Tecnicas histol´ ogicas´ AMPLIACIONES - Universidade de Vigo · elecci on del jador, formaci on...

Atlas de Histologıa Vegetal y Animal

Tecnicas histologicasAMPLIACIONES

Manuel Megıas, Pilar Molist, Manuel A. Pombal

Departamento de Biologıa Funcional y Ciencias de la Salud.Fcacultad de Biologıa. Universidad de Vigo.

(Version: Agosto 2018)

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Contenidos

1 Artefactos 1

2 Hematoxilina 6

3 Tabla de colorantes 8

4 Desenmascaramiento de antıgenos 14

Tecnicas histologicas. Ampliaciones. 1

1 Artefactos

Un artefacto se define como cualquier alteracion inde-seada introducida en una muestra de tejido debido alas tecnicas de procesamiento que se realizan para suobservacion. Pueden ser espacios sin tejido, roturas,pliegues, colores anormales, precipitados, burbujas deaire, etcetera. En algunas ocasiones son inevitables,pero en la mayorıa de los casos son consecuencia deun mal procesamiento histologico. Reconocer estas al-teraciones es esencial para una buena interpretaciony diagnosis de la muestra, especialmente si tratamoscon muestras patologicas.

Los artefactos se pueden introducir en cualquierpaso del proceso histologico, desde la toma de la mues-tra hasta el montaje para su observacion. Vamosa describir los artefactos cronologicamente segun elmomento de la tecnica histologica donde pueden serintroducidos: obtencion de la muestra, fijacion, in-clusion, corte, tincion y montaje.

Obtencion de la muestra

Numerosos artefactos observados con el microsco-pio son consecuencia de un proceso de necropsia,es decir, ha transcurrido un tiempo excesivo entreel cese del flujo sanguıneo y la fijacion del tejido.Por ejemplo, 3 minutos postmortem son suficientespara producir expansiones de las vellosidades intesti-nales. Ademas, se pierde nitidez en los lımites delas membranas y descamacion en epitelios, sobre todoprismaticos o columnares. Por tanto, hay que procu-rar que la fijacion siga inmediatamente a la extracciondel tejido, y que el tamano de la pieza no sea muygrande. En el caso de muestras grandes o animalespequenos, es recomendable la fijacion por perfusion.

Durante la obtencion de las muestras de tejidos esrecomendable evitar deformarla y/o perforarlas du-rante su manipulacion, puestas que estas alteracionesno pueden ser corregidos durante la fijacion. En laextraccion de biopsias hay que tener en cuenta a quetratamiento se ha sometido previamente a la mues-tra. Ası, podemos encontrar restos de sutura, col-orantes que han delimitado la region, polvos de talcode los guantes, demasiado anestesico, metodos de ob-tencion que emplean calor, etcetera. Todo ello puede

introducir alteraciones que tendran que ser tenidas encuenta.

Figura 1. Danos provocados durante el proceso de ex-traccion en la piel.

En algunos casos hay que tener en cuenta la difer-ente dureza entre partes de la muestra a obtener. Sepueden producir roturas o espacios sin tejido entrelas partes duras y las blandas. Otro ejemplo son lasmuestras de retina, donde la dureza al corte de la es-clerotica facilita que se desprendan los segmentos ex-ternos de los fotorreceptores del epitelio pigmentario(algo similar a lo que se produce en los desprendimien-tos de retina), creando un espacio artefactual.

Fijacion

Durante la fijacion se pueden producir diversasalteraciones del tejido consecuencia de una malaeleccion del fijador, formacion de pigmentos de he-mateına o de formalina acida, adherencia de las mues-tras al recipiente de fijacion, cantidad o tiempo inade-cuados de fijador, muestras muy grandes, etcetera.

En la fijacion por inmersion se recomiendan piezasno superiores a 6 mm, siendo el volumen de fijadorunas 20 veces el volumen de la muestra. En histopa-tologıa, el fijador usado normalmente es la formalinaal 10%. Una fijacion muy prolongada dificulta la ob-tencion de secciones por endurecimiento del tejido,pero ademas puede producir retracciones del mismo.Es recomendable usar el fijador en soluciones amor-tiguadoras de pH para evitar posibles retracciones oexpansiones del tejido producidas por el uso de solu-ciones hipertonicas o hipotonicas, respectivamente.La fijacion excesiva no solo altera la consistencia del

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tejido sino tambien sus caracterısticas bioquımicasy reactivas, siendo posible por tanto los falsos posi-tivos y/o negativos. Se puede producir contaminacioncon herrumbre cuando el frasco usado para la fijaciontiene componentes metalicos, como puede suceder conla tapa del frasco.

