Suceptibilidad por técnicas de amplificación de ácidos nucleicos

Lesiones tuberculosis > 108 bacilos

RIF 1 por cada 107-108 bacilos (100 000 000)

INH 1 por cada 105-106 bacilos (100 000)

SM 1 por cada 105-106 bacilos (100 000)

EMB 1 por cada 105-106 bacilos? (100 000)

Quinolonas 1 por cada 105-106 bacilos? (100 000)

Otro fármacos 1 por cada 105-106 bacilos ? (100 000)

PZ 1 por cada 102-103 bacilos (1 000)

Resistencia tuberculosis

Alteraciones genéticas puntuales en los genes del cromosoma bacteriano que codifican la diana del fármaco o enzimas implicadas en su activación.

No se a reportado elementos genéticos móviles (no hay transmisión horizontal de genes de resistencia es decir por procesos de conjugación, transformación, y transducción

Mutaciones espontaneas

MDR-XDR: acumulación secuencial de mutaciones en diferentes genes.

Resistencia adquirida en MTBC

4,411,529 pb

Fármaco involucrado Gen Mecanismos de acción de la del fármaco Frecuencia de mutaciones

Rifampiciana rpoB (falta de interacción de la rifampicina con la subunidad β del RNA polimerasa

Inhibición de la transcripción de genes por interacción con la subunidad β de la ARN polimerasa

96-98%

Isoniazida katG (catalasa-peroxidasa impide la activación de isoniazida)inhA (enol ACP reductasa) las mutaciones inducen la sobreexpresión del gen superando el poder inhibitorio de INH

Inhibición de la síntesis de ácidos micólicos

50-68% katG

21-34% inhA

Pirazinamida pncA (enzima pirazinamidasa) disminución de ácido pirazinoico, metabolito activo

No conocido 72-92%

Estreptomicina Amikacina

CapriomicinaKanamicina

rrs (Subunidad ribosomal 16S)rpsl (Subunidad ribosomal 12s)Impiden interacción con estreptomicina.

Inhibición de la síntesis de proteínas

8-21% rrs 64-67% rpsl

69-75%73-87%

Genes, función y mutaciones

Fármaco involucrado

Gen Mecanismo de acción del fármaco

Frecuencia de mutaciones

Etambutol embB ( enzimas aribinosiltransferasa)

sobreexpresión de este gen permite la síntesis de (arabinos galactanos)

Inhibición de componentes de la pared celular (arabino galactanos)

47-65%

Fluorquinolonas Levofloxacino, moxifloxacino

gyrA (disminución interacción fármaco con sub unidad β de

la topoisomerasa II)

Inhibición de rotura de cadenas de DNA, enrollamiento y

desenrrollamiento.

74-89%

• Detecta MTB y resistencia a RIF

• Es una hemisted Real time PCR para amplificar la secuencia del gen rpoB (189 pb) y la región 16S(209 pb)

• Integra los procesos sobre la muestra y el PCR dentro del cartucho de plástico.

• Lisis de bacteria (sonicación)• Extracción de DNA• Amplificación de DNA• Detección del amplicón

• El resultado se obtiene en un periodo de 2 horas

GeneXpert MTB/RIF

Identificación del amplicón

Utiliza tres pares de primers específicos, un par para la región 16S y dos pares para la región rpoB.El amplicón es identificado por medio de 5 sondas moleculares de desplazamiento de longitud de onda (A,B,C,D y E).

Ventajas: Equipo totalmente automatizado, mínima intervención del operador , rápido.Desventajas: Método costoso solo identifica resistencia a un solo antibiótico

MTBDR plus• Se basa en la tecnología DNA Strip• Identifica monoresistencia a INH y

RIF• Multidrogorresistente: Resistencia

INH a RIF• El análisis del gen rpoB la

resistencia a RIF• Analiza dos genes katG y inhA que

confieren resistencia a INH• El kit se puede realizar para cepas

aisladas del complejo MTB o muestras pulmonares (muestras procesadas por método de Petroff)

MTBDR sl• Identificación de resistencia a

Fluoroquinolonas (ofloxacino, levofloxacino y moxifloxacino), gen gyrA.

• Identificación de resistencia a aminoglucósidos (kanamicina, Capriomicina y Amikacina), gen rrs.

• Extremadamente drogorresistente

GenoType ®

GenoType®

ExtracciónAmplificaciónHibridación

Gen rpoB (Rifampicina)

rpoB WT1 (505-509)

rpoB WT2 (510-513)

rpoB WT3 (513-517) rpoB MUT1 D516V

rpoB WT4 (516-519)

rpoB WT5 (518-522)

rpoB WT6 (522-526) rpoB MUT2A H526YrpoB MUT2B H526DrpoB WT7 (525-529)

rpoB WT8 (529- 533) rpoB MUT3 S531L

GenoType MTBDR plus

Isoniazida

katG inhA

WT1 315 inhA WT1 -15 & -16

MUT1

S315T1

inhA WT2 -8

MUT2

S315T2

inhA MUT1 C-15T

inhA MUT2 A-16G

inhA MUT3A

T8C

inhA MUT3B

T8A

GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG CAC CAG AAC AAC CCC CTG TCC GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG

