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INTRODUCCION

En Chile, la infección por hantavirus es unazoonosis endémica que ha generando casos hu-manos desde las VI a XI regiones. Mediantetrampeo de roedores se ha observado la circula-ción de hantavirus en ratones capturados desdela Región Metropolitana hasta la XI Región.Hasta ahora se ha determinado la presencia dehantavirus en Oligoryzomys longicaudatus yen Abrothrix longipilis, existiendo especímenesserológicamente positivos de otras especies, peroen las cuales no se ha detectado la portación devirus.

Artículo relacionado de C. Pavletic B.en pág. 186

Técnicas diagnósticas de infección humana porhantavirus

T.M. HECTOR GALENO A.1, ELIECER VILLAGRA C.1, B.Q. JORGE FERNANDEZ O.1, B.Q. EUGENIO RAMIREZ V.1 y M.V.JUDITH MORA R.1

1 Instituto de Salud Pública de Chile, Sección Virología.

DIAGNOSTIC TECHNIQUES FOR HANTAVIRUS HUMAN INFECTION

Hantavirus are enveloped viruses with trisegmented RNA. American isolatesbelong to subfamily Sigmodontinae rodents and can cause hantavirus cardiopulmonarysyndrome (HCPS) while European and Asiatic hantavirus belong to subfamiliesMurinae and Arvicolinae and can produce hemorragic fever with renal syndrome. Inthis article the laboratory techniques employed at the present time to certify humanhantavirus infection are described.

Key words: Hantavirus; Laboratory diagnosis; Serology; RT-PCR; Immuno-histochemistry; Isolation.

Desde su reconocimiento en Chile, a juniodel 2000 se han notificado 119 casos de síndro-me cardiopulmonar por hantavirus (SCPH), conuna letalidad cercana a 50%. Por otra parte, sehan detectado casos de infección por hantavirusque no han cursado con SCPH, incluyendo ca-sos de infección asintomática (Informe de Si-tuación Epidemiológica de Hantavirus, Julio2000, MINSAL). Por la frecuente presentaciónen conglomerados de casos relacionados y porotros antecedentes, no es posible descartar cate-góricamente la transmisión persona a personaen etapas tempranas de la infección. Este fenó-meno parece ser propio de los hantavirus circu-lantes en Chile y Argentina.1-3 Un elementoimportante para la sobrevida de los pacientes esla sospecha y el diagnóstico precoz de la infec-

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Suplemento: Infección por hantavirus en Chile

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ción por hantavirus, lo que permite iniciar unmanejo oportuno del caso, mejorandosignificativamente la sobrevida de estos pacien-tes.4 Además, facilita una rápida acción en ellugar probable de contagio de estos pacientes.

Generalidades

El género Hantavirus es uno de los 5 génerosde la familia Bunyaviridae. Este género es elúnico de la familia que no se transmite a travésde artrópodos hematófagos. Los otros 4 géne-ros (Bunyavirus, Nairovirus, Phlebovirus yTospovirus) constituyen los arbovirus (arthro-pod-borne viruses). La transmisión de loshantavirus desde los roedores al humano ocurremediante la aerolización de orina, heces o salivade roedores portadores crónicos del virus.5

Los hantavirus, al igual que los arbovirus,poseen genoma ARN trisegmentado: segmentoS (short), segmento M (medium) y segmento L(large). El segmento S codifica para lanucleoproteína (o proteína del core viral), elsegmento M codifica para las 2 proteínas deenvoltura, el segmento L codifica para proteí-nas no estructurales (polimerasa viral). Desdeel punto de vista morfológico, los hantavirusson de forma esférica u oval, de 70 a 120 nm dediámetro. El componente proteico mayor lo cons-tituyen las moléculas de nucleoproteína queestructuran la nucleocápside y ésta contiene alARN genómico en su interior. La nucleocápsideestá rodeada por la envoltura viral, conformadapor una bicapa lipídica (suministrada por lacélula huésped) y por las glicoproteínas de laenvoltura viral (G1 y G2).

Dentro del género Hantavirus se han recono-cido diferentes especies, cepas, serotipos, aisla-dos o variantes (estas diferentes denominacio-nes pueden ser consideradas como sinónimos).Debido a las dificultades de manejo de estosvirus, a la fecha no se ha podido establecer unaclasificación exacta de ellos. Se ha aceptado eluso de la secuenciación de ácidos nucleicospara establecer las relaciones taxonómicas en-tre hantavirus circulantes en diferentes hábitats,aun partiendo de ácidos nucleicos virales recu-perados directamente de tejidos o sangre.6 Sinembargo, diferencias genéticas no necesaria-

mente significan diferencias estructurales o fun-cionales.

Desde el punto de vista evolutivo, loshantavirus parecen haberse adaptado a diferen-tes especies de roedores y juntos hancoevolucionado.7 Los hantavirus americanosprovienen de la subfamilia de roedores Sigmo-dontinae y pueden causar el síndromecardiopulmonar por hantavirus (SCPH) mien-tras que los hantavirus europeos y asiáticosprovienen de las subfamilias Murinae yArvicolinae, que pueden producir la fiebrehemorrágica con síndrome renal (HFRS).8-11 Ala fecha, no se conoce el o los factores viralesque determinan la correspondiente manifesta-ción clínica de los hantavirus provenientes delas diferentes subfamilias de roedores. La rele-vancia de los hantavirus americanos radica enla elevada letalidad observada (40-60%). Loshantavirus americanos que más casos humanoshan causado (casos notificados) son: el virusSin Nombre (SNV) del ratón norteamericanoPeromyscus maniculatus, y el virus Andes(AND) del ratón sudamericano Oligoryzomyslongicaudatus.12-15

Un virus propio de una especie de roedorpuede infectar a otras especies que compartanel mismo hábitat (fenómeno denominadospillover). Sin embargo, la infección en estaotra especie es autolimitada y no tiene mayorrelevancia epidemiológica. Desde el punto devista del laboratorio, es posible detectaranticuerpos anti hantavirus en esta especie se-cundaria, pero es poco probable la detección devirus o genoma viral. Esto no excluye que dos omás virus diferentes puedan circular en un mis-mo hábitat.

La infección en el ratón no parece tener ma-yores consecuencias para su huésped. Se puededetectar la presencia de virus tanto en sangre,muestras de diferentes órganos, así como ensecreciones, orina y deposición del roedor in-fectado. En humanos, después de ocurrir unainfección preliminar en células de la mucosa delas vías respiratorias, los virus pasan al torrentecirculatorio, iniciando ciclos de multiplicacióngeneralizada. Las células blanco de la infecciónson las células endoteliales de los vasos sanguí-

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neos.16 Mediante el análisis de necropsias se hapodido visualizar la presencia de proteínas oácidos nucleicos virales en diferentes órganos,especialmente asociados al endotelio capilar.17,

18 No se observa necrosis de tejido, se aprecia lapresencia de inmunoblastos en mayor o menorcantidad. En la infección con hantavirus ameri-canos es poco común observar microhemorra-gias; en el tejido pulmonar se observa la con-densación de material proteináceo en losalvéolos, reflejando el paso de plasma hacia eseespacio. Al parecer, las células endoteliales in-fectadas sufren una alteración funcional que lesimpide mantener las uniones intercelulares, de-jando poros que permiten el paso libre de plas-ma y generando consumo masivo de plaquetas.La recuperación de la permeabilidad selectivanormal de los vasos sanguíneos pasa por elrecambio de las células pero también impidien-do la infección de nuevas células endoteliales.Parece ser que la respuesta inmune juega un rolimportante en la superación de la infección através de la producción de anticuerposneutralizantes. Los pacientes que logran recu-perarse de esta infección no muestran mayoresseñales de secuelas macro o microscópicas delproceso.

Para explicar las diferencias en la expresiónde la infección por hantavirus en diferentesindividuos hay que tener presente: la variantefuncional viral, la dosis infectante y la rapidezde la generación de anticuerpos neutralizantes,entre otros factores. En nuestro medio, ademásdel síndrome clásico, podemos observar perso-nas que cursan la infección sin manifestar sín-tomas, o personas que presentan síntomas sinpasar por la fase cardiopulmonar. El estudio deestas diferencias nos puede proveer de nuevosconocimientos para enfrentar de mejor modo elproblema.

Diagnóstico de la infección humanapor hantavirus

Frente a la sospecha clínico-epidemiológicade infección aguda por hantavirus es necesariorecurrir al diagnóstico específico realizado porel laboratorio que certifique o descarte la infec-ción. El laboratorio debe disponer de tests sen-

sibles y específicos, capaces de detectarprecozmente la infección.

Pruebas serológicasLa manera más cotidiana de realizar diag-

nóstico de infección aguda es mediante la detec-ción de IgM específica anti hantavirus. Al mo-mento de plantearse la sospecha de infección, lamayoría de los pacientes ya presentan respuestade IgM, o bien ésta se desarrolla a los pocosdías después. Este diagnóstico precoz por IgMpuede ser acompañado por la detección de IgG.La aparición de IgG específica ocurre pocosdías después de la aparición de IgM. La IgMpuede acompañar al paciente convaleciente poral menos 6 a 8 meses, mientras que la IgGparece perdurar a niveles elevados durante va-rios años.19

Para la detección de IgM se prefiere la utili-zación de ensayos tipo ELISA de captura porser altamente sensibles y específicos. No obs-tante, en toda prueba serológica hay que teneren consideración las características de losantígenos utilizados. A mayor homologíaantigénica con las variantes de una determinadaárea geográfica, mayor será la sensibilidad deltest. En el cono sur de América parece habercercanía antigénica entre las diferentes varian-tes o cepas circulantes (virus Andes, LagunaNegra, etc.). Esta relación es menos cercanacon los virus Sin Nombre de Norteamérica oPuumala de Europa. Los virus asiáticos (porejemplo Hantaan, Seuol) parecen ser claramen-te divergentes; por lo tanto, las pruebasserológicas que sólo contienen materialantigénico de estos virus no son recomendadaspara diagnóstico del SCPH.

Detección viralBajo ciertas circunstancias no es posible rea-

lizar el descarte o comprobación serológica deinfección por hantavirus, ya sea por no dispo-ner de la muestra apropiada o bien por estarfrente a un paciente seronegativo que ha evolu-cionado rápidamente con resultado de muerte,en el cual podemos sospechar que la respuestainmune humoral no se ha establecido aún. Laopción es el diagnóstico directo ya sea mediantela detección del genoma viral, de proteínasvirales (antígenos) o del virus propiamente tal.

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Acidos nucleicosUna alternativa posible es la detección del

ácido ribonucleico viral (ARN) ya sea en mues-tras de sangre (coágulo) u otros tejidos obteni-dos en la autopsia (pulmón, hígado, riñón, bazo)utilizando la tecnología de transcriptasa reversa-reacción de polimerasa en cadena TR-RPC (RT-PCR en su original anglosajón). Esta metodolo-gía es altamente sensible y específica para ladetección de ácidos nucleicos virales, tanto entejidos como en sangre u otros fluidos de pa-cientes con infección aguda por hantavirus.20

