T15 Biotecnologia 1112 - cosmolinux.no-ip.orgcosmolinux.no-ip.org/recursos_aula/BIO1erBAT/... ·...

IES Guillem Cifre de Colonya. BIOLOGIA BATXILLERAT 2. Professor: Tomeu Vilanova

1

1. L’enginyeria genètica. 1.1 Concepte 1.2 Tècniques d’enginyeria genètica 2. Biotecnologia. Concepte 3. Biotecnologia industrial 4. Biotecnologia en agricultural, ramaderia i alimentació 4.1 Biotecnologia en plantes 4.2 Biotecnologia en animals 5. Biotecnologia en medicina

5.1 Eines biotecnològiques per al diagnòstic 5.2 Diagnòstic de malalties 5.3 Aplicacions terapèutiques

6. Biotecnologia en ètica i dret

15

ENGINYERIA GENÉTICA I

BIOTECNOLOGIA

IES Guillem Cifre de Colonya. BIOLOGIA BATXILLERAT 2. Professor: Tomeu Vilanova 2

1 L’ENGINYERIA GENÈTICA

1.1 CONCEPTE

L’enginyeria genètica és una tècnica que consisteix en la introducció de gens al genoma d’un individu que n’està mancat.

El 1971, un article de Kathleen Danna i Daniel Nathans va marcar l’inici de la tecnologia de l’ADN recombinant o engenyeria genètica. Larticle descrivia l’aïllament d’un enzim bacterià endonucleasa de restricció , que és útil per a tallar l’ADN víric en regions en seqüències específiques.

La tecnologia de l’ADN recombinant o engenyeria genètica, és un conjunt de tècniques que ens permeten localitzar, aïllar, sintetitzar, manipular, recombinar i transferir a les cèl.lules seqüències específiques d’ADN

Les tècniques emprades en la manipulació genètica han obert un camp molt ampli per a l’obtenció de substàncies, medicaments, per a la millora de rendiment d’animals i plantes etc.

1.2 TÈCNIQUES D’ENGINYERIA GENÈTICA

Fragmentació de l’ADN. Endonucleases de restricció.

Una de les eines més útils en enginyeria genètica és l’us dels anomenats enzims o endonucleases de restricció que són enzims aïllats de bacteris que són capaços de «tallar» l’ADN en uns punts concrets i així separar els segments que interessen.

Són endonucleases (hidrolizen la molècula en el seu interior) que fragmenten l’ADN en nombrosos trossos, sempre en seqüències conegudes d’entre 4 i 8 parell de bases, que són els anomenat fragments de restricció . Tallen les dues fibres deixant cues en una sola fibra (extrems cohesius ) que llavors serviran per a la unió, ja que són complementàries.

Els fragments resultants poden separar-se per electroforesis i així es coneixen les diferències entre les molècules d’ADN.

S’han aïllat més de 800 endonucleases de resticció que reconeixen i tallen l’ADN en seqüències diferents.

Separació i visualització dels fragments d’ADN

Després de la fragmentació d’una molècula d’ADN amb els enzims de restricció, els fragments de restricció obtinguts es poden separar per mitjà d’electroforesi en gel d’agarosa .

Comparant el tamany dels fragments de restricció formats a partir d’una regió gènica determinada, després del seu tractament amb diverses restrictasses es pot elaborar un mapa de restricció . Aquesta tècnica permet comparar diferents regions d’ADN (comparant els mapes de restricció) sense haver de seqüenciar tot l’ADN. Ha resultat molt útil per a la localització exacta de gens i determinar la identitat o parentiu d’individus..


3

Localització de seqüències d’ADN. Hibridació. El mètode més emprat per localitzar una seqüència específica d’ADN consisteix en la hibridació de l’ADN , que es basa en el fet que dues molècules d’àcids nucleics de cadena senzilla, amb seqüències complementàries de nucleòtids, formen un híbrid de doble cadena. Per localitzar una seqüència específica d’ADN per hibridació, es construeixen molècules d’ADN o ARN amb una seqüència de bases complementàries de la seqüència del gen que volem localitzar i es marquen de manera fluorescent o radiactiva. Aquestes molècules s’utilitzen com a sondes que hibridaran de manera selectiva amb les seqüències d’ADN que cercam. Síntesi de molècules d’ADN recombinant Per a obtenir una molècula d’ADN recombinant a partir d’ADN d’organismes diferents, es tracten els ADN dels dos organismes amb la mateixa endonucleasa de restricció. D’aquesta manera, s’obtenen fragments d’ADN amb extrems cohesius complementaris que es poden associar entre sí. Una vegada associats, els fragments d’ADN s’uneixen per mitjà de l’enzim ADN ligasa

Producció de còpies d’ADN. Reacció en cadena de la polimerasa (PCR) Per a l’estudi de l’estructura de l’ADN se’n necessiten grans quantitats. En l’actualitat és possible clonar ADN sense necessitat de cel.lules vives. El 1983 Kary Mullis va desenvolupar una nova tècnica anomenada reacció en cadena de la polimerasa (PCR) que permet amplificar un fragment d’ADN milers de milions de vegades, en unes quantes hores, en un tub d’assaig i amb un mecanisme que és bàsicament el mateix que l’utilitzat per les cèl.lules en el procés de replicació. Aquesta tècnica es fonamenta amb l’ús de l’ADN polimerasa per replicar molècules monocatenàries d’ADN a les quals s’han unit petits fragments d’ADN monocatenari, anomenats encebadors , que tenen seqüències complementàries dels dos extrems de la regió que volem amplificar. Aquests encebadors serveixen perquè l’ADN polimerasa iniciï la replicació en els punts de l’ADN que ens interessen. Per poder dur a terme la PCR es necessiten els components següents:

- El fragment d’ADN que es vol amplificar. - Els encebadors , amb seqüències complementàries de cada un dels extrems 3’ del fragment d’ADN que es vol amplificar.

