Se abre esta actividad, que incia el 26 de octubre, para que vayan adelantando los aportes que deben realizar

Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD

INTROCUCCIONLos resultados de produccin in vitro de embriones en distintas especies fueron mejorando significativamente a medida que avanzaron los conocimientos acerca de sus requerimientos. Para ello, fue necesario transformar los medios de cultivos primitivos, muy complejos y suplementados frecuentemente con suero, en medios ms definidos, en los cuales cada uno de sus componentes pudiera ser estudiado en funcin del efecto que genera sobre el desarrollo embrionario, su sobrevida poscriopreservacin, la tasa de gestacin y el porcentaje de cras viables.FERTILIZACION IN VITRO

La fertilizacin in vitro es una biotecnologa reproductiva de alta complejidad, con la cual se obtienen embriones viables en condiciones de laboratorio que pueden ser implantado en teros con ciclos sincronizados, aptas para la gestacin.Para esta tcnica se utilizan ovocitos inmaduros de un ovario sin tener en cuentas las caractersticas fisiolgicas de la hembraEQUIPOS DE LABORATORIO

1. Heladeras

2. Autoclave3. Horno4. Destilador de agua5. Ultra purificador de agua6. Balanza de precisin7. Micro pipetas automticas8. Bao mara9. Plantillas calientes10. Mechero11. Lupas estereoscpicas y microscpicas12. Centrifuga13. Termo de nitrgeno14. Cabina de flujo laminar15. Estufa de flujo de conexin a CO216. Congelador automtico de embrionesTcnica de aspiracin folicular OPUEsta tcnica permite recoger ovocitos en las hembras de ms de seis meses de edad, durante los primeros tres meses de gestacin y a partir de las 2-3 semanas del postparto, por lo que no interfiere con los ciclos productivos o reproductivos de las hembras donantes.La aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido es la tcnica de recoleccin de ovocitos de hembras vivas usada regularmente. La aspiracin folicular puede ser repetida en el mismo animal durante 5-6 meses y una periodicidad de dos aspiraciones por semana o una semanal, sin ningn efecto sobre la reproduccin o el bienestar animal.

LOS PASOS PARA LA ASPIRACIN FOLICULAR (OPU)

1. se llevara a cabo con el animal en pie en un potro de contencin2. posteriormente, se debe administrar anestesia va epidural para reducir los esfuerzos expulsivos y facilitar la manipulacin del ovario. 3. Vaciamiento del recto, limpieza y desinfeccin de la vulva y rea perineal4. Se introduce el transductor en la vagina convenientemente lubricado y protegido por una cubierta sanitaria de ltex. (Introduccin del transductor. Sujecin del ovario (mano izquierda) y manejo del mango de OPU (mano derecha).

Para la visualizacin de los folculos ovricos empleamos un ecgrafo equipado con una sonda transvaginal de 5-75 MHz y un handgrip o mango de OPU de 60 cm de longitud donde se colocara la gua de puncin. Por la gua se introducir una aguja de puncin desechable (20 G, 09 x 70mm) conectada a un tubo estril de 50 ml mediante una conduccin de Tefln. El equipo de OPU se completa con una bomba de vacio accionada por pedal con la que se aplicara una aspiracin constante de 50-53 mm Hg (20 ml/min). El tubo de recogida debe mantenerse atemperado a 37oC en bao termosttico

5. Los ovarios se posicionaran va rectal delante de la sonda para ovricos visibles de ms de 3 mm de dimetro. Antes de iniciar la sesin de puncin se drenara el sistema aspirando una pequea cantidad de medio de recogida. Tras la aspiracin de cada 3-4 folculos se realizara un lavado exhaustivo del fluido folicular en la aguja de aspiracin y en el sistema de recoleccin con medio de lavado y recogida [PBS suplementado con heparina sdica (22 UI/ml) y suero fetal bovino (1%)]6. El fluido obtenido de cada animal contenido en un tubo de recogida de 50 ml ser inmediatamente filtrados restos de sangre sern eliminados por continuos lavados en PBS fresco y se pasara a una placa de Petri para localizar y evaluar morfolgicamente bajo estereomicroscopio los complejos cumulus ovocito (COCs) aspiradosSe Clasifican los COCs obtenidos en cinco categoras, segn homogeneidad, morfologa del citoplasma y compactibilidad de las clulas del cumulo:

Categora I: Ovocitos con ms de tres capas de clulas de cumulo compactas y con citoplasma homogneo uniformemente granulado

Categora II: Ovocitos con menos de tres capas de clulas del cumulo y citoplasma generalmente homogneo

Categora III: Ovocitos con una sola capa de clulas del cmulo y citoplasma de aspecto irregular con reas oscuras

Categora IV: Ovocitos denudados Categora V: Ovocitos madurados in vivo, con cumulo expandido.

SISTEMAS DE PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES.

