UNIVERSIDAD POLITCNICA DE VALENCIA Departamento de Produccin Vegetal Cambios en la expresion genica asociados a la maduracion interna del Iruto de los citricos: identiIicacion de rutas metabolicas implicadas en la acumulacion y eliminacion de acidos. TESIS DOCTORAL Guillermo Soler Fayos Valencia, 2009 UNIVERSIDAD POLITCNICA DE VALENCIA Departamento de Produccion Vegetal Cambios en la expresion genica asociados a la maduracion interna del Iruto de los citricos: identiIicacion de rutas metabolicas implicadas en la acumulacion y eliminacion de acidos. MEMORIA PRESENTADA POR: Guillermo Soler Fayos Para optar al grado deDOCTOR INGENIERO AGRONOMO DIRECTORES: Dr. Manuel Talon Cubillo Dr. Manuel Cercos Sanchez Valencia, 2009 INSTITUTO VALENCIANO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS Apartado OIicial 46113 Moncada (Valencia) D.ManuelTalonCubillo,DoctorenCienciasBiologicas,ProIesordeInvestigaciondel InstitutoValencianodeInvestigacionesAgrarias(IVIA)yD.ManuelCercosSanchez, Doctor en Ciencias Biologicas, Colaborador CientiIico Adjunto del IVIA, INFORMAN que: D.GuillermoSolerFayos,IngenieroAgronomo,harealizadobajonuestradireccionel trabajo que, con el titulo 'Cambios en la expresion genica asociados a la maduracion interna del Iruto de los citricos: identiIicacion de rutas metabolicas implicadas en la acumulacion y eliminacion de acidos, presenta para optar al grado de Doctor Ingeniero Agronomo. Para que asi conste a los eIectos oportunos, Iirman el presente documento en Moncada a 1 de junio de 2009. Fdo. Dr. Manuel Talon Cubillo Dr. Manuel Cercos Sanchez A mi mujer Beatriz y a mi hija Claudia AGRADECIMIENTOS En primer lugar me gustaria expresar mi agradecimiento a mis directores de tesis, Dr. ManuelTalonyDr.ManuelCercos,porsuinestimableayudaalolargodeestosintensos aos de trabajo y por supuesto, al IVIA por su Iinanciacion y por permitirme trabajar en sus instalaciones.Tambien me gustaria agradecerle al Dr. Luis Navarro por la colaboracion prestada al poner a mi disposicion material vegetal unico para realizacion de nuestros estudios. AlDr.DomingoIglesiasporsuvaliosaayudaconlastecnicasanaliticasde espectroIotometria de masas y cromatograIia ionica de adsorcion. Ademas, quiero agradecer la disponibilidad de todas las personas que han compartido susconocimientosconmigoduranteeldesarrollodeestatesis:RaIaelBono,FranciscoR. Tadeo,JavierTerol,MiguelAngelNaranjo,ConchaDomingo,CarlosRomero,Salvador Zaragoza, Aurelio Buj, Alejandro Medina, Ignacio Trenor, Angel Boix y Batiste Alberola.QuieroagradecerdeunaIormaespecialelapoyoquemehanbrindadoentodo momentoPepitaGiner,MAngelesForneryJuanB.Former,queparamisoncomomi segunda Iamilia. AIsabelSanchis,ElenaBlazquez,MatildeSancho,AnaAlmenar,IsabelLopez, Fernando Martinez y Patricia Botella-Pavia su excepcional ayuda en el laboratorio. Y por su pueto a mis grandes compaeros y mejores amigos, Enri Alos, Javier Agusti, Fernando Andres y Javi Brumos.Finalmente,porsuapoyo,paciencia,dedicacionyamor,lesdedicomimayor agradecimientoamispadres,JuanyAmparo;mimujer,Beatriz;mihija,Claudiaymi hermano, Juan. ABREVIATURAS 3-PGA3-IosIoglicerato Acoaconitasa ATPadenosina triIosIato cDNADNA complementario CFGPProyecto de Genomica Funcional de Citricos (Citrus Functional Genomics Project) DDAdias despues de antesis DEPCdietilpirocarbonato dNTPsdesoxinucleotidos triIosIato E.Serror estandar ESTsmarcador de secuencia expresada (expressed sequence tags) GