Introduccin a la terapia gnica

Curso de Gentica Molecular

Ciencias Biolgicas

Universidad de Jan

TERAPIA GNICA

Introduccin de secuencias de ADN (naturales o artificiales) en clulas para alterar su expresin gnica con fines teraputicos.No se incluye el transplante de mdula sea o de hgado.

Dos tipos principales de terapia gnica:

Somtica: Introduccin de ADN en clulas no reproductivas,puede ser in vivo o ex vivo. No permanece en la descendencia del organismo tratado.

Germinal: Introduccin de ADN en clulas reproductivas. Modifica el patrimonio gentico de la especie y puede ser transmitido a la descendencia. Presenta graves inconvenientesticos aunque en animales (ratones) est muy desarrollada (knock-outs y transgnicos).

TERAPIA GNICA

Tipos de terapia gnica

Reemplazar un gen defectuoso (ciruga gentica),

enfermedades hereditarias monognicas.

1. Manipulacin para aumentar la expresin de genes

(citocinas, etc.)

2. Reducir la expresin de un gen potencialmente daino

(oligonucletidos antisentido)

3. Introducir un gen no-humano (resistencia a metales,

antibiticos, patgenos, etc.)

TERAPIA GNICA

Tipos de problemas tratables por terapia gnica

1. Enfermedades heredables (fibrosis qustica,

etc.)

2. Enfermedades adquiribles

Infecciosas (virus, bacterias, parsitos)

Cncer

Arteriosclerosis

Etc.

TERAPIA GNICA

Mtodos de introduccin de ADN

Transfeccin:Fsicos: Biolstica (genegun), electroporacinQumicos: Lipidos catinicos, fosfato clcico, polmeros, etc.Biolgicos: ADN unido a ligandos de receptores de membrana expresados en clulas diana

Transduccin: dependientes de virusRetrovirusAdenovirusVirus Adeno-Asociados (AAV)Herpesvirus

TERAPIA GNICA

Tipos de reparto del ADN

EX VIVO:Paciente no est directamente expuesto al sistema de transferencia gnica.Posibilidad de monitorizar la expresin del transgenTrabajo sobre poblaciones de clulas especficas

IN SITU:ADN dirigido directamente a un rgano o tumor

IN VIVO:ADN introducido directamente a travs de la sangre

Crecimiento de la terapia gnicaCrecimiento de la terapia gnica1988 1988 -- 20002000

050

100150200250300350400450

Prot

ocol

os d

e te

rapi

a g

nica

apr

oba d

os

Progresin de ensayos clnicos Progresin de ensayos clnicos sobre terapia gnicasobre terapia gnica

0

50

100

150

200

250

300

Phase I Phase I-II Phase II Phase III

Prot

ocol

os d

e te

rapi

a g

nica

apr

oba d

os

Esquema estructura de los retrovirus

Esquema ciclo de vida de los retrovirus

Produccin de retrovirus defectivos para terapia gnica

Problemas de los retrovirus en terapia gnica

Se ha observado la desconexin de los genes a las pocas

semanas de la introduccin. Posiblemente por metilacin. El

cambio de promotores puede aliviar este problema.

Posibilidad de integracin aleatoria que desrregule o inactive

genes celulares imprescindibles.

Dificultad para infectar clulas quiescentes (cerebro, hgado).

Baja eficacia de transduccin viral en tejidos vivos.

Limitacin a 7-7,5 Kb

Citocinas necesarias para la Citocinas necesarias para la hematopoyesishematopoyesis

IL-2,4,6,7,10,13,14,15

IL-2,4,6,7,9,12,15

IL-2,12,15

CFUs

Plaquetas

Monocitos

Polimorfos

G.Rojos

(TPO)/IL-11

GM-CSF

G-CSF/GM-CSF

EPO

Clulas maduras

Natural Killer

Linfocitos T

Linfocitos B

Clulas maduras

clulamadre

CFU-GEMM

Stem CellFactor(SCF),

IL-3

Lnea linfoide

IL-3

Lnea mieloide

Varios receptores de factores de Varios receptores de factores de crecimiento contienen la cadena crecimiento contienen la cadena comncomn

