NUCLEÓTIDO: ADN

ADN

REPLICACIÓN DO ADN

DOGMA DA BIOLOXÍA MOLECULAR

TRANSCRIPCIÓN I

TRANSCRIPCIÓN II

TRANSCRIPCIÓN III

TRADUCCIÓN: SÍNTESE DUNHA PROTEÍNA

CÓDIGO XENÉTICO

ENXENERÍA XENÉTICA.

• É un conxunto de técnicas que permiten illar, alterar ou transferir xenes dun organismo a outro para controlar a produción dunha substancia. A enxeñaría xenética, ocúpase da manipulación de xenes e dos seus produtos.

• Comprende varias técnicas entre as que sobresaen:• Obtención de fragmentos de ADN de tamaño apropiado para

que poidan ser estudados e manipulados mediante o corte de ADN en puntos concretos por os enzimas de restricción.

• As técnicas do ADN recombinante, que consisten en tomar un fragmento de ADN de un organismo e unilo o ADN doutro individuo, recombinación, formándose un ADN mixto, que introducido nunha célula, permite obter unha proteína que pode ter interes.

• A clonación xénica, obtención de gran cantidade de fragmentos de ADN.

• Identificación de fragmentos de ADN que teñan interese médico, científico ou industrial.

• Determinación da secuencia de nucleótidos dun fragmento de ADN.

Enzimas de restricción

ENZIMAS DE RESTRICIÓN

OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN

• Por encimas de restrición. Son enzimas, endonucleasas, presentes en moitas bacterias, que teñen a propiedade de cortar o ADN estraño que penetra no seu interior. O corte faise en sitios específicos de poucos pares de bases, secuencias de recoñecemento, que no ADN da bacteria están protexidas para evitar a súa destrución.

• Actúan como «tesoiras biolóxicas» que cortan o ADN de forma que en cada extremo queda un fragmento monocatenario con unha determinada secuencia bases, denominados extremos adherentes ou cohesivos, que se poden unir a outros fragmentos de ADN cortados pola mesma encima de restrición ao ser as súas bases complementa- rias, formando un ADN híbrido.

• Os fragmentos obtidos pódense separar por tamaños mediante técnicas de electroforese e así estudalos.

Outras técnicas empregadas para obter fragmentos de ADN consiste en sintetizar «in vitro» o ARNm se se coñece a secuencia de aminoácidos dunha proteína, ou ben illar da célula o ARNm desexado, recoñecéndoo e mediante a retrotranscriptasa ou transcriptasa inversa, sintetizar o ADN correspondente.

INSERCION DE FRAGMENTOS RECOMBINANTES

• Realízase mediante vectores de clonado, transportadores capaces de introducir fragmentos de ADN, no ADN nas células hospedadoras. Utilízanse fundamentalmente dous tipos de vectores: plásmidos e virus.

• Plásmidos. Un fragmento de ADN que contén un xen é introducido nun plásmido despois de ser cortados ambos por o mesmo enzima de restricción.

• Bacteriófagos. Trátase de inserir o xene desexado nun fragmento de ADN vírico.

• A continuación este ADN hibrido pode introducirse nunha célula hospedadora, en bacterias realizase por procesos de transdución ou de transformación.

Inserción de fragmentos

Esquema xeral

OBTENCIÓN DE COPIAS DE ADN

Poden obterse por dous métodos:• A clonación molecular, consiste na

obtención de copias dun fragmento de ADN, mediante a súa replicación en bacterias. Usando tecnicas de inserción, o ADN recombinante nas células hospedadoras replicarase para formar novas copias.

• Reacción en cadea da polimerasa (PCR). É unha técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN nun tubo de ensaio. A reacción é sinxela, só se precisa dun tubo de ensaio, unha pequena cantidade do ADN a copiar, ADN pol, reactivos, unha fonte de calor e unhas pequenas cadeas de nucleótidos que actúan como cebadores.

• A molécula de ADN que se vai copiar quéntase para que se desnaturalice e se separen as dúas febras, cada unha delas é copiada pola ADN-polimerasa. As cadeas recén formadas son separadas de novo pola calor e comeza outro novo ciclo de copias. Estes ciclos repítense ata que se obtén o número de copias desexado. A potencialidade desta técnica é enorme, a partir dunha soa molécula de ADN, a PCR pode xerar 100000 millóns de moléculas idénticas nunha tarde. O ADN pode proceder dunha mostra de tecido dun hospital, dunha gota de sangue ou seme na escena dun delito, ou dun cerebro momificado.

APLICACIÓNS DA PCR

• Secuenciación. Unha das razóns mais comúns para o uso da PCR é a formación de suficiente cantidade de ADN molde para a súa secuenciación. É moito mais sinxelo e rápido que a clonación en células.

• Estudios evolutivos. Mediante a PCR pódense amplificar xenes de organismos xa extinguidos, como do mamut, ou restos antigos humanos. Comparando estes xenes con xenes semellantes de organismos actuais podese reconstruír árbores filoxenéticas.

