Tema 6
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nikolas-aguilera -
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ANLISIS Y CUANTIFICACIN DE AMINOCIDOSReaccin de la ninhidrina (espectrofotomtrica)Reaccin con o-ftalaldehdo (Fluorimtrica) Cromatografa deintercambio catinicoActualmente: HPLC
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Cromatografa en capa fina (aminocidos)
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PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE PROTENAShttp://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
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CENTRIFUGACIN ISOPCNICAhttp://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
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SEPARACIN Y PURIFICACIN DE PROTENASSe basa en la diferente:
Solubilidad
Tamao
Carga elctrica
Densidad
Afinidad por otras molculas
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SEPARACIN DE PROTENASCROMATOGRAFA EN COLUMNALas diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamao o unin a grupos qumicoshttp://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
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A: CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO(Ej: intercambio catinico)Las protenas se separan segn su carga a un pH determinado
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B: CROMATOGRAFA DE FILTRACIN O EXCLUSIN MOLECULARLas protenas se separan segn su tamao
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C: CROMATOGRAFA DE AFINIDADLas protenas se separan en funcin de la especificidad de unin a un ligando. En este ejemplo el ligando es la glucosa y se separan aquellas protenas que se unen a ella. Las protenas de inters se eluyen aadiendo un exceso de ligando libre.
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ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
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ELECTROFORESIS EN GEL ELECTROFORESIS EN GEL:Tras aplicar un campo elctrico las protenas migran en funcin del tamao y de la carga(solubiliza protenas)Electroforesis en SDS-PAGEhttp://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
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Ejemplo de anlisis de protenas por SDS-PAGE en cada paso de una purificacin. En el ltimo paso hay una nica banda, lo que indica que tenemos la protena de inters completamente purificada
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ISOELECTROENFOQUEEs un tipo de electroforesis en gel con anfolitos que crean un gradiente de pH. Cada protena migra hasta su punto isoelctrico.http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
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Ejemplo de SDS-PAGE teido con azul de CoomassieMarcador de PMMarcador de PM
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GELES BIDIMENSIONALES (2D)Primero isoelectroenfoque y luego SDS-PAGE
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Ejemplo de gel bidimensional
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SEPARACIN Y PURIFICACIN DE PROTENASSe basa en la diferente:
Solubilidad
Tamao
Carga elctrica
Densidad (centrifugacin)
Afinidad por otras molculas
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FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIN DE LA SOLUBILIDAD(Voet)(p.e. sulfato de amonio)
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(Voet)