Tesis

Papel del factor de transcripción Pitx2 en los procesos de diferenciación de

músculo esquelético y músculo cardiaco

Sergio Martínez Fernández Defensa de Tesis Doctoral

Jaén, 2006

http://www.ujaen.es/

INTRODUCCIÓN

• Origen y estructura de la musculatura esquelética

• Origen y estructura de la musculatura cardiaca

• Gen Pitx2

• Ectodermo

• Mesodermo

• Endodermo

Origen embrionario de la musculatura esquelética

Hojas o capas embrionarias:

Origen embrionario de la musculatura esquelética

Tubo neural Ectodermo

Mesodermo

paraxial

Mesodermo

lateral Mesodermo

cordal

Mesodermo

intermedio

Formación y maduración de los somitos

Mesodermo presomítico

paraxial

Ectodermo

Notocorda

Tubo

neural

Región hipaxial

Región epaxial

Somito epitelial

Dermotomo

Miotomo

Esclerotomo

Dermomiotomo

Tubo

neural

Notocorda

Región epaxial

Esclerotomo

Mesodermo lateral

Miotomo

Ectodermo

Dermotomo

Región hipaxial

Dermomiotomo

Deslaminación y migración de los precursores miogénicos de la extremidad

(Wnts)

(BMPs) (HGF y

FGF)

Esclerotomo

Dermotomo

Región epaxial

Miotomo

Tubo neural

Notocorda

Dermomiotomo

Desarrollo de los músculos de las extremidades

Brote de la extremidad

MRFs

Mioblastos

Pax3

c-met

Lbx1

Precursores miogénicos de la extremidad

Precursores

miogénicos Fibras musculares

esqueléticas Miotubos Mioblastos

Pax3

c-met

Lbx1

Miogenina

MRF4

(Miogénesis terminal)

MyoD

Myf5

(Miogénesis temprana)

Paso de mioblastos a miotubos durante la miogénesis esquelética

Requisitos para el paso de mioblastos a miotubos:

• Cese proliferación

• Inicio fusión

• MyoD y relación con genes del ciclo celular

Fase M

Fase S

Fase G2

Fase G1

Abandono del ciclo celular en el paso de mioblastos a miotubos

Rb activo

MyoD

No entrada en fase S

Cese de proliferación

Comienzo de fusión

Complejos ciclina-CDK

Entrada en fase S

Proliferación

Rb inactivo

MyoD

P

P

Sarcómero

Banda A Banda I Banda I

Banda H

Línea

Z Línea

Z

Línea M Filamento

delgado

Filamento grueso

Miofibrillas

• Células miogénicas indiferenciadas asociadas a las fibras

musculares.

• Lesión muscular Abandono del estado quiescente y

comienzo de la diferenciación para reparar las fibras musculares

dañadas.

• Líneas estables de células satélite (ej. C2C12 y Sol8) recapitulan

los procesos de diferenciación miogénica en determinadas

condiciones de cultivo in vitro.

Células satélite del músculo esquelético adulto

Células del pre-endocardio

Ectodermo Placa neural

Mesodermo somático

Mesodermo esplácnico

Células del pre-miocardio

Endodermo

Notocorda

Crestas cardiacas y formación del tubo cardiaco

Origen y estructura de la musculatura cardiaca

E8.5

Tubo neural

Ectodermo

Notocorda

Intestino anterior

Miocardio

Endocardio

Tubo cardiaco lineal Gelatina cardiaca

Crestas cardiacas y formación del tubo cardiaco

Tracto de entrada

Futuros atrios

Futuros ventrículos

Tracto de salida

Región posterior

(atrial, venosa o caudal)

Región anterior

(ventricular, arterial o craneal)

Tubo cardiaco lineal

Campo cardiaco secundario y su contribución a la formación del corazón

Región cefálica embrionaria

(E7.5)

Región cefálica embrionaria

(E8)

Tubo cardiaco

(E8.5)

Región anterior

Campo

cardiaco

primario

Campo cardiaco

secundario

Región posterior

Localización: células del mesodermo de la cabeza, del mesodermo faríngeo y del mesénquima

de los arcos branquiales.

Contribución: formación del miocardio del tracto de salida, del ventrículo derecho y del polo

venoso.

