Tesis-MC.Eneida Aracely L pez Arias.) · y Tecnología en la opción terminal de Biotecnología...

Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco

GUADALAJARA, JALISCO, OCTUBRE 2013

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

BIOMARCADORES PARA EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE CÁNCER DE MAMA; BÚSQUEDA E

IDENTIFICACIÓN

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE

MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA

PRESENTA

BIOL. ENEIDA ARACELY LÓPEZ ARIAS

Tutor: Rodolfo Hernández Gutiérrez


La presente tesis de maestría se llevó a cabo gracias a la beca

CONACYT otorgada a la Biol.

Eneida Araceli López Arias, Reg. No. 275806/223658 y al

financiamiento al proyecto “Búsqueda e identificación de

biomarcadores de cáncer de mama y desarrollo de un chip (prototipo)

para el diagnóstico temprano”, otorgado por el fondo sectorial de

investigación en salud y seguridad social-2007, No. 0700226, del Dr.

en C. Rodolfo Hernández Gutiérrez


Guadalajara, Jalisco, a 25 de octubre de 2013 Dr. Carlos Rubio González Director de Posgrado PICYT-CIDESI Querétaro Los abajo firmantes miembros del comité tutorial del estudiante Lic. en Biol. Eneida Araceli

López Arias, una vez leída y revisada la Tesis titulada “Biomarcadores para el diagnóstico

temprano de cáncer de mama, búsqueda e identificación” aceptamos que la referida tesis

revisada y corregida sea presentada por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia

y Tecnología en la opción terminal de Biotecnología Productiva durante el Examen de Grado

correspondiente.

Y para que así conste firmamos la presente a los ocho días del mes de Febrero del año dos mil

trece.

Dr. Rodolfo Hernández Gutiérrez Dra. Ana Laura Márquez Aguirre

Tutor académico Asesor


Guadalajara, Jalisco, a 25 de octubre de 2013

Dr. Carlos Rubio González Secretario Técnico del PICYT PICYT-CIDESI Querétaro Los abajo firmantes, miembros del Jurado de Examen del Lic. En Biol. Eneida Araceli

López Arias, una vez leída y revisada la Tesis titulada “Biomarcadores para el diagnóstico

temprano de cáncer de mama, búsqueda e identificación”, aceptamos que la referida tesis

revisada y corregida sea presentada por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia

y Tecnología en la opción terminal de Biotecnología Productiva durante el Examen de Grado

correspondiente.

Y para que así conste firmamos la presente a los veintidós días del mes de Febrero del año dos

mil trece.

Dr(a). Alejandro Canales Aguirre Dr(a). Erika Nahomy Marino Marmolejo Presidente Secretaria

Dr. en C. Rodolfo Hernández Gutiérrez Vocal


Dedicatoria


1

RESUMEN

El cáncer de mama es la segunda neoplasias con mayor incidencia, (por debajo del cáncer

cervico-uterino) en nuestro país y es también una de las primeras causas de muerte en mujeres

de 30 a 65 años de nuestro país. La detección temprana del cáncer de mama es de gran

importancia tanto para realizar tratamientos eficaces que permitan mejorar el pronóstico de la

enfermedad y brindar una mejor expectativa de vida. Se han realizado muchos esfuerzos con el

fin de encontrar marcadores útiles para diagnóstico, de manera más eficaz, sencilla y

específica.

El principal objetivo de este trabajo fue analizar las muestras de pacientes de cáncer de mama

en etapas tempranas (Etapa II), utilizando técnicas de alta resolución de separación de

proteínas con la finalidad de establecer perfiles proteicos tanto de personas normales, como

de personas en etapas iniciales de la enfermedad. Con ayuda de estos perfiles se podrá

establecer un análisis comparativo de geles bidimensionales a partir de proteínas séricas para

la identificación de proteínas diferenciales. La identificación de proteínas diferenciales de

ambos grupos es esencial para el establecimiento de marcadores tempranos diacríticos del

cáncer de mama, razón por la cual este análisis fue complementado con los ensayos de

Western Blot. Además mediante el análisis por espectrometría de masas (MS) se identificaron

tanto proteínas diferenciales como Antígenos Asociados a Tumor (AAT).

Para los estudios comparativos de mapas proteómicos se utilizaron 20 sueros de mujeres sanas

y fueron comparados con 20 sueros de mujeres con cáncer de mama; una vez obtenidos estos

mapas proteómicos el análisis se realizó in silico por medio del programa computacional PD

Quest Advanced Software, se observaron y se identificaron algunas proteínas, por debajo de

los 40 KDa y con pI en un rango de pH entre 4 - 6; las proteínas encontradas bajo estos rangos

fueron algunos tipos de apoliproteínas y cadena 2 haptoglobina entre otras.

Para la identificación de AAT se utilizaron 20 sueros de individuos sanos y 25 de mujeres con

cáncer de mama, Proteínas séricas de individuos sanos se utilizaron para realizar ensayos de

electroforesis y electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa, Las membranas

conteniendo estas proteínas se incubaron con sueros de pacientes con cáncer de mama y sueros

de personas sanas, estos ensayos permitieron identificar algunas proteínas interesantes entre

las que destaca la proteína Alfa 1 Antritripsina


2

ABSTRACT


3

INDICE DE CONTENIDO

RESUMEN .................................................................................................................................. 1

ABSTRACT ................................................................................................................................ 2

INDICE DE CONTENIDO ......................................................................................................... 3

INDICE DE FIGURAS, GRAFICAS Y TABLAS ..................................................................... 6

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................... 8

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 10

2. ANTECEDENTES ............................................................................................................ 12

2.1. GENERALIDADES. .................................................................................................. 12

2.1.1. DEFINICIÓN DE CÁNCER. .............................................................................. 12

2.1.2. CARACTERÍSTICAS DEL CÁNCER Y CÉLULAS CANCEROSAS ............ 12

2.1.3. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN ............................................................................... 14

2.1.3.1. DESARROLLO DEL CÁNCER ..................................................................... 15

2.1.4. GENETICA DEL TUMOR ................................................................................. 19

2.1.4.1. GENES ASOCIADOS AL CÁNCER (PROTOONCOGENES, ONCOGENES Y ANTIONCOGENES) ................................................................................................ 19

2.1.5. RESPUESTA INMUNE FRENTE AL TUMOR ................................................ 21

2.1.5.1. ANTÍGENOS TUMORALES ......................................................................... 22

2.1.5.2. AUTOANTICUERPOS ................................................................................... 23

2.2. CÁNCER DE MAMA ................................................................................................ 23

2.2.1. DEFINICIÓN ...................................................................................................... 23

2.2.2. EPIDEMIOLOGÍA .............................................................................................. 24

2.2.3. FACTORES DE RIESGO ................................................................................... 26

2.2.4. BIOLOGÍA DE LA MAMA ............................................................................... 27

2.2.4.1. FISIOLOGÍA DEL CANCER DE MAMA ..................................................... 28

2.2.4.2. CLASIFICACIÓN DE CÁNCER DE MAMA ............................................... 29

2.2.4.3. ETAPAS DE CÁNCER DE MAMA ............................................................... 31

2.2.4.4. PROTEÍNA ASOCIADA AL CÁNCER DE MAMA .................................... 34

2.2.5. DIAGNOSTICO DEL CANCER DE MAMA .................................................... 34

2.3. MARCADORES TUMORALES ............................................................................... 37

2.3.1. DEFINICIÓN ...................................................................................................... 37

2.3.2. CLASIFICACIÓN ............................................................................................... 37


4

2.3.3. MARCADORES TUMORALES DE CÁNCER DE MAMA ............................ 38

2.3.3.1. ANTÍGENOS ASOCIADOS AL TUMOR (AATS) EN CÁNCER DE MAMA……. ................................................................................................................. 39

2.4. PROTEÓMICA .......................................................................................................... 41

2.4.1. DEFINICIÓN ...................................................................................................... 41

2.4.2. TÉCNICAS DE ESTUDIO Y CLASIFICACIÓN .............................................. 42

2.4.2.1. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL ....................................................... 43

2.4.2.2. ESPECTROMETRÍA DE MASAS ................................................................. 43

2.5. INMUNO-PROTEÓMICA ......................................................................................... 44

3. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 45

4. HIPOTESIS ....................................................................................................................... 46

5. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 47

5.1. .................................................................................................................................. 47

6. METODOLOGÍA .............................................................................................................. 48

6.1. DISEÑO DE EXPERIMENTAL ................................................................................ 48

6.1.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN PARA LOS PACIENTES ..................................... 48

6.1.2. MODELO ESTADÍSTICO ..................................................................................... 49

6.2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 49

6.2.1. OBTENCIÓN DE LOS SUEROS ....................................................................... 49

6.2.2. INTERPRETACIÓN DE MASTOGRAFÍA ....................................................... 50

6.2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS SUEROS ............................................................... 51

6.2.4. ESTANDARIZACIÓN DE LA DOBLE DIMENSIÓN (2-DE) DE LOS SUEROS ............................................................................................................................ 51

6.2.5. DEPLESIÓN DE SUEROS ................................................................................. 52

6.2.6. DOBLE DIMENSIÓN ........................................................................................ 52

6.2.6.1. PREPARACIÓN DE LOS SUEROS PARA LA PRIMERA DIMENSIÓN .. 52

6.2.6.2. PRIMERA DIMENSIÓN ................................................................................ 52

6.2.6.3. ELECTROFORESIS DE DOBLE DIMENSIÓN ........................................... 53

6.2.7. ANALISIS DE DOBLE DIMENSIÓN ............................................................... 54

6.2.8. INMUNO-BLOT DE DOBLE DIMENSIÓN ..................................................... 54

6.2.8.1. ELECTROTRANSFERENCIA DE 2-DE Y BLOQUEO DE MEMBRANA 54

6.2.8.2. INCUBACIÓN DEL PRIMER, SEGUNDO ANTICUERPO Y REVELADO DE LA MEMBRANA ................................................................................................... 54

6.2.9. ANALISIS POR INMUNOBLOT DE SUEROS DE PACIENTES ................... 55

6.2.9.1. ELECTROELUSIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE 2-DE ................................ 55


5

6.2.9.2. ELECTROTRANSFERENCIA 1-D Y BLOQUEO DE LA MEMBRANA . 55

6.2.9.3. INCUBACIÓN CON SUEROS DE PACIENTES .......................................... 55

6.2.10. ANÁLISIS DE DOBLE DIMENSIÓN E INMUNO-BLOT .......................... 56

6.3. IDENTIFICACIÓN MEDIANTE ESPECTOMETRIA DE MASAS (MS) ....... 56

7. RESULTADOS ................................................................................................................. 57

7.1. CLASIFICACIÓN DE LOS SUEROS ....................................................................... 57

7.2. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Y OBTENCION DE MAPAS PROTEOMICOS ................................................................................................................... 59

7.3. ANALISIS DE MAPAS PROTEOMICOS ................................................................ 60

7.3.1. ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS ......................................... 66

7.4. ENSAYOS DE INMUNO-BLOT BIDIMENSIONALES (3-D) ............................... 66

7.4.1. ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS ......................................... 70

7.5. ENSAYOS DE INMUNO-BLOT 1-D ....................................................................... 71

7.5.1. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS POR INMUNO-BLOT 74

8. DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 78

9. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 83

10. PERSPECTIVAS ........................................................................................................... 84

11. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 85

12. APÉNDICE .................................................................................................................... 91

13. ANEXOS ...................................................................................................................... 106


6

INDICE DE FIGURAS, GRAFICAS Y TABLAS FIGURAS Fig. 1. Etapas características en el desarrollo del cáncer (Tomado de Luque y Herraez 2002). .................................................................................................................................. 18

Fig. 2. Imagen de la mama, en la cual se muestra la estructura anatómica (Tomada de Novartis Oncology). .................................................................................................................. 30

Fig. 3. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa 0 y I del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology). ................................................................................................. 31

Fig. 4. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IIA y IIB del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology). ................................................................................... 32

Fig. 5. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IIIA, IIIB y IIIC del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology) .................................................................................... 33

Fig. 6. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IV del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology). ..................................................................................................... 33

Fig. 7. Toma de una muestra de sangre para la obtención de suero. ................................... 50

Fig. 8. Kit para deplesión de proteínas abundantes (Sigma). ............................................. 51

Fig. 9. Equipo Ettan IPGphor3 donde se realiza la primera dimensión o Isoelectroenfoque. 53

Fig. 10. Equipo para electroforesis Mini-Protean Tetra Electrophoresis System .................. 54

Fig. 11. Imagen de un mapa proteómico perteneciente a un individuo control .................... 60

Fig. 12. Imagen representativa de un mapa proteómico perteneciente un paciente con cáncer de mama. .............................................. 60

Fig. 13. Imagen representativa obtenida de PDQuest advanced V.8.0.1 en la cual se muestra una comparación del gel master (parte superior izquierda) con los mapas proteómicos tanto de individuos sanos (parte superior), como de pacientes con cáncer de mama (parte inferior). .. 60

Fig. 14. A. Imagen en 2D representativa de un individuo sano, con su vista tridimensional (B). C. Imagen en 2D representativa de un paciente con cáncer de mama con su vista tridimensional (D). ....................................................................................................... 63

Fig. 15. A Vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos de un individuo sano y B de un paciente con cáncer de mama. ................................................................. 64

Fig. 16. A Vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos de un individuo sano y B de un paciente con cáncer de mama. ................................................................. 66

Fig. 17. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó un suero de individuo sano. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual fueron transferidas las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot con suero de un individuo sano como primer anticuerpo, en el cual se puede ver claramente que no se encontraron anticuerpos. .............. 68

Fig. 18. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó el suero (108) de un paciente con cáncer de mama en etapa II. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual se transfirieron las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot en el cual es claramente visible la presencia de varios anticuerpos presentes en los sueros con cáncer de mama en etapa II (marcados con flechas). ............................................................................................. 68

Fig. 19. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó el suero (109) de un paciente con cáncer de mama en etapa II. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual se transfirieron las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot en el cual es visible la presencia de anticuerpos en menor número provenientes de los sueros con cáncer de mama en etapa II (marcados con flechas). .................................................................................... 70


7

Fig. 20. Gel bidimensional de poliacrilamida teñido con azul de coomassie, del cual se cortaron las proteínas para ser sometidas al análisis por MS. Puntas de flecha. ................... 70

Fig. 21. Electroforesis unidimensional, se muestra en el gel de poliacrilamida (carril 2) la proteína identificada, aislada de los geles bidimensionales, y caracterizada por MS como A1AT. Presenta un peso molecular aproximado de 50 KDa. MPM carril 1. ....................... 72

Fig. 22. Inmuno-blot 1-D (panel B), se muestra la membrana con la proteína A1AT (carril 2) identificada, aislada de los geles bidimensionales y caracterizada por MS que fue reconocida por mAb-A1AT. Panel A comparación de la electroforesis unidimensional (fig. 19) con el inmuno-blot 1-D. ......................................................................................................... 72 Fig. 23A. Inmuno-blot en 1-D en donde el análisis se realizó con sueros de individuos sanos en la membrana de nitrocelulosa que contenía solamente la proteína A1AT aislada de geles de 2-DE. 23B. Inmuno-blot en 1-D en donde el análisis se realizó con sueros de pacientes con cáncer de mama en etapaII en la membrana de nitrocelulosa que contiene solamente la proteína A1AT aislada de geles de 2-DE……………………………………………………...74 GRAFICAS Gráfica 1. Gráfica de incidencia y mortalidad de los principales tipos de cáncer en mujeres reportados a nivel mundial (Parkin 2002). ...................................................................... 24

Gráfica 2. Grafica del número de incidencias de cáncer de mama a nivel mundial. .............. 24

Gráfica 3. Estadística de incidencia de cáncer de mama en México (SSA). ......................... 25

Gráfica 4. Estadística de incidencia de cáncer de mama en Jalisco (SSA). .......................... 25

Gráfica 5. Representación porcentual de los sueros obtenidos y su clasificación. ................ 57

Gráfica 6. Representación porcentual de la subclasificación de los sueros obtenidos........... 58

TABLAS Tabla 1. Clasificación de los estados BI-RADS ............................................................... 50

Tabla 2. Clasificación del total de los sueros obtenidos para el estudio .............................. 57

Tabla 3. Subclasificacion de los sueros BI-RADS 4-6 ..................................................... 58

Tabla 4. Tabla representativa de la comparacion de mapas proteomicos controles vs cáncer de mama. ......................................................................................................................... 60

Tabla 5. Tabla en la cual se muestra el total de los puntos en los geles (proteinas) que resultaron significativos ................................................................................................ 61

Tabla 6. Resultado del analisis por espectrometria de masas de las proteinas identificadas. .. 70

Tabla 7. Resumen estadistico de las edades de individuios sanos y con cancer de mama. ..... 74

Tabla 8. Resultado de AAT positivos y negativos para ambos grupos encontrados en los ensayos inmunoproteomicos. ......................................................................................... 75

Tabla 9. Resultados para X2 con los positivos y negativos de ambos grupos. ..................... 76

Tabla 10. Resumen estadisticos para X2 ......................................................................... 76

Tabla 11. Resultado de AAT positivos y negativos para ambos grupos encontrados en los ensayos inmunoproteomicos. ......................................................................................... 77

Tabla 12. Porcentaje de deteccion de AATs para ambos grupos ........................................ 77


8

LISTA DE ABREVIATURAS CaMa Cáncer de mama

2-DE Electroforesis bidimensional

SDS Duodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE Sodiun duodecil sulfate poliacrilamide gel electrophoresis

KDa Kilodalton

µl Micro litros

PM Peso molecular

MPM Marcador de peso molecular

IEF Isoelectroenfoque

PI Punto isoeléctrico

IPG Gradiente inmovilizado de pH

MS Espectrometría de masas

WB Western blot

MT Marcador tumoral

IgG Inmunoglobulina tipo G

IgA Inmunoglobulina tipo A

IgM Inmunoglobulina tipo M

IgD Inmunoglobulina tipo D

CEA Antígeno carcinoembrionario

AAT(s) Antígeno(s) asociado(s) a tumor

AHSG Alfa 2 glicoproteína

A1ATP Alfa 1-antitripsina

HER 2 Receptor 2 del Factor de crecimiento Epidérmico Humano

BRCA-1 Breast Cancer 1

BRCA-2 Breast Cancer 2

mAb Anticuerpo monoclonal

ADN Ácido desoxirribonucleico


9

ARN Ácido ribonucleico

CMH Complejo mayor de histocompatibilidad

EGF Factor de crecimiento epidérmico

RMN Resonancia magnética

TAC Tomografía axial computarizada

PET Tomografía por emisión de protones

HRP Peróxidasa de rábano picante

PBS Tampón fosfato salino

H2O2 Peróxido de hidrogeno

PSA Persulfato de amonio

CIBO Centro de Investigaciones Biomédicas de Occidente

INC Instituto Nacional del Cáncer

OMS Organización Mundial de la Salud


10

1. INTRODUCCIÓN

Se ha reportado que más de 11 millones de personas son diagnosticadas con algún tipo de

cáncer cada año alrededor del mundo, sin embargo el cáncer de mama es el más frecuente en

la mujer del mundo occidental, con aumento de su incidencia en los últimos años, sobre todo

en la población más joven (<40 años). En México su aumento ha sido de 2001 a 2011 mayor

al 133% y en caso particular del estado de Jalisco en más de un 142%. (SSA 2011). Existen

aproximadamente más de 100 tipos de cáncer y cada uno de ellos puede presentar diferentes

subtipos (Casal, 2008).

La técnica más útil para el diagnóstico del cáncer de mama es la mastografía y aunque esta ha

contribuido de manera importante a reducir el número de muertes, resulta no ser lo

suficientemente sensible, pues ocurre que durante las primeras etapas (I y II) del cáncer de

mama las pequeñas lesiones de mama (entre 1 a 3 cm) no pueden ser detectables

especialmente en mujeres jóvenes que no pueden ser sometidas de manera frecuente a este

estudio; o en mujeres que presentan tejido mamario denso. El diagnóstico temprano de cáncer

es difícil debido a la ausencia de síntomas específicos en etapas tempranas así como al

limitado conocimiento de la etiología y la oncogénesis. Sin embargo la detección del cáncer de

mama en etapas iníciales contribuye de manera significativa a la disminución de los índices de

morbilidad y mortalidad, esto se traduce en el incremento en la respuesta positiva a los

tratamientos y en un aumento en la calidad de vida para el paciente y su familia. (Michael et

al. 2006).

Ante este reto se han desarrollado nuevas técnicas de investigación que ayudan a buscar y

probar nuevos y mejores métodos de investigación para el diagnóstico, una de ellas es la

proteómica, entendiendo como proteoma al conjunto de proteínas que se obtienen de la

traducción de los genes de un organismo vivo bajo condiciones y tiempos específicos. La

proteómica se constituye como una herramienta valiosa en la búsqueda de biomarcadores

específicos para la detección de un gran número de enfermedades incluyendo el cáncer (Liao

et al. 2008). Actualmente la proteómica se utiliza para describir la totalidad del análisis

funcional de los productos génicos, desde su localización a gran escala o el mecanismo de la

expresión de miles de proteínas simultáneamente hasta el estudio de su dinámica y sus


11

interacciones; por otra parte se le ha dado el término de oncoproteómica al estudio de las

proteínas y sus interacciones con células cancerosas (Cho. 2007, Casal. 2008); así se tiene que

es posible encontrar nuevas moléculas como proteínas marcadoras o indicadoras que revelen

un estadio temprano del cáncer.

La búsqueda de estas proteínas se realiza por medio de técnicas proteómicas e inmuno-

proteómicas la cual viene dada en primer término por la introducción de electroforesis en

doble dimensión (2-DE) y en segundo término por la introducción de espectrometría de masas

(MS) para su identificación, así como las técnicas de Western Blot (Liao et al. 2008).

El suero sanguíneo es una fuente valiosa para la búsqueda de proteínas marcadoras de

procesos fisiológicos específicos. Es fácil de obtener y refleja el estado de salud de un

individuo, ya que las proteínas son secretadas por las células al torrente sanguíneo en

respuesta a un estado fisiológico y/o proceso patológico específico, por lo cual ha sido

ampliamente utilizado para el diagnóstico de diversas enfermedades (Barba et al. 2007). El

suero, contiene varios cientos de proteínas con concentraciones que van de 60-80 mg de

proteína por ml (Marck et al. 2005).