- Un enzim ADN polimerasa resistent al calor, que s’aïlla de bacteris que viuen en ambients sotmesos a altes temperatures, entre 60 i 80 ºC (per exemple en fonts termals), com ara l’espècie Thermus aquaticus

- Els quatre tipus de desoxirribonucleòtids trifosfat i altres cofactors de l’ADN polimerasa (ions monovalents i divalents) en un amortidor adequat.


Aquests reactius es mesclen en un tub d’assaig que s’introdueix en un aparell anomenat termociclador, que fa cicles de tres etapes:

1. Desnaturalització , en que s’eleva la temperatura a 90-100º C per separar les cadenes del fragment d’ADN que es vol amplificar.

2. Hibridació (o alineament), a una temperatura d’uns 50º C,

que permet la hibridació dels encebadors amb les seqüències complementàries en cada una de les cadenes d’ADN.

3. Elongació (o extensió) , a uns 70º C, de temperatura a la

qual l’ADN polimerasa és activa i sintetitza les cadenes noves d’ADN.

Aplicacions de la PCR - Seqüenciació: Generació de suficient ADN. - Estudis d’expressió : Es pot utilitzar per a estudi d’ARNm. Serveix per conèixer quan s’expressen gens tumorals o vírics i, en conseqüència, si es efectiva, o no, una teràpia - Biologia evolutiva: Degut a que pot ampliar molt petites quantitats d’ADN permet analitzar teixits d’espècies extingides (mamut, humans primitius...) i construir arbres filogenètics. L’ADN mitocondrial ha estat emprats per a molt estudis evolutius - Mapes de cromosomes . Ha permès poder realitzar el mapa del genoma humà. - Diagnòstic : És el de major impacte. Tècnica ideal per a diagnòstic prenatal i d’enfermetats hereditàries (amniocentesi etc) - Medicina forense i proves de paternitat : Ha permès determinar la identitat d’una persona desconeguda a partir d’un cabell, gota e sang, etc.

Inserció de gens. Ús de vectors

Per a la inserció de gens cal la utilització de vectors, entre els quals els més utilitzats són: El plasmidi bacterià

Un plamidi és un petit ADN circular de doble hèlix del qual hi pot haver uns quants exemplars (de 20 à 50) en un mateix bacteri. Són com minicromosomes que es dupliquen autònomament.

Si gràcies a la lisi dels bacteris queden lliures al medi, poden penetrar dins d'altres bacteris, procés anomenat transformació, especialment si les membranes es fan permeables a l'ADN per l'addició de clorur càlcic. Els bacteris receptors adquireixen així les propietats dels gens que hi ha al plasmidi.

Per saber quins bacteris han sofert aquesta transformació, s'afegeixen, a més d'aquest ADN, gens que codifiquen proteïnes degradadores d'antibiòtics als plasmidis que s'utilitzen com a vectors d'un ADN passatger. Aquesta circumstància després permet seleccionar els bacteris que han integrat el plasmidi, ja que són les úniques que sobreviuen en un medi amb antibiòtics.


5

Els virus

Els virus també s'utilitzen coma vectors. Quan un virus infecta un bacteri i s'inicia el cicle lític, destrueix l'ADN cel.lular, es replica l' ADN víric i se sintetitzen les proteïnes de la càpsida.

Posteriorment, els ADN vírics s'encapsulen i es formen nous virus. De vegades, per error, s' encapsulen segments de l'ADN bacterià. Aquests virus defectius poden infectar un segon bacteri, i introduir un segment de l’ADN del bacteri hoste anterior, procés que s’anomena transducció . El cosmidis Els cosmidis són un tipus de plasmidis que contenen els extrems complementaris del genoma del fag λλλλ els anomenats extrems COS. Això els permet introduir-se en la càpside del fag i així passar a l’interior dels bacteris. Inserció de gens

Com ja s’ha esmentat per a possibilitar la inserció de l'ADN passatger a l'ADN vector, és convenient tallar-los tots dos amb el mateix enzim de restricció. Aquests tallen en un punt determinat, situat en unes seqüències (anomenades palindròmiques) que són iguals en els dos filaments i que presenten simetria segons la complementarietat de les bases. D’aquesta manera els segments cohesius faciliten la formació d'ADN recombinants.

Com que en els procariotes no hi ha procés de maduració de l' ARNm, si es vol intercalar un gen eucariòtic en un bacteri, no es pot introduir un segment d'ADN amb introns i exons, sinó que s’ha d'utilitzar un enzim d'origen víric, anomenat transcriptasa inversa o retrotranscriptasa, per produir ADN a partir d'un filament d' ARNm madur (molècula en la qual ja no hi ha introns).

Posteriorment s'ha de duplicar perquè es formi ADN de doble hèlix anomenat ADN complementari (ADNc), i finalment introduir-lo en un vector (un virus o un plasmidi) perquè el transporti a l' interior del bacteri.


Els gens que s'han d'introduir, l'anomenat ADN passatger pot provenir dels elements següents:

- ADN d'una cèl .lula que ha estat fragmentat enzims de restricció.

- ARNm aïllat , que s'utilitza com a motlle per fabricar un ADN (gràcies a la transcriptasa inversa) - ADN sintetitzat artificialment . Això permet introduir mutacions i elaborar nous enzims (enzims disseny).

Els dos darrers processos permeten que un bacteri (organisme en el qual no hi ha maduració de l’ARNm) pugui fabricar proteïnes de cel· lules euçariotes, els gens de les. quals solen presentar introns i exons.