En este tipo de muestras se realiza la extraccióndel contenido total de ARN y con este materialultra puro se realiza la prueba de TR-RPC, queconsiste en la transcripción reversa (TR) espe-cífica del ARN blanco a cADN y luego laamplificación específica del cADN medianteciclos térmicos con enzima ADN polimerasa(RPC). El producto final de estas reacciones esanalizado mediante electroforesis en geles deagarosa o poliacrilamida. La presencia de ban-da de ADN en la posición esperada según eltamaño molecular y ausencia de ellas en loscontroles negativos, es indicativa de la presen-cia del ARN de hantavirus en el tejido examina-do. La posibilidad de detección de ARN viral vadisminuyendo en la medida que ocurre la elimi-nación de virus de los tejidos o de la sangre porparte del sistema inmune del huésped. Un frentede inconvenientes para la TR-RPC puede pro-venir de la posibilidad de mutaciones espontá-neas del ARN blanco, o de estar frente a unavariante genética que pueda involucrar cambiosen la secuencia genética de ciertas posicionesclaves para el reconocimiento por parte de lospartidores (primers) propios de la prueba. Paradiagnóstico se prefiere la selección de partidorescomplementarios a secuencias genéticas alta-mente conservada entre los diferentes hantavirus(por ejemplo, el segmento S que codifica para lanucleoproteína viral).9

Antígenos viralesOtra alternativa en uso para diagnóstico la

constituye la detección de proteínas virales di-rectamente en cortes de tejidos (técnicas deinmunohistoquímica). Mediante el uso de sue-ros hiperinmune anti hantavirus y los respecti-vos conjugados y sustratos se pueden visualizar

los depósitos de proteínas virales especialmenteasociados a las células endoteliales en tejidosfijados de los diferentes órganos, ya sea pul-món, hígado, bazo, etc.18

Aislamiento viralFinalmente, otra alternativa para la detec-

ción de hantavirus puede ser el cultivo viral (oaislamiento viral) en células Vero E6. En lapráctica, no constituye un procedimiento útilpara muestras humanas dado el bajo rendimien-to, demora en entregar resultados, necesidad deinfraestructura (bioseguridad nivel 3) y recur-sos humanos adiestrados, etc. Sin embargo,para fines de investigación puede ser muy útilpara en la obtención de cepas y su posteriorcaracterización. Una de las razones principalesdel bajo rendimiento en muestras humanas esque cuando se establece la sospecha de infec-ción por hantavirus y se toman muestras, lospacientes ya presentan anticuerpos que neutra-lizan la capacidad infectiva de los viriones pre-sentes en la muestra, inhibiendo su adherencia ala superficie de las células del frasco de culti-vo.21

RESUMEN

Los hantavirus son virus envueltos, de genomaARN trisegmentado. Los hantavirus america-nos provienen de la subfamilia de roedoresSigmodontinae y pueden causar el síndromecardiopulmonar por hantavirus (SCPH) mien-tras que los hantavirus europeos y asiáticosprovienen de las subfamilias Murinae yArvicolinae que pueden producir la fiebrehemorrágica con síndrome renal. En este artícu-lo se describen las técnicas de laboratorio desa-rrolladas al momento actual para certificar lainfección por hantavirus en humanos.

BIBLIOGRAFIA

1.- WELLS R M, SOSA E S, YADON Z E et al. Anunusual hantavirus outbreak in southern Argentina:person-to-person transmission? Emerg Infect Dis1997; 3: 171-4.

2.- PADULA P J, EDELSTEIN A, MIGUEL S D L,LOPEZ N M, ROSSI C M, RABINOVICH R D.

Técnicas diagnósticas de infección humana por hantavirus - H. Galeno A. et al

Hantavirus pulmonary syndrome (HPS) outbreak inArgentina: molecular evidences for person-to-persontransmission of Andes virus. Virology 1998; 241:323-30.

3.- ENRIA D, PADULA P, SEGURA E et al. HantavirusPulmonary Syndrome in Argentina: possibility ofperson to person transmission. Medicine 1996, 56:709-11.

4.- TAPIA M. Síndrome Pulmonar por Hantavirus. RevChil Enf Respir 1997; 13: 103-10.

5.- TSAI T F. Hemorrhagic fever with renal syndrome:Mode of transmission to human. Lab Anim Sci1987; 37: 428-30.

