Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la...

Análisis de interacciones reguladoras en transducción... Paloma Salinas Berná

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad d'Alacant. 2003

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Análisis de interacciones reguladoras en transducción

de señales de nitrógeno mediante el sistema del doble

híbrido de levaduras

Trabajo realizado en la División de Genética del Departamento

de Fisiología, Genética y Microbiología de la Universidad de

Alicante, para optar al grado de Doctor en Biología por la

Licenciada Paloma Salinas Berna

Alicante, 2003

M '. .: y

lNV-:'.Fj.



ASUNCIÓN CONTRERAS DE VERA, Profesora Titular de

Genética de la Universidad de Alicante

HAGO CONSTAR:

Que el presente trabajo ha sido realizado bajo mi dirección y

recoge fielmente la labor desarrollada por la Licenciada Paloma

Salinas Berna para optar al Grado de Doctor en Biología.

Alicante, Noviembre de 2003



Agradecí mientos

A Asunción Contreras, por confiar en mí capacidad para llevar a cabo este

trabajo. Por su dedicación y entusiasmo por este proyecto desde el primer al

último momento.

A Rafael Maldonado, José Martín Nieto e Ignacio Luque, por permitirme

aprender de su amplia experiencia. Por su ayuda durante los años de

laboratorio y por soportar pacientemente mis largas discusiones y "comeduras

de coco".

A Isabel Martínez y María Luisa Cayuela, por su constante apoyo dentro del

laboratorio y por todos los momentos compartidos fuera de el. Gracias a

vosotras, las horas de laboratorio se hicieron más amenas. Me habéis ayudado

a aprender muchas cosas, tanto a nivel profesional y científico como a nivel

personal.

A Inma Fuentes por su inestimable ayuda técnica y por su entusiasmo

constante por el trabajo (¡incluso el rutinario y aburrido!). Sin las largas

charlas que hemos compartido y las sesiones de "despeje" (a costa de nuestros

pobres bolsillos) los últimos años no habrían estado tan llenos de buenos

recuerdos. ¡No cambies nunca!

A mís compañeros y vecinos del laboratorio de al lado. Por compartir penas,

quejas, malos ratos, experimentos fallidos, algún que otro reactivo y,

sobretodo, buenos cafés y buena música. A Fernando y Arantxa, porque sois

únicos. ¡Sé que vais a llegar lejos!!!

A Elena, por compartir los últimos cinco años de trabajo, charlas, y buenos

recuerdos. Empezamos siendo sólo dos en el laboratorio y ¡mira cuanta gente

hay ahora! Por haber estado siempre ahí para escuchar mis largos rollos

delante de un café. Se que conseguirás todo lo que te propongas.

Al Dr. Martin Drummond y a su grupo en el John Innes Centre (Norwich), por

acogerme durante una brevísima estancia en su laboratorio. Por su paciencia,



entusiasmo y apoyo en el trabajo que realicé allí. Fue una experiencia

enriquecedora a nivel científico y personal.

A mis amigos de siempre. Junto a vosotros empecé mi andadura universitaria.

Porque se que a pesar de que nuestros caminos hayan tomado rumbos

diferentes siempre estáis al otro lado del teléfono o del correo electrónico, sea

la hora que sea y pase lo que pase. Entonces ya erais, y seguís siéndolo, como

el viento que ayuda a sostener mis alas.

A mi familia, por su apoyo incondicional y su cariño.

A mis hermanos, porque se que siempre están ahí, (aunque a veces no lo

parezca o yo no sepa verlo). Espero que sigáis poco a poco encontrando

vuestro sitio en este mundo (¡creo que empezáis a ir por buen camino!).

A mis padres, porque me han enseñado casi todo lo que se. Por haberme

inculcado el afán por conseguir todo con mi propio esfuerzo. Y por haberme

dado, con su educación y ejemplo, los dos mejores regalos que puede tener

una persona: unas sólidas raíces sobre las que basarme y unas fuertes alas

para poder volar.

A José. Llegaste en el momento más complicado, cuando todo era un remolino

en mi cabeza que no sabía deshacer. Me diste la paz y la serenidad necesarias

para saber encajar todas las piezas en su sitio y llevar este barco a buen

puerto. No se que me depara el camino que ahora se abre ante mi. Pero se

que, me lleve a donde me lleve, quiero andarlo contigo.



-Hijo mío -dijo el padre-. Para volar, hay que

crear el espacio de aire libre necesario para

que las alas se desplieguen. Es como tirarse en

paracaídas: necesitas cierta altura antes de

saltar.

Para volar hay que empezar asumiendo

riesgos. Si no quieres, lo mejor quizás sea

resignarse y seguir caminando para siempre.

Jorge Bucay

Déjame que te cuente...



índice

Introducción

1. Transducción de señales y sistemas de dos componentes.

1.1. Los sistemas de dos componentes en la era genómica

1.2. Regulación.

1.3. Organización y mecanismo.

1.4. Relación estructura-función en histidina quinasas.

1.5. Relación estructura-función en reguladores de respuesta.

2. Regulación de la asimilación del nitrógeno.

2.1. El sistema Ntr de enterobacterias.

2.2. Relación estructura-función en el sistema de dos componentes

NtrB/NtrC.

2.3. Los sistemas de dos componentes NifL/NifA en Klebiella

pneumoniae y Azotobacter vinelandit

3. El sistema del doble híbrido de levaduras y transducción de señales en

bacterias.

3.1. El problema biológico: Interacciones entre proteínas.

3.2. El sistema del doble híbrido de levaduras. Variantes y

secuelas

3.3. Contribución de las herramientas doble-híbrido al estudio de

la transducción de señales en bacterias

3.4. Ensayos doble híbrido: Consideraciones generales.

Objetivos

Materiales y Métodos

1. Estirpes y plásmidos.

2. Medios y condiciones de cultivo.

2.1.Cultivo de bacterias.

2.2. Cultivo de levaduras.

3. Procedimientos de obtención, manipulación, clonación y selección de

moléculas de DNA recornbinante.

3.1. Aislamiento de DNA de microorganismos.

3.1.1. Obtención de DNA genómico de Azotobacter vinelandü.



índice

3.1.2. Obtención de minipreparaciones de DNA de S. cerevisiae.

3.2. Fragmentación de DNA genómico medíante sonicación.

3.3. Tratamiento enzimático de DNA.

3.3.1. Tratamiento con enzimas de corte y modificación del DNA.

3.3.2. Reparación de extremos de DNA.

3.3.3. Comprobación por PCR de fragmentos clonados.

3.4. Construcción de fusiones a dominios de GAL4 de AnfA y VnfA de A.

vinelandii.

3.5. Construcción de un plásmido para la sobreexpresión de AspA91-312

4. Obtención y conservación de genotecas doble híbrido en S. cerevisiae

PJ696.

Resultados y Discusión

1. Interacciones moleculares mediadas por NtrB, NtrC y sus dominios.

1.1. Diseño de proteínas de fusión y análisis doble híbrido.

1.2. Interacciones NtrC-NtrC.

1.3. Interacciones NtrB-NtrB.

1.4. Interacciones NtrB-NtrC.

1.5. Interacciones NtrB-GlnB.

Anexo I

Anexo II

2. Interacciones entre los activadores parálogos NífA, AnfA y VnfA de A.

vinelandii.

3. Identificación de proteínas implicadas en transducción de señales de

nitrógeno.

3.1. Fragmentación del genoma de A. vinelandii por sonicación.

3.2. Construcción genotecas >Sau3AI de E. coli.

3.3. Escrutinios de genotecas Sau3AI de E. coli con NtrB como cebo.

3.3.1. Interacciones NtrB-GlnK.

3.3.2. Interacciones NtrB-AspA.

3.4. Escrutinios de genotecas Sau3AI E. coli con GlnB como cebo.

3.5. Construcción de genotecas Tsp5091 de E. coli

3.6. Construcción de genotecas Sau3AI y Tsp509I de K. pneumoniae.

3.7. Escrutinios doble híbrido por conjugación.



índice

Anexo III

Conclusiones

Bibliografía



Introducción

13



introducción

1, Transducción de señales y sistemas de dos

componentes.

1.1. Los sistemas de dos componentes en la era

genómica.

Con la aparición de los programas de análisis de secuencias, se puso de

manifiesto una sorprendente relación entre proteínas bacterianas

aparentemente no relacionadas (Drummond et al, 19S6; Kofoid & Parkinson,

1988; Nixon et al, 1986). Estas proteínas estaban implicadas en el control de

procesos como el metabolismo del nitrógeno en enterobacterias, la quimiotaxis

en E. coli y la esporulación en B, subtilis. Se clasificaron en dos grandes

familias: sensores y reguladores, entre las que la transmisión de la señal se

realiza a través de un mecanismo conservado de transferencia de grupos

fosfato. A diferencia de los entonces mucho mejor conocidos sistemas

eucarióticos, la fosforilación implicaba residuos His y Asp, en lugar de Ser/Thr

o Tyr. El término "sistema de dos componentes" se acuñó entonces para

referirse a este nuevo tipo de sistemas de regulación, en los que cada pareja de

sensor y regulador {más tarde denominado regulador de respuesta) constituye

la unidad básica del sistema de regulación (Gross et al, 1989; Stock et al,

1989; Stock et al., 1990). La secuenciación de genomas completos y su

posterior análisis han aportado una gran cantidad de información en cuanto a

diversidad y distribución biológica de estos sistemas de transducción de

señales, que, aunque presentes en los tres dominios, son mucho más

abundantes en Eubacteria que en Arehaea y Eukarya.

