado en guarda griega porque las células no se distribuyen homogéneamente: linfocitos en franja central, monocitos y polimorfos nucleares en el borde.

4. Las proporciones de la fórmula leucocitaria varían según:* Edad*especie (humanos predominan los neutrófilos, rata

predominan los linfocitos)

Ganglios axilares

Timo

Ganglios mesentéricos

Ganglios inguinales

Placas de Peyer

Bazo

Ganglios linfáticos

órganos linfoides secundarios.

Linfocitos T 77 %

Linfocitos B 18 %

Timo

órgano linfoide primario.

Linfocitos T 97 %

Linfocitos B 1 % Médula óseaórgano linfoide primario. Generación de células

del SI.Capacidad

hematopoyéticaMédula ósea

Bazoórgano linfoide

secundario.Linfocitos T 35 %Linfocitos B 38 %

Sangre

Linfocitos T 70 %

Linfocitos B 24 %

Obtención de células de órganos linfoides

Preparación de suspensiones celulares

Obtención de M.O.RPMI 1640

Obtención de células linfoides

Centrifugar

Resuspender en medio de cultivo

Contar

Timo

Bazo

Ganglios

Recuento de células

• Determinación de la concentración de células en una suspensión

• cámara de Neubauer

Nº de células/ml=

∑n

4

X 10 x dil4

Separación de poblaciones celulares

Un método eficiente debe reunir :

• Buena recuperación

• Alta pureza

• Mantenimiento de la funcionalidad celular

Sirven para: enriquecer o depletar una población de células

Métodos basados en tamaño y densidadVelocidad de sedimentación a 1 x g

Ley de Stokes: Fuerza de fricción experimentada por objetos esféricos moviéndose en un fluido viscoso en un régimen laminar de bajo número de Reynolds (Re< 2000).

Una célula que sedimenta obedeciendo la Ley de Stokes (en general es válida para partículas pequeñas moviéndose a velocidades bajas), llega a una velocidad terminal dada por:

2 g ( - ´) r2

V =9

Densidad de la célula Densidad del medio

Radio de la célula

Viscosidad del medio

Constante gravitacional

La temperatura puede modificar la velocidad de sedimentación alterando la viscosidad

6 7 8 9 10 11 122

3

4

5

6

7

8

9

10

Vel

ocid

ad

de

sedi

men

taci

ón (

mm

/h)

Diámetro (µ)

1,09 1,08 1,07 1,06

Densidad celular

El diámetro influye más que la densidad de la célula en la determinación de la velocidad de sedimentación

Separación en base al tamaño principalmente (medio de baja densidad)

Ventajas:

• Buena reproducibilidad

• Buena recuperación

• Puede separar una gran cantidad de células

Desventaja:

• Tiempo requerido para la separación

Separación en base a la densidad

Centrifugación en gradiente de densidad:

utiliza un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior.el gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar puede ser suspendidapermite separar los componentes de una muestrarealizar medidas analíticas

Dos variantes: Centrifugación zonal: la muestra se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrifuga las partículas sedimentan moviéndose a diferentes velocidades dependiendo de su masa. Centrifugación isopícnica : la muestra se disuelve en una sn en donde está el soluto formador del gradiente. Durante la centrifugación el soluto se distribuye en el tubo y las particulas de la muestra se reorientan de acuerdo a su densidad. (sedimentación a altas g a través de un medio cada vez más denso)

Cuando la densidad del medio y de las células son iguales, entonces v = 0 y la célula flota en una posición de equilibrio.

Las células muy densas llegan al fondo del tubo y pueden morir por compresión.

Las células muertas también son muy densas y llegan al fondo del tubo.

Se utilizan altas g para alcanzar más rápido el equilibrio y evitar mezclas por efectos de difusión.

Cuanto mayor es la relación núcleo : citoplasma, mayor es la densidad de la célula

Medio hipotónoico: células menos densas; medio hipertónico: células más densas

Se utilizan gradientes de BSA lineales o discontinuos y sílica gel coloidal, Percoll.

Separación en base a tamaño y densidad (Hypaque-Ficoll)

Separación de una suspensión celular a través de un medio de alta densidad por centrifugación a baja velocidad

Ficoll. Se trata de un polisacárido sintético de alto peso molecular (400 kDa). Presenta un alto contenido en grupos hidroxilo por lo que tiene una buena solubilidad en medios acuosos. Además no presenta grupos ionizables que puedan servir de unión a las muestras. Es estable a pH neutro y alcalino, pudiendo ser autoclavado sin degradarse. Su viscosidad es menor que la de la sacarosa, aunque sigue siendo algo elevada, lo que supone un inconveniente y no altera la presión osmótica del medio. Debido a sus propiedades, el ficoll se ha utilizado para la separación de células y partículas subcelulares mediante centrifugación zonal.

Densidad del medio para células humanas : 1,075 g/cm3

ratón : 1,09 g/cm3

rata: 1,089 g/cm3

(C12H22O11)n.(C3H5ClO)n

PM: 400.000

Ficoll Hypaque

Polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina

Hypaque sódico (diatrizoato sódico)

sodio 3,5-diacetamido-2, 4, 6-triiodobenzoate (C11H8I3N2NaO4) contiene 59.87 % de Iodo

Obtención de células mononucleares de sangre periférica por Ficoll- Hypaque

Antes de centrifugar

Sangre diluida

Ficoll Hypaque

Centrifugación Plasma y plaquetas

Mononucleares

Ficoll Hypaque

Polimorfonucleares +Glóbulos rojos

Mononucleares: Linfocitos + monocitos

400 g 30´ temp amb

Después de centrifugar

Purificación de PMN provenientes de Ficoll-Hypaque

• Por sedimentación sobre dextran 6 %

Lisis con H2O (1’) Llevar a isotonicidad

PMN + GR *

GR

Dextran

PMN + GR + SF

Agitación por inversión y sedimentación por 30’

El dextran es un polisacárido complejo y ramificado formado por muchas moléculas de glucosa unidades en cadenas de longitud variable (de 10 a 150 kDa). La cadena consiste en uniones glucosídicas α1->6 entre moléculas de glucosa, mientras que las ramificaciones empiezan en uniones α1->4 (en algunos casos también en uniones α1->2 y α1->3). El dextrano es sintetizado a partir de la sacarosa por ciertas bacterias ácido-lácticas( Leuconostoc mesenteroides y Streptococcus mutans).

