IDENTIFICACION DE LAS ESPECIES PERTENECIENTES AL GRUPO DE

Streptococcus viridans PRESENTES EN LA CAVIDAD ORAL DE

NIÑOS PREDENTALES

ADRIANA PATRICIA DIAZ GIL

MARIA JOSE MORALES MARTINEZ

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

para optar el título de

BACTERIOLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BACTERIOLOGIA

BOGOTÁ, D. C.

2002

IDENTIFICACION DE LAS ESPECIES PERTENECIENTES AL GRUPO DE

Streptococcus viridans PRESENTES EN LA CAVIDAD ORAL DE

NIÑOS PREDENTALES

ADRIANA PATRICIA DIAZ GIL

MARIA JOSE MORALES MARTINEZ

_____________________________ Dra. MARIA CECILIA MARTINEZ

Directora

_________________________________ Dra. ADRIANA RODRIGUEZ CIODARO

Codirectora

____________________________ ____________________________ Dra. MIRIAM DE RICO Dr. FREDY GAMBOA Jurado Jurado

____________________________ ___________________________ Dra. Aura Rosa Manascero Dra. Angela Umaña Directora Carrera de Bacteriología Decano de la Facultad

1NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946 : “ La Universidad no se hace responsable por los

conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado ”.

Gracias a Dios por haberme permitido culmi nar esta carrera y a mis padres quienes me apoyaron

incondicionalmente y a los que dedico en primer lugar este trabajo, así como a todas aquellas personas que de

alguna manera estuvieron a mi lado

y pusieron su confianza en mi para que pudiera

realizarme como profesional.

María José Morales Martínez

Doy gracias a Dios por haberme dado unos padres maravillosos que me permitieron formarme

como profesional y como persona; de igual forma dedico

Este trabajo a todas aquellas personas que estuvieron

conmigo incondicionalmente durante

todos estos años.

Adriana Patricia Díaz Gil

CONTENIDO

Pág INTRODUCCIÓN 11

1. MARCO TEORICO 14

1.1 CAVIDAD ORAL 14

1.1.1 ECOSISTEMAS ORALES PRIMARIOS DE NIÑOS PREDENTALES 16

1.1.1.1 Mucosa oral 16

1.1.1.2 Labios 16

1.1.1.3 Dorso de la lengua 16

1.1.1.4 Paladar blando 17

1.1.1.5 Saliva 17

1.2 Streptococcus viridans 19

1.2.1 CLASIFICACIÓN DE LOS Streptococcus viridans 19

1.2.1.1 Grupo salivarius 23

1.2.1.2 Grupo mutans 24

1.2.1.3 Grupo mitis 25

1.2.1.4 Grupo anginosus 28

1.3 Streptococcus viridans Y CARIES DENTAL 28

2. JUSTIFICACIÓN 33

3. OBJETIVOS 35

3.1 Objetivo general 35

3.2 Objetivos específicos 35

4. MATERIALES Y METODO 36

4.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 36

4.2 POBLACIÓN 36

4.3 PROCEDENCIA DE LAS CEPAS DE Streptococcus viridans 36

4.4 RECONSTITUCIÓN Y CONFIRMACIÓN DE LAS CEPAS 37

COMO Streptococcus viridans

4.5 IDENTIFICACIÓN DE LA S CEPAS 39

5. RESULTADOS 42

6. DISCUSIÓN 57

7. CONCLUSIONES 63

8. RECOMENDACIONES 65

BIBLIOGRAFÍA 66

ANEXOS 70

LISTA DE TABLAS

Pág Tabla 1. Clasificaciones de Streptococcus viridans. 22 Tabla 2. Clasificación actual de Streptococccus viridans según Beighton, D. 23 et. al. Tabla 3. Resultados de las pruebas realizadas a las 50 cepas de 43 Streptococcus viridans. Tabla 4. Especies presentes en los 18 niños en edad predental. 45 Tabla 5. Frecuencia de aparición de especies de S. viridans en los 18 niños 46 y cantidad total de cepas encontradas. Tabla 6. Frecuencia de aparición por grupos de S. viridans en los 18 niños. 46 Tabla 7. Especies de Streptococcus viridans identificadas en las 50 cepas 47 aisladas de niños predentales. Tabla 8. Agrupación de las especies identificadas. 48 Tabla 9. Especies de Streptococcus viridans en los 3 grupos de edades. 49 Tabla 10. Descripción de las colonias de 50 cepas aisladas de 18 niños 55 predentales.

LISTA DE FIGURAS

Pág Figura 1. Diagrama de flujo para la identificación de especies 41 pertenecientes al grupo de Streptococcus viridans. Figura 2. Distribución de las especies de Streptococcus viridans 47 aislados de niños en etapa predental. Figura 3. Especies de Streptococcus viridans aisladas en los tres 50 Grupos de edades. Figura 4. Colonias Streptococcus mutans 51 Figura 5. Colonias Streptococcus sobrinus 51 Figura 6. Colonias Streptococcus mitis. 52 Figura 7. Colonias Streptococcus gordonii. 52 Figura 8. Colonias Streptococcus oralis. 53 Figura 9. Colonias Streptococcus crista. 53 Figura 10. Colonias Streptococcus anginosus. 54

LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Caldo Tioglicolato. 70 Anexo 2. Agar Tripticasa Soya. 72 Anexo 3. Agar Base sangre. 74 Anexo 4. Prueba de resistencia a optoquina. 76 Anexo 5. Catalasa. 78 Anexo 6. Agar Mitis salivarius. 80 Anexo 7. Caldo Base rojo de fenol. 82 Anexo 8. Prueba de resistencia a bacitracina. 84 Anexo 9. Hidrólisis de arginina. 86 Anexo 10. Medio MR.VP. 90

INTRODUCCION

La cavidad oral de niños en etapa predental es un ecosistema abierto en el cual existen

microorganismos indígenas o nativos entre los cuales predominan los anaerobios y facultativos que

se retienen en diferentes regiones de la boca del recién nacido. Esta cavidad presenta las

alteraciones propias para la edad lo que permite la instalación de los diferentes microorganismos,

además de poseer las condiciones adecuadas de temperatura, humedad y diferentes tensiones de

oxígeno. Así mismo la cantidad de carbohidratos ingeridos, la consistencia del alimento, la

frecuencia de ingestión, y el contacto con el ambiente familiar favorecen dicha colonización.1

In útero el feto normalmente esta libre de gérmenes; durante el nacimiento el niño puede ser

inoculado con la flora normal del tracto genital de la madre, es decir, algunos de los siguientes

microorganismos o todos, aunque estos no se instalan de forma definitiva en la boca de los

infantes: lactobacilos, corinebacterias, micrococos, coliformes, streptococcus alfa y beta

levaduras, protozoarios y probablemente virus. El ser humano es edéntulo en el nacimiento y

tiene una flora característica de este estado. Cuando los dientes primarios comienzan a

erupcionar, hay un cambio significativo en el medio que se refleja en los cambios en la flora oral.

En el momento que se completa la dentición primaria, las condiciones son relativamente estables

hasta que comienzan a brotar los dientes permanentes. Dentro del grupo de estreptococos que

1 DE FIGUEIREDO, Luiz Reynaldo. Odontología para el Bebé. Actualidades Médico Odontológicas Latinoamérica. Sao Paulo, Brasil. 2000. p 95-97.

colonizan la cavidad oral de los infantes son importantes aquellos pertenecientes al grupo

viridans, estos microorganismos predominan en la cavidad oral y el tracto respiratorio alto de

humanos y animales y actúan como comensales, siendo causa de infecciones oportunistas de la

parte oral y de otros sitios del organismo en personas sanas y pacientes inmunocomprometidos.

De la misma forma se han relacionado fuertemente con la generación de la caries dental, al actuar

sobre la sacarosa para producir glucanos y formar ácidos que desmineralizan y provocan la

ruptura del esmalte dando inicio a la lesión cariosa . 2, 3, 4

A pesar de las fuerzas de limpieza por rozamiento de los labios, mejillas, lengua y el empleo de los

métodos de higiene externa, algunas áreas de la boca están relativamente bien protegidas y

permiten la acumulación excesiva de bacterias, las cuales pueden actuar como agentes de

enfermedad en otras áreas del organismo humano debido a la alteración de factores como la

temperatura, pH, potencial de óxido-reducción, presión osmótica, nutrientes, alteración en la

adhesión de los microorganismos a las superficies orales, disminución de las defensas del

hospedador entre otras.5, 6

2 BURNET, George. Microbiología Oral y Enfermedad Infecciosa. Editorial Medica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 1982. p 228 y 229. 3 WHILEY, R.A., BEIGHTON, D. Current classification of the oral streptococci Oral Microbiology and Immunology 1998, 13 : 195-216. 4 PEARCE, CH., BOEDEN. G.H.. Identification of pioneer viridans streptococci in the oral cavity of human neonates . J. Med. Microbiol. 1995, 42 : 67-72. 5 ANDERS, Thylstrup. Caries. Ediciones Doyma. Barcelona, España. 1988. p 40. 6 ESCOBAR, Miriam. Microbiología de la Cavidad Oral. Centro Editorial Javeriano CEJA. 1999. p 57 y 58.

El presente estudio realizó una identificación clara basada en pruebas bioquímicas, de uno de l

grupos de mayor interés en el área odontológica, en la cavidad oral de niños entre los 0 y 6 meses

de edad, conocidos como Streptococcus viridans o estreptococos orales ; aunque dichos

microorganismos son habitantes normales en la mucosa oral, respiratoria y gastrointestinal del

hombre y patógenos oportunistas de poca virulencia pueden tener una importante repercusión

sanitaria que compromete la salud de la comunidad ya que están implicados en la generación de

caries, factor que puede manifestarse de forma agresiva pudiendo evolucionar a estados severos

que interfieran negativamente en el crecimiento y desarrollo de los niños afectados.

1. MARCO TEORICO

1.1 CAVIDAD ORAL

Durante toda la vida el cuerpo humano alberga una gran variedad de microorganismos que

potencialmente pueden producir enfermedad. La cavidad oral representa un ambiente del huésped

que tiene características que favorecen la ubicación y el crecimiento de muchas especies. Los

microorganismos de la boca fueron los primeros en ser observados por el hombre, pero el interés

por la microbiología tardó mucho en aparecer, posiblemente porque la enfermedad bucal no se

consideraba peligrosa, ya que el dolor originado en una pieza dentaria podía eliminarse fácilmente

con la extracción de dicha pieza. Solo cuando fue evidente que la microflora oral podía influir en

la enfermedad generalizada se inició el interés acerca de la naturaleza y tipos de microorganismos

tanto en la boca saludable como en la enferma.7

La cavidad oral está formada por un conjunto de tejidos, con numerosos microorganismos

asociados a ellos constituyendo un ecosistema. Cuando este sistema ecológico se encuentra en

equilibrio se denomina eubiosis, en cambio cuando estas relaciones se alteran pasan a llamarse

disbiosis, que corresponde a la boca enferma.8

7 NOLTE, William A.Microbiología Odontológica. Editorial Interamericana. México. 1986. p 188. 8 LIEBANA, José. Microbiología Oral. McGraw-Hill Interamericana. México. 1997. p 402

Todos los humanos se consideran libres de gérmenes in útero a no ser que la madre halla

desarrollado alguna patología durante el embarazo. El ser humano adquiere los primeros

microorganismos al pasar por el canal del nacimiento, durante este proceso el bebé adquiere entre

otros el bacilo de Doderlain semejante al lactobacilo. Al nacer y respirar por primera vez obtiene

del medio ambiente diversos microorganismos, durante esta época es importante recordar que la

boca del niño carece de dientes y su alimentación básicamente es la leche materna o fórmulas

preparadas lo cual condiciona el tipo de microorganismos. En estas condiciones durante las

primeras semanas de vida predominan Streptococcus como mitis, oralis y salivarius. En

ausencia de dientes se hace difícil detectar S. mutans, sin embargo el contacto íntimo con la

madre o con quien cuida del bebé, permite que a través de la saliva algunos de estos

microorganismos transeúntes sean adquiridos por el niño.

La boca del recién nacido presenta alteraciones estructurales propias para la edad y permite la

introducción de una gran cantidad de microorganismos, ya que actúa como un microambiente

ideal con una temperatura entre los 35 y 37 ºC y abundante humedad, además de un excelente

aprovisionamiento de diferentes tipos de alimentos y variadas tensiones de oxígeno. 9

1.1.1 ECOSISTEMAS ORALES PRIMARIOS DE NIÑOS PREDENTALES :

En el proceso de investigación microbiológica de la cavidad oral, es indispensable conocer l

diferentes ecosistemas orales primarios que la componen. Cada uno de estos nichos ecológicos

posee diferentes características físicas, químicas y nutricionales que permitirán el desarrollo de una

u otras especies microbianas.