12

2. ANTECEDENTES

2.1.GENERALIDADES.

2.1.1. DEFINICIÓN DE CÁNCER.

De acuerdo a la OMS el cáncer es un término genérico para un grupo de más de 100

enfermedades que pueden afectar a cualquier parte del organismo. Otros términos utilizados

son neoplasias y tumores malignos (OMS 2007).

El cáncer ocurre debido a la proliferación acelerada, desordenada y no controlada de células

dañadas o alteradas a nivel genético, y que además están estrechamente asociadas con defectos

en las proteínas que se encargan de traducir señales, las cuales actúan normalmente

suprimiendo o estimulando la continuidad del ciclo celular, y que pueden pertenecer a

distintos tejidos. Una de las características que define el cáncer es la división rápida de células

anormales que crecen más allá de sus límites normales y pueden invadir zonas adyacentes del

organismo o diseminarse a otros órganos en un proceso llamado metástasis (Stryer et. al.,

2008).

2.1.2. CARACTERÍSTICAS DEL CÁNCER Y CÉLULAS CANCEROSAS

En las células eucarióticas el control de la división celular tiene que estar regulado por la

duplicación de cromosomas, la citocinesis y además los componentes del aparato mitótico se

deben formar y funcionar en el momento adecuado del ciclo celular; así que cuando la célula

alcanza una masa crítica se divide produciendo dos células hijas más pequeñas las cuales en

condiciones apropiadas crecerán y se dividirán. Conforme las células avanzan a través de este

ciclo celular deben tener lugar dos procesos clave, de manera precisa y coordinada: 1) el

material genético debe duplicarse, 2) las dos copias del material genético deben distribuirse

fielmente entre las dos células hijas (Gardner et. al. 2007).

En gran parte el estudio de los factores que llevan a la transformación de una célula normal a

una célula neoplásica ha sido posible gracias al desarrollo de cultivos celulares in vitro. La


13

transformación maligna puede observarse cuando fibroblastos primarios o líneas celulares

inmortalizadas (preneoplásicas, contienen alteraciones en el cariotipo y presentan la enzima

telomerasa) son tratadas con ciertos virus tumorales, o con carcinógenos químicos o físicos. Se

caracterizan por su crecimiento autónomo, sin regulación; dichas células proliferan a alta

densidad celular y a veces en ausencia de factores de crecimiento. Además las células

transformadas son más esféricas y pueden crecer sin adherirse a la matriz celular; la mayoría

de las células transformadas son inmortales. Otra característica importante de las células

cancerosas es su inestabilidad genómica y su heterogeneidad cromosómica dentro un tumor

(Orozco 2000).

La célula cancerosa difiere notablemente de una célula normal en los mecanismos que

bloquean el avance del ciclo celular, es decir; una serie de eventos coordinados que involucran

periodos sucesivos de replicación del ADN y de división celular. En el ciclo celular podemos

distinguir la fase G1 entre la mitosis (o fase M) y la replicación del ADN o fase S,

posteriormente a la fase de síntesis de ADN tenemos la fase G2 y finalmente la fase M. en la

fase G aumenta la masa y volumen celular y se establecen los puntos de bloqueo y control

negativo del ciclo celular; es generalmente en la fase G1 cuando las células detienen su

zproliferación y se retiran del ciclo celular, estas células; ahora en fase G0 pueden iniciar el

proceso de diferenciación celular, lo anterior se puede inducir en células normales carentes de

factores de crecimiento; por el contrario las células transformadas no entran a la fase G0

cuando se eliminan los factores de crecimiento. Dos tipos de proteínas son de gran

importancia en la regulación del ciclo celular: 1) la ciclinas que varían en concentración

durante el ciclo celular y 2) las cinasas dependientes de ciclinas. Los factores de crecimiento

activan la expresión de ciclinas necesarias para la transición entre G1 y S; algunas ciclinas

pueden estar sobre expresadas o alteradas estructuralmente en ciertas neoplasias. Además

algunos genes que codifican inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas pueden estar

dañados en canceres humanos. Si el ADN celular sufre algún daño por algún compuesto

carcinógeno, el ciclo celular se detiene hasta que se repare el daño; si el daño al ADN es muy

grande y no se puede reparar, la célula sufre apoptosis (muerte celular programada). La falta

de apoptosis observada en ciertos tipos de células tumorales parece ser uno de los factores que

se relacionan con su inestabilidad genética, con su resistencia a las drogas quimioterapéuticas


14

y en parte con el crecimiento del tumor. Por lo anterior se sugiere que un defecto en algún

punto de control del ciclo celular tiene un papel importante en la oncogénesis (Orozco 2000).

Otra gran diferencia entre células cancerosas y células normales es el grado de diferenciación

que presentan, la diferenciación se puede definir como la expresión o represión de un conjunto

de genes como resultado de la expresión de un grupo específico de factores de transcripción,

durante la diferenciación terminal las células ya no se dividen y se retiran del ciclo celular,

pero en los canceres no se encuentra un alto grado de diferenciación. La diferenciación celular

es importante ya que de esta se puede inferir el tipo de cáncer que se presenta o se diagnostica,

debido a que el cáncer puede originarse de cualquier tipo de célula y en cualquier tejido se

clasifica en tres subtipos principales:

Sarcomas. Afectan el tejido conectivo como son huesos, cartílagos, nervios, vasos

sanguíneos, músculos y tejido adiposo.

Carcinomas. Afectan a los tejidos epiteliales como la piel, epitelio de los órganos, tejido

glandular de mama y próstata.

Linfomas. Que afectan los tejidos formadores de células sanguíneas, (inflamación de ganglios

linfáticos, invasión del bazo, medula ósea, sobreproducción de células blancas inmaduras)

(Wolfgan 2005).

2.1.3. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN

La transducción de señales permite la comunicación a nivel celular. Las señales van desde los

ambientes extracelulares e intracelulares, así como de otras células. Las células responden a

estas señales en una variedad de formas, principalmente mediante la modificación de los

niveles de proteína, actividades y ubicación. Los niveles de proteína son controlados por las

tasas de transcripción, traducción y proteólisis, mientras que las actividades de las proteínas se

ven afectadas por modificaciones covalentes y las interacciones no covalentes con otras

proteínas y moléculas pequeñas. Las vías de transducción de señales regulan la diferenciación,

división y muerte en los organismos maduros y en desarrollo. Algunas vías son comunes a

todas las células, pero otros son específicos de células especializadas (por ejemplo, la síntesis

y secreción de insulina por el páncreas, la migración y la fagocitosis por los neutrófilos) y el


15

comportamiento anormal de las células enfermas (por ejemplo, la invasión, y el crecimiento de

las células cancerosas). La mayoría de las señales son iniciadas por ligandos y son detectadas

por los receptores a los que se unen. La unión de un ligando a un receptor estimula la actividad

de las proteínas, necesarias para continuar con la transmisión de la señal a través de la

formación de complejos multiproteícos y la generación de pequeñas moléculas de segundos

mensajeros. La integración de las señales de múltiples vías determina la respuesta definitiva de

la célula de competencia y las señales complementarias.

A la vista de su complejidad no es sorprendente que las vías de transducción de señales fallen

a veces causando patologías o enfermedades (Luque et. al. 2002).

2.1.3.1. DESARROLLO DEL CÁNCER

El cáncer se manifiesta de formas variables, ampara más de 100 formas de la enfermedad

dependiendo de las circunstancias, el tipo de cáncer o tejido afectado (incluso dentro de un

mismo tejido se pueden encontrar muchas variedades de cáncer con distintas morfologías y

grados de malignidad), así como de la edad de la persona entre otras. A grandes rasgos su

desarrollo puede agruparse en tres etapas con posibles sub-etapas de difícil delimitación; pero

favorablemente los mecanismos moleculares de las distintas formas de cáncer son similares

(Orozco et. al. 2000).

1. Tumor primario benigno. Llamado tumorogénesis, carcinogénesis tumoral o

transformación neoplásica, es la más estudiada y mejor conocida. Inicia con la llamada

“célula progenitora de cáncer” que surge en un determinado tejido por la mutación de

algún gen, su proliferación da lugar a un clon de células mutadas (clon neoplásico) este

comienzo monoclonal es la primer característica del cáncer. A pesar del origen común las

células del clon inicial se hacen genéticamente distintas por la acumulación de nuevas

mutaciones; así la mutación iniciadora confiere a la célula susceptibilidad tumoral es

decir, una predisposición selectiva para la proliferación desmedida. La acumulación en las

células hijas de sucesivas mutaciones en los genes implicados en el control del ciclo

celular o de apoptosis que favorezcan la proliferación o la inmortalidad conduce

progresivamente a las propiedades genéticas anormales del cáncer.


16

2. Cáncer in situ. Corresponde a la situación en que las células del tumor primario no han

escapado del tejido donde se originaron, ya que el tumor todavía carece de capacidad

invasiva y su pronóstico clínico es en general benigno. Solo resulta grave en aquellos

casos donde, por su localización, afecte a vasos sanguíneos, músculos o nervios críticos.

3. Tumor maligno. Es la etapa que caracteriza y define el cáncer, en esta etapa la célula

neoplasia se convierte en una célula cancerosa aquí ocurre la progresión y propagación del

tumor. A pesar de su trascendencia es la menos estudiada durante los últimos años se le ha

prestado mayor atención y se han llegado a conocer en parte sus aspectos moleculares.

Puede dividirse en varias sub-etapas de difícil clasificación (Luque et. al. 2002).

a. Invasividad o escape celular. Las células constituyentes de tejidos normales se

mantienen doblemente adheridas entre sí por medio de uniones intracelulares y a

uniones de las células con el espacio o matriz extracelular. Esta es una estructura

formada por proteínas fibrosas como colágeno y elastina, las cuales son secretadas

por la propia célula que actúan a modo de soporte. En estas interacciones intervienen

proteínas transmembranales llamadas integrinas; por su dominio intracelular, las

integrinas se unen a los filamentos de actina del citoesqueleto de cada célula mientras

que a través de su dominio extracelular tienen afinidad por proteínas receptoras de

células vecinas (adhesión célula-célula) y por proteínas fibrosas de la matriz

extracelular (adhesión célula-matriz). En el cáncer ambos tipos de adhesión se ven

alterados y como consecuencia la célula puede desprenderse del tejido,

convirtiéndose así en una célula invasora de otros tejidos; esta liberación es

consecuencia también de la acción de enzimas proteolíticas (proteasa) específicas que

destruyen la matriz extracelular. Entre ellas son destacables las metaloproteasas de

matriz extracelular, las cuales degradan casi todos los componentes de la matriz

extracelular por lo que intervienen en procesos fisiológicos de remodelación tisular

tales como desarrollo embrionario, crecimiento óseo y cicatrización. La actividad

proteasa aumenta especialmente en neoplasias malignas, posiblemente como

consecuencia de un aumento en la biosíntesis de estas enzimas.


17

b. Vascularización o angiogénesis. Este proceso consiste en la capacidad de un tejido

para formar una red vascular propia, mediante el desarrollo de nuevos vasos

sanguíneos por mecanismos cuyos detalles se conocen aun de manera incompleta. Por

este mecanismo las células tumorales producen agentes angiogénicos que actúan

sobre células endoteliales vecinas para dar lugar a la formación de una nueva red de

venas, arterias y capilares; ello permite que un tumor crezca mucho y rápidamente al

asegurar la llegada de oxígeno y nutrientes. La vascularización puede favorecer la

migración de algunas células cancerosas al torrente circulatorio para difundirse a

otros tejidos donde generara una metástasis.

c. Formación de tumor secundario o metástasis. Mediante la diseminación celular

las células del tumor primario pueden fijarse en tejidos normales para multiplicarse y

diferenciarse en ellos dando lugar al tumor secundario o metástasis. Esta etapa es de

enorme gravedad clínica y constituye una nota distintiva letal e irreversible del tumor

maligno porque supone la destrucción del tejido sano que rodea a las células

tumorales y por consiguiente la dificultad de su eliminación (Luque et. al. 2002).


18

Fig. 1. Etapas características en el desarrollo del cáncer (Tomado de Luque y Herraez 2002).


19

2.1.4. GENETICA DEL TUMOR

La división celular como todos los demás procesos biológicos están bajo control genético,

ciertos genes deben regular el proceso de división celular en respuesta a señales intracelulares,

intercelulares y ambientales. Estos genes reguladores están indudablemente sujetos a

mutación, como todos los demás genes. Cabría esperar que las mutaciones que suprimen la

función de estos genes reguladores conduzcan a la división anormal de las células, ya sea

incapacidad para dividirse del todo, o la incapacidad de parar la división (Gardner 2007).

2.1.4.1.GENES ASOCIADOS AL CÁNCER (PROTOONCOGENES, ONCOGENES Y ANTIONCOGENES)

Hasta la fecha no se conocen los detalles de cómo la división celular está controlada, ni se han

identificado todos los genes que regulan este proceso. Sin embargo, los estudios recientes de

genes virales denominados oncogenes (del griego onkos, que significa tumor) que pueden

ocasionar la pérdida del control normal de la división celular ha conducido a la identificación

de un conjunto de genes homólogos denominados protooncogenes; estos pueden convertirse

en oncogenes celulares tumorígenos por mutación o asociándose con nuevas secuencias

reguladoras por medio de procesos de recombinación. Por otro lado se tiene la presencia de

genes supresores de tumor los cuales regulan negativamente el crecimiento celular y son

denominados como antioncogenes. El descubrimiento de estos ha permitido explicar el cáncer

a nivel molecular (Wolfgan 2005).

Protooncogenes. Desempeñan funciones importantes para el crecimiento celular, codifican

proteínas muy diversas; como son: 1) factores de crecimiento (c-cis), receptores de factores de

crecimiento (c-fms y c-erbB), 2) los que codifican proteínas que se unen al GPT con actividad

GTPasa (c-H-ras, c-k-ras y N-ras; 3) los que codifican a proteínas cinasas, ya sea proteínas

cinasas específicas para tirosina (c-abl, c-fes, c-gfr, c-fps, c-ros, c-src y c-yes) o a proteínas

cinasas específicas para serina/treonina (c-mil, c-mos, y c-raf) y 4) y proteínas nucleares que

actúan como factores de replicación o de transcripción activando genes importantes en el

crecimiento normal de la célula (c-fos, c-jun, c-erbA, c-myc, y posiblemente c-myb y c-ets);


20

estos son los cuatro grupos en los que se clasifican. Cabe mencionar que los protooncogenes

han sido conservados a través de la evolución (Gardner et. al. 2007).

Oncogenes. Cuando los protoncogenes se alteran molecularmente se transforman en

oncogenes activados, o forma mutada de genes normales. Estas alteraciones se pueden dar por:

mutación, arreglo génico y amplificación génica, y con frecuencia se puede presentar más de

una de estas alteraciones. Las más comunes son translocaciones y mutaciones puntuales; en

otros tipos tumorales como neuroblastomas, cáncer cervico-uterino y mamario, la activación

de protooncogenes se da por amplificación del ADN. La mayoría de estudios sobre oncogenes

provienen de estudios de virus de ARN que inducen tumores, llamados retrovirus, estos

almacenan su información genética en una cadena sencilla de ARN la cual se transforma por

medio de transcriptasa inversa en ADN después de infectar la célula que hospedante. El más

conocido es el Sarcoma de Rous (en pollos) que origina cáncer en los tejidos (sarcoma) y que

además lleva un oncogén activado llamado v-src que induce el cáncer; al suprimir este gen se

origina el mismo modo v-src pero no oncogénico (Stryer et.al. 2008, Wolfgan 2005, Gardner

2007).

Existen más de 100 oncogenes sin embargo solo se mencionaran algunos, como el oncogén c-

myc, ayuda en la transformación celular, su expresión depende de factores de crecimiento;

aumenta durante el ciclo celular por lo que se sugiere puede ser componente de la

proliferación celular normal. También tiene importantes dominios en la región amino-

terminal de sus proteínas N-Myc, C-Myc L-Myc; además myc interacciona con proteínas

como Max para controlar genes inductores de apoptosis. Otro oncogén importante es ras, a

esta familia (Ha-ras, Ki-ras, N-ras) se le caracteriza por el potencial transformante de proteínas

como p21, se sabe que Ras también actúa traduciendo señales del exterior al interior de la

célula. Otro gen de reciente importancia bcl-2 o su proteína Bcl-2 por su sobreexpresión que

confiere resistencia a la apoptosis, su expresión abundante se puede deber a alteraciones en

p53 ya que es la encargada de suprimirlos, bcl-2 actúa sinérgicamente con c-muy en la

generación de células malignas, pero el exceso de Bcl2 puede suprimir la apoptosis inducida

por c-myc por lo que facilita la proliferación celular (Stryer et.al. 2008, Wolfgan 2005,

Gardner 2007).


21

Antioncogenes. Originan la acción contraria a los oncogenes, llamados también genes

supresores de tumor; de manera normal codifica una proteína que detiene la proliferación, o

induce la apoptosis. Una mutación de este gen da lugar al cáncer. Los más estudiados son el

gen retinoblastoma (rb) y el gen p53.

El producto del gen rb 1 es una fosfoproteína nuclear (pRb) cuyo control del ciclo celular es

negativo al unirse a E2F e inactivar la transcripción; pRb está regulada negativamente por

cinasas dependientes de ciclinas (cdks), a su vez estas por reguladores negativos de

proliferación celular. pRb controla el ciclo celular y participa en diferenciación celular de

tejidos, recientemente se ha observado que aumenta la inmunogenicidad, disminuye la

angiogénesis y suprime la invasividad del tumor.

La proteína p53 participa como reparador en dos formas: 1) deteniendo la fase G1, antes de la

división celular, 2) causando apoptosis cuando se ha extendido el daño genético (en este caso

su concentración se mantiene elevada mucho tiempo). Se puede inhibir su función por

deleciones, inserciones y mutaciones puntuales.

Existes otros genes supresores como son p16 que puede ser inactivado en algunos canceres por

metilación de su región promotora. El BRCA1 y BRCA2 que se encuentra en forma aberrante

y predispone al cáncer mamario y el HNPCC que presenta alteraciones en las secuencias

repetidas del DNA y se encuentra en el cáncer colorectal hereditario (Orozco 2000, Luque

2002).

2.1.5. RESPUESTA INMUNE FRENTE AL TUMOR

Observaciones clínicas y experimentales han establecido que aunque las células tumorales se

derivan de células huésped, los tumores desencadenan una respuesta inmune.

En experimentos realizados en ratones a los cuales a los cuales les induce sarcoma por medio

de metilcolantreno, se observó que cuando se trasplanta en otros ratones el tumor crece, sin

embargo al replantarlo nuevamente en el ratón inicial el tumor es rechazado. Por lo que la

inmunología de los tumores implica que células tumorales expresan antígenos que son

reconocidos como extraños por el sistema inmunitario adaptativo y esta respuesta esta

mediada principalmente por linfocitos T. Sin embargo la respuesta inmunitaria no puede

prevenir por completo el crecimiento tumoral debido a que las células tumorales son similares


22

al huésped ya que provienen de estas, por lo que en la mayoría de los tumores solo se

expresan algunos antígenos que pueden ser reconocidos como no propios; por otra parte el

rápido crecimiento y diseminación de los tumores pueden superar la capacidad del sistema

inmunitario. Bajo este conocimiento se han previsto inmunoterapias antitumorales para

tratamiento, potencializando esta respuesta antitumoral (Burnester et.al. 2003).

2.1.5.1. ANTÍGENOS TUMORALES

Se han identificado diversos antígenos antitumorales que pueden ser reconocidos por linfocitos T y

B y que además provocan una respuesta inmunitaria adaptativa (de aquí que se pueden utilizar

como componentes de vacunas, y los anticuerpos generados para la inmunoterapia).

Los antígenos que se expresan en células tumorales pero no en células normales son denominados

Antígenos Específicos de Tumores. Los antígenos tumorales que se expresan también en las

células normales son denominados Antígenos Asociados a Tumores (AATs) son constituyentes

celulares normales cuya expresión es aberrante o está regulada de forma anormal. Existe un método

reciente para la identificación de antígenos tumorales que reconocen específicamente a los

anticuerpos del suero de los pacientes con cáncer denominado análisis serológico de la expresión

del ADN complementario recombinante (SEREX). Existe la posibilidad de que los antígenos

tumorales que son reconocidos por los linfocitos T sean los principales inductores de la inmunidad

antitumoral; porque anticuerpos tumorales no reconocen a los péptidos asociados al CMH (son los

antígenos que reconocen linfocitos T); la mayor parte del conocimiento está limitado a antígenos

que reconocen linfocitos T citotóxicos (CD8), y recientemente se han intentado identificar a los que

son reconocidos por linfocitos cooperadores (CD4). Algunos antígenos tumorales se producen por

mutaciones oncogénicas de los genes normales, estos productos son sintetizados en el citoplasma de

las células tumorales como cualquier otra proteína citosólica por lo que pueden entrar en la vía del

procesamiento de antígenos de clase I, y además en la vía del procesamiento de antígenos de clase

II en células presentadoras de antígenos (que han fagocitado células tumorales muertas). Debido a

que los genes alterados no están presentes en células normales, los péptidos derivados no inducen

autotolerancia y pueden estimular respuestas mediadas por linfocitos T.

Los antígenos tumorales pueden ser sintetizados por genes mutados aleatoriamente y sus

productos no se relacionan con el fenotipo transformado. Actualmente se sabe por los


23

experimentos de sarcomas inducidos que antígenos tumorales son péptidos derivados de

proteínas propias mutadas y que son presentados en forma de complejos peptídicos-MHC de

la clase I capaces de estimular a los linfocitos T citotóxicos. Estos antígenos son muy variados

por lo que los carcinógenos que inducen tumores pueden producir mutaciones de forma

aleatoria en cualquier gen del huésped y la vía presentadora de antígenos del CMH de la clase

I puede presentar péptidos de cualquier proteína citosólica mutada en cada tumor. En el cáncer

humano se ha demostrado que las proteínas mutadas del huésped pueden actuar como

antígenos tumorales (Abbas et.al. 2008).