Por otro lado, la eleccion del fijador ha de con-siderar el medio de inclusion, el metodo de cortey la tecnica de tincion. Por ejemplo, hay fijadoresque no son apropiados para inclusiones en parafina,como es una elevada concentracion de glutaraldehıdo,tetroxido de osmio, acroleına y otros. Sin embargo,estos mismos fijadores sı son apropiados para inclu-siones en resinas. Por otro lado, los fijadores con acidopıcrico no son los mas adecuados para las tecnicas in-munohistoquımicas.

Deshidratacion-Inclusion

Si tras la fijacion se ha de retallar la muestra parasu inclusion hay que evitar que queden restos de tejidoen la muestra que a incluir. Las muestras con partesque pueden desprenderse han de procesarse por sep-arado para evitar que un bloque contenga tejidos demuestras diferentes.

La inclusion en parafina siempre tiene un paso pre-vio de deshidratacion, puesto que la parafina no eshidrosoluble. Esto paso implica sustituir el agua dela muestra por alcohol, este por la sustancia aclarante(normalmente xileno) y esta ultima por la parafina.Si el agua permanece en el tejido, la parafina no pen-etrara y la inclusion sera defectuosa. Los alcoholespierden gradacion por la incorporacion de agua de laatmosfera y de las propias muestras. Por ello, siem-pre que sea posible, se han de usar alcoholes recienpreparados o con pocos usos. En caso de encontrarnosdefectos que supongamos consecuencia de una maladeshidratacion, las muestras pueden volver a la est-ufa para licuar la parafina e hidratarse de nuevo, yası hacer una nueva inclusion.

Si la deshidratacion no es adecuada pueden for-marse cristales del fijador que permanecen en el tejido.Ademas, la presencia de restos de agua en la mues-tra acarrea problemas de corte, provoca a una malatincion de esa zona y resulta en una mayor opacidaddel tejido. Pero si la deshidratacion es excesiva en el

tiempo, los tejidos se pueden volver fragiles y duros,lo que puede interferir con el proceso de corte y conlos colorantes.

Es muy importante que las muestras no se sequendurante la deshidratacion, especialmente en el paso dela sustancia de aclarado. De lo contrario, se puedencrear y retener burbujas de aire en la muestra queluego apareceran como zonas comprimidas de tejidorodeando a espacios vacıos. Si el tiempo en el lıquidoaclarante ha sido largo, se producen retracciones deltejido.

Si la inclusion en parafina no fue buena, las sec-ciones se estiraran muy rapidamente cuando se colo-can en el bano con agua caliente, lo que puede provo-car que las estructuras tisulares se separen unas deotras, como ocurre con epitelios, cartılagos, etcetera.Tambien pueden aparecer grietas. La mala infil-tracion de la parafina puede estar causada por unamala fijacion, deshidratacion, aclarado o tiempo in-suficiente en la propia infiltracion.

Figura 2. Imagenes de retina. A) Una deficiente deshidrat-acion provoa densidades diferentes que al cortar provoca laseparacion de los tejidos con diferente consistencia. B) Lainclusion fue adecuada y los tejidos permanecen guardandosu organizacion inicial.



Trazas de los lıquidos de deshidratacion y aclaradoen la muestra incluida pueden llevar a secciones conarrugas, que no se estiraran durante el estiramiento,ni cuando se monten en el portaobjetos. Ademas, estaporcion del tejido se tenira mas intensamente puestoque los colorantes tienen acceso al tejido por las dossuperficies.

Si el medio de inclusion es mas duro que la mues-tra se producen arrugas y grietas. Hay tener especialcuidado cuando se manipulan las muestras con pinzascalientes durante el proceso de inclusion, estos instru-mentos no deben estar sobrecalentados.