En bacterias, donde más importancia relativa adquieren estos sistemas,

su número puede variar considerablemente y refleja en buena medida la

necesidad de responder a ambientes cambiantes, y por tanto su capacidad de

adaptación. Así, en Escherichia coli se han identificado 62 proteínas

pertenecientes a estos sistemas (Mizuno, 1997), 27 en Streptococcus (Throup

et al, 2000) 70 en B. subtilis (Fabret et al, 1999), 80 en Synechocystis (Mizuno

et al, 1996} y ninguna en organismos como Micoplasma genitalium o

Methanoccoccus jannaschii (Mizuno, 1998). Recientemente, se ha creado una

base de datos, que incluye todas las proteínas pertenecientes a sistemas de

dos componentes identificadas en los distintos organismos (Maltsev et al,

2002). Los procesos celulares que regulan estos sistemas incluyen adaptación

metabólica a cambios en las fuentes de carbono (Island et al, 1992), nitrógeno

15



Introducción

{Keener & Kustu, 1988), aceptares de electrones (Lin & Iuchi, 1991) o fosfato

{Wanner & Wilmes-Riesenberg, 1992); respuestas a cambios en la osmolaridad

{Mizuno, 1991), temperatura o pH; quimiotaxis (Stock et al, 2002);

diferenciación (Shapiro & Losick, 1997; Ward & Zusman, 1997) y esporulación

(Hoch, 1993; Perego, 1998). También actúan regulando procesos de especial

interés sanitario o medioambiental como los relacionados con patogénesis

(Groisman & Heffron, 1995), resistencia a antibióticos (Matsushita & Janda,

2002) o establecimiento de simbiosis {Gottfert et al, 1990).

En eucariotas, donde la presencia de estos sistemas de dos componentes

se restringe a levaduras, hongos, protozoos y plantas, los sistemas de dos

componentes identificados están implicados en osmorregulación, estrés y

procesos de desarrollo mediados por hormonas (Thomason & Kay, 2000).

Merece la pena destacar la ausencia de este tipo de sistemas en animales, no

habiéndose encontrado los correspondientes genes en ninguno de los genomas

completos analizados hasta la fecha (1998; Adams et al, 2000; Lander et al,

2001).

1.2. Regulación.

Con frecuencia el componente regulador de un sistema de dos

componentes está sometido a autorregulación, actuando la forma fosforilada

del regulador como activador o represor de su propio operón (Birkey et al.,

1994; Soncini et al, 1995; Ueno-Nishio et al, 1984; Wanner & Chang, 1987).

Por otra parte, dependiendo del tipo de ruta o proceso que controlan, algunos

sistemas de dos componentes producen una respuesta del tipo todo o nada,

como el sistema Spo que controla la esporulación en B. subtilis (Hoch, 1995),

mientras que otros median respuestas más graduales (Pratt & Silhavy, 1995).

En cualquier caso, las respuestas producidas son dependientes del nivel de

acumulación del componente regulador fosforilado, que a su vez puede

depender de diversas señales y componentes, que permiten optimizar la

respuesta en función de las necesidades de cada sistema concreto. Esta

multiplicidad de mecanismos de regulación permite la integración de distintas

señales metabóücas, proporcionando una importante flexibilidad.

16



Introducción

1.3. Organización y mecanismo. El único mecanismo demostrado de comunicación entre proteínas de los

sistemas de dos componentes (Bourret eí al., 1991) implica reacciones de

fosforilación y desfosforilación entre módulos altamente conservados. En el

sistema prototipo, cada componente esta formado por dos módulos

funcionales, aunque estos módulos pueden hallarse en solitario, es decir

constituir el único dominio de la proteína, o en combinación con otros

módulos de transferencia de fosfatos, dando lugar a las denominadas histidina

quinasas híbridas (Grebe & Stock, 1999; Wolanin eí al, 2002). Esto último

ocurre en la mayoría de los sistemas eucarióticos analizados.

Independientemente de su asociación con otros, los módulos conservados se

denominan transmisor y receptor, y se localizan, respectivamente, en la región

C-terminal de las histidina quinasas y N-termínal de los reguladores de

respuesta "clásicos". Dentro de cada componente, estos dominios conservados

se asocian a otros dominios no relacionados que funcionan como elementos de

entrada (dominio sensor o input} o de salida (dominio efector, regulador u

outpuf¡, respectivamente. El dominio input del componente sensor,

generalmente asociado a membrana, actúa detectando la señal específica del

sistema y regulando la actividad del módulo transmisor conservado, que a su

vez controla la fosforilación del dominio receptor del regulador de respuesta.

Esta fosforilación repercute drásticamente en la conformación de la proteína,

alterando la actividad del correspondiente módulo efector.

El módulo transmisor del componente sensor posee actividad auto-

quinasa, lo que le permite catalizar la incorporación de grupos fosfato desde el

ATP a residuos conservados de histidina presentes en este mismo módulo. Por

este motivo, los componentes sensores de los sistemas de dos componentes

reciben también el nombre de histidina quinasas. El residuo de fosfohistidina

es el sustrato para la transferencia del fosfato al dominio receptor del

regulador en una reacción que parece catalizada por el propio dominio

receptor, al igual que la desfosforilación (Hess eí al, 1988; Lukat eí al,, 1992).

En otros casos, la histidina quinasa promueve la rápida desfosforilación del

dominio receptor en respuesta a señales ambientales (Aiba eí al, 1989; Keener

8s Kustu, 1988; Lois eí al., 1993). Esta actividad recibe el nombre de actividad

fosfatasa regulada, aunque no está claro si implica una actividad catalítica

propia del módulo transmisor o una activación alostérica de la actividad

autofosfatasa del dominio receptor (Parkinson, 1993). Análisis genéticos y

17



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Introducción

bioquímicos en diversos sistemas indican que esta actividad juega un papel

central en la regulación de la actividad del componente regulador (Stock et al.,

2000). En otros sistemas, la desfosforilación del componente receptor está

mediada por proteínas no relacionadas con las histidina quinasas (Blat &

Eisenbach, 1994; Blat & Eisenbach, 1996; Ohlsen et al, 1994; Perego et al,

1994).

Así, pues, las actividades quinasa y fosfatasa de los sensores y

reguladores de respuesta constituyen la base bioquímica de la transducción

de la señal en los sistemas de dos componentes. A pesar de la gran cantidad

de análisis que se han llevado a cabo en algunas de estas proteínas, los

mecanismos moleculares operativos en la comunicación entre los distintos

módulos, y entre éstos y las señales de entrada y salida del sistema continúan

siendo en muchos casos desconocidos.

1.4. Relación estructura-función en histidina quinasas.

El módulo transmisor, de unos 250 aminoácidos, presenta una serie de

motivos altamente conservados en la superfamilia de las histidina quinasas. El

sitio de fosforilación, incluido en la región H, se localiza en posición N-terminal

respecto del resto de las secuencias conservadas que constituyen las regiones

N, G l , F y G2, denominadas asi por el residuo conservado que define al

corespondíente bloque de secuencias (Alex & Simón, 1994; Parkinson &

Kofoíd, 1992). En todos los casos estudiados, la autofosforilación tiene lugar

mediante un mecanismo de transfosforilación entre las unidades que

constituyen el dímero (Ninfa et al, 1993; Pan et al, 1993; Surette et al, 1996;

Swanson et al., 1993; Wolfe & Stewart, 1993). Los alineamientos de una gran

cantidad secuencias han permitido la clasificación de las histidina quinasas

en 11 subfamilias diferentes (Grebe & Stock, 1999).

Las estructuras tridimensionales de las histidina quinasas EnvZ y CheA,

indican la presencia de dos dominios diferenciados en el módulo transmisor

(Bilwes et al, 1999; Park et al, 1998). En EnvZ, el dominio fosfotranferasa,

central o de dimerización comprende las regiones H y N y forma una

estructura de cuatro hélices {four-helix bundle), a la que cada monómero

contribuye con dos hélices (Tomomori et al, 1999). Por el contrario en CheA,

una histidina quinasa atípica, la misma estructura de 4 hélices es

monomérica, y cada dímero CheA contiene dos de estas estructuras con sus

correspondientes histidinas fosforilables (Zhou et al, 1995).

