Teoria

Capítulo 1 Antecedentes y Justificación

CAPÍTULO 1

1. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN

1.1 Introducción

Desde el inicio del desarrollo de la microbiología como ciencia, a finales del siglo XIX, se

han realizado diversas investigaciones, con el fin de comprender tanto la diversidad

microbiana como su potencial utilidad (Madigan y col., 2007). De particular interés fue el

estudio de los organismos capaces de adaptarse a ambientes cuya presión, temperatura,

pH, alcalinidad, acidez o salinidad fueran extremos, respecto a las condiciones que

caracterizan los hábitats considerados aptos para el ser humano. Los mecanismos

utilizados por estos organismos para resistir y responder apropiadamente al estrés

físico, mecánico o químico de los medios extremos y la aplicación de estos desde una

perspectiva industrial han sido durante décadas los temas preponderantes de

investigación (Rossi y col., 2003).

Los organismos vivos capaces de habitar ambientes “extremos” son conocidos como

“extremófilos”; entre estos, aquellos denominados halófilos, por su capacidad de habitar

ambientes hipersalinos, han sido durante los últimos 25 años objeto de diversos e

importantes estudios. (Prescott y col., 2002). En la actualidad, se sabe que los

mecanismos por los cual estos organismos se adaptan a su medio se basa en la

acumulación de materiales intracelulares, como iones inorgánicos (K+, Cl-) y compuestos

orgánicos compatibles, que proveen un balance osmótico con las elevadas

concentraciones de NaCl del medio (Quillaguamán, 2005; Ramírez y col., 2006).

Los microorganismos halófilos han sido considerados interesantes desde el punto de

vista biotecnológico, debido a su capacidad de producir una amplia variedad de

compuestos útiles para la industria, como enzimas, solutos compatibles, y polímeros,

como resultado del desarrollo de mecanismos de adaptación y protección frente al estrés

provocado por los factores característicos de los medios en los que habitan (Ramírez y

col., 2006).

Entre los polímeros de mayor interés producidos por halófilos se encuentra el poli (3-

hidroxibutirato) (PHB), un polímero sintetizado intracelularmente y acumulado en forma

de gránulos (Quillaguamán, 2005). El PHB posee características físicas y mecánicas


similares al poliestireno y otros plásticos y elastómeros derivados del petróleo, aunque

por su naturaleza biológica el PHB es biodegradable, biocompatible y no tóxico,

características por las que es considerado un potencial sustituto de los plásticos

convencionales, derivados del petróleo. Sin embargo, su fabricación a escala industrial

es limitada, principalmente por los costos elevados que implica su producción (Choi y

Lee 1999).

Si bien los factores que afectan los costos totales de producción son varios, el principal

es el costo referido a la fuente de carbono a partir de la cual el microorganismo sintetiza

el PHB, este representa aproximadamente el 40-50% de los costos totales de producción

(Quillaguamán y col., 2006). Por ello, en el presente trabajo de investigación se estudió

el uso de hidrolizados de almidón de yuca como una fuente alternativa de carbono

considerando que estos tienen un costo inferior, por lo menos cinco veces menor al de la

glucosa (el sustrato más utilizado en la producción de PHB). Las pruebas experimentales

fueron realizadas, utilizando H. boliviensis (una bacteria halófila) como microorganismo

productor; en una primera etapa, los ensayos se realizaron en frascos agitados como

sistemas batch. Posteriormente, en un bioreactor operado en sistemas batch y fed-batch

bajo condiciones controladas de temperatura, pH y aireación.


1.2 Antecedentes

El estudio de los polímeros de origen microbiano, denominados polihidroxialcanoatos, se

inició probablemente el año 1888 cuando Beijerinck, microbiólogo holandés, reportó por

primera vez la presencia de gránulos de poli (3-hidroxibutirato) (PHB) en células

bacterianas. Décadas más tarde, en 1927, Lemoigne describió la composición de los

gránulos observados por Beijerinck, dando lugar al descubrimiento del homopoliester

conocido hoy como poli (3-hidroxibutirato), los siguientes 50 años diversas

investigaciones científicas derivaron en la determinación de la función del polímero en la

célula, el estudio de su estructura cristalina, sus propiedades físicas y químicas y su

metabolismo, y el desarrollo de métodos de detección y cuantificación (Slepecky y Law,

1961; Braunegg y col., 1998)

Aunque durante muchos años se analizó y reportó la presencia de PHB en diferentes

microorganismos, el interés en su estudio se limitó a su importancia fisiológica como

sustancia microbiológica. No obstante, el reconocimiento de biopoliester como material

útil para la fabricación de envases biodegradables y artículos de uso diario se dio

durante la primera mitad de los años 60. Desde entonces, diferentes industrias y centros

de investigación en el mundo (Chemie Linz GmbH, Petrochemia Danubia, Biomer,

Tianjin Northern Food Inc./China, Instituto de Microbiología de la Academia China,

Laboratorio de Microbiología de la Universidad Tsinghua, Centro Guangdong Jiangmen

para el desarrollo de biotecnología/China, etc.) han promovido el estudio de la

producción de PHB utilizando nuevas especies de microorganismos, desarrollando

nuevas técnicas de purificación y métodos de procesamiento, con el fin de lograr la

optimización del proceso productivo del homopolímero e incentivar su comercialización

(Braunegg y col., 1998).

En Sud América, y en Bolivia especialmente los estudios que se han llevado a cabo

sobre polímeros biodegradables son escasos. Las principales investigaciones realizadas,

han sido desarrolladas por el Centro de biotecnología de la U.M.S.S. y se encuentran

relacionadas con el aislamiento de una nueva especie bacteriana habitante de las zonas


hipersalinas de nuestro país (Laguna Colorada) denominada Halomonas boliviensis, un

microorganismo halófilo moderado capaz de producir poli (3-hidroxibutirato) a niveles

comercialmente competitivos (Quillaguamán, 2005). Los estudios realizados, han

despertado interés en la producción de biopoliester, por lo que en la actualidad se

encuentran en desarrollo proyectos de investigación, como el presente, destinados a

desarrollar estrategias que permitan mejorar el proceso productivo de PHB a fin de iniciar

su producción a escala industrial en nuestro país.

1.3 Justificación

Durante las últimas décadas el uso de plásticos sintéticos derivados del petróleo ha

incrementado significativamente (Figura 1.1) (Müller, 2008), gracias a sus propiedades

fisicoquímicas versátiles, capacidad de producción en masa y reducidos costos de

comercialización (1 $us/Kg) (Panda y col., 2006). Sin embargo, la rápida disminución de

recursos no renovables y la acumulación de materiales persistentes nocivos para el

medio ambiente han generado interés en la producción de polímeros biodegradables,

principalmente de origen microbiano (Braunegg y col., 1998; Philip y col., 2007).