Corte

Una mala sujecion de la cuchilla o de cualquier otrapieza del microtomo puede llevar a secciones con difer-ente grosor en diferentes partes de la muestra, o in-cluso a la perdida de la muestra. Tambien cuandoel angulo de la cuchilla es erroneo o la cuchilla noesta bien afilada. El angulo de inclinacion posible dela cuchilla en los microtomos modernos puede oscilarentre 10o-15o. Si el angulo es muy agudo la cuchillacomprime el tejido, normalmente donde el tejido esmas blando. Igual compresion y arrastre del tejidoocurre en cuchillas mal afiladas.

Cuando se selecciona un grosor de corte muy del-gado las secciones pueden salir arrugadas y a vecesno es posible estirarlas en el agua. Se pueden pro-ducir secciones incompletas por una mala inclusion oporque se ha elegido un grosor de corte muy delgado.Si la cuchilla esta mellada se producen roturas estri-adas en las secciones. Conviene que la muestra estecompletamente rodeada por medio de inclusion paraque la cuchilla no “ataque” directamente a la muestra,lo cual podrıa deformarla o danarla.

Estiramiento de los cortes

El agua que se emplea para estirar los cortesdebe ser destilada, para que al evaporarse no quedencristales, y limpia para que no haya restos extranos.Ademas, durante el secado de los cortes, deben pro-tegerse del polvo o partıculas.

Cuando la temperatura del agua es muy alta o muybaja pueden generarse grietas en las secciones. Siesta muy alta se producen expansiones del tejido y

Figura 3. Estrıas producidas en el corte por una cuchillamellada.

pueden aparecer nucleos picnoticos y burbujas nucle-ares. Tambien hay que tener en cuenta la distribucionde las secciones para evitar que se solapen o se ar-ruguen por falta de espacio durante el estiramiento.

Los portaobjetos tienen que estar completamentelimpios y sin restos de ningun tipo. Si los portaob-jetos se han cubierto con el adherente en el propiolaboratorio (son muy comunes los portaobjetos recu-biertos con gelatina y alumbre de cromo y potasio), seha de tener especial cuidado en que no se produzcangrumos de la solucion sobre el portaobjetos cuando seesta secando en la estufa. Ademas, la solucion debeser transparente y, una vez sumergidos los portaob-jetos, deben escurrirse muy bien. Por otra parte, sila calidad del adherente usado no es buena, los cortespodrıan desprenderse total o parcialmente del por-taobjetos durante el procesado posterior.

Tincion

La eliminacion de parafina debe ser completa antesde la tincion porque los restos de parafina producenmala penetracion de los colorantes, alterando la cali-dad de la tincion.



Figura 4. Zona muscular de delfın cercana al pancreas.Pliegues del tejido muscular, que se observan a ambos la-dos de una arteria, formadas por no extender los cortes demanera correcta. Van Gieson.

Las soluciones de colorantes han de estar limpiasde microorganismos y filtradas para evitar artefactoscomo cristales o precipitados de colorante. Es unabuena practica filtrar la solucion del colorante antesde su uso.

Cuando se tinen las muestras mediante gota, nosumergiendo el portaobjetos en la solucion, hay queprocurar que todo el corte quede cubierto y que nose seque la solucion durante el tiempo de tincion paraque la tincion sea homogenea y evitar precipitados decolorante por evaporacion local.

Los artefactos mas frecuentes producidos durante latincion suelen deberse a un aclarado incompleto delcolorante y a la precipitacion de cristales de coloranteen el tejido. En algunos casos es necesario adaptarel tiempo de tincion a las caracterısticas de la mues-tra (grosor, dureza, etc.), para que el tejido se tinaadecuadamente.

Montaje

Una vez tenidas las secciones, la deshidratacion hade ser completa para evitar la aparicion de gotitasde agua en el medio de montaje. Si esto ocurre,

Figura 5. Tejido cartilaginoso con precipitados. Esto sedebe a no filtrar los colorantes o por formacion de precipi-tados en cortes que han estado almacenados durante ciertotiempo.

se puede solucionar sumergiendo otra vez las sec-ciones en xileno, alcohol absoluto y en alcoholes degradacion decreciente, hasta su hidratacion, y repi-tiendo la deshidratacion en mejores condiciones (solu-ciones nuevas, alargar tiempos, etc.). Sin embargo, enalgunos casos el tiempo en alcohol determina el gradode tincion, por los que habrıa que volver a pasar denuevo por las soluciones de colorantes.