1.1.1.1 Mucosa oral: Recubre labios, paladar, mejillas y encías. Está formada por un epitelio

escamoso estratificado con algunas variaciones histológicas según la localización. Su continuidad

se ve interrumpida por los conductos salivales así como por los dientes cuando estos aparecen.

Se encuentra habitada principalmente por cocos Gram positivos anaerobios facultativos,

especialmente Streptococcus viridans.

1.1.1.2 Labios: Cubiertos externamente por piel e internamente por membrana mucosa que

continúa en la cavidad oral y que reviste la boca. Rodean el orificio de la boca y forman el límite

anterior de la cavidad oral. Se encuentran colonizados por una microbiota cutánea como

Staphylococcus epidermidis y micrococcus spp. Además pueden encontrarse también

Streptococcus viridans que provienen de la saliva, mejillas, paladar duro y dorso de la lengua.

1.1.1.3 Dorso de la lengua: Su característica especial es la de ser un órgano musculoso y estar

queratinizado. Sus dos tercios anteriores están cubiertos de papilas y el tercio posterior con

9 NOLTE, Op. cit., p. 112.

numerosas glándulas mucosas y folículos linfoides. Ofrece amplias posibilidades para la

colonización bacteriana principalmente por especies de Streptococcus salivarius, además de

cocos Gram negativos anaerobios estrictos y bacilos Gram positivos anaerobios facultativos.

1.1.1.4 Paladar blando: Forma un tabique entre la boca y la nasofaringe y está compuesto por

un músculo en forma de arco. Contiene bacterias propias de las vías respiratorias como

Haemophylus spp, Streptococcus pyogenes y Streptococcus viridans.

1.1.1.5 Saliva: Baña abundantemente todas las superficies orales. Los microorganismos que se

hallan en la saliva proceden del desprendimiento que se produce en otras áreas bucales,

especialmente del dorso de la lengua. Predominan los cocos Gram positivos anaerobios

facultativos, cocos Gram negativos anaerobios estrictos como Veillonella spp y bacilos

anaerobios facultativos Gram positivos como actinomyces spp.10 ,11

Los microorganismos que componen la microbiota oral coexisten en los diferentes ecosistemas

primarios, regulados por una serie de factores, fisicoquímicos, de adhesión; agregación y

coagregación; nutricionales; protectores del hospedador; y antagónicos ínterbacterianos. Dentro

de los factores fisicoquímicos se encuentra la humedad; factor importante para las bacterias ya

que dependen de ella para el intercambio de nutrientes, para las reacciones metabólicas y la

eliminación de productos de desecho. El pH también es óptimo para el desarrollo bacteriano y

10 LIEBANA. Op. cit., p 402-405. 11 ESCOBAR, M. Op. cit. p 57-58.

está continuamente sometido a variaciones generadas por la ingestión de alimentos como los

carbohidratos los cuales a través del metabolismo de las bacterias provocan descensos

importantes que algunas veces son controlados por la saliva que actúa como un amortiguador. La

temperatura, es otro factor importante en el desarrollo de los microorganismos orales, y la

cavidad oral actúa como el microambiente ideal con 37 ?C. Por último el potencial de óxido

reducción permite que existan las condiciones apropiadas de oxígeno necesarias para la

supervivencia de los microorganismos; además es un factor determinante en la clase de

microorganismos que van a colonizar los diferentes nichos orales. Los factores relacionados con

la adhesión permiten que se establezca una unión entre los microorganismos y los tejidos del

hospedador, lo cual da lugar a la colonización de estos últimos; y la agregación y coagregación,

son procedimientos que tienen las bacterias, de las mismas o diferentes especies, de adherirse

entre si para formar colonias que fortalecen y estabilizan la colonización. Los factores

nutricionales permiten que exista una gran cantidad y diversidad de microorganismos orales, estos

son obtenidos a partir de los tejidos o secreciones del hospedador, de otros microorganismos, y

de la dieta alimentaría. Otro de los factores corresponde a los mecanismos protectores del

hospedador, que de alguna forma limitan la multiplicación, el establecimiento y la penetración de

los microorganismos, contribuyendo al estado de salud de la cavidad oral; y así mismo el

antagonismo ínterbacteriano que determina la supervivencia de unas u otras especies

bacterianas.12

12 LIEBANA. Op. cit., p 410-426

1.2 Streptococcus viridans Entre los principales microorganismos que colonizan la cavidad oral se encuentran los

estreptococos pertenecientes al grupo viridans; estos microorganismos son cocos Gram positivos

que comúnmente suelen asociarse en parejas y cadenas cortas o largas, carecen de catalasa y son

anaerobios facultativos, su crecimiento se ve favorecido por una atmósfera de 5% de CO2 y su

desarrollo en agar sangre determina una hemólisis ? o no hemólisis; aunque actualmente se ha

podido comprobar la presencia de varias cepas de los grupos de Streptococcus salivarius

anginosus que producen hemólisis ? . Se ha determinado de la misma forma que no poseen

antígenos de pared de los grupos B ó D de Lancefield, no crecen en caldo con 6.5% de Cloruro

de Sodio y no son solubles en bilis ni inhibidos por la optoquina.

Estreptococos del grupo viridans son habitantes normales de la mucosa oral respiratoria y

gastrointestinal del hombre y los animales, y son capaces de adherirse a las células epiteliales y

endoteliales así como a las superficies duras de los dientes, y es probablemente esta capacidad un

factor clave en su patogenia.

1.2.1 CLASIFICACION DE Streptococcus viridans

Bajo la denominación de viridans se agrupa un amplio número de estreptococos cuya

clasificación no es fácil, lo que ha motivado una importante confusión taxonómica que dista de ser

resuelta; gracias a la aplicación de técnicas genéticas como la hibridación DNA-DNA, hibridación

DNA-RNA ribosómica (rRNA) y la secuenciación de la subunidad pequeña de rRNA (16S) se

han podido ampliar los estudios en el conocimiento e identificación de dichas especies.13

En el pasado la mayoría de los laboratorios clínicos ofrecían una denominación genérica a los

aislamientos como “estreptococos no hemolíticos” o “? -hemolíticos”. Sin embargo a finales de

la década de los 60 comenzaron a desarrollarse diversos esquemas taxonómicos en función de las

propiedades bioquímicas, fisiológicas y de análisis de la pared bacteriana. Colman y Williams, en

1972, propusieron un grupo compuesto por 5 especies ( Ver Tabla 1): S. mutans, S. milleri, S.

sanguis, S. salivarius y S. mitior. Aunque este esquema fue aceptado principalmente por los

laboratorios británicos y algunos del continente europeo, posteriormente Facklam en 1977,

reconoció diez especies (Ver Tabla 1) que fueron bien acogidas en Estados Unidos. De esta

forma las cepas de S. sanguis y S. mitior de Colman y Williams quedaron como S. sanguis

S. sanguis II o S. mitis. Además, los aislamientos de S. milleri se dividieron en Streptococcus

anginosus-constellatus y Streptococcus MG-intermedius. Las diferencias surgidas entre estas

dos clasificaciones llevaron a una cierta confusión en las denominaciones e identificaciones.

Con el desarrollo de la tecnología molecular en la última década, han aparecido diversas

aproximaciones al problema. De esta forma, se han llevado a cabo estudios de relación mediante

hibridación de DNA y análisis de secuencias del rRNA 16S y del gen que codifica la superóxido

dismutasa, que han provocado cambios sustanciales en la taxonomía y

13 KONEMAN, Elmerw. Diagnostico Microbiológico. Editorial Médica Panamericana. Madrid. España. 1999 564,565.

nomenclatura del género Estreptococo. Sin embargo en Streptococcus viridans, no se ha

logrado un consenso general sobre la denominación de las especies que lo integran, ni las cepas

patrón que las representan. Por lo tanto una de las posturas razonables es el intento de

categorización presuntiva que realizó Coykendall en 1989. Basándose en la definición genética y

su correlación con las características fenotípicas útiles en las pruebas de laboratorio se

reconocieron cinco grupos / especies (Ver Tabla 1): S. mutans, S. salivarius, S. sanguis, S.

mitis, y S. anginosus. Esta clasificación incluye prácticamente todas las especies aisladas en las

muestras clínicas y constituye un esquema de identificación fácil para los microbiólogos. Además

contiene toda la información clínica útil a efectos de diagnóstico y tratamiento de los diferentes

procesos infecciosos producidos por estos microorganismos. En una actualización posterior

sobre nomenclatura, taxonomía y clasificación de diversos agentes infecciosos realizada por

Bruckner y Colona en 1997, persiste el establecimiento de cinco grupos dentro de Streptococcus

viridans, con tan solo un cambio en la denominación de S. anginosus por el de S. milleri.14 , 15

Tabla 1. Clasificaciones de Streptococcus viridans. 14 BEIGHTON, D., HARDIE, J.M., WHILEY, R.A.. A Scheme for the Identification of Viridans StreptococciMed. Microbiol. 1991, 35 : 367-372. 15 WHILEY, R.A.. Op. cit., p 195-216. 16 FERNANDEZ DE VEGA, Fernando. Aspectos Microbiológicos de los Estreptococos del grupo Viridans. Control de Calidad SEIMC. Servicio de Microbiología. www : / :monografías. google. com.

Colman y Williams

(1972)

Facklam (1977)

Coykendall

(1989)

Bruckner y Colonna

(1997)

S. salivarius

S. mitior

S. sanguis S. milleri S. mutans

S. salivarius

S. mitis

S. sanguis II

S. sanguis I

S. intermedius

S. anginosus-constellatus

S. mutans

S. morbillorum

S. acidominimus

S. uberis

S. salivarius

S. mitis

S. sanguis

S. anginosus

S. mutans

S. salivarius

S. mitis

S. sanguis

S. milleri

S. mutans

La más reciente clasificación fue realizada por Beighton D. et al. en 1991 quienes designaron

cuatro grupos: “anginosus”, “mitis”, “mutans” y “salivarius” integrados por 18 especies

incluyendo el S. thermophilus cuyo hábitat es desconocido ( Ver Tabla 2).

Tabla 2. Clasificación actual de Streptococcus viridans según Beighton, D. et al.

Grupo anginosus

Grupo mitis

Grupo salivarius

Grupo mutans

S. anginosus

S. constellatus

S. intermedius

S. mitis

S. oralis

S. gordonii

S. sanguis

S. parasanguis

S. pneumoniae

S. salivarius

S. vestibularis

S. thermophilus

S. mutans

S. rattus

S. cricetus

S. sobrinus

S. downei

S. macacae

S. ferus

1.2.1.1 Grupo salivarius: Se encuentra integrado por: S. salivarius, S. vestibularis, y

thermophilus. Usualmente son no hemolíticos sobre agar sangre aunque se han encontrado

cepas que presentan ? ó ? hemólisis. Muestran colonias grandes y mucoides sobre agar con

contenido de sacarosa debido a la producción de fructanos solubles. Cuando hay producción de

glucanos insolubles las colonias poseen textura dura. La especie S. salivarius tiene su origen y

hábitat en la cavidad oral de humanos y animales, en particular en la lengua y saliva, y su

capacidad cariógena es dudosa. S. vestibularis se aísla preferentemente de la región vestibular

de la cavidad oral, no se conoce su significado patógeno ni en este ni en otros niveles del

organismo humano. Por otra parte S. thermophilus en algún momento llegó a considerarse

subespecie de S. salivarius, pero estudios de homología del ADN indicaron que correspondía a

una especie diferente.

1.2.1.2 Grupo mutans: Se encuentra conformado por: S. mutans, S, sobrinus, S. cricetus, S.

rattus, S. macacae, S. downei y S. ferus. Se caracterizan por ser ? -hemolíticos o no

hemolíticos sobre agar sangre. Las colonias sobre agar con 5% de sacarosa son blancas y

ocasionalmente amarillas, ásperas y sueltas sobre la superficie del agar. Sobre agar MSA (mitis

salivarius-agar) y MSB (mitis-salivarius-bacitracina) aparecen elevadas, convexas

onduladas, opacas o de color azul oscuro, con márgenes irregulares, superficie granular, más o

menos adheridas y con una burbuja de color brillante rodeándolas cuando producen polisacáridos

extracelulares El aspecto de las colonias puede variar no solo entre las especies sino también

entre las cepas de la misma especie lo que dificulta su identificación.