19



Introducción

El segundo dominio del módulo transmisor es el dominio quinasa o

catalítico, localizado en posición C-terminal. Las estructuras determinadas

para este dominio en EnvZ y CheA muestran una elevada homología con la

familia GHKL de ATPasas, a la que pertenecen las proteínas DNA girasa B,

Hsp90 y MutL (Bilwes et al, 1999; Tanaka et al, 1998). Esta similitud había

sido previamente observada a nivel de secuencia, fundamentalmente en los

motivos N, Gl , F y G2, que conforman el sitio de unión a ATP (Mushegían et

al, 1997).

La organización de ambos dominios, fosfotranferasa y catalítico, dentro

de la proteína y del dímero implican movimientos de estos dominios uno sobre

el otro para llevar a cabo la autofosforilación. Algunas evidencias sugieren que

las regiones entre dominios pueden ser importantes para permitir esta

flexibilidad de movimientos.

Las histidína quinasas pueden llevar asociados diferentes tipos de

dominios sensores, que pueden ser extracelulares o citoplasmáticos,

diseñados para interacciones específicas con sus ligandos o estímulos (Dutta

et al, 1999; Galperin et al, 2001; Stock et al, 2000). Esta enorme variedad se

refleja en una muy baja similitud de secuencia y tamaño existente entre los

sensores pertenecientes a distintas histidína quinasas. Los sensores

extracelulares se encuentran conectados al citoplasma y al módulo transmisor

a través de una o más regiones transmembrana. Entre los dominios sensores

citoplasmáticos, se han identificado en muchos casos la presencia de dominios

tipo PAS o GAF. Estos dominios actúan como módulos de detección de

diferentes tipos de señales {luz, potencial redox, etc..) y su función suele estar

asociada a la unión de un cofactor o a interacciones proteína-proteína (Taylor

&Zrrulin, 1999).

La mayoría de las histidína quinasas contienen una región de unos 50

amino ácidos con dos segmentos en hélice separados por una corta región más

compacta, denominada "linker" (o HAMP), que precede a la región H y que

parece jugar un papel importante en la transducción de señales (Appleman et

al, 2003; Aravind & Ponting, 1999; Hsing et al, 1998). Diversos análisis

mutacionales sugieren su implicación en un correcto alineamiento de los

monómeros (Appleman & Stewart, 2003; Hsíng et al, 1998; Raivio & Silhavy,

1997). En base a la naturaleza dinámica de estas estructuras, se ha propuesto

un posible papel en la detección de cambios conformacionales producidos en

el dominio sensor y su transmisión al módulo transmisor (Park & Inouye,

20



Introducción

1997). La localización de la histidina fosforilable cerca del extremo de una

estructura de este tipo sugiere que un cambio en la conformación de dicha

estructura podría controlar la accesibilidad de esta histidina al dominio

quinasa, permitiendo la fosforilación (Hsing eí al, 1998).

1.5. Relación estructura-función en reguladores de

respuesta.

El dominio que caracteriza a un regulador de respuesta es el dominio

receptor, que suele tener unos 125 residuos y presenta homología con las

GTPasas eucarióticas (Artymiuk eí al, 1990; Chen eí al, 1990; Stock eí al,

1991). La mayoría de los reguladores de respuesta contienen dos dominios: el

dominio receptor conservado en su extremo N-terminal, y un dominio efector

en su extremo C-terminal. Estos últimos están generalmente implicados en

regulación transcripcional, aunque también se conocen algunos ejemplos de

dominios efectores con actividad enzímática, como es el caso de CheB (Simms

eí al, 1985).

Los reguladores de respuesta que actúan como reguladores

transcripcionales pueden clasificarse en tres subfamilias en función de la

homología que presentan en su dominio efector C-terminal. Estas subfamilias

reciben el nombre del regulador representativo de la subfamilia: OmpR, NarL y

NtrC (Gross eí al, 1989). Aunque todos ellos contienen motivos de unión a

DNA del tipo hélice-vuelta-hélice, la estructura del dominio que lo contiene es

diferente. Las interacciones que cada regulador de respuesta presenta con la

maquinaria de transcripción y el mecanismo de activación de la transcripción

varían entre componentes de una misma subfamilia.

La primera estructura tridimensional obtenida para un dominio receptor

fue la de la proteína CheY, implicada en el control de la quimiotaxis en E. coli,

y que no contiene dominios efectores asociados (Stock eí al, 1990; Volz,

1993). Todos los dominios receptores cuya estructura ha sido resuelta desde

entonces, y que incluyen a NtrC (Volkman eí al, 1995), PhoB (Sola eí al,

1999) ó CheB (Djordjevic eí al, 1998), tienen una estructura similar a la

determinada para CheY.

Los dominios receptores catalizan la transferencia del grupo fosfato

desde la correspondiente histidina quinasa a su propio residuo de Asp. Esta

autofosforilación del dominio receptor también puede llevarse a cabo

21



introducción

utilizando como sustrato pequeñas moléculas donadoras como el acetilfosfato

(Lukat et al, 1992) o, a menos in vitro, a los residuos de fosfohistidina de

histidina quinasas pertenecientes a otros sistemas. Las tasas de fosforilación

en ambos casos son mucho menores que las obtenidas utilizando como

sustrato su correspondiente histidina quinasa (Fisher et al, 1996; McCleary,

1996).

En la mayoría de los casos, los dominios receptores catalizan su propia

desfosforilación con eficiencias que difieren considerablemente de un

regulador a otro, con oscilaciones en el tiempo de vida medio de la forma

fosforilada de entre segundos y horas. Estas diferencias reflejarían las

necesidades propias de cada sistema.

Los estudios genéticos, bioquímicos y biofisicos llevados a cabo con

diferentes reguladores ha permitido elaborar hipótesis para explicar la

transducción de las señales intramoleculares. Los reguladores de respuesta se

encontrarían en equilibrio entre dos estados conformacionales alternativos:

inactivo y activo. La fosforilación del dominio receptor provocaría un cambio

conformacional que desplaza este equilibrio hacia la forma activa (Birck et al.,

1999; Halkides et al, 2000; Kern et al, 1999; Lewis et al, 1999; Nohaile et al,

1997; Zhu et al, 1997). Las regiones alteradas tras la fosforilación coinciden

con las superficies previamente identificadas por su implicación en

interacciones proteína-proteína y difieren de un regulador a otro. Las

consecuencias de estas interacciones intramoleculares también pueden ser

muy diferentes. En algunos casos se modifican regiones implicadas en la

interacción con sus correspondientes histidina quinasas u otras proteínas

auxiliares que controlan la actividad de los reguladores de respuesta. En otros

casos, la fosforilación promueve la dimerización u oligomerización de la

proteína, requerida para alguna de sus actividades, la liberación de

interacciones inhibitorias o la regulación de la actividad enzimática.

2. Regulación de la asimilación de nitrógeno.

2.1. El sistema Ntr de enterobacterias.

En enterobacterias, la actividad de la glutamina sintetasa {GS) y de otros

enzimas importantes en la asimilación de nitrógeno está regulada de acuerdo

con la disponibilidad de fuentes de nitrógeno, entre las cuales el amonio es la

que permite la mayor velocidad de crecimiento. La GS y en general las

22



introducción

proteínas implicadas en el transporte y catabolismo de fuentes alternativas de

nitrógeno se sintetizan a bajos niveles cuando dicho nutriente es abundante, y

a altos niveles en ausencia o escasez de amonio (Kustu et al, 1979; Merrick &

Edwards, 1995; Neidhardt & Magasanik, 1957; Pahel, Rothstein & Magasanik,

1982; Prival & Magasanik, 1971).

Los genes implicados en la asimilación de fuentes alternativas de

nitrógeno se agrupan en varios operones ntr (de nitrogen regulation), que en

conjunto se conocen como el reguión Ntr. Este reguión incluye sistemas de

movilización y transporte de aminoácidos como glutamina (glnHPQ), arginina

(argT) o histidina (hisJQMP), genes implicados en la asimilación de nitrato y

nitrito (nasFEDCBA) y, en K. pneumoniae, los genes reguladores de la fijación

de nitrógeno atmosférico (nifLA) (Ninfa et al, 2000; Reitzer, 2003). La

expresión de estos operones está regulada por el sistema de dos componentes

NtrB/NtrC. La histidina quinasa NtrB (también llamada NRII) está codificada

por el gen ntrB (glnL) y el regulador de respuesta NtrC (NRI) por el gen ntrC

(glnQ.

En condiciones limitantes de amonio, NtrB fosforíla al regulador

transcripcional NtrC, mientras que en condiciones de exceso de nitrógeno

promueve su desfosforilación. La proteína activa (NtrC-P) regula positivamente

al conjunto de promotores ntr, que tienen en común la presencia de

secuencias UAS (de Upstream Activator sequence), también llamadas

intensificadoras o enhancers, localizadas a cierta distancia del inicio de la

transcripción. Estos promotores dependen para su actividad de NtrC-P, que

reconoce una secuencia consenso centrada a 100-150 pb aguas arriba del

inicio de la transcripción, y de la RNA polimerasa cargada con el factor sigma

alternativo a54 (Ea54) (Hirschman et al, 1985; Ninfa, Reitzer & Magasanik,

1987; Reitzer & Magasanik, 1986; Reitzer, Movsas & Magasanik, 1989). Los

promotores dependientes de Ea54 presentan secuencias consenso centradas a

-12 y -24 con respecto al inicio de la transcripción en +1, mientras que la

inmensa mayoría de los promotores de enterobacterias están definidos por

secuencias consenso a -10 y -35 (Merrick, 1993).