• O PCR tamén se utilizou para conseguir o mapa do xenoma humano.• Pegadas xenéticas (as pegadas dactilares do ADN).(as pegadas dactilares do ADN).

A determinación das pegadas dactilares xenéticas constitúe unha das aplicacións mais interesantes da PCR. Mediante esta técnica é posible comparar mostras diferentes de ADN para comprobar se pertencen ao mesmo individuo ou non, ou se existe parentesco entre elas. Esta técnica aplícase actualmente en Medicina forense e investigacións policiais, co fin de identificar indiividuos a partir de mostras biolóxicas, como sangue, seme, pel ou cabelos. Tamén se utiliza nas probas de paternidades.

LOCALIZACION DE SEGMENTOS DE ADN• Úsanse fundamentalmente dous métodos: Mediante sondas de hibridación e a selección de

células hospedadoras de plásmidos recombinantes obtidos por clonación por acción dun antibiótico.• O 2º metodo de clonación e selección faise da seguinte forma: os fragmentos de ADN a clonar

unense a plásmidos formandose complexos de ADN recombinante que se incuban cun cultivo de bacterias (ex Escherichia coli), para que cada unha délas incorpore únicamente un plásmido recombinante.

• Si os plásmidos levan ademais un xene que lles confire resistencia a un antibiótico, as bacterias transformadas serán seleccionadas si se cultivan nun medio que conten o antibiótico. Únicamente, as bacterias que levan o plásmido recombinante sobrevira e forman colonias nas placas. As demais, que non foron que non levan consigo o plásmido recombinante, morren.

• Cada colonia de bacterias cultivase e a medida que as bacterias se duplican, tamén se duplica o número de plásmidos recombinantes e os fragmentos de ADN que levan inseridos.

•

PROCURA ESPECÍFICA DUN XENE MEDIANTE HIBRIDACIÓN CON SONDAS DE ADN

• En biotecnoloxía a hibridación do ADN permite identificar a presenza dun xene de interese nun cromosoma. A identificación faise mediante unha sonda de ADN, que é un fragmento artificial de ADN de cadea sinxela marcada con radioactividade ou fluorescencia, que tén unha secuencia de nucleótidos complementaria á secuencia do xene a detectar. Unha sonda de ADN que hibridou lógrase detectar mediante diversos métodos, por exemplo, por impresión dunha película radiográfica.

• Cando se queren analizar á vez milleiros de xenes utilízanse os biochips ou chips de ADN, que son láminas de vidreo con microscópicas celas donde se deposita unha cantidade ínfima de fragmentos de ADN de cadea simple que actúan como sonda para un xene determinado.

• Os milleiros de microscópicas celas sitúanse a xeito de cuadrícula na lámina de vidro e permiten desenvolver en paralelo milleiros de reaccións de hibridación. Como se coñece a situación exacta de cada sonda no biochip, calquera fragmento de ADN que hibride cunha délas poderá ser identificado cun xene concreto simplemente localizando a posición da sonda á que se atopa unido no biochip.

.

LOCALIZACIÓN DE SEGMENTOS ADN

.

DETERMINACIÓN DA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS

• Conócese tamén como secuenciación. • Esta técnica é posible grazas a unha característica propia das

restrictasas é que cada encima corta a molécula de ADN por un sitio diferente e concreto. Utilizando unha encima obtéñense uns fragmentos específicos, utilizando outra restrictasa sobre o obtéñense outros fragmentos diferentes. Estes fragmentos obtidos por distintas encimas pódense separar por electroforese e logo clonalos en infinidade de copias.

• Esas copias pódense analizar mediante unha serie de reaccións químicas e/ou enzimáticas de alta complexidade, moitas da cales se automatizaron e con todos os fragmentos obtidos, canto máis pequenos mellor, trátase de recompoñer a molécula orixinal coma se se tratase dun crebacabezas.

• Entre os metodas mais usados está o método de secuenciación de Sanger.

CLONACIÓN POR PLÁSMIDOS

.

CLONACIÓN CON PLÁSMIDOS

CLONACIÓN POR BACTERIÓFAGO

.

APLICACIÓNS PRÁTICAS DA ENXENIERÍA XENÉTICA

Organismos xeneticamente modificadosMicroorganismos transxénicos Animáis transxénicos e as suas aplicaciónsPlantas transxénicas e as suas aplicacións

Terapia xénicaClonación reprodutiva Células nai Proxecto Xenoma Humano (PXH

APLICACIÓNS DE MICROORGANISMOS XENETICAMENTE MODIFICADOS

• Mellora do medio ambiente. Emprego de microorganismos para eliminar a contaminación ambiental, biorremedia- ción:

• Eliminación de hidrocarburos (mareas negras), de metáis pesados e de plásticos

• Produción de biocombus- tibles (biodiesel e bioalcol).