Formación del corazón embrionario: “looping” cardiaco

Formación del corazón fetal: procesos de septación

Septo inter-atrial

Septo inter-ventricular

VI

VD

Tracto de salida Tracto de entrada

AI AD

CAV

A

VD

AD AI

VI

Tracto de

salida

Septo

inter-atrial

Tracto de entrada

VI

Ultraestructura de los cardiomiocitos

• Estructura sarcomérica. Estriación transversal.

• Discos intercalares.

Disco intercalar

Cardiomiocito 1 Cardiomiocito 2

Gen

Cresta

cardiaca

Tubo cardiaco

lineal

Corazón embrionario

Corazón fetal

Región

Anterior

Región

Posterior

TS

VE

CAV

AE

TE

VI

VD

AI

AD

Nkx2.5

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

Gata4

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

Gata5

+

+

+

+

+

+

Gata6

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

Mef2a

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

Mef2b

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

Mef2c

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

Mef2d

+

+

+

+

+

+

+

+ + + +

Tbx2

+

+

+

+

+

+

Tbx5

+

+/-

+

+/-

+/-

+/-

+

+

+ +

dHand

+

+

+

+

+

+

eHand

+

+

+

+

+

Irx4

+

+

+

+ +

Anf

+

+

+

+ + + +

Genes reguladores de la cardiogénesis

Gen

Tubo cardiaco lineal

Corazón embrionario

Corazón fetal

Región

anterior

Región

posterior

TS

VE

CAV

AE

TE

VI

VD

AI

AD

αMHC

+/-

+

+/-

+

+

+

+/-

+/-

+

+

MLC2a

+/-

+

+/-

+

+

+

+/-

+/-

+

+

MLC1a

+

+

+

+

+

+/-

+/-

+

+

βMHC

+

+/-

+

+

+

+/-

+

+

MLC1v

+

+

+

+

+

+

+

MLC2v

+

+

+

+

+

+/-

+

+

Tm

+

+

+

+

+

+

cTnI

+/-

+

+/-

+/-

+/-

+

+

+/-

+/-

+/-

+

cTnC

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

cTnT

+

+

+/-

+/-

+

Genes de isoformas cardiacas de proteínas contráctiles

Monocilios de las

células del nódulo y

otros factores

?

Creación de la asimetría inicial

Propagación de la asimetría

Línea

media

Nódulo de

Hensen

Nodal

Pitx2

Lefty2 Lefty1

Acción de proteínas

morfogenéticas e

interpretación de la señal

durante la organogénesis Genes diana

concretos en la

formación de

diferentes órganos

Derecha Izquierda

Gen Pitx2

Relación con la ruta de señalización molecular izquierda-derecha

HD

UGA AUG

3’UTR ORF 5’UTR

Pitx2a E1 E2 E5 E6

E1 E2 E3 E4 E5 E6

AUG

HD

UGA

ORF 5’UTR 3’UTR

Pitx2c

E5 E6 E4

E6

HD

UGA AUG

5’UTR ORF 3’UTR

Pitx2b

E1 E2 E5 E3

Estructura genómica de Pitx2 en ratón

Expresión de Pitx2 durante el desarrollo cardiaco

Campione y col., 2000

Schweickert y col., 2000

Kioussi y col., 2002 Pitx2abc+/+ Pitx2abc-/-

Gage y col., 1999

Kitamura y col., 1999

Liu y col., 2002

Ratones nulos Pitx2

Expresión de Pitx2 durante el desarrollo muscular esquelético

MyoD Pitx2

Marcil y col., 2003

Colocalización de Pitx2 y Pax3 en precursores miogénicos de las extremidades

(Kitamura y col., 1999; Kioussi y col., 2002).

Expresión de Pitx2 en mioblastos del brote de la extremidad con un patrón similar a

Pax3 y MyoD (Marcil y col., 2003).

Modelo de regulación de la proliferación celular por parte de Pitx2 mediante

la ruta de señalización Wnt/Dvl2/β-catenina (Kioussi y col., 2002).

Kioussi y col., 2002

Relación de Pitx2 con genes que controlan el ciclo celular

OBJETIVOS

• Análisis de la expresión de las diferentes isoformas de Pitx2 en

mioblastos de la línea celular Sol8.