2.1.5.2. AUTOANTICUERPOS

Son anticuerpos desarrollados por el sistema inmunitario que actúa directamente en contra de

uno o más antígenos del propio organismo. Muchas enfermedades autoinmunes tienen su

etiopatogenia en la sobreproducción de este tipo de anticuerpos, casos típicos son el lupus

eritematoso sistémico y la artritis reumatoide. En el caso de canceres se ha demostrado la

presencia de estos debido a que algunas proteínas pueden presentarse después de la traducción

de forma aberrante (mal plegada, defectos en la glicosilación, fosforilación.) o en una mayor o

menor cantidad de la normal, dando lugar a antígenos que se asocian a los tumores y

originando una respuesta inmune en contra de ellos (Abbas et.al. 2008).

2.2. CÁNCER DE MAMA

2.2.1. DEFINICIÓN

Se le nombra cáncer de mama al crecimiento anormal e incontrolado de las células que forman

los conductos de la mama donde se forma la leche. Los tumores que se originan en este tipo de

tejidos reciben el nombre de carcinomas, este término se aplica a las neoplasias malignas de la

mama que se originan en estirpes celulares de origen epitelial o glandular y no a las que son

generadas por células de estirpe mesenquimal llamados sarcomas (Muñoz et. al. 2007).


24

2.2.2. EPIDEMIOLOGÍA

El cáncer es un problema de salud pública mundial, más de 11 millones de personas son

diagnosticadas cada año y se estima que habrá 16 millones de casos para el 2020 (William,

2007). Ocasiona 7.6 millones de muertes al año, y se tiene un estimado de 11.4 millones de

decesos para 2030 (OMS 2007).

Según lo reportado por (Cancer Stats 2011) entre los diferentes tipos de cáncer existen

diferencias para los dos géneros, en el caso de las mujeres los canceres más frecuentes son:

cáncer de mama, cérvico-uterino, colon, pulmón y estomago (Grafica 1).

A Nivel mundial el cáncer de mama ocupa el primer lugar de ocurrencia dentro de las

neoplasias malignas. Anualmente se reportan en Europa alrededor de 150 mil casos, en USA

cerca de 200 mil y en México 8 mil (Parkin 2002).

Gráfica 1. Gráfica de incidencia y mortalidad de los principales tipos de cáncer en mujeres reportados a nivel mundial (Parkin 2002).

Gráfica 2. Grafica del número de incidencias de cáncer de mama a nivel mundial.


25

Series10

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

3,3914,076 4,223 4,462

5,2726,162

7,4608,032 7,989 8,153

9,347 9,565

Casos de cáncer en México

0

500

1000

1500

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

153

795

400548

806704

920 906789

10431132

1301

Casos de cáncer en Jalisco

En México el cáncer de mama es un problema de salud importante, representa la segunda

neoplasia más frecuente en la mujer, pero en los últimos años se han incrementado el número

de casos, superando al cáncer cérvico-uterino (Revista de epidemiologia SSA 2001-2012).

Durante los últimos 9 años el incremento de casos de cáncer de mama ha sido mayor a 200%

En Jalisco el número de casos a partir de 2001 hasta 2010 ha aumentado de 153 casos a 1043

es decir que representa casi un 700% estos datos pueden dar una idea alarmante de este rápido

incremento.

Gráfica 3. Estadística de incidencia de cáncer de mama en México (SSA).

Gráfica 4. Estadística de incidencia de cáncer de mama en Jalisco (SSA).


26

2.2.3. FACTORES DE RIESGO

Se reconocen varios factores de riesgo para que una mujer pueda o no desarrollar cáncer de

mama. Sin embargo en la mayoría de las mujeres afectadas no es posible identificar factores

de riesgo específicos. Los antecedentes familiares de cáncer de mama multiplican el riesgo por

dos o tres. Algunas mutaciones, sobre todo en los genes BRCA1, BRCA2 y p53, se asocian a

un riesgo muy elevado de ese tipo de cáncer. Sin embargo, esas mutaciones son raras y

explican solo una pequeña parte de la carga total de cáncer mamario (IARC 2008, Lacey et. al.

2009).

El cáncer de mama es un tumor hormonodependiente, por lo que cualquier factor que aumente

la exposición a estrógenos, va aumentar el riesgo de padecer cáncer de mama. Entre estos

factores encontramos los factores reproductivos asociados a una exposición prolongada a

estrógenos endógenos, como: menarquia precoz, menopausia tardía, primer embarazo tardío

(si ocurre es después de los 30 años aumenta el riesgo 2-5 veces con respecto a las que tienen

el primer embarazo antes de los 20 años), por lo que figuran entre los factores de riesgo más

importantes; la no lactancia y nuliparidad (1.5 veces) también presentan un factor. La

hormonoterapia sustitutiva parece tener un riesgo asociado de 1.3. No existen estudios

definitivos con respecto al papel de los anticonceptivos orales. Las hormonas exógenas

parecen tener efectos, por lo que las usuarias de anticonceptivos orales y de tratamientos de

sustitución hormonal pueden tener un riesgo asociado (de 1.3 en el caso de la

hormonoterapia), que las mujeres que no usan esos productos. (IARC 2008, Lacey et. al.

2009).

Danaei y colaboradores (2005) calcularon la contribución de diversos factores de riesgo

modificables, exceptuando los factores reproductivos, a la carga global de cáncer de mama.

Los autores concluyen que el 21% de todas las muertes por cáncer de mama registradas en el

mundo son atribuibles al consumo de alcohol, el sobrepeso u obesidad, y la falta de actividad

física. Esa proporción fue mayor en los países de ingresos altos (27%), y el factor más

importante fue el sobrepeso y la obesidad. En los países de ingresos bajos y medios, la

proporción de cánceres de mama atribuibles a esos factores de riesgo fue del 18%, y la falta de

actividad física fue el factor determinante más importante (10%).


27

La diferente incidencia del cáncer de mama en los países desarrollados y los países en

desarrollo puede explicarse en parte por los efectos de la alimentación, aunados a la mayor

edad del primer embarazo, el menor número de partos y el acortamiento de la lactancia (Peto,

2001). La creciente adopción de modos de vida occidental en los países de ingresos bajos y

medios es un determinante importante del incremento de la incidencia de cáncer de mama en

esos países. La exposición a agentes químicos o carcinógenos tanto en el trabajo como en el

ambiente. En el tabaco se han encontrado más de 50 agentes carcinógenos, los epidemiólogos

indican que el 30% de las muertes se debe al hábito de fumar; sin embargo este hábito

conjuntamente afecta a las personas expuestas al humo de los fumadores (fumadores pasivos).

En algunos alimentos y en el aire de algunas ciudades también se han detectado algunos

carcinógenos (Orozco et. al. 2000).

Sin embargo el factor de riesgo principal del cáncer de mama es la edad; la mayoría de los

cánceres de mama ocurren en mujeres de más de 50 años y las mujeres de más de 60 años son

las que presentan el riesgo más elevado (INC 2008).

2.2.4. BIOLOGÍA DE LA MAMA

La mama es una estructura llamada “glándula” de origen ectodérmico y constituye la

característica fundamental de los mamíferos, su función es la de alimentar a sus crías con el

producto de su secreción (leche); esta glándula esta fija a la piel, es la que le da forma y la

sujeta; está situada en la parte anterior del tórax y puede extenderse en medida variable por su

cara lateral. La mayor parte de la masa de la mama está constituida por tejido glandular y

adiposo. Durante el embarazo y la lactancia el tamaño de la mama aumenta debido al

crecimiento del tejido glandular. Está formada por un conjunto de quince a veinte lóbulos, que

a su vez forma lobulillos los cuales están formados por un promedio diez a cien acinos

(estructurados por células de secreción láctea), se encuentran unidos entre sí por tejido

conectivo; y su función principal consiste en producir leche durante el periodo de lactancia.

Estos lóbulos y lobulillos están unidos por una serie de conductos mamarios denominados

“ductos o conductos galactóforos” revestidos por epitelio cuboideo o cilíndrico los cuales

terminan en el pezón, así mismo la mama contiene vasos sanguíneos cuya función consiste en


28

proporcionar sangre a la glándula y a los vasos linfáticos encargados de recoger la linfa que

confluyen en pequeñas formaciones denominadas ganglios linfáticos. Aunque la anatomía de

la mama es similar en todos los casos su consistencia y volumen puede variar mucho de una

mujer a otra debido a la proporción de tejido graso que rodea a la glándula mamaria. Por otro

lado desde el nacimiento hasta la edad adulta experimenta cambios; durante la pubertad crece

hasta adquirir su tamaño definitivo, luego en la edad reproductiva sufre cambios temporales

debido a los ciclos menstruales; durante la menopausia los niveles hormonales descienden lo

que provoca que gran parte de la glándula mamaria se atrofie y sea sustituida por grasa. Sin

embargo el cambio más grande que puede presentar es durante el embarazo y la lactancia,

pues durante este periodo el tejido glandular se activa para producir la leche, de manera que la

mama puede llegar a duplicar su volumen con gran facilidad, pero al término de este periodo

también puede llegar a sufrir una atrofia súbita que le suponga una pérdida de volumen incluso

menor al tamaño inicial (Masiá et.al. 2009).

2.2.4.1. FISIOLOGÍA DEL CANCER DE MAMA

La variante más habitual del cáncer de mama es la que se inicia en las células epiteliales de los

conductos galactóforos. Cuando el cáncer progresa rompe la membrana basal, invadiendo

ductos, lóbulos adyacentes y grasa mamaria, llegando a los ganglios linfáticos intramamarios e

invadiendo la pared de los vasos. Puede extenderse infiltrando y ulcerando piel y pezón,

afectando los linfáticos subdérmicos, produciendo la llamada piel de naranja. En profundidad

puede afectar la fascia del pectoral y la pared torácica. La tasa de crecimiento del tumor es

constante desde el inicio, y se estima una media de 5 años hasta que se hace el tumor palpable.

La localización más frecuente es en el cuadrante supero-externo (48%), seguido de

retroareolar (17%), supero-interno (15%) e inferiores (17%). Su incidencia es algo superior en

la mama izquierda que en la derecha. Un 3% presentan afectación multicéntrica o masiva de la

mama (Fig. 2) (NBCO 2009).


29

2.2.4.2. CLASIFICACIÓN DE CÁNCER DE MAMA

Existen diferentes tipos de cáncer de mama, cada uno recibe el nombre de la parte de la mama

en la que comienzan a desarrollarse las células cancerosas. El carcinoma ductal es el tipo más

común. Comienza en las células de los conductos. El carcinoma lobular es otro tipo de cáncer

de mama que comienza en los lóbulos y lobulillos (donde se produce la leche). Si el tumor

permanece dentro del conducto o lobulillo, se lo conoce como carcinoma in situ; el tumor que

se disemina fuera del conducto o lobulillo se conoce como carcinoma infiltrante o invasivo.

Carcinoma ductal in situ. Es el diagnóstico clínico más temprano que se puede hacer

del cáncer de mama y con frecuencia se diagnostica con una mamografía de detección

que revela pequeñas áreas de calcificación en el seno. Se origina en las paredes de los

conductos mamarios, es un cáncer muy localizado que no es capaz de producir

metástasis aunque es agresivo localmente, puede extirparse fácilmente. Raramente las

pacientes sospechan que tienen cáncer de mama. Si este tipo de cáncer no recibe

tratamiento, aproximadamente el 30 por ciento de las pacientes desarrollarán cáncer de

mama invasivo en un promedio de 10 años a partir del diagnóstico inicial, pero si es

tratado casi todos las estudios señalan que se tiene una tasa de curación del 98-99%.

(NBCO 2009; Masiá 2009)

Fig. 2. Imagen de la mama, en la cual se muestra la estructura anatómica (Tomada de Novartis Oncology).


30

Carcinoma ductal infiltrante. Es el cáncer de mama invasivo más común, y

representa el 80 por ciento de los casos. La forma característica del carcinoma ductal

infiltrante es un bulto muy duro que tiene bordes irregulares y parece estar anclado en

los tejidos circundantes. Se inicia en el conducto mamario pero logra atravesarlo y

pasar a los tejidos de la mama. Es posible que la piel que cubre la zona, o que el pezón

se retracte (NBCO 2009; Masiá 2009).

Carcinoma lobular in situ. Se origina en los lóbulos y su diagnóstico es controvertido

ya que se considera que el carcinoma lobular in situ es un indicador de mayor riesgo de

desarrollar cáncer de mama invasivo, pero es posible que no sea un precursor directo

del mismo. Esta anomalía por lo general está ampliamente distribuida en toda la mama

y con frecuencia se presenta en ambos senos de manera simultánea. (NBCO 2009)

Carcinoma lobular infiltrante. Este tipo de cáncer representa aproximadamente el 10

por ciento de todos los cánceres malignos invasivos es muy parecido al carcinoma

ductal infiltrante excepto que este se encuentra en el lóbulo. Se presenta con mayor

frecuencia en mujeres de entre 45 y 56 años de edad. El tumor crece en la última parte

de los lóbulos donde se produce la leche. Por lo general no aparece en las mamografías

por lo que es difícil diagnosticarlo, esto debido a sus características pero al tocarlo

podría sentirse como un engrosamiento del cuadrante superior exterior del seno (desde

el pezón hasta la axila) a medida que va infiltrando las paredes de los lóbulos. (NBCO

2009; Masiá 2009)

Finalmente existen otros tipos de cáncer de mama poco común:

Carcinoma inflamatorio. Involucra la piel del seno. Este tipo de cáncer representa

menos del 4 por ciento de todos los cánceres de mama que se diagnostican cada año. Sin

embargo se comporta de forma agresiva y crece con rapidez, los síntomas físicos del

carcinoma inflamatorio incluyen enrojecimiento de la piel del seno y una hinchazón

general del mismo. En algunos casos es posible que esté presente también un bulto o

masa. (NBCO 2009; Masiá 2009)


31

Enfermedad de Paget. Afecta la piel del pezón y/o la areola con una apariencia de

eccema. Esta enfermedad puede estar asociada o no a un carcinoma ductal, pero tiene

incidencia muy baja; es menor al 1% de los cánceres de mama (Masiá 2009)

2.2.4.3. ETAPAS DE CÁNCER DE MAMA

Los oncólogos clasifican y diagnostican el cáncer de acuerdo a sus etapas, sin embargo para

determinar cada etapa del cáncer de mama se consideran tres factores importantes de su

desarrollo.

1. Tamaño del tumor. El tamaño de un tumor primario es una de las principales

características de diferenciación.

2. Estado ganglionar. Si hay presencia o ausencia de células cancerosas en los ganglios.

3. Metástasis. Si es que el cáncer se ha difundido desde la mama afectada hasta otra zona del

organismo como son tejido blando (mama opuesta, ganglios linfáticos lejanos o piel),

hígado, pulmones, cerebro y huesos.

Etapa 0

El carcinoma ductal o lobular in situ es el cáncer de mama muy temprano que no se ha

diseminado fuera del conducto o lobulillo.

Etapa I

El tumor mide dos centímetros o menos y no se ha diseminado fuera de la mama (Fig. 3).

Fig. 3. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa 0 y I del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology).


32

Etapa IIA

El tumor mide dos centímetros o menos y se ha diseminado a los ganglios linfáticos axilares, o

mide de 2 a 5 centímetros pero no se ha diseminado a los ganglios axilares

Etapa IIB

El tumor mide de 2 a 5 centímetros y se ha diseminado a los ganglios linfáticos axilares, o

mide más de 5 centímetros y se encuentra únicamente en la mama (Fig. 4).

Etapa IIIA

No se encuentra tumor en la mama pero se ha diseminado a los ganglios linfáticos axilares que

están adheridos entre sí a otras estructuras, o el tumor mide 5 centímetros o menos y se ha

diseminado a los ganglios linfáticos axilares que están adheridos entre sí a otras estructuras, o

el tumor puede medir más de 5 centímetros y se ha diseminado a los ganglios linfáticos

axilares que pueden estar adheridos o no a otras estructuras.

Etapa IIIB

El tumor se ha diseminado a tejidos cercanos a la mama, ya sea la piel o la pared torácica

incluidas las costillas y músculos del tórax; y puede haberse diseminado a los ganglios

linfáticos dentro de la zona de la mama o debajo del brazo.

Fig. 4. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IIA y IIB del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology).


33

Etapa IIIC

El tumor se ha diseminado a los ganglios linfáticos debajo de la clavícula y cerca del cuello, y

puede haberse diseminado a los ganglios linfáticos de la zona de la mama o debajo del brazo y

a los tejidos cercanos de las mama (Fig. 5).

Etapa IV

Ocurre metástasis es decir que el tumor se ha diseminado a otros órganos del cuerpo, con más

frecuencia a los huesos, pulmones, hígado o cerebro (Fig.6).

Fig. 5. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IIIA, IIIB y IIIC del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology)

Fig. 6. Imagen de la mama, en la cual se muestra la etapa IV del cáncer de mama (Tomada de Novartis Oncology).


34

2.2.4.4. PROTEÍNA ASOCIADA AL CÁNCER DE MAMA

Receptores de estrógeno. Las hormonas estrógeno cumplen una función vital en la fisiología

reproductiva, ya que al unirse a sus receptores dentro de las células estimula el crecimiento y

la diferenciación celular (factores de crecimiento epidérmico o EGF), desencadenando la

proliferación de células que recubren las glándulas mamarias y preparándolas para producir

leche durante el embarazo. De igual manera promueve la proliferación de las células que

forman el revestimiento interior o endometrio, del útero, con lo que lo dispone para la posible

implantación del embrión. Los receptores de estrógeno son factores de transcripción ligando-

dependientes que se unen como homodímeros a sitios específicos de unión simétrica del ADN;

las interacciones ejercidas por el dominio de la proteína controlan la actividad del receptor.

Receptores inactivos se conservan en el citosol y son capaces de entrar en el núcleo solo

después de la unión del ligando y un posterior cambio conformacional. Al modular la

actividad de los factores de transcripción los estrógenos estimulan la proliferación celular.

Desafortunadamente y a pesar de los efectos benéficos importantes, también ocasiona daño.

Durante cada ciclo menstrual el estrógeno en condiciones normales desencadena la

proliferación celular que forma el revestimiento interior de las glándulas mamarias; si el

embarazo no ocurre los niveles de estrógeno disminuyen dramáticamente al final de cada

ciclo, en ausencia de estos las células de las glándulas que han proliferado se deterioran y

mueren; esto significa cientos de ciclos de división y muerte celular repetida en un periodo de

vida ocasionando un riesgo para la proliferación de células anormales o dañadas (Molina

2001, Márkes 2002, Wolfman 2005)

2.2.5. DIAGNOSTICO DEL CANCER DE MAMA

La mejor arma en la lucha contra el cáncer de mama es la detección temprana del tumor ya

que aumentarán las posibilidades de éxito del tratamiento, pues los oncólogos afirman que

puede ser hasta un 100% curable. Existen diferentes técnicas para su detección aunque

lamentablemente no son 100% efectivas. Estas son algunas de las principales con las que se

cuentan:


35

Autoexploración o tacto. Esta técnica es de las primeras medidas y consiste en la

propia observación y palpación del seno, sirve para determinar la presencia de

alguna alteración en forma o tamaño normal del pecho.

Exploración clínica. La exploración clínica, incluye la inspección y

palpación tiene una especificidad de 90%, sin embargo muchos cánceres podrían

pasar inadvertidos al tener una sensibilidad entre el 40 y el 70%. Es útil con el

complemento de la mamografía para aquellas lesiones sin calcificaciones,

imperceptibles para el estudio radiológico o para detectar los tumores que aparecen

en el intervalo entre mamografías. El valor predictivo positivo oscila entre el 4 y el

50%. (Kösters. 2003).

Radiografía o Rayos X. Es una prueba sencilla de radiografía para observar si

existe alguna anomalía que deba ser considerada.

Mastografía. Esta técnica ha sido y sigue siendo una de las pruebas más eficaces

para el diagnóstico, el mastógrafo emplea rayos X de baja potencia; se realiza a

mujeres mayores de 40 años, la sensibilidad es aproximadamente del 70-80% y su

especificidad se encuentra alrededor del 5% -10%, (Chapman et. al. 2007); sin

embargo el valor predictivo de la mastografía disminuye cuando los pacientes

presentan tejido mamario denso, lesiones pequeñas y en mujeres pre-menopaúsicas

(Elmore et al. 2005), de igual manera cabe mencionar que estos porcentajes

dependen en gran medida del personal que opera e interpreta los resultados.

Biopsia. Es el diagnóstico definitivo que confirma el cáncer de mama esta prueba

consiste en tomar una muestra del tejido afectado para realizarle un análisis

histológico; la biopsia se puede realizar a través de diferentes pruebas según el tipo

de tumor y su localización (Muñoz et. al. 2007), las más comunes son:

a. Punción con aguja fina. Se realiza una pequeña punción de la masa tumoral a

través de la piel con una aguja finísima, suele realizarse de forma ambulatoria y

sin necesidad de anestesia.


36

b. Biopsia con aguja gruesa. La punción se realiza con una aguja de mayor calibre

permitiendo obtener muestras de mayor tamaño y con mayor facilidad.

c. Biopsia abierta quirúrgica. Se extrae un fragmento del tejido tras realizar una

incisión en la mama.

Existen también algunas otras técnicas a las que no todas las mujeres pueden tener acceso por

ser demasiado costosas, como lo son:

Ecografía de mama. Esta técnica es complementaria, se realiza por medio de un

aparato que emite ultrasonidos los cuales terminan transformándose en imágenes.

Resonancia magnética nuclear (RMN). Es una técnica de imágenes muy

sofisticada se emplean ondas magnéticas para crear imágenes altamente precisas en

el interior de la mama, y aunque detecta con mucha exactitud también puede llegar

a confundir lesiones benignas con cáncer (NCCN 2007).

Tomografía axial computadorizada (TAC). Esta técnica obtiene imágenes

mediante rayos X que permiten el estudio de todo el cuerpo con gran facilidad, se

le usa mayormente para observar hasta qué punto se ha extendido el cáncer de

mama y diagnosticar posibles metástasis (Esserman et. al. 2007).

Tomografía por emisión de positrones (PET). Esta herramienta es de las más

sofisticadas y solo se indican en casos muy específicos, consiste en utilizar radio-

fármaco capaz de fijarse en zonas cancerosas, y para localizar posibles metástasis

que no se pueden detectar mediante otras técnicas (SIGN 2005).

Marcadores tumorales. Permiten detectar la actividad del tumor y las posibles

metástasis a distancia, ya que al ser sustancias que segrega el metabolismo del

tumor se pueden encontrar en la sangre y orina del paciente (INC 2007).