S. mutans es agente etiológico de la caries por excelencia lo que implica que el substrato más

importante en su desarrollo es la sacarosa, a partir de la cual producen ácidos y sintetizan

polisacáridos extra e intracelulares. La especie mutans posee las enzimas: Glucosiltransferasas

(GTFs) y Fructosiltransferasas (FTFs) que le permiten sintetizar glucanos solubles e insolubles y

fructanos, además de polisacáridos intracelulares de reserva que pueden ser degradados por

dextranasas, frucatanasas y glucógeno fosforilasas. Coloniza especialmente las superficies duras

de la cavidad oral (esmalte o cemento), ya que presenta proteínas fijadoras de glucanos. A nivel

extraoral S. mutans está relacionado con endocarditis subaguda y raramente con otros procesos

patológicos. S sobrinus es la única especie del grupo que elabora Peróxido de Hidrógeno

(H2O2), produce glucanos solubles e insolubles pero no fructanos y posee dextranasas para

hidrolizar los glucanos. No sintetiza polisacáridos intracelulares y al igual que S. mutans posee

proteínas fijadoras de glucanos. Es capaz de inducir cua lquier tipo de caries en superficies lisas,

fosas y fisuras ínterproximales y cemento e interactuar en la progresión de las lesiones cariosas.

Fuera del ambiente oral su importancia patógena es dudosa salvo en endocardítis subaguda.

S. cricetus, es una especie poco frecuente en las placas dentales humanas. Aunque sintetiza los

dos tipos de glucanos y polisacáridos intracelulares su potencial de cariogenicidad humano es

escaso. Su origen y hábitat es la cavidad oral de ratas silvestres, hamsters y ocasionalmente

humanos.

S. rattus presenta colonias gomosas o ásperas que se encuentran abultadas sobre el agar con

contenido de sacarosa debido a la producción de polisacáridos extracelulares (glucanos). Tienen

su origen y hábitat en la cavidad oral de ratas y ocasionalmente en humanos.

S. ferus, S. downei y S. macacae raramente se aíslan de la cavidad oral humana y por el

contrario predomina en animales como monos y ratas.

1.2.1.3 Grupo mitis: Es constituido por las especies : S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S.

gordonii, S. parasanguis, S. crista y S. pneumoniae. Las cepas son ? -hemolíticas sobre agar

sangre y pueden tener un verde pronunciado en agar chocolate. No producen polisacáridos

extracelulares en agar con sacarosa y su hábitat y origen es la cavidad oral humana y faringe.

S. mitis en agar MSA (mitis-salivarius-agar) presenta colonias lisas, planas, de color azul con

una cúpula central y son poco adherentes al agar. Se han descrito dos biotipos basados en la

hidrólisis de la arginina, fermentación de rafinosa y melobiosa y producción de fosfatasa ácida,

glucosaminidasa y la incapacidad para producir proteasa IgA y sialidasa. No sintetizan fructanos

pero excepcionalmente produce glucanos solubles, insolubles y polisacáridos intracelulares. Su

poder cariógeno y de progresión de lesiones es dudoso, pero en la producción de endocardítis

subaguda se ha establecido claramente como agente etiológico.

S. oralis, es de las primeras especies que coloniza el diente. La síntesis de polisacáridos

extracelulares solubles tipo glucano es variable. Se ha señalado su potencial poder bacteriémico y

como productor de endocardítis.

S. sanguis presenta colonias que en agar MSA (mitis-salivarius-agar) aparecen elevadas, de

superficie y bordes lisos y fuertemente adheridas al agar. Se han descrito tres biotipos

caracterizados por la fermentación de rafinosa y amigdalina. No sintetiza polisacáridos

intracelulares ni extracelulares a excepción de glucanos solubles pero no posee dextranasas.

Es de los primeros colonizadores del diente y actúa como substrato para la adición de nuevas

bacterias y la maduración de la placa. Carece de atributos de cariogenicidad, y por el contrario

aparece implicado en endocarditis subagudas, infecciones de heridas y diversos tipos de abscesos

y procesos purulentos.

El llamado S. gordonii solo elabora polisacáridos extracelulares solubles tipo glucano y no

intracelulares. Forma parte de las placas coronales maduras, y fuera del ámbito oral, su

significado patógeno es similar a S. sanguis.

S. parasanguis, incluye cepas atípicas de estreptococos viridans procedentes de diversos

aislamientos (p. ej. faringe, orina y sangre). No produce polisacáridos extra ni intracelulares, y su

importancia a nivel oral no ha sido claramente determinada.

S. crista, se caracteriza por poseer un mechón fibrilar lateral íntimamente relacionado con

procesos de adhesión, agregación y coagregación bacteriana en la formación de placas maduras.

La producción de glucanos solubles es variable.

S. pneumoniae, genéticamente está próximo a algunas especies de Streptococcus viridans

aunque fenotípicamente no debe considerarse como perteneciente a estos. Carece de antígenos

de los grupos de Lancefield aunque posee la sustancia C. En condiciones de aerobiosis produce

? -hemólisis, mientras que en anaerobiosis puede ser ? -hemolítico. Su hábitat natural son las vías

respiratorias superiores, y está involucrado en la producción de neumonía, meningitis, otitis media,

sinusitis y conjuntivitis.

1.2.1.4 Grupo anginosus: Se encuentra formado por: S. anginosus, S. constellatus y

intermedius. La mayoría de las cepas producen ? -hemólisis o no hemólisis sobre agar sangre,

salvo algunas excepciones que producen ? -hemólisis. La diferencia en los resultados de

homología de ADN obtenida por diversos autores supone que deben ser consideradas como

especies diferentes. Tienen una distribución muy amplia (p. ej. nasofaringe, intestino, piel y tracto

respiratorio superior) lo que supone una patología muy diversa, aislándose de numerosos

procesos infecciosos como abscesos del sistema nervioso central, hígado, odontógenos,

infecciones genitales, septicemias y endocarditis. No producen polisacáridos extracelulares ni

intracelulares por lo que su importancia cariógena es muy dudosa al igual que la génesis de

periodontitis pese a que forman parte importante de la microbiota subgingival. 17 ,18 ,19

1.3 Streptococcus viridans Y CARIES DENTAL

17 WHILEY, R.A. Op. cit., p 195-216. 18 LIEBANA. Op. cit., p 233-238. 19 KILIAN, M., MIKKELSEN, L., HENRICHSEN, J..Taxonomic study of Viridans Streptococci : Description of Streptococcus gordonii sp. nov. and Emended Descriptions of Streptococcus sanguis (White and Niven1946), Streptococcus oralis (Bridge and Sneath 1982), and Streptococcus mitis (Andrews and Horder 1906). International Journal of Systematic Bacteriology. Oct. 1989. 471-484.

Desde hace mucho tiempo y gracias a las investigaciones realizadas en este campo se han

vinculado algunas de las especies de Estreptococos del grupo viridans con la generación de

caries. La caries ha sido considerada como una enfermedad infecciosa de origen multifactorial

que incluye la susceptibilidad del huésped, la dieta y los microorganismos cariogénicos ,

actualmente se ha incluido otro factor determinante: el tiempo, que permitió esclarecer de una

forma más precisa la formación de la caries dental. Suele desarrollarse en una serie de etapas que

finalizan con la destrucción de la pieza dentaria, y son en su orden las siguientes: 1. adhesión inicial

de los microorganismos al esmalte dental, 2. producción de ácidos (ácido láctico, acético,

propionico etc.) que llevan a la desmineralización del diente y 3. desarrollo de la lesión cariosa.

La sola presencia de los microorganismos cariogénicos no garantiza el progreso de la caries; es

por ello que se han considerado cuatro factores que permiten la consecución de la misma; a saber

son: el agente o microbiota oral, la dieta que actúa como un substrato, el diente o huésped y el

tiempo. Estudios realizados por Orland et al. confirman lo anterior, la caries dental no ocurre en

ausencia de microorganismos. Animales mantenidos en un medio libre de gérmenes no

desarrollaron caries aún cuando fueron alime ntados con dietas con exceso de carbohidratos. Sin

embargo, la caries se desarrollaba en los animales a los que se le inocularon microorganismos

procedentes de animales con caries activa y se les nutría con dietas cariógenas.20, 21

Los Estreptococos del grupo mutans son los principales implicados en la generación de caries, en

especial Streptococcus mutans serotipo c; estos microorganismos se encargan de

20 RODRIGUEZ, Adriana. Fisiopatología de la caries dental. Univers Odont. May 2000, 20 (Supl 1) : 21-27.

metabolizar la sacarosa proveniente de la dieta para producir ácidos y sintetizar polisacáridos

extra e intracelulares por la acción de dos enzimas Glucosiltransferasa (GTF) y fructosiltransferasa

(FTF), que escinden la molécula de sacarosa y polimerizan los monosacáridos transfiriendo

grupos glucosílicos y fructosílicos respectivamente, a aceptores de glucanos y fructanos

preexistentes. Estudios referentes a la adherencia de las bacterias a la superficie del diente

muestran interacciones iniciales entre los microorganismo y los substratos. Esto incluye las

superficies externas de ambos organismos y el substrato, que puede ser influenciado por el medio

en el cual esta suspendido, adicionalmente la influencia de la saliva como un fluido en el cual están

suspendidos estos componentes también debe ser considerada. Al compendio de todos estos

elementos provenientes de los microorganismos se les denomina “adhesinas”, mientras que a los

factores derivados del huésped se les conoce como “ligandos”.

Entre los ligandos del huésped se encuentran las células del epitelio bucal las cuales presentan en

su superfic ie ácido siálico que puede actuar con receptores a nivel bacteriano. De la misma forma

las fibras de colágeno, componentes estructurales del tejido conjuntivo, pueden actuar como

receptores para algunos grupos bacterianos como los Estreptococos. Sin embargo, el principal

grupo de receptores se encuentra en la saliva; estos son absorbidos a la mucosa bucal o a la

superficie del esmalte lo cual les permite influir en la adherencia bacteriana. Respecto a las

21 SEIF, Tomás. Cariología. Prevención, Diagnóstico y Tratamiento Contemporáneo de la caries dental

adhesinas bacterianas, se sabe que son lectinas, las cuales se unen a carbohidratos que funcionan

como receptores en la superficie dentaria. 22

Las bacterias que se aglutinan en la superficie del diente forman la llamada placa bacteriana o

biofilm, la cual se presenta como el hábitat perfecto para el desarrollo de estos microorganismos

y la producción de caries. La formación de la placa bacteriana se inicia con la producción de la

película adquirida, integrada por proteínas de origen salival y del fluido crevicular, por un proceso

de absorción altamente selectivo. Una vez formada la película adquirida se inicia la colonización

de los microorganismos residentes en la cavidad bucal a través de procesos de adhesión,

agregación y coagregación23

S. mutans no se encuentra en la cavidad oral antes de la erupción dentaria debido a que estos

microorganismos requieren la presencia de tejido duro no descamativo para su

colonización, pero investigaciones en este campo por Davery et. al. confirmaron que S. mutans

es transmitido oralmente de la madre al niño, y de la misma forma Junner y Liew demostraron la

relación existente entre el número de S. mutans presentes en las madres y en los menores. La

saliva parece ser el principal medio de transmisión entre madre e hijo y las investigaciones de

patrones de ADN comprobó la igualdad entre las bacterias de ambos grupos de estudio. No

sucedió lo mismo en los trabajos de Tappunni et. al. quien no aisló en ninguno de los niños en

etapa predental S. mutans y solo fue detectado en sujetos dentados; en contraste S. vestibularis

22 SEIF. Op. cit. p 39-43

se hallo en ambos grupos de niños, dentados y predentados pero no en adultos. Algunas

investigaciones actuales intentan evitar la transmisión de este microorganismo a los niños

reduciendo la concentración de los que se encuentran en la boca de la madre.24 , 25, 26, 27

23 DELGADO, Jorge Enrique. Placa bacteriana y caries dental . Univers Odont. May 2000, 20 (supl 1) : 28-32. 24 MACDONALD, Ralph. Dentistry for the Child and Adolescent. Mosby. St. Louis. Missuri. 1999. p 210-213.25 DEVERY, A.L.,y ROGERS, A.H. Multiple types of the bacterium Streptococcus mutans in the human mouth and their intrafamily transmission. Arch. Oral. Biol. 1984. 29 : 453-460. 26 BROWN, J.P., JUNNER, C., LIEW, V. A Study of Streptococcus Mutans levels in both infants with bottle caries and their mothers. Aus. Dent. J. 1985. 30 : 96-98. 27 TAPPUNI, A.R., CHALLACOMBE, S.J., Distribution and Isolation Frequency of Eight Streptococcal Species in Saliva from Predentate and Dentate Children and Adults. J. Dent. Res. 1993, 72 (1) : 31-36.

