Tema 5

Plásmidos

• Su existencia en la Naturaleza. Importancia en la Transferencia Horizontal de genes en comunidades microbianas. Ocurrencia y abundancia en arqueas, levaduras y bacterias. Ventajas adaptativas.

• Tipos: Circulares y Lineales. Modos de replicación.

• Se conocen tres mecanismos generales por los que las bacterias pueden transferir lateralmente información genética:

• conjugación,

• transformación

• y transducción

• Estos mecanismos sexuales, o mas bien parasexuales, difieren en muchos aspectos de los mecanismos sexuales de los eucariontes:

• Son unidireccionales, de un donador a un receptor; se transfiere solo una fracción del genoma, que puede involucrar desde algunos pares de bases a cientos de kilobases, dependiendo principalmente del mecanismo de transferencia;

• La transferencia de genes ecológicamente adaptativos permite la diversificación y especiación bacteriana,

• Por lo que estos eventos tienen un gran impacto sobre la evolución de las poblaciones de estos organismos.

• Esta es una de las grandes diferencias y ventajas del intercambio genético en bacterias con respecto al de los eucariontes; las bacterias no tienen que “reinventar la rueda”:

• La transferencia de genes, operones e islas genómicas crean nuevos linajes con combinaciones únicas que pueden explotar nuevos nichos y generar nuevas especies o ecotipos a través de uno o unos pocos eventos evolutivos

• La transferencia horizontal de genes (HGT, por sus siglas en inglés) consiste en la transmisión del genoma o parte de éste de un organismo a otro que no forma parte de su descendencia.

• Por el contrario, el tipo de transferencia habitual, o transferencia vertical de genes, es la que se da desde un ancestro a su descendencia, como ocurre por ejemplo en la reproducción sexual.

• Desde hace tiempo se conoce la importancia del proceso de HGT en procariotas, como en el caso de la conjugación bacteriana, con la mediación de plásmidos.

• Estos procesos son muy importantes como fuente de variación genética, equivalentes en cierto modo a la recombinación cromosómica de los organismos con reproducción sexual.

• Sin embargo, la HGT en bacterias va más allá, dado que también se produce transferencia genética entre especies alejadas filogenéticamente,

• Lo cual permite la formación de genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos.

¿Qué es un Plásmido?

• El plásmido es una molécula circular de DNA que tiene una existencia independiente en la célula.

• Los plásmidos son muy abundantes en las bacterias, y mas escasos en las células eukariotas.

• Llevan en su seno varios genes, a menudo responsables de características útiles para la célula.

• Por ejemplo, la capacidad para soportar concentraciones tóxicas de un antibiótico, como el cloranfenicol o la ampicilina.

• Son elementos genéticos que se replican independientemente del cromosoma.

• Se encuentran dentro de la célula.

• Existen varios tipos de plásmidos.

• En E. coli, se han aislado mas de 300

• Estos genes se emplean para seleccionar aquellas células que tienen un plásmido de las que no lo tienen.

• La mayoría de los plásmidos tienen una secuencia que sirve como orígen de replicación. Esto le permite replicarse independientemente.

• Los plásmidos mas pequeños emplean la maquinaria celular para su duplicación y mantenimiento.

• Otros son capaces de integrarse en el cromosoma principal durante generaciones (episomas). Luego se pueden volver a escindir.

• Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras.

• Su tamaño varía desde 1 a 250 kb.

• El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula

Tamaño y número de copia

• El tamaño de un plásmido es variable. (1 kb-250kb).

• Como vector, es deseable que su tamaño no sobrepase

10kb.• Ejemplos:• PUC8 2,1kb E. coli • ColE16,4kb E. coli• F 95 kb E. coli

Tamaño

• Existe una amplia gama: hasta plásmidos muy grandes (ciertos plásmidos de Pseudomonas tienen 500 kb).

• Incluso existen “megaplásmidos” en ciertos Rhizobium que llegan a tener 1600 kb.

Características de los Plásmidos

• Replicación autónoma

• Estabilidad

• Incompatibilidad

• Transferencia:

–Plásmidos conjugativos

–Plásmidos no conjugativos

• Integración (Episomas)

• Confieren distintas propiedades fenotípicas

Tipos de plásmidos

• P. conjugativos: codifican pili sexuales y proteínas necesarias para la transferencia de DNA.

• P. R (resistencia a los antibióticos, mercurio).

