Separaciones por cromatografía

Técnica de separación en la cual, los componentes de la muestra, se distribuyen entre dos fases de diferente naturaleza, como consecuencia de la variación de velocidad que se establece al ser arrastrados por una fase móvil, líquida o gaseosa, a través de una fase estacionaria, sólida o líquida.

Las fases cromatografícas son dos:

La fase móvil: que fluye a través de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los compuestos de la mezcla.

Fase móvil (liquida o gaseosa): contiene los componentes separar y fluye a través de la fase estacionaria.

La fase estacionaria: en la cual están retenidos los componentes de la muestra, y a través de la cual fluye la fase móvil arrastrando a los mismos.

Fase estacionaria (liquida o solida): a través de la cual fluye la fase móvil y donde quedan momentáneamente retenido los componentes de la muestra.

La cromatografía fue originalmente descrita por Tswett en 1906, Ideó un método para separar pigmentos de las plantas utilizando un tubo de vidrio lleno de CaCO3, Después de añadir un extracto de las plantas y lavarlo con un disolvente orgánico observó que se separaban diferentes bandas coloreadas en el interior de la columna.Los componentes de la muestras se distribuyen en el interior del lecho cromatográfico al ser arrastrados por la fase móvil.

Las especies individuales quedan retenidas en la fase estacionaria en función de las interacciones que tienen lugar tales como:

Adsorción superficial Solubilidad Carga

La aplicación práctica de la cromatografía consiste en hacer pasar la fase móvil a través de la columna cromatográfica que contiene la fase estacionaria, donde están retenidos los solutos.tiempo de retención tR: tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el sistema cromatográfico. Esta retención se ejerce en función de las características moleculares de cada compuesto. Elución: proceso por el cual todos los solutos terminan por abandonar la columna.

También se pueden clasificar en función de la forma en la que se lleve a cabo: a) PLANA: La fase estacionaria se coloca sobre una superficie plana b) COLUMNA: se utiliza un tubo de vidrio cilíndrico como soporte de la fase estacionaria y se hace pasar a través de ella la fase móvil.

En cromatografía líquida podemos distinguir dos modalidades básicas:

Cromatografía en fase normal: fase móvil no polar y la fase estacionaria es polar (gel de sílice)

Cromatografía en fase invertida: fase móvil de naturaleza polar y fase la estacionaria no polar (cadena hidrocarbonada que puede ser:

Cadena larga: C-18 Cadena intermedia: C-8 Cadena corta: C-2

Cromatografía plana: Cromatografía en papel Cromatografía en capa fina (TLC)

Cromatografía en columna:

Cromatografía de gases (GC) Cromatografía líquida (LC)

cromatografía líquido - líquido cromatografía sólido – líquido

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Todas las cromatografías denominadas en columna se caracterizan por tener una fase estacionaria que se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de diámetro por la que se hace pasar una fase móvil líquida o gaseosa que estará en permanente movimiento. Según la afinidad de las moléculas por la fase móvil o la estacionaria, éstas se separaran. Después de cada cromatografía se puede obtener información del cromatograma tanto cualitativa (para identificar los distintos compuestos de la mezcla) como cuantitativa (para poder obtener la cantidad y composición de las sustancias separadas). Las fases estacionarias pueden ser de materiales muy distintos, existen derivados de dextranos (sefadex), derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de vidrio, sílice, etc.

Existen distintos tipos de cromatografía en columna:

Cromatografía de intercambio iónico: se basa en la afinidad de los iones en solución por los sitios de polaridad opuesta que se encuentran en la fase estacionaria.

Cromatografía de exclusión: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas.

Cromatografía de afinidad: se fundamenta en la especificidad de algunas macromoléculas biológicas. Éstas se unen específicamente a la fase estacionaria y para separar dicha macromolécula, bastará con variar el pH una vez que la columna este limpia y sólo se encuentre de interés.

Cromatografía de adsorción: se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los compuestos por el sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más polar que la fase móvil.

Cromatografía de partición: la fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. Otra vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel. La cromatografía de gases (GC) y de alta resolución (HPLC) son técnicas de partición ampliamente empleadas.

Cromatografía de fase reversa: el mecanismo de separación depende de interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema.

CROMATOGRAFÍA PLANA

La mayoría de los principios que se aplican para la cromatografía en columna se aplican también a la cromatografía en superficie plana.