• Análisis del papel del factor de transcripción Pitx2 en los procesos de

proliferación frente a los procesos de diferenciación en los mioblastos y

miotubos de la línea celular Sol8.

Estudio de la función de Pitx2 durante la miogénesis esquelética

• Sobreexpresión de Pitx2c en cardiomiocitos derivados de células

madre embrionarias de la línea R1.

• Análisis de la expresión de genes reguladores de la cardiogénesis y

de genes de proteínas estructurales a lo largo de los procesos de

diferenciación in vitro de cardiomiocitos derivados de la línea R1.

• Estudio de los perfiles de expresión de genes reguladores de la

cardiogénesis y de genes de isoformas cardiacas de proteínas

contráctiles en los cardiomiocitos derivados de la línea R1 que

sobreexpresan Pitx2c y comparación con los perfiles de expresión

existentes en condiciones normales.

Estudio del papel de Pitx2c durante los procesos de diferenciación muscular cardiaca

MATERIAL Y

MÉTODOS

Estudio del papel de Pitx2 en los procesos de diferenciación muscular esquelética: línea celular Sol8

Línea Sol8 – Células satélite del músculo sóleo de ratón. Recapitulan

in vitro los procesos de miogénesis del desarrollo embrionario.

Mioblastos Sol8

Medio 10% FBS

Miotubos Sol8

Medio 2% HS

Estudio del papel de Pitx2 en los procesos de diferenciación muscular esquelética: línea celular Sol8

Transfecciones:

EGFP

Neo

Promotor

αMHC Kan

pA

pA

Promotor

SV40

pαMHC-EGFP

Actividad del promotor αMHC

pαMHC-Pitx2c-IRES-Pur

Promotor

αMHC

Pitx2c

pA

IRES

pA

Pur

Amp

Sobreexpresión de Pitx2c

y selección

Análisis de expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa

normalizando frente a β-actina.

Recogida y cultivo en placas adherentes

7 días

Cuerpo embrionario

PBS

Método de gota colgante

Células madre embrionarias

indiferenciadas (línea R1)

Estudio del papel de Pitx2c en los procesos de diferenciación muscular cardiaca: línea celular R1

Línea R1 – Células madre embrionarias de ratón.

Aislamiento de áreas contráctiles

7 + 3 días (cardiomiocitos tempranos) 7 + 7 días (cardiomiocitos intermedios) 7 + 13 días (cardiomiocitos terminales)

Cuerpos embrionarios

císticos


simples

Áreas

contráctiles

Observación de

fluorescencia mediante

microscopía confocal


indiferenciadas

Transfección

Selección de clones

Expansión de clones

Diferenciación de

clones

EGFP

Neo

Promotor

αMHC Kan

Promotor

SV40

pαMHC-EGFP

Comprobación de actividad del

promotor αMHC

Transfecciones realizadas en la línea R1

1

Promotor GK

Neo

pA

Amp

pGK-Neo pαMHC-Pitx2c-IRES-Pur

Promotor αMHC

Pitx2c

pA

IRES

pA

Pur

Amp

Selección de células madre indiferenciadas Sobreexpresión de Pitx2c

2

Transfecciones realizadas en la línea R1

Selección de clones cotransfectados y “screening” de sobreexpresión de Pitx2c


indiferenciadas

Cotransfección

Selección de clones

Expansión de clones

Diferenciación de clones


císticos


simples

Áreas contráctiles

Análisis de expresión de Pitx2c

mediante Northern blot

Cuantificación de expresión de Pitx2c y de genes que intervienen en la diferenciación in

vitro mediante RT-PCR cuantitativa.

Normalización frente a Nkx2.5, marcador de miocardio durante todo el desarrollo

embrionario (Komuro e Izumo, 1993; Lints y col., 1993).