6.- FELDMANN H, SANCHEZ A, MORZUNOV S etal. Utilization of autopsy RNA for the synthesis ofthe nucleocapsid antigen of a newly recognized vi-rus associated with hantavirus pulmonary syndrome.Virus Res 1993; 30: 351-67.

7.- HJELLE B, JENISON S, TORREZ-MARTINEZ Net al. A novel hantavirus associated with an outbreakof fatal respiratory disease in the southwesternUnited States: evolutionary relationships to knownhantaviruses. J Virol 1994; 68: 592-6.

8.- DUCHIN J S, KOSTER F T, PETERS C J et al.Hantavirus pulmonary syndrome: a clinicaldescription of 17 persons with a newly recognizeddisease. N Engl J Med 1994; 330: 949-55.

9.- NICHOL S, SPIROPOULOU C, MORZUNOV S etal. Genetic identification of a novel hantavirusassociated with an outbreak of acute respiratoryillness in the southwestern Unites States Science1993; 262: 914-7.

10.- SCHMALJOHN C, HJELLE B. Hantavirus: a glo-bal problem. Emerg Infect Dis 1997; 3(2): 95-104.

11.- CHILDS J, BRYAN R. HPS in the Americas. InManual of Hemorrhagic Fever with Renal Syndromeand Hantavirus Pulmonary Syndrome, 1999. WHOCollaborating Center for Virus Reference andResearch, pp: 63-73.

12.- CHILDS J E, KSIAZEK T G, SPIROPOULOU C Fet al. Serologic and genetic characterization ofPeromyscus maniculatus as the primary rodent

reservoir for a new hantavirus in the southwesternUnited States. J Infect Dis 1994; 169: 1271-80.

13.- LEVIS S C, MORZUNOV S P, ROWE J E et al.Genetic diversity and epidemiology of hantavirusesin Argentina. J Infect Dis 1998; 177: 529-38.

14.- LOPEZ N, PADULA P, ROSSI C, LAZARO M E,FRANZE-FERNANDEZ M T. Genetic identificationof a new hantavirus causing severe pulmonarysyndrome in Argentina. Virology 1996; 220: 223-6.

15.- LOPEZ N, PADULA P, ROSSI C et al. Geneticcharacterization and phylogeny of Andes virus andvariants from Argentina and Chile. Virus Res 1997;50: 77-84.

16.- ZAKI S R, GREER P W, COFFIELD L M et al.Hantavirus pulmonary syndrome: pathogenesis ofan emerging infectious disease. Am J Pathol 1995;146: 552-79.

17.- ZAKI S, KHAN A, GOODMAN R et al, Retrospec-tive diagnosis of hantavirus pulmonary syndrome,1978-1993. Arch Pathol Lab Med 1996; 120: 134-9

18.- ZAKI S. Nolte K. Pathology, Immunohistochemistryand in situ hybridization. In Manual of HemorrhagicFever with Renal Syndrome and HantavirusPulmonary Syndrome, 1999. WHO CollaboratingCenter for Virus Reference and Research, pp: 142-54.

19.- ROSSI C A, KSIAZEK T G. Virus detection andidentification with serological tests. In Manual ofHemorrhagic Fever with Renal Syndrome andHantavirus Pulmonary Syndrome, 1999. WHOCollaborating Center for Virus Reference andResearch, pp: 87-91.

20.- HJELLE B. Virus detection and identification withgenetic test. In Manual of Hemorrhagic Fever withRenal Syndrome and Hantavirus PulmonarySyndrome, 1999. WHO Collaborating Center forVirus Reference and Research, pp: 132-7.

21.- LEE H W. Virus isolation. In Manual ofHemorrhagic Fever with Renal Syndrome andHantavirus Pulmonary Syndrome, 1999. WHOCollaborating Center for Virus Reference andResearch, pp: 75-9.

Correspondencia a:Héctor Galeno A.Fax : 56 (2) 350 7583Email: hagaleno@yahoo.com

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