Term Mol
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TERMINOLOGA DE LOS
MTODOS MOLECULARES
Lic. TM Juan Cceres Torres
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BIOLOGIA MOLECULAR
Su objetivo es el estudio de la
bases moleculares de la vida.
Estudia todos aquellos procesos
celulares que contribuyen a que la
informacin gentica se transmita
eficientemente en los nuevos
individuos.
Relaciona las estructuras de las
biomolculas con las funciones
especficas que desempean en la
clula y en el organismo.
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HISTORIA DE LA BIOLOGA MOLECULAR
1865 Gregor Mendel Reglas bsicas de la herencia
1869 Johann Friedrich Miescher descubri el DNA (nuclena)
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1902 - Emil Hermann Fischer postul propiedades protenas definidas por la composicin y disposicin de sus aminocidos
1911 Thomas Hunt Morgan descubre los genes en los cromosomas
1950 Edwin Chargaff Citosina se complementa con Guanina y
Adenina con Timina
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1952-1953 James D. Watson y Francis H. C. Crick deducen la estructura de doble hlice del DNA
1961 Francois Jacob
Investig sobre la forma en que los genes trasmiten la informacin
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1970 Howard Temin and David Baltimore independientemente aislan la primera enzima de restriccin (DNA puede cortarse en piezas reproducibles)
1996 secuenciacion del genoma
de Saccharomyces cerevisae
1997 secuenciado Escherichia coli cepa K-12
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2000 Secuencia completa del genoma de Drosophila melanogaster
2003 Abril
Proyecto Genoma Humano Completado
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APAREAMIENTO DE BASES : Proceso por el cual las
bases de purinas y pirimidinas se unen a travs de puentes
de hidrgeno. La adenina se une con la timina ( o el uracilo)
y la guanina con la citosina.
SECUENCIA DE BASES : Es el orden exacto de las bases
purnicas (G y A) y pirimdicas (C,T o U) hallado en los
cidos nucleicos. Este orden define la secuencia primaria
de aminocidos de los productos genticos, que son las
protenas.
DNA COMPLEMENTARIO (cDNA) : Es el DNA que
contiene una secuencia exacta de bases que se va a
emparejar a una hebra de DNA o RNA a travs del
apareamiento de bases. Este cDNA puede ser usado como
una sonda para detectar secuencias especficas.
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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN : Clase de nucleasas
(usualmente bacterianas) que actan sobre una hebra de DNA
a una secuencia especfica de bases para cortar el DNA.
POLIMERASAS : Clase de enzimas que sintetizan DNA de un
templado existente. Las polimerasas requieren de un cebador
para iniciar la sntesis, usando ribo o deoxiribonucletidos
trifosfatos como reactantes y magnesio como cofactor.
HIBRIDIZACIN : Proceso por el cual hebras simples de
cidos nucleicos complementarias forman complejos de doble
hebra a travs del apareamiento de bases.
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CARACTERSTICAS GENERALES DEL
GENOMA
Genoma (gen, origen) es el conjunto total de
material gentico hereditario presente en una
clula tanto nuclear como extranuclear,
codificante o no.
Organismos Procariontes (eubacteria y
arqueobacterias) se reduce a un nico
cromosoma formado por una molcula circular de
ADN.
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En Eucariontes son variadas
y complejas.
El genoma nuclear aparece
bajo dos formas:
a) Cromatina
b) Cromosomas
El genoma de los orgnulos
est organizado en
cromosomas circulares igual
que el de los procariotas.
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EXONES
Secuencias que
codifican proteinas o
ARNs.
INTRONES
(ADN intragnico)
Secuencias que no
codifican.
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MAGNITUD DEL GENOMA NUCLEAR
El material gentico contenido en el ncleo
supone ms del 90% del total de ADN.
La magnitud se puede expresar de varias
formas:
a) En nmero de cromosomas (n, 2n).
b) En masa de ADN (pg = picogramos).
c) Expresarlo en longitud: pb (en hebra sencilla).
Para molculas largas Kb o Mb.
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El tamao del genoma
humano es de 3 x 109 pb.
En forma lineal, la longitud
total del ADN de una clula
humana somtica seria de
unos 2 metros.
GENOMA HUMANO
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Las clulas de individuos de una misma especie poseen la misma cantidad de ADN y nmero de cromosomas.
El contenido total de ADN, expresado en pg o en pb, y el nmero de cromosomas varan ampliamente entre especies diferentes.
COMPLEJIDAD DEL GENOMA
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No existe correlacin entre el tamao del genoma de distintas especies y el nmero de cromosomas que lo componen.
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TAMAO DE ALGUNOS TIPOS DE
GENOMAS
Organismo Tamao
Genoma (pb.)