RESULTADOS

Expresión de Pitx2 en mioblastos

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Pitx2a Pitx2b Pitx2c

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

• Pitx2c es la isoforma predominante en los mioblastos de la línea Sol8

Papel de Pitx2 en los procesos de diferenciación de músculo esquelético

E11.5

Actividad del promotor αMHC en mioblastos y miotubos de la línea Sol8

β-actina

MB MT C M

αMHC

M MB MT C

Miotubos

Mioblastos pαMHC-EGFP

Sobreexpresión de la isoforma Pitx2c

Miotubos Sol8 control Mioblastos Sol8 control

Medio 10% FBS Medio 2% HS

Células Sol8 transfectadas

Medio 2% HS

0

1

2

3

4

5

MT control Sol8-Pitx2c

Niv

eles

de

expr

esió

n de

AR

Nm

(vec

es)

Pitx2c pαMHC-Pitx2c-IRES-Pur

Células Sol8

transfectadas

Miotubos control

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h

Nú

mero

de c

élu

las v

iab

les

Sol8-Pitx2c

Mioblastos

control

Capacidad proliferativa de las células Sol8 que sobreexpresan Pitx2c

0

1

2

3

4

5

6

7

MB control Sol8-Pitx2c

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

1

2

3

4


Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

0

10

20

30

40

50


Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

c-myc Ciclina D1 Ciclina D2

Condiciones de proliferación (medio 10% FBS)

Regulación de Pitx2c sobre el ciclo celular

Células Sol8 que sobreexpresan Pitx2c

Mioblastos control


Miotubos control Condiciones de diferenciación (medio 2% HS)

0

0,5

1

1,5

2

MT control Sol8-Pitx2cNiv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

1

2

3

4

5


ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

5

10

15

20

25


ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

c-myc

Ciclina D2

Ciclina D1

La sobreexpresión de Pitx2c no afecta a los niveles de expresión de Pitx2a y Pitx2b

Pitx2c

0

2

4

6

8

10

MB control Sol8-Pitx2cNiv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Pitx2a

0

0,5

1

1,5


eles

de

exp

resi

ón

de

AR

Nm

(vec

es)

0

0,5

1

1,5


eles

de

exp

resi

ón

de

AR

Nm

(vec

es)

Pitx2b


Células Sol8 transfectadas

Mioblastos control

Pitx2c

• Concordancia con datos previos de otros autores (Kioussi y col.,

2002) sugiriendo un efecto específico de la isoforma Pitx2c en la

proliferación de las células Sol8 transfectadas.

• Sobreexpresión de Pitx2c y expresión de genes del ciclo celular

superiores en células Sol8 transfectadas cultivadas en condiciones

de proliferación (10% FBS). Concordancia con estudios previos

realizados en otra línea celular miogénica (Kioussi y col., 2002),

sugiriendo un efecto adicional del suero.

Papel de Pitx2c en el control transcripcional de la miogénesis

Condiciones de diferenciación (medio 2% HS) Pax3

MyoD Miogenina

0

1

2

3


ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

5

10

15

20

25


ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

1

2

3

4

5


ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

0,5

1

1,5


ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

0,5

1

1,5


ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Pax3 MyoD Miogenina


Pax3

MyoD Miogenina

0

2

4 100

200

300

MT control Sol8-Pitx2c

• Posible papel de Pitx2c durante la miogénesis esquelética en la etapa

que abarca desde el comienzo de la expresión de Pax3 hasta el inicio de

la expresión de MyoD y Miogenina.

Precursores

miogénicos Fibras musculares Miotubos Mioblastos

Pax3 MyoD

Miogenina Genes de proteínas

contráctiles

Pitx2c

Efectos inhibidores de Pax3 sobre la miogénesis esquelética (Epstein y

col., 1995)

Coexpresión de Pitx2 y Pax3 en mioblastos embrionarios del brote de la

extremidad (Kioussi y col., 2002; Marcil y col., 2003).

• La sobreexpresión de Pitx2c produce invariablemente un aumento de

expresión de Pax3 en condiciones de proliferación y de diferenciación.

• 4 sitios de unión para Pitx2c en el promotor de Pax3.

Posibles interacciones Pax3 / Pitx2c durante la ruta de señalización

molecular de la miogénesis esquelética.

0

5

10

15

20


ele

s d

e e

xpre

sió

n d

e A

RN

m

(vec

es)

Sobreexpresión de Pitx2c y miogénesis terminal

Condiciones de diferenciación (medio 2% HS)

sTnI MyH3

• La sobreexpresión de Pitx2c bloquea la miogénesis terminal.