El cubreobjetos tiene que estar limpio y hay quemanipularlo cogiendolo por los bordes. Ademas, nodeben quedar burbujas de aire durante el montaje yhay que tener cuidado con la cantidad de medio demontaje a utilizar: si es poco podrıa no cubrir todala seccion cuando se evapore el xileno. Si se anadeun exceso de medio de montaje se generara una capatan gruesa que no se podran utilizar objetivos de granaumento, como el de 100x. Estos objetivos tienen uandistancia focal muy corta, es decir, la lentes de estosobjetivos deben estar muy proximas a la muestra parapoder enfocarla. y el aumento del espesor normal delmedio de montaje se lo impedira. Del mismo modo,debe usarse un medio de montaje lo mas parecido acomo se obtuvo de la casa comercial puesto que con



el tiempo los medios de montaje suelen perder el dis-olvente y se vuelven mas viscosos. Esto hace que seamas difıcil conseguir una capa delgada y por tantoestamos en el mismo problema mencionado anterior-mente.

El corte no se debe secar una vez que sale del ultimoxileno y antes de anadir el medio de montaje puestoque se pueden generar burbujas. Si, tanto el por-taobjetos como el cubreobjetos, se ensucian duranteeste proceso por un exceso de medio de montaje (locual dificultarıa la visualizacion de la muestra en elmicroscopio), este se puede eliminar lavando cuida-dosamente la preparacion con xilol o limpiando conuna cuchilla afilada.

Figura 6. Durante el proceso de montaje final puedenquedar burbujas de aire entre el tejido y el cubre-objetos.

Figura 7. Pancreas delfın. Este artefacto se observacuando se realiza una mala deshidratacion del corte yatenido. El agua acumulada no protege al tejido que seseca apareciendo zonas negras. Van Gieson.

Consejo general

Antes de realizar cualquier tecnica histologica sedeben hacer pruebas con diferentes tiempos de fi-jacion, deshidratacion, inclusion y tincion. Aunquehay establecidos unos tiempos estandar para cada unode estos procesos hay que considerarlos orientativosporque cada tejido reacciona de diferente manera antelos distintos procedimientos histologicos.

Bibliografıa

Jimson S. Malathi L, Kumar GMK, Balachander N.2016. Artefacts in histologycal section. Biomedicaland pharmocology journal. 9: 843-845.

McInnes E. 2005. Artefacts in histopathology.Comparative clinical pathology. 13: 100-108.



2 Hematoxilina

La hematoxilina es un colorante natural que se obtienede la madera del arbol Haematoxylum campechi-anum. El nombre deriva del griego: haimatos: sangrey xylon: madera. La hematoxilina que se compraproviene directamente de estos arboles que son orig-inarios de America Central y del Sur. Aunque se haconseguido sintetizar en el laboratorio su produccionsigue siendo natural. Para su obtencion se astilla lamadera y se hierve. Se obtiene una solucion rojiza queluego se vuelve amarilla, y posteriormente negruzcacuando se vuelve a enfriar. El agua se evapora de-jando la hematoxilina cruda con una pureza que puedellegar al 10 %. Es necesario purificar posteriormentecon eter, secar y volver a cristalizar en ambiente acu-oso.

Como colorante fue introducido independiente-mente por Bohmer (1865) y Fischer (1875). Wos-sowzky (1876) introdujo la mezcla hematoxilina yeosina en una tincion.

El colorante no es realmente la hematoxilina sino lahemateına, la cual se consigue durante la preparaciondel colorante mediante la oxidacion quımica de lahematoxilina, aunque tambien se puede obtener poroxidacion del oxıgeno atmosferico dejandola madurardurante 6 a 8 semanas. El yodato sodico es el agenteoxidante mas comunmente usado (0.2 g oxidaran a 1g de hematoxilina). Otros son la iodina, el peroxidode hidrogeno, o el permanganato potasico. Esta ox-idacion continuara por la accion atmosferica y si elcolorante es muy viejo se puede producir una sobre-oxidacion que resultara en malas tinciones. Esta tasade oxidacion se puede reducir anadiendo glicerol o unalcohol a la solucion. Normalmente se anade la mitaddel oxidante necesario para oxidar toda la hematox-ilina de la solucion por lo que con el tiempo se iraproduciendo mas hemateına sin riesgo de sobreoxi-dacion, y el colorante se podra usar durante muchotiempo.