Separación de células sanguíneas humanas por centrifugación en gradiente de Percoll

Cuando la densidad del medio y de las células son iguales, entonces v = 0 y la célula flota en una posición de equilibrio.

Mononucleares

(linfocitos)

GR

PMN

70 % (1083)

60 % (1077)

50 % (1065)

Plasma Monocitos, NK

• Gradiente de Percoll (50-70 %): Buena recuperación y pureza mayor al 90 %

•Percoll. Se trata de una suspensión de partículas (5.15 nm) de ácido silícico revestidas de un derivado de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que presenta baja viscosidad a densidades altas, no afecta prácticamente a la presión osmótica del medio y es estable a pH comprendidos entre 5 y 10.Es soluble en solución acuosa y estable en ellas siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato), especialmente a bajos pH. El compuesto puede ser utilizado para centrifugaciones zonales, preformando gradientes, o bien para centrifugación isopícnica, ya que la centrifugación de percoll en rotores angulares durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce un ligero gradiente, independientemente de la densidad inicial del percoll.

Métodos basados en adherencia3 categorías:

1- Adherencia activa: Requiere del metabolismo celular y es temperatura dependiente (ej: macrófagos, polimorfonucleares)

2- Adherencia física: Se puede realizar a 4 °C o a 37 °C (ej: subsets de células B)

3- Adherencia de células muertas o dañadas

Sustancias empleadas:

• Sephadex G10: Quedan retenidas las células adherentes. La separación se basa en adherencia y tamaño.

• Polvo de hierro (Carbonyl iron powder): Las células que fagocitan o se adhieren a las partículas de hierro, son removidas con un imán. (ej: Remoción de linfocitos B)

• Lana de nylon: Se utiliza para obtener células T libres de células B. El rendimiento es bajo (15 a 25 %). Puede haber retención diferencial de subpoblaciones T.• Adherencia a superficies de vidrio o plástico

Adherencia a lana de nylon

Rendimiento bajo (15-25 %)Alta pureza.

Métodos basados en adherencia

Adherencia a superficies de vidrio o plástico

* Purificación de macrófagos (células adherentes)

* Separación por agentes químicos (quelante de calcio, EDTA o

tripsina) o por rastrillado.

* Purificación de linfocitos T

Métodos basados en afinidad (Interacción receptor-ligando)

*Rosetas

*Columnas con anticuerpos

*Panning: superficies plásticas recubiertas con anticuerpo

*Beads magnéticas

*Aglutinina de maní: interacciona con residuos D-galactosa de timocitos inmaduros, aglutinando las células (las células maduras presentan éstos residuos enmascarados por ácido siálico.

*Aglutinina de soja: aglutina células B pero no células T.

*FACS

Monocitos + LB

Métodos basados en afinidad (Interacción

receptor-ligando)

Rosetas espontáneas

Ficoll-Hypaque

GRc

GRc

GRc

GRcGRc

LT

Roseta

GRcCD 2

Rosetas T

LT (humanos)

A partir de interfase de Ficoll- Hypaque

Métodos basados en afinidad

Panning

Utilización de pequeñas beads recubiertas con anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a los linfocitos T o B. Una vez hecha la unión las células se extraen con la ayuda de un separador magnético. La pureza es excelente. Se trabaja a temperatura ambiente

Beads magnéticas

YY YY YY Y YY YY

superficies plásticas recubiertas con anticuerpos

CD 19 (Linfocito B)

CD 3 (Linfocito T)

Selección positiva

Selección negativa

Técnicas inmunomagnéticas

Receptor de la superficie celular que se combina con un ligando (basado en la especificidad de la interacción) Antisuero + complemento: Eliminación de una subpoblación que lleva un antígeno de membrana específico.

Método basado en filtración por columna de bolitas de vidrio

53 a 65 µ de diámetro

Las células más grandes se retrasan con respecto a las más pequeñas.

El vidrio debe estar siliconado

Metodo basado en carga eléctrica neta

En roedores hay una distribución bimodal de movilidades correspondiendo a células B y T.

En humanos esa distribución no se puede correlacionar con las poblaciones B y T

Otros métodos de separación

Métodos basados en la separación funcional por inactivación de células proliferantes

1- Pulso de timidina marcada con radioisótopos

Linfocitos expuestos a Ag o mitógenos se dividen y la timidina se incorpora al ADN

La desintegración radioactiva mata las células proliferantes.

(Reacciones mixtas de linfocitos, respuestas citotóxicas mediadas por células).

La timidina se incorpora al ADN celular

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2- Pulso de 5-Br-2-Deoxiuridina (BUdR)Se incorpora al ADN en células en división como análogo de la timidina. Cuando se activa con luz UV, causa el daño del ADN.

3- Mitomicina CCausa cross-linking del ADN y las funciones que requieren división celular son abolidas4- IrradiaciónRayos X, Cobalto (60Co), Cesio (137Cs), rayos gamma.

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