0

4

8

70

80

MT control Sol8-Pitx2c Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)


Miotubos control

• La isoforma Pitx2c ejerce una función en el balance entre la

proliferación y la diferenciación durante la miogénesis esquelética.

• La sobreexpresión de Pitx2c en las células Sol8 provocó un aumento

de la expresión de los genes que controlan el ciclo celular, manteniendo

las células en un estado altamente proliferativo y previniendo procesos

de miogénesis terminal.

Estudio del papel de Pitx2c durante la diferenciación cardiaca (línea R1)

0

1

2

3

4

5

6

7

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Nkx2.5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

5

10

15

20

25

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

2

4

6

8

10

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Gata4

Gata5 Gata6

Genes de determinación celular cardiaca

Expresión génica en cardiomiocitos derivados de la línea R1

Nkx2.5 en cuerpos embrionarios de la línea D3. RT-PCR convencional. Expresión

máxima a los 6 días (Lints y col., 1993).

Nkx2.5 cuerpos embrionarios de la línea HM1. RT-PCR cuantitativa. Expresión

máxima a los 13 días (Fijnvandraat y col., 2003).

Este estudio – Nkx2.5 en áreas contráctiles de la línea R1. RT-PCR cuantitativa.

Expresión máxima a los 10 (7 + 3) días.

Posibles causas: distintas líneas celulares, condiciones de diferenciación y/o tejido

analizado (áreas contráctiles / cuerpos embrionarios completos).

Expresión de Nkx2.5 en cuerpos embrionarios de la línea R1, con posterioridad a

marcadores de diferenciación mesodérmica (Leahy y col., 1999).

• Nkx2.5 comienza a expresarse en cuerpos embrionarios una vez

establecido el mesodermo, iniciando la especificación cardiaca.

Gen Pitx2c

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Pitx2c

Genes de factores de especificación cameral

0

2

4

6

8

10

12

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

Tbx2

0

5

10

15

20

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

Tbx5

Anf

0

2

4

6

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n

de A

RN

m (

veces)

• Detección de niveles elevados de ARNm de Nkx2.5, Tbx5 y Tbx2 y niveles

bajos de Anf en cardiomiocitos tempranos derivados de la línea R1. Posible

existencia de las interacciones descritas por el modelo durante la diferenciación

in vitro.

Habets y col., 2002

Tracto de salida, canal

atrio-ventricular y

tracto de entrada –

Cámaras cardiacas +

Modelo de regulación transcripcional de la activación del promotor de Anf.

Irx4 (gen ventricular)

Irx4

0

0,5

1

1,5

2

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)


0

1

2

3

4

5

6

7

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

βMHC αMHC

0

1

2

3

4

5

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

MLC2a MLC2v

0

5

10

15

20

25

30

Tem I TerNiv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

RT-PCR convencional. αMHC y βMHC en cuerpos embrionarios de la línea

D3 entre 7 y 20 días de diferenciación (Maltsev y col., 1993; Maltsev y col.,

1994; Fassler y col., 1996).

RT-PCR convencional y cuantitativa. MLC2a y MLC2v en cuerpos

embrionarios de la línea D3 entre 7 y 20 días de diferenciación (Kubalak y

col., 1994; Fijnvandraat y col., 2003).

Este estudio - RT-PCR cuantitativa. αMHC, βMHC, MLC2a y MLC2v en

áreas contráctiles de la línea R1 entre 10 y 20 días de diferenciación.

Sobreexpresión de Pitx2c en cardiomiocitos derivados de la línea R1

7+7 días de diferenciación in vitro 7+5 días de diferenciación in vitro

Actividad del promotor αMHC en áreas contráctiles

pαMHC-EGFP

Pitx2c

C- 5 7 8 9 10 14 15 16 20

GAPDH

C- 5 7 8 9 10 14 15 16 20

“Screening” de clones cotransfectados y seleccionados

pGK-Neo

pαMHC-Pitx2c-

IRES-Pur


indiferenciadas (clon 8)

Diferenciación

Áreas contráctiles

7+3 días de diferenciación



Análisis de expresión de

Pitx2c (RT-PCR cuantitativa)


indiferenciadas (control)

0

2

4

6

8

10

Tem I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Pitx2c

Cardiomiocitos

derivados del

clon8

Cardiomiocitos

control

Sobreexpresión de Pitx2c en cardiomiocitos intermedios y terminales

Sobreexpresión de Pitx2c y genes del ciclo celular

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

I Ter

Niv

eles

de

exp

resi

ón

de

AR

Nm

(vec

es)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

c-myc Ciclina D1 Ciclina D2

• Pitx2c no controla la expresión de los genes del ciclo celular en células

cardiacas.