La hemateına en solucion tiene un color rojo a pHmenor que 1, amarilla a un pH entre 1 y 5, y violetaa un pH por encima de 6. Sin embargo, la hemateınano tine por sı sola, sino que necesita iones metalicos

cargados negativamente, y que actuan como mor-diente. . Normalmente estas sales son de aluminio(como el alumbre de amonio o de potasio) o de hi-erro (cloruro ferrico o alumbre de hierro). Las solu-ciones que contienen alumnio y hemateına se llamahemalumbre. Otros mordientes menos frecuentes sonel alumbre de cromo, y solo en casos especiales seanade iones de plomo, cobre, zirconio, o acido fos-fotungstico o acido fosfomolıbdico. La cantidad deiones ha de ser mayor que la de hemateina y debe seruna solucion acidificada. La hematoxilina con mordi-ente de aluminio se usa para resalta nucleos, los mor-dientes de hierro permiten tenir nucleos en ambientesacidos, para las estrıas musculares. Con acido fos-fotungstico se usa para las estrıas musculares, fibrinay fibras gliales. El color de la tincion con hematox-ilina se puede cambiar mediante su combinacion conlos mordientes. Ası, cuando se mezcla con alumbrede aluminio se consigue un color azul, el alumbre dehierro da un color negro y las sales de estano dan uncolor rojo.

La tincion con hemalumbre puede ser progresiva oregresiva. Se prefiere normalmente una tincion pro-gresiva, pero si se ha sobretenıdo se puede corregir conalcohol de 70o o 95o, con un poco de acido clorıdrico.Tambien se puede usar una solucion acuosa acidifi-cada, pero el proceso es mas lento. La sobretincion sepuede prevenir anadiendo a la solucion de colorantemas aluminio o acidificandola mas. El hemalumbrecambia de color marron a azul a pH 6, eso es por loque se pone en agua del grifo.

La hemateına-hierro da un color mucho mas os-curo. En la hematoxilina de Heidenhain la hemateınay el hierro se aplican secuencialmente obteniendouna gran variedad de estructuras tenidas por difer-enciacion. Esta hematoxilina es recomendada cuandose aplican soluciones acidas posteriores puesto que latincion del nucleo es muy fuerte. Por eso, ademas,son tecnicas progresivas.

Bibliografıa

Kiernan JA. 2008. Histological and histochemi-cal methods. Theory and Practice. Scio Publix-hing limited 4th Edition. Oxfordshire.UK. ISBN:9781904842422.



Figura 8. Conversion de hematoxilina en hemateına



3 Tabla de colorantes

Los colorantes son sustancias que se emplean para darcolor a las estructuras que componen los tejidos an-imales y vegetales, es decir, para tenir las celulas, ysus compartimentos, y la matriz extracelular. Hayun numero muy elevado de colorantes que se empleanen los laboratorios de histologıa con usos diversos, loque depende de lo que queramos observar en nues-tra preparacion. Los colorantes se eligen en funcionde su color, forma y peso molecular, solubilidad y sucapacidad para reaccionar con moleculas del tejido.

Los colorantes pueden ser previsibles en cuanto aque estructuras van a tenir y con que color lo van ahacer si consideramos su naturaleza quımica. Ası, sitenemos en cuenta su carga electrica, que se puedededucir de su estructura molecular, podemos clasifi-carlos en cationicos o acidos que teniran el nucleo

(el acido desoxirribonucleico) y carbohidratos acidos,anionicos o basicos que teniran el citoplasma y matrizextracelular. Mientras que los colorantes no carga-dos pueden ser reactivos que tinen una gran variedadde estructuras, los liposolubles que tinen depositoslipıdicos y los mordientes que tinen principalmentemielina y nucleos. El tamano de la molecula y sucapacidad para formar agregados es a veces impor-tante por la diferente capacidad de penetracion en eltejido. Por ejemplo, se pueden usar dos colorantesanionicos con diferente tamano para tenir estructurasdiferentes.