2. JUSTIFICACION

Existe en la literatura muy poca información respecto a las especies del grupo de Streptococcus

viridans que habitan en la cavidad oral de niños en etapa predental, así mismo de los factores que

intervienen en la adquisición inicial de estas bacterias; aunque se ha comprobado, basado en

estudios anteriores, que provienen de la saliva de sus madres, del contacto con otros individuos

así como con su medio ambiente, inclusive se a llegado ha hablar de una ventana de infectividad.

Por el contrario es bien conocida su relación con los procesos de generación de caries y

endocarditis en niños y adultos, observados con frecuencia en la mala higiene bucal y enfermedad

periodontal en estos pacientes.

A pesar de que se consideran patógenos de poca virulencia, son agentes etiológicos de diversos

procesos patológicos y pueden tener una importante trascendencia a nivel sanitario Es conocido

que diversos microorganismos de este grupo como Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis

y Streptococcus mutans, tienen la capacidad de producir glucanos extracelulares que actúan

como mediadores en los mecanismos de fijación y favorecen su establecimiento en diferentes

superficies como los dientes, y válvulas cardiacas. Otro aspecto relevante es la diferente

patogenicidad de estas especies; los neonatos son una de las poblaciones más susceptibles por el

hecho de no poseer un sistema inmunológico muy desarrollado, lo que implica que cualquiera de

estos microorganismos podría afectar su salud en el caso de que se produzca un cambio en su

hábitat natural, por ello es importante su identificación, así mismo el desarrollo de un esquema de

bioquímicas que permita su identificación en el laboratorio clínico.

Todo lo anterior conducirá a formular nuevas investigaciones que fortalezcan el conocimiento de

las especies del grupo de Streptococcus viridans en la cavidad oral de infantes en etapa

predental, además se podrán establecer datos sobre prevalencia e incidencia de los mismos.

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Identificar las especies pertenecientes al grupo de Streptococcus viridans presentes en la

cavidad oral de niños predentales entre los 0 y 6 meses de edad.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

? Determinar la frecuencia de las especies microbianas que conforman las 50 cepas de

Streptococcus viridans.

? Clasificar en grupos los Streptococcus viridans presentes en la cavidad oral de niños

predentales de 0 – 6 meses de edad.

? Realizar la descripción de las colonias de cada uno de los microorganismos identificados.

4. MATERIALES Y METODOS

4.1 TIPO DE INVESTIGACION

Descriptiva. Mediante este estudio se busca determinar las especies pertenecientes al grupo de

Streptococcus viridans que se hallan en la cavidad oral de un grupo de niños en edad predental

4.2 POBLACION

50 cepas de Streptococcus viridans, aislados previamente de 18 niños en el trabajo de grado

realizado por Sandra Paola Moreno Ch y Jazmín Rojas Martínez, “Caracterización de la

microflora oral en niños de 0 a 6 meses de edad”.

4.3 PROCEDENCIA DE LAS CEPAS DE Streptococcus viridans.

Las 50 cepas de Streptococcus viridans usadas en este estudio, fueron obtenidas de 18

muestras de niños en etapa predental de 0 – 6 meses de edad, los cuales se encontraban e

Hospital universitario San Ignacio y el Hospital La Granja. La recolección de dichas muestras fue

realizada por medio de un hisopado de la mucosa oral, las mejillas, el dorso de la lengua, el

paladar duro, el surco yugal y los rebordes alveolares edéntulos, de manera uniforme. Cada

hisopo se transportó en 5 ml de caldo Tripticasa soya y fue incubado durante 48 horas a 37 °C

para obtener un mayor número de microorganismos y permitir su recuperación.

Transcurrido este tiempo se procedió a hacer siembra masiva con el hisopo en agar sangre con sangre de cordero al 5% v/v y se incubó durante 48 horas a 37 °C en microareofilia.

A todas las colonias que allí se aislaron, se les realizó coloración de Gram (cocos Gram positivos en cadenas), prueba de catalasa (negativa) , coagulasa (negativa) y sensibilidad a optoquina (resistente). Posteriormente se sembraron en agar mitis salivarius para su crecimiento. Identificadas las cepas se almacenaron en viales rotulados a – 85 °C en caldo Tripticasa Soya con 3% de glicerol, en el Centro de Investigaciones odontológicas, de la Universidad Javeriana.

4.4 RECONSTITUCIÓN Y CONFIRMACIÓN DE LAS CEPAS COMO Streptococcus

viridans.

Al comenzar el trabajo practico fue necesario hacer una reconstitución de las cepas y

posteriormente una confirmación de que estas fueran Streptococcus viridans y que no se

encontraran contaminadas con ningún otro microorganismo.

Primero se procedió a descongelar las cepas a temperatura ambiente (21°C) durante 2 horas;

luego se tomaron aproximadamente 100 ? L de cada cepa y se inocularon en 2 ml de caldo

Tioglicolato (Oxoid) (Ver Anexo 1), se llevaron a incubación a 37 °C durante 72 horas en

ambiente de microaerofilia.

Cumplido este tiempo se les realizó coloración de Gram y siembra por aislamiento en agar base

sangre (Oxoid) (Ver Anexo 3) con sangre de cordero al 5% v/v, para recuperar las cepas si estas

se encontraban contaminadas con otro microorganismo. La incubación fue durante 48 horas a

37 °C en microaerofilia, la cual se suministro introduciendo las cajas en latas metálicas herméticas

y encendiendo una vela en su interior para luego taparlas.

A las colonias puras obtenidas en el agar Sangre se les determinó la hemólisis ? , ? o no hemólisis

a través de los cambios que presentaba el agar luego del crecimiento de los microorganismos. Si

el medio alrededor de las colonias era completamente transparente se identificó como hemólisis

beta, ya que se producía lisis completa de los eritrocitos que rodeaban las colonias con liberación

de la hemoglobina y eliminación total de la sangre del medio de cultivo; si la lisis de los eritrocitos

ocurría de manera incompleta el medio presentaba un cambio de color de rojo a gris-verdoso y

fue considerada como hemólisis alfa, y si el agar no presentaba ningún cambio eran no

hemolíticas.

Una vez identificadas las hemólisis se procedió a hacer coloración de Gram, para comprobar la

morfología, características tintoriales y clásicas de Streptococcus viridans; así mismo, se

realizaron pruebas de susceptibilidad a la optoquina (Ver Anexo 4) con discos de 0.05 U y

catalasa con peroxido de hidrógeno al 3% (Ver Anexo 5); como pruebas confirmatorias.

Una vez puras y confirmadas las cepas, se procedió a sembrarlas en agar Mitis Salivarius

(Difco)(Ver Anexo 6), para la descripción de las colonias.

4.5 IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS

La identificación de las 50 cepas se llevó a cabo según el esquema de identificación de Beigthon,

D. et al. 1998 (Ver Figura 1); el cual se basa en el empleo de pruebas metabólicas: producción

de ácidos a partir de carbohidratos ( manitol, trehalosa, rafinosa, inulina y lactosa ) por reacciones

de fermentación, la vía de Voges – Proskauer para la formación de acetoína, hidrólisis de arginina

y una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (resistenc ia a bacitracina ).

La primera prueba del esquema es la fermentación de manitol, entendiéndose por fermentación

como un proceso metabólico de oxidorreducción que tiene lugar en un medio anaerobio, en el

cual un sustrato orgánico es el aceptor final de hidrógeno (electrones) en lugar del oxigeno.28

Para la realización de estas pruebas, se utilizó caldo base rojo de fenol (Merck) (Ver Anexo 7)

con una concentración de azúcar al 1%.

La fermentación de manitol divide el diagrama de identificación en dos: Los microorganismos que

producen ácidos a partir de este azúcar, estreptococos del grupo mutans, a los cuales se les

realizo la prueba de resistencia a la bacitracina (Ver Anexo 8) que se hizo en cajas de petri con

22 ml de agar sangre con sangre de cordero al 5 % v/v y sensidisco de antibiótico ( bacitracina )

con una concentración de 0.05 U.

A los estreptococos pertenecientes a los grupos anginosus, mitis y sanguis, los cuales no

fermentan el manitol, se les hizo la prueba de Voges Proskauer o producción de acetoína (Ver

anexo 10).

28 KONEMAN, Elmerw. Op. cit., p 167

A todos los microorganismos resistentes a bacitracina y acetoína positivo y negativo se les realizó

la prueba de hidrólisis de arginina para la cual se empleo el medio descarboxilasa Moeller al que

se le adicionó una concentración al 1% del aminoácido (arginina) (Ver Anexo 9).

+S. rattus

+S. mutans

-S. sobrinus

-RAFINOSAINULINA

+A.D.H *

+S. cricetus

-S. ferus

+RAFINOSA

-S. downei

+ESCULINA

-S. macacae

-INULINA

+RESISTENCIA A BACITRACINA

+S. salivarius

+S. anginosus

-TREALOSALACTOSA

+RAFINOSA

+S. salivarius

-S. vestibularis

-RAFINOSA

+A.D.H.

+S. gordonii

+S. parasanguis

-S. crista

-S. sanguis

RAFINOSA

+INULINA

+S. pneumoniae

+S. oralis

-S. mitis

-RAFINOSA

-TREALOSA

-A.D.H.

-ACETOINA

( V.P.)

MANITOL

CEPA A IDENTIFICAR

Figura 1. Diagrama de flujo para la identificación de especies pertenecientes al grupo S treptococcus viridans * Streptococcus mutans normalmente es variable para la prueba de ADH ( arginina dehidrolasa ), en este caso se tomo como negativo según clasificación de Beighton, D. et al., la procedencia de muestra confirma que el microorganismos identificado es Streptococcus mutans y no Streptococcus rattus cuyo hábitat es la cavidad oral de ratas y no se ha encontrado en humanos

5. RESULTADOS

Los resultados obtenidos en el presente estudio provienen de 50 cepas aisladas de la cavidad oral

de 18 niños en edad predental cuyas edades oscilan entre los 0 y 6 meses. Los niños se

encontraban sanos y no presentaban ninguna patología al momento de la recolección de las

muestras.

Los resultado de las pruebas realizadas a las 50 cepas, y que permitieron la identificación de estas en especie y grupo, se encuentran en la tabla 3 en donde se identifica el tipo de hemólisis que presentaron, el número de la cepa y la especie a la que pertenecen. Se observó que pruebas como el ADH produce resultados variables para los Streptococcus mutans, mientras que para las especies mitis, oralis y sobrinus la prueba resulta negativa, además se pudo establecer que especies como S. sobrinus y S. anginosus presentaron hemólisis beta confirmando los estudios realizados por Beighton et. al..