• Acción tejido-específica de Pitx2c.

Cardiomiocitos que sobreexpresan Pitx2c Cardiomiocitos control

Genes de factores de determinación celular cardiaca

Nkx2.5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

I TerNiv

eles

de

expr

esió

n de

AR

Nm

(vec

es)

Ninguna variación importante de la expresión de Nkx2.5.

• Pitx2c no regula la expresión de Nkx2.5, en concordancia

con datos descritos in vivo (Shiratori y col., 2001).

Cardiomiocitos que

sobreexpresan Pitx2c

Cardiomiocitos control

Gata4

0

5

10

15

20

25

30

35

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

Gata5

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m (

veces)

Gata6

0

5

10

15

20

25

30

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

Genes de determinación celular cardiaca

Genes de factores de especificación cameral

0

2

4

6

8

10

12

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Tbx2

0

5

10

15

20

25

30

35

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

Tbx5

0

5

10

15

20

25

30

35

I TerNiv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e

AR

Nm

(veces)

Anf

Cardiomiocitos que sobreexpresan Pitx2c Cardiomiocitos control

La sobreexpresión de Pitx2c en cardiomiocitos derivados de la línea R1 provocó un

incremento de la expresión de Anf en la fase final de la diferenciación in vitro,

coincidiendo con un aumento de los niveles de ARNm de los genes Gata4, Gata6 y

Tbx5.

Anf sólo se expresa en las cámaras cardiacas durante el desarrollo embrionario.

• Papel de Pitx2c en la formación de cardiomiocitos de cámaras cardiacas en las

etapas terminales de la diferenciación in vitro.

Pitx2c

Anf

Nkx2.5

Gata4 Tbx5

Anf Gata6 Gata4 Charron y col., 1999

Anf

Nkx2.5

Gata4 Tbx5 Garg y col., 2003

Tbx5

Gata6

Gata4 Pitx2c

Pitx2c

Pitx2c

Gata6

Gata4

Tbx5

Regulación indirecta

Anf Pitx2c

Regulación directa Cox y col., 2002

Irx4 (gen ventricular)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Irx4

• Implicación de Pitx2c en la regulación de la expresión de Irx4.

Expresión de Irx4 en ventrículos durante el desarrollo embrionario (Bruneau y col., 2000;

Christoffels y col., 2000).

• Posible participación de Pitx2c en la especificación de cardiomiocitos ventriculares.

Cardiomiocitos que


Cardiomiocitos

control


MLC2a MLC2v

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

αMHC

0

0,5

1

1,5

2

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

βMHC

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

0

5

10

15

20

25

I Ter

Niv

ele

s d

e e

xp

resió

n d

e A

RN

m

(veces)

Cardiomiocitos que


Cardiomiocitos

control

Participación de Irx4 en el programa de expresión de genes específicos de

ventrículo, entre ellos MLC2v (Bruneau y col., 2001).

Expresión de MLC2v mayoritariamente en ventrículos durante el desarrollo

embrionario (O’Brien y col., 1993; Lyons, 1994).

Cardiomiocitos terminales que sobreexpresan Pitx2c presentan incrementos

de los niveles de ARNm correspondientes a Irx4 y a MLC2v.

Irx4 Pitx2c

Irx4

MLC2v Irx4

• Regulación indirecta de Pitx2c sobre la expresión de MLC2v.

CONCLUSIONES

Departamento de Anatomía

Facultad de Medicina

Universidad de Wisconsin-Madison

Dr. Gary E. Lyons

Área de Biología Celular

Departamento de Biología Experimental

Facultad de Ciencias Experimentales

Universidad de Jaén

Dra. Amelia E. Aránega Jiménez

Dr. Francisco N. Navarro Gómez

http://www.ujaen.es/

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