Figura 1.1: Consumo mundial de plásticos derivados del petróleo

49

77

101

141

165 175

183

0

50

100

150

200

250

1985 1990 1995 2000 2005 2006 2007

Mill

on

es

de

Tn

Año


El poli (3-hidroxibutirato), un polímero biodegradable perteneciente a la familia de los

polihidroxialcanoatos, es quizá el poliéster más atractivo como sustituto de los plásticos

convencionales, debido a sus propiedades físicas y mecánicas similares a las de varios

termoplásticos y elastómeros derivados de la petroquímica (Guzmán y col., 2009;

Bordes y col., 2009). No obstante, su elaboración a escala industrial es limitada por los

elevados costos que involucra su producción (4-6 $us/Kg) (Quillaguamán y col., 2006).

Con el fin de viabilizar la comercialización de PHB investigadores de diversas industrias

y universidades han promovido la utilización de nuevas cepas bacterianas productoras

del polímero, el uso de fuentes de carbono económicas y el desarrollo de procesos de

fermentación y purificación más eficientes (Choi y Lee, 1999).

Al presente, una cepa recombinante de E. coli, Alcaligenes latus, Capriavidus necátor y

Halomonas boliviensis, una bacteria halófila moderada, son los microorganismos más

estudiados en la producción de PHB (Quillaguaman, 2005). El proceso de producción

óptimo para estos microorganismos toma como precursor a la glucosa. Sin embargo,

este trabajo de investigación consideró que H. boliviensis es capaz de utilizar diferentes

carbohidratos como fuentes para producir PHB; por lo que se estudió la utilización de

una fuente de carbono alternativa (hidrolizados de almidón de yuca), que permite

disminuir el costo de producción referido al precursor, sin afectar la eficiencia del

proceso. Por otra parte, se logró la optimización del proceso a través de la reducción de

la concentración de NaCl requerida, pues aunque se sabe que H. boliviensis produce el

biopolímero (PHB) a concentraciones de 4,5 % (m/v) (Guzmán y col., 2009), los costos

debido al mantenimiento de equipos son reducidos al utilizarse concentraciones menores

de la sal. La producción de PHB fue estudiada en reactores aireados conocidos como

air-lift, siendo este el primer estudio sobre la producción del biopoliester en este tipo de

fermentadores.


1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo general

- Estudiar la producción de poli (3-hidroxibutirato) por Halomonas boliviensis (LC1)

utilizando hidrolizados de almidón de yuca (mandioca) como sustrato

1.4.2 Objetivos específicos

- Estudiar el crecimiento bacteriano y la producción del polímero utilizando mezclas

de xilosa y glucosa en frascos agitados.

- Determinar el rendimiento y productividad volumétrica de poli (3-hidroxibutirato)

usando hidrolizados de almidón de yuca como sustrato.

- Evaluar la producción del poliéster y la evolución del crecimiento bacteriano en un

Bioreactor operado en sistemas batch y fed-batch.

- Diseñar Bioreactores para el escalamiento de la producción del poliéster en una

planta piloto.

- Determinar el costo de producción del biopolímero en una planta piloto.

Capítulo 1 Antecedentes y

Justificación

CAPÍTULO 2

2. MARCO TEÓRICO

2.1 Microorganismos Extremófilos: vida en ambientes extremos

2.1.1 Características generales

Hasta hace poco se pensó que los medios habitables por los seres vivos se

restringían únicamente a los ambientes utilizados por los seres humanos para el

desarrollo de sus actividades. Sin embargo, durante los últimos 50 años se ha

demostrado que regiones cuyas condiciones físicas y químicas consideradas

poco favorables o intolerables para muchos organismos, incluidos entre estos el

hombre, son el hábitat común de otros entes vivos conocidos hoy como

“extremófilos” (Ramírez y col., 2006).

Los “extremófilos” son organismos que se caracterizan por su aptitud para

prosperar en condiciones hostiles, en términos de temperatura, pH, presión,

radiación, humedad y salinidad. Sus límites de crecimiento y desarrollo involucran

hábitats con temperaturas de -12 a 113 ºC, pH 0-13, presiones hidrostáticas de

hasta 1400 atm., reducida disponibilidad de agua (aW 0.6-0.65), elevadas

concentraciones de NaCl de 3 a 33 %(m/v), metales pesados y compuestos

recalcitrantes (Podar y Reysenbach, 2006; Prescott y col., 2002; Satyanarayana y

col., 2005).

2.1.2 Clasificación y mecanismos de adaptación

La existencia de una amplia variedad de microorganismos “extremófilos”, como

consecuencia de la presencia de diversas condiciones ambientales en nuestro

planeta, dificulta la realización de una clasificación precisa de estos. (Ramírez y

col., 2006) No obstante, se ha establecido un criterio principal para la

categorización, este criterio, considera el parámetro ambiental al que se refiere la

extremofilia del organismo (Ramírez y col., 2006; Satyanarayana y col., 2005).

La tabla 2.1 presenta un resumen de la clasificación y descripción de los

organismos “extremófilos” en función al parámetro ambiental al que se encuentra

ligada su extremofilia.


Justificación

Tabla 2.1: Clasificación y descripción de microorganismos

extremófilos en función al parámetro al que está referida su

extremofilia

Parámetro

Ambiental Tipo

Crecimiento

Óptimo Ejemplo

Temperatura

Hipertermófilos Temp. 80-113ºC Pyrolobus fumarii

Termófilos Temp. >45ºC Synechococcus

lividus

Psicrófilos Temp. < 15ºC Pseudoalteromonas

atlántica

pH

Alcalófilos pH>9 Spirulina laxa

Acidófilos pH < 5 Ferroplasma

acidiphilum

Humedad Xeróbilos

Organismos capaces

de sobrevivir en

condiciones de

extrema sequedad.

Metallogenium

Concentración

de metales

pesados

Metalófilos

Organismos que

crecen en presencia

de altas

concentraciones de

metales.

Ralstonia

metallidurans

Presión Barófilos

Organismos que

requieren elevadas

presiones (> 1 atm)

para prosperar

Methanococcus

jannaschii

Concentración

de sales

inorgánicas

Halófilos

extremos

Concentraciones de

15% NaCl (m/v) o

mayores

Halobacterium

salinarum

Halófilos Concentraciones de Halomonas

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=33070

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=33070


Justificación

Moderados 3-15% NaCl (m/v) boliviensis

Fuente: Elaboración propia

Con frecuencia los “extremófilos” viven en biotopos, que combinan dos o más

factores extremos, por lo que pueden pertenecer a más de un grupo. Así por

ejemplo, existen microorganismos capaces de prosperar a bajas temperaturas y

tolerar altas presiones o habitar medios acídicos y soportar elevadas temperaturas

(Prescott y col., 2002; Podar y Reysenbach, 2006).

Los mecanismos utilizados por los “extremófilos” para adaptarse a sus hábitats,

varían en función del parámetro ambiental que causa mayor estrés en el medio.

Estos mecanismos, pueden involucrar la acumulación o síntesis de compuestos al

interior de las células o la presencia de variaciones en la estructura y composición

de las biomoléculas del organismo (Castillo, 2005).