Bibliografıa

Kiernan JA. 2008. Histological and histochemi-cal methods. Theory and Practice. Scio Publix-hing limited 4th Edition. Oxfordshire.UK. ISBN:9781904842422.



Figura 9



Figura 10



Figura 11



Figura 12



Figura 13

Figura 14



4 Desenmascaramiento de antıgenos

Este un resumen del trabajo fin de grado de ClaraLeboreiro Babe, defendido en 2017 en la Universidadde Vigo.

Numerosas enfermedades son detectadas y evalu-adas mediante tecnicas inmunohistoquımicas. La cal-idad de los resultados de estas pruebas es a menudoesencial para tomar una decision sobre el tratamientoo el estadio en el que se encuentra dicha enfermedad.Una de las precauciones a la hora de emplear tecnicasinmunohistoquımicas es tener en cuenta la posible al-teracion de los antıgenos debido a la fijacion y proce-samiento de los tejidos.

En la mayorıa de los laboratorios de patologıaclınica se procesan los tejidos mediante la fijacionen formol y posterior inclusion de los mismos enparafina. Este fijador es una disolucion acuosade formaldehıdo, normalmente a una concentraciondel 4%. Se ha demostrado que el formaldehıdoprovoca numerosas y complejas reacciones entre lasproteınas del tejido, principalmente enlaces cruza-dos entre dichas proteınas. En soluciones acuosas elformaldehıdo forma metileno hidratado que reaccionacon una gran cantidad de cadenas laterales de lasproteınas para formar grupos reactivos hidroximetilo,los cuales se unen a otras proteınas presentes en eltejido formando puentes de metileno. Las cadenaslaterales de las proteınas que presentan mayor reac-tividad con este compuesto contienen los aminoacidoscisteına, lisina, histidina y tirosina.

Las proteınas entre las que se producen los en-laces cruzados incluyen algunas que actuan comoantıgenos y que se emplean en la deteccion de nu-merosas patologıas mediante tecnicas inmnunohis-toquımicas. Estos enlaces impiden en ocasiones queel anticuerpo pueda reconocer a la proteına porquelos sitios de union o epıtopos quedan enmascarados.Como consecuencia se pueden generar falsos negativosen los resultados, es decir, se dan casos en los queel antıgeno se encuentra en el tejido y debido a esteenmascaramiento antigenico no se detecta inmunohis-toquımicamente.

Ademas de las modificaciones descritas, la for-

macion de complejos de calcio, la modificacion dela conformacion de las proteınas y la variacion dela carga electrostatica de las mismas se consid-eran fenomenos causantes de enmascaramiento deantıgenos por efecto del formol. Se cree que lasmodificaciones proteicas se producen en la cadenaaminoacıdica, o estructura primaria de la proteına,siendo menos relevante las alteraciones en las es-tructuras secundarias y terciarias, aunque en oca-siones tambien se pueden modificar estas ultimas al-terandose de este modo los epıtopos conformacionales.La union antıgeno-anticuerpo depende sobre todo defuerzas electrostaticas y la fijacion con formaldehıdomodifica tambien la carga electroestatica superficialdel antıgeno completo y del epıtopo especıfico a de-tectar, impidiendo la interaccion antıgeno-anticuerpo.

Los enlaces cruzados formados por el formaldehıdoson estables a ciertos niveles de pH, temperatura ysegun el medio en el que se encuentre el tejido. Sinembargo, tienen la particularidad de ser reversibles ysi estos factores son modificados se podrıan romperdichos enlaces y los epıtopos de interes quedarıan ex-puestos. El proceso por el que se consigue desenmas-carar los epıtopos para ser reconocidos por anticuer-pos se conoce como recuperacion de antıgenos o re-cuperacion antigenica. La recuperacion de antıgenosse podrıa llevar a cabo mediante la eliminacion debarreras moleculares que impiden el reconocimientodel antıgeno por parte del anticuerpo; de este modola tecnica de recuperacion antigenica revertirıa lamayorıa de las modificaciones generadas por la fi-jacion, restableciendose una conformacion proteicacasi identica a la original, restaurando la carga elec-trostatica de las proteınas y recuperando su in-munoreactividad previa a la fijacion con formol.