Fago 5104
Escherichia coli 4106
Levadura 2107
Caenorhabditis
elegans 8107
Drosophila
melanogaster 2108
Humano 3109
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GENOMA HUMANO
GENOMA NUCLEAR GENOMA
MITOCONDRIAL
ARNt 22 genes
Codifican Protenas
13 genes
Codifican ARN 24 genes
ARNr 2 genes
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CONDENSACIN DEL ADN
El ADN debe empaquetarse en un ncleo de aproximadamente 5 m.
Esto representa una condensacin de ms de 100 000 veces.
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Esto se debe a dos aspectos teoricamente independientes pero funcionalmente relacionados.
1. El empaquetamiento del ADN debido a la
asociacin de protenas.
2. El superenrrollamiento (Supercoils) del ADN.
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BIOLOGA MOLECULAR APLICADA AL
LABORATORIO CLNICO
Anlisis de material gentico de
diversos organismos
Muestra: cidos nucleicos (ADN,ARN)
Basadas en complementariedad
(especificidad)
PCR, reaccin en cadena de la
polimerasa (sensibilidad)
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PATOLOGA MOLECULAR
Es una subespecialidad de la patologa que
utiliza las tcnicas de la biologa molecular
para:
Detectar estados de enfermedad
(diagnstico)
Predecir la progresin de la enfermedad
(pronstico)
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SUBESPECIALIDADES DE LA PATOLOGA MOLECULAR
ENFERMEDADES HEREDITARIAS (GENTICAS)
Fibrosis qustica
Anemia Falciforme
Predisposiciones al cncer
ENFERMEDADES INFECCIOSAS Bacterianas
Viral
Fngicas
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SUBESPECIALIDADES DE LA PATOLOGA MOLECULAR
HEMATOPATOLOGA
Leucemias
Linfomas
TUMORES SLIDOS
Cncer de mama
Cncer de colon
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SUBESPECIALIDADES DE LA PATOLOGA MOLECULAR
FORENSE
PRUEBAS DE IDENTIFICACIN
HLA
Parentesco
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Diagnstico y
seguimiento
Agente etiolgico Susceptibilidad
Pronstico Identificacin de especie
Estudio de brotes Factores de patogenicidad
MICROBIOLOGA
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De crecimiento lento
No cultivables
Fastidiosos
No identificables por mtodos
convencionales
Mtodos serolgicos S y E
MICROORGANISMOS A
ANALIZAR
Mycobacterium tuberculosis
Virus Herpes 1 y 2
Virus Hepatitis C
Trypanosoma cruzi
HTLV 1 y 2
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ENZIMAS DE RESTRICCIN
Endonucleasas especficas
Reconocen secuencias especficas cortas de DNA y
cortan al DNA en o cerca de la secuencia reconocida
Reconocimiento de secuencias: usualmente 4 o 6 bases
pero hay algunos que son de 5, 8, o mayores
Reconocimiento de secuencias es palindrmica
Palndromo: secuencia de DNA que es la misma cuando
una hebra es leda de izquierda a derecha o la otra hebra
es leda de derecha a izquierda consiste de repeticiones adyacentes invertidas
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ENZIMAS DE RESTRICCIN
Ejemplo:
GAATTC
CTTAAG
Son aisladas de bacterias
Su nombre se deriva de la bacteria
Gnero- Primera letra en mayscula
Especie- segunda y tercera letras (minscula)
Letras adicionales a partir de las cepas
Nmeros romanos designan a diferentes enzimas de la misma cepa
bacteriana, en orden nmerico a su descubrimiento
Ejemplo: EcoRI
E Escherichia
Co coli
R cepa R
I 1era. enzima descubierta del Escherichia coli R
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SONDAS
Es un cido nucleico que :
Puede ser etiquetado con un marcador que permitir su
identificacin y cuantificacin
Se hibridizar con otro cido nucleico debido la
complementaridad de sus bases
Tipos de marcadores
Radioactivos (32P, 35S, 14C, 3H)
Fluorescentes
FISH: fluorescent in situ hybridization
Cromosomas
Biotinilados (avidina-estreptavidina)
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Hibridacin de cidos Nucleicos
Surge de la observacin del proceso de renaturalizacin de un ADN previamente desnaturalizado.
TECNOLOGIAS DE HIBRIDACIN
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HIBRIDACIN: SONDAS DE ADN
Sonda de Hibridacin
El principio de la tcnica se basa en los enlaces
de hidrgeno entre GC y AT
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Doble hebra DNA
Denaturacin
Hebra simple DNA
Apareo de bases
inicial
Denaturacin - Renaturacin
DNA Renaturado
Renaturacin
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Hibridacin In Situ
Mary Lou Pardue y Joseph Gall (1960):
cromosomas gigantes presentes en las
glndulas salivales de Drosophila para mapeo
de transcritos.