Los genes ntrB y ntrC comparten operón con glnA, el gen estructural de

la glutamina sintetasa, y enzima clave en la asimilación de nitrógeno. Estos

tres genes se transcriben en el orden glnA, ntrB, ntrC (Esphi et al, 1982) a

partir de tres promotores distintos: glnApl, glnAp2 y ntrB (Pahel et al, 1982).

Las dos primeros están situados aguas arriba del gen glnA y el tercero se

23



Introducción

encuentra entre los genes glnA y ntrB. En condiciones de exceso de amonio,

tiene lugar una expresión basal del operón a partir de los promotores glnApl y

ntrB. Estos son promotores típicos, dependientes del factor de iniciación

transcripcional 070 (Reítzer & Magasanik, 1985) y están negativamente

regulados por NtrC (Ueno-Nishio et al, 1984). En condiciones de carencia de

amonio, la transcripción se realiza a partir del promotor glnAp2, dependiente

de cr54 y NtrC, lo que permitte la amplificación de la señal correspondiente

(Hunt & Magasanik, 1985; Reitzer & Magasanik, 1985).

A diferencia de otros sistemas de dos componentes, la histidina quinasa

NtrB no detecta directamente la señal, sino que le es comunicada por las

proteínas triméricas PII, codificadas por los genes parálogos glnBy glnK. Tanto

GlnB como GlnK son modificados por la enzima UTasa/UR, producto del gen

glnD, en función de la concentración intracelular de glutamina. En

condiciones de escasez de nitrógeno (baja concentración de glutamina), la

UTasa uridilila a GlnB y GlnK, mientras que en condiciones de exceso de

nitrógeno cataliza la reacción contraria (Arcondeguy et al, 2001). Las formas

no uridililadas de las proteínas PII inhiben ligeramente la actividad

autoquinasa e inducen la actividad fosfatasa de NtrB (Atkinson & Ninfa, 1999;

Jiang & Ninfa, 1999; Jiang et al, 2000). Este efecto resulta en la rápida

desfosforilación de NtrC-P {Kamberov et al, 1995). En ausencia de proteínas

PII, o en presencia de sus formas modificadas (GlnB-UMP y/o GlnK-UMP),

prevalece la actividad quinasa de NtrB (Jiang eí al, 2000). A pesar de sus

funciones comunes, el papel fisiológico de las proteínas GlnB y glnK difiere

debido a sus diferentes patrones de expresión (Atkinson et al, 2002). Por otra

parte, las proteínas PII forman heterotrímeros estables, aunque con

propiedades distintas de los homotrímeros, que han sido puestas de

manifiesto tanto in vitro como in vivo {Forchhammer et al, 1999; van Heeswijk

et al, 2000 y datos sin publicar). La formación de heterotrímeros añade por

tanto nuevas sutilezas a la regulación dependiente de nitrógeno (van Heeswijk

et al, 2000).

Además de en el control transcripcional del reguión Ntr, las proteínas PII

juegan un papel clave en el control de la actividad glutamina sintetasa (GS).

Esta regulación la ejercen a través de la ATasa o

adeniltransferasa/adenilremovasa, codificada por glnE. Las actividades de la

ATasa son reguladas en función del grado de uridililación de las proteínas PII

24



Introducción

(Jaggi et al, 1997). La adenilación de la GS resulta en una rápida inactivación

del enzima (Rhee et al, 1985; Rhee et al, 1989).

Las interacciones clave en las que participan los componentes

reguladores de la asimilación de nitrógeno en enterobacterias se resumen

esquemáticamente en la Figura 2

ATasa glutamina

0 i! GlnB

U T a s a \ \ PII / 1 NtrB(P)l— NtrC(P) GlnK

oxoglutarato S^ / Qenes ntr * aen

nifA

Figura 2. Regulación de la asimilación de nitrógeno en K.

pneumoniae. Los detalles se describen en el texto.

2.2. Relación estructura función en el sistema de dos

componentes NtrB/NtrC.

NtrB es una proteína de 369 aminoácidos, cuya organización modular se

representa esquemáticamente en la Figura 3. La región N-terminal de NtrB,

bastante diferente a las de la mayoría de las histidina quinasas, es esencial en

la regulación de las actividades quinasa y fosfatasa de NtrB. En esta región, y

en particular en el linker que precede al sitio de fosforilación, se localizan la

mayoría de las mutaciones reguladoras (Ninfa et al, 1995; Pioszak & Ninfa,

2003a). En el extremo N-terminal se localiza una región con homología a los

recientemente identificados dominios PAS, implicados en la unión de ligandos

reguladores y en interacciones proteína-proteína.

El módulo transmisor conservado presenta una organización típica,

estando compuesto por dos dominios estructurales y funcionales. El dominio

central o fosfotransferasa contiene el sitio de autofosforilación His-139 y el

dominio C-terminal, quinasa o catalítico contiene el resto de los motivos de

secuencia conservados (Kramer 85 Weiss, 1999; Jiang et al, 2000; Kramer &

25



iniroclucx-io::

Vv'eiss. i999). La autofosforilación de NtrB implica transfosforilación entre

subun idades (Ninfa et ai. 1993). En condiciones de deficiencia de nitrógeno.

NtrB promueve la transferencia del grupo fosfato desde su residuo de his t icma

al residuo Asp54 del domino receptor de NtrC. mientras que en suficiencia de

nitrógeno promueve la desfosforilación de NtrC a través de su actividad

fosfatasa. Ensayos con derivados t runcados indican que esta actividad reside

en el dominio central y sugieren que es necesaria u n a determinada

conformación ce dicho dominio para inducirla. La actividad fosfatasa cíe NtrB.

que rx es una reversión de la reacción de transferencia, de fosfato es el blanco

principal cic las proteínas PII (Jiang et ai. 2000: Pioszak & Ninfa. 2003a:

Pioszak & Ninfa. 2003b).

El reguiador de respues ta NtrC pertenece a la subfamilia de activadores

trar.scripcicnales dependientes de a5 : (Kustu et ai. 1989:. Se t ra ta ele u n a

proteir.a cimérica en la que se distinguen tres dominios es t ructurales v

funcionales Figura. 3: ;Drummond et ai. 1986). El dominio N-termmal de 123

aminoácidos es el módulo receptor conservado, fosforilado por NtrB en Asp-5-1-

El dominio centra.! interacciona con el complejo transcripeior.al E~ : _•

contiene un motivo de unión a ATP (Morctt & Segovia. 1993: Osuna. Soberon

& Morett. 1997.. El dominio C-tcrminal contiene un motive H-'i'-i: -cíe E'exv

T:.¿n:-Iielix o hélice-giro-hélice necesario para la unión a ENA Ccntrerax &

Drummonci. 19SS• y es también necesario para la dimenzación de NtrC Portcr

et ai. 1993: Shiau. Chcn & Reitzer. 1993).

La fosforilación de NtrC aumen ta la coopcratividac en su tmiór. al

enhancer en el DNA ;Chen & Reitzer. 1995: Portcr et ai. 1993' Wciss ?:, ai.

1991 ' . estimula la actividad ATPasa e induce la formación de oiigómercs sobre

los sitios de unión a 1DNA (Hwang et ai. 1999: VVeiss et ai.. 1992: IVyman et

ai. 1997'. Mientras que la capacidad de represión reside en el dominio ele

unión a ENE iContreras & Drummonci. 1988: Erummonci et ai. 199C:. la

función activacora requiere los tres dominios de la proteína Erummonxl el ai.

1990, y es notablemente más compleja. Únicamente la forma fosfonlaxla de

NtrC es capaz de activar la transcripción (Ninfa & Magasanik. 1986:.

26



Introducción

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27



¡r.iroíiurció::

2.3. Los sistemas de dos componentes NifL/NifA en

Klebsiella pneumoniae y Azotobacter uinelandii.

La capacidad de fijar nitrógeno atmosférico supone un alio coste

energético, que unido a la sensibilidad de la enzima ni t rogenasa al oxigene,

obliga a un estricto control de los genes correspondientes (genes nifl. La

regulación ele estos procesos ha sido ampliamente estudiada en varíes

organismos modelo, entre ellos K. pneumoniae, enterobacteria que fija

nitrógeno en anaerobiosis. y A. uinelandii, u n aerobio estricto.

Tanto en K. pneumoniae como en A. uinelandii, la expresión de los genes

.".;/" es dependiente del regulador transcripcional NifA. codificado por nifA. que

comparte operon con el gen nifL. En condiciones de exceso de nitrógeno y

presencia de oxígeno. NifL forma un complejo proteico con NifA inhibiendo su

actividad. La formación de este complejo NifLA está modulada por cambios

redox e interacción con ligandos y otras proteínas reguladoras (Schmitz el al..