Tabla 3. Resultados de las pruebas realizadas a las 50 cepas de Streptococcus viridans

Cepa

Hemólisis Manitol Bacitracina Acetoina

ADH Inulina Rafinosa Trealosa

Lactosa

1 ? Neg Neg Neg Neg Neg 2 ? Neg Pos Pos Neg Pos Pos 3 NO Pos R V Pos Pos 4 ? Neg Pos Pos Neg Pos Pos 5 ? Neg Neg Neg Neg Neg 6 NO Pos R V Pos Pos 7 NO Pos R V Pos Pos 8 ? Neg Pos Pos Neg Pos Pos 9 ? Pos R V Pos Pos

10 ? Pos R Neg Neg Neg 11 NO Neg Neg Neg Pos Neg 12 ? Pos R Neg Neg Neg 13 NO Pos R V Pos Pos 14 ? Neg Neg Neg Neg Neg 15 ? Neg Pos Pos Neg Pos P 16 ? Neg Neg Neg Neg Neg 17 ? Neg Pos Pos Neg Pos Pos 18 ? Neg Neg Neg Neg Neg 19 NO Pos R Neg Neg Neg 20 ? Neg Neg Neg Neg Neg 21 ? Neg Neg Neg Neg Neg 22 ? Neg Neg Neg Neg Neg 23 ? Neg Pos Pos Neg Pos Pos 24 ? Neg Neg Neg Neg Neg 25 ? Pos R V Pos Pos 26 ? Pos R V Pos Pos 27 ? Pos R V Pos Pos 28 ? Pos R V Pos Pos 29 ? Neg Pos Pos 30 ? Pos R V Pos Pos 31 ? Pos R V Pos Pos 32 NO Pos R V Pos Pos 33 ? Pos R Neg Neg Neg 34 ? Pos R Neg Neg Neg 35 ? Pos R V Pos Pos 36 ? Neg Neg Pos Neg Neg 37 ? Pos R Neg Neg Neg 38 ? Neg Pos Pos 39 ? Neg Pos Pos Neg Pos Pos

Cepa Hemólisis

Manitol Bacitracina Acetoina

ADH Inulina Rafinosa Trealosa

Lactosa

40 ? Pos R V Pos Pos 41 NO Pos R Neg Neg Neg 42 ? Pos R V 43 ? Pos R V Pos Pos 44 NO Neg Neg Neg Neg Neg 45 NO Neg Neg Neg Neg Neg 46 NO Neg Pos Pos Neg Pos Pos 47 NO Neg Neg Neg Neg Neg 48 NO Neg Pos Pos Neg Pos Pos 49 NO Pos R V Pos Pos 50 ? Pos R Neg Neg Neg

Una vez identificadas, se estableció el número de colonias y especies presentes en los 18 niños,

encontrándose que el niño número 3 fue quien presento la mayor cantidad de colonias (14) en el

cual predominó S. mutans (5), seguido por S. mitis (4) y S. anginosus (3). Es importante

observar también que cada uno de los niños no presentó una solo especie sino que en la cavidad

oral podían hallarse varias de estas. (Ver Tabla 4)

Tabla 4. Especies presentes en los 18 niños en edad predental

NIÑO

NÚMERO COLONIAS

S. mutans

S. mitis

S. anginosus

S. sobrinus

S. gordonii

S. crista

S. oralis

1 3 0 1 1 1 0 0 0 2 1 0 0 1 0 0 0 0 3 14 5 4 3 1 0 0 1 4 7 3 3 1 0 0 0 0 5 1 1 1 0 0 0 0 0 6 3 0 1 1 1 0 0 0 7 1 0 1 0 0 0 0 0 8 1 0 0 0 1 0 0 0 9 3 0 2 0 1 0 0 0 10 1 0 0 1 0 0 0 0 11 3 2 0 1 0 0 0 0 12 3 1 0 0 1 1 0 0 13 2 2 0 0 0 0 0 0 14 2 1 0 0 1 0 0 0 15 1 0 0 0 1 0 0 0 16 2 2 0 0 0 0 0 0 17 1 0 0 0 0 0 1 0 18 1 0 0 0 0 1 0 0

Se encontraron 17 cepas de S. mutans en 8 de los niños (44.4 %), 12 cepas de S. mitis en 6

niños (33.3%), 9 cepas de S. anginosus en 7 niños (38.8%); de S. sobrinus se aislaron 8 cepas

de 8 niños (44.4%); y en menor proporción fueron halladas las especies de S. gordonii (11.1%),

S. crista (5.5%), y S. oralis (5.5%). (Ver Tabla 5)

Tabla 5. Frecuencia de aparición de especies de S. viridans en los 18 niños y cantidad total de cepas encontradas

ESPECIES CEPAS n = 50

NIÑOS n = 18

%

S. mutans 17 8 44.4 S. mitis 12 6 33.3 S. anginosus 9 7 38.8 S. sobrinus 8 8 44.4 S. gordonii 2 2 11.1 S. crista 1 1 5.5 S. oralis 1 1 5.5

La frecuencia de aparición por grupo en los 18 niños fue: mutans con 25 cepas halladas en 16 niños (88.8%), en segundo lugar grupo mitis con 16 cepas en 10 niños (55.5%) y por último grupo anginosus con 9 cepas encontradas en 9 niños (50%). (Ver Tabla 6) Tabla 6. Frecuencia de aparición por grupos de S. viridans en los 18 niños

GRUPO CEPAS n = 50

NIÑOS n = 18

%

Mutans 25 16 88.8 Mitis 16 10 55.5 Anginosus 9 9 50

Se encontraron 17 cepas de Streptococcus mutans (34%), 12 cepas de Streptococcus mitis

(24%), 9 cepas de Streptococcus sanguis (18 %), 2 cepas de Streptococcus gordonii (2%) y

1 cepa de Steptococcus crista y oralis (2%). ( Ver Tabla 7 y Figura 2)

Tabla 7. Especies de Streptococcus viridans identificadas en las 50 cepas aisladas de

niños predentales .

ESPECIE CEPAS % S. mutans 17 34 S. mitis 12 24 S. anginosus 9 18 S. sobrinus 8 16 S. gordonii 2 4 S. crista 1 2 S. oralis 1 2

S. mitis24%

S. anginosus18%

S. oralis2%

S. gordonii4%

S. crista

S. sobrinus16%

S. mutans34%

Figura 2. Distribución de las especies de Streptococcus viridans aisladas de niños en etapa

predental

Los resultados obtenidos por grupo corresponden a un 50 % de aparición del grupo mutans, con

25 de los casos analizados, seguido por el grupo mitis con un 32 % (16 casos), y el grupo

sanguis con 18 %, que corresponde a 9 de las muestras (Ver Tabla 8).

Tabla 8. Agrupación de las especies identificadas

Los microorganismos más prevalentes en los 3 grupos de edades estudiados corresponden a:

Grupo número 1 (0 - 51 días, n = 24) en el cual la principal especie identificada correspondió a 7

cepas de Streptococcus mutans (29.1%), seguido por 6 cepas de Streptococcus mitis (25%),

4 cepas de Streptococcus anginusus (16.6%), igualmente 4 cepas de Streptococcus sobrinus

(16.6%), y en menor proporción se halló Streptococcus gordonii, oralis y crista, cada uno con

una cepa (4.1%), ( Ver Tabla 9).

En el grupo número dos (52 - 103 días, n = 15), se hallaron 5 cepas de Streptococcus mutans

(33.3%), 3 cepas de Streptococcus mitis (20%), 4 cepas de Streptococcus anginosus

(26.6%), 2 cepas de Streptococcus sobrinus (13.3%) y 1 cepa de Streptococcus gordonii

GRUPO CEPAS % mutans 25 50 mitis 16 32 anginosus 9 18

(6.6%); por el contrario en este grupo no fueron identificadas las especies Streptococcus crista

oralis (Ver Tabla 9).

En el último grupo (104 - 181 días, n = 11), se presentaron cinco cepas de Streptococcus

mutans (45.4% ), 3 cepas de Streptococcus mitis (27.2%), una cepa de Streptococcus

anginosus (9.0%) y dos de Streptococcus sobrinus (18.1%). Las especies de Streptococcus

gordonii, oralis y crista no se hallaron ( Ver Tabla 9)

Tabla 9. Especies de Streptococcus viridans en los 3 grupos de edades.

ESPECIE 0 – 51 DÍAS n = 24

52 – 103 DÍAS n = 15

104 – 181 DÍAS n = 11

S. mutans 7 29.1% 5 33.3% 5 45.4% S. mitis 6 25.0% 3 20.0% 3 27.2% S. anginosus 4 16.6% 4 26.6% 1 9.0% S. sobrinus 4 16.6% 2 13.3% 2 18.1% S. gordonii 1 4.1% 1 6.6% 0 0% S. crista 1 4.1% 0 0% 0 0% S. oralis 1 4.1% 0 0% 0 0%

Se halló un alto porcentaje de las especies S. mutans y S. mitis en los 3 grupos de edades

estudiados y en menor proporción fueron encontradas las especies S. anginosus, S. sobrinus, S.

crista y S. oralis (Ver Figura 3).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 - 51 52 - 103 104 - 181

Grupo de edades ( días )

Núm

ero

de c

epas

iden

tific

adas

S. mutans

S. mitis

S. anginosus

S. sobrinus

S. gordonii

S. crista

S. oralis

29.1%

25%

16.6%

4.1%

33.3%

20%

26.6%

13.3%

6.6%

45.4%

27.2%

9%

18.1%

Figura 3. Especies de Streptococcus viridans aisladas en los 3 grupos de edades .

El crecimiento de los microorganismos en agar Mitis -Salivarius permitió hacer la descripción de cada una de las colonias, obteniendo las principales características morfológicas de las especies. COLONIA S. mutans De la 17 cepas que se identificaron como Streptococcus mutans, 6 ( 35.2%) presentaron colonias elevadas, circulares, convexas, onduladas de color azul, márgenes irregulares y burbuja brillante rodeándolas cuando producían polisacáridos extracelulares. Las 11 cepas restantes ( 64.7%) tuvieron la misma morfología pero no la burbuja brillante. (ver Figura 4)

Figura 4 . Colonias Streptococcus mutans.

COLONIA S. sobrinus Forma circular, borde entero, elevación plana y superficie lisa brillante; fue la descripción de 7 de las colonias ( 87.5% ) que se identificaron como Streptococcus sobrinus. El 12.5% presentó forma irregular, borde ondulado, y superficie plana rugosa. (Ver Figura 5)

Figura 5. Colonias Streptococcus sobrinus

COLONIA S. mitis El 100% de las 12 cepas identificadas como Streptococcus mitis presentaron colonias puntiformes, borde ondulado, de color azul con cúpula central, mucoides, poco adherentes al agar. Las colonias jóvenes no presentaron la cúpula central. (Ver Figura 6)

Figura 6 . Colonias Streptococcus mitis

COLONIA S. Gordónii Las 2 cepas identificadas ( 100% ) fueron puntiformes, elevadas, de borde entero y de superficie rugosa. (Ver Figura 7)

Figura 7. Colonias Streptococcus gordonii

COLONIA S. oralis La colonia ( 100 % ) que se identifico como S. oralis presentó forma circular, borde entero, elevada, superficie lisa y sueltas en el medio. (Ver Figura 8)

Figura 8. Colonias Streptococcus oralis COLONIA S. crista La colonia de Streptococcus crista ( 100% ) presentó forma irregular borde ondulado, elevada, dura y fuertemente adheridas al medio.

Figura 9. Colonia Streptococcus crista

COLONIA S. anginosus Las 9 cepas ( 100% ) identificadas como S. anginosus presentaron colonias de forma circular, borde entero, de superficie lisa brillante y sueltas en el medio. (Ver Figura 10)

Figura 10. Colonias Streptococcus anginosus

En la tabla 10 se agrupa la descripción de las colonias de cada una de las 50 cepas identificadas Tabla 10. Descripción de las colonias de 50 cepas aisladas de 18 niños predentales.

CEPA ESPECIE DESCRIPCION DE COLONIAS ( AGAR MITIS-SALIVARIUS ) 1 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 2 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 3 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas, de color azul oscuro, márgenes irregulares burbuja

brillante. 4 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 5 S. mitis Forma : puntiforme, Borde : entero, Elevación : umbilicada, Superficie : rugosa, mucoides y

sueltas en el medio. 6 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.7 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.8 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 9 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.10 S. sobrinus Forma: irregular, Borde: ondulado, plana, Superficie: rugosa. 11 S. oralis Puntiforme, borde: entero, elevada, superficie lisa y sueltas en el medio. 12 S. sobrinus Forma: irregular, Borde: ondulado, plana, Superficie: rugosa. 13 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas, de color azul oscuro, márgenes irregulares

brillante. 14 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 15 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 16 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 17 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 18 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 19 S. sobrinus Forma: irregular, Borde: ondulado, plana, Superficie: rugosa. 20 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 21 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 22 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 23 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 24 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 25 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.26 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.27 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas, de color azul oscuro, márgenes irregulares burbuja

brillante. 28 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.29 S. gordonii Puntiforme, Borde: entero, elevadas y superficie: rugosa. 30 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas, de color azul oscuro, márgenes irregulares burbuja

brillante. 31 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.32 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.33 S. sobrinus Forma: irregular, Borde: ondulado, plana, Superficie: rugosa. 34 S. sobrinus Forma: irregular, Borde: ondulado, plana, Superficie: rugosa. 35 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas, de color azul oscuro, márgenes irregulares burbuja

brillante. 36 S. crista Irregular, borde ondulado, elevada, duras y fuertemente adheridas al medio. 37 S. sobrinus Forma: irregular, Borde: ondulado, plana, Superficie: rugosa. 38 S. gordonii Puntiforme, Borde: entero, elevadas y superficie: rugosa. 39 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 40 S. mutans Forma : circular, Borde : entero, Elevación : elevada, Superficie : granular, mucoides.41 S. sobrinus Forma: irregular, Borde: ondulado, plana, Superficie: rugosa. 42 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.43 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.44 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 45 S mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 46 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 47 S. mitis Puntiforme, borde: ondulado, elevada con cúpula central, mucoides, de color azul y poco

adherentes al agar. 48 S. anginosus Circular, borde entero, plana, superficie lisa brillante y sueltas en el medio. 49 S. mutans Circular, elevada, convexas, onduladas de color azul oscuro, márgenes irregulares.50 S. sobrinus Circular, borde: entero, plana, superficie: lisa brillante.