2.1.3 Aplicaciones biotecnológicas de los microorganismos extremófilos

Desde su descubrimiento, los microorganismos “extremófilos” han sido estudiados

con el fin de explotar, desde una perspectiva industrial, las propiedades y

características especiales que les permiten habitar en condiciones consideradas

letales para otros seres vivos (Satyanarayana y col., 2005). La mayoría de los

procesos industriales que involucran organismos “extremófilos” se basan en el uso

de sus biomoléculas, principalmente proteínas estructurales, lípidos y enzimas.

Debido a su elevada termoestabilidad y resistencia a la acción de agentes

desnaturalizantes, muchas de estas biomoléculas son utilizadas en la producción

de detergentes, en la industria alimentaria, textil, y química, y en el tratamiento del

cuero (Podar y Reysenbach, 2006).

Otras aplicaciones de “extremófilos” en procesos biotecnológicos implican al

microorganismo en sí; por ejemplo, en biominería se utilizan poblaciones de

microorganismos para la extracción de metales como cobre, cobalto, oro y uranio

de los minerales (Podar y Reysenbach, 2006), mientras en el área del tratamiento

biológico de la contaminación (bioremediación) los “extremófilos” son empleados


Justificación

para la biodegradación de petróleo y algunos compuestos xenobióticos, la

descomposición de hidrocarburos y la transformación de metales pesados

(Madigan y col., 2007).

La tabla 2.2 muestra a continuación un resumen acerca de algunas aplicaciones

actuales y potenciales de extremófilos en biotecnología.

Tabla 2.2: Aplicaciones actuales y potenciales de extremófilos en

biotecnología

Fuente Uso

Termófilos / Hipertermófilos

ADN polimerasa

Proteasas y Lipasas

α-amilasas, glucoamilasas, α-

glucosidasa, pululanasa,

xilosa/glucosa isomeras

Alcohol deshidrogenasa

Xilanasas

Amplificación de ADN por PCR

Suplementos en detergentes

Industria del almidón, obtención de

edulcorantes (ej.: glucosa, fructosa)

Síntesis química

Blanqueamiento de papel

Psicrófilos

Proteasas, lipasas, celulasas y

amilasas

Alcalino fosfatasa

Lipasas, proteasas

Ácidos grasos poli-insaturados

Detergentes

Biología molecular

Producción de queso

Aditivos alimentarios y suplementos

dietéticos

Alcalófilos

Proteasa, celulasa, xilanasa y lipasa

Ciclodextrinas

Xilanasas y proteasas

Pectinasa

Microorganismos

Detergentes

Productos alimenticios, químicos y

farmacéuticos

Blanqueador de pasta

Tratamiento de residuos y desengomado

Recuperación de aceites, producción


Justificación

antibióticos

Acidófilos

Microorganismos sulfuro-oxidantes

Enzimas ácido-tolerante

Recuperación de metales y desulfurizacion

de carbono

Catalizadores en síntesis de compuestos

en disoluciones ácidas

Metalófilos

Microorganismo Remoción de metales pesados

Halófilos

PHAs

Solutos compatibles

Amilasas, nucleasas y proteasas

Ácido γ-linoleico, β-caroteno,

extracto

celular

Microorganismos

Plásticos biodegradables

Protectores de células y proteínas

Aplicación industrial (ej.: agentes

saborizantes)

Suplementos dietéticos, colorantes

alimentarios, y materias primas

Transformación y degradación de

residuos,


2.2 Microorganismos halófilos: vida en ambientes hipersalinos

2.2.1 Características generales

Los halófilos son organismos “extremófilos”, capaces de prosperar en ambientes

hipersalinos considerados inhóspitos para otros seres vivos (Prescott y col., 2002),

crecen óptimamente a concentraciones de sal mayores o iguales a 5 % (m/v) y

toleran por lo menos 10%(m/v) de NaCl (Quillaguamán y col., 2009).

2.2.2 Clasificación y mecanismos de adaptación

El principal problema para la existencia de distintos tipos de microorganismos en

ambientes hipersalinos es la pérdida de agua citoplasmática a causa de la elevada

osmolaridad del medio. Para adaptarse y lidiar con las condiciones hostiles de

este tipo de hábitats, los halófilos han desarrollado mecanismos que les permiten

alcanzar un balance osmótico con las altas concentraciones de NaCl del entorno


Justificación

sin interferir en su propio metabolismo; estos mecanismos, involucran la

acumulación intracelular de compuestos orgánicos compatibles, sintetizados por el

propio microorganismo, o iones inorgánicos, procedentes del medio y depositados

en el interior de la célula gracias a mecanismos de transporte de membrana

específicos (Meseguer y col., 2004).

La acumulación de iones inorgánicos, es considerada un estrategia de

osmoadaptación típica de las Arqueas mientras la acumulación de compuestos

orgánicos compatibles es más utilizada por especies halófilas de los dominios de

Bacteria y Eucaria, aunque se ha reportado también el uso de este mecanismo de

adaptación en algunas Arqueas metanogénicas (Oren, 2002; Quillaguamán y col.,

2009).

Los microorganismos halófilos pueden clasificarse según sus requerimientos de

sal, aunque no se ha establecido aun un criterio específico para esta división, se

considera típicamente la existencia de dos tipos:

- Halófilos moderados: Capaces de prosperar en medios con concentraciones de

3-15% (m/v) de NaCl.

- Halófilos extremos: Crecen óptimamente en ambientes que presentan

concentraciones de 15-30% (m/v) de NaCl.

Es posible también, encontrar organismos halotolerantes, aptos para desarrollar

tanto en ambientes salinos como en medios carentes de sal (Kushner, 1978;

Quillaguamán, 2005).

2.2.3 Aplicaciones biotecnológicas de los microorganismos halófilos

Los microorganismos halófilos han encontrado aplicaciones diversas e

interesantes en el área biotecnológica, no sólo porque producen compuestos de

interés industrial, sino también porque presentan propiedades fisiológicas que

facilitan su explotación comercial (Oren, 2002).

Se utilizan microorganismos halófilos en la producción de alimentos fermentados,

salsa de soya, enzimas extra e intracelulares (amilasas, nucleasas, fosfatasas,

lipasas, gelatinasas y proteasas), solutos compatibles como glicina betaína y

ectoínas que son utilizados como protectores de estrés y estabilizadores de


Justificación

enzimas, ácidos nucleicos y membranas, síntesis de biopoliesteres (PHAs),

exopolisacáridos, liposomas, lectinas y tratamiento biológico de residuos en

medios salinos (Castillo, 2005; Oren, 2002; Ventosa y col., 1998).

La tabla 2.3 muestra algunas de las aplicaciones biotecnológicas de actual y

potencial explotación de Arqueas, Bacterias y Eucarias halófilas.

Tabla 2.3: Usos biotecnológicos actuales y potenciales de microorganismos

halófilos.

Producto Microorganismo

Productor Uso

Arqueas

Bacteriorodopsina

Pigmentos

carotenoideos

PHAs

Polisacaridos

extracelulares

Enzimas (amilasas,

amiloglucosidasas,

proteasa, lipasas)

Halobacterium salinarum

Diferentes miembros de

Halobacteriaceae

Haloferax mediterranei

Haloferax mediterranei

Diferentes arqueas

halófilas

Material de almacenamiento

halográfico, memorias de

computadora, unidades de

procesamiento, convertidores

fotoeléctricos.