37

2.3. MARCADORES TUMORALES

Las transformaciones de una célula normal a una célula cancerosa se relacionan con la

alteración de los genes encargados de la regulación y expresión de proteínas (Tzu-Chia Lai et

al. 2010). Por lo que el entendimiento de esta relación contribuye al estudio de nuevas técnicas

de diagnóstico, como es el caso de marcadores tumorales; así mismo los avances de la biología

molecular han permitido descubrir nuevos marcadores que ya se han incorporado a la práctica

clínica y que brindan una importante información acerca del comportamiento biológico del

tumor.

2.3.1. DEFINICIÓN

Un biomarcador es una molécula biológica que "marca" o indica los cambios que pueden ser

medibles y/o detectables, ya sean bioquímicos, fisiológicos o morfológicos asociados a una

enfermedad o patología.

Los marcadores tumorales (MT) son indicadores bioquímicos de la presencia de un tumor.

Incluyen antígenos de superficie celular, proteínas citoplasmáticas, enzimas y hormonas. En la

práctica clínica el término se utiliza referido a moléculas que pueden ser detectadas en plasma,

fluidos corporales, tumores sólidos, células tumorales circulantes, ganglios linfáticos y médula

ósea (Coronato et. al. 2002).

2.3.2. CLASIFICACIÓN

En los últimos años se ha ampliado el espectro de marcadores en cáncer de mama, debido a los

avances de la biología molecular que está estudiando a profundidad los eventos de la

carcinogénesis, la progresión tumoral y los mecanismos de producción de la metástasis. Estos

marcadores pueden clasificarse en base a sus características biológicas (Coronato et. al. 2002):

Marcadores de proliferación: están presentes en determinadas fases del ciclo

celular. Factores de crecimiento y hormonas: estimulan el crecimiento tumoral.

Receptores: su sobreexpresión o su presencia alterada puede estar presente en

algunos tipos de células tumorales.

Receptores para estrógenos (RcE): cuya presencia es indicadora para asentar

una terapia hormonal.


38

Angiogénesis y factores del microambiente: favorecen la progresión de la

neoplasia.

Moléculas de adhesión y expresión de proteasas: permiten la invasión y la

metástasis.

Oncogenes y genes supresores: su amplificación o sobrexpresión se asocia con

la desregulación del crecimiento y la apoptosis.

Proteínas inducidas por estrógenos.

Mucinas: su detección en la circulación se utiliza como índice de enfermedad.

2.3.3. MARCADORES TUMORALES DE CÁNCER DE MAMA

Se han establecido algunos marcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos que han

contribuido de manera importante al diagnóstico y tratamiento; dentro de estos se han

reportado biomarcadores de tipo genético para cáncer de mama como HER-2 (Receptor 2

del factor de crecimiento epidérmico humano), es una proteína la cual participa en el

crecimiento normal de las células y es encontrada en altas concentraciones ante la presencia de

un tumor, este proto-oncogén se sobre-expresa aproximadamente en 20-25% de los casos de

cáncer de mama primario frecuente mente en carcinoma in situ, y además tiene un pronóstico

desfavorable, se le relaciona con un estado agresivo del mismo, así como con presencia de

ganglio positivos (Tanja Fehm et. al. 2007). Los biomarcadores genéticos BRCA-1 y BRCA-2

se han encontrado en mujeres con riesgo de predisposición hereditaria a padecer la

enfermedad, se ha observado que se encuentra presente entre el 5-10% de los casos que se

diagnostican; codifican fosfoproteínas nucleares que interactúan con múltiples procesos

biológicos incluyendo fundamentalmente reparación del ADN dañado, regulación de la

transcripción, duplicación del centrosoma y regulación negativa del ciclo celular. Por lo tanto

funcionan como activos inhibidores de la progresión neoplásica (Laronga et. al. 2007). Las

mutaciones de BRCA-1 están asociadas a aparición de cáncer de mama en mujeres entre 40 y

50 años y también con el riesgo de padecer otros tumores, por ejemplo de ovario. Las

mutaciones de BRCA-2 están asociadas a la aparición de cáncer a edades más avanzadas, entre

60 y 70 años, y en la población en general con la predisposición de padecer cáncer de mama

en varones, de ovario, vejiga, próstata y páncreas (Lee et. al. 1999).


39

El oncogén p53 el cual es un gen supresor de tumor cuya función es eliminar e inhibir la

proliferación anormal de las células, en situaciones normales se encuentra en bajos niveles,

pero en situaciones tumorales se ve sobre expresado, debido a que es un factor de

transcripción y que regula la transcripción de un conjunto de genes que son clave para generar

tumores, no solamente se encuentra presente en neoplasias de mama sino que está presente en

distintos tipos de cáncer. Basados en este tipo de receptores o moléculas, el cáncer de mama

puede diferenciarse en varios tipos, como HER2/neu positivos, se encuentran aquellos que

permiten la reclasificación de cáncer de mama: receptor de estrógenos (RE), receptor de

progesterona (RP) y HER/neu; un tercer grupo de cáncer que no se encuentra o se clasifica

dentro de estos tres grupos y que por ello se han denominado triple negativo y los cuales

presentan la peculiaridad de ser más agresivos y para los cuales no existen tratamientos

específicos (Awadallah et. al. 2004).

En la mayoría de los casos, el cáncer solamente puede ser diagnosticado mediante una biopsia

(la cual consiste de extraer algunas células del tumor para que puedan ser analizadas mediante

pruebas inmunohistoquimicas y verse por medio de un microscopio si son o no cancerosas).

Este tipo de marcadores tumorales pueden ser útiles para determinar si el cáncer es probable.

Y si el cáncer ya se encuentra propagado al momento de su detección, los marcadores

tumorales pueden servir así mismo para determinar en dónde se originó (Desmetz et. al.

2009).

2.3.3.1. ANTÍGENOS ASOCIADOS AL TUMOR (AATs) EN CÁNCER DE MAMA

Por los motivos descritos en el párrafo anterior, identificar marcadores tumorales específicos

y que sean capaces de provocar una respuesta inmune temprana en contra del tumor, parece

ser una condición ideal para el diagnóstico temprano en el cáncer de mama.

Se ha reportado en la literatura Autoanticuerpos o Antígenos Asociados a Tumor (AATs).

Los tumores expresan una gran variedad de proteínas que son aberrantes o están reguladas en

forma anormal, por lo que son capaces de producir una respuesta inmune; estudios han

demostrado que la presencia de estos AAT puede surgir meses o incluso años antes del

diagnóstico clínico de un tumor (Tong et. al. 2009, Chapman et al. 2007), y por consiguiente,

en el suero se puede encontrar la presencia de estos AAT (Pereira-Faca SR et. al. 2007).


40

A la fecha se ha reportado que proteínas como CA27.29, CA15.3 y MUC1 se alteran durante

cambios malignos en las glándulas mamarias por la acción de glicosilación (adición de

carbohidratos a la proteína) o incrementando su expresión; sin embargo no es específica para

cáncer de mama ya que una proporción de pacientes con neoplasia de próstata, ovario y

páncreas también presentan elevación en los niveles de esta mucina. El 50% de las pacientes

de cáncer de mama en estadio IV y entre el 10 y 20% en estadio II, presentan valores elevados

en alguna de estas proteínas, tiene un 23% de sensibilidad y un 69 % de especificidad para

cáncer de mama, (Kirmiz et. al. 2006). La presencia de anticuerpos contra el proto-oncogén c-

erbB-2/HER2/neu, solo se ha visto en el 11% de los casos (Disis & Cheever 1997). El

antígeno carcinoembrionario (CEA) sólo ha sido descrito para la detección o el monitoreo de

un estado avanzado del cáncer (Park et al. 2008). Se ha observado la presencia de

autoanticuerpos anti-p53 en el 15% de los pacientes con cáncer de mama (Lenner et. al.1999;

Soussi et. al. 2000). Actualmente se han reportado anticuerpos contra ciclofilina A, que

pertenece a un grupo de proteínas con actividad peptidil-prolil cis-trans isomerasa (PPIA),

identificado como receptor intracelular para la ciclosporina A. La formación de auto-

anticuerpos en pacientes con cáncer de mama es del 80%. TPI (triosa fosfato isomerasa) es

una enzima de expresión ubicua en tejidos con alta actividad glucolítica, de igual manera se ha

reportado la formación de autoanticuerpos en el 90% de los pacientes con cáncer de mama

(Desmetz et. al. 2009; Tamesa et. al. 2009). FKBP52 es una proteína de unión de la familia de

las inmunofilinas, estas proteínas están involucradas en la regulación de la respuesta inmune y

en procesos celulares básicos como el plegamiento de las proteínas. Es una proteína es una

prolil cis-trans isomerasa y se le relaciona con el cáncer de mama, el 72.8% de los pacientes

generen auto-anticuerpos contra FKBP52 esto debido a que se asocia con dos proteínas de

choque térmico (Hsp90 y Hsp70) desempeñando un una función en el tráfico intracelular de

hormonas esteroideas. La peroxirredoxin 2 o PRDX2 es una enzima perteneciente la familia

de los antioxidantes de peroxirredoxina, las cuales reducen el peróxido de hidrógeno y los

hidroperóxidos de alquilo. Esta enzima tiene una función protectora antioxidante en las células

y contribuye con la actividad antiviral de las células T CD8(+). Puede tener un efecto de

proliferación en el desarrollo del cáncer, se reportado que el 64.9% de pacientes presentan

auntoanticuerpos contra esta proteína (Desmetz et. al., 2009). De igual manera se han

reportado anticuerpos contra 2-HS Glycoproteina (AHSG) los cuales están presentes en un


41

79% de pacientes con cáncer de mama (Kyo Yi et. al. 2009). Se ha sugerido que esta proteína

tiene actividad biológica como antagonista del factor de crecimiento transformante β1; está

asociado con la progresión de tumoral así como inmunosupresor hospedero. AHSG bloquea el

factor de crecimiento transformante β1 uniéndose a los receptores celulares de superficie y

suprime la señalización del factor de crecimiento transformante β. Desde este punto de vista la

formación de autoanticuerpos puede neutralizar la función de AHSG que normalmente

suprime la progresión del cáncer de mama (Kyo Yi et. al. 2009).

2.4. PROTEÓMICA

Las proteínas son lo que se podría llamar los arquitectos de la vida, pues son cruciales en los

procesos celulares de todos los seres vivos. Las proteínas están implicadas en la catálisis de las

reacciones químicas celulares, en el transporte de moléculas, transducción de señales, la

segregación del material genético, la producción y el manejo de energía. El trabajo celular

vital necesita de muchos tipos diferentes de proteínas.

La proteómica es la nueva etapa en la investigación biológica que emana naturalmente como

continuación de la genómica; pero vinculada fuertemente a esta, la genómica y los genomas

no responden de qué manera se da el funcionamiento del organismo, mientras que el genoma

de un individuo permanece constante a lo largo de su vida, el proteoma es dinámico y

cambiante, según la edad, condición y tipo celular entre otros; por lo tanto es necesario

estudiar las proteínas (Mojica et. al. 2003).

2.4.1. DEFINICIÓN

La proteómica es el estudio y caracterización del todo el conjunto de proteínas expresadas de

un genoma (proteoma). Puede definirse como el estudio sistemático de secuencias de

proteínas, su expresión, cantidad, isoformas, estado de modificación postraduccional,

interacción con otras proteínas, actividad bioquímica, función celular, localización subcelular

y estructura en algún momento dado de algún tipo de célula. Por otra parte se le ha dado el

término de oncoproteómica al estudio de las proteínas y sus interacciones con células

cancerosas (Cho. 2007).


42

2.4.2. TÉCNICAS DE ESTUDIO Y CLASIFICACIÓN

El proteoma de una célula varía según el estado en el que se encuentre la célula, si se encuentra

en una situación de estrés, bajo el efecto de fármacos o de una hormona. Así, en cada momento

y en cada tipo celular el perfil de proteínas expresadas será diferente. Las técnicas de la

proteómica abordan el estudio de este conjunto de proteínas. La Proteómica permite identificar,

categorizar y clasificar las proteínas con respecto a su función y a las interacciones que

establecen entre ellas. De este modo, se pueden caracterizar las redes funcionales que establecen

las proteínas y su dinámica durante procesos fisiológicos y patológicos. La proteómica se está

aplicando en la identificación de nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades, la

identificación de nuevos fármacos, la determinación proteínas involucradas en al patogenia de

enfermedades y el análisis de procesos de transducción de señales (BioMol 2007).

La proteómica puede ser clasificada de varias formas, de acuerdo con el interés del

investigador:

a) Proteómica de expresión. Es el estudio cualitativo y cuantitativo de las proteínas en

procesos biológicos complejos que involucran cambios en su expresión. Se puede comparar

la expresión del proteoma completo o subproteomas para identificar proteínas nuevas o que

aumenten su expresión, que a su vez pueden ser etiquetadas como biomarcadores específicos

de una enfermedad. b) Proteómica estructural. Mapear la estructura de los complejos

proteínicos o de las proteínas presentes en organelos celulares específicos. Identificar todas las

proteínas que forman un complejo proteínico u organelo como el núcleo o la mitocondria;

determinar su localización subcelular y la arquitectura total de la célula.

c) Proteómica funcional. Describir las funciones realizadas por las proteínas codificadas en

el genoma. Identificar las interacciones proteína-proteína en un complejo proteínico o

subproteoma, al determinar las vías de esas interacciones y finalmente inferir la participación

funcional de proteínas individuales. Las estrategias proteómicas específicas y dirigidas

utilizadas en la proteómica funcional pueden dar información muy importante sobre el

señalamiento de proteínas, mecanismos de enfermedad o interacciones de proteína-droga

(Oliva et. al. 2007).

Las técnicas más usadas en la proteómica se basan en la electroforesis bidimensional y en la

espectrometría de masas.


43

2.4.2.1. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

La electroforesis es la técnica central para analizar un número grande de proteínas al mismo

tiempo. La técnica electroforética es relativamente antigua, fue inventada hace más de 50 años

por Tiselius, y en 1956 Smithies y Poulik describieron el primer gel en dos dimensiones

(mapas proteómicos); mientras que en 1975 Patrick O´Farell optimizo el proceso de

separación de 2D. Actualmente la electroforesis 2D permite obtener mapas proteómicos los

cuales se emplean en estudios comparativos de patrones proteicos de diferentes individuos;

por ejemplo un patrón de proteínas de un individuo sano frente a un individuo enfermo, o de

un mismo individuo expuesto a diversas condiciones ambientales o experimentales.

La electroforesis bidimensional es la técnica que permite la separación de mezclas complejas

de proteínas, la separación se hace en dos etapas consecutivas; en la primera dimensión se

efectúa el isoelectroenfoque utilizando gradientes inmovilizados de pH, es decir; las proteínas

se separan en función de su carga, avanzando en un campo eléctrico hasta alcanzar un valor de

pH igual a su punto isoeléctrico (donde su carga es igual a cero). En la segunda dimensión la

separación de las proteínas se hace en presencia de dodecil-sulfato de sodio (SDS) y las

proteínas son separadas entre sí en función de su masa molecular. La correcta preparación de

las muestras es frecuentemente el paso más importante para un resultado exitoso y la

visualización de este resultado muestra el conjunto de proteínas presentes en la mezcla inicial

(Hanash 2003, Mojica et. al. 2003, BioMol 2007).

2.4.2.2. ESPECTROMETRÍA DE MASAS

La espectrometría de masas es una herramienta útil en la identificación de las proteínas ya que

complementa las técnicas de la proteómica. Las manchas del gel son extraídas y cada una es

tratada con tripsina para producir un patrón característico de péptidos que se identifican por

MS. La espectrometría de masas se fundamenta en la separación de partículas moleculares por

su diferente masa (en este caso la masa de los péptidos producidos por digestión con tripsina)

la cual es medida con gran precisión. Los espectrómetros de masas tienen dos partes: una

fuente de iones (MALDI o ESI) y otra un aparato medidor (cuádruplos, trampas iónicas, y

TOF). Las combinaciones de estas técnicas más utilizadas son:


44

MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass

Spectrometry) o Espectrometría de masas basada en la desorpcion ionización asistida por una

matriz solida de rápida ocurrencia. Esta identificación de proteínas ocurre cuando están

inmovilizadas en una membrana o en una matriz de un gel.

MALDI o ESI-MS Electro Spray Ionization Mass Spectrometry) o espectrometría de masas

por ionización en electroatomizado. Esta técnica analiza proteínas inmovilizadas en

membranas o eluídas y digeridas en geles.

Los datos que salen de la técnica de espectrometría de masas son fingerprints o huellas

digitales de péptidos separados por su masa. La identificación de las proteínas se hace por

aprendizaje de máquina, refiriendo los patrones particulares de MS a una base de datos

(Domol y Hebersold 2006).

2.5. INMUNO-PROTEÓMICA

El “Western Blot” es una técnica utilizada para identificar y localizar proteínas en función de

su capacidad para unirse a anticuerpos específicos. Primero las proteínas son separadas por

electroforesis unidimensional o bidimensional; posteriormente las proteínas se transfieren a

una membrana de nitrocelulosa manteniendo el mismo patrón que en el gel; esta transferencia

es incubada posteriormente con los anticuerpos específicos para finalmente ser mostradas

mediante un sustrato que revela por coloración (Liu et al. 2008).

La técnica de “Western blot” permite detectar proteínas del interés dentro de una mezcla

compleja de proteínas. Así mismo puede proporcionar información sobre el tamaño de la

proteína (con respecto a un marcador de tamaño o escala en kDa), y también da información

sobre la expresión de proteínas (con respecto a un control como muestra no tratada o de otro

tipo de muestra). Se han publicado algunos artículos en los que se utilizan ensayos de

“Western Blot” combinados con técnicas proteómicas (Kyo Yi et al. 2009, John A. Mclntyre

et al. 2009, Liu et al. 2008) en los cuales se reportan proteínas/antígenos asociados a tumor en

algunos tipos de canceres.


45

3. JUSTIFICACIÓN

Al igual que ocurre en el caso de la genómica, la proteómica aplicada al cáncer se ha

centrado fundamentalmente en la búsqueda de marcadores tumorales de tipo proteico

expresados diferencialmente en tumores, de la misma forma que ocurre con la búsqueda de

nuevos blancos terapéuticos (Hanash 2003); ya que el suero sanguíneo provee información de

gran valor para esta búsqueda debido a que contiene gran cantidad de proteínas (Barba et. al.

2007), esta es una fuente ideal para nuestros fines. Se han reportado a nivel experimental

pruebas para detectar el cáncer de manera temprana, sin embargo la mayoría de los

biomarcadores tumorales están muy lejos de ser sensibles y específicos

Es de gran relevancia la búsqueda e identificación de biomarcadores que sean más sensibles y

específicos, que aplicados a nuevos métodos rápidos y sencillos, permitan identificar el cáncer

de mama en etapas tempranas, para poder de esta manera contribuir en un diagnóstico

oportuno y brindar una mejor calidad de vida para las mujeres que presenten Cáncer de mama,

se sabe que si el cáncer de mama es diagnosticado y tratado cuando aún se encuentra

específicamente en la mama, es decir en etapas I y II, la tasa de éxito del tratamiento es

cercana al 100%. El uso de la mastografía ha demostrado su eficacia puesto que se ha

observado una reducción de la mortalidad entre un 20 y 35% en mujeres con edades entre 40 y

69 años. La sensibilidad de la mastografía es alrededor del 70%-80% y su especificidad del

5%-10%, pero estos porcentajes dependen del personal que opera e interpreta los resultados,

sin contar con que su valor de predicción disminuye cuando algunas mujeres presentan tejido

mamario denso, lesiones pequeñas o se encuentran en estado pre-menopaúsico; por lo que

estos estudios proteicos de los sueros de mujeres con cáncer de mama e individuos sanos

mediante proteómica e inmuno-proteómica; permitirá identificar proteínas (biomarcadores) las

cuales estén relacionadas de manera directa a lesiones mamarias tempranas, y por consiguiente

que tengan el potencial para ser utilizadas en nuevos métodos de diagnóstico no invasivo, así

mismo puedan ser usadas como pruebas de tamizaje y/o apoyo para los métodos utilizados en

la actualidad como la mastografía y la biopsia. Propiciando la obtención de diagnósticos en

etapas tempranas y por consecuencia una mejor respuesta y efectividad de los tratamientos.


46

4. HIPOTESIS

Mediante el análisis comparativo de mapas proteómicos y ensayos diferenciales de inmuno-

blot es posible encontrar marcadores tumorales en sueros de mujeres con cáncer de mama en

etapas tempranas.


47

5. OBJETIVOS

5.1. GENERAL:

Identificar y caracterizar marcadores tumorales provenientes de sueros de pacientes con cáncer

de mama en etapas tempranas.

5.1.1. PARTICULARES:

5.1.1.1. Clasificar las muestras de sueros de pacientes con cáncer de mama en

etapas tempranas, así como de individuos sanos.

5.1.1.2. Obtener los mapas proteómicos de pacientes con cáncer de mama y de

individuos sanos.

5.1.1.3. Comparar estos mapas proteómicos mediante análisis in silico, e identificar

proteínas diferenciales

5.1.1.4. Identificación de autoantígenos y autoanticuerpos asociados a cáncer de

mama.

5.1.1.5. Caracterizar las proteínas encontradas.


48

6. METODOLOGÍA

6.1. DISEÑO DE EXPERIMENTAL

La etapa de los experimentos dio inicio en el mes de septiembre de 2008 y finalizo en

septiembre de 2010, para este estudio se seleccionaron dos grupos comparativos: individuos

sanos los cuales se utilizaron como controles y pacientes con cáncer de mama los cuales

fueron las muestras de interés.

En este diseño se plantearon dos vías:

1) Obtener mapas proteómicos, en donde se consideraron un total de 20 muestras controles y

20 muestras de cáncer.

2) Ensayos de inmuno-blot con un total considerado de 20 muestras para los controles y 20

para cáncer.