6. DISCUSION

Estreptococos alfa y no hemolíticos son las principales especies involucradas en la colonización de

la boca humana y comprenden la mayor parte de la microbiota comensal que se localiza en la

cavidad oral y faringe. Estos microorganismos se han asociado fuertemente con la caries dental y

el desarrollo de varios casos de endocarditis bacteriana subaguda.

En el presente estudio fueron empleadas una serie de pruebas bioquímicas (Ver Figura 1) que

permitieron identificar las especies de estreptococos pertenecientes al grupo viridans en la

cavidad oral de niños predentales, lo cual permitió demostrar el incremento en la diversidad de

estreptococos orales presentes en la boca de los infantes durante los primeros días de vida, y que

a medida que se incrementaba la edad de los niños disminuía el número de especies pero

aumentaba el número de microorganismos, además se obtuvo como promedio por niño 2.7

cepas, aunque esta cifra no es representativa puesto que existen extremos en la cantidad de

microorganismos halladas por niño alejándose de la media.

Por otra parte la morfología de las colonias identificadas no tuvo las mismas características entre

especies ni por grupos, aunque por especie se presentó mayor uniformidad, lo cual implica que

este no sea un medio útil para la identificación de estos microorganismos.

La identificación de Streptococcus viridans se ha dificultado a través de los años debido a la

falta de uniformidad en las características de las colonias y reacciones bioquímicas de estas

especies, además de la existencia de diferentes nomenclaturas y esquemas de clasificación que se

contradicen. Los análisis por medio de técnicas moleculares, genotípicas y baterías ampliadas de

pruebas fenotípicas ha alterado considerablemente la taxonomía de estos microorganismos.

Inicialmente el método convencional de identificación consistía en la realización de una batería de

pruebas fisiológicas y de fermentación de hidratos de carbono; sin embargo la falta de

actualización respecto a la incorporación de nuevas especies generó un cambio en los esquemas

los cuales, sin embargo, continuaron con la utilización de pruebas de producción de ácido a partir

de carbohidratos más una batería de sustratos marcados con 4-metilumbeliferilo para la

determinación rápida de enzimas glucosídicas.

En nuestro trabajo se emplearon en su mayoría pruebas de fermentación que son fáciles y

permiten un reconocimiento rápido de la actividad metabólica de los microorganismos, así, se

utilizó en primera instancia el manitol, que permitió separar en dos grupos las cepas estudiadas, un

grupo de aquellos microorganismos capaces de generar ácido a partir de el, como los

estreptococos del grupo mutans, y aquellos incapaces de hacerlo como los estreptococos de los

grupos mitis, anginosus y salivarius; después de esta primera clasificación se hicieron pruebas

de resistencia a bacitracina y arginina dehidrolasa, acompañadas de otras pruebas de

fermentación de carbohidratos como inulina, trehalosa, rafinosa, y lactosa, que establecieron la

presencia de S. mutans y S. sobrinus; además se realizó prueba de acetoína (VP) que detectó

estreptococos de los grupos mitis y anginosus.

Aunque el esquema de identificación está conformado por pruebas bioquímicas que son sencillas

y de fácil preparación e interpretación, existen muchas cepas que se apartan de los resultados

previamente establecidos, y por otra parte, gracias a las técnicas moleculares además de las

especies comunes de cada grupo se han podido reconocer biotipos de cada una, que son muy

difíciles de identificar por sus similitudes, con solo pruebas bioquímicas, lo cual condiciona al

investigador a realizar pruebas adicionales que sean más especificas.

Dos esquemas bioquímicos han sido los más aceptados a través de estos años y corresponden a

los emitidos por Kilian et al. en 1989 y el de Beighton D. et al. en el año 1991, basados

principalmente en pruebas de hidrólisis y fermentación. El primero describe cuatro biotipos para

S. sanguis, 3 biotipos de S. gordonii y dos biotipos de S. mitis ; por el contrario el esquema

propuesto por Beighton D. et al. divide a S. sanguis en tan solo tres biotipos y no incluye división

alguna para S. gordonii y S. mitis , además incluye cinco especies adicionales que no son

descritas por el esquema de Killian et al. 29, 30

29 KILIAN, M. Op. cit., p 31-36. 30 BEIGHTON, D. Op. cit., p 367-372.

Los resultados de este estudio encontraron que la especie predominante en la 50 cepas

analizadas fue el S. mutans (34%) hallado en 17 cepas (8 niños 44.4%); este microorganismo no

es común encontrarlo en la cavidad oral antes de la erupción dentaria, debido a que requiere la

presencia de tejido no descamativo para su asentamiento y colonización. La principal fuente de

adquisición y transmisión de esta bacteria en estos

niños, es a partir de la saliva de sus madres, lo cual ha sido demostrado en estudios preliminares

donde se halló un patrón idéntico de ADN cromosomal en las bacterias de los niños y las de sus

madres. Adicionalmente un trabajo realizado por Kohler et al. demostró que reduciendo el

número de S. mutans en las madres disminuía notablemente la colonización de estos

microorganismos en la boca de los bebés, previendo de la misma forma el desarrollo de caries a

una temprana edad.31, 32

Conjuntamente aunque en menor proporción, otra especie perteneciente al grupo mutans,

sobrinus se halló en 8 cepas (16 %) provenientes de 8 niños (44.4%), el hábitat principal de este

microorganismo es la superficie de los dientes y las lesiones cariosas, y al igual que el S. mutans

no es común encontrarlo antes de la aparición de los dientes, lo cual demuestra que las madres o

las personas que comparten con el infante son el factor principal de su transmisión. Un estudio

anterior realizado por Matte et al. en 1992 reveló la prevalencia de estreptococos del grupo

31 KULKAINI, G., CHAN, K., SANDHAM, H. Investigation into the use of restriction endonuclease analysis for the study of transmission of mutans streptococci. J. Med. Res. 1989. 687 : 1155-1161.

mutans en niños ; donde la única especie detectada fue el S. mutans y no hallaron S. sobrinus,

cual condujo a los autores a pensar que su ausencia se asociaba al bajo nivel del consumo de

sacarosa en la población estudiada, pues ya habían demostrado que la ingesta de sacarosa con la

dieta es fundamental para su implantación, mientras que S. mutans no requiere de este

carbohidrato, aunque facilita la colonización. Lo anterior demuestra que la presencia de este

microorganismo en la cavidad oral de los niños en estudio no se debe únicamente a la transmisión

por parte de la madre sino también al tipo de alimentación que recibe.33

En segundo lugar y con un porcentaje del 24 % (12 cepas provenientes de 6 niños 33.3%)

mitis fue uno de los microorganismos más prevalente en las 50 cepas; junto a el otras especies

del grupo mitis integrados por S. gordonii identificado en 2 cepas (4%) aisladas de 2 niños

(11.1%), S. crista se encontró en una cepa (2%) aislada de 1 niño (5.5%), y S. oralis

identificado también en una cepa (2%) proveniente de 1 niño (5.5%) fueron encontradas. Su

hábitat natural es la cavidad oral humana y faringe. Un trabajo previo realizado por Tappuni et al.

en 1993 demostró lo anterior, su estudio incluyó sujetos adultos y niños predentales y dentados

en los cuales la especie predominante fue S. mitis el cual es encontrado abundantemente en saliva

y el dorso de la lengua, pero no fue hallado S. gordonii ni S. crista. Por el contrario S. oralis que

en el estudio de Tappuni et al. fue hallado en gran porcentaje en el grupo de adultos y niños

32 KOHLER, B. The effect of caries -preventive measures in mothers on dental caries and the oral presence of bacteria Streptococcus mutans and lactobacilli in their children. Arc. Oral. Biol. 1984. 29 (11) : 879-883.

dentados, en nuestro estudio tuvo baja prevalencia ya que es de las primeras especie que

coloniza el diente y requiere de su superficie para implantarse y el trabajo no contaba con

pacientes dentados, y tal vez podía tratarse de una especie transeúnte.34

S. anginosus fue el tercer microorganismo aislado con mayor frecuencia confirmado en 9 cepas

(18 %) provenientes de 7 niños (38.8%). Esta especie se halla comúnmente en la cavidad oral

humana, tracto respiratorio superior y vagina. No se ha vinculado con generación de caries pero

si se han aislado de varios procesos infecciosos incluidos los genitales, no es común hallarlo en la

cavidad oral de niños predentales, lo cual indica que puede provenir del tracto genitourinario de la

madre y se implanta en la boca del recién nacido en el momento que atraviesa el canal de parto,

lo cual fue demostrado anteriormente en el trabajo realizado por Pearce et. al. en donde estos

microorganismos fueron hallados en la cavidad oral de los niños entre los 1 y 3 días de nacidos

hasta el mes de edad, a partir de la cual no era común hallarlos.35

33 MATEE, M., MIKX, F., MASELLE, S. Mutans streptococci and lactobacilli in breast-fed children with rampant caries. Caries. Res. 1992. 28 (3) : 183-187. 34 TAPPUNI, A.R. Op. cit. p 31-36. 35 PEARCE, C., BOWDEN, G.H. Identification of pioneer viridans streptococci in the oral cavity of human neonates.Med. Microbiol. 1995, 42: 67-72.

7. CONCLUSIONES

? Las especies encontradas con mayor frecuencia en los niños fueron Streptococcus mutans

(44.4%) y Streptococcus sobrinus (44.4%).

? El grupo encontrado con mayor frecuencia en los 18 niños fue: el grupo mutans (88.8%).

? Las principales especies identificadas en las 50 cepas aisladas de 18 niños fueron:

Streptococcus mutans (34%), Streptococcus mitis (24%), Streptococcus anginosus (18%)

y Streptococcus sobrinus (16%).

? Los grupos que predominaron en las 50 cepas estudiadas fueron en su orden el grupo

mutans (50%), grupo mitis (32%) y el grupo anginosus (18%).

? El mayor número de cepas de Streptococcus viridans fue encontrado en el grupo etareo 0

51 días ( 24 cepas ).

? A medida que aumenta la edad de los niños disminuye la variabilidad y cantidad de

Streptococcus viridans.

? La morfología de las colonias no presentó las mismas características entre especies, ni por

grupos, aunque por especies hay mayor uniformidad.

8. RECOMENDACIONES

? Formular nuevas investigaciones que fortalezcan el conocimiento de Estreptococos del grupo

viridans en la cavidad oral de infantes en etapa predental, que permitan establecer datos sobre

prevalencia e incidencia de los mismos.

? Realizar investigaciones que permitan identificar la procedencia de Streptococcus viridans

presentes en la boca del bebé.

? Desarrollar medios de cultivo que sean más selectivos para los Streptococcus viridans

como pruebas bioquímicas que permitan identificar especies y subespecies de los mismos.

BIBLIOGRAFIA

ANDERS, Thylstrup. Caries. Ediciones Doyma. Barcelona, España. 1988. p 40.

BEIGHTON, D., HARDIE, J.M., WHILEY, R.A. A Scheme for the Identification of Viridans

Streptococci. J. Med. Microbiol. 1991, 35 : 367-372.

BROWN, J.P., JUNNER, C., LIEW, V. A Study of Streptococcus Mutans levels in both infants

with bottle caries and their mothers. Aus. Dent. J. 1985. 30 : 96-98.

BURNET, George. Microbiología Oral y Enfermedad Infecciosa. Editorial Medica

Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 1982. p 228 y 229.

CAUFIELD, P.W., CUTTER, G.R., DASANAYAKE, A.P.. Initial Acquisition of Mutans

Streptococci by Infants : Evidence for a Discrete Window of Infectivity. J. Dent. Res. 1993, 72

(1) : 37-45.

DE FIGUEIREDO, Luiz Reynaldo. Odontología para el Bebé. Actualidades Médico

Odontológicas Latinoamérica. Sao Paulo, Brasil. 2000. p 95-97.