Absorción de luz, aumento de

evaporación en tanques de

cristalización de sal.

Plásticos biodegradables.

Recuperación de petróleo de

pozos petroleros.

Industria farmacéutica, química,

de cosméticos y alimentaria.

Bacterias

Ectoina e hidroxiectoina

PHAs

Halomonas elongata

Diferentes miembros de la

Producida como enzima

estabilizadora, hidratante en

cosméticos.


Justificación

Enzimas (amilasas,

nucleasas, fosfatasas,

proteasas)

familia Halomonadaceae

Diferentes bacterias

halófilas

Plásticos biodegradables

Diferentes aplicaciones

industriales

Eucarias

β-caroteno

Biomasa

Especies de Dunaliella

Especies de Dunaliella

Producido como antioxidante y

agente colorante de alimentos.

Dunaliella es utilizada como

aditivo en cosméticos anti

arrugas.


2.3 Polímeros biodegradables

Los polímeros biodegradables son macromoléculas químicamente sintetizadas o

biosintetizadas durante los ciclos de crecimiento de diversos organismos (Avérous,

2004; Bordes y col., 2009), su característica principal es su capacidad de

degradarse al ser incorporados en ambientes biológicos, sufriendo modificaciones

químicas que conducen a su ruptura y a la posterior formación de fragmentos de

menor masa molecular (Platt, 2006). Los polímeros biodegradables presentan una

estructura química diferente a la de los plásticos convencionales; sin embargo,

muchas de sus propiedades físicas y mecánicas son similares (Bordes y col.,

2009).

Los polímeros biodegradables pueden ser producidos a través de diversas

tecnologías, a partir de recursos renovables de origen animal o vegetal, o a partir

de recursos fósiles, por lo que su clasificación puede darse en función a los

procesos y las materias primas utilizadas para su síntesis (Platt, 2006; Avérous,

2004; Bordes y col., 2009). La figura 2.1 muestra un esquema de dicha

clasificación.


Justificación

Polímeros

Biodegradables

Agropolímeros Biopoliésteres

Obtenidos a partir

de la biomasa

Polisacáridos Proteínas

Obtenidos a partir

de recursos

agrícolas

Obtenidos a partir

de recursos fosiles

Polihidroxialcanoatos

(PHA)Poliláctidos

Policaprolactona

(PCL)

Poliesteramidas

(PEA)

Co-poliésteres

alifáticos

Co-poliésteres

aromáticos

Celulosa

Almidones y

féculas

Animales:

colágeno,

caseína

Vegetales:

zeina, gluten

Poli

(3-hidroxibutirato)

(PHB)

Ácido poliláctico

(PLA)

Lípidos

Figura 2.1: Clasificación de los polímeros biodegradables


Justificación

Agropolímeros

Los agropolímeros son polímeros compostables y renovables, obtenidos de la

biomasa a través de procesos de fraccionamiento; entre los más importantes se

encuentran los polisacáridos, los lípidos y las proteínas (Avérous, 2004).

Los polisacáridos son macromoléculas formadas por azucares simples unidos a

través de enlaces glucosídicos, que constituyen el 75% de la materia orgánica de

la biosfera (Madigan y col., 2007). Entre los polisacáridos más abundantes en la

naturaleza se encuentran la celulosa, un biopolímero lineal, semicristalino

sintetizado por plantas y bacterias que a pesar de no ser procesado con facilidad

puede convertirse en un material biodegradable a través de modificaciones

químicas que alteren su estructura ordenada, y el almidón, un termoplástico

altamente hidrofílico de bajo costo y alta disponibilidad que puede ser utilizado

como aditivo biodegradable o material de sustitución en plásticos biodegradables

(Avérous, 2004). La figura 2.2 ejemplifica este tipo de polímeros.

a b

Figura 2.2: a) Amilosa, b) Amilopectina constituyentes del almidón

Las proteínas, son biomoléculas conformadas por aminoácidos enlazados por

medio de uniones peptídicas (Madigan y col., 2007). Las proteínas de origen

animal de ocurrencia más común son el colágeno, un biopolímero fibroso e

insoluble que constituye aproximadamente el 30% de las proteínas corporales de


Justificación

las especies vertebradas, y la caseína, una fosfoproteína presente en la leche y en

algunos de sus derivados fermentados como el yogurt y el queso.

La proteína de origen vegetal de mayor abundancia es el gluten, una

glucoproteína amorfa presente en la semilla de la mayoría de los cereales

(Avérous, 2004).

Biopoliésteres

Los biopoliésteres son una categoría de biopolímeros que contienen el grupo

funcional ester en su cadena principal. Su estructura general es la mostrada en la

figura 2.3 (Ashby y col., y col., 2005).

C OR

O

n

Figura 2.3: Estructura general de un biopoliester (Ashby y col., 2005)

Los biopoliésteres pueden ser obtenidos a partir de recursos agrícolas o recursos

fósiles. Entre los principales, biopoliésteres, producidos en base a recursos del

agro se encuentran los poliláctidos y lo polihidroxialcanoatos. Entre los

biopoliésteres sintetizados a partir de recursos fósiles más conocidos se

encuentran la policaprolactona, las poliesteramidas, los co-poliesteres alifáticos y

los co-poliesteres aromáticos (Avérous, 2004).

Los ácidos polilácticos (Figura 2.4) son biopoliésteres alifáticos, obtenidos

mediante la polimerización del ácido láctico (Ashby y col., 2005). Las

propiedades de los polilácticos pueden variar en función del proceso utilizado para

la síntesis del acido láctico. Los polímeros obtenidos de monómeros naturales (L-

PLA) presentan un elevado grado de cristalinidad, alta resistencia a la tensión y

baja elongación por lo que son adecuados para aplicaciones que requieran


Justificación

soportar carga (suturas, fijaciones ortopédicas), mientras aquellos obtenidos de

monómeros químicamente sintetizados (L,D-PLA) son amorfos, muestran baja

resistencia a la tensión y alta elongación lo que los hace útiles para los sistemas

de liberación de fármacos (Ashby y col., 2005; Wolf y col., 2005).

C CH

O CH3

O

n

Figura 2.4: Poli (ácido láctico) PLA (Avérous, 2004)

La policaprolactona (Figura 2.5) es biopoliéster alifático semicristalino, preparado

mediante la polimerización por apertura de anillo de la ε-caprolactona (Avérous,

2004), posee una buena resistencia al agua, aceite y otros solventes. La

policaprolactona se comporta como un material biocompatible, por lo que es

utilizado como dispositivo para la liberación contralada de fármacos y como sutura

biodegradable (Wolf y col., 2005).