6.1.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN PARA LOS PACIENTES

De las muestras sanguíneas se obtuvieron los sueros, provenientes de la clínica de displasias

del Centro Médico Nacional de Occidente (CMNO) del estado de Jalisco. En pacientes

(mujeres) con cáncer de mama vírgenes, es decir; recién diagnosticadas y sin tratamiento

alguno, como son quimioterapia, radioterapia y/o cirugía. Y en individuos sanos voluntarios

que no presentaban ningún tipo de lesión o enfermedad. La donación de sangre fue de mujeres

con edades de 25 a 60 años que fueron inicialmente diagnosticadas mediante mastografía y el

diagnostico posteriormente confirmado por biopsia. Estas mujeres en un inicio se realizaron el

estudio de rutina por mastografía, y tras ser diagnosticadas se clasificaron por el estado de la

neoplasia que presentaban; las muestra de sangre fueron tomadas solamente después de

obtener el consentimiento informado por escrito para este estudio.

Las muestras de sangre obtenidas de individuos sanos fueron de mujeres donantes voluntarias

a las cuales también se les realizaron los estudios de rutina para comprobar su buen estado de

salud, al igual que con las pacientes de cáncer se les informo de los fines de este estudio (ver

anexos).


49

6.1.2. MODELO ESTADÍSTICO

De acuerdo a las características para este estudio en donde las muestras son variables de tipo

cualitativo con comparación entre los dos grupos: Individuos sanos vs Pacientes con cáncer de

mama, se determinó que los modelos estadístico más adecuados serían:

1) Para la comparación de los mapas proteómicos se realizó un análisis in sillico en donde el

software utiliza el modelo de Carl Gauss y “t-Test” o “t-Student” con una confiabilidad

del 95%

2) Para inmunoblot se plantearon: a) Modelo binomial Bernoulli (no paramétrico) ya que se

consideró adecuado debido sus características en donde el espacio muestral contiene

solamente dos resultados posibles que se denominan éxito (E) y fracaso (F), este nos

ayudara a determinar en qué porcentaje es posible encontrar AATs en los pacientes con

cáncer de mama. b) Prueba de Ji-cuadrada (X2), es una prueba de independencia y de

ajuste en la estimación de las varianzas, en donde tenemos dos variables aleatorias

independientes con una distribución normal, la cual nos ayudara a identificar que tanto

influye el estado de salud de los pacientes con cáncer de mama para la búsqueda de AATs

(Gutiérrez 2008., Gil. 1998).

Para analizar las que edades de ambos grupos no fueran un factor que influyera en los

resultados se utilizó una prueba t-Test la cual determina la diferencia entre las medias de las

dos poblaciones con una confiabilidad del 95%.

6.2. MATERIALES Y MÉTODOS

6.2.1. OBTENCIÓN DE LOS SUEROS

Las muestras de sangre fueron obtenidas por personal de CIBO-IMSS, se tomaron del

antebrazo de las pacientes con cáncer de mama y de voluntarias sanas, se utilizaron tubos

vacutainer de 5ml para ser posteriormente centrifugadas a 3,000rpm/15min 20oC, para obtener

el suero. Una vez obtenidos los sueros se almacenaron en tubos Eppendorf alícuotas de 500µl

del suero a -72oC hasta el momento de su uso.

Fig. 7. Toma de una muestra de sangre para la obtención de suero.


50

6.2.2. INTERPRETACIÓN DE MASTOGRAFÍA

El diagnóstico inicial se realizó por medio de BI-RADS (Breast Imaging Report and Database

System) que es el reporte estándar de interpretación a mastografía o rayos X. Este reporte se

encuentra dividido en 6 categorías las cuales se describen en la siguiente tabla:

Tabla 1. Clasificación de los estados BI-RADS

Diagnóstico

BI-RADS: Reporte estándar de interpretación a mastografía o RX

BIRADS 0

Negativo, no es posible detectar alguna patología

BIRADS I

No maligno sin ganglios ni alteraciones 0% probable

BIRADS II

Negativo a malignidad, hallazgos benignos (ganglios, calcificaciones), 0% de posibilidades de cáncer.

BIRADS III

Probable benignidad, requiere control a 6 meses. (Nódulos circunscritos o algún grupo pequeño de calcificaciones). 2.24% de posibilidades de cáncer.

BIRADS IV

Resultado dudoso de malignidad. Requiere una confirmación histopatología. Consta de 3 grados de acuerdo con su porcentaje de malignidad que van del 3 al 94%

BIRADS V

Alta sospecha de malignidad. Requiere biopsia para confirmar diagnóstico. > de 95% de posibilidades de malignidad.

BIRADS VI

Malignidad comprobada mediante biopsia.

La confirmación inicial del diagnóstico que se obtuvo por medio de BI-RADS se realizó en la

unidad de radiología del Centro Médico Nacional de Occidente del Instituto Mexicano del

Seguro Social, y el diagnóstico definitivo mediante biopsia por ensayos de

inmunohistoquímica.


51

6.2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS SUEROS

Dentro de los datos que se obtuvieron, se encuentra la edad de los pacientes, la fecha en la que

se tomó la muestra, la fecha de diagnóstico y el tipo de diagnóstico. Las muestras de suero

fueron obtenidas y procesadas en el centro de investigaciones biomédicas de occidente

(CIBO). Se clasificaron de acuerdo al número de pacientes y al estado que presentaban (Ver

anexos)

6.2.4. ESTANDARIZACIÓN DE LA electroforesis de proteínas en DOBLE DIMENSIÓN (2-DE) DE LOS SUEROS

Para poder realizar el análisis comparativo de los sueros por 2-DE se estandarizaron las

condiciones de electroforesis en dos dimensiones y la preclarificación de los sueros; esto

debido a que el suero contiene cientos de proteínas con concentraciones que van de 60-80 mg

de proteína por ml (Mark et. al. 2005). La albumina en el suero humano representa más del

60% de la proteína total presente en este, por lo que esta alta concentración oscurece la

detección de proteínas de baja abundancia (Adkins et. al. 2002). Para que estos sueros puedan

ser fácilmente utilizados y de manera confiable es indispensable eliminar o por lo menos

disminuir significativamente estas proteínas abundantes como son, albumina,

inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgD), Transferina, Fibrinogeno, Macroglobulinas,

Antitripsina, Haptoglobulina, Glycoproteína acida, Ceroloplasmina, Apoliproteínas entre otras

(Pietrowska et. al. 2009).

Para este fin se utilizaron 3 métodos:

1. ProteoSeek™ Albumin/IgG Removal Kit (Pierce).

2. Proteoprep® 20 Plasma Inmunodepletion Kit (Sigma-Aldrich).

Fig. 8. Kit para deplesión de proteínas abundantes (Sigma).


52

3.

4.

5. Columna Superdex 75 10/300GL (GE Healtcare).

Se siguieron los protocolos de fabricante cada uno de los kits evaluados. Los mejores

resultados se obtuvieron con el kit Proteoprep® 20 Plasma Inmunodepletion, por lo que este

método fue el que se utilizó para la reducir la cantidad de proteínas mayoritarias los sueros.

6.2.5. DEPLESIÓN DE SUEROS

Se tomaron 30µl de suero y se mezclaron con buffer de equilibrio proveniente del kit, estas

mezclas fueron ultra-sonicadas durante 20 min en un ultrasonicador Branson 5510, las

muestras se concentraron en un concentrador de vacío “Speedvac Vacufuge™ Eppendorff”,

durante 1h /30°C. Posteriormente las muestras de sueros se pasaron 2 veces por la columna del

kit incubando durante 15 min cada vez; estos sueros pasados por la columna se precipitaron

con acetona fría 1:4 v/v, 1h. /4°C; y finalmente fueron centrifugadas a 9,000 rpm/10 min a

4°C. (Ver apéndice)

6.2.6. DOBLE DIMENSIÓN

6.2.6.1.Preparación de los sueros para la primera dimensión

La pastilla de proteínas obtenida se re-solubilizó en un volumen final de 125µl de Buffer de

hidratación el cual contiene: solución de rehidratación (Urea 7M, Thiourea 2M, CHAPS),

DTT 1M e IPG Buffer (4-7) 20mM; con cantidades de 118.0µl, 6.125µl y 0.875µl

respectivamente. Se utilizaron tiras de gradiente inmovilizado de pH (IPG) lineales de 7cm,

gradiente pH 4-7 (Bio-Rad). La muestra se dejó hidratando en las tiras IPG durante 16 horas.

6.2.6.2.Primera dimensión

Las tiras IPG con el contenido de muestras de suero se colocaron en la charola del

isoelectroenfoque y fueron cubiertas con aceite mineral (Bio-Rad). Las condiciones de corrida

del Isoelectroenfoque (IEF) fueron las siguientes: 1 Stp 300V/2:30 min, 2 Grd 1000V/0:30


53

min, 3 Gd 5000V/1:30 min, 4 Stp 5000V/0:35 min. En el equipo Ettan IPGphor3 (GE

Healtcare) Figura 9.

Una vez terminada la electroforesis en 1-D por medio del IEF, las tiras IPG fueron

equilibradas con buffer de equilibrio (ver apéndice) y DTT (1% w/v) por 20 min y

posteriormente con buffer de equilibrio y Yodoacetamida (2.5% w/v) por 20 min.

6.2.6.3.Electroforesis segunda dimensión

La electroforesis se realizó en geles preparativos (con un pozo a lo largo del gel) de

poliacrilamida a una concentración 13% (ver apéndice). En el equipo Mini-Protean Tetra

Electrophoresis System (Bio-Rad). Se colocaron las tiras IPG en la parte superior del gel para

la separación de las proteínas por peso molecular y se colocaron marcadores de peso

molecular (Broad Range de Bio-Rad) y se sometieron a 130V/90 min Figura 10.

Fig. 9. Equipo Ettan IPGphor3 donde se realiza la primera dimensión o Isoelectroenfoque.


54

Finalmente los geles de poliacrilamida fueron teñidos con un kit de plata (compatible con la

técnica de MS) para visualizar las proteínas (Proteo Silver™ Stain Kit de Sigma-Aldrich).

(Ver apéndice).

6.2.7. ANALISIS DE DOBLE DIMENSIÓN

Las imágenes de los geles obtenidos mediante electroforesis bidimensional fueron capturadas

con el equipo Molecular Imager ® Gel Doc XR ™ (BioRad) y analizados con el software

Quantity One Software (Bio-Rad) para calcular el peso molecular de las proteínas. El análisis

in sillico de los mapas proteómicos fue realizado con software PDQuest Advanced 8.0.1 (Bio-

Rad).

6.2.8. INMUNO-BLOT DE DOBLE DIMENSIÓN

6.2.8.1.Electrotransferencia de 2-DE y bloqueo de membrana

Se realizaron ensayos de inmunoblot en doble dimensión. Los geles 2-DE al 13% que

contenían las proteínas aun sin teñir, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa

(Amersham™ Hybond™-ECL-GE Healthcare), en el equipo para electrotransferencia Electro-

eluter (Bio-Rad) a 100v/1h. Terminada la transferencia de las proteínas se bloqueó la

membrana con leche al 5% / PBS-Tween20 0.5% durante 16h. Se realizaron 4 lavados con

20 ml de PBS-Tween20 0.1%.

6.2.8.2.Incubación del primer, segundo anticuerpo y revelado de la membrana

Las membranas posteriormente fueron incubadas con el anticuerpo primario: sueros de

pacientes con cáncer de mama y sueros controles (individuos sanos); a una dilución 1:200

(100µl suero en 20ml PBS-Tween20 0.5%) durante 18h a 4ºC. Se realizaron nuevamente 4

lavados con 20 ml de PBS-Tween20 0.1%.

Fig. 10. Equipo para electroforesis Mini-Protean Tetra Electrophoresis System


55

Se incubo el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (“horseradish

peroxidase-conjugates goat anti-human immunoglobulin”, Jackson) a una dilución 1:2000 por

2,5 h. Se realizaron 5 lavados con 20 ml de PBS-Tween20 0.05%. La reacción se visualizó

mediante quimioluminiscencia con revelador de color para HRP (Hot Rabbit Peroxidasa) de

BioRad. (Ver apéndice), finalmente se detuvo la reacción con agua corriente.

6.2.9. ANALISIS POR INMUNOBLOT DE SUEROS DE PACIENTES

6.2.9.1.Electroelusión de las proteínas de 2-DE

Para validar de manera individual lo que se observó de las membranas obtenidas por inmuno-

blot en 2-DE, se realizaron ocho geles 2-DE; los cuales contenían las proteínas

correspondientes las manchas reveladas en los ensayos anteriores de inmuno-blot, estas fueron

removidas de los geles 2-DE, se les realizo una electro-elución (ver apéndice) para separarlas

del gel de poliacrilamida por un periodo de 4 horas a 10 mA en el “Electro-Eluter”-422

(BioRad).

6.2.9.2. Electrotransferencia 1-D y bloqueo de la membrana

A todo el purificado de la proteína que se obtuvo mediante electroelusión, se le realizo

electroforesis de 1-D en un gel preparativo (un solo poso a lo largo del gel) de poliacrilamida

al 11%. Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE fueron transferidas a una membrana de

nitrocelulosa (Amersham™ Hybond™-ECL-GE Healthcare), en el equipo para

electrotransferencia “Mini Trans-Blot” (Bio-Rad) 100v/1h. Se bloqueó la membrana con leche

al 5% / PBS-Tween20 0.05% durante 16h. Se realizaron 4 lavados con 20 ml de PBS-

Tween20 0.1%.

6.2.9.3. Incubación con sueros de pacientes

Después de bloquear, se obtuvieron pequeñas fracciones (en tiras) de la membrana de

nitrocelulosa y se incubaron durante 18 horas a 4 ° C, con sueros de 20 controles (individuos


56

sanos) y 25 pacientes con cáncer de mama, utilizados de manera individual para las tiras

(1:100 dilución), las membranas fueron lavadas con PBS-Tween20 0,1%.

6.2.9.4. Incubación del segundo anticuerpo

La membrana se incubó 3 horas con el anticuerpo (“conjugated goat anti-human” IgG (H + L)

marcado con biotina (KPL), dilución 1:5000, se realizaron 4 lavados con PBS-Tween20 0,1%,

y fueron incubadas posteriormente con HRP-estreptavidina peroxidasa (KPL) por 30 minutos.

Se visualizaron por quimioluminiscencia con la solución de revelado HRP (BioRad).

6.2.10. Análisis de doble dimensión e inmuno-blot

El análisis para los ensayos de inmuno-blot fue realizado por medio del software Stat Graphics

Centurion v15.1.0.2

6.3. IDENTIFICACIÓN MEDIANTE ESPECTOMETRIA DE MASAS (MS)

Las proteínas observadas de 2-DE y por inmuno-blot fueron cortadas de los geles y enviadas

para identificación por MS. Los puntos de gel fueron desteñidos según Gharahdaghi y

colaboradores (1999), se lavó con varios cambios de agua. El agua fue eliminada y

reemplazada con 100µl 0,01 DTT/0.1M Tris, pH 8,5, el tubo fue colocado en calentamiento a

55ºC durante 1-2h. Se enfrió a temperatura ambiente, el líquido fue retirado y reemplazado

con 100µl 0,015 iodoacetamida/0.1M Tris, pH 8,5. Se dejó reaccionar durante 30 min. en

oscuridad, después el líquido se retiró y el gel se lavó con buffer 2X 30% acetonitrilo/0.05M

Tris, pH 8,5 por 15 minutos en agitación. El gel posteriormente fue deshidratado en remojo

durante unos minutos con 200µl de acetonitrilo. El acetonitrilo se eliminó y el gel se secó

completamente por 30 minutos en el concentrador Vacufuge (Eppendorf). Los geles fueron

rehidratados con 0.020µg y tripsina 0.1µg Lys-C (Roche Applied Science) en la cantidad

mínima de 0,025 M Tris, pH 8,5, luego los tubos fueron colocados en calentamiento de 32 ° C

toda la noche. Los péptidos se extrajeron con buffer 2X 50µl 50% de acetonitrilo / 2% de TFA

y los extractos combinados se secaron, luego se resuspendió en una solución matriz de 10 mg /

ml de solución de ácido 4-hidroxi-α-cyanocinnamic 50% acetonitrilo 0.1% TFA además de

dos normas internas, angiotensina e insulina bovina, a la solución matriz. Estando


57

completamente seco, se lavó dos veces con agua. El análisis MALDI-MS se realizó en el

resumen con un PerSeptive Voyager DE-Pro espectrómetro de masas en el modo lineal. Para

la búsqueda de péptidos las masas medias de los péptidos se introdujeron en la base de datos

Genpept.

7. RESULTADOS

7.1. CLASIFICACIÓN DE LOS SUEROS

Se obtuvieron un total de 148 sueros de mujeres, los sueros obtenidos se clasificaron de la

siguiente manera: 57 sueros pertenecen al grupo control (individuos sanos), 26 se

encuentran en BI-RADS 0-3 y 65 se encuentran en BI-RADS 4-6. (Tabla 2).

Tabla 2. Clasificación del total de los sueros obtenidos para el estudio

Total Controles BI-RADS 0-3

BI-RADS 4-6

148 57 26 65

Gráfica 5. Representación porcentual de los sueros obtenidos y su clasificación.


58

Dentro de la clasificasion BI-RADS 4-6 donde hay 65 pacientes se realizo una nueva

subclasificacion, de los cuales 11 de los pacientes resultaron benignos, 1 se presenta en

primera etapa de cancer de mama , 32 en segunda etapa, 3 en tercera etapa y el resto de 18 el

diagnostico no fue confirmado (Tabla 3).

Tabla 3. Subclasificacion de los sueros BI-RADS 4-6

BI-RADS 4-6 Benignos Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 No confirmados

65 11 1 32 3 18

Dentro del grupo BI-RADS 4-6 que es el grupo de alto riesgo de presentar cáncer de mama

(ver tabla 1) se seleccionaron los sueros que se quedaron dentro de la clasificación como etapa

II para realizar los ensayos de doble dimensión e inmuno-blot.

Gráfica 6. Representación porcentual de la subclasificación de los sueros obtenidos.


59

7.2. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Y OBTENCION DE MAPAS PROTEOMICOS

Debido a que el proteoma total del suero humano representa muchos cambios, el análisis se

dificulta ya que estos cambios interfieren con la técnica de doble dimensión, para reducir esta

complejidad y enriquecer proteínas de baja abundancia, se realizó la reducción de proteínas

mayoritarias de los sueros por medio del kit Proteoprep20, una vez obtenidos los sueros de la

de esta manera, se procedió con la electroforesis bidimensional la cual consiste en separar a las

proteínas primero por su punto isoeléctrico, y segundo por peso molecular. Finalmente se

obtuvieron los mapas proteómicos bidimensionales teñidos por medio de un kit de plata

compatible con MS.

Se obtuvieron un total de 20 sueros provenientes de individuos sanos y 20 de pacientes con

cáncer de mama en etapa II.

A continuación se muestran las imágenes representativas los mapas proteómicos

pertenecientes a un suero de un individuo sano (utilizado como control), y un suero de

paciente con cáncer de mama en los cuales se pueden observar las proteínas séricas separadas

en un gradiente con pI de 4-7 y en un gel de poliacrilamida al 13%, ambos teñidos con plata

(Figuras 11 y 12).


60

A. Control B. Cáncer de mama

7.3. ANALISIS DE MAPAS PROTEOMICOS

Una vez obtenidos los mapas, el análisis in sillico de estos se realizó por medio el software

PDQuest Advanced 2-D Analisys Software V.8.0.1.

Se hizo un análisis comparativo de los mapas proteómicos por medio del software para

encontrar el número de puntos (proteínas) presentes en cada gel y las diferencias significativas

entre estos (Figura 13).

Tabla 4. Tabla representativa de la comparacion de mapas proteomicos controles vs cáncer de mama.

Experimento: comparación

Create Experiment on disk: 6 gels

Detect member 1: 'suero 2a v1' Detect member 2: 'suero 4a v1' Detect member 3: 'suero 7a v1'

Detection parameter: 'suero 2a' Detection parameter: 'suero 2a' Detection parameter: 'suero 2a'

Fig. 12. Imagen representativa de un mapa proteómico perteneciente un paciente con cáncer de mama.

Fig. 11. Imagen de un mapa proteómico perteneciente a un individuo control

Fig. 13. Imagen representativa obtenida de PDQuest advanced V.8.0.1 en la cual se muestra una comparación del gel master (parte superior izquierda) con los mapas proteómicos tanto de individuos sanos (parte superior), como de pacientes con cáncer de mama (parte inferior).


61

Make gel image Make gel image Make gel image

Smoothing: Adaptive 3x3 Smoothing: Adaptive 3x3 Smoothing: Adaptive 3x3

Background removal: Floating Ball 77 Background removal: Floating Ball 77 Background removal: Floating Ball 77

Consistent spot detection with

sensitivity: 2.2423


sensitivity: 1.6988


sensitivity: 1.5435

Gaussian fit spots Gaussian fit spots Gaussian fit spots

Total number of spots: 1422 Total number of spots: 1326 Total number of spots: 1376

Detect member 4: 'suero 111 v1' Detect member 5: 'suero 122 v1' Detect member 6: 'suero 70 v1'

Detection parameter: 'suero 2a' Detection parameter: 'suero 2a' Detection parameter: 'suero 2a'

Make gel image Make gel image Make gel image

Smoothing: Adaptive 3x3 Smoothing: Adaptive 3x3 Smoothing: Adaptive 3x3

Background removal: Floating Ball 77 Background removal: Floating Ball 77 Background removal: Floating Ball 77

Consistent spot detection

with sensitivity: 1.6600


sensitivity: 2.0093

Consistent spot detection

with sensitivity: 1.5047

Gaussian fit spots Gaussian fit spots Gaussian fit spots

Total number of spots: 1402 Total number of spots: 1310 Total number of spots: 1308

Tabla 5. Tabla en la cual se muestra el total de los puntos en los geles (proteinas) que resultaron diferentes

Comparación: 'Todos los puntos validos'

Automatically normalize Experiment Automatic: analysis

Method: 'All valid spots' Added quantitative analysis set

Name: Quant control vs cancer

Spots: 429

Added statistical analysis set Added union Analysis Set Added intersection Analysis Set

Name: T-Test control vs cancer Name: Union of all auto sets Name: Intersection of all auto sets

Spots: 69 Spots: 471 Spots: 27

En la tabla 4 se muestran el total de puntos encontrados en los geles, el número de estos nos

indica geles con buen contenido de proteínas las cuales fueron bien realizados mediante esta

técnica y que pueden además utilizarse confiablemente para esta comparación, así como el

número de proteínas que tienen en común.

La tabla 5 muestra el número de proteínas que pudieron ser diferenciadas y validadas por

medio de la prueba t, la unión de todo el conjunto e intersección de este mismo.