Cromatografía en capa fina (TLC)

Para la cromatografía en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de partículas de unos milímetros de espesor, fijadas sobre un soporte sólido generalmente de aluminio, plástico o vidrio. Después de aplicar el analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la separación.

La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultáneamente la muestra y el patrón, mientras que en la cromatografía en columna las muestras se analizan individualmente. Además, las muestras que son difíciles de separar, se pueden resolver utilizando dos disolventes diferentes por desarrollo de la placa en direcciones perpendiculares.

Cromatografía en papel

En este caso, el soporte y fase estacionaria es papel. El papel que normalmente se utiliza es de celulosa. La celulosa es muy polar en el agua y se vuelve electronegativa. El papel tiene propiedades de intercambio iónico débiles, así como de adsorción.

La mayoría de las propiedades varían de papel a papel, lo que provoca variaciones en el Rf. Actualmente existen papeles modificados con resinas cambiadores de iones, alúmina, etc. El aparato que se usa consta de un soporte para el papel, un recipiente para el disolvente y una cámara hermética para desarrollar el cromatograma. La cámara hermética es necesaria para evitar la evaporación de los disolventes volátiles debido a la gran superficie del papel expuesta. Antes de sumergir el papel en el disolvente de elución se aplica la muestra en forma de punto diminuto con cualquier objeto que pueda transferir un pequeño volumen.

El papel debe estar en equilibrio con los vapores del disolvente antes de empezar el desarrollo. La cromatografía en papel se ha aplicado con buen éxito a problemas de química orgánica e inorgánica y de bioquímica.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico.

La cromatografía en capa fina (CCF)

Es una técnica cromatográfica que utiliza una placa inmersa verticalmente. Esta placa cromatográfica consiste en una fase estacionaria polar (comúnmente se utiliza sílica gel) adherida a una superficie sólida. 

Elección del eluyente

La elección del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en que la

separación se lleva a cabo. Un método que se emplea para la selección del eluyente es una

cromatografía en capa fina con distintos disolventes y unas muestras patrón.

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

Éter de petróleo

Éter dietílico

Ciclohèxano

Acetato de etilo

Tetracloruro de carbono†

Piridina†

Benceno†

Etanol

Cloroformo†

Metanol

Diclorometano

Agua

Ácido acético

En la elección del eluyente influyen varios factores:

Precio.

Pureza.

No utilizar mezclas de eluyentes a menos que se conozcan las proporciones de los

disolventes que conformen la mezcla (reproducibilidad).

No utilizar compuestos muy volátiles.

Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del

componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

1. Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.

2. Aplicando un eluyente poco polar.

3. Aplicando un eluyente más polar.

Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa

para aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado.

Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras

distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro

de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma

que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera más eficaz.

CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA

La cromatografía en capa fina (en inglés thin layer chromatography o TLC) es una técnica analítica rápida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de Química Orgánica. Entre otras cosas permite: ‐ Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación. ‐ Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia. ‐ Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado. La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase móvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente.

Adsobentes y eluyentes

Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son la gel de sílice (SiO2) y la alúmina (Al2O3), ambas de carácter polar. La alúmina anhidra es el más activo de los dos, es decir, es el que retiene con más fuerza a los compuestos; por ello se utiliza para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas). El gel de sílice, por el contrario, se utiliza para separar sustancias más polares (alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). El proceso de adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo‐dipolo o enlaces de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de descomposición. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante interacción dipolo dipolo o mediante enlace‐ de hidrógeno si lo presentan.

El orden de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil o eluyente. Este puede ser un disolvente único o dos miscibles de distinta polaridad. En el siguiente recuadro se recoge por orden creciente de fuerza eluyente los disolventes más comúnmente empleados.

Hexano tetraclorometano cloroformo diclorometano acetato de etilo acetona 2 propanol ‐ metanol agua

En general, estos disolventes se caracterizan por tener bajos puntos de ebullición y viscosidad, lo que les permite moverse con rapidez. Raramente se emplea un disolvente más polar que el metanol. Usualmente se emplea una mezcla de dos disolventes en proporción variable; la polaridad de la mezcla será el valor promediado en función de la cantidad de cada disolvente empleada. El eluyente idóneo para cada caso ha de encontrarse por "el método del ensayo y del error".