Se aplica en muestras en su ubicacin natural,
generalmente aquellas preparadas para
microscopia.
Actualmente se utiliza bajo la forma de FISH
para identificar y mapear regiones
cromosmicas complementarias a cDNAs
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SOUTHERN BLOT
Desarrollada por E.M. Southern.
Implica cinco etapas bien diferenciadas:
Separacin electrofortica
Desnaturalizacin
Transferencia
Hibridacin
Deteccin
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TRANSFERENCIA DE BANDAS
SOUTHERN BLOT
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NORTHERN BLOT
El procedimiento es identico, pero el acido
nucleico analizado es ARN.
Por su menor tamao no es necesario su
fragmentacin con endonucleasas.
Se emplea principalmente para obtener
informacin sobre el tamao de ARNs y
sobre el modelo de expresin de genes
especificos.
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WESTERN BLOT
Se emplea para detectar las proteinas presentes en una muestra.
La muestra es sometida en Gel de Poliacrilamida en presencia de SDS y transferida a una membrana.
La deteccin de las bandas proteicas en la membrana o filtro se realiza gracias a la unin especifica de un anticuerpo contra la protena o regin proteica que se quiere estudiar.
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TRANSFERENCIAS
TRANSFERENCIA MATERIAL
TRANSFERIDO SONDA REFERENCIA
Southern ADN ADN, ARN Southern (1975)
Northern ARN ADN Alwine (1977)
Western Proteinas Anticuerpos Burnette (1981)
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MICROARRAYS
(MICROARREGLOS) (DNA Chip)
La tcnica de microarreglos se basa en la hibridizacin de
las molculas de DNA o RNA para la realizacin de
estudios a gran escala. Su "ancestro tcnico" es el
Northern blot.
Un DNA microarray (DNA Chip) es un biosensor que
analiza informacin gentica de humanos y bacterias.
Una sonda DNA es colocada en lminas de vidrio en la
forma de micropuntos de algunos micrmetros de
dimetro dispuestos en filas mltiples.
Los genes son extrados de muestras como la sangre,
amplificados y luego reflejados en el DNA chip,
permitiendo investigar caractersticas tales como la
presencia y mutacin de genes.
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COMO SE CONSTRUYEN LOS DNA CHIPS
PASO 1: CONSTRUIR SONDAS DNA
Usando tcnicas convencionales tales como PCR y sntesis bioqumica, se construyen y purifican hebras de DNA identificado. Existen una variedad de sondas disponibles en el mercado.
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PASO 2: FABRICACIN DE LA
LMINA SUSTRATO
Se emplean la fotolitografa y otras tcnicas de nanomanufactura para convertir al vidrio y a lminas de plstico en receptculos para las sondas DNA.
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PASO 3: DEPSITO DE
SECUENCIAS GENTICAS
Se usan una variedad de procesos como la disposicin por medio de la robtica para adherir el material gentico al sustrato. Se deben observar condiciones higinicas y estndar para lograr el control sobre grado de contaminacin mximo permitido durante el proceso.
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Preparacin de Microarreglo Sondas de cDNA
LECTURA
Tecnologa del Microarreglo
Se combinan cantidades iguales
Las sondas se hibridizan en el microarreglo
Se marcan con reactivos fluorescentes
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1 cm
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PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
Es la amplificacin de DNA in vitro por medio de la polimerizacin en cadena de DNA utilizando un termociclador.
El propsito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.
Se realiza la amplificacin de un segmento especfico de DNA, teniendo poco material disponible.
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1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.
-Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma-
El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces o ms:
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2. Apareamiento o anneling:
Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares
especficos por complementariedad de bases. Para esto, se
baja la temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores segn
sea el caso.
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3. Polimerizacin o Extensin.
Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio
comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos
trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De
estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las
hebras de DNA molde
Se efecta a 70C por 1 minutos (puede variar segn sea
necesario)
Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.
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Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * * A C G -T
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
Cortos primers de DNA especficos hibridizan con la
cadena que tiene que ser copiada
5 3
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Sntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T -T A C G T A
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
5 3
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Despues del primer periodo de sntesis de
DNA, tenemos copiada una cadena de DNA
Primer 1 Extensin de la cadena
Cadena original de DNA
Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
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Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100C)
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
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Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
Al mismo tiempo, la cadena original se copia
nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1
2
1
Ahora tenemos dos copias de la molcula original
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
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Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR
Fusin
95C
Hibridizacin
50-60C
Extensin de
La cadena
75C
Primer Ciclo
2do Ciclo
95C
50 - 60C
75C
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en
el nmero de copias
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En el PCR hay una amplificacin exponencial
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COMPONENTES ESENCIALES EN
EL PROCESO ESTNDAR DEL PCR
1) ADN molde (Templado) : DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucletidos de longitud. El mnimo va de 10-100 ng y el mximo entre 400-500 ng.