• P. Producción de bacteriocinas y antibióticos.

FENOTIPOS Y FUNCIONES DETERMINADOS POR

PLÁSMIDOS

• Plásmidos de virulencia: producción de toxinas, factores de penetración en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias patógenas.

• .

• Plásmidos de virulencia: producción de toxinas, enzimas, tumores. (E. coli O157 Toxina shiga)

• Plásmidos de funciones fisiológicas:

Utilización de urea,

Fermentación de carbohidratos.

Producción de pigmentos.

• Producción de sideróforos (quelatos para secuestrar iones Fe3+).

• Utilización de hidrocarburos, incluyendo algunos cíclicos recalcitrantes (degradación de tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas.

• Inducción de tumores en plantas (plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens).

• Interacciones simbióticas y fijación de nitrógeno en ciertos Rhizobium

Número de copias• Cada tipo de plásmido tiene un número medio de

copias por célula característico.

• Por regla general, los grandes plásmidos tienen una o dos copias por célula (plásmidos con control estricto de la replicación).

• Mientras que los pequeños suelen estar presentes como varias copias (>10), denominándose plásmidos de control relajado.

• E coli, posee un plásmido conjugativo llamado Factor F:

- Capacidad para sintetizar pili.

- Movilización del DNA para su transferencia.

- Alteración de receptores de la superficie de la célula.

Conjugación• Los plásmidos se pueden clasificar en dos grupos: conjugativos y

no conjugativos.

• Los conjugativos tienen la capacidad de promover la conjugación.

• El plásmido F de E. coli es capaz de integrarse en el cromosoma.

• Cuando la conjugación tiene lugar en esta situación, parte del cromosoma se transfiere a la cepa F-.

• Solo los plásmidos conjugativos tienen la capacidad de ser transferidos en la conjugación.

• A veces, en presencia de un plásmido conjugativo, otro plásmido puede transferirse.

• A este mecanismo de conjugación se debe el surgimiento de la resistencia bacteriana a los antibióticos

Conjugación en Gram negativos

Conjugación en Gramnegativos

1. Formación de pares efectivos

2. Transferencia de ADN

− Origen de transferencia

− Replicación cadenas ADN

F+ F- F+ F-

F+ F+F+ F+

Conjugación: Importancia

• Bacterias Gram - −Resistencia antimicrobianos−Diseminación rápida

• Bacterias Gram +

−Producción de factores de adherencia−Resistencia antimicrobianos

Compatibilidad• Plásmidos distintos pueden encontrarse en una

misma célula.

• En E. coli se han descrito hasta siete tipos distintos coexistiendo en una célula.

• Sin embargo, para ello, tienen que ser compatibles.

• Algunos plásmidos se pierden rápidamente en presencia de otros, y por tanto, hay una serie de grupos de incompatibilidad.

• Las bases de la incompatibilidad no se entienden bien, pero parecen tener que ver con la replicación.

INCOMPATIBILIDAD ENTRE PLÁSMIDOS Y GRUPOS DE

INCOMPATIBILIDAD

• Cada plásmido, dentro de la amplia diversidad de los que se conocen, se suele clasificar según el grupo de incompatibilidad al que pertenece.

• Los grupos de incompatibilidad se suelen denominar con las siglas Inc seguidas de una letra mayúscula (por ejemplo IncP, IncFII, etc).

REPLICACIÓN

• Modelo de replicación en (theta):

• Separación de las dos cadenas en el sitio oriV, creando una estructura que se parece a la letra griega (theta).

• La replicación es unidireccional (sólo hay una horquilla de replicación , que avanza a lo largo de la molécula, hasta que vuelve al sitio oriV, en el que las dos moléculas hijas se separan).

• Otros plásmidos se replican en por un modelo bidireccional (dos horquillas de replicación de sentidos opuestos, que se encuentran cerca de la mitad de la molécula).

• La replicación en es frecuente en plásmidos de bacterias Gram-

negativas.

Modelo de replicación en σ (sigma), o modelo del círculo rodante

• Una de las dos cadenas es rota a nivel de oriV, de modo que el extremo 3’ suministra el cebador para la replicación de la “cadena adelantada”.

• La cadena desplazada (cadena “menos”) funciona como cadena retrasada (“lagging”) y debe ser replicada a partir de sitios de cebado especiales.

• Este tipo de replicación es frecuente en plásmidos de bacterias Gram-positivas.

El mismo tipo de sistema de control del número de copias y de reparto

• El número total de copias nA+nB = N (determinado por el sistema de control) no varía,

• Pero por fluctuaciones aleatorias en el reparto, algunas células heredan más copias de uno de los plásmidos que del otro, y tras varias generaciones aparecen células carentes de uno o del otro plásmido (nA = 0 y nB = N, o viceversa).

• Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicación u ORI (un punto inicial para la replicación del ADN),

• Lo cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal.

• Los plásmidos de la mayoría de las bacterias son circulares, pero también se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayoría de eucariotes.

Vectores de clonado

• Plásmidos, fago Lambda, cósmidos, y cromosoma artificial de levadura (YAC).

• Un típico vector de clonado (Modelo de clonado)

• Contiene un sitio de policlonado( polilinker),

• Un gen de resistencia a Ampicilina (ampr) como marcador

• Y un origen de replicación (ORI).

• Utilizando un plásmido se inserta y liga un fragmento con un gen de interés.

• Capacidad de almacenaje: hasta 25 Kb.

• Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética como vectores de clonado por la facilidad con la que se manipulan.

• Un vector plasmídico se fabrica a partir de plásmidos naturales cuyos segmentos innecesarios son eliminados, agregándose en cambio secuencias esenciales

• Para clonar una muestra de la ADN, se debe utilizar la misma enzima de restricción para cortar el vector y la muestra de ADN.

• Por lo tanto, un vector contiene generalmente una secuencia (polylinker) que pueda reconocer varias enzimas de restricción para poder utilizar el vector para clonar diversos fragmentos de ADN.

- promotor- terminador- sitio de unión a ribosoma - sitios único de corte de enzimas - marcadores genéticos- orígen de replicación- tamaño pequeño

Características generales de los vectores de expresión:

Vectores basados en plásmidospBR322

• Nomenclatura: pBR322.• Tamaño: 4363pb. Capacidad: hasta 10.000• Contiene dos marcadores de resistencia:

Amp y Tet.• Es un plásmido multicopia. Pueden

encontrarse hasta 15 copias por célula. Utilizando cloranfenicol, puede aumentarse hasta 1000-3000.

El mapa de pBR322

pUC18: un plásmido avanzado

• Desciende de pUC8, a su vez de pBR322.• Conserva el origen de replicación y ampR.• La secuencia del marcador se ha alterado para

eliminar los sitios de restricción.• Estos se encuentran insertos en la secuencia de

lacZ.• Ventajas: 500-700 copias/célula. Identificación

directa empleando X-gal. Múltiples sitios para clonar (sitios de restricción).

Mapa de restricción de pUC18

El plásmido pGEM3

Vectores basados en M13

• El genoma de M13 consiste de 6,4Kb, de los que la mayoría corresponde a 10 genes empaquetados.Todos son esenciales.

• Queda una región intergenica de 507 nucleótidos que tiene el origen de replicación: ori.

• A pesar de estas dificultades, el hecho de que este vector se encuentra en forma monocatenaria lo hace muy atractivo para procesos de clonaje.

Estrategias para desarrollar vectores basados en M13

Los vectores MP13mp contienen el gen LacZ.

Los más modernos (mp7) tienen insertado un polilinker “simétrico”.

O en su caso, polilinkers que permiten incorporar fragmentos con extremos cohesivos distintos, asegurando la orientación de la inserción (mp8/9).

Existen otros vectores mixtos con plásmidos: phagemids o fagómidos.

Aislamiento del gen de interés

Inserción en un vector de clonación

Transformación de la célula huésped

Purificación y análisis del ADNc

Expresión del ADNc y análisis de la proteína

CLONACIÓN MOLECULAR

Aislamiento e incorporación de un fragmento de DNA dentro de

un vector en el que puede replicarse

X-galactosa incorporado en la placa de cultivo permite la selección de las colonias que han incorporado el plásmido con el inserto:- Colonias con inserto

Se inactiva el gen LacZ, no hay complementación Se observan colonias blancasblancas

-Colonias sin insertoNo se inactiva el gen LacZ, hay complementación Se observan colonias azulesazules

Selección de recombinantes empleando la técnica de la complementación

Que representan las colonias blancas? Que representan las colonias azules?Que colonias utilizaría?Si nos olvidamos de colocar ATB en la placa que resultado obtendriamos?

¿Qué pasó???????????????

Tres formas de plásmidos en los geles

Bibliotecas genéticas o genotecas

• Son colecciones de vectores que colectivamente contienen todos los fragmentos de un organismo.

• Cuantos clones hacen falta para albergar un genoma?

• N= ln(1-P)/ln(1-a/b)• P= la probabilidad de que un gen esté presente, a

es el tamaño medio de fragmento y b es el tamaño total del genoma.

Valores de N: Tabla por especies

Especie Genoma (pb) nº clones de 17kb de 35kbE.coli 4 x 106 820 410S. cerevisiae 1.8 x 107 3225 1500Arroz 5.7 x 108 100000 49000Humanos 3.2 x 109 564000 274000

ARCHAEA

BACTERIA

Características:

• Tienen una pared celular que brinda protección a los procariotas y les confiere su forma característica.

• Algunos procariotas se desplazan mediante flagelos simples.

• Las endosporas protectoras permiten a ciertas bacterias soportar condiciones adversas.

• Se reproducen por fisión binaria

• Se especializan en hábitats específicos y presentan diversos metabolismos.

• Desempeñan muchas funciones que son importantes para otras formas de vida.

• Algunas bacterias constituyen una amenaza para la salud humana.

BACTERIA y ARCHAEADiferencias

• La rígida pared celular que encierra las células bacterianas contiene peptidoglicano, pero las paredes celulares de las arqueas carecen de esta sustancia exclusivamente bacteriana y poseen pseudopeptidoglicano, glicoproteínas o proteína dispuesta en simetría hexagonal (capa superficial paracristalina-Capa S)

• La estructura y composición de otros componentes celulares como las membranas plasmáticas, los ribosomas y las ARN polimerasas.

• Las características fundamentales de procesos básicos como la transcripción y la traducción.

• El grupo más antiguo, las arqueobacterias, constituyen un fascinante conjunto de organismos y por sus especiales características se considera que conforman un Dominio separado: Archaea.

• Fenotípicamente, Archaea son muy parecidos a las Bacterias. La mayoría son pequeños (0.5-5 micras) y con formas de bastones, cocos y espirilos.

• Las Archaea generalmente se reproducen por fisión, como la mayoría de las Bacterias.

• Los genomas de Archaea son de un tamaño sobre 2-4 Mbp, similar a la mayoría de las Bacterias.

• Si bien lucen como bacterias  poseen características bioquímicas y genéticas que las alejan de ellas.

• Por ejemplo: no poseen paredes celulares con peptidoglicanos

• Presentan secuencias únicas en la unidad pequeña del ARNr

• Poseen lípidos de membrana diferentes tanto de las

bacterias como de los  eucariotas (incluyendo enlaces éter en lugar de enlaces éster)

• Las arqueas existen en una gran variedad de hábitats, son una parte importante de los ecosistemas globales

• Cuatro grupos fisiológicos principales. Son los halófilos,

• termófilos, • alcalófilos • y acidófilos

• Las arqueas, por lo general, tienen un único cromosoma circular al igual que las bacterias, que varía en tamaño desde 5.751.492 pares de bases en Methanosarcina acetivorans,

• El mayor genoma secuenciado hasta la fecha, hasta 490.885 pares de bases en Nanoarchaeum equitans, el genoma más pequeño conocido que puede contener sólo 537 genes codificadores de proteínas.

• Las arqueas también pueden presentar plásmidos que se pueden propagar por contacto físico entre células, en un proceso que puede ser similar a la conjugación bacteriana.

• Los plásmidos son cada vez más importantes como herramientas genéticas pues permiten la realización de estudios genéticos en Archaea

¿Qué es una levadura?

• Dominio:Eukaria

• Reino:Fungi

• Principales

• Características: Heterótrofos– •Unicelulares– •Pared celular de quitina– •Reproducción por gemación– •Metabolismo respiratorio (aeróbico) y fermentativo

• El genoma de levadura contiene un conjunto de 16 cromosomas completamente caracterizados.

• Sus tamaños oscilan desde 200 a 2.200 kb.

• Se calcula que aprox. debe contener unos 6200 marcos abiertos de lectura, o genes.

Plasmidos en levadura

• Se conocen plásmidos en eucariotas.

• Los más conocidos son el plásmido de 2 micras en levaduras y los plásmidos que transmiten androesterilidad en el maíz, llamados S1 y S2 presentes en las mitocondrias.