ILIL--2R2R ILIL--15R15R ILIL--7R7R ILIL--4R4R ILIL--9R9R

TTBB

NKNK

TTBB

NKNK

TTBB

TTBB

TT

ILIL--22 ILIL--1515ILIL--77 ILIL--44 ILIL--99

CC CC CC CC CC

Terapia gnica para XTerapia gnica para X--SCIDSCID

insercin en el paciente

co-cultivo

cadena comn

vector retroviralY

mdula sea

gen expresado en las clulas precursoras

desarrollo correcto de linfocitos B y NK

reconstitucinde un sistema inmune funcional

cocultivo clulas madre

1. Aparece durante la infancia con infecciones recurrentes oportunsticas. Los nios suelen tener infecciones tpicas del SIDA como Candida albicans, Pneumocystis carinii. Sin tratamiento es mortal en el 100% de los casos

2. SCID ligado al cromosoma X aparece por una mutacin en la cadena comn del los receptores de citocinas, el gen est situado en el cromosomas X. Presenta una incidencia de 1/50,000. Los pacientes tienen unos niveles muy bajos de linfocitos T y elevadas cantidades de linfocitos B inmaduros no funcionales.

3. La nica terapia curativa es el transplante de mdula. Este sistema es eficaz en el 100% de los casos con HLA idntico.

4. La ciruga gentica es potencialmente curativa

Inmunodeficiencia combinadad severa ligada al cromosoma X

Deteccin del ARNm de la cadena Deteccin del ARNm de la cadena C mediante RTC mediante RT--PCRPCR

Resultados terapia gnica para XResultados terapia gnica para X--SCID : qu pasa con SCID : qu pasa con los niveles de expresin del transgn?los niveles de expresin del transgn?

M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71

Paciente 1Paciente 1 Paciente 2Paciente 2

Niveles cuantificados por citometra de flujoNiveles cuantificados por citometra de flujo

Resultados terapia gnica para XResultados terapia gnica para X--SCID : qu pasa con los niveles SCID : qu pasa con los niveles de linfocitos?de linfocitos?

M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71

Resultados terapia gnica para XResultados terapia gnica para X--SCID : beneficios clnicosSCID : beneficios clnicosM. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71

As a likely consequence of development and sustained function of the immune system, clinical improvement was observed in both patients. In P2, protracted diarrhea as well as extensive graft-versus-host disease (GVHD)-like skin lesions disappeared. Both patients left protective isolation at days 90 and 95 and are now at home 11 and 10 months, respectively, after gene transfer without any treatment. Both enjoy normal growth and psychomotor development. No side effects have been noted. A similar result has since been achieved in a third patient 4 months after gene transfer. These results demonstrate that in these patients, a selective advantage was conferred to T and NK lymphocyte progenitors, enabling full-blown development of mature and functioning T and NK lymphocytes.

ILIL--22 ILIL--1515 ILIL--77 ILIL--44 ILIL--99

CC CC CC CC CC

Virus de ADN utilizados en terapia gnicaAdenovirus:

Potencialmente patognicos

Comn en terapia gnica in situ

Insertos de ADN grandes (35Kb)

Amplio espectro de clulas diana

Puede transducir clulas quiescentes

En cultivo se pueden obtener grandes cantidades (1011/ml)

Problemas: Inmunognicos y expresin transitoria (3 semanas)

AAV:

Virus humanos no patognicos

Sitio de integracin preferente (Cromos. 19)

Amplia variedad de tejidos diana pero no muy eficaz

Slo permite insertos de 5 Kb

No tiene sistema de empaquetamiento eficiente e independiente

ProblemasProblemas1. A los 10 aos de la aprobacin del primer estudio de terapia gnica ms de 4000 pacientes han recibido este tratamiento en todo el mundo. Muy pocos han tenido beneficios clnicos definitivos. 2. Hace un par de aos muri un paciente despus de un tratamiento de terapia gnica3. Algunos ensayos clnicos han sido suspendidos debido a obscurantismo por parte de los investigadores en los informes preceptivos de la FDA.4. Dos pacientes de X-SCID han desarrollado leucemia

PromesasPromesas1. Recientemente una enfermedad mortal (X-SCID) ha sido curada por terapia gnica2. Avances en la biologa molecular y los sistemas de transferencia gnica acelerarn el uso de la terapia gnica.

Terapia gnica 2003Terapia gnica 2003