DELGADO, Jorge Enrique. Placa bacteriana y caries dental. Univers Odont. May 2000, 20 (supl

1) : 28-32.

DEVERY, A.L.,y ROGERS, A.H. Multiple types of the bacterium Streptococcus mutans in the

human mouth and their intrafamily transmission. Arch. Oral. Biol. 1984. 29 : 453-460.

DOUGLAS, C.W., HEAT, J., HAMPTON, K.K.. Identity of Viridans Streptococci isolated

from cases of Infective Endocarditis. J. Med. Microbiol. 1993, 39 : 179-182.

ESCOBAR, Miryam. Microbiología de la Cavidad Oral. Centro Editorial Javeriano CEJA.

Bogotá, Colombia. 1999. p. 57-59, 95-99, 120-123.

FERNANDEZ DE VEGA, Fernando. Aspectos Microbiológicos de los Estreptococos del

grupo Viridans. Control de Calidad SEIMC. Servicio de Microbiología. www : / :monografías.

google. com.

HEGDE, S., MUNSHI, A.K., Influence of the maternal vaginal microbiota on the oral microbiota

of the newborn. The Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 1998, 22 (4) : 317-321.

KILIAN, M., MIKKELSEN, L., HENRICHSEN, J.. Taxonomic study of Viridans

Streptococci : Description of Streptococcus gordonii sp. nov. and Emended Descriptions of

Streptococcus sanguis (White and Niven 1946), Streptococcus oralis (Bridge and Sneath

1982), and Streptococcus mitis (Andrews and Horder 1906). International Journal of Systematic

Bacteriology. Oct. 1989. 471-484.

KOHLER, B. The effect of caries-preventive measures in mothers on dental caries and the oral

presence of bacteria Streptococcus mutans and lactobacilli in their children. Arc. Oral. Biol.

1984. 29 (11) : 879-883.

KONEMAN, Elmer. Diagnóstico Microbiológico. Editorial Médica Panamericana. Madrid,

España. 1992. p 564-565.

KULKAINI, G., CHAN, K., SANDHAM, H. Investigation into the use of restriction

endonuclease analysis for the study of transmission of mutans streptococci. J. Med. Res. 1989.

687 : 1155-1161.

LIEBANA. Jorge. Microbiología Oral. McGraw-Hill Interamericana. México. 1997. p 199-205.

LOESCHE, Walter. Association of the oral flora with important medical diseases. Current

Opinion in Periodontology. 1997, 4 : 21-28.

MACDONALD, Ralph. Dentistry for the Child and Adolescent. Mosby. St. Louis. Missuri.

1999. p 210-213.

MATEE, M., MIKX, F., MASELLE, S. Mutans streptococci and lactobacilli in breast-

children with rampant caries. Caries. Res. 1992. 28 (3) : 183-187.

NOLTE, William A.Microbiología Odontológica. Editorial Interamericana. México. 1986. p 188.

PEARCE, CH., BOWDEN, G.H., EVANS, M.. Identification of pioneer Viridans Streptococci

in the oral cavity of human neonates. J. Med. Microbiol. 1995, 42 : 67-72.

PEARCE, E., SISSONS, C. On cariogenicity of lactose. New Zel. Dent. Res. 1987. 83 (372)

32-36.

SEIF, Tomás. Cariología. Prevención, Diagnóstico y Tratamiento Contemporáneo de la caries

dental. Actividades Medico Odontológicas Latinoamérica. C.A. Colombia. 1997. p 37-53.

SMIT, D.J., ANDERSON, J.M., KING, Van Houte. Oral streptococcal colonization of infants

Oral Microbiol Inmunol. 1993, 8 : 1-4.

TAPPUNI, A.R., CHALLACOMBE, S.J., Distribution and Isolation Frequency of Eight

Streptococcal Species in Saliva from Predentate and Dentate Children and Adults. J. Dent. Res.

1993, 72 (1) : 31-36.

RODRIGUEZ, Adriana. Fisiopatología de la caries dental. Univers Odont. May 2000, 20 (Supl

1) : 21-27.

WHILEY, R.A., BEIGHTON, D.. Current classification of the oral streptococci. Oral. Microbiol.

Inmunol. 1998, 13 : 195-216.

Anexo 1. Caldo Tioglicolato (Oxoid)

COMPOSICION

Formula g/L

L-cistina 0.5

Cloruro de Sodio 2.5

Dextrosa 5.5

Extracto de Levadura 5.0

Digerido Pancreático de Caseína 15.0

Tioglicolato de Sodio 0.5

pH 7.1 ? 0.2

INSTRUCCIONES

Se suspenden 29 gramos en un litro de agua destilada y se hierve has disolver el medio por

completo. Se distribuye en tubos o frascos y se esteriliza en el autoclave a 121 ?C durante 15

minutos.

DESCRIPCION

Esta ideado para las pruebas de esterilidad de ciertos productos biológicos que sean turbios o

que, de otra manera, no se presten fácilmente al cultivo en el medio líquido de Tioglicolato a causa

de su viscosidad.

CONDICIONES DE CONSERVACION Y TIEMPO DE VIDA

Conservar el medio deshidratado a menos de 25 ?C y utilizarlo ante de la fecha de caducidad

expresada en la etiqueta.

No se recomienda la conservación del medio preparado, si bien el medio preparado se puede

conservar a 20-30 ?C en la oscuridad. La conservación a temperatura inferior aumenta la

absorción del oxígeno.

CONTROL DE CALIDAD

? Control Positivo : Candida albicans

Bacteroides fragilis

? Control Negativo : Medio sin sembrar

ADVERTENCIA

Este medio carece de agar y de indicador reductor, por lo que es esencial que el medio se

prepare y use dentro de las cuatro horas de preparación. El medio de Tioglicolato no debe

recalentarse más de una vez puesto que se forman radicales tóxicos de oxígeno.

(UNIPATH LIMITED. Manual OXOID. Unipath España. 1995. p 62)

Anexo 2. Agar Tripticasa Soya (Oxoid)

Medio general utilizado para el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos

COMPOSICION

Formula g/L

Triptona 15.0

Peptona de Soja 5.0

Cloruro de Sodio 5.0

Agar 15.0

pH 7.3 ? 0.2

INSTRUCCIONES

Se suspenden 40 gramos en un litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por

completo. Se esteriliza en el autoclave a 121 ?C durante 15 minutos.

DESCRIPCION

Se trata de un medio de agar para uso general. Contiene dos peptonas, las cuales favorecen el

crecimiento de una amplia variedad de microorganismos. Es idóneo para el cultivo, tanto de

aerobios como de anaerobios, creciendo los últimos bien en cultivos en profundidad o bien en

incubación bajo condiciones anaeróbicas.

Puesto que el agar de Triptona-soja no contiene hidratos de carbono, puede utilizarse con sangre

en la determinación simultánea de la hemólisis.

CONDICIONES DE CONSERVACION Y TIEMPO DE VIDA

Conservar el medio deshidratado a menos de 25 ?C y utilizarlo antes de la fecha de caducidad

expresado en la etiqueta.

CONTROL DE CALIDAD

? Control Positivo : Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

? Control Negativo : Medio sin sembrar.

(UNIPATH LIMITED. Manual OXOID. Unipath España. 1995. p 243)

Anexo 3. Agar base sangre (Oxoid)

Medio general no selectivo, que se puede enriquecer con sangre o suero.

COMPOSICION

Formula g/L

Polvo “Lab-Lemco” 10.0

Peptona 10.0

Cloruro sódico 5.0

Agar 15.0

pH 7.3 ? 0.2

INSTRUCCIONES

Se suspenden 40 gramos en 1 litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por

completo. Se esteriliza en autoclave a 121 ?C, durante 15 minutos.

Para el agar sangre , se enfría la base a 50 ?C, y se añade 7 % de sangre de Cordero

desfibrinada SR50. Se mezcla con una rotación suave y se vierte en placas de petri u otros

recipientes.

DESCRIPCION

La base de Agar Sangre Oxoid es un medio no selectivo para fines generales, ampliamente

utilizado para el crecimiento de bacterias patógenas y no patógenas :

? Con sangre, el medio no solamente es enriquecido, sino que se hace adecuado para la

determinación de las reacciones hemolíticas típicas, que son criterios diagnósticos importante para

estreptococos, estafilococos y otros microorganismos. Para agar sangre se debe añadir sangre

estéril al 7% al medio esterilizado y enfriado a 45-50 ?C.

CONDICIONES DE CONSERVACION Y TIEMPO DE VIDA

El medio deshidratado debe conservarse a temperatura inferior a 25 ?C, y ser utilizado antes de la

fecha de caducidad señalada en la etiqueta. Conservar las placas preparadas a 2-8 ?C.

(UNIPATH LIMITED. Manual OXOID. Unipath España. 1995. p 262)

Anexo 4. Prueba de resistencia a Optoquina

PRINCIPIO

El Clorhidrato de etildihidrocupreína (Optoquina), un derivado de la quinina, inhibe en forma

selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae a muy bajas concentraciones (5

microgramos/mL o menores). Así mismo, la Optoquina puede inhibir otros estreptococos del

grupo viridans, pero solo a concentraciones mucho más altas. La prueba tiene una sensibilidad

de más del 95 %.

MEDIOS Y REACTIVOS

1. Colonias bien aisladas en agar sangre de carnero del microorganismo a probar

2. Placa de agar sangre de carnero.

3. Discos de Optoquina (5 microgramos)

4. Los discos deben conservarse a 4 ?C mientras no se utilizan.

CONTROL DE CALIDAD

? Control Positivo : Streptococcus pneumoniae

? Control Negativo : Estreptococos del grupo viridans

PROCEDIMIENTO

a. Mediante un asa de argolla o una recta, seleccionar 3 ó 4 colonias bien aisladas del mismo

microorganismo a probar y estriarlas en una mitad a un tercio de la placa de agar sangre.

b. Colocar un disco de Optoquina en el tercio superior del área sembrada, presionar el disco con

pinzas flameadas de tal forma que el disco se adhiera con firmeza a la superficie del agar.

c. Incubar la placa a 35 ?C durante 18 a 24 horas en jarra con vela (5 % de CO2).

INTERPRETACION

Un halo de 14 mm o más alrededor del disco de 6 mm indica sensibilidad a la optoquina e

identifica al microorganismo como un neumococo. Si el halo es más pequeño de 14 mm, debe

efectuarse una prueba de identificación alternativa como solubilidad en bilis, debido a que algunos

Streptococcus viridans pueden mostrar pequeños halos de inhibición. Streptococcus viridans

los del grupo D son en general resistentes a la Optoquina.

(PETRICK, K. Manual de Microbiología 2000. Merck KGaA. p 224)

Anexo 5. Catalasa

PRINCIPIO

La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua (H2O) y

oxígeno (O2). Excepto los Estreptococos, la mayor parte de las bacterias aerobia s y anaerobias

facultativas poseen actividad catalasa entre ellos se encuentran los Estafilococos.

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales de oxidación del

metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule, resulta letal para

las células bacterianas. La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno según la

siguiente reacción :

2H2 O2 ? 2H2O + O2

REACTIVOS

? Peróxido de hidrógeno al 3 %.

? Cultivo de 18 a 24 horas del microorganismo a probar.

CONTROL DE CALIDAD

? Control Positivo : Staphylococcus aureus

? Control Negativo : Streptococcus

PROCEDIMIENTO

Agregar una gota de solución de peróxido de hidrógeno al 3 % sobre una lámina y sobre esta

solución vertir una pequeña cantidad de la bacteria en crecimiento con un palillo de madera, y

observar la formación de burbujas.

INTERPRETACION

La aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una reacción positiva.

Debido a que algunas bacterias poseen enzimas distintas de la catalasa que pueden descomponer

el peróxido de hidrógeno, la observación de unas pocas burbujas pequeñas después de 20 a 30

segundos no se considera un resultado positivo. Además, los eritrocitos poseen catalasa, por lo

cual debe tenerse cuidado de no tomar eritrocitos junto con el material de colonia.

(PETRICK, K. Manual de Microbiología 2000. Merck KGaA. p 21)

Anexo 6. Agar mitis Salivarius (Difco)

Base para usar con la solución de Chapman de Telurito en el aislamiento de Streptococcus mitis,

salivarius, y enterococos.