Seqüènciació. Tècnica Sanger

Existeixen diverses tècniques de seqüènciació, la més emprada és la tècnica didesoxi o tècnica Sanger. Com a motlle s’utilitza una versió monocatenària de l’ADN que s’ha de seqüènciar. S’empra com a encebador per a iniciar la síntesi de l’ADN un curt oligonucleòtid complementari. La base de la tècnica està en la introducció de didesoxinucleòtids (ddNTP), és a dir nucleòtids modificats de manera que el grup –OH del carboni 3’ està substituït per un –H. Una vegada units a una cadena d’ADN, aquesta ja no pot crèixer ja que no té l’extrem –OH en posició 3’ (necessari per a l’addició de nucleòtids), així doncs la incorporació d’un ddNTP implica el final de la cadena. Per a la realització d’aquesta tècnica es necesiten 4 tubs separats; cada tub conté els nucleòtids necessaris per a la síntesi d’ADN. Un d’ells, el que actua d’encebador, està marcat radiactivament. A més cada tub conté un dels ddNTP per acabar la cadena. D’aquesta manera, per exemple, al tub G, hi ha ddGTP que s’incorpora a les cadenes que s’estan sintetitzant, i la bloquejaran, just quan l’ADN moncatenari que es vulgui seqüenciar hi hagi un nucleòtid de citosina (complementari a G). Posteriorment els fragments dels quatre tubs, es passen a les plaques de gel I es radiografien per a obtenir les bandes corresponents. Selecció de transformants amb ADN clonat. Hibridaci ó de colònies La selecció de cèl.lules transformades amb ADN clonat és una de les tècniques més dificultoses ja que es parteix d’un gran mombre de fragments d’ADN que es clonen en bacteris formant com una biblioteca genòmica, un reservori per a l’obtenció de gens. Es fa necessari, doncs, algun sistema per a “pescar” el clon que volem entre la resta de la biblioteca genòmica. Per això cal emprar una sonda que actui com a “ham”, específic. La tècnica consisteix en agafar un ARNm que codifica per a la proteïna que volem (per exemple insulina del pàncreas) i mitjançant la transcriptassa inversa se sintetiza l’ADN corrresponent . Aquest ADNc és la sonda necessari per a extreure la seqüència o gen que interessa la biblioteca genòmica.


7

2 BIOTECNOLOGiA. CONCEPTE

El terme biotecnologia va ser creat per l'enginyer hongarès Karl Ereky en 1917 per descriure processos en els quals es formaven productes a partir de materials crus, amb l'ajuda de l'activitat metabòlica d'organismes vius. Avui el terme biotecnologia engloba tot tipus de producció industrial de "béns i serveis" per mitjà de processos que utilitzen organismes, sistemes o processos biològics. Els processos industrials que utilitzen microorganismes per a l'obtenció dels seus productes constitueix la anomenada biotecnologia microbiana

3 LA BIOTECNOLOGIA A LA INDUSTRIA

Producció d’aliments i begudes

La producció d'aliments i begudes per fermentació constitueixen avui dia un sector molt important dins de la indústria alimentària. Les fermentacions més rellevants són:

La fermentació làctica , destaca l'elaboració del iogurt (que es fabrica fermentant llet sencera amb dos bacteris làctics, Streptococcus thermophilus i Lactobacillus bulgaricus, i del formatge format per bacteris que converteixen la lactosa de la llet en àcido làctico que acidifica la llet, la qual cosa provoca una coagulació i precipitació de les proteïnes làctiques, separàndose la quallada del sèrum.

L'art de fabricar formatges depèn de la naturalesa dels bacteris que s'empren com *iniciadores, les quals constitueixen un dels factors que determinen el tipus de formatge resultant. Altres factors són la presència o absència d'un flora bacteriana secundària i la temperatura de fabricació. La fermentació alcohòlica . Cal esmentar l'elaboració de begudes alcohòliques, tals com el vi (fermentació del raïm per l'acció de Saccharomyces ellipsoideus), de la cervesa (S. Cerevisiae) i de les begudes destil·lades. La fermentació acètica com la produïda pels bacteris del gènere Acetobacter i Gluconobacter Cal destacar també la producció d'aliments per a animals a força de proteïnes unicel.lulars o proteïnes microbianes , espècie de pinso elaborat amb cèl·lules senceres dessecades i premsades.


Elaboració de productes químics industrials i combu stibles Els microorganismes fabriquen multitud de productes químics d'ús industrial que s'empren com a dissolvents, combustibles, lubrificants, adhesius, acidulantes, extractors, plàstics, explosius, propulsors, pesticides, colorants, cosmètics, aromatizantes, etc. Entre elles figuren, com més importants des d'un punt de vista econòmic, les següents: - Enzims, que s'exploten principalment com a descomponedors de grans molècules, com les proteasas que degraden proteïnes i s'utilitzen com a agents de neteja en detergents i com a coadjuvants de la digestió en pinsos per a animals. Les amilases trenquen el midó per produir glucosa. - Compostos orgànicos alifàticos com dissolvents (etanol, acetona i glicerol), àcidos orgànicos industrials (acètic, cítric i làctic) - Aminoàcidos. Recordam que dels 20 aminoàcids que formen les proteïnes, vuit no els sintetitza el nostre cos; d'aquests, la lisina i la metionina es fabriquen per enriquir pinsos. L’àcido glutàmico (en forma de glutamoato monosòdic) s'usa com a potenciador del sabor.

Producció de fàrmacs

L'aplicació de la microbiologia en la indústria farmacèutica, va suposar una autèntica revolució. Els avanços obtinguts en el coneixement dels microorganismes i en les tècniques de la seva manipulació genètica troben avui la seva aplicació rutinària en la identificació de noves substàncies terapèutiques. Entre els productes d'interès per a la indústria farmacèutica tenim: - Agents antiinfecciosos (antibiòtics d'ampli i mig espectre, sulfonamidas, vacunes, drogues antifúngicas, etc.), Des d'una perspectiva comercial clínica, els antibiòtics constitueixen la base més importants de fàrmacs que s'obté dels microbis. Són metabòlits secundaris, de manera que la seva acumulació es produeix després del creixement de les cèl·lules que els síntetizan. - Enzims, vitamines i esteroides . Una fita en la producció de fàrmacs per microorganismes va ser la síntesi d'un pèptid humà, la somatostatina , per una cèl·lula bacteriana. Gràcies a les tècniques de l'ADN recombinant es va aconseguir fabricar el gen de la somatostatina coneixent la seqüència de aminoàcidos que codifica. El pèptid s'elabora en el hipotalamo humà per regular la síntesi de l'hormona del creixement i de la insulina.