La recuperacion antigenica ha mejorado la tecnicainmunohistoquımica para su uso en el diagnostico depatologıas. Se definen dos etapas en la historia delempleo de la inmunohistoquımica en histologıa, pre-antigen-epitope retrieval y post-antigen-epitope re-trieval, debido a la importancia que supuso su in-troduccion en los laboratorios. El formol es el fi-jador mas comun en la mayorıa de los laboratorios deanatomıa patologica, ası como en los bancos de teji-dos, y en ambos casos es habitual realizar el procesode desenmascaramiento antigenico antes de emplear



inmunohistoquımica en los tejidos. Una ventaja adi-cional que conlleva el uso de esta tecnica es que con-sigue un menor umbral de deteccion del antıgeno, per-mitiendo emplear diluciones mayores de anticuerpo;esto, ademas de suponer una ventaja economica, re-duce el ruido de fondo y se aumenta la senal del mar-caje. Los tejidos que se encuentran en los denom-inados bancos de tejidos han adquirido un enormevalor gracias al uso de esta tecnica, ya que se posi-bilita que tejidos fijados decadas atras y en diferenteslaboratorios se empleen para investigaciones clınicas.Ademas, es posible la combinacion de la tecnica de re-cuperacion de antıgenos junto con la proteomica parala busqueda y uso de biomarcadores en medicina per-sonalizada.

El origen de la tecnica de recuperacion de antıgenosconsistio en hervir secciones de tejido en agua. Pos-teriormente se comenzaron a emplear tampones ensustitucion del agua con el fin de mantener la con-formacion de las proteınas. A dıa de hoy, hay unagran diversidad en cuanto a metodos de recuperacionantigenica que combinan el uso de diversas fuentes decalor, tampones y actividad enzimatica. El uso de en-zimas se introdujo como un metodo alternativo paradesenmascarar antıgenos que puedan perder antigeni-cidad si son expuestos a calor, como las citoquerati-nas.

Los metodos de recuperacion de antıgenos se divi-den segun se aplique calor, en cuyo caso se empleanlas siglas HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval), osi se basa en el uso de enzimas proteolıticas, conocidocomo PIER (Proteolytic-Induced Epitope Retrieval).El metodo HIER es el mas comun, con variaciones encuanto a las fuentes de calor utilizadas. La mayorıade los investigadores utilizan el microondas o un re-cuperador de antıgenos de funcionamiento similar aun autoclave. Como alternativa, se puede emplearun bano caliente o una estufa. Cada fuente de calorpresenta una serie de ventajas y desventajas (Tabla1).

En el metodo PIER las enzimas mas comunes sonla proteinasa K y la tripsina, las cuales degradan lospuentes metileno. La duracion de la aplicacion en-zimatica debe ajustarse en funcion del tiempo de fi-jacion al que ha estado sometido el tejido. Debido a

que un tiempo inadecuado de exposicion a la actividadenzimatica puede danar el tejido no es un metodo em-pleado en muchos laboratorios. Se ha sugerido la uti-lizacion combinada de ambos metodos, PIER y HIER,en aquellos casos en los que no se obtienen buenosresultados empleando uno de estos dos metodos porseparado.

Los principales factores que afectan a la recu-peracion de antıgenos en el metodo HIER son la tem-peratura y el pH de la solucion tampon en la cual sesumerge el tejido durante el proceso de recuperacionantigenica. El efecto de la temperatura depende dedos variables, la temperatura alcanzada y el tiempode exposicion al calor. A medida que aumenta la tem-peratura alcanzada se debe disminuir el tiempo de ex-posicion, y viceversa. Por otra parte, la composiciondel tampon no parece tener tanta importancia comosu pH. Ası, determinados antıgenos se recuperan conmayor facilidad a pH basicos mientras que otros pre-cisan de pH acidos. El tampon que se suele usar enpH acidos es el tampon citrato, mientras que a pHbasicos es mas comun el tampon Tris.