C (CH2)5

O CH3

O

n

Figura 2.5: Policaprolactona (Avérous, 2004)

Las poliesteramidas son polímeros que contienen enlaces tipo ester (COO-) y

enlaces tipo amida (-CONH-) en la cadena principal. A escala industrial, las

poliamidas son obtenidas por la copolimerización de monómeros de poliamida (PA

6 o PA 6-6) y ácido adípico Las poliesteramidas más conocidas, a pesar de

haberse suspendido su producción, son las poliesteramidas BAK1095 (cuya

estructura se observa en la figura 2.6) y BAK2195, producidas por la empresa


Justificación

químico-farmacéutica Bayer. La utilidad de BAK destacaba en la horticultura, la

agricultura y la industria alimentaria (Avérous, 2004).

C (CH2)4

O

C O

O

(CH2)4 O C

O

(CH2)5 NH

x y

Figura 2.6: Poliesteramida BAK 1095 (Avérous, 2004)

Los co-poliésteres alifáticos son biopoliésteres obtenidos por la combinación de

dioles y ácidos dicarboxílicos (Avérous, 2004; Bordes y col., 2009). El interés en

estos polímeros se ha incrementado desde la presentación del polímero Bionolle

(Figura 2.7), comercializado por Showa Highpolymer, en 1990. La aplicación del

material abarca desde bolsas de basura y compostaje a envases para alimentos,

cosméticos y espumas.

C (CH2)4

O

C O

O

(CH2)4 O C

O

(CH2)4 C O

x

O

(CH2)4 O

y

Figura 2.7: Co-poliester alifático BIONELLI (Avérous, 2004)

2.3.1 Polihidroxialcanoatos

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres alifáticos de hidroxiácidos (Naik y

col., 2008), sintetizados de forma natural por una extensa variedad de procariotas


Justificación

(Braunegg y col., 1998) a través de la transformación de diversos sustratos de

carbono bajo condiciones de cultivo específicas, que generalmente incluyen la

limitación de nutrientes esenciales(O, N, P, S) o elementos traza (Mg, Ca, Fe)

(Naik y col., 2008).

Los PHAs se encuentran ampliamente distribuidos en el mundo natural; en la

actualidad, se sabe que son sintetizados por más de 300 microorganismos


Entre los que se hallan especies de Bacterias Gram positivas y Gram negativas

(ej.: Pseudomonas, Bacillus, Rolstonia y Aeromonas) y algunas Arqueas (ej.:

Haloferax sulfurifontis y Haloferax mediterranei,) (Philip y col., 2006).

Los PHAs se encuentran en los microorganismos en forma de inclusiones

citoplasmáticas, útiles como reservas de carbono y energía (Anderson y Dawes,

1990; Kessler y Witholt, 2000; Philip y col., 2006). Una vez extraídos de las células

exhiben propiedades termoplásticas y elastoméricas similares a las de varias

poliolefinas aunque a diferencia de estas últimas los PHAs son biodegradables y

biocompatibles, lo que permite su aplicación en biomedicina, agricultura y en la

elaboración de envases (Guzmán y col., 2009; Bordes y col., 2009).

La estructura general de un PHA es la expuesta en la figura 2.8. En esta, tanto el

valor de x como la composición del radical R determinan la identidad de la unidad

monomérica (Braunegg y col., 1998). Normalmente x equivale a 1 para PHA´s de

relevancia comercial, R puede representar un átomo de hidrógeno o cadenas

hidrocarbonadas de hasta 16 átomos de carbono y n (número de veces que se

polimeriza el monómero) puede adquirir valores entre 100-30000 (Wolf y col.,

2005).

C

O

(CH2)x CH

R

O

n


Justificación

Figura 2.8: Estructura general de los polihidroxialcanoatos (PHAs)


En función del número de átomos de carbono presentes en la cadena lateral R, los

PHAs se clasifican en dos grupos:

- De cadena lateral corta: el radical R está conformado por 3-5 átomos de

carbono.

- De cadena lateral media: el radical R está compuesto por 6-14 átomos de

carbono (Quillaguamán, 2005; Naik y col., 2008).

Las diferencias en el tamaño de la cadena lateral R se presentan debido al tipo de

sustrato utilizado para la producción del PHA y a la especificidad de la enzima

PHA polimerasa y dan lugar a la variación de las propiedades físicas de los PHAs.

Así por ejemplo, los polihidroxialcanoatos de cadena lateral corta (termoplásticos)

son tiesos, quebradizos y tienen un alto grado de cristalización, mientras

polihidroxialcanoatos de cadena lateral mediana (elastómeros) son flexibles, de

baja cristalización y temperatura de fusión (Philip y col., 2007).

Dependiendo del sustrato utilizado y el metabolismo del microorganismo productor

pueden obtenerse monómeros de diferente estructura, lo que da lugar a una

extensa variedad de polihidroxialcanoatos de cadena lateral corta y/o mediana

(Bordes y col., 2009).

La tabla 2.4, a continuación, muestra la estructura de los polihidroxialcanoatos

básicos y de mayor interés comercial.

Tabla 2.4: Estructura de los PHAs básicos y de mayor interés

comercial

PHA Estructura de la cadena

lateral

Poli (3-hidroxipropionato) -H


Justificación

(PHP)

Poli (3-hidroxibutirato) (PHB) -CH3

Poli (3-hidroxivalerato) (PHV) -CH2CH3

Poli (3-hidroxicaproato) (PHC) -(CH2)2CH3

P(3HB-co-3HV) -CH3 y -CH2CH3

P(3HB-co-3HH) -CH3 y -(CH2)3CH3

P(3HB-co-3HO) -CH3 y -(CH2)4CH3


2.4 Poli (3-hidroxibutirato)

El Poli (3-hidroxibutirato) (PHB) (cuya estructura química se muestra en la figura

2.9) es uno de los miembros más estudiados de la familia de los

polihidroxialcanoatos (Anderson y Dawes, 1990; Bonartsev y col., 2005). Es

considerado como un homopolímero de cadena lateral R corta; está constituido

por unidades monoméricas de 3-hidroxibutirato y es sintetizado intracelularmente

por varias especies de Arqueas y Bacterias en presencia de un sustrato de

carbono en exceso y, generalmente, cuando el crecimiento celular se encuentra

limitado por la falta de un nutriente como: O, P, N o S (Quillaguamán, 2006).

C

O

(CH2) CH

CH3

O

n


Justificación

Figura 2.9: Estructura química del PHB

La principal función del PHB en los microorganismos es la de constituirse en un

reservorio de carbono y energía; su presencia garantiza el almacenaje de grandes

cantidades de carbono reducido sin afectar significativamente la presión osmótica

de la célula. Además, con frecuencia permite retardar la degradación de los

componentes celulares importantes durante periodos de escases de nutrientes

(Anderson y Dawes, 1990).

El PHB se presenta en las células en forma de gránulos lábiles y amorfos cuyos

diámetros alcanzan entre 0,2 - 0,7 m y se encuentran aislados del citoplasma

gracias a la presencia de una membrana de 2 nm de espesor compuesta por

lípidos y proteínas (Braunegg y col., 1998).