9

Altres substàncies fabricades posteriorment per enginyeria genètica són: La insulina L'hormona del creixement. L’interferó que actua com a agent antitumoral i contra malalties víriques. La vacuna contra l'hepatitis B El factor VIII de la coagulació de la sang, (que falta en els hemofílicos) Aplicacions minerals

En l’àmbit de la mineria, s'usen microorganismes per a l'extracció de metalls pesats, metalls preciosos, urani... En els mètodes de recuperació de petroleo s'afegeixen determinades substàncies produïdes per microorganismes, a l'aigua en els pous de petroli, para per fer-la mes viscosa i que sigui més fàcil de bombar. En la mineria , els jaciments amb baixes concentracions de menes no poden explotar-se de forma convencional pel seu alt cost us de mines de molts països es estan recolzant en la utilització de microorganismes que extreuen i concentren els metalls valuosos.

Aplicacions medioambientals

Els microorganismes poden servir-nos de gran ajuda davant diferents problemes mediambientals, mitjançant diferents tècniques de biorremediació , com per exemple:

La contaminació de les aigües utilitzades per les indústries i als domicilis, és a dir, les aigües residuals. Les plantes de tractament requereixen de sistemes de biorremediación mitjançant bacteris que eliminen metalls pesats que acumulen en el seu citoplasma (alguns Thiobacillus), urani (Pseudomonas aeruginosa), hidrocarburs (certes Pseudomonas) i tota una de productes contaminants.

Les marees negres i els rentats dels tancs dels petroliers Per a això s’empren diferents ceps de Pseudomonas que poden consumir diferents hidrocarburs.

Altres problemes que s'estan intentant solucionar amb l'ajuda de microorganismes són: els residus sòlids urbans (la seva part orgànica pot usar-se per obtenir compost o metà), olis de cotxes usats, purins de porcs i vaques...


4 LA BIOTECNOLOGIA EN AGRICULTURA, RAMADERIA I ALIMENTACIÓ

4.1 BIOTECNOLOGIA EN PLANTES Plantes transgèniques Les plantes transgèniques són aquelles el genoma de les quals ha estat modificat per enginyeria genètica, per introduir-hi un o diversos gens nous o per modificar la funció d’un gen propi que permeti canviar alguna de les característiques, com també el nou gen es transmeti a la descendència. En les plantes transgèniques la modificació genètica es fa de manera dirigida i afecta a un nombre reduït de gens, per això les varietats transgèniques no difereixen gaire de les no trnasgèniques. La producció d’una planta transgència es basa en dues etapes:

- La transformació , es a dir, la inserció d’un gen (transgèn) en el genoma d’una cèl.lula de la planta. - La regeneració . Consisteix en l’obtenció d’una planta completa a partir d’aquesta cèl.lula vegetal

transformada.

Tècniques més emprades en biotecnologia en plantes

Tècniques de manipulació de cultius cel.lulars Plantes senceres, part d'elles i fins i tot cèl·lules úniques poden fer-se créixer en cultius estèrils líquids, que continguin mitjans nutritius adequats. Es coneixen diferents tècniques de cultiu: - La micropopagació, permet clonar en poc temps gran nombre de plantes. Es fa per exemple a partir de cultius meristemàtics, obtinguts de gemmes, o cultius de cèl·lules aïllades per disgregació. - La manipulació de la ploidía o producció d'haploi des consisteix en la producció de plantes haploides mitjançant el cultiu d'anteres i d'ovaris. - Les plantes haploides són especialment útils en producció de línies homocigóticas, és a dir línies pures per a futurs hibridacions i per a detecció i selecció de mutants recessius.

Técniques de modificació genètica de cultius cel.lu lars Les cèl·lules cultivades poden sotmetre's a tractaments que modifiquin el seu patrimoni genètic. - La transformació de cèl·lules intervinguda per Agrobacterium tumefaciens . Aquest bacteri, present en el sòl, és patògena de plantes dicotiledònies, a les quals els produeix un tumor Aquest fenomen natural és emprat per utilitzar al bacteri com a vector de gens que es desitgin introduir en una cèl·lula vegetal. - La fusió de protoplasts Un protoplast és una cèl·lula vegetal desproveïda de la seva paret cel·lular. La fusió de protoplastos, que pot aconseguir-se mitjançant fusógenos , proporciona la transferència de tot el genoma d'una cèl·lula vegetal a una altra cèl·lula vegetal de diferent espècie.


11

- Una altra tècnica és la electrofusión , que consisteix a aplicar un pols elèctric de curta durada amb la qual cosa es formen porus en la membrana i es fusionen els protoplasts. Així s'ha pogut per exemple hibridar patata comercial amb patata silvestre molt més resistent a l'atac de virus. - La selecció de mutants permet obtenir plantes amb alguna característica que interessi, com a resistència a herbicides, a plagues, o la fabricació d'alguna substància d'interès. Els mutants es produeixen mitjançant el tractament amb mutagens químics com etilmetilsulfonat (EMS), o mutagens físics (rajos gamma, X i ultraviolada) - La transferència directa de gens permet introduir un gen de qualsevol espècie de cèl·lula vegetal, que després regenerarà una planta transgènica. La transferència directa d'ADN estrany s'aconsegueix mitjançant:

Mètodes químics , com l'ús de polietilenglicol (fusógeno) Electroporació ; la microinjecció usant pipetes d'injecció especials; i mitjançant l'ús de liposomes, vesícules que transporten en el seu interior un fragment d'ADN. La transformació biolística o perdigonada . Aquesta tècnica es basa a bombardejar cèl·lules vegetals partícules de tungstè o d'or (perdigons) en la superfície dels quals van ferides molècules d'ADN amb els gens que interessin. Així s'han aconseguit plantes transgèniques de cereals com a blat i blat de moro.