GlY Thr Ser Gln Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu

GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG CAC CAG AAC AAC CCC CTG TCC GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG

507 508 509 HisCAT

ProCCG

ThrACC

LeuCTA

514 IleATA

ValCTC

517 518 519 520 MetATG

LeuTTG

523 524 525 TyrTAC

527 528 529 530 LeuTTG

532 ProCCG

510 ARGCGG

ArgCGC

LysAAA

515 TyrTAC

521 522 AspGAC

TrpTGG

533

511 512 ProCCA

GluGAG

ARGCGC

CysTGT

513 GlyGGC

LeuCTC

GlnCAG

516 ProCCC

531

GluCAA

AsnAAC

GlnCAG

rpoB WT1 rpoB WT3

rpoB WT2 rpoB WT4 rpoB WT6

rpoB WT8rpoB WT7rpoB WT5

rpoB MUT1

rpoB MUT2A

rpoB MUT2BrpoB MUT3

Gen rpoB

Gen katG y inhA

katG gene Catalasa-Peroxidasa

1

735

315

KatG codón 315AGC->ACC (Ser->Thr)AGC->ACA (Ser->Thr)

inhA (enol ACP reductasa) MabA (3-ketoacyl-ACP Reductasa)

A-16 C-15 T-8

inhA MUT1C-15-TinhA MUTA-16G

inhA MUT3A T-8CinhA MUT3B T-8A

GenoType MTBDR sl

Gen gyrA

gyrA WT1 85-90

gyrA WT2 89-93

gyrA MUT1 A90VgyrA MUT2 S91P

gyrA WT3 92-97

gyrA MUT3A D94AgyrA MUT3B D94N ó YgyrA MUT3C D94GgyrA MUT3D D94H

Gen embB

306 Met→Val (ATG→GTG)

embB MUT1B

306 Met→Ile (ATG→ATC) embB MUT1B

306 Met→lle (ATG→ATA) embB MUT1A

Gen rrs

rrs WT1 1401-1402

rrs MUT1 A1401Grrs MUT1 C1402T

rrs WT2 1484 rrs MUT2 G1484T

CAC CCG CAC GGC GAC GCG TCG ATC TAC GAC AGC CTG

85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 99H P H G D A S I Y D S L

TGCC

GTGV

CCGP

GCCA

ACCT

AACNTACYGGCGCACH

gyrA WT1

gyrA WT2

gyrA WT3

gyrA MUT1

gyrA MUT2gyrA MUT3A

gyrA MUT3B

gyrA MUT 3C

gyrA MUT3D

Gen gyrB

Gen rrs

1484

rrs WT2

rrs MUT2

rrs MUT1

rrs WT1

GenoType MTBDR plus

STR; 6.35%

RIF; 15.87%

INH; 7.94%

STR+ INH; 4.76%

STR+ INH + EMB; 4.76%RIF + INH; 28.57%

RIF + INH + STR; 22.23%

RIF + INH + EMB; 4.76%XDR ; 4.76%

63 cepas aisladas resistentes de 356 aislados

Aislados MDR= 60.32%Aislados No MDR=37.78%

Fuente: Laboratorio de Microbiología Clínica, INER, 2014

GenoType MTBDR plus

Resistencia en rpoB; 97.36%

Resistencias no detec-tadas ; 2.64%

Sensibilidad de RIF en 38 aislado MDR

37/38 aislados

Mtb no identi-ficadas; 40.00%

Resistente a rpoB; 60.00%

10 cepas monorresistentes a

rifampicina Fuente: Laboratorio de Microbiología Clínica, INER, 2014

6/10 aislados

4/10 aislados

GenoType MTBDR plus INH

Resist

encia

en

katG

Resist

encia

en

inhA

Resist

encia

s no

det

ecta

das

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

47.36%

26.31% 26.33%

Sensibilidad a INH en 38 aislados MDR

18/38 aisla-dos 10/38

aisla-dos

0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%

45.45%27.27% 27.28%

Sensibilidad a INH en 11 aislados no MDR

Resistencia de KatG + inhA=72.72

5/11 aislados 3/11

aislados

Resistencia de katG + inhA= 73.67

Fuente: Laboratorio de Microbiología Clínica, INER, 2014

GenoType MTBDR sl EMB

resistencia en emBB Resistencias no detectadas 0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

55.55%

44.45%

Resistencia a EMB en 11 aislados

5/9 aislados

4/9 aislados

Sensibilidad teórica para el gen embB 47%-65%

Fuente: Laboratorio de Microbiología Clínica, INER, 2014

GenoType MTBDR sl (FLQ Y AG)

0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%

100.00%120.00%

0.00%

100.00%

Resistencia a FLQ en 3 aislados XDR

3/3 ais-lados

0/3 ais-lados

0.00%

20.00%

40.00%

60.00%66.66%

33.34%

Resistencia a AG en 3 aislados XDR

2/3 ais-lados

1/3 aislados