62

Se pudieran considerar las 69 proteínas para un análisis más fino y detallado. Este análisis

conlleva el manejo experimentado del software y de conocimientos especializados en análisis

estadísticos, motivo por el cual utilizamos los mapas proteómicos para el análisis con las

proteínas de baja abundancia.

Posteriormente se realizó una comparación particular entre los geles bidimensionales para

identificar las diferencias significativas existentes entre los dos grupos de estudio (Sanos vs

Cáncer). La imagen 14 que se muestra, es representativa de un individuo sano (control), en la

cual se puede observar el mapa proteómico del cual se seleccionó por medio de un recuadro

(rojo) para obtener un acercamiento en una vista tridimensional de las proteínas analizadas por

medio de comparación. De la misma manera se puede observar la imagen representativa de un

paciente con cáncer de mama (etapa II), al cual se le realizo el mismo análisis comparativo.

A. Control B. Control


63

C. Cáncer D. Cáncer

Se ha reportado que el mayor número de proteínas diferenciadas como biomarcadores se

encuentran en rangos de mediano a bajo peso molecular. En este análisis se observaron

algunas diferencias entre individuos sanos y pacientes con cáncer de mama en etapa II; las

cuales se obtuvieron en mayor importancia por debajo de los 35 KDa. Los resultados fueron

analizados mediante el uso del software PD Quest advanced V.8.0.1.

En la figura 15 se pueden observar de un total de 5 proteínas con diferencias, 3 proteínas con

PM aproximado de 29, 30 y 24 KDa y rango de PI entre 5 – 6 (marcadas en color rojo) en los

individuos sanos, la cuales no se aprecian en los pacientes con cáncer de mama (marcadas en

color negro), una proteína presente en los pacientes con cáncer con PM aproximado de 29

KDa y PI en un rango de pH aproximado de 5, (marcado en color rojo) que no presentas los

individuos sanos (marcados en color negro); y una proteína que se aprecia en menor cantidad

en los pacientes con cáncer de mama con PM aproximado a los 22 KDa y PI entre 4.5

(marcado en color azul) respecto a los controles (marcado en color verde). A estas imágenes

se les realizó una vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos. En el

recuadro seleccionado en la parte inferior (rojo) se muestran las diferencias de algunas

proteínas que se compararon en los pacientes de cáncer de mama.

Fig. 14. A. Imagen en 2D representativa de un individuo sano, con su vista tridimensional (B). C. Imagen en 2D representativa de un paciente con cáncer de mama con su vista tridimensional (D).


64

A. Control B. Cáncer

En la figura 16 se pueden observan 2 proteínas presentes en individuos sanos las cuales

presentan un PM aproximado de 15 y 22 KDa y con un rango de PI cercano a 4.5 y 5

(marcadas en color rojo), las cuales se encuentran ausentes en los pacientes con cáncer de

mama (marcadas en color negro), 2 proteínas presentes en personas con cáncer de mama PM

aproximado a 27 KDa y PI entre 4.3 (marcadas en color rojo) respecto a los individuos sanos

(marcados en color negro), y dos proteínas que se encuentran en mayor cantidad en pacientes

con cáncer de mama, PM aproximado a 15 y 18 KDa y PI entre 4 y 4.5 (marcadas en color

azul) respecto a los individuos sanos (marcados en color verde). A estas imágenes de igual

manera se les realizó una vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos. En el

Fig. 15. A Vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos de un individuo sano y B de un paciente con cáncer de mama.


65

recuadro seleccionado en la parte inferior (rojo) se muestran las diferencias de algunas

proteínas que se compararon en los pacientes de cáncer de mama.

A. Control


66

B. Cáncer

7.3.1. ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS

Las proteínas identificadas en los mapas proteómicos y señaladas con diferencias que

figuran como significativas fueron cortadas del gel de poliacrilamida, se colocaron en

microtubos de manera individual, se etiquetaron y se mandaron para su identificación

mediante espectrometría de masas, los resultados de este análisis no fueron concluyentes

debido a que por algún factor como pudo ser mal manejo, contaminación o posible

degradación, las proteínas no pudieron ser identificadas. Sin embargo de acuerdo al PM y PI

de las proteínas identificadas en los mapas proteómicos, y contrastando de acuerdo a lo

reportado en el artículo (Hannah et.al. 2004), se puede inferir que se tratan de algunos tipos de

apolipoproteinas AI, apolipoproteinas II y apolipoproteinas CII y III, transtiretina;

haptoglobina cadena α 2.

7.4. ENSAYOS DE INMUNO-BLOT BIDIMENSIONALES (3-D)

Como se mencionó en el apartado de materiales y métodos se realizaron ensayos de inmuno-

blot en 2-DE con sueros de individuos sanos y pacientes con cáncer de mama en etapa II, las

condiciones para procesar las muestras de suero para la obtención de proteínas fueron las

mismas, se utilizó el kit de sigma y las proteínas obtenidas se concentraron con acetona, los

procesos de rehidratación de las muestras, el isoelectroenfoque y la separación en SDS-PAGE

se realizaron como se ha descrito anteriormente.

Una vez separadas las proteína séricas de individuos sanos en los geles bidimensionales, se

transfirieron las proteínas a las membranas de nitrocelulosa, se realizaron los ensayos de

inmuno-blot utilizando sueros de individuos sanos y de pacientes con cáncer de mama (como

anticuerpos primarios), estos ensayos nos revelaron que existen anticuerpos en el suero de los

pacientes con cáncer contra varias proteínas séricas, se observan 6 puntos en la membrana de

nitrocelulosa de los cuales 1,2 y 3 pertenecen a A1AT; 4 a Haptoglobina y 5 y 6 Albumina de

suero, se observó además que los sueros de personas sanas no presentan anticuerpos (Fig. 19).

Fig. 16. A Vista tridimensional de una fracción de los mapas proteómicos de un individuo sano y B de un paciente con cáncer de mama.


67

4 pI 7

188

62 49 38

28

18

6

PMP

Durante los ensayos iniciales se encontraron varias proteínas de alto y mediano peso

molecular (Fig. 20), mencionadas en el párrafo anterior y se encuentran marcadas como 1, 2 y

3, tienen un peso alrededor de los 49 KDa con PI aproximado de 4.5 a 5.5, el punto 4 con peso

de 40 KDa aproximadamente y pI de 6; los puntos 5 y 6 con un peso de 50 KDa y PI de 6.5

aproximadamente. Al realizar las réplicas de los mismos solo se encontraron proteínas de

mediano peso molecular algunas fueron las mismas ya observadas en los ensayos anteriores

(1, 2 y 3), las otras observadas durante los ensayos iniciales ya no aparecieron (Fig. 17)

A

B


68

4 pI 7

188

62 49 38

28

18

6

1 2 3

4 5

6

PMP

A B

Fig. 17. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó un suero de individuo sano. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual fueron transferidas las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot con suero de un individuo sano como primer anticuerpo, en el cual se puede ver claramente que no se encontraron anticuerpos.

Fig. 18. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó el suero (108) de un paciente con cáncer de mama en etapa II. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual se transfirieron las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot en el cual es claramente visible la presencia de varios anticuerpos presentes en los sueros con cáncer de mama en etapa II (marcados con flechas).


69

188 62 49 38

28

18

6

1 2 3 P

MP 4 pI 7

A


70

1 2 3

4

5

B

7.4.1. ANALISIS POR ESPECTROMETRIA DE MASAS

Las proteínas observadas correspondientes a las del WB fueron cortadas del gel de

poliacrilamida, con la ayuda de una punta estéril de micropipeta, una vez tomadas del gel se

pusieron en un microtubo estéril, se etiqueto cada tubo con el numero consecutivo conforme

fueron tomadas del gel P-Hs-1 (proteína de suero humano 1, 2 etc.) y se enviaron para su

análisis mediante espectrometría de masas, el resultado de este análisis fue el siguiente:

Tabla 6. Resultado del analisis por espectrometria de masas de las proteinas identificadas.

Puntos1 Proteinas Identificadas

2 NCBI Acceso #

3

P-Hs-1 alpha-1-antitrypsin P01009



P-Hs-4 CD5 like 5174411

P-Hs-5 serum albumin P27169

Fig. 19. Inmuno-blot en 2-DE en el cual se utilizó el suero (109) de un paciente con cáncer de mama en etapa II. Se puede observar arriba (A) el gel bidimensional del cual se transfirieron las proteínas a la membrana; abajo (B) se observa el inmuno-blot en el cual es visible la presencia de anticuerpos en menor número provenientes de los sueros con cáncer de mama en etapa II (marcados con flechas).

Fig. 20. Gel bidimensional de poliacrilamida teñido con azul de Coomassie, del cual se cortaron las proteínas para ser sometidas al análisis por MS. Puntas de flecha.


71

1.- Puntos referenciados que fueron identificados y cortados del gel 2.-Proteina identificada 3.-No de acceso en NCBI de donde se identifico la proteina

7.5. ENSAYOS DE INMUNO-BLOT 1-D Debido a estos resultados se decidió trabajar con la proteína que estuvo presente en todos los

ensayos (fig.17) de inmuno-blot en 2-DE, y que fue identificada como alfa-1 Antitripsina. Las

tres manchas proteicas identificadas como A1AT se cortaron de 8 geles bidimensionales de

poliacrilamida teñidos con azul de Coomassie, la proteína fue recuperada de los fragmentos

del gel mediante el proceso de electroelución, y la proteína obtenida fue sometida nuevamente

a SDS-PAGE y electrotransferida a membranas de nitrocelulosa (a partir de un gel

preparativo de poliacrilamida) para el análisis individual de los sueros.

Antes de transferir a la membrana se cortó una pieza del gel para teñirlo con plata y comprobar

la presencia de la proteína (Fig. 21).


72

Para comprobar en estos resultados y que efectivamente este reconocimiento de anticuerpos es

para A1AT se probó con el anticuerpo monoclonal comercial anti-A1AT (Fig. 22)

Una vez que fue transferida a la membrana se bloqueó con leche al 5% y PSTwen-20 al 0.1%,

se realizó el corte de la membrana en pequeñas piezas (tiras) para probar de manera individual

los sueros de los pacientes con cáncer de mama, así como los de individuos sanos, se

obtuvieron un total de cuarenta y seis tiras las cuales fueron incubadas en mini bandejas de

incubación durante 18h a 4ºC; se utilizaron 20 tiras para incubar sueros controles de pacientes

sanos, 25 para incubar sueros con cáncer de mama (todos a una dilución 1:100 con este

anticuerpo primario), y una más con el anticuerpo comercial A1AT monoclonal de Sigma (se

muestra en la fig 23. Para el anticuerpo secundario se utilizó conjugado biotin-labeled goat

Fig. 21. Electroforesis unidimensional, se muestra en el gel de poliacrilamida (carril 2) la proteína identificada, aislada de los geles bidimensionales, y caracterizada por MS como A1AT. Presenta un peso molecular aproximado de 50 KDa. MPM carril 1.

Fig. 22. Inmuno-blot 1-D (panel B), se muestra la membrana con la proteína A1AT (carril 2) identificada, aislada de los geles bidimensionales y caracterizada por MS que fue reconocida por mAb-A1AT. Panel A comparación de la electroforesis unidimensional (fig. 19) con el inmuno-blot 1-D.


73

anti-human IgG (H+L) a dilución 1:5000 (KPL) durante 3h en el caso de los sueros y para el

anticuerpo comercial fue goat anti-mouse IgG (BioRad). Se lavaron 5 veces con PBS Tween-

20 al 0.1% y fue revelado con HRP-streptavidin peroxidase (KPL).

En el caso de los pacientes con cáncer de mama se examinaron 25 sueros (fig. 23A carril 1-25)

en este resultado se puede observar la presencia de anticuerpos que reconocen A1AT para la

mayoría de los casos, solamente en un caso, un suero con cáncer de mama (fig. 23A carril 15)

no dio resultado positivo. Mientras tanto se puede observar que para el caso de los controles

Fig. 23A. Inmuno-blot en 1-D en donde el análisis se realizó con sueros de individuos sanos en la membrana de nitrocelulosa que contenía solamente la proteína A1AT aislada de geles de 2-DE. 23B. Inmuno-blot en 1-D en donde el análisis se realizó con sueros de pacientes con cáncer de mama en etapaII en la membrana de nitrocelulosa que contiene solamente la proteína A1AT aislada de geles de 2-DE


74

solo en los carriles 6 y 12 (fig. 23B) se reconoce la presencia del anticuerpo, mientras que en

los demás carriles no existe reconocimiento contra A1AT. Por lo que la probabilidad de éxito

para detectar anticuerpos en personas sanas es muy baja.

Así mismo se realizó un análisis densitométrico en las tiras el cual se muestra que el suero de

los pacientes con cáncer de mama se podrían clasificar en tres grupos con relación a la

intensidad de la banda: un primer grupo presenta alta intensidad (Fig. 23A, carriles 2, 5, y 6);

un segundo grupo muestra intensidad media ( carriles 1, 3, 4, 7, 8, 16, 19, y 20), y un tercer

grupo muestra baja intensidad (carriles 9-14, 17, 18, y 21-25). La intensidad de la banda se

normalizó a porcentajes, en el que la banda más intensa fue considerada como 100%. Se

encontró que el grupo, dos y tres tenían porcentajes promedio de 97, 80, y 72%,

respectivamente. En la fig. 23B, carriles 6 y 12 bandas de reactividad con presentes

intensidades de 52 y 51%, respectivamente, que son alrededor de 47% menor con respecto del

primer grupo y 20% menor que la del tercer grupo. Las diferencias observadas en la intensidad

de las bandas en las tiras de membrana de nitrocelulosa fueron las esperadas, debido a que la

concentración de los anticuerpos es variable, el estado inmunológico y nutricional de los

sujetos comparados es diferente, y por qué el tamaño o el tiempo de evolución del tumor son

diferentes también, aun considerando una etapa temprana de la enfermedad.

7.5.1. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS RESULTADOS POR INMUNO-BLOT

El análisis estadístico utilizado para determinar las diferencias significativas entre las edades

de los grupos fue por t-Test, donde se compararon las edades del grupo de individuos sanos

con las de los pacientes con cáncer de mama que fueron utilizados para este estudio.

Tabla 7. Resumen estadistico de las edades de individuios sanos y con cancer de mama.

Cáncer Control

Conteo 25 20

Promedio 48.725 44.85

Desviación estándar 6.5861 8.32419

Coeficiente de variación 13.5183% 18.5601%

Mínimo 38.0 30.0

Máximo 61.0 60.0


75

Rango 23.0 30.0

Skewness estándar 0.1275506 0.1591

Kurtosis estándar -0.797189 -0.633538

En donde:

Ho: La media 1 = a la media 2 Ha: La media 1 ≠ a la media 2

Asumiendo igualdad de varianzas t = 1.74217 P-value = 0.0886287

Se concluye que no existe diferencia estadísticamente significativa entre las dos medias de las

muestras, con un 95% de confiabilidad. La edad de los pacientes no es un factor que afecte las

variables de los análisis comparativos en la búsqueda de AATs.

Grafica 3. Grafica de medias de las edades de individuos sanos y pacientes con cáncer de mama

PRUEBA X2

La comparación para la presencia de anticuerpos entre el grupo de individuos sanos y los

pacientes con cáncer de mama se realizó por medio de una prueba de X2 para probar la

influencia del estado de salud en la presencia de AATs.

Tabla 8. Resultado de AAT positivos y negativos para ambos grupos encontrados en los ensayos inmunoproteomicos.

AAT

Positivo Negativo Total


76

Control 2 18 2

Cáncer 24 1 25

Total 26 19 45

En donde:

Ho: Datos independientes (no existe asociación). No influye el estado de salud de los

pacientes con cáncer de mama para la presencia de AATs.

Ha: Dados no independientes (existe asociación) influye el estado de salud de los pacientes

con cáncer de mama para la presencia de AATs.

Tabla 9. Resultados para X2 con los positivos y negativos de ambos grupos.

AAT


Control 11.56 8.44 20

Cáncer 14.44 10.56 25

Total 26 19 45

Tabla 10. Resumen estadisticos para X2

X2 (0) = 33.68

X2 (1, 0.95) = 3.841

(p Value) X2 = 6.47573E-09

De acuerdo a X2 (p < 0.0000) se rechaza Ho, por lo que se demuestra que si influye el estado

de salud de los pacientes con cáncer de mama en la presencia de antígenos asociados a tumor

teniendo un 95% de confiabilidad, por lo que en este estudio prueba que los individuos sanos

no presentan AATs y que es preciso el estado de cáncer de mama para poder encontrar AATs;


77

evidenciando así que por medio de la búsqueda de AATs podemos determinar el estado

canceroso de un individuo y es factible su uso como indicadores del estadio canceroso.

MODELO BINOMIAL BERNOULLI

Y el modelo binomial de Bernoulli se usó para determinar la probabilidad de éxito de

encontrar AATs en los pacientes con cáncer de mama.

Tabla 11. Resultado de AAT positivos y negativos para ambos grupos encontrados en los ensayos inmunoproteomicos.

AAT


Control 2 18 20

Cáncer 24 1 25

Total 26 19 45

En donde p(Exito) por lo tanto p(Exito) = probabilidad de encontrar AAT

Tabla 12. Porcentaje de deteccion de AATs para ambos grupos

AAT

Positivo Negativo

Control 10% 90%

Cáncer p(E) = 96% 4%

Se tiene que p = probabilidad de éxito de encontrar AAT, por lo tanto encontramos que en los

pacientes con cáncer de mama esta probabilidad es p = 0.96, estos resultados expresados en


78

datos porcentuales son del 96% de probabilidad de encontrar anticuerpos contra A1AT en

sueros de pacientes con cáncer de mama, comparado con los individuos sanos en donde solo

se encontró el 10% de probabilidad.

8. DISCUSIÓN

Los recientes avances en la comprensión de las tecnologías moleculares han llevado a los

análisis globales de perfiles de proteínas, se han realizado varios estudios de proteoma

comparando sueros cancerosos vs normales. El proteoma de suero es una fuente ideal para la

identificación de biomarcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas, en el cáncer si un

biomarcador es sensible puede ser detectado en el suero y ser utilizado para la detección o

diagnóstico temprano. En este estudio se utilizaron métodos proteómicos 2-DE, e inmuno-

proteómicos, WB) para análisis diferenciales en la búsqueda de marcadores tumorales, así

como AATs en pacientes con cáncer de mama en segunda etapa. A través del análisis de las

proteínas menos abundantes en el suero de las pacientes.

La resolución de 2-DE de proteínas nos permite analizar el proteoma de sueros humanos,

Wulfkuhle y colaboradores (2002), han reportado 170 puntos de proteínas que surgen

diferencialmente en tejidos de carcinoma ductal, e identificado 51 de ellos; en estudios

subsecuentes en carcinoma de mama ductal se identificaron 57 proteínas diferencialmente

expresadas, 10 de las cuales se validaron por inmuno-histoquimica (Wulfkuhle et. al. 2002).

Sin embargo en esta investigación proteómica, mediante análisis in sillico se detectaron 69

proteínas diferenciales (cáncer vs control) de las cuales observamos sobre expresadas en

pacientes con cáncer, algunas de bajo peso molecular (alrededor de 11), como es el caso de la

cadena α2 haptoglobina, que es una glicoproteína secretada en células de hígado cuya función

principal es captar hemoglobina libre y reciclarla (Liao et. al. 2008). En estudios previos se ha

demostrado que cuerpos de hierro promueven el crecimiento celular neoplásico y la

acumulación en células cancerosas más que en células normales. Adicionalmente otros

estudios han indicado un alto riesgo en pacientes con grandes depósitos de hierro que en los

que cuentan con menores reservas de hierro; así mismo el incremento relacionado con la


79

hemoglobina resulta en una reducción de las concentraciones de haptoglobina, sin embargo

también ha sido identificada como un fuerte agente antioncogénico, activador del crecimiento

celular endotelial y la diferenciación. se ha reportado la subexpresion de haptoglobulina en

sueros de algunos tipos de cáncer como por ejemplo ovario y pulmón (Liao et. al. 2008,

Awadallah et. al. 2004, Huang et. al. 2006). Este último autor reporta una disminución en la

expresión de la cadena α2 haptoglobina en muestras de suero de pacientes con cáncer; en

nuestro caso encontramos esa diferencia observando una disminución de esta proteína en

relación con los sueros de pacientes sanos.

Otras proteínas observadas por sus diferencias en los mapas proteómicos y referenciadas

fueron apoliproteinas AI, AII, C-II y III (Hannah et.al. 2004). Cabe mencionar que estas

proteínas no pudieron ser identificadas como tales por medio de espectrometría de masas.

De manera alternativa se realizaron ensayos de inmunoblot en 2-DE, que consiste en la

combinación de las técnicas de electroforesis de proteínas y “Western blot”. Esta combinación

metodológica nos permitió obtener resultados interesantes y prometedores. Existen algunos

estudios en los que se ha demostrado la presencia de autoanticuerpos en personas con cáncer

incluso hasta 4 años anteriores a la detección por mastografía; de la misma manera también se

ha reportado autoantígenos estos son candidatos prometedores para el diagnóstico y pronostico

del cáncer de mama (Fernández 2005, Chapman et.al. 2007, Cho 2007, Desmetz et.al.2009,

Tamesa et. al. 2009).

Los resultados de nuestros ensayos nos permitieron observar la presencia de algunos AATs en

pacientes con cáncer de mama específicamente con carcinoma ductal infiltrante en etapa II,

por inmunoblot se visualizaron 6 manchas principales en algunos ensayos de las cuales se

identificaron como Alpha 1-antitripsina (A1AT), Hs-4 Haptoglobina y por ultimo P-Hs-5 y 6

como Albumina de suero (tabla 4).

La albumina sérica humana es una proteína con actividad antioxidante, una propiedad que

puede ser anticancerígena; algunos estudios han reportado el aumento de riesgo de mortalidad

por cáncer asociado a bajas concentraciones de albumina (Phillip et. al. 1980, Law et. al.

1994), así mismo una fuerte asociación positiva entre niveles de albumina y la aparición del

cáncer de colon; el riesgo se asocia con altos niveles de albumina sérica (Knekt et. al. 2000).

Otros estudios reportan la utilidad de la albumina como un factor de predicción en la


80

sobrevivencia del cáncer, ya se le ha relacionado con la alimentación y su presencia en bajos

niveles es indicativo de desnutrición y por lo tanto a un alto riesgo de muerte por cáncer

(Gupta et. al. 2010).