Utilitats de les plantes transgèniques La producció de plantes transgènciques permet obtenier varietats de cultius amb noves característiques d’interès, coma ara:

- Millorés de processos bàsics de les plantes com la fotosíntesi i la fixació de nitrogen atmosfèric. - Fabricació de metabòlits secundaris de plantes d'interès farmacèutic: fàrmacas, essències, perfums, pigments i plaguicides. - Conservació d'espècies i varietats vegetals en perill d'extinció. - Resistència a herbicides, patògens i factors d'estrès (com a calor, fred, salinitat, sequera, inundació, etc) Per exemple s'han clonat plantes de tabac en les quals s'ha introduït una toxina proteïca d'un bacteri (Bacillus thuringiensis) enfront del desenvolupament de larves de lepidòpters i demosquitos. - Productes agrícoles de millor qualitat i durada per a un millor almacenamiento, millor sabor etc

Els avantatges fonamentals de les plantes transgèniques són:

- Els gens que s’incorporen poden ser de qualsevol procedència i no és necessari que es trobin en plantes que puguin ser hibridades entres si. - En la planta transgènica es pot introduir un únic gen nou, amb la qual cosa es preserven en la seva descendència els altres gens de la planta original. - El procés es duu a terme en molt menys temps.


13

4.2 LA BIOTECNOLOGÍA EN ANIMALS

Igual que les plantes, en els animals es poden aplicar tècniques de reproducció in vitro, cultiu de cèl·lules i teixits cel·lulars i manipulació del material genètic. Transgènesis en animals La transgènesis es pot definir com la introducció d'ADN en un genoma, de manera que es mantingui estable de forma hereditària i afecti a totes les cèl·lules en els organismes multicel.lulars. Generalment, en animals, l'ADN estrany, anomenat transgén , s'introdueix en zigots, i els embrions que hagin integrat l'ADN estrany en el seu genoma, prèviament a la primera divisió cel·lular, produiran un organisme transgènic; de manera que el transgén passés a les següents generacions a través de la línia germinal (gàmetes). Les aplicacions dels animals transgènics són múltiples:

Estudiar a nivell molecular el desenvolupament embrionari i la seva regulació. Manipular de forma específica l'expressió gènica in vivo. Estudiar la funció de gens específics. L'ús de mamífers com biorreactores per a la producció de proteïnes humanes. La correcció d'errors innats de metabolisme mitjançant teràpia gènica.

La transgènesis pot efectuar-se seguint dues estratègies: - Transgénesis per microinjecció de zigots . Des que en 1982 s'obtingués un ratolí transgènic, la producció d'animals transgènics es fa cada vegada més quotidiana, existint ja exemplars transgènics de les següents espècies: ratolí, rata, conill, porc, vaca, cabra i ovella.

- Transgénesis per manipulació de cèl·lules embrion àries. Una estratègia molt més poderosa per a la transgènesis implica la introducció d'ADN estrany en cèl·lules embrionària totipotentes (cèl·lules ÉS) o cèl·lules embrionàries mare (cél EM). Es prenen de l'interior del blastocist (blàstula) en desenvolupament i són passades a un mitjà que conté una substància amb activitat inhibidora de la diferenciació, mantenint el seu estat embrionari L'ADN estrany pot introduir-se en les cèl·lules ÉS mitjançant diverses tècniques com electroporació, transfecció o microinjecció; posteriorment, les cèl·lules transfectadas són reintroducidas en un blastocisto i es reimplanta en una femella pseudoprenada. Amb aquesta tècnica els nounats són quimeres, però mitjançant l'encreuament d'aquestes s'aconsegueixen animals transgènics a partir d'aquelles quimeres que hagen incorporat el transgen en el seu línia germinal.


Clonació d'animals El principi de la clonació està l'obtenció d'organismes idèntics genèticament, i per tant morfologicament i fisiològicament, com el són dos bessons univitelins. Aconseguir clons d'animals se solen utilitzar dos mètodes: - Per disgregació de cèl·lules embrionàries Es basa en el mateix principi pel qual naixen bessons de forma natural. Els investigadors separen les cèl·lules d'un embrió en diferents estats de desenvolupament, des de l'estat de 2 cèl·lules fins a l'estat de mòrula. Cada cèl·lula separada pot funcionar com un zigot que inicia de nou tot el procés de diferenciació des del principi. - Per transferència nuclear Per a això es prenen cèl·lules embrionàries en fase de mòrula o blàstula per disgregació, es cultiven in vitro i, a continuació, es transfereixen a ovòcits enucleats (als quals se'ls ha retirat el seu nucli). Es provoca la fusió de les dues cèl·lules animals de manera que el nucli de la cèl·lula embrionària diploide quedi a l'interior de l'ovòcit, podent aquest començar a funcionar com un zigot. Com més diferenciades estiguen les cèl·lules donants de material genètic, més difícil és aconseguir la reprogramació d'aquest material genètic, perquè puga iniciar la diferenciació de la cèl·lula receptora. En l'actualitat és possible obtenir clons de cèl·lules totalment diferenciades d'un animal adult que actuen com a donants del seu material genètic, com va ocórrer en el cas de l'ovella Dolly.


15

5 LA BIOTECNOLOGIA EN MEDICINA

5.1 EINES BIOTECNOLÒGIQUES PER AL DIAGNÒSTIC CLÍNIC Els biosensors Un biosensor és un dispositiu d’anàlisi, sensor, que utilitza un ésser viu o un producte derivat d’un ésser viu, com són els anticossos o enzims. Els més freqüents fan servir enzims , que permeten modificar de manera específica una substància continguda en una mescla complexa com ara la sang o l’orina. Els sensors enzimàtics més fàcils d’utilitzar i els que donen resultats més precisos contenen un enzim directament unit a un element electrònic, per exemple, un elèctrode, que mesura la intensitat de la reacció enzimàtica i, d’aquesta manera, determina la concentració del compost que es vol analitzar: sang, orina, aigües residuals, etc Els bioxips Un bioxip és un suport sòlid, generalment vidre, en el qual es dipositen milers de minúscules taques de molècules d’ADN de cadena senzilla. Hi ha diferents tipus de xips depenent de si utilitzen oligonucleòtids o fragments d’ADN La utilitat d’aquests xips d’ADN es basa en la capacitat dels àcids nucleics de cadena senzilla per reconèixer altres molècules de cadena senzilla que continguin una seqüència complementària i aparrellar-s’hi (hibridar). Gràcies a aquesta propietat, els bioxips s’utilitzen per identificar molècules d’ARN o d’ADN contingudes en una mostra determinada, com pot ser un teixit d’un tumor, per al diagnòstic clínic i ent erapèutica. A mesura que sigui possible identificar els gens implicats en les malalties o en la resposta als fàrmacs, els bioxips d’ADN seran molt útils per identificar els individus amb un risc més elevat de desenvolupar una malaltia, com també per escollir el tractament personalitzat més indicat.