2002:.

Las proteínas NifL presentan uno o dos dominios PAS en su región X-

tcrmina'. en K. pneumoniae o .4. uinelandii. respectivamente.. irr.pLca.doiS en

la detección del estado redox mediante la unión a un cofactor LAD HL1 ez al.

1996: Schrnnz. 1997). Los dominios C-terminal de las proteínas Nifl..

comparten homología con histidina quinasas , a u n q u e no están implicados en

transferencia de fosfato (Blanco et al, 1993; Drummond & Wootton. 1987) El

dominio C-terminal de NifL de A. uinelandii es capaz de unir nucleótidos

(Soderback et al. 1998). mient ras que no se h a demostrado ic mismo en el

caso de NifL ele K. pneumoniae (Klopprogge et al, 2002).

Las proteínas NifA comparten homología en sus dominios centra, y C-

ternninal con reguladores transcripcionales dependientes ce factor stgma 5 -

ceme XtrC Lvíoreit & Buck. 1988; Morett et al. 1988: Studholme & Dixon.

20031. En su región N-terminal presentan un dominio GAF. que ha sido

relacionado con la regulación de NifA en respues ta a oxígeno.

La regulación de la activación de NifA en función de ia disponibiiciaá de

nitrógeno se realiza a través de la proteína GlnK; aunque el mecanismo difiere

en Celda organismo. En K. pneumoniae. een condiciones ce ausencia de

nitrógeno. NtrC-? activa la expresión de GlnK. La interacción de Glr.X con el

complejo XifLA promueve su disociación, permitiendo la activación de XifA 1-1 c

28



http://irr.pLca.doiS

Introducción

et ai, 1998; Jack et al, 1999). En el caso de A. vinelandii, donde la expresión

de GlnK es constitutiva (Colnaghi et ai, 2001; Meletzus et al, 1998), la forma

no modificada de GlnK promueve la formación de un complejo ternario

inhibitorio de la actividad de NifA. En condiciones de falta de nitrógeno, la

modificación de GlnK promueve la liberación del complejo y la activación de

NifA.

En A. vinelandii, existen tres nitrogenasas alternativas que contienen

diferentes cofactores. La expresión de los genes correspondientes requiere

activadores específicos. Asi, NifA activa la expresión de la nitrogenasa de

hierro y molibdeno, mientras que sus parálogos VnfA y AnfA activan la síntesis

de las nitrogenasas de hierro y vanadio y hierro solo, respectivamente (Joerger

et ai, 1989}. Algunos genes nif pueden ser activados transcripcionalmente por

cualquiera de los tres reguladores. La presencia en dichos promotores de sitios

de unión solapados para los tres reguladores puede implicar la existencia de

interacciones moleculares entre ellos, que jugarían un papel en el control de

estos genes en las distintas situaciones fisiológicas (Drummond et ai, 1996).

3. El sistema del doble híbrido de levaduras y

transducción de señales en bacterias.

3.1. El problema biológico: Interacciones entre proteínas.

Las interacciones pro teína-pro teína y su especificidad son fundamentales

en los más variados procesos biológicos, incluyendo la formación de

estructuras celulares, complejos enzimáticos y otras asociaciones más

transitorias y no exentas de complejidad, como las que pueden tener lugar

entre proteínas implicadas en transducción de señales. Puesto que la

supervivencia de las bacterias depende en buena medida de la capacidad de

detectar e integrar estímulos ambientales para producir una respuesta celular

apropiada, el estudio de las interacciones que tienen lugar entre componentes

de las rutas de transducción de señales es fundamental para entender las

estrategias de adaptación de los microorganismos.

La complejidad de los procesos de transducción de señales se sustenta,

en gran parte, en la multifuncionalidad de las proteínas implicadas en estos

procesos. Esta multifuncionalidad puede ser un reflejo de las actividades de

los diferentes dominios de la proteína, pero también de la interacción un

29



Introducción

mismo dominio con diferentes componentes celulares. Esto explicaría el efecto

pleiotrópico de muchas mutaciones en este tipo de genes. La existencia de

redundancia de funciones, a su vez, complicaría la correspondiente

adscripción fenotípica de los mutantes (Schaechter, 2001). La visión "lineal",

en la que la amplificación de una señal a través de actividades catalíticas

sucesivas conduce a una respuesta celular, ha dado paso a una visión más

interactiva en la que las proteínas reguladoras de una ruta modulan su

actividad en función de interacciones con otros reguladores y componentes

celulares. Diferentes señales pueden así converger en elementos comunes o

ser anuladas o amplificadas, en función de la actividad de los distintos

componentes celulares, permitiendo una regulación coordinada y flexible en

función de las condiciones ambientales. Por todo ello, más que de rutas habría

que hablar de redes de transducción de señales.

3.2, El sistema del doble híbrido de levaduras. Variantes

y secuelas.

En la década de los ochenta se describió la organización modular de los

reguladores transcripcionales eucarióticos, constituidos por dominios de

activación (AD, de Activation Domain) y dominios de unión a DNA (BD, de

Binding Domain)(Keegan, GUI & Ptashne, 1986; Ma & Ptashne, 1987a; Ma &

Ptashne, 1987b). Esta separación de funciones fue elegantemente demostrada

en experimentos de intercambio entre el dominio de activación de la proteína

GAL4 de S. cerevisiae y el represor de LexA de E. coli, compuesto por un solo

dominio de unión a DNA (Brent & Ptashne, 1985) y posteriormente confirmada

con ejemplos en los que los módulos AD y BD son proporcionados por

proteínas diferentes (Ptashne, 1988; Triezenberg, Kingsbury & McKnight,

1988a; Triezenberg, LaMarco & McKnight, 1988b). Estos experimentos fueron

la base para el desarrollo de una nueva metodología en el estudio de las

interacciones proteína-proteína in vivo: el sistema del doble híbrido de

levaduras (Fields & Song, 1989). En este sistema, los módulos AD y BD son

acercados mediante la interacción entre las proteínas a las que han sido

fusionados (Figura 4). Esta interacción da lugar a la activación de genes

testigos, en los que promotores dependientes del dominio BD utilizado han

sido fusionados a genes cuya actividad es fácilmente detectable. Según el tipo

de genes testigo presentes en las cepas de levaduras empleadas (típicamente

30



Introducción

a)

b)

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d)

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Figura 4. Detección de interacciones moleculares mediante el sistema del doble hibrido. a) La activación del promotor gall por la proteína modular Gal4 requiere la unión a DNA del dominio BD y la interacción con la RNA Polimerasa II medíate el dominio AD. b) La fusión del dominio BD a la proteína de interés X no activa la transcripción, c) La fusión entre el dominio AD y la proteína Y tampoco activa la transcripción, d) La expresión simultanea de ambas proteínas de fusión reconstituye la actividad transcripcional si las proteínas X e Y interaccionan entre sí.

31



[ni roduccióii

un marcador nutricional como HIS3 o el gen lacZ de E. coh). la interacción

puede visualizarse directamente en medios específicos o cuamiñearse

mediante determinación de actividades enzimáticas.

Ademas del ya clásico s is tema del doble híbrido basado en GAL4, se han

desarrollado otros, como los basados en LexA y la protcina VP16 del virus del

herpes ¡Vojtek et al.. 1997) o en LexA y B42 de E. coli (Goicmis & Bren;.. 1997i.

En los años siguientes a la descripción de la técnica, la simplicidad del ensayo

hizo crecer" rápidamente sus aplicaciones. Las variantes de uno o tres híbridos

permiten, respectivamente, el estudio de interacciones DXA-pro:eína Li &

Fieles. 1993. Wang & Stillman, 1993) o RNA-proteína (Putz. Skehe". & Kuhl.

1996 . Las vanan tes '"reversas" permiten la identificación y el estudio de

mutaciones y moléculas que destruyen interacciones proteína-proteína o DXA-

proteítia Lcanna & í lannink. 1996; Vidal et al. 1996¡. Una de las aplicaciones

más potentes es. sin duda, la identificación de proteínas capaces de

interaccionar con otra de interés, mediante el escrutinio de genotecas cíe

expresión.

Más recientemente, se han desarrollado u n a serie ce s is temas doble

híbrido bacterianos. Algunos de estos s is temas están basados , de manera

homologa a ios s is temas de levaduras, en la obtención de reguladores

t ranscnpcionales híbridos, tanto represores (Hu et al. 1990: Kornacker el a'..