El proceso de produccin in vitro de embriones bovinos puede dividirse en tres pasos fundamentales:

-Maduracin de ovocitos -Fecundacin de ovocitos maduros

-Cultivo de embriones.Estos tres pasos, comprenden una compleja serie de procesos fisiolgicos, muchos de los cuales son an desconocidos, condicionando cada uno el xito o el fracaso del siguiente. Luego de la maduracin in vitro, aproximadamente el

90% de los ovocitos inmaduros puestos a cultivar, alcanzan la metafase II y expulsan el primer cuerpo polar entre las 16 y 24 hs de comenzada la maduracin. 21 De estos, aproximadamente el 80% es fecundado y comienzan a dividirse, al menos, hasta el estadio de 2 a 4 clulas. Sin embargo, slo un 25- 40% alcanza el estadio de blastocisto (B) o blastocisto expandido luego del cultivo durante 6-7 das. Esto indica que el cultivo embrionario, correspondiente al paso ms prolongado dentro del proceso de produccin in vitro, es el perodo en el que se establece el mayor porcentaje de prdidas del sistema. A su vez, durante esta etapa, se define en gran medida la calidad de los embriones obtenidos.FECUNDACIN DE LOS OVOCITOS.Consiste en incubar los vulos madurados con espermatozoides vivos y mviles durante un periodo de 6 a 24 horas, luego de un proceso de seleccin y capacitacin espermtica que nos permitir a su vez deshacernos de componentes del plasma seminal, crio protectores y espermatozoides muertos o con escasa vitalidad. La capacitacin espermtica generalmente se logra exponiendo los espermatozoides vivos a concentraciones de heparina y cafena, entre otras. Estas sustancias logran estimular el proceso de capacitacin del espermatozoide que lo prepara para interaccionar y fecundar el vulo. Una vez que disponemos de ovocitos maduros, el siguiente objetivo es lograr la fecundacin de los mismos, para ello se incuban junto con espermatozoides capacitados en un medio suplementado con fuentes energticas (piruvato, lactato) y albmina srica. En la especie bovina, la capacitacin espermtica se ve favorecida por la incorporacin de heparina al medio. No obstante, para lograr unos resultados ptimos es necesario ajustar la concentracin de heparina y el nmero de espermatozoides para cada eyaculado concreto. En el caso de la fecundacin in vitro, los ovocitos madurados son cocultivados con espermatozoides en medios especiales y en un ambiente controlado por estufas de cultivo por un tiempo comprendido entre 5-24 hs dependiendo del protocolo, la concentracin de espermatozoides y la calidad del semen utilizado. Con el fin de lograr los procesos de capacitacin, reaccin del acrosoma y pasaje a travs de las barreras ovo citaras, el semen debe ser tratado rpidamente antes de cocultivar los espermatozoides con los ovocitos. Este tratamiento incluye la eliminacin de todos los elementos presentes (plasma seminal,

Componentes del diluyente en caso de semen congelado-descongelado, contaminantes, etc) excepto los espermatozoides y una seleccin de los espermatozoides vivos y con motilidad progresiva. Esto se logra mediantes tcnicas basadas en la migracin de los espermatozoides (swim up), la centrifugacin en gradientes de densidad (percoll) y filtracin (lana de vidrio). De estas las ms utilizadas son el swim up y el percoll. Posteriormente se procede a iniciar el proceso de capacitacin espermtica que habitualmente se establece dentro del tracto reproductor femenino. Los dos elementos que juegan un rol importante para que esto se logre in vitro son; Incorporacin de sustancias inductoras de la capacitacin espermtica como la heparina. Utilizacin de semen congelado-descongelado, proceso que induce cambios procapacitantes en los espermatozoides as conservados. Por ltimo se efecta la dilucin y el conteo de los espermatozoides motiles para alcanzar habitualmente una dosis inseminarte de 1-6 millones de espermatozoides por ml de medio de

CULTIVO Y MEDIOS

En la produccin in vitro de embriones, los elementos constitutivos de los medios, son de importancia capital. El mayor componente de los medios de cultivo es el agua, conteniendo tambin iones inorgnicos (con funciones catalticas y fisiolgicas) (Palas AT y col, 2000); aminocidos, implicados en la sntesis proteica y vitaminas, que juegan un papel importante como coenzimas en el metabolismo (Lehninger AL, 1975).

Diversos autores han estudiado el efecto de la adicin de hormonas, tales como LH, FSH y 17 estradiol, en los medios de maduracin y desarrollo. Como alternativa, se pueden emplear suero de vaca en celo (SVC) y/o licor folicular bovino (LFb), componentes biolgicos, ms econmicos (Larocca y col; 1993; 1997).Se ha estudiado el efecto de adicionar LFb a diferentes concentraciones y proveniente de diferentes fuentes al medio de maduracin y/o de desarrollo, encontrndose efectos positivos (Larocca y col, 2004).