A1AT se ha encontrado en suero y en tejido de pacientes con carcinoma ductal infiltrante y de

cáncer colorrectal; la cual ha sido reportada como una proteína que incrementa su expresión,

durante la presencia de tumores malignos (Hamrita et. al. 2009, Xie et. al. 2010). A1AT

pertenece a la superfamilia de proteínas llamadas serpinas (Inhibidores de la proteinasa

serina), es una glicoproteína sintetizada principalmente por células de hepatocitos, monocitos,

macrófagos, así como por células tumorales; también juega un papel central en la protección

de los tejidos; de actividad proteolítica extracelular en la regulación de los procesos

proteolíticos y tiene un papel clave para la coagulación de la sangre, la activación del

complemento y la apoptosis. Diversos estudios demostraron que el 90% de la capacidad

inhibidora de la tripsina sérica circulante se atribuye a A1AT y que esta actividad es

importante para el mantenimiento de la homeostasis de proteasa-antiproteasa y la prevención

de daños en los tejidos así como para la migración celular (Wewer et. al.1987, Marcus et.al.

2010). Otros estudios sugieren que la deficiencia de A1AT se asocia con un mayor riesgo de

varios tipos de cáncer y la disminución de los niveles de A1AT induce las actividades de la

serina proteasa contribuyendo al desprendimiento de las células malignas de su lugar de origen

(Yang et. al. 1999).

El reconocimiento auto inmune se está convirtiendo en un importante tema en la biología del

cáncer, múltiples antígenos identificados y asociados con el cáncer de

mama hasta la fecha poseen profundas implicaciones más allá de la búsqueda de nuevos

biomarcadores de diagnóstico de cáncer. Aunque no está claro por qué algunos de los

pacientes desarrollan inmunogenicidad a un antígeno particular, la mayoría de AATs no son

productos del gen mutado, sino más bien proteínas o antígenos que se encuentran

sobreexpresados y que están relacionados con el proceso de diferenciación celular (Menart et

al. 2000, Yi et al. 2009).

En el presente manuscrito, se presenta, la identificación de A1AT como potencial y especifico

AATs importante e interesante y que ha de seguirse estudiando. Este AATs se encontró en

población de mujeres jóvenes mexicanas (menores a 50 años de edad) con etapa temprana del


81

cáncer de mama. Debido a la sensibilidad de la mamografía la probabilidad de detección es

menor en pacientes con tejido mamario denso, con lesiones de poco tamaño, y en mujeres

premenopáusicas, sin embargo la identificación del estado de los AATs puede llevar a la

detección en las primeras etapas del cáncer de mama en mujeres menores de 50 años de edad.

Se ha establecido que la eficacia del tratamiento en pacientes con cáncer de mama depende de

la detección precoz de la neoplasia. En este sentido, la relevancia de la identificación de este

AATs es prometedora en términos de su uso potencial como biomarcador de pronostico

durante las primeras etapas en el desarrollo del cáncer.

Las ventajas en la validación de este tipo de biomarcador es que se podría ser utilizado para la

detección en personas asintomáticas y en etapas tempranas del cáncer de mama y que los

autoanticuerpos pueden ser encontrados en muestras de suero, las que son fácilmente

accesibles para la investigación, son además muy estables, y permanecen en el suero durante

un largo período de tiempo. La persistencia y estabilidad de los anticuerpos les da una ventaja

sobre otros biomarcadores. Por otra parte, la variedad de técnicas y reactivos para realizar el

análisis de la presencia de anticuerpos facilita el desarrollo de estos ensayos de detección.

Es importante destacar que estos resultados son preliminares y que requieren de una mayor

verificación y validación de estudios caso-control. En estos resultados, se observó que algunos

individuos sanos contienen anticuerpos que reaccionan con la proteína A1AT, pero esta

reactividad fue mucho menor que en los pacientes con cáncer de mama. Con estos resultados

preliminares, no sería posible todavía determinar si la baja reactividad de estos sueros

normales debería ser tomada como negativa o positiva en términos de la presencia de cáncer

de mama. Aunque tomando en cuenta que la generación de autoanticuerpos puede ocurrir

durante el proceso de tumorigénesis, es probable que estos anticuerpos en los sueros

correspondan a una etapa muy temprana, que aún no ha sido detectado por el análisis de

mamografía; sería interesante mantener a estos individuos controles que reaccionaron como

positivos bajo observación y darles seguimiento.

Por otro lado, un método cuantitativo como ELISA podría ayudar a establecer y definir las

muestras positivas y negativas. El plan a futuro es construir una plataforma de microarreglos

con la proteína recombinante y utilizar esta plataforma para corroborar los resultados de


82

estudios caso-control utilizando muestras de 200 o más individuos. Además, también se planea

analizar los pacientes con enfermedades autoinmunes, como artritis o lupus y con otros tipos

de cáncer, para determinar la especificidad de este biomarcador. Del mismo modo, más

estudios con muestras de pacientes con carcinoma ductal in situ y cáncer de mama en estadios

III y IV ayudaría a confirmar la especificidad de los autoanticuerpos de A1AT en este

subconjunto de pacientes con cáncer de mama. En resumen, nuestros resultados confirman que

los niveles de proteína A1AT son elevados en el suero de los pacientes con cáncer de mama y

que se encuentran sobreexpresados.


83

9. CONCLUSIONES

En conclusión se encontraron mediante técnicas proteómicas de 2-DE, algunas proteínas

asociadas al cáncer de mama en etapa II, las cuales no fueron confirmadas por espectrometría

de masas, pero si identificadas en algunos mapas proteómicos ya reportados; el análisis de la

técnica in sillico es algo complejo, requiere mayor experiencia en conocimiento y tiempo de

análisis. Por otro lado aplicando la técnica de inmunoblot 2-DE se detectaron AATs, de los

cuales A1AT fue la proteína sérica encontrada como más prometedora en sus primeros

estudios, para confirmar si en el suero de pacientes con cáncer vs controles existía este AATs

se analizaron 25 sueros diagnosticados con carcinoma ductal infiltrante en Etapa II, en 24 se

detectó respuesta ante A1AT resultando de esta manera con una alta frecuencia en cuanto a los

casos positivos contra los casos controles, de los cuales solamente 2 de 20 muestras se

pudieron detectar; indicando de esta manera, que los sueros de pacientes con cáncer de mama

contienen autoanticuerpos contra A1AT, motivo por el cual se propone como preliminar y

potencial biomarcador útil para el diagnóstico de pacientes con cáncer de mama en etapas

tempranas.


84

10. PERSPECTIVAS

En el caso de la búsqueda de marcadores tumorales de cáncer de mama mediante técnicas

proteómicas en 2-DE se sugiere realizar nuevamente el análisis de las proteínas estudiadas por

espectrometría de masas para su identificación, de igual manera se propone un análisis más

detallado de los datos estadísticos de la zona de mediano y alto peso molecular, la cual se

muestra interesante, llevando estos estudios al encuentro de diferencias que sean establecidas

como significativas y que de alguna manera lograrían arrojar mayor número de datos sobre

posibles biomarcadores .

Por otro lado mediante los estudios realizados por inmuno-proteomica es importante enfatizar

que es un estudio preliminar y se sugiere realizar nuevos ensayos con otros tipos de cáncer,

así como en alguna otra etapa en cáncer de mama y de igual manera con mayor número de

muestras que complementen los resultados obtenidos.


85

11. BIBLIOGRAFÍA

1. Abbas Abul k., Lichtman Andrew H., Pillai Shiv. 2008. Immunology cellular and

molecular. 6th edition, Editorial Elsevier. 2. Adkins Joshua., Susan M Varnum., Kenneth J Auberry., Ronald J Moores., Nicolas H

Angell., Richard D Smith., David l Spriger., Joel G Pounds. 2002. Toward a human blood serumproteome. doi:10.1074/mcp.m200066-mcp200.

3. Aly Karsan., Bernhard J. Eigl., Stephane Flibotte., Karen Gelmon., Philip Switzer., Patricia Hassell Dorothy Harrison., Jenniferlaw., Malcolm Hayes., Moira Stillwell., Zhen Ziao., Thomas P. Conrads., and Timothy Veenstra. 2005. Analytical and Preanalytical Biases in serum proteomic pattern analysis for breast cancer diagnosis. Clinical chemistry 51, no. 8, 1525-1528.

4. Awadallah SM., Atoum MF. 2004. Haptoglobin polymorfhism in breast cancer patients from Jordan. Clin. Chim. 34:17-21.

5. Barba Ana., Ofelia Lugo-Melchor., Erika Briones., Alicia Chagolla., Antonio De Leon., Leticia Santos., Guelaguetza Vazquez., Mauricio Salcedo. 2007. Analisis of human serum from women affected by cervical lesions. 7:65-72.

6. Belluco C., Petricoin Ef., Mammano E., Facchiano F., Ross-Rucker S., Nitti D., Di Maggio C., Liu C., Lise M., Liotta Lance A. and Whiteley G. Serum proteomic analysis identifies a highly sensitive and specific discriminatory pattern in stage 1 breast cancer. Breast oncology 2007.

7. Bertucci Francois., Birnbaum Daniel., and Goncalves Anthony. 2006. Proteomics of breast cancer. Molecular & Cellular proteomics. 5:1772-1786.

8. Biomol. 2007. Electroforesis bidimensional. www.medmol.es/tecnica.ctm?id=25 9. Biomol. 2007. Proteómica. www.medmol.es/tecnica 10. Casal Ignacio. 2008. Biotecnología, genómica y proteómica del

cáncer.www.institutoroche.es/genomica.php?op=biotecnologia&id=20. 11. Chapman C., Murray A., Chakrabarti, Thorpe A., Woolston C., Sahin U., Barnes A.

2007. Autoantibodiesin breast cancer: their use as an aid to early diagnosis. Ann Oncol 18:868-73.

12. Coronato Silvia., Graciela E. Laguens., Osvaldo M., Spinelli., Wanda Di Girolamo.2002. Marcadores tumorales en cáncer de mama. MEDICINA (Buenos Aires) 62: 73-82.

13. Danaei Goodarz., Ding Eric L., Mozaffarian Dariush., Taylor Ben., Rehm jürgen., Murray Chistopher., ezzati Majid. 2009. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assement of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. Plas Medicine. 6:1-23.

14. Desmetz Caroline., Bascoul-Mollevi Caroline., Rochaix Philippe., Lamy perre-Jean., Kramar Andrew., Rouanet Philippe., Maudelonde Thierry., Mangé Alain., Solassol Jerome. Identification of a mew panel of serum autoantibodies associated with the


86

presence of in situ carcinoma of the breast in younger women. Clin Cancer Res. 15:4733-4741.

15. Disis ML. & Cheever MA. 1997. HER-2/neu protein: a target for antigen-specific immunotherapy of human cancer. Adv Cancer Res. 71:343-371.

16. Domol R. and Hebersold R. 2006. Mass spectrometry and protein analysis. Science 312:212-217

17. Duan L., Wang y., Shun-Cheng Li S., Wan Z., and Zhai J., 2005. Rapid and simultaneous detection of human hepatitis b virus and hepatitis c virus antibodies based on a protein chip assay using nano-gold immunological amplification and silver staining method. bmc infectious diseases. 5:53.

18. Elmore JG., Armstrong K., Lehman CD., Fletcher SW. 2005. Screening for breast cancer. Jama 293:1245-56.

19. Esserman LJ., Shieh Y., Park JW., Ozanne EM. 2007. A role for biomarkers in the screening and diagnosis of breast cancer in younger women. Expert Rev Mol Diagn 7:533-44.

20. Fernández Félix Madrid. 2005. Autoantibodies in breast cancer sera:candidate biomarkers and reports of tumorigenesis. Cancer letters. 230:187-198.

21. Gardner Eldon J.., Simmons Michael J., Snustad Peter. 2007. Principios de genética, cuarta edición. Cap 17. Ed Limusa Wiley.

22. Gutiérrez P. Humberto., De la Vara S. Román., 2008. Análisis y diseño de experimentos, segunda edición. Editorial Mc Graw Hill.

23. Goldknopf Ira., Park Helen., Fritsche Herbert A., Kuerer Henry. Proteomic methods for diagnosis and monitoring of breast cáncer. u.s. co7k1/26,co7k1/28, co7k1/36,go1n33/574,go1n33/68,co7k1/00, go1n33/574 go1n33/68(ipc1):go1n33/700. 13 nov 2003. us20020301512 20021120.

24. Gupta Digant., Lis Christopher G. 2010. Pretreatment serum albumin as a predictor of cancer survival: A systematic review of the epidemiological literature. Nutrition Journal. 9:1-16.

25. Hamrita B., Chahed K., Trimeche M., Guillier C., Hammann P., Chaïeb A., Korbi S., Chouchane L. 2009 Proteomics-based identification of alpha1-antitrypsin and haptoglobin precursors as novel serum markers in infiltrating ductal breast carcinomas. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 404(2):111-8.

26. Hanash Sam. 2003. Disease proteomics. Nature. 422:226-232. 27. Hannah Alexander., Andrew L., Stegner., Collete Wagner-Mann., Garret C., Stephen

Alexander., Edward R. 2004. Proteomic analysis to identify breast cancer biomarkers in nipple aspirate fluid. 10: 7500-7510.

28. Hennessy Bryan., Mills Gordon., Coombes Kevin., Gonzales Ana. U.S. go1n33/574, c12n5/06, go1n33/574, c12n5/06. 05 ag 2008. us20070835234 20070807.

29. Huagh H., Stasyk T., Modandell S., Dieplinger H., Falkensammer G., Griesmacher ., A., Mogg M., Scheiber M., Feuerstein I., Huck C., Stecher G., Bonn G., Huber L. 2006. Biomarkers discovery in breast cancer serum usin 2-D diferencial gel electrophoresis/MALDI-TOF/TOF and data validation byroutine assays. Electrophoresis. 27:1641-1650.

30. Instituto nacional del cáncer (INC). 2008. www.cancer.gov/español. 31. Internationa Agency for Research on Cancer (IARC) 2008. www.iarc.fr. 32. John A., Mclntrye., and W. Page Faulk., 2009, Autoantibodies potencial of cancer

therapeutic monoclonal antibodies.


87

33. Kyo Yi Jae., Jong Wook Chang., Wonshik Han., Jong Won Lee., Eunyoung Ko., Dong Hyun Kim., Ji-Yeon Bae., Jonghan Yu., Cheolju Lee. 2009. Autoantibody to Tumor Antigen, Alpha 2-HS Glycoprotein: A Novel Biomarker of Breast Cancer Screening and Diagnosis., 18:1357-1364.

34. Kirmiz Crystal., Bensheng Li., Hyun Joo., Brian H Clowerst., Helen K Chews., Kit S Lam., Anthony Ferrige., Robert Alecio., Alexander D Borowsky., Shola Sulaimon., Carlito B Lebrilla., Suzanne Miyamoto. 2006. A serum glycomics approach to breast Cancer Biomarkers. doi 10.1074/mcp.m600171-mcp200.

35. Knaul Felicia Marie., Lozano Rafael., Arreola-Ornelas Héctor., Gómez Dantés Héctor. 2008. México: numeralia de cáncer de mama. www.funsalud.org.mx/competitividad

36. Kohlmeier I., Rehm J., Hoffmeister H. 1990. Lifestyle and trends in worldwide breast cancer rates. 609:259-67.

37. Kösters JP., Gøtzsche PC. Autoexamen o examen clínico regular para la detección precoz del cáncer de mama; 2003 (Revisión Cochrane traducida). En: La Biblioteca Cochrane Plus, 2007 Número 2. Oxford: Update Software Ltd. Disponible en: www.update-software.com.

38. Lacely James., Kreimer Aimee., Buys Aundra., Marcus Pamela., Chang Shih-Chen., Leitzman Michael., Hoover Robert., Prorok Phillips., Berg Christine., Patricia Hartge. 2009. Breast cancer epidemiology accordin to recognized breast cancer risk factors in the prostate, lung, colorectal and ovarian (PLCO) cancer screening trial cohort. BMC Cancer. 9:1-8.

39. Laronga Cristine., Richard R Drake. 2007. Proteomic approach to breast cancer. vol 14 pp 360-366.

40. Law MR., Morris JK., Wald NJ & Hale AK. 1994. Serum albumin and mortality in the BUPA study. Int. J. Epidemiol. 23:38-41.

41. Lee W, JinY, Chang T, Lin Y, Su I. 1999.Immunolocalization of BCRA1 protein in normal breast tissue and sporadic invasive ductal carcinomas: a correlation with other biological parameters. Histopathology. 34: 106-112.

42. Lenner P., Wiklund F., Emdin So., Arnerlov C., Eklund C., Hallmans G., Zentgraf H., Dillner J. 1999. Serum antibodies against p53 in relation to cancer risk and prognosis in breast cancer: a population-based epidemiological study. Br J Cancer 79:927-932.

43. Liao Qiulin., Zhao Liang., Chen Xiaodong., Deng Yongjian., Din Yanqing. 2008. Serum proteome analysis for profiling protein markers associated with carsinogenesis and lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma. Clin Exp Metastasis, 25:465-476.

44. Liu W., P Wang., Z. Li., W. Xu., L. Dai., K.Wang., J. Zhang. 2008. Evaluation of tumor-associated antigen (TAA) miniarray in inmunodiagnosis of colon cancer. Scandinavian journal of Inmunology; 57-63.

45. Luque Jose., HerraézAngel. 2002. Biologia Molecular r Ingeneria Genetica: conceptos técnicas y aplicaciones de la salud. Ed. Revertré. Madrid, España.

46. Marcus N. Y., Brunt E. M., Blomenkamp k. 2010. Characteristics of hepatocellular carcinoma in a murine model of alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology Research. 40: 641–653v.

47. Mark D., Schuchard., Richard J., Mehigh., Steven L. Cockrill., George T. Lipscomb., Jonathan D. Stephan., Justin Wildsmith., Rafael Valdes-Camin., William K. Kappel., Alex J. Rai., and Graham B.I. Scott. 2005. Artifactual isoform profile modification


88

following treatment of human plasma or serum with protease inhibitor, monitored by 2-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. 39:239-247.

48. Markes Diana. 2002. Receptores de estrógeno: bases moleculares aplicadas a medicina. Universidad de Los Angeles. www.vitae.ucv.ve/pdfs/VITAE_3012.PDF.

49. Masiá Jaume. 2009. Después del cáncer de mama. Editorial Integal. Barcelona, España.

50. Mateo Cristina M., Roque Lourdes T., Rodriguez Mabel., Rojas Gestrudis., Talavera Ariel. Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliosido n-glicolilgm3 y su uso para diagnóstico y tratamiento de tumores. mex. a61k39/395, co7k16/46. 31 mar 2006. pa/a/2005/011368.

51. Medicina molecular. 2007. www.medmol.es/tecnica.cfm?id=25. 52. Michael Davis., Hanash Samir. 2006. Plasma-based proteomics in early detection and

therapy. 8:217 doi:10.1186/bcr1619. 53. M. Muñoz., P. Fernández., B. Farrús., M. Velasco., J. Fontdevila., G. Zanón., S. Vidal.,

J. Oriola., M. Gironès., M. J. Sánchez., X. Caparrós., J. Güell., P. Gascón. 2007. El cáncer de mama. Fundación BBVA · Hospital Clínic de Barcelona. http://www.forumclinic.org/enfermedades/cancer-de-mama/enfermedades/cancer-de-mama/archivospdf/es.pdf .

54. Molina Maria., Reigosa Aldo., Nobrega Doris., Molina Yajaira. 2001. Receptores de estrógeno y progesterona en cáncer de mama asociación con variables clinicopatológicas. DHC 5:3-7.

55. Morgan Gilberto., Adriana Aguilar Lemarroy., Luis Felipe Jave Suaréz. 2008. Más salud y menos cáncer: guía práctica para la prevención del cáncer. Editoreal Leamas. P.61-82.

56. Mojica Tobias., Sánchez Oscar., Bobadilla Leonardo. 2003. La proteómica la otra cara de la genómica. Nova 1:1974-2370.

57. Myeong-Hee Yu., andDong-You ng Noh1., Kalenka Armin., Robert E Feldmann., Kevin Otero Martin H Maurer., Klaus F Waschke., Fritz Fiedler. 2006. Changes in the serum proteome of patients with sepsis and septic shock. doi: 10.1213/01.ane 0000242533.59457.70.

58. National Breast Cancer Organization (NBCO). 2009. www.y-me.org/espanol/informacion/diagnostico/tipos.

59. Natinonal Comprehensive Cancer Network (NCCN). 2007. Clinical Practice Guidelines in Oncology. Breast Cancer. NCCN V2. www.nccn.org.

60. Novartis oncology 2011. Que es el cáncer de mama. www.ribbonofpink.com/spanish/content/what-is-breast-cancer.jsp.

61. Organización Mundial de la Salud (OMS). http://www.who.int/mediacentre/news/notes/2007/np31/es/index.html.

62. Oliva Jaime., Febe Elena. 2007. Diagnóstico molecular en medicina, cap. 13. Editorial El manual moderno.

63. Orozco Esther., Vidal Patricio., 2000. Genética y biomedicina molecular, cap 12. Editorial Limusa.

64. Park BW., Oh Jw., Kim JH., Park SH., Kim KH., Lee KS. 2008. Preoperative CA 15-3 and CEA serum levels as predictor of breast cancer outcomes. Ann Oncol. 19:675-681.

65. Parkin D. Max., Bray Freddie., Ferlay J., Pisani Paola. 2002. Global Cancer Statistics, 2002. Ca Cancer J Clin 2005; 55:74-108.


89

66. Pereira-Faca SR., Kuick R., Puravs E., Zhang Q., Krasnoselsky AL., Phanstiel D., Qiu J., Misek DE., Hinderer R., Tammemagi M., Landi MT., Caporaso N., Pfeiffer R,Edelstein C., Goodman G., Barnett M., Thornquist M., Brenner D., Hanash SM.2007. Identification of 14-3-3 theta as an antigen that induces a humoral response in lung cancer. Cancer Res 67:12000-6.

67. Peto Julian. 2001. Progress cancer epidemiology in the last century and the next decade. Mature. 411:390-395.

68. Petricoin Ef., Ardekani Am., Hitt Ba. 2002. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet; 359:572-577.

69. Phillips A., Shaper AG & Whincup PH. 1989. Association between serum albumin and mortality from cardiovascular disease, cancer, and other causes. Lancet II, 1434 - 1436.