5.2 DIAGNOSIS DE MALALTIES Diagnosis de malalties congènites La utilització de tècniques de diagnòstic molecular en individus amb risc elevat de ser portadors de malalties genètiques (per exemple, amb antecedents familiars) permet aplicar tractaments preventius o modificar els hàbits o les dietes que poden retardar el desenvolupament d’algunes patologies genètiques. El diagnòstic molecular també és útil per a la detecció prenatal de malalties que afecten a pocs nucleòtids ja que la detecció de mutacions genètiques és fàcil si es tracta de grans alteracions com delecciones o insercions gèniques, però requereix de tècniques precises quan els canvis afecten a pocs nucleòtids. Així, una malaltia greu com la distròfia muscular de Duchene, que provoca una profunda debilitat en homes, és produïda per una delección de part del gen de la distrofina situat en el cromosoma X. Aquesta delección i altres similars són detectades en observar l'absència de fragments de restricció en una anàlisi Southern d'ADN genómic, o mitjançant la PCR.

Diagnòstic i tractament del càncer L’anatomia patològica molecular permet detectar el càncer per les seves característiques patogèniques degudes a les alteracions genètiques i bioquímiques, en lloc de fer-ho per la morfologia del tumor, tal com ho feia l’anatomia patològica clàssica. Aquesta tècnica permet detectar i classificar el càncer de manera molt precoç, la qual cosa facilita la seva erradicació. L’ús de la PCR i de tècniques d’anticossos monoclonals resulten molt útils per a aquesta finalitat. Per altra part se sap que algunes persones presenten una predisposició congènita a desenvolupar càncer, a causa de la mutació de gens concrets dels seus progenitors. La seqüènciaació d’aquests i altres gens relacionats amb el càncer permet determinar les alteracions i identificar les persones amb risc molt elevat a desenvolupar càncer. En un futur proper la biotecnologia permetrà, per mitjà de l’ús de xips d’ADN, determinar exactament les alteracions genètiques i bioquímiques de les cèl.lules que componen un tumor i aplicar teràpies dissenyades especialment per a a cada pacient.


17

5.3 APLICACIONS TERAPÈUTIQUES Vacunació y manipulació genètica

La vacunació contra les malalties infeccioses ha sigut un dels grans èxits de la medicina humana i veterinària. L'exemple més significatiu és l'eradicació de la pigota. Existeixen dues estratègies clàssiques de vacunació: - Una consisteix en la vacunació de patògens morts o amb parts (Subunitats) d'aqueixos patògens; - Una altra que utilitza virus o bacteris patògens vius però atenuades (menor poder virulent), que no causen la malaltia. Les tendències actuals són les d'usar vacunes amb subunitats amb poder inmunógeno i que puguen ser produïdes en gran quantitat per microorganismes o en cultius cel·lulars eucariotes. La producció de noves vacunes passa per la identificació de l'antigen potencial inmunògen, la localització del gen responsable de la formació d’aquest antigen, el clonat del gen i la seua transferència mitjançant les tècniques ADN recombinant a organismes o a cultius cel·lulars que siguen capaços fabricar-ho en quantitat. Anticossos monoclonales Els anticossos són produïts pels limfòcits B, (ja ho estudiarem més endavant). Els anticossos, a més de servir per a la nostra defensa autònoma contra infeccions i substàncies estranyes, són eines molt valuoses en la curació de malalts que no són capaços de produir-los i per a l'estudi de molècules biològiques. La tècnica dels anticossos monoclonales va permetre preparar quantitats il·limitades d'anticossos homogenis. Està basada en el fet que cada limfòcit B forma solament un únic i Específic anticòs L'essència d'aquesta tècnica consisteix a immortalitzar les cèl·lules madures responsables de la producció d'anticossos (cèl·lules plasmàticas, producte madur obtingut per activació de limfòcits B), aconseguint que es multipliquen indefinidament. Aquesta immortalitat s'aconsegueix hibridant les cèl·lules plasmàticas i cèl·lules tumorals, com les dels mielomes, amb capacitat de multiplicació indefinida. Les cèl·lules filles resultants es denominen hibridomes


Teràpia gènica . Moltes malalties de l’espècie humana tenen el seu origen en defectes d’enzims o altres proteïnes codificades per gens mutats. Un cop identificades les mutacions responsables d’aquestes malalties genètiques, és possible, per mitjà de tècniques de l’ADN, detectar-les i reparar-les. Es creu que la teràpia gènica constituirà la quarta revolució en la medicina (Després de les mesures de salut pública, l'anestèsia i la introducció d'antibiòtics). La teràpia gènica pot aplicar-se seguint dues estratègies: - Inserir una còpia sana d'un gen en les cèl·lules del pacient, per a compensar l'efecte d'un gen defectuós. . - Produir un gen especialment dissenyat perquè subministre una propietat a les cèl·lules. Per exemple, introduir en limfòcits un que produïsca un inhibidor de la replicació del virus de la SIDA. Fins ara la teràpia gènica només es realitza sobre cèl·lules somàticas, pels problema ètics que es plantegen en fer-ho en cèl·lules germinals, posat les modificacions es transmetrien a la descendència. Tècniques a) Teràpia ex vivo (fóra del cos): s'extrauen cèl·lules amb gens defectuosos fóra del cos i li les introdueix amb vectors adequats, còpies normals d'aquests gens. Ara s'intenta fer en cèl·lules mare per a tractar problemes sanguinis. b) Teràpia in situ (en el mateix lloc) s'introdueixen portadors o vectors (virus, liposomes...) de gens correctors directament en els teixits on es necessiten els gens. c) Teràpia in vivo (dins del cos): S'injecta en la sang vectors a manera de taxis (generalment virus) que contenen els gens desitjats, aquests interactuan sol en les segelles diana i els transfereixen el seu contingut

Encara que, en principi, moltes malalties es podrien tractar amb aquestes teràpies, el desenvolupament de la tecnologia no és prou avançat. Una de les principals dificultats és introduir el gen normal i que aquest s’expressi corectament en els pacients afectats. Les malalties hereditàries provocades per la mancaça d’un enzim o proteïna són les més idònies per a la teràpia gènica. Un exemple és el cas de la immunodeficiència ADA (“nins bombolla”) causada per la manca de l’enzim adenosina-desaminasa. La introducció del gen funcional que codifica aquest enzim en algunes cel.lules extretes als malalts, que posteriorment són reinserides, està essent eficaç pel seu tractament.