DESCRIPCION

Como medio poco selectivo puede usarse MSA (mitis-salivarius-agar) que contiene un 5 por

ciento de sacarosa y como sustancia inhibidoras, Telurito Potásico, Azul Tripán y Cristal Violeta.

Como medio más selectivo, el usado habitulamente es MSB (mitis-salivarius-Bacitracina), que

es MSA al que se añade 0.2 U/mL de bacitracina y !5 gramos más de sacarosa por ciento. Este

medio está considerado, por algunos autores, como un inhibidor del serotipo a (S. cricetus

pese a que esta especie es muy poco frecuente en la cavidad oral humana, se han desarrollado

otros medios de cultivo que no tienen este hipotético inconveniente como es el caso del agar

TYCSB (con tripticasa, extracto de levadura, cisteína, sacarosa y bacitracina).

PREPARACION

Suspender 90 gramos de polvo en un litro de agua purificada. Mezclar bien y calentar agitando

frecuentemente, hervir durante 1 minuto hasta disolver completamente el polvo. Autoclavar a 121

?C por 15 minutos. Enfriar a temperatura de 50-55 ?C y agregar 1 mL de solución de Telurito de

Chapman.

COMPOSICION

Formula g/L

Digerido Pancreático de Caseína 6.0

Peptona de Proteasa No 3 9.0

Peptona de Proteasa 5.0

Dextrosa 1.0

Sacarosa 50.0

Fosfato Dipotásico 4.0

Azul Trípano 0.075

Cristal Violeta 0.008

Agar 15.0

pH 7.0 ? 0.2

(DIFCO LABORATORIOS. Becton Dickinson. Microbiology Systems p 92)

Anexo 7. Caldo base rojo de fenol. (Oxoid)

Medio de cultivo de ensayo para la identificación bioquímica con la serie color, mediante la

adic ión de sustancia reaccionantes.

COMPOSICION

Formula g/L

Peptona de Caseína 5.0

Peptona de Carne 5.0

Cloruro Sódico 5.0

Rojo de Fenol 0.008

FORMA DE ACTUACION

La peptona de caseína provee carbono y nitrógeno, el cloruro de sodio actúa como estabilizador

osmótico y como inhibidor del desarrollo de muchas especies bacterianas que son contaminantes

comunes del ambiente. El rojo de fenol es un indicador de pH que hace virar el medio a amarillo

si la producción de ácidos hace que el pH descienda por debajo de 6.8.

PREPARACION

Disolver 15 gramos por litro de agua destilada, conjuntamente con 0.5 - 1.0 gramos por litro de

agar-agar, distribuir en tubos provistos eventualmente de campanas de Durham y esterilizar en

autoclave por 15minutos a 121 ?C. Después de enfriar por debajo de 60 ?C, añadir las

sustancias reaccionantes en forma de solución filtrada estéril, cuya concentración final sea de 5.0 a

10.0 gramos por litro.

pH : 7.4 ? 0.2

EMPLEO E INTERPRETACIÓN

Los tubos se siembran con el microorganismo a analizar, simultáneamente se siembran también

tubos sin sustancias reaccionantes, como controles de crecimiento.

En el caso de microorganismos especialmente exigentes, se recomienda añadir a cada tubo

algunas gotas de suero inactivo estéril. Los Anaerobios se ensayan en medios de cultivo que

contengan en lo posible agar y bajo condiciones lo más anaerobias posibles.

El periodo de incubación es hasta 14 días a la temperatura óptima de 37 ?C en la mayoría de los

casos.

Durante la incubación se controla diariamente el viraje de color rojo a amarillo así como la

presencia y acumulación de gas en las campanas de Durham.

(UNIPATH LIMITED. Manual OXOID. Unipath España. 1995. p 49)

SUSTANCIAS REACCIONANTES PARA LA SERIE COLOR

? Manitol

? Rafinosa

? Trehalosa

? Inulina

Anexo 8. Prueba de resistencia a Bacitracina

La bacitracina es un polipéptido aislado de una cepa (cepa Tracy) del Bacillus subtilis.

Actúa bloqueando la formación de la pared celular; inhibe las primeras etapas de la biosíntesis del

peptidoglucano. Para la diferenciación de estreptococos beta hemolíticos grupo A de Lancefield

DESCRIPCION

Discos de papel estériles conteniendo cada uno 0.05 unidades de bacitracina, que se utilizan para

la diferenciación de los estreptococos del grupo A de Lancefield de otros estreptococos beta

hemolítico.

Si se utiliza esta prueba como selectiva antes del agrupamiento serológico, los discos de

bacitracina proporcionan considerable ahorro en tiempo, trabajo y material.

Maxted demostró que los estreptococos del grupo A son más sensibles a la bacitracina que las

cepas beta hemolíticas pertenecientes a otros grupos, y que, así, la bacitracina puede ser utilizada

como agente que permite un diagnóstico rápido de los estreptococos del grupo A.

El uso de la prueba de la sensibilidad a la bacitracina no se ha limitado a la diferenciación de los

estreptococos beta hemolíticos, Guthof observó que la sensibilidad a la Bacitracina y Furacina

era una prueba útil para distinguir aerococcus, viridans y Streptococcus milleri de los

enterococos y de los estreptococos del grupo mitis.

TECNICA

a. Se inocula homogéneamente la superficie de una placa de agar sangre con un cultivo puro de la

cepa de estreptococo beta hemolítico que se va a probar.

b. Se coloca asépticamente un disco de bacitracina sobre la superficie inoculada.

c. Se incuba 18-24 horas a 37 ?C.

d. Se examina si existe una zona de inhibición alrededor del disco de bacitracina. Una zona de

inhibición indica que el estreptococo es presuntivamente del grupo A.

CONTROL DE CALIDAD

Utilizar estreptococos del grupo A y no A para comprobar la actividad de los discos.

(PETRICK, K. Manual de Microbiología 2000. Merck KGaA. p 63)

Anexo 9. Hidrólisis de arginina (ADH) (Oxoid)

Cuando se suplementa el medio base de Moeller con lisina, arginina u ornitina, puede ser usado

para diferenciar bacilos entéricos Gram negativos, basándose en la producción de arginina

dehidrolasa, lisina y ornitina decarboxilasa.

FUNDAMENTO

En 1955 Moeller introdujo este medio de cultivo para evaluar la producción de Lisina y ornitina

decarboxilasa y arginina dehidrolasa. Estas pruebas junto con otros test bioquímicos permiten

diferenciar a las enterobacterias y otros bacilos Gram negativos tales como aeromona,

plesiomona y vibrio spp. La producción de ornitina decarboxilasa, es una prueba clave para

diferenciar el grupo Klebsiell-Enterobacter . El medio basal de Moeller contiene peptona y

extracto de carne para suministrar la fuente de nitrógeno necesaria para el crecimiento bacteriano.

El piridoxal actúa como una coenzima para la decarboxilación de los aminoácidos. La glucosa es

un hidrato de carbono fermentable. El púrpura de bromocresol y el rojo de cresol son indicadores

del pH. Los aminoácidos lisina, ornitina y arginina, se agregan al medio basal para detectar la

producción de enzimas específicas de estos sustratos. Cuando el medio se inocula con una

bacteria capaz de fermentar glucosa, se produce ácido que baja el pH del medio y cambia el

color del medio del púrpura al amarillo. La condición ácida estimula la actividad decarboxilasa. Si

el organismo produce la enzima apropiada, es degradado el aminoácido a su correspondiente

amina. La decarboxilación de la lisina forma cadaverina, mientras que la decarboxilación de

ornitina forma putrescina. La arginina es hidrolizada a citrulina. La producción de estas aminas

eleva el pH del medio, cambiando el color del indicador de amarillo a púrpura o violeta. Si el

organismo no produce la enzima apropiada, el medio permanece ácido (amarillo). Cada cepa

aislada además debe ser sembrada en un tubo de medio basal que no contiene aminoácidos. Para

obtener las reacciones apropiadas los tubos inoculados deben protegerse del aire con una capa

de aceite mineral. La exposición al aire puede causar alcalinización en la superficie del medio, lo

que traería que un organismo decarboxilasa negativo aparezca como falso positivo.

COMPOSICION

Formula g/L

Peptona de Carne 5.0

Extracto de Carne 5.0

Glucosa 0.5

Piridoxal 0.005

Rojo de Cresol 0.005

Púrpura de Bromocresol 0.01

pH : 6.0 ? 0.2

INSTRUCCIONES

Suspender 10.5 gramos por litro de polvo en agua destilada. Reposar cinco minutos y mezclar

hasta uniformar. Agregar L-aminoácidos al 1 % según se desee. No agregar al tubo control.

Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 10

minutos a 121 ?C.

PROCEDIMIENTO

Partiendo de cepas bien aisladas inocular al caldo suplementado con uno de los tres aminoácidos

distribuyendo la siembra a través del medio. Agregar al medio 1 mL de aceite mineral. Incubar los

tubos con las tapas flojas a 35 ? 2 ?C. Examinar para evaluar crecimiento y reacciones de

decarboxilación a las 24, 48, 72 96 horas. El medio se torna amarillo inicialmente si la glucosa es

fermentada, y luego gradualmente se torna púrpura si la actividad decarboxilasa o dihidrolasa

ocurre y se eleva el pH del medio.

RESULTADOS

Compare el color de los tubos con medio, conteniendo los respectivos aminoácido, con el color

de los tubos de medio basal sin aminoácidos que han sido inoculados con la misma cepa. Si el

tubo control sin aminoácidos muestra una reacción alcalina la prueba está invalidada. El medio

con aminoácidos permanece púrpura o violeta si la reacción es positiva (alcalina). Un color

amarillo indica que la prueba es negativa (el organismo no produce la enzima apropiada). Para

organismos no fermentadores como Pseudomonas, una reacción alcalina origina que el indicador

se vuelva púrpura en el fondo del tubo control. El color del medio permanece igual si el organismo

no produce la enzima adecuada.

CONTROL DE CALIDAD

MICROORGANISMO LISINA ARGININA ORNITINA

Klebsiella pneumoniae + - -

Enterobacter cloacae - + +

(UNIPATH LIMITED. Manual OXOID. Unipath España. 1995. p 65)

Anexo 10. Medio RMVP (Oxoid)

Medio recomendado para las pruebas de Rojo de Metilo y Voges Proskauer en la diferenciación

del grupo coli-aerogenes.

Dos vías alternativas (ácidos mixtos y butilenglicol) para el metabolismo del piruvato formado por

fermentación de la glucosa. Las bacterias que siguen principalmente la vía de fermentación ácida

mixta, producen a menudo suficiente ácido como para mantener el pH por debajo de 4.4 (el limite

ácido de viraje de color del indicador rojo de metilo) contra el sistema estabilizador del pH del

medio.

La prueba de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en

diacetilo por acción del KOH y el oxígeno atmosférico. El diacetilo se convierte en un complejo

rojo por acción catalítica del ? -naftol y la creatinina. Las bacterias que utilizan esta vía producen

menores cantidades de ácidos mixtos, insuficientes como para bajar el pH del medio con rojo de

metilo y provocar un cambio de color.

COMPOSICION

Formula g/L

Peptona 5.0

Glucosa 5.0

Buffer de Fosfatos 5.0

pH : 7.5 ? 0.2

INSTRUCCIONES

Agregar 15 gramos a un litro de agua destilada. Mezclar bien y distribuir en recipientes definitivos

y esterilizar en autoclave a 121 ?C por 15 minutos.

DESCRIPCION

Este medio se recomienda para las reacciones de Rojo de Metilo y Voges Proskauer en la

diferenciación del grupo coli-aerogenes. La prueba conocida como Rojo de Metilo diferencia los

organismos capaces de producir grandes cantidades de ácido de la glucosa y que hace descender

el pH por debajo de 4.4 de aquellos otros que no producen descenso del mismo.

FORMA DE ACTUACION

a. Algunas bacterias utilizan glucosa con gran formación de ácido, de forma que el valor del pH

del medio desciendo a menos de 4.4. Otras bacterias producen menos ácido reduciendo en

menor medida el pH del medio. Esta distinción puede hacerse visible a través del Rojo de

Metilo que presenta color amarillo por encima de un pH de 5.1 y solo presenta color rojo

cuando el pH desciende a 4.4.

b. A partir de la glucosa, numerosos microorganismos forman acetoína (acetilmetilcarbinol), 2,3

butandiol o diacetilo. La demostración de estos productos metabólicos se lleva acabo con el

reactivo de KOH y ? -naftol.

(UNIPATH LIMITED. Manual OXOID. Unipath España. 1995. p 146)