• El gran interés que despertaron estas partículas fue principalmente por su propiedad para transmitir la resistencia a los antibióticos y a sustancias tóxicas

Plasmidos en levadura

• Ciertos vectores (YEP o Yeast episomal plasmids) contienen el origen de replicación de un plásmido natural de S. cerevisiae, el plásmido 2 µ (mu, letra griega).

• Tal vector se mantiene en forma de epísomos en número de 10 a 40 copias por célula (integrado al cromosoma).

• Los plásmidos que contienen las secuencias 2 µ son relativamente estables en la levadura, son transmitidos eficientemente a la descendencia durante la mitosis.

Plasmidos en levadura

• Los vectores pESC constituyen una serie de vectores epítopes marcados diseñados para la expresión y el análisis funcional de genes eucariotas en la levadura S. cerevisiae.

• Estos vectores contiene los promotores GAL1 y GAL10 de levadura.

Plasmidos en levadura

• YCP ou Yeast centromere plasmids:

Otros vectores (YCP o Yeast centromere plasmids) contienen un orígen de replicación cromosómico ARSH4 (Autonomous replicating sequence), secuencia de replicación autónoma y un centrómero CEN6 : ellos están presente en número de 1 a 2 copias por célula .

.

Plasmidos en levadura• Los vectores pYC

Contienen el orígen de replicación para un número pequeño de copias CEN6/ARSH4 en levadura.

• Se encuentran disponibles con una variedad de marcadores de selección.

• A los vectores pYC también se los encuentra con una variedad de epítope tags (marcadores epitopes) para la detección y purificación de proteínas recombinadas.

Plasmidos en levadura• El vector pYC2/NT contiene un N-terminal Xpress™-

6xHis tag,

• Mientras que los vectores pYC2/CT y pYC6/CT contienen un C-terminal V5-His tag.

• Tanto el vector pYC2/NT como el pYC2/CT poseen el gen marcador URA3 para su selección.

• El vector pYC6/CT contiene el gen de resistencia al Blasticidina para su selección en levadura.

Tipos de vectores

• YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma

• YEp: episomales: ori 2 (alto número de copias)

• YCp: centroméricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)

Promotores

Vectores de levadurasVectores de levaduras

Promoter Status

Acid phosphatase PHO5 InducibleAlcohol dehydrogenase I ADH I ConstitutiveAlcohol dehydrogenase II ADH II InducibleGalctokinase GAL 1 InducibleMetallothionein Cup 1 InduciblePhosphoglycerate kinase PGK ConstitutiveTriose Phosphate isomerase TPI Constitutive

21-Expresión proteínas-BM 2009

Vectores episomales

22-Expresión proteínas-BM 2009

Vectores centroméricos

23-Expresión proteínas-BM 2009

Expresión de proteínas en Expresión de proteínas en Pichia pastorisPichia pastoris

1) Requiere técnicas simples para la manipulación genética (similar a S. cerevisiae)

2) Producción de altos niveles de proteínas (intra y extracelular)

3) Modificaciones post-traduccionales: glicosilación, puente disulfuro, procesamiento proteolítico.

4) Kits de expresión disponibles.

5) Empleo del gen AOX1

24-Expresión proteínas-BM 2009Diagrama general de un vector P pastoris shuttle

MCS

Ampr, oriE: mantenimiento en E. coli

AOX1p: promotor de alcohol oxidasa.

AOX1t: secuencias terminador transcripción.

MCS: sitio múltiple clonado.

HIS4: marcador biosintético.

3´-AOX1

25-Expresión proteínas-BM 2009

Integración del vector de P. pastoris

•Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresión.

•Corte del vector que lleva inserto de interés flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinación homóloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.)

•Transformación con vector linealizado por electroporación o métodos químicos.

•Cepa huésped: his4 pep4 prb1 (auxotrófica para Histidina y deficiente en proteasas).

Inserto

Inserto

Selección en medio his-

Cepa resultante aox1=Muts

Metanol: crec lento, alta producción prot.

26-Expresión proteínas-BM 2009

Pichia methanolica Expression System

Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol oxidasa):

reprimido por glicerol o glucosa

Inducido por metanol

-factor: péptido señal para secreción de la proteína expresada.

V5 epítope: para detección con anticuerpos anti-V5

6xHis: tag polihistidina purificación níquel-agarosa.

ADE2: marcador biosintético.

MUCHAS GRACIAS