• Produtos industriáis, farmacéuticos e médicos: Encimas que degradan substancias, como as dos detergentes. Antibióticos, como a tetraciclina e a penicilina. Proteínas humanas empregadas en medicina, como o interferon, a insulina humana, a hormona do crecemento e o factor antihemofílico.

ANIMÁIS TRANSXÉNICOS E AS SUAS APLICACIÓNS

• Levan nas súas células algún xene procedente doutro organismo, o transxene, que se inxiere no ADN do animal hospedeiro mediante por microinxección nun óvulo,usando virus ou bacterias.

• Aplicacións de animáis transxénicos:

• Aumentar a resistencia a enfermi- dades e mellorar a produción animal,

• Deseñar animáis knockout, un xene funcional sustituese por outro non funcional co fin decoñecer a función desempregada polo xene.

• Fabricar órganos de animáis para transplantes, xenotransplantes.

• Crear granxas farmacéuticas. Os animáis transxénicos (ovellas, vacas ou cabras) poden producir fármacos ou moléculas biológicas (insulina, factor antihemofílico, etc.) de xeito que o produto se segrega través do leite, de onde se extrae e purifica.

.

PLANTAS TRANSXÉNICAS.• Son plantas con xenes de organismos

distintos que permiten obter variedades que non son posibles na natureza. Os xenes son introducense na planta mediante un plásmido, oTi, por microinxección ou directamente mediante a pistola de xenes que lanza «balas microscópicas de ADN» contra as células vexetais .

• Aplicacións:• Resistencia contra herbicidas ou pragas

que permiten reducir a necesidade de fumigar os campos de cultivo con produtos químicos.

• Resistencia as xeadas, as secas ou ao exceso de acidez e salinidade do solo.

• Atrasar a maduración. Desenvolvéronse plantas que producen froitos que ao maduraren non adolecen.

• Mellorar o valor nutritivo das plantas empregadas no agro. Exemplo, plantas que producen arroz amarelo con provitamina A e que no corpo humano se converte en vitamina

• Producir substancias de interese farmacolóxico

• .

TERAPIA XÉNICA

• Ten como obxectivo tratar, curar e previr enfermidades producidas por un so xene defectuoso introducindo no paciente un xene terapéutico que pretende substituir o xene defectuoso. A introducción faise mediante virus, liposomas ou microinxección. Hai varios tipos

• Terapia in vivo, introducindo os vectores directamente na persoa enferma por vía sanguínea, que só son recoñecidos polas células diana. Así conseguense modificar os xenes defectuosos en todas as células de unha determinada líña celular.

• Terapia ex vivo, extráense células do enfermo e cultívanse. Insértaselle o xene normal e introdúcense no organismo.

• Terapia xénica somática, inténtase corrixir a enfermidade tratando solo algunhas células do corpo da persoa enferma, as que se lle introduce o xene terapéutico.

• Terapia xénica da liña xerminal, consiste en introducir células transxénicas nun óvulo fecundado, o xene terapéutico formará parte do código xenético de todas as células corpo

.

TERAPIA XÉNICA

CLONACIÓN REPRODUTIVA

• A biotecnoloxía actual permite crear clons de animáis grazas a unha técnica que se coñece como clonación reprodutiva.

• Esta técnica consiste en eliminar o núcleo dun óvulo dun animal doador e substituílo polo núcleo dunha célula somática procedente do animal que se quere clonar, método denominado transplante nuclear. Así, créase un embrión «artificial» que posterior- mente se implanta no útero dunha femia da mesma especie para que finalice o seu desenvolvemento embrionario. O organismo que se obten é xeneticamente idéntico ao individuo do que procede o núcleo da célula somática empregada.

• Pode usarse para obter descendentes de individuos moi seleccionados.

.

CÉLULAS NAI OU CÉLULAS TRONCÁIS

• Son células indiferenciadas que poden dividirse indefinidamente producindo novas células nai e en condicións axeitadas, diferenciárense nun ou varios celulares especializados, células musculares, sanguíneas,hepáticas…. Poden ser de varios tipos

• Células nai embrionarias son células pluripotentes, aínda que por si mesmas non poden dar orixe ao organismo completo (precisan da placenta), son a orixe de todos os tipos celulares e tecidos do individuo adulto. Fórmase a partir do cigoto, que é a unha única célula totipotente capaz de xerar, a través de sucesivas divisións celulares, o novo individuo e toda a variedade de centos de células diferentes do novo organismo

• Células nai adultas (AST). Atópanse nunha gran cantidade de tecidos do organismo adulto, como o sangue ou a peí. A súa principal función é substituir as células que morren dentro dun órgano ou tecido. Son células multipotentes, capaces de orixinar moitos tipos celulares, pero non todos

.

OBTENCIÓN DE CÉLULAS NAI

CLONACION PARA OBTER CELULAS NAI

CLONACIÓN TERAPEÚTICA

• Clonación terapeutica, para alcanzar a

verdadeira capacidade terapéutica desta

tecnoloxía, teríanse que conseguir reconstruir ademais de tecidos complexos,

órganos ou algunhas das súas partes con total funcionalidade