1998: Oer:el-Buchheit et al.. 1993) como activadores Dove et al. 1997:

Jappelli & Brer.r.er. 1998: Kolmar et al. 1995). El s is tema más conocido, sin

embargo, se basa en la reconstitución, en u n a estirpe cya deficiente en

adenilatc ciclasa, de E. coh de la actividad de la enzima aderulato ciclasa ce

Borceteila per tussis (Karimova et al. 1998). A pesar de que estos s is temas

han sido aplicados con éxito en diversos estudios, su uso no ha sido todavía

generalizado y no se han publicado, has ta donde sabemos, resultados

procedentes de escrutinios de genotecas. con lo que. para. a lgunas

aplicaciones, los sisteman bacterianos son todavía estrategias "de nesgo" Hu

et al. 2000: Ladant & Karimova. 2000).

3.3. Contribución de las herramientas doble-híbrido al

estudio de la transdueción de señales en bacterias. La concentración de recursos en la investigación de s is temas de

t ransdueción de señales relacionada con procesos de desarrollo y cáncer, ha

.Í2



Introducción

influido en el éxito espectacular de las estrategias doble híbrido. Esta

circunstancia, ha hecho que sepamos hoy en día más sobre las interacciones

proteína-proteína en las complejas rutas de transducción de señales

eucaríóticas que en las mediadas por sistemas de dos componentes en

bacterias.

En investigación científica es común la utilización de sistemas simples

para el estudio de sistemas más complejos. Así, durante décadas, una buena

parte de los conocimientos sobre el funcionamiento de los seres vivos a nivel

molecular han sido obtenidos en E. coli. Esta bacteria y en menor medida la

levadura Saccharomyces cerevisiae, son utilizadas de forma rutinaria, en

laboratorios de todo el mundo, como herramientas en el análisis y

manipulación de genes y genomas de organismos pluricelulares. En el marco

de la Genética clásica ambos microorganismos han compartido protagonismo

con otros sistemas modelo como Drosophüa melanogaster, sometidos a análisis

genéticos cada vez más sofisticados. Quizás esta lógica, que implica en

muchos casos trabajar con organismos simples para intentar extrapolar a

otros más complejos, explique el retraso en la aplicación del sistema del doble

híbrido al estudio de interacciones proteicas en procariotas. Es hecho es que,

tras una cierta resistencia a la utilización de herramientas genéticas

eucaríóticas para estudiar procesos biológicos bacterianos, este tipo de

aproximación se ha consolidado en la literatura científica {Bartel et al., 1996;

Lei et al., 1999; Rain et al., 2001). Es este contexto, la menor complejidad de

los genomas bacterianos y su distancia evolutiva a levaduras implican, al

menos en teoría, que el ruido de fondo debido a interacciones con

componentes endógenos sea menor que con proteínas eucariotas. Basándose

en esta premisa, algunos autores sugieren que el uso del sistema de levaduras

sería preferible en el estudio de proteínas procariotas, mientras que el sistema

bacteriano sería el ambiente apropiado para el estudio de proteína de origen

eucariótico (Hu et al., 2000).

La secuencia genómica de B. coli revela que una importante fracción de

sus hipotéticos productos génicos son todavía de función desconocida. Los

sistemas doble híbrido permiten obtener información sobre estas proteínas, a

partir de la identificación y análisis de las interacciones en las que participan.

Proporcionan por tanto, herramientas fundamentales en "genómica funcional",

que complementan las aproximaciones genéticas y bioquímicas clásicas. En el

contexto concreto de la transducción de señales de nitrógeno en

33



Introducción.

enterobacferias, intensamente estudiada, el sistema del doble híbrido de

levaduras, al estar basado en una premisa distinta (la detección de

interacciones proteína-proteína), nos permite abordar aspectos como la

identificación nuevos elementos, de función conocida o no, en las redes de

transducción de señales, así como obtener información relevante sobre los

dominios y motivos proteicos implicados en las interacciones detectadas.

3.4. Ensayos doble híbrido: Consideraciones generales.

Actualmente existe una gran variedad de vectores y estirpes que

permiten "personalizar" el sistema del doble híbrido para adecuarlo a objetivos

experimentales concretos (Bartel & Fields, 1997; Zhu & Hannon, 2000),

aunque el sistema más utilizado sigue siendo el basado en el regulador GAL4.

A los componentes básicos de todos los vectores pueden añadirse elementos

adicionales, que facilitan la detección y posteriores estudios de las proteínas

de fusión. Estas secuencias, sin embargo, pueden aumentar la probabilidad

de recombinaciones entre los plásmidos en el interior de la levadura, lo que

puede dificultar la detección de algunos clones interesantes (falsos negativos),

o generar fusiones capaces de activación independiente del cebo (falsos

positivos) (Fromont-Racine et al, 1997).

Los distintos tipos de vector permiten diferencias en el nivel de expresión

de las proteínas de fusión, en las dianas de restricción del MCS (sitio de

clonación múltiple) y en el marcador de selección para levaduras. Así por

ejemplo, un elevado nivel de expresión de las proteínas de fusión puede

favorecer la detección de interacciones débiles, pero aumenta la probabilidad

de que la proteína de fusión expresada resulte tóxica para la célula. Este

fenómeno, particularmente si afecta a la fusión a utilizar como cebo en los

correspondientes escrutinios, repercute negativamente en el número de clones

detectado. La utilización los vectores AD y BD con el mismo MCS facilita la

construcción de los dos tipos de fusiones necesarias para la realización de

ensayos recíprocos, en los que se intercambian los módulos de GAL4

fusionados a una pareja concreta de proteínas. La disponibilidad de variantes

que difieran en la pauta de lectura del MCS, a su vez, resulta particularmente

importante en la construcción de genotecas por fragmentación enzimática. Por

último, los marcadores de selección de levaduras presentes de los vectores

suelen ser de tipo nutricional, y la única característica a tener en cuenta es

34



Introducción

que sean compatibles con la estirpe de levadura seleccionada para realizar los

ensayos.

Los genes testigo más utilizados en análisis doble híbrido son aquellos

que permiten una selección nutricional (ADB2 ó HIS3), debido a su facilidad de

ensayo. El marcador lacZ es también ampliamente utilizado, tanto en ensayos

líquidos (actividad (5-galactosidasa), que producen resultados cuantitativos,

como en placa (X-gal). Las características del promotor {tipo y repeticiones de

las secuencias UAS) al que se encuentra fusionado el gen testigo permiten

detectar y /o discriminar interacciones más o menos débiles.

La presencia en una misma estirpe de varios marcadores de selección

bajo el control de diferentes promotores facilita la discriminación de señales

no derivadas de la interacción entre las fusiones ensayadas {falsos positivos).

Aunque las causas de la aparición de este tipo de clones son diveras y no

siempre pueden establecerse (Bai & Elledge, 1997), suelen asociarse a

mutaciones genómicas o a la capacidad de algunas fusiones GAL4AD de

unirse de manera específica a promotores concretos.

35



Objetivos

37



Objetivos

El objetivo fundamental de este proyecto de investigación es contribuir

a la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en transducción

de señales de nitrógeno en bacterias mediante la utilización del sistema del

doble híbrido de levaduras. El reto estaba en demostrar que una herramienta

genética eucariótica podía utilizarse para aportar información en sistemas de

transducción de señales procarióticos y, en particular, en el paradigmático

sistema de dos componentes NtrBC.

Los objetivos concretos de este trabajo son los siguientes:

1. Investigar la utilidad del sistema del doble híbrido de levaduras en el

estudio de interacciones moleculares mediadas por proteínas

pertenecientes a los sistemas de dos componentes.

2. Explorar el potencial del sistema del doble híbrido para abordar el

problema de la especificidad y posible comunicación cruzada entre

histidina quinasas y reguladores de respuesta.

3. Analizar interacciones intra e intermoleculares en el sistema de dos

componentes NtrB/NtrC.

4. Analizar interacciones entre NtrB y las proteínas que actúan aguas arriba

en la ruta de transducción de señales de nitrógeno (proteínas PH).

5. Construir y analizar genotecas doble híbrido encaminadas a la

identificación de nuevos componentes de las rutas de transducción de

señales de nitrógeno.

6. Contribuir a la construcción de un "ínteractoma del nitrógeno" en

enterobacterias.

7. Caracterizar las posibles nuevas interacciones identificadas.

39



40



Una gran parte de ios resultados obtenidos en esta Tesis Doctora.! han sido

publicados en los tres artículos que se incluyen como anexos. Con el fin de

evitar duplicaciones innecesarias, en la Tesis se hace referencia a las figuras y

tablas de las publicaciones f a la vez que se presenta un resumen de los

resultados y discusión correspondientes. Por el contrario, se detalla en mayor

profundidad lo relativo a los resultados que, por diversas razones, no han sido

publicados.

Anexo I: Two-hybrid analysis of domain interactions involving NtrB and

NtrC two-component regulators. Martínez-Argudo, L, Martin-Nieto, J., Salinas,

P., Maldonado, R., Drummond, M. y Contreras, A. Molecular Microbiology

40(1):169-178. 2001.

Anexo II: Domain interactions on the ntr signal transduction pathway:

two-hybrid analysis of mutant and truncated derivatives of histidine kinase

NtrB. Martínez-Argudo, I., Salinas, P., Maldonado, R., y Contreras, A. Journal

of Bacteriology 184(1): 200-206. 2002.