19

Les cèl.lules mare Una cèl·lula mare és aquella que té les següents característiques:

Capacitat de dividir-se originant noves còpies de si mateixa. Capacitat per diferenciar-se en altres tipus i llinatges cel.lulars quan se li proporcionen determinades condicions fisiològiques o experimentals. -Capacitat per originar teixits i òrgans .

S’anomenen cèl.lules totipotents les que donen lloc a tots els teixits i òrgans. L’exemple més significatiu és el zigot. A mesura que avança el desenvolupament embrionari i fetal, les cèl·lules mare van perdent les propietats inicials i reben successivament els noms de: toti-, pluri-, multi- i, finalment unipotents. Segons el seu origen i les seves propietats, les cèl.lules mares es classifiquen en:

Cèl·lules mare embrionàries (ESC, embryonic stem cells). Procedents especialment de la massa cel·lular interna del blàstòcit.

Cèl·lules mare adultes (adult stem cells), que procedeixen de teixits adults. Les seves funcions són la reparació dels teixits danyats i la renovació cel.lular fisiològica.

Altres tipus cel·lulars Són les cèl·lules fetals, les germinals i les cèl·lules mare procedents del cordó umbilical i actualment es treballa en el potencial de les cèl·lules procedents del líquid amniòtic .

Mètodes d’obtenció de cèl.lules mare Clonatge terapèutic , que es limita a l’obtenció d’embrions, a partir del qual s’obtenen cèl.lules mare embrionàries per tractar malalties. Aquesta tècnica suposa una línia esperançadora per a l’eliminació dels transplantaments i la cura de malalties degeneratives com ara l’Alzheimer i el Parkinson. Reprogramació cel.lular , és una de les línies actuals més esperançadores per a poder evitar, juntament amb el clonatge cel.lular, els problemes del rebuig en els trasplantaments.


Usos potencials Les aplicacions potencials, en vistes al futur, són:

- Teràpia cel.lular per a la regeneració i la reparació de teixits danyats. - Teràpia cel.lular i modificació genètica, en què, a més de reconstruir un teixit danyat, per mitjà d’enginyeria molecular es pot millorar l’expressió d’algun factor que ajudi al pacient.

Teràpia cel·lular A partir de cèl·lules mare embrionàries es poden generar altres tipus cèl.lulars (endotelials, hematopoètiques, musculars, etc) Tenen l’avantatge que creixen més fàcilment, encara que, en models d’animals, poden generar tumors. Les cèl.lules mare adultes es poden obtenir directament d’un gran nombre de teixits adults. Tanmateix el seu cultiu in vitro és més lent i pot originar degeneració cromosòmica. A més, la seva plasticitat i la seva pluripotència són més restringides. La teràpia cel.lular s’ha emprat enb animals per curar malalties com ara el càncer, Parkinson, cardiopaties, traumes de medul,.la espinal, tot i que encara no s’han aconseguit els resultats desitjats amb assaigs en persones ja que les patologies són més complexes i estan influenciades per factors com l’edat, dieta, hàbits de vida...


21

Biotecnologia en la ciència forense Els exàmens forenses segueixen el principi que pot haver-hi una transferència d'evidències entre el criminal i l'escena del crim. La comesa del biòleg forense se centra en l'anàlisi de mostres tals com a sang, saliva i pèls, trobats en casos de mort, violació i altres tipus d'agressions. Perfilat de l’ADN o identificació de la petjada genètica (fingerprint ing) La tècnica del perfilat d'ADN o prova de l'ADN permet detectar la «petjada genètica » d'una persona amb un grau de certesa del 99,96 %, impossible d'aconseguir amb les tècniques anteriors. També s'aplica en la identificació de restes de persones desaparegudes, en persones amb demanda de paternitat, etc. En 1986, va començar el desenvolupament d'aquesta tècnica, gràcies a Alec Jeffreys , inicialment va denominar petjades d'ADN. En el seu article descrivia region ADN no codificants denominades minisatèlits o VNTR (el nomve de la repetició en tandem) que consisteixen en moltes repeticions de petita seqüència. EI nombre exacte de les repeticions varia en mesura en cada individu; pel que, les longituds dels minisatélites diferents en persones diferents. El genoma haploide humà conté uns tres mil milions de parells de bases (3 • 109 pb). Aproximadament el 10 % codifica proteïnes, i en les regions no codificants es troben els minisatèlits. El mètode que s'empra actualment es denomina de locus únic (SLP) per la seua simplicitat i major sensibilitat, en el qual s'utilitzen vàries sondes (oligonucleótidos marcats radioactivament) en sèrie, de manera que cada sonda detecta un sol minisatèlit. És molt similar a un anàlisis Southern blot i pot emprar-se amb diversos materials biològics, tals com a sang (s'usen els leucòcits com a font d'ADN), semen (els espermatozoides), saliva deixada en un cigarret (cèl·lules epitelials de la mucosa bucal), pèls (cèl·lules de les arrels, del pèl) etc.