70. Pietrowska Monika., Lukasz Marczak., Joanna Polanska., Katarzyna Behrendt., Elzbieta Nowicka., Anna Walaszczyk., Aleksandra Chmura L., Regina Deja., Maciej Stobiecki., Andrzej Polanski., Rafal Tarnawski., Piotr Widlak. 2009. Mass spectrometry-based serum proteome pattern analysis in molecular diagnostics of early stage breast cancer. Journal of Translational Medicine 7:60.

71. Ruiz Pablo. 2006. Marcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos en cáncer de mama. respyn. 5-2006. www.respyn.uanl.mx/especiales/2006/ee-05-2006/simposios/s3.htm#top.

72. Sandoval John., Katharyn E Turner., Derek J Hoelz., Frederick J Rescorla., Robert J Hickey., Linda H Malkas. 2007. 142(2): 268-274.

73. Scottish Intercollegiate Guidelines Network (SIGN). 2005. Managent of breast cancer in women. A national clinical guidelines. Edinburg: SIGN no 84. www.sign.ac.uk.

74. Said Gil., Zárate de Lara Guillermo. 1998. Métodos estadísticos: un enfoque interdiciplinario, cap. 6 y 8. Editorial trillas.

75. Soussi T. 2000. P53 Antibodies in the sera of patients with various types of cáncer: a review. Cancer Res. 60:1777-1788.

76. Stearns V., Yamauchi H., Hayes DF. 1998. Circulating tumor markers in breast cancer: accepted utilities and novel pros-pects. Breast Cancer Res Treat. 52: 239-59.

77. Styer Lubert., Tymoczko Jonh L., Berg Jeremy M. 2008. Bioquímica, Sexta edicion. Ed. Revertré.

78. Tanja Fehm., Sven Becker., Silke Duerr-Stoerzer., Karl Sotlar., Volkmar Mueller., Diethelm Wallwiener., Nancy Lane., Erich Solomayer1 and Jonathan Uhr. 2007. Determination of HER2 status using both serum HER2 levels and circulating tumor cells in patients with recurrent breast cancer whose primary tumor was HER2 negative or of unknown HER2 status Breast Cancer Research Vol 9 No 5.

79. Tamesa Mchiko S., Kuramitsu Yasuhiro., Fujimoto Masanori., Maeda Noriko., Nagashima Yukiko., Tanaka Toshiyuki., Yamamoto Shigeru., Oka Masaaki., Nakamura Kazuyuki. 2009. Detection of autoantibodies against cyclophilin A and triosephosphate isomerase in sera from breast cancer patients by proteomic analysis. Electrophoresis. 30:2168-2181.

80. Tong AW., Fulgham P., Jay C., Chen P., Khalil L., Liu S., Senzer N., Eslund AC., Han J., Nemunaitis J. 2009. MicroRNA profile analysis of human prostate cancer. Cancer Gene Ther. 16.206-216.

81. Tzu-Chia Lai., Hsiu-Chuan Chou., Yi-Wen Chen., Tian-Ren Lee., Hsin-Tsu Chan., Hsin-Hsin Shen., Wei-Ta Lee., Szu-Ting Lin., Ying-Chieh Lu., Chieh-Lin Wu., and


90

Hong-Lin Chan. 2010. Secretomic and Proteomic Analysis of Potential Breast Cancer Markers by Two-Dimensional Differential Gel Electrophoresis. 1302-13-22.

82. Vicent T. De Vita., Teodores Lawrence. Steven a. Rosenberg. 2008. Principles & Practice of Oncology. 8TH Edic. Ed. Lippincott William & Wilkins.

83. Wewers MD., Casolaro MA., Crystal RG. 1987. Comparison of alpha-1 antitrypsin levels and anti-neutrophil elastase capacity of blood and lung in an individual with the alpha 1-antitrypsin phenotype null-null before and during alpha 1-antitrypsin augmentation therapy. Am Rev Respir Dis. 135: 539-593.

84. White Ian., Keyur Patel., William T Symond., Anouk Dev., Philip Griffin., Nikos Tsokanas., Mark Skehel., Chiang Liu., Amany Zekry., Paul Cutler., Mahanandeeshwar Gattu., Don C Rockey., Michelle M Berrey., John G Mchutchison. 2007. Serum proteomic analysis focused on fibrosis in patients with hepatitis c virus infection. 5:33 do:10.1186/1479-5876-533.

85. William C. S. Cho. 2007. Contribution of oncoprotemic to cancer biomarker discovery. molecular cancer. 6:25, doi:10.1186/1476-4598-6-25.

86. Wolfgan Arthur Schulz. 2005. Molecular Biology of Human cancers. Ed. Sringer Science N.Y.

87. Wulfkuhle JD., Sgrori DC., Krutzsch H., et. al. 2002. Proteomics of human breast ductal carcinoma in situ. Cancer Res 62:6740-9.

88. www.inegi.gob.mx. tabla de datos de tasa de mortalidad por edades. 89. Xie Li-Qi., Chao Zhao., San-Jun Cai. 2010. Novel Proteomic Strategy Reveal

Combined α1 Antitrypsin and Cathepsin D as Biomarkers for Colorectal Cancer Early Screening. Journal of Proteome Research. 9: 4701-4709.

90. Yang P., Wentzlaff K. A., Katzmann J. A. 1999. α1-antitrypsin deficiency allele carriers in lung cancer patients. Cancer Epidemiol. Biomark. 8: 461-465.

91. Zhang Z., Bast Rc., Yu Y. 2004. Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancer. Cancer res; 4:5882-5890.

92. Zhu H., and Snyder M. 2003. Protein chip technology. Curr opin chem biol. 7 (1): 55-63.


91

12. APÉNDICE

12.1. Carta de consentimiento informado.


92

12.2. Tabla del total de sueros obtenidos.


93

Muestras

de suero Edad Diagnóstico Fecha de toma Diagnostico

1 38 control 21/05/2008

2 32 control 22/05/2008

3 53 control 21/05/2008

4 60 control 21/05/2008

5 36 control 21/05/2008

6 _

control 21/05/2008

7 _ control 21/05/2008

8 38 control 26/05/2008

9 41 control 26/05/2008

10 47 control 29/05/2008

11 35 control 29/05/2008

12 47 control 29/05/2008

13 46 control 05/06/2008

14 26 control 09/06/2008

15 28 control 09/06/2008

16 50 control 09/06/2008

17 38 control 09/06/2008

18 25 control 10/06/2008

19 - control 10/06/2008

20 - control 10/06/2008

21 25 control 11/06/2008

22 25 control 11/06/2008

23 30 control 11/06/2008

24 38 control 11/06/2008

25 24 control 12/06/2008

26 26 control 12/06/2008

27 60 control 13/06/2008


94

28 42 control 16/06/2008

29 54 control 16/06/2008

30 49 control 17/06/2008

31 51 control 17/06/2008

32 - control 17/06/2008

33 - control 17/06/2008

34 27 control 23/06/2008

35 40 control 25/06/2008

36 34 control 30/06/1008

37 46 control 12/08/2008

38 27 control 12/08/2008

39 23 control 12/08/2008

40 24 control 12/08/2008

41 29 control 18/08/2008

42 33 control 14/10/2008

43 24 control 14/10/2008

44 49 control 25/09/2008

45 26 control 25/09/2008

46 45 control 05/11/2008

47 59 Control

48 54 control

49 24 control

50 36 control

51 36 control

52 49 control

53 43 control

54 40 control

55 24 control

56 20 control

57 23 control


95

58 46 BIRADS 0 ACRIII 11/06/2008

59 45 BIRADS 0 ACR IV 11/06/2008

60 51

BIRADS 0 ACRIII

cirugia 4 años 13/06/2008

61 61 BIRADS 0 12/11/2008

2831/09 Carcinoma de

conductos mamarios invasor

sin patron especifico,grado II

62 43 BIRADS I ACR II 11/06/2008

63 53 BIRADS II ACR III 11/06/2008

64 34 BIRADS II ACR II 11/06/2008

65 51 BIRADS II ACR II 12/06/2008

66 60 BIRADS 2 13/06/2008

67 47 BIRADS 2 ACRII 16/06/2008

68 56 BIRADS II ACR III 17/06/2008

69 57 BIRADS II ACR II 23/06/2008

70 57 BIRADS II 18/12/2008

71 52 BIRADS II 07/01/2009

72 49 BIRADS II 07/01/2009

73 64 BIRADS II 08/01/2009

74 58 BIRADS II 09/01/2009

75 47 BIRADS II 09/01/2009

76 55 BIRADS II 13/01/2009

77 44 BIRADS II 13/01/2009

78 48 BIRADS II 13/01/2009

79 61 BIRADS II 14/01/2009

80 52 BIRADS II 14/01/2009

81 48 BIRADS II 14/01/2009

82 52 BIRADS II 16/01/2009

83 41 BIRADS II 16/01/2009


96

84 68 BIRADS IV ACRI 27/06/2008

EHP: 9799/08 Características

histologicas normales, se

sugiere nueva Biopsia.

85 66 BIRADS IV ACRI 30/06/2008 Papilomatosis intraductal

86 49 BIRADS IV ACR II 20/08/2008

Carcinoma ductal in situ con

extensión lobulillar e invasión

multifocal grado II etapaI

87 48 BIRADS IV ACR II 20/08/2008

88 78 BIRADS IV ACR I 20/08/2008

89 43 BIRADS IV ACR III 16/10/2008

90 35 BIRADS IV 22/10/2008

91 54 BIRADS IV 05/11/2008

92 41 BIRADS IV 06/11/2008

93 68 BIRADS IV 06/11/2008

94 57 BIRADS IV 21/11/2008

95 44 BIRADS IV 24/11/2008

96 68 BIRADS IV 24/11/2008

97 58 BIRADS IV 02/12/2008

98 67 BIRADS IV 02/12/2008

99 53 BIRADS IV 02/12/2008

100 63 BIRADS IV B 02/12/2008

18428/08 Carcinoma ductal

infiltrante sin patron

especifico. etapaII

101 58 BIRADS IV 05/12/2008

ETO 18075/08 Ca ductal

infiltrante etapa II

102 45 BIRADS IV A 08/12/2008

103 40 BIRADS IV 08/12/2008

Carcinoma ductal infiltrante

moderadamente

diferenciado

104 58 BIRADS IV 09/12/2008

105 54 BIRADS IV 10/12/2008

106 47 BIRADS IV 10/12/2008


97

107 36 BIRADS IV 11/12/2008

108 55 BIRADS IV 11/12/2008

109 50 BIRADS IV 11/12/2008

110 46 BIRADS IV 12/12/2008


moderadamente

diferenciado etapa II

111 36 BIRADS IV 12/12/2008

112 61 BIRADS IV 16/12/2008 Negativo a malignidad

113 52 BIRADS IV 16/12/2008

114 51 BIRADS IV C 18/12/2008

19048/08 Carcinoma ductal

infiltrante. etapa II

115 43 BIRADS IV 18/12/2008

116 57 BIRADS IV A 19/12/2008

117 62 BIRADS IV 21/01/2009

Adenocarcinoma de los

ductos mamarios etapa II

118 43 BIRADS IV ACR II 21/01/2009 Carcinoma ductal infiltrante

119 53 BIRADS IV A 05/02/2009

120 56 BIRADS V ACR III 18/06/2008

EHP: 36/09 : Adenocarcinoma

de los ductos mamarios

Grado II.

121 79 BIRADS V 01/07/2008

EHP: 9970/08 Ca ductal bien

diferenciado invasor grado I

con permeacion linfatica

122 43 BIRADS V 20/11/2008

123 45 BIRADS V 02/12/2008 2641/09 Positivo Her 2

124 40 BIRADS V 08/12/2008

EHP 16872/08 :

Adenocarcinoma papilar

invasor con areas quisticas

ductales pobre a moderada

diferenciación

125 64 BIRADS V 15/12/2008 Carcinoma ductal infiltrante etapa II

126 40 BIRADS V ACR III 27/01/2009 Carcinoma ductal infiltrante etapa II

127 44 BIRADS V ACR II 27/01/2009

Carcinoma ductal con

microinvasión etapa II

128 65 BIRADS V ACR II 03/02/2009


ductos mamarios etapa II

129 54 BIRADS V 03/02/2009

Carcinoma de ductos

mamarios infiltrante

moderadamente



98

130 38 BIRADS V ACR II 10/03/2009

Carcinoma de los ductos

mamarios infiltrante etapa II

131 51 BIRADS V ACR III 19/03/2009 Carcinoma ductal invasor etapaIII

132 54 BIRADS VI 12/09/2008

Carcinoma lobulillar mama

derecha etapaIII

133 53 BIRADS VI 26/11/2008

EHP: 2759/09Carcinoma

ductal infiltrante

moderadamente

diferenciado con permeacion

linfatica Grado II etapaIII

134 49 09/12/2008

135 BIRADS IV


mamarios infiltrante etapa II

136 46 BIRADS IV


moderadamente


137 45 BIRADS V Carcinoma ductal infiltrante etapa II

138 45 BIRADS IV

Carcinoma de ductos


moderadamente


139 45 BIRADS V Carcinoma ductal infiltrante etapa II

140 41 BIRADS IV


moderadamente


141 40 BIRADS IV


ductos mamarios

142 50 BIRADS IV



143 37 BIRADS V Carcinoma ductal infiltrante

144 59 BIRADS V

145 39

146 39

147 44

148 59


99

12.3. PROTOCOLO PARA DEPLESIÓN DE SUEROS

Kit proteoprep 20 plasma Sgma-Aldrich.

1. Diluir el buffer de equilibrio y de elución del kit 9:1(para que quede 1X).

2. Diluir el suero 9:1 en el buffer de equilibrio del kit (anteriormente diluido).

3. Sonicar durante 20 min.

4. Pasar el suero por los filtros corning spin-x del kit y centrifugar a 4,500 rpm 1min.

5. Llevar a concentrar la muestra en speed vac durante 1h (o a un volumen no menor

de 100µl).

6. Equilibrar la columna de deplesión del kit de la siguiente manera:

a) Con la jeringa del kit tomar 4ml de buffer de equilibrio y pasarlos por la

columna.

b) Colocar la columna en un eppendorff y centrifugar a 4,500 rpm 1min.

c) Desechar el centrifugado del eppendorff.

7. Colocar el suero filtrado y concentrado en la columna e incubar durante 15 min.

8. Colocar la columna de deplesión en un eppendorff y centrifugar el suero a 4,500

rpm 1min, (guardar el suero centrifugado)

9. Eluir la columna de la siguiente manera.

a) Con la jeringa del kit tomar 2ml de buffer de elucion y pasarlos por la

columna.

b) Colocar la columna en un eppendorff y centrifugar a 4,500 rpm 1min.

c) Desechar el centrifugado, si es que no se desea analizar.

10. Equilibrar nuevamente la colunma como en el paso 6.

11. Colocar el suero filtrado y concentrado en la columna e incubar durante 15 min.

12. Colocar la columna de deplesión en un eppendorff y centrifugar el suero a 4,500

rpm 1min, (guardar el suero centrifugado por segunda vez).

13. Repetir los pasos 9 y 10.

Nota: La columna se guarda una vez equilibrada y son buffer de equilibrio ya que

puede ser utilizada hasta 100 depleciones.


100

12.4. PROTOCOLO PARA TINCIÓN CON PLATA (SIGMA-ALDRICH)

Reactivo Volumen Tiempo Solución Agua desionizada

Metanol Ácido acético

20 ml 25 ml 5 ml

20 min

Fijadora

Etanol Agua desionizada

15 ml 35 ml

10 min

Lavado (Etanol 30%)

Agua desionizada

50 ml 10 min Lavado

Agua desionizada Sensibilizador

50 ml 500 µl

10 min

Sensibilizador

Agua desionizada

50 ml 10 min Lavados (2)

Agua desionizada Proteo silver silver

50 ml 500 µl

10 min

Plata

Agua desionizada

50 ml 1-1.5 min Lavado

Agua desionizada Proteo silver developer1 Proteo silver developer2

46 ml 2.5 ml 50 µl

3-7 min

Revelado

Proteo silver Stop

2.5 ml 5 min Parado

Agua desionizada

50 ml 30 seg Lavado

12.5. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA GELES DE ACRILAMIDA

Buffer de corrida 5X

Agitar en poco agua desionizada y aforar al final

Trisma base 15.1 g

Glicina 72 g

SDS 5 g

Agua desionizada 1000 ml


101

Buffer de muestra stock 2X (SDS)

Solución stock de la cual se prepara el buffer de muestra 1X y 2X

50ml 100ml

Trisma base 12M 0.76 g 1.52 g

SDS 0.12M 1.0 g 2.0 g

Ajustar pH a 6.8

Glicerol 2M 10 ml 20 ml

Buffer de muestra 2X

500 µl

Buffer de corrida 2X 400 µl

B-mercaptoetanol 50 µl

Azul de bromofenol 50 µl

Buffer de muestra 1X

1000 µl

Buffer de corrida 2X 500 µl

B-mercaptoetanol 50 µl

Azul de bromofenol 50 µl

Agua bidestilada 500 µl

Marcador de peso molecular

Hervir por 5 min, cargar de 3 a 6 µl por carril; almacenar a 4°C

20 µl 40 µl

Buffer de muestra 1X 19 µl 38 µl

Marcador de peso molecular 1 µl 2 µl


102

Persulfato de amonio 10%

Preparar al momento (almacenar a 4°C no más de 1 semana)

Persulfato de amonio 40 mg (0.040 g)

Agua bidestilada 400 µl

4X Tris Cl/SDS, pH 6.8

Ajustar el pH a 6.8 antes de aforar

50 ml 100ml

Trisma base 3.02 g 6.55 g

SDS 0.2 g 0.4 g

Agua bidestilada 50 ml 100 ml

4X Tris Cl/SDS, pH 8.8

Ajustar el pH a 6.8 antes de aforar

50 ml 100ml


SDS 0.2 g 0.4 g


Acrilamida 30%

Disolver la acrilamida en 40 ml de agua agregar al bis acrilamida y aforar, protegiendo de la luz. Filtrar por poro de 0.45 y almacenar a 4°C

50 ml 100ml


SDS 0.2 g 0.4 g



103

Azul de coomassie

Agitar el metanol y azul de coomassie por 24h, posteriormente agregar el ácido acético y al final aforar con agua adicionándola por las paredes.

1000 ml Concentrado 500 ml

Metanol 50% 500 ml 250 ml

Azul de coomassie 0.05% 0.500 g 1g

Ácido acético glacial 10% 100 ml 50 ml


Solución decolorante

1000 ml Concentrado 1000 ml Ácido acético 50 ml 100 ml

Metanol 65 ml 400 ml


PARA DOBLE DIMENSION

Solución de rehidratación

Preparar al momento Solución de rehidratación 94.5 %

DTT 1M 5 %

IPG 4-7 0.5 %

Buffer de equilibrio 2-DE

Concentración final Cantidad Urea (PM 60.06) 6M 72.1 g

Tris-HCl pH 8.8 75mM 10.0 ml

Glicerol (87% w/w) 29.3% (v/v) 69 ml (84.2 g)

SDS 2% (v/v) 4.0 g

1% azul de bromofenol 0.002% (w/v) 400 µl

Agua bidestilada a 200 ml


104

PARA ELECTROTRANSFERENCIA Y W.B.

Protocolo de electrotransferencia

1. En una charola verter el buffer de transferencia, mojar las esponjas, el papel filtro

y la membrana de nitrocelulosa.

2. Colocar la placa de transferencia con la parte negra hacia abajo y dentro acomodar

de la siguiente manera:

a) Esponja.

b) Papel filtro

c) Gel de poliacrilamida (MPM hacia la izquierda)

d) Membrana

e) Papel filtro

f) Esponja

3. Se cierra la placa y se coloca dentro de la cámara de electrotranferencia

coincidiendo los polos.

4. Se coloca el refrigerante y se llena con el buffer de transferencia.

5. Se corre al 100v 1h

Buffer de transferencia

Disolver el tris y la glicina en poco agua, adicionar metanol y aforar 1000 ml 2000 ml

Trizma base 3.025 g 6.05 g

Glicina 14.45 g 28.9 g

Metanol 200 ml 400 ml

Agua bidestilada a 1000 ml a 2000 ml

PBS pH 7.0

500 ml 1000 ml 10X NaCl 4 g 8 g 80 g

KCl 0.1 g 0.2 g 2 g

NaH2PO4 0.325 g 0.650 g 6.5 g

Kh2PO4 0.1 g 0.2 g 0.2 g


105

PBS/Tween

400 ml 800 ml PBS 400 ml 800 ml

Tween 20 400 µl 800 µl

Solución de revelado con HRP Se preparan la solución A y la solución B por separado, se mezclan al momento de revelar

Solución A Solución B

HRP Metanol PBS H2O2 Volumen final

60 mg 20 ml 100 ml 60µl 120 ml

30 mg 10 ml 50 ml 30 µl 60 ml

15 mg 5 ml 25 ml 15 µl 30 ml

7.5 mg 2.5 ml 12.5 ml 7.5 µl 15 ml


106

13. ANEXOS

13.1. Cursos,

� Seminario de información: manejo de presentación oral y escrita.

Realizado el 31 de Octubre de 2010. CIATEJ. Guadalajara Jalisco


107

13.2. Congresos

� Simposio Mexicano de Espectrometría de Masas y Proteómica Celular y Molecular.

Realizado del 8-12 de Noviembre de 2009. San Luis Potosí.

� Simposio de cáncer de mama.

Realizado el 25 y 26 de Octubre de 2010. Mexico DF.

� México Bio 2010. 2do. Foro internacional de negocios en biotecnología. Con el cartel

de investigación científica: Identificación de antígenos y autoanticuerpos en sueros de

pacientes con cáncer de mama en etapas tempranas.

Realizado del 20 al 22 de Octubre de 2010. CINVESTAV Irapuato.


108


109

13.3. Artículo


110


111


112


113


114


115


116


117

13.4. Patente

Tesis-MC.Eneida Aracely L pez Arias.) · y Tecnología en la opción terminal de Biotecnología...

Documents

Transcript of Tesis-MC.Eneida Aracely L pez Arias.) · y Tecnología en la opción terminal de Biotecnología...