Anexo III: Identification and analysis of Bscheríchia coli proteins that

interact with the histidine kinase NtrB in a yeast two-hybrid system. Salinas,

P. y Contreras, A. Molecular Genetics and Genomics 269:574-581. 2003.

41




43




La mayoría de los procedimientos utilizados en la presente Tesis Doctoral

se hayan descritos con detalle en las publicaciones incluidas como anexos. En

esta sección se detallan tan sólo aquellos procedimientos, estirpes y plásmidos

que no se mencionan en dichos anexos.

1. Estirpes y plásmidos

Estirpe Genotipo Referencia/ procedencia

A. vinelandii UW136 Derivado RiP de UW (ATCC

13705) (Bishop & Brill, 1977)

K.(pneumoniae) oxytoca M5a l Silvestre J o h n Innes Centre

E. coli ET8000

E. coli FT8000

rbs lacZy.lSl gyrA hut&K

(silvestre)

rbs lacZ::lSl gyrA hutCPK

AglnBl ÜGm' AglnKl

(MacNeil eí al, 1982)

(Reyes-Ramirez eí al, 2001)

Tabla 1. Estirpes.

Plásmido Caracterís t icas Referencia/procedencia

pTM13 vn#lenpT7.7 John Innes Centre

pTM 14 anfA en pT7.7 John Innes Centre

pTRC99a Vector expresión inducible por IPTG (Amann eí al, 1988)

Tabla 2. Plásmidos.

2. Medios y condiciones de cultivo

2.1. Cultivo de bacterias.

El cultivo de K. pneumoniae se realizó en medio Luria-Bertani (LB,

(Miller, 1972) a 37° C y con agitación orbital {220 r.p.m.) en el caso de cultivo

líquido.

45




Para analizar el efecto de ía sobreexpresión de AspA91312 en estirpes de E.

coli se utilizó el medio WN. Las soluciones A y B se prepararon y autoclavaron

por separado. La solución A contiene (por litro) 120 g Tris, 75 mi de HCl

concentrado, 20 g KC1, 6,54 g Na2HPC>4 anhidro y 3,5 g Na2S04. La solución B

se preparó disolviendo 5 g de MgCb'óLbO en 100 mi de agua destilada. Para

preparar 100 mi de placas de medio sólido, se mezclaron 90 mi de agua

destilada, 9 mi de solución A y 1 mi de solución B, se suplemento con 1,5 g de

agar bacteriológico y se esterilizó mediante autoclavado. Tras enfriar a 50 °C,

se añadió glucosa (20 mg/ml), sulfato amónico {1 mg/ml), glutamina (25

ug/ml), prolina (2 mM), tiamina (0,05 mM), 30 uM IPTG y los antibióticos

correspondientes, en su caso.

El cultivo de A. vinelctndü se realizó en medio BS (Guerrero et al, 1973).

2.2. Cultivo de levaduras .

El cultivo de S. cerevisiae se realizó a 30 °C, con agitación orbital (220

r.p.m.) en el caso de los cultivos líquidos, en medio rico YPD o en medio

mínimo YNB con los suplementos necesarios según el caso (20 mg/1 de

adenina, 20 mg/1 de histidina, 20 mg/1 de triptófano y/o 100 mg/1 leucina).

En la estirpe PJ696, los ensayos de interacción entre proteínas se realizaron

en medio YNB -Ade e YNB -His con lmM y 5mM de 3-AT.

3. Procedimientos de obtención, manipulación,

clonación y selección de moléculas de DNA

recombinante.

3 .1 . Aislamiento de DNA de microorganismos.

3.1.1. Obtención de DNA genómico de Azotobacter vinelandii.

Las células contenidas en 20 mi de un cultivo de A. vinelandii (DOs40nm

entre 0,6-1) fueron recogidas por centrifugación a 4.000 r.p.m. durante 4 min.

El precipitado se lavó con un volumen equivalente de NaCl 3%, se volvió a

centrifugar y se resuspendió en 10 mi de tampón TES (2 mM Tris, 90 mM

EDTA pH 8,0, 150 mM NaCl). Las células se Usaron mediante adición de 1,6

mi de SDS 10% e incubación a 37 °C durante 15 min. El DNA presente en el

lisado fue precipitado mediante la adición de una mezcla de 10 mi de etanol

46




absoluto y 1,2 mi de acetato de sodio 3 M. Las hebras de DNA que se formaron

fueron extraídas de la solución utilizando una pipeta Pasteur de vidrio sellada

a la llama. El DNA recogido en la pipeta se dejó secar al aire y se resuspendió

en 3 mi de 0,1 x SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM citrato sódico). Posteriormente, se

añadieron 10 ug/ml de RNAsa y se incubó durante 30 min a 37 °C. Tras la

adición de 500 ug/ml de proteasa K se incubó a 37 °C durante 12-16 horas.

La solución de DNA fue entonces extraída dos veces con un volumen

equivalente de fenol:cloroformo, y el DNA precipitado mediante al adición de

150 ul de acetato de sodio 3 M y 2 mi de etanol absoluto frío. Tras recoger el

precipitado del modo descrito anteriormente, se dejó secar y se resuspendió en

100-500 ul de 0,1 x TESL.

3.1.2. Obtención de minipreparaciones de DNA de S.

cerevisiae.

Tras centrifugar un volumen de cultivo de S. cerevisiae equivalente a 2 U

de DOeoonm, las células se resuspendieron en 200 ul de buffer YLS (300 mM

NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0 y 0,1 % SDS) y transferidas a un tubo

de 1,7 mi con tapón de rosca (Sorenson). Tras la adición de 200 ul de bolas de

vidrio de 0,5 mm de diámetro (Sigma) y 200 ul de

fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1), la suspensión celular fue sometida a

homogenización durante 30 seg en un Mini-BeadBeater (Biospec). Tras

centrifugación a 5.000 r.p.m. durante 10 min, la fase acuosa fue transferida a

un tubo eppendorf. El DNA presente en esta solución fue precipitado mediante

la adición de 500 ul de etanol absoluto y centrifugación a 13.000 r.p.m.

durante 20 min a temperatura ambiente. Tras lavar con etanol 70% y dejar

secar al aire, el DNA fue resuspendido en 30 ul de agua ultrapura.

3.2. Fragmentación de DNA genómico mediante

sonicación.

El DNA genómico de A. vinelandii se fragmentó utilizando un sonicador

Soniprep 150 (Sanyo). Muestras de 20 ug de DNA se llevaron a un volumen de

2 mi mediante al adición de HoO ultrapura estéril, y se sometieron a uno o

varios pulsos de diferente duración a una amplitud de onda de 10 um. Tras

cada pulso, la muestra se introdujo en un baño de agua-hielo para evitar el

sobrecalentamiento. Tras la aplicación de los pulsos, una alícuota de 100 ul se

47




precipitó con etanol absoluto y acetato potásico, se dejó secar, y se

resuspendió en 10 pil de agua ultrapura estéril. Esta alícuota se analizó por

electroforesis para determinar el rango de tamaño de los fragmentos

producidos y, tras comprobar que el rango de tamaño de los fragmentos era el

deseado, el resto de la muestra fue precipitada con etanol absoluto y acetato

potásico. El DNA precipitado se dejó secar, se resuspendió en 200 ul de agua

ultrapura estéril, y se cargó en un gel de agarosa para su fraccionamiento por

tamaños.

3.3. Tratamiento enzimático de DNA.

3.3.1. Tratamiento con enzimas de corte y modificación del

DNA.

El tratamiento del DNA con enzimas de restricción y modificación

(fosfatasa alcalina, quinasa, ligasa, etc..) se realizó siempre siguiendo las

condiciones y tiempos de incubación indicados por el fabricante, o siguiendo

protocolos estándares (Ausubel et al, 1999; Sambrook eí al., 1989)

3 . 3 . 2 . R e p a r a c i ó n d e e x t r e m o s d e DNA.

En la reparación de extremos de los fragmentos de DNA obtenidos tras la

sonicación se utilizaron tres protocolos diferentes que variaban en los tiempos

y condiciones de incubación, así como en el tipo y cantidad de enzimas

utilizadas.

Protocolo 1; 2 pg de producto de sonicación se incubaron durante 3

horas a 15 °C en un volumen final de 35 ul que contenía 2 ul de dNTPs 0,25

mM, 3 ul de tampón TM {100 mM Tris pH 8,0 y 100 mM MgCl2) y 20 U de DNA

polimerasa de T4 (Invitrogen).

Protocolo 2: 3 ug de producto de sonicación se incubaron durante 30 ó

60 min a 37 °C en un volumen final de 40 ul que contenía 50 mM de acetato

potásico, 20 mM de Tris acetato, 10 mM de ditiotreitol, 1 mM ZnSCU y 120 U

de nucleasa Mung Bean (Amersham Pharmacia Biotech).