6 RISCOS I IMPLICACIONS ÈTIQUES DE LA ENGINYERIA GENÈTICA

Davant els avanços de l’enginyeria genètica el 1974, onze biòlegs van demanar l'establiment de normes per regular els possibles perills dels treballs amb ADN recombinant i van demanar una mo-ratòria respecte d'experiments amb gens productors de càncer o substàncies tòxiques. El 1976 es van establir les normes per a aquest tipus d'experiments. En una primera etapa, les qüestions sobre enginyeria genètica es van centrar en la qualitat, la seguretat i l'eficàcia dels productes.

En una segona etapa, la discussió ha versat sobre qüestions ètiques i la relació amb els processos legislatius. Per donar resposta a aquestes qüestions s'han creat diverses organitzacions, entre les quals destaca el Comitè Internacional de Bioètica de la Unesco, constituït per uns cinquanta científics d'uns 35 països, fundat per l'espanyol F. Mayor Zaragoza el 1993.

L'objectiu d'aquests comitès de bioètica és evitar aspectes del progrés que atemptin contra la dignitat humana, que ciència no sigui identificada com a parcialment sospitosa, i que les seves possibilitats no generin perillositat per falta de definicions ètiques. Els criteris bàsics establerts són:

Límits per motius ecològics i de sanitat. Es considera que hi ha d'haver controls molt estrictes en la producció d'organismes transgènics quan aquests puguin causar desastres ecològics, com ara l'extinció d'espècies naturals a causa de l'increment de la competitivitat, causar malalties en l'espècie humana (per exemple, infeccions degudes als nous virus o nous bacteris) o causar contaminacions, sobretot de les aigües, a causa dels nous processos metabòlics indesitjables.

Límits per motius ètics i morals. Es considera que moltes aplicacions que són totalment lí-cites en espècies animals i vegetals no ho són en l'espècie humana a causa de la dignitat de la persona. L'ús d'enginyeria genètica amb la intenció de guarir una malaltia humana (terà-pia gènica) és moralment desitjable, sempre que es respecti la integritat de l'individu i no l'exposi a riscos desproporcionats. En el cas dels embrions, cal el consentiment dels pares. Com que la intenció curativa de l'individu no és aplicable a les cèl.lules reproductores (no són individus), no es considera èticament correcta l'aplicació d'aquestes tècniques als gàmetes humans. També es prohibeix treballar amb embrions humans amb finalitats de sim-ple experimentació.

Límits per motius socials. Es considera que hi ha d'haver límits legals, basats en el dret a la intimitat, que impedeixin l'exigència d'un sondeig gènic per accedir a un lloc de treball, a una plaça 'en un centre educatiu, a una assistència sanitària, a la firma d'una pòlissa d'assegurances, etc.

Límits per motius polítics. Es considera que les aplicacions de l'enginyeria genètica en la producció vegetal i animal han d'afavorir a tots els humans i no tan sols els grups que dominen aquestes tècniques. Hi podria haver perjudicis econòmics greus si, amb l'establiment de patents d'organismes transgènics, s'augmentessin les diferències entre els països pobres i els països rics.

Hi ha controvèrsia entre els científics sobre la licitud de patentar les seqüències del genoma humà que es vagin descobrint. Uns consideren que no s'haurien de patentar mai, sinó posar-les al servei de tots els països. D'altres diuen que és lògic que els laboratoris vulguin recuperar les inversions fetes, tal com passa en la indústria farmacèutica, ja que si aquesta investigació la paguessin els governs, comportaria un augment dels impostos que no semblen disposats a assu-mir; i que si no es permet obtenir beneficis, és possible que no es comuniquin els avanços per por que es prohibeixi patentar-los.


23

1) Defineix bioremediació. 2) Posa alguns exemples de microorganismes que s’empren en biotecnología industrial

3) Què són els organismes transgènics? Posa alguns exemples.

4) Què són els enzims de restricció (endonucleases)?

5) Quina funció fa la transcriptasa inversa?

6) Què són els plàsmids recombinants?

7) Per què en enginyeria genètica és un avantatge utlitzar com a vector de gens un plasmidi que

tingui informació sobre resistència a determinats antibiòtics?

8) Explica la tècnica de l’ADN recombinant.

9) Un pleontòleg recull una mínima quantitat de matèria orgànica de les restes d’un ocell fòssil. Vol comparar aquest fragment amb una mostra d’ADN d’ocells vius de la mateixa espècie, però necessita una quantitat més gan de la mosta d’ADN antic. Com la podria aconseguir? Quins passos segueix la tècnica necessària per fer-ho?.

10) Cerca informació de com es va clonar l’ovella Dolly y quins problemes varen sorgir, perquè

va morir jove?

11) Dissenya un mètode per a produir tiroxina humana mitjançant engenyeria genètica per tal de poder curar els malalts que tenen mancança d’aquesta hormona.

12) Qués és un bioxip? Quines aplicacions té?

13) Explica la tècnica del Southern Blot i la seva utilitat.

14) Explica la tècnica del microarray

15) Defineix:

– Cèllules totipotents – Cèllules mare embrionaries – Cèllules mare adultes

16) Per què és més fàcil aplicar l’enginyeria genètica als peixos que als mamífers.

17) Quins perills respecte de l’equilibri ecològic i respecte de la salut humana es poden derivar de

l’enginyeria genètica?

18) Creus que hi ha d’haver límits per a determinades pràctiques científiques? És responsable el científic del mal ús que posteriorment es pugui fer dels seus descobriments?

19) Creus que l’elecció d’embrions, la clonació de noves espècies i la producció d’organismes

transgèncis... èticament es poden dur a terme en humans?

ACTIVITATS. ACTIVITATS. ACTIVITATS. ACTIVITATS. Tema 15: Enginyeria gTema 15: Enginyeria gTema 15: Enginyeria gTema 15: Enginyeria genética i biotecnologiaenética i biotecnologiaenética i biotecnologiaenética i biotecnologia

T15 Biotecnologia 1112 - cosmolinux.no-ip.orgcosmolinux.no-ip.org/recursos_aula/BIO1erBAT/... ·...

Documents

Transcript of T15 Biotecnologia 1112 - cosmolinux.no-ip.orgcosmolinux.no-ip.org/recursos_aula/BIO1erBAT/... ·...