El LFb contiene esteroides,glucosaminoglicanos y muchos otros metabolitos sintetizados por las clulas de lateca folicular (Romero y Sidel, 1994; Sirard y col, 1995).Una forma de suplementar protenas a los embriones in vitro es mediante la adicin al medio de suero fetal bovino (SFb) o de albmina de suero bovino (BSA).(Palasz AT y col, 2000). El SFb y la BSA afectan al pH del medio y actan como quelantes de iones metlicos, contienen factores de crecimiento y ciertas cantidades variables de hormonas que inciden en la diferenciacin y proliferacin celular (Ball y col, 1985).

Los medios de cultivo suelen ser complementados de forma estandarizada con antibiticos para suprimir el crecimiento de microorganismos contaminantes.

Otros requerimientos de cultivo son la temperatura, el pH, dixido de carbono y tensin de oxgeno, osmolaridad y humedad relativa. La osmolaridad ptima en medios decultivo de embriones bovinos est en el rangode 275 a 285 mOsm. (Gordon, 1994).

El pH del mediode cultivo debe estar entre 7,2 y7,4, mientras que enlos mediosde fecundacin, se recomienda ligeramente superior (7,6-7,8) (Palasz AT y col,2000). Las condiciones habituales de las distintas etapas de cultivo de embriones son 5%de CO2 y 95% de aire.El dixido de carbonoresulta necesario para la regulacindel pH intracelular (Carner y Bavister, 1986).La temperatura de cultivo utilizada en general por los investigadores es de 38,5Ccon 100% de humedad.

MADURACIN IN VITRO

La meiosis permanece detenida en los ovocitos que se encuentran en los folculos hasta que estos son expuestos a gonadotrofinas que permiten su continuacin. La meiosis in vivo es detenida por sustancias foliculares que an no estn bien definidas. Sin embargo, los COCs que son removidos desde los folculos, comienzan la meiosis espontneamenteEn el proceso de maduracin in vivo de los ovocitos, intervienen la hormona folculo estimulante (FSH) en el crecimiento folicular, la hormona luteinizante(LH), que induce la maduracin final y la ovulacin del ovocito seleccionado (12,38, 44). Varios autores han indicado que para que el proceso de maduracin se lleve a cabo debe existir un balance hormonal en el folculo (particularmente de los esteroides) (25). En un sistema in vitro, este balance natural es imitado agregando las hormonas FSH, LH y estradiol 17 al medio de maduracin (TCM-199). En algunos laboratorios la adicin directa de estas hormonas ha sido substituida agregando suero de vacas en celo (SVC) y licor folicular bovino (LFb). Estos componentes biolgicos son suficientes para producir maduracin (nuclear y citoplasmtica), expansin de las clulas del cmulus y futuro desarrollo delcigoto.1. Transferencia de embriones

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Dia 4-5

Dia 6 Da 7

Ventajas.

Evaluacin eficiente de la capacidad fertilizante de espermatozoides y ovocitos. Difusin del uso de semen valioso y escaso. Prolongacin de la vida reproductiva de animales genticamente valiosos, inmaduros o muy viejos. Creacin de bancos de gametos provenientes de animales seleccionados por excelencia productiva y/o adaptabilidad. Determinacin y seleccin del sexo de embriones. Control de enfermedades de la esfera reproductiva. Aplicacin de la transferencia de embriones en especies exticas y en peligro de extincin Permite obtener descendientes de hembras de elevada calidad gentica que deban ser sacrificadas por padecer enfermedades, infertilidad, por su avanzada edad o durante los programas de erradicacin de enfermedades infecciosas (tuberculosis, brucelosis, leucosis). Permite el aprovechamiento de animales con determinadas formas de infertilidad: machos con oligospermias severas, hembras con alteraciones estructurales o funcionales del tracto genital.Desventajas.

Bajo rendimiento, el porcentaje de ovocitos capaces de transformarse en embriones transferibles se encuentra estancado entre el 30 y 40%. Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los obtenidos in vivo. Reduccin del potencial de desarrollo pre y postimplantacional, ocasionando bajos porcentajes de gestacin (30 a 40%). Existe una escasa resistencia a la Criopreservacin, dificultando su conservacin a largo plazo. Incremento de la mortalidad embrionaria, abortos, problemas gestacionales como el hidroalantoides y alargamiento de la gestacin. Nacimiento de terneros muy voluminosos, con anomalas estructurales y funcionales, conocido con el nombre de sndrome de exceso de volumen fetal, que disminuyen el vigor de los animales en el momento de su nacimiento y provocan una mayor mortalidad peri natal.

Obtencin de ovocitos

Maduracin de ovocitos

Seleccin de ovocitos

Aspiracin intravaginal de ovocitos

Donantes de ovocitos

2. Maduracin de ovocitos

3. Fertilizacin In vitro

Capacitacin de espermatozoides

Fecundacin de los ovocitos maduros

Lavado de los cigotos (eliminacin de clulas del cumulus y espermatozoides)

Seleccin de cigotos fertilizados y colocacin del cultivo

4. Maduracin de embriones

Cultivo de los cigotos y cambio cada 48 horas los medios de cultivo

Seleccin de receptoras y seleccin de blastocitos

Transferencia de embriones

5. Transferencia de embriones

Programa de Zootecnia