Protocolo 3: 3 ug de producto de sonicación se incubaron durante 30 min

a 37 °C en un volumen final de 40 ul que contenía tampón de polimerasa de

T4 (Invitrogen), 2,5 mM dNTPs, 10 U de polimerasa de T4 (Invitrogen) y 10 U

de polimerasa Klenow (Invitrogen).

48




Tras cualquiera de estos t ra tamientos , el DNA fue extraído dos veces con

fenol :cloroformo, precipitado con etanol y acetato de sodio, secado y

resuspendido en agua u l t r apura estéril.

3.3.3. Comprobación por PCR de fragmentos clonados.

La amplificación de fragmentos clonados en los vectores pGAD424 y

derivados a part i r de biomasa de colonias de E. colí se realizó en u n a mezcla

de PCR que contenía 200 uM de cada dNTP, 0,4 uM de los cebadores ACT-A

(Anexo I) y ACT-B (5'-CAGTATCTACGATTAATAG-3') y 1 U de la enzima Taq

Polimerasa NEED, en el t ampón de reacción suminis t rado por el fabricante y

en u n volumen final de 50 ul. Se u sa ron p u n t a s de plástico estéril p a r a

transferir b iomasa de los distintos clones (colonias) a analizar a la mezcla de

PCR descrita. Las m u e s t r a s se introdujeron en u n termociclador programado

para realizar 30 ciclos con las siguientes fases: desnatural ización, incubación

1 min a 95° C; alineamiento, incubación 1 min a 50° C, y polimerización,

incubación 2 min a 72° C. Estos ciclos iban precedidos de u n a incubación

inicial de 4 min a 95° C, y finalizaban con u n a incubación adicional de 5 min

a 72° C, pa sando luego a permanecer a 4 o C por t iempo indefinido. Los

productos de PCR obtenidos fueron analizados mediante electroforesis en geles

de agarosa.

3.4. Construcción de fusiones a dominios de GAL4 de

AnfA y VnfA de A. vinelandii

Los fragmentos Ndel-BamHÍ de los plásmidos pTM13 y pTM14 (Tabla 2),

se clonaron en los vectores pGAD424-NdeI y pGBT9-NdeI (Anexo II), dando

lugar a los vectores pSBOl (GAL4AD:AnfA), pSB02 (GAL4BD:AnfA), p S B l l

(GAL4AD:VnfA) y pSB12 (GAL4BD:VnfA). Estos plásmidos fueron verificados

por análisis de restricción con varias enzimas.

3.5. Construcción de u n plásmido p a r a la sobreexpresión

de AspA91-312

El fragmento SmaifSañ del pUAGSl l (Anexo IÍI} se clonó en el vector

pTRC99a digerido con los mismos enzimas. El plásmido p U A G S H E obtenido,

que permite la expresión del polipéptido AspA91-312 bajo el control de u n

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promotor inducíble por IPTG, se verificó mediante análisis de restricción con

varias enzimas.

4. Obtención y conservación de genotecas doble

híbrido en S, cerevisiae PJ696. 50 ug de DNA plasmídico de la /s genoteca/s correspondiente/s se utilizó

para transformar S. cerevisiae PJ696 mediante un protocolo de

transformación a gran escala, tal como se describe detalladamente en el

"MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 & Librarles User Manual" de

Clontech. Varias diluciones de la mezcla de transformación obtenida se

sembraron en placas de YNB -Leu y se incubaron a 30 C durante 3 días. Las

colonias resultantes se utilizaron para calcular el número total de

transformantes totales.

Para amplificar la genoteca obtenida en levaduras, el resto de la mezcla

de transformación se sembró en placas de medio YNB -Leu y se incubó a 30

°C durante 3 días, tras los cuales se añadieron 3 mi de TE estéril a cada placa,

se resuspendieron las colonias con ayuda de un asa de vidrio estéril y la

suspensión celular se traspasó a un matraz estéril. Este procedimiento se

repitió con cada una de las placas sembradas y por duplicado, hasta recoger

toda la biomasa obtenida en la amplificación de la genoteca. Tras centrifugar a

5000 r.p.m. durante 10 min, las células fueron lavadas en TE estéril. Tras

centrifugar de nuevo, las células se resuspendieron en un volumen

equivalente de una solución de glicerol al 65% y 25 mM Tris pH 7,5, se

distribuyeron en alícuotas de 500 ul y los crioviales se almacenaron a -80 °C.

Para titular las genotecas congeladas, se descongeló u n a alícuota y se

prepararon diluciones seriadas en agua destilada estéril. 100 ul de las

diluciones 10-5, 10"6 y 10 7 se sembraron en medio YNB -Leu y se incubaron

durante 3 días a 30 °C. Las colonias resultantes se contaron para determinar

el número de unidades formadoras de colonias por unidad de volumen de

células congeladas (ufe/100 ul).

50




51



xcsU -tcjs ••.• .):sr„s:6n

1. Interacciones moleculares mediadas por í\trB,

NtrC y sus dominios.

1.1. Diseño de proteínas de fusión \ análisis doble

híbrido.

Con el objetivo de investigar las posibilidades del s is tema del doble

híbrido de levaduras en el estudio de las interacciones moleculares mediadas

por proteinas de los s is temas de dos componentes , generamos diversas

fusiones proteicas entre los dominios de GAL4 y las proteinas NtrB y NtrC :y

diversas variantes t runcadas) de K. pneumoniae. En el contexto ele esta tesis

se generaron u n a buena p a n e de los plásmicos que codifican fusiones a

polipeptidos derivados de NtrB. que se indican esquemát icamente , jun to con

los derivados de NtrC utilizados en este trabajo, en la Figura 1. Es tas

variantes t runcadas se diseñaron de acuerdo con la información disponible en

su momento sobre la es t ruc tura y función de ios co r re sponden te s módulos y

dominios ÍKramer & Weiss. 1999: Porter et al. 1993' . En la Figura 2 se

mues t ran , sobre la secuencia de ntrB, las posiciones de los distintos

oligonucleótidos utilizados como cebadores pa ra las construcciones

correspondientes. Para el estudio de las interacciones entre NtrB y GinB. se

utilizaron fusiones a dominios de GAL4 de GlnB de K. pneumoniae. Para

analizar la especificidad de las interacciones, se utilizaron como controles

fusiones a dominios de GAL4 de otras proteínas come CheA _•. F:r.Z-"::'-: de E.

CGÍÍ. \ PhoP de Saímonella typhirnurium. La secuencia de ios otigonücleóudos y

la construcción de ios plásmidos correspondientes se desenoe c>~al"adamentc

en ios anexos 1 y 11.

Para determinar la capacidad de dos polipeptidos cualesquiera de

interaccionar, se ensayó, en todos los casos, la expresión de los genes testigo

GAL AlacZ y GAL1:H!S3 en estirpes de S. cereuisiae Y190 mediante ensayos 8-

gaíactosidasa y crecimiento en medio sin histidina, respectivamente. El grado

de crecimiento en medio selectivo se clasificó en cuatro categorías Figura 2-

Al,. Cada pareja de fusiones proteicas a estudio se nombró siempre en el

orden GAE-ALYX GAE-3D:Y. abreviado X/V. donde X e Y son cualquier

poiipéptido fusionado a GAL4AD ó GAL4BD, respectivamente. Ninguna de las

construcciones derivadas cíe NtrB o NtrC activó a ios genes testigo por sí

misma, por le que se excluyó la posibilidad de eye a lguna de las

construcciones "autoactivara".

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Plásmidos Proteína de fusión a Dominios Aas.

pUAGll

pUAG31

pUAGól

pUAG21

pUAG211

pUAG261

pUAG281

pUAG251

pUAG221

pUAG291

pUAG301

pUAG331

pUAG311

pUAG12

pUAG32

pUAG62

pUAG22

pUAG212

pUAG262

pUAG282

pUAG252

PUAG222

pUAG292

pUAG302

pUAG332

pUAG312

> • > • X L D

ü

4L

1 lili

1

lili

NtrC 1-469

NtrCR 1-130

NtrC0 127-381

NtrCD

NtrB

N t r B S H N

NtrBSH

NtrB s

N t r B H N G

NtrBH

NtrBHN

NtrBNG

380-469

1-349

1-269

1-221

1-115

110-349

110-221

110-269

221-349

NtrBG 269-349

Figura 1. Representación esquemática de las proteínas de fusión a NtrB y NtrC codificadas por los plásmidos utilizados en este estudio. Siguiendo el código de colores previamente utilizado, los dominios de NtrB se representan en verde y los de NtrC en rojo. S: dominio "sensor"; H, N y G: motivos del módulo transmisor; R: dominio receptor; C: dominio central; D: dominio de unión a DNA. Los plásmidos impares codifican fusiones a GAL4AD, los pares codifican fusiones a GAL4BD. Los números de la última columna hacen referencia a los aminoácidos de NtrB y NtrC presentes en las proteínas de fusión.

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NTRB-2R NTRB--1R NTRB-5R NTKU-1R

alnA ntrB ntrC ~

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la...

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