Se ha estudiado el efecto que podrıa tener elCa en la recuperacion antigenica ya que su pres-encia en los tejidos parece promover el enmas-caramiento antigenico, mediante la formacion de com-plejos moleculares en los que participa el calcioendogeno durante el procesamiento del tejido. Paratratar de solucionar este problema son numerosos losestudios que emplean EDTA como componente de lostampones en la recuperacion antigenica. El EDTA esun compuesto que se emplea como quelador de calciocon el fin de eliminar el calcio presente en el tejido.Sin embargo, hay controversia respecto al papel quepodrıa tener este elemento pues algunos resultadossugieren que el EDTA no afecta a la recuperacionantigenica de determinados antıgenos.

La evaluacion de una tincion inmunohistoquımicamediante metodos cuantitativos no esta muy exten-dida a dıa de hoy, pues todavıa se siguen evaluandolas tinciones por observacion directa al microscopio,es decir, cualitativamente. El analisis de imagen per-mite una evaluacion cuantitativa de una imagen dig-ital. Depende de dos factores: los equipos para laadquisicion de imagenes digitales y los programas de



Figura 15. Resumen de las caracterısticas mas importantes de las fuentes de calor comunmente empleadas en el metodoHIER:

analisis de imagen. A continuacion se describen losaspectos a tener en cuenta:

Adquisicion de imagenes. Estas pueden sertomadas en escala de grises o en formato RGB. Sedeben tener en cuenta los efectos que compensan lascamaras digitales como la compensacion de color, ilu-minacion, balance de blancos y optica del microsco-pio. Por tanto, las condiciones de captura de imageneshan de ser exactamente iguales para todas las mues-tras.

Tipo de sensor de la camara. Existen dos tiposde sensores, los CCD (Charge Coupled Device) ylos CMOS (Complementary Metal Oxide Semicon-ductor). La tecnologıa de los CCD es mas avan-zada, se considera superior y mas adecuada para elanalisis cientıfico de imagen ya que los pıxeles son masgrandes. Ademas, los equipos con tecnologıa CMOSnormalmente generan imagenes con mas ruido, espe-cialmente cuando se trabaja con fluorescencia. For-mato de imagen. Determinados formatos de imagencomprimen las fotografıas perdiendo calidad y, porlo tanto, informacion. La calidad de la imagen de-pende tambien de su resolucion. Por tanto, hay queencontrar el balance entre el grado de compresion yel tamano de la imagen.

Analisis de imagen. Para analizar una imagendigital tomada de un tejido procesado inmunohis-toquımicamente se presupone que hay una relaciondirecta entre la senal y la cantidad de antıgeno, y quepor lo tanto una mayor intensidad de tincion corre-sponde con una mayor concentracion antigenica. Apesar de que el analisis de imagen reduce el error a lahora de evaluar una tincion inmunohistoquımica, esnecesario que las muestras a comparar sigan exacta-

mente el mismo protocolo antes de tomar la imagendigital: recoleccion, fijacion, inclusion, tratamiento derecuperacion de antıgenos, e inmunotincion. De otramanera se pueden obtener resultados erroneos.

Debido a que la formacion de puentes cruzados porel formol depende en gran medida de la estructura pri-maria de las proteınas, la recuperacion antigenica vaa estar determinada por la secuencia de aminoacidosde cada antıgeno. Se ha demostrado que determi-nados antıgenos necesitan de unas condiciones es-pecıficas para su recuperacion. Algunos antıgenosprecisan ser recuperados para poder detectarse enuna tincion inmunohistoquımica, mientras que paraotros antıgenos la tecnica de recuperacion antigenicano es esencial para su deteccion pero su aplicacionaumenta la senal de marcaje. En algunos casos la re-cuperacion antigenica ha dado lugar a falsos positivos,pero tambien a falsos negativos, por lo que el correctoajuste de las condiciones de recuperacion es de vi-tal importancia. Esto significa que una aproximacionincorrecta a la tecnica de recuperacion de antıgenospuede no mejorar la senal de marcaje, e incluso dis-minuir la misma. Por tanto, es recomendable elaborarun protocolo de recuperacion de antıgenos particularpara el antıgeno en el que se este interesado.

Bibliografıa

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