La figura 2.10 muestra a continuación una fotografía de gránulos de PHB en

células de la bacteria halófila moderada Halonomas boliviensis.

Gránulos de PHB

Figura 2.10: Gránulos de PHB en H. boliviensis. Fotografía tomada con un

microscopio electrónico de transmisión (Quillaguamán, 2005).


Justificación

2.4.1 Vías biológicas para la síntesis de PHB

La biosíntesis del poli (3-hidroxibutirato) se da a partir del uso de diversos

sustratos como carbohidratos, ácidos grasos, dióxido de carbono y alcoholes y el

desarrollo de diferentes vías biosintéticas (como se muestra en la figura 2.11)

(Quillagua

mán J., 2005).

La vía metabólica utilizada por la mayoría de los microorganismos productores de

PHB, hoy conocidos, involucra la formación de moléculas de acetil-CoA y el

desarrollo de tres reacciones sucesivas catalizadas por tres enzimas específicas:

3-Cetoacil-CoA tiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y PHB polimerasa (Via I)

(Anderson y Dawes, 1990; Quillaguamán J., 2005). La primera reacción,

catalizada por la 3-Cetoacil-CoA tiolasa, permite la formación de una molécula de

acetoacetil-CoA a través de la condensación reversible de dos moléculas de acetil-

CoA. La segunda reacción, en la que actúa la enzima NADPH dependiente

acetoacetil-CoA reductasa, da lugar a la transformación estéreo-selectiva de una

molécula de acetoacetil-CoA en D-(-)-3-hidroxibutiri-CoA. Finalmente, la tercera

reacción, catalizada por la PHB polimerasa, permite la polimerización vía

esterificación de 3-hidroxibutiril-CoA a Poli (3HB) (Braunegg y col., 1998; Kessler y

Witholt, 2000; Philip y col., 2007).

Una variación de la vía metabólica antes descrita se presenta en las bacterias de

la especie Rhodospirillum rubrum. En esta, la síntesis de PHB involucra la

formación de L-(-)-3-hidroxibutiri-CoA por la acción de la acetoacetil-CoA

reductasa y la posterior conversión del L-estereoisómero al R-estereoisómero vía

crotonil-CoA gracias a la acción de las enzimas estereoespecíficas enoil-CoA

reductasa y enoil-CoA hidratasa (Via II) (Anderson y Dawes, 1990; Quillaguamán,

2005).

Por otra parte, el uso de acido butírico como precursor en la síntesis de PHB, da

lugar a la formación directa de una molécula de acetoacetil-CoA, omitiendo la


Justificación

degradación del sustrato a acetil-CoA y desestimando la participación de la 3-

Cetoacil-CoA tiolasa en la síntesis (Vía III) (Braunegg y col., 1998).


Justificación

SCoA

O

SCoA

O O

SCoA

OOH

O

O

n

SCoA

O

SCoA

OOH

OH

O

SCoA

O

SCoA

O

SCoA

OOH

ATP

AMP

2H2O

2H2O

2H2O

CoASH

CoASH

Enoil-CoA

reductasa

Enoil-CoA hidratasa

PHB

polimerasa

Acetoacetil-

CoA reductasa

3-Cetoacil-CoA

tiolasa

Acetoacetil-CoA

reductasa

CoASH

NAD NADH2 NADH2 NAD

FAD FADH2

NADPH NADP

II

I

III


Justificación

Figura 2.11: Vías para la biosíntesis de PHB: (I) A partir de acetil-CoA, (II) a

través de una ruta alternativa a la vía I para la conversión del

estereoisómero, (III) A partir de acido butírico. (Quillaguamán, 2005)

2.4.2 Propiedades

Propiedades físicas, térmicas y mecánicas

El PHB es un poliester estereoregular, ópticamente activo, con el centro quiral de

la unidad monomérica siempre en configuración R, por lo que puede alcanzar un

alto grado de cristalinidad (Anderson y Dawes, 1990). Su peso molecular puede

adquirir valores entre 500000 a 2000000Da, dependiendo de las condiciones del

proceso de fermentación, el microorganismo y la fuente de carbono utilizada para

la síntesis (Eggink y col., 1994).

El Poli (3-hidroxibutirato) es un material termoplástico, por lo que a temperaturas

próximas a su punto de fusión se convierte en una resina viscosa y moldeable

mientras al enfriar cristaliza rápidamente hasta convertirse en un material plástico

rígido y frágil cuyas propiedades se asemejan a las del polipropileno (Tabla 2.5)

(Anderson y Dawes, 1990; Braunegg y col., 1998; Marchessault y Yu; 2000).


Justificación

Tabla 2.5: Propiedades físicas y mecánicas del PHB comparadas

con las propiedades del polipropileno

Propiedades Polipropileno PHB

Peso molecular 2·105 5·105 - 20·105

Densidad (g/cm3) 0.905 1.18 -1.25

Temperatura de fusión (ºC) 176 180

Temperatura de transición

vítrea (ºC) -10 -5 - +5

Temperatura de utilización (ºC) -60 a 120 -30 a 120

Cristalinidad (%) 70 80

Módulo flexular (MPa) 1700 3500

Fortaleza ante la tensión (MPa) 38 40

Resistencia a la rotura (%) 400 5


Justificación

Permeabilidad al O2.

(cm 3/m2/átomo/día) 1700 45

Transmisión de vapor de H2O

(g/m2/día) ---- 60-70


Propiedades Químicas

Debido a su alto grado de cristalinidad el PHB tiene una resistencia aceptable a la

presencia de solventes, grasas y aceites (Anderson y Dawes, 1990). En

comparación con el polipropileno (PP), exhibe mayor resistencia a la radiación

ultravioleta aunque, es más susceptible al ataque de ácidos y álcalis; posee baja

permeabilidad al oxígeno, vapor de agua y dióxido de carbono por lo que puede

ser utilizado en aplicaciones que requieran la protección de productos sensibles a

los gases (Hocking y Marchessault, 1998).

El PHB es insoluble en agua y relativamente resistente a la degradación

hidrolítica. Esto, lo diferencia de otros biopolíesteres que se muestran sensibles a

la humedad y/o son solubles en agua (Wolf y col., 2005).

Otras propiedades

Debido a su naturaleza biológica el PHB es biodegradable, biocompatible y no

tóxico. Su degradación completa puede realizarse tanto en condiciones aerobias

como anaerobias, y a través de medios térmicos o por hidrólisis enzimática

(Braunegg y col., 1998; Wolf y col., 2005). En el medio ambiente el poliéster puede

ser degradado por una amplia diversidad de microorganismos principalmente

pertenecientes a las familias Pseudonocardiaceae, Micromonosporaceae,

Termomonosporaceae, Streptosporagiaceae y Streptomicetaceae. En organismos

vivos el PHB se degrada principalmente por la acción de enzimas presentes en la

sangre y en los tejidos (Philip y col., 2007).

El ritmo de biodegradación en el medio ambiente como en organismos vivos

depende tanto de las condiciones ambientales (temperatura, humedad, pH) como


Justificación

de las características intrínsecas del polímero (composición del monómero,

cristalinidad) (Braunegg y col., 1998; Philip y col., 2007).

2.4.3 Aplicaciones

Durante los últimos años el poli (3-hidroxibutirato) ha sido estudiado con el fin de

explotar comercialmente todas las propiedades y características especiales que

posee. Su aplicación se ha expandido a diversas áreas entre las que se incluyen

la medicina y la agricultura (Philip y col., 2007).

Aplicación industrial

En el área industrial el principal interés en el PHB se debe a su biodegradabilidad,

característica que le permite ser utilizado para la elaboración de todo tipo de

materiales de embalaje, incluyendo bolsas de compost y envases para alimentos,

y la fabricación de objetos de uso diario como peines, lapiceros y artículos

sanitarios desechables (Hocking y Marchessaul, 1998; Philip y col., 2007).

Por otra parte, debido a su naturaleza piezoeléctrica, el biopolímero es empleado

en la fabricación de sensores de presión para teclados, instrumentos de medición

de aceleración y elasticidad, sensores de ondas de choque, encendedores,

micrófonos, detectores ultrasónicos, instrumentos de medición de presión sonora,

auriculares y parlantes (Philip y col., 2007).

Aplicación médica

El área médica es quizá uno de los campos principales y más desarrollados de

aplicación de los polímeros biodegradables, especialmente del PHB; material que

por su biodegradabilidad, biocompatibilidad y no toxicidad es utilizado en medicina

regenerativa o ingeniería de los tejidos, en el área cardiovascular para la

fabricación de parches pericardios, válvulas de corazón, injertos y endoprótesis

vasculares (Philip y col., 2007), en el área farmacéutica como films o

microcapsulas que permiten la liberación controlada, por degradación y difusión


Justificación

simultanea, de drogas y hormonas (Rojas y col., 2008) y para la elaboración de

dispositivos médicos como placas y tornillos para la fijación de huesos y

cartílagos, materiales óseo-sintéticos, e hilos para suturas quirúrgicas (Bonartsev y

col., 2007).

2.4.4 Producción industrial

En la actualidad, la producción a escala industrial de Poli (3-hidroxibutirato) y otros

polihidroxialcanoatos es limitada, principalmente debido a los elevados costos que

implica (Naik y col., 2008). Sin embargo, algunas empresas y entidades

investigadoras han estudiado el uso de nuevas cepas y han desarrollado procesos

productivos y de recuperación más eficientes, que permiten reducir los costos de

producción de estos biopoliésteres.

Aunque existe un gran número de microorganismos productores de PHB, solo

algunas cepas poseen características que pueden ser explotadas en la producción

a gran escala (Tabla 2.6); entre estas Alcaligenes latus, Capriavidus necátor,

Halomonas boliviensis, Azobacter vinelandii,y cepas recombinantes de Echerichia

coli.

Alcaligenes latus es una cepa bacteriana capaz de crecer en medios con

sacarosa, glucosa o melaza y almacenar hasta 88% de PHB en relación a su peso

seco. Fue utilizada por la compañía Chemie Linz GmbH en colaboración con

Petrochemia Danubia (PCD) para la producción de biopoliester, de 1982 a 1988, la

producción alcanzó 1000Kg/semana utilizando sacarosa como precursor. En la

actualidad la compañia Bioemer de Alemania posee la tecnología de producción

de PHB por Alcaligenes latus y los derechos de su uso. Hoy en día, el polímero

obtenido es utilizado en la elaboración de artículos de uso diario como peines y

lapiceros.

Capriavidus necátor, es una bacteria Gram-negativa, utilizada por el Instituto de

Microbiología de la Academia china de ciencias en colaboración con Tianjin

Northern Food Inc./China, para investigar la producción de PHB en medios con

glucosa.


Justificación

Azobacter vinelandii, es una bacteria Gram-negativa quimiorganotrofa capaz de

crecer rápidamente en medios con melaza y acumular PHB hasta 90% de su

peso seco. Es utilizado por el laboratorio de microbiología de la universidad

Tsinghua y el centro Guangdong Jiangmen para el desarrollo de

biotecnología/China para la producción de PHB, utilizando melaza como sustrato,

en una planta piloto. El PHB producido alcanza masas moleculares de 1-4

millones de Da. Y es en la actualidad estudiado para su aplicación en ingeniería

de tejidos.

Tabla 2.6: Producción de PHB en sistema de cultivo “fed-batch” por bacterias con

potencial aplicación industrial (Quillaguamán y col, 2006).

Organismo Fuente de

carbono

Densidad

celular (g/L)

Contenido

de PHB

%(p/p)

Concentraci

ón PHB (g/L)

Productividad

Volumétrica

(g/L/h)

Halomonas

boliviensis Glucosa 44 81.0 35.4 1.10

Alcaligenes

latus Sacarosa 111.7 88.0 98.7 4.94

Echerichia

coli Glucosa 194.4 73.0 141.7 4.63

Cupriavidus

necátor Glucosa 164.0 76.0 121.0 2.42

Cupriavidus

necátor

Dióxido de

carbono 91.3 67.8 61.9 1.55

Azobacter

vinelandii Glucosa 40.1 79.8 32.0 0.68

Pseudomon

as

extorquens

Metanol 233.0 64.0 149.0 0.88



Justificación

2.4.5 Producción de PHB por Halomonas boliviensis

Halomonas boliviensis (Figura 2.12) es una bacteria Gram-negativa, aeróbica,

heterotrófica, halófila moderada, alcalinotolerante y psicrofílica, a la fecha

únicamente aislada a partir de muestras de suelo procedentes de orillas de

Laguna Colorada, presenta un crecimiento óptimo a concentraciones de NaCl de

4.5 % (m/v), pH 7.5 y temperatura de 25-30 ºC en medios de cultivo complejos, no

obstante, es capaz de prosperar en medios con concentración de NaCl de 0-25 %

(m/v), valores de pH de 6-11 y temperaturas entre 0-40 ºC (Quillaguamán, 2004).

Figura 2.12: Células de Halomonas boliviensis. Fotografía tomada con un

microscopio electrónico de escaneo a 9500 veces de magnificación respecto

al tamaño original de la bacteria (Quillaguamán, 2005).

H. boliviensis es capaz de producir Poli (3-hidroxibutirato) a partir de diferentes

fuentes de carbono como glucosa, xilosa, sacarosa, acetato de sodio,

maltooligosacáridos y ácido butírico (Quillaguamán y col., 2005; 2006; 2007).

Desde su descubrimiento, se ha estudiado el efecto de las fuentes de carbono y

nitrógeno en la acumulación de PHB en H. boliviensis. Determinándose que el

cultivo del microorganismo utilizando hidrolizados de salvado de trigo como

sustrato, en frascos agitados, da lugar a la obtención de una densidad celular igual


Justificación

a 3.19g/L y un contenido de PHB de 33.8 wt%, mientras el uso de una mezcla de

xilosa (0.25% m/v) y glucosa (0.75% m/v) como fuente de carbono permitió

alcanzar una densidad celular de 2.2g/L y un contenido de PHB de 50 wt%

(Quillaguamán y col., 2007).

El cultivo del microorganismo en un medio optimizado, utilizando 1% (m/v) de

hidrolizado de salvado de trigo, 0.8%(m/v) de acetato de sodio y 0.8% (m/v) de

ácido butírico como fuente de carbono y 0.5% (m/v) de extracto de levadura como

fuente de nitrógeno, en un fermentador operado en sistema batch, dio lugar a la

obtención de una densidad celular de 8.0g/L y un contenido de PHB de 50 wt%

(Quillaguamán y col., 2007).

Sin embargo, la máxima concentración de PHB (81 wt%) y densidad celular

(44g/L), se obtuvieron a través del cultivo de H. boliviensis en un fermentador

operado en sistema fed-batch, utilizando glucosa como fuente de carbono, y

glutamato de sodio como fuente de nitrógeno (Quillaguamán y col., 2008). Los

valores obtenidos se asemejan a los valores máximos reportados hasta la fecha

por otras bacterias capaces de sintetizar el biopoliester (tabla 6), por lo que se

considera que H. boliviensis puede ser utilizada en la producción de PHB a escala

industrial.

2.5 Escalamiento de bioreactores

Un bioreactor es un dispositivo o recipiente en el que se lleva a cabo un proceso

químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas

derivadas de dichos organismos. Si un bioreactor es utilizado en procesos de

fermentación es conocido como fermentador (Madigan y col., 2007).

2.5.1 Características de las fermentaciones a gran escala

Las fermentaciones a gran escala son desarrolladas en bioreactores de acero

inoxidable cuyas capacidades alcanzan entre 10000 y 500000 litros. Los

fermentadores industriales generalmente se encuentran equipados con una

cubierta refrigerante externa o una serie de refrigerantes internos que permiten

tanto la esterilización del equipo y del medio de cultivo así como el control

permanente de la temperatura (Madigan y col., 2007).


Justificación

Según el tipo de proceso (aeróbico o anaeróbico) en el cual van a ser utilizados

los fermentadores pueden o no requerir equipamiento adicional. Así por ejemplo,

los fermentadores anaeróbicos utilizados en la industria pueden prescindir de

equipamiento especial, pues solo requieren aquel que les permita eliminar el

exceso de calor generado durante la fermentación. Los fermentadores aeróbicos

en cambio, necesitan un equipamiento específico, que garantice una aireación y

mezclado adecuados

Las fermentaciones a gran escala requieren de un control y monitoreo

permanente. Para ello, es necesario medir el crecimiento del cultivo y la formación

del producto y realizar las modificaciones necesarias a los parámetros ambientales

(temperatura, pH, concentración de oxígeno, etc.) a medida que transcurre la

fermentación. (Madigan y col., 2007).

2.5.2 Proceso de escalado

El escalamiento de un determinado proceso involucra el estudio de los problemas

asociados a transferir la información obtenida en un laboratorio a escala de planta

piloto y desde escala de planta piloto a escala industrial. El escalado involucra la

realización y exitosa conclusión de tres etapas:

Experimentos en laboratorio: en esta primera etapa, a través del uso de

matraces y fermentadores de laboratorio (1 a 10 litros de capacidad), se lleva a

cabo la selección de las cepas y medios de cultivo, se realizan estudios básicos de

cinéticas de crecimiento, se prueban variaciones en las condiciones del medio, y

se obtiene los primeros indicios acerca de la factibilidad del proceso de interés.

Pruebas en planta piloto: en esta segunda etapa, se realizan ensayos utilizando

equipos de 300 a 3000 litros de capacidad; el objetivo es el de optimizar las

condiciones de operación del proceso productivo (flujos, presión, temperatura,

velocidad de agitación, etc.).

Producción en fermentador comercial: la etapa final del escalado consiste en la

elaboración del producto deseado a niveles rentables, por medio de la evaluación


Justificación

de los resultados obtenidos en fases previas y la utilización de equipos con

capacidades de 10000 a 500000 litros.

Durante cada etapa del proceso de escalado se deben controlar factores como la

aireación, temperatura, pH, etc. para determinar la forma en la que el cambio de

volumen del bioreactor afecta a las variables del proceso.

2.5.3 Reactor Air-lift

Si bien en la industria existen diferentes tipos y configuraciones de bioreactores,

en la mayoría de los procesos biotecnológicos, se utilizan aquellos de tipo tanque

agitado, columnas de burbujeo y air-lift. De los tres tipos, el de tanque agitado es

el más utilizado, por ser capaz de suministrar altas cantidades de oxígeno por

unidad de tiempo y volumen. Sin embargo, existen varias razones que hacen

inadecuada su aplicación para cierto tipo de bioreacciones; así por ejemplo, el

grado de agitación requerido para lograr suficiente transferencia de oxígeno

ocasiona en algunos casos daños a las células que pasan a través de las zonas

de grandes esfuerzos de corte o bien, la energía mecánica suministrada para

lograr una adecuada transferencia de O2 y un mezclado homogéneo del medio

puede resultar económicamente inviable (Doran, 2002).

Cuando se presentan este tipo de inconvenientes en la aplicación de reactores de

tanque agitado es posible emplear columnas de burbujeo o reactores air-lift.

Un bioreactor air-lift es un dispositivo de contacto gas-líquido y gas-líquido-solido,

agitado neumáticamente (Merchuk, 1990). La estructura de este tipo de

bioreactores comprende la existencia de cuatro zonas distintas, con características

diferentes:


Justificación

- Zona de ascenso (riser): región en cuya base se inyecta un gas que permite el

movimiento del líquido en forma ascendente y da lugar a la mayor parte de la

transferencia de oxígeno.

- Zona de descenso (downcomer): región paralela a la zona de ascenso, en la

que el movimiento del fluido es descendente. La principal fuerza motriz para la

circulación del líquido es la diferencia entre las densidades o las presiones

hidrostáticas entre esta zona y la de ascenso.

- Separador gas-líquido: sección ubicada en la parte superior del fermentador,

se conecta con la zona de ascenso y la zona de descenso permitiendo la

recirculación del líquido y la eliminación del gas.

- Base: región ubicada en la parte inferior del bioreactor, conecta la zona

ascendente y la zona descendente garantizado la circulación continua del

líquido (Chisti, 1998; Doran, 2002).

Los bioreactores air-lift se clasifican en general según su configuración en dos

tipos: dispositivos de circulación interna o externa. Los primeros poseen un tubo

“draft” o deflector situado en el interior del tanque que delimita la zona de ascenso

y la zona de descenso; mientras, los bioreactores con circulación externa, en los

que el movimiento del líquido se da través de dos conductos separados, uno de

diámetro menor y uno de diámetro mayor, en el que normalmente se inyecta gas.

La figura 2.13 muestra, a continuación, los esquemas básicos de bioreactores

air-lift de circulación interna y externa.


Justificación

a b

Figura 2.13: Esquema de un bioreactor air-lift a) de circulación interna. b) de

circulación externa (Williams, 2002).

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