2) ADN polimerasa termoestable (Taq ADN polimerasa, Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis)
3) Oligonucleotidos iniciadores (primers) (secuencia conocida, presencia en exceso)
4) Dinucletidos trifosfatados (dNTPs) dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
5) Tampn de reaccin
1) Cationes divalentes (Mg ++)
2) Cationes monovalentes (Na +)
3) Buffer (para mantener el pH)
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ANLISIS DE LA MUESTRA
La deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico.
Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.
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ANLISIS DE LA MUESTRA
La posterior visualizacin se puede realizar con
bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de
plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas
(primers inespecficos se
pegan a varios sitios)
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UTILIDAD DEL PCR
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MADRE PADRE NIO 1 NIO 2 NIO 3 NIO 4
IDENTIFICACIN DE PATERNIDAD
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CRIMINALSTICA
Ejemplo de un caso de criminalstica resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.
Si se observan los patrones bandas podr comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil gentico de la vctima (V)
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VENTAJAS DEL PCR
A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener
una cantidad considerable para el estudio que se vaya a
realizar.
El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y
anlisis.
Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o
muerto.
Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense,
diagnsticos, anlisis prenatales, etc.
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DESVENTAJAS DEL PCR
Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde
se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40
pares de bases.
Se necesitan primers especficos que sean
complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo
investigador o de cualquier otro)
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AMPLIFICACIN MEDIADA POR
TRANSCRIPCIN (TMA)
LaTMA es un sistema de amplificacin de la transcripcin del RNA que usa dos enzimas para llevar a cabo la reaccin : RNA polimerasa y la reversa transcriptasa.
La TMA es isotermal; la reaccin entera es realizada a la misma temperatura en un bao de agua o en un bloque trmico. Esto contrasta con el PCR que requiere un termociclador para cambiar rpidamente la temperatura para la reaccin.
La TMA puede amplificar tanto DNA como RNA y produce tambin amplicones * de RNA.
La TMA posee una rpida cintica que resulta en una amplificacin de un billn de veces dentro de 15 a 30 minutos.
* Amplicn : Conjunto de molculas de DNA idnticas resultado de una
reaccin de PCR. Esencialmente, se trata de un clon molecular.
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CLULAS MADRE
CARACTERSTICAS
Son clulas no especializadas
Capaces de dividirse y renovarse a s
mismas por largos perodos de tiempo
(proliferacin)
Poseen el potencial de dar lugar a tipos
celulares especializados(diferenciacin)
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La esperanza con las clulas madre es que se puedan emplear para terapia celular y trasplantes de tejidos, evitando los problemas de falta de donantes y problemas de rechazo del paciente.
CLULAS MADRE
FUNCIONES TERAPUTICAS
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Clulas Madre
Clulas Madre
Totipotentes
Embrinicas
Clulas Madre
Adultas
Clulas Embrinicas
Clulas Madre
Teratomas y
Teratocarcinomas
Clulas Madre
Germinales
TIPOS DE CLULAS MADRE
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Las clulas totipotentes son capaces de
generar uno o ms tipos de clulas
diferenciadas y es capaz de auto
regenerarse, dando lugar a otras clulas
totipotentes.
CLULAS TOTIPOTENTES
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Se dan en la masa interna del embrin a los 7-14 das. A partir de ellas, despus de divisiones celulares se forma el tejido especializado. Pero las diferencia de las clulas madre como tal, porque se van diferenciando a medida que
avanza el perodo de gestacin.
CLULAS MADRE
EMBRINICAS
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Estn en la cresta germinal del feto y ah
comienzan su diferenciacin, tambin son
totipotentes.
CLULAS MADRE
GERMINALES
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Se sitan en las gnadas en forma de tumor a partir de clulas madre pluripotentes que a su vez derivan de clulas madre germinales. Son tumores con gran diversidad de tipos celulares.
CLULAS MADRE
TERATOMAS Y TERATOCARCIOMAS
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Poseen siempre su capacidad multipotencial (pueden originar clulas especializadas de un rgano concreto en el embrin y en el adulto)
Ejemplo: Las clulas de la mdula sea que son capaces de originar los tipos celulares de la sangre y el sistema inmune.
CLULAS MADRE
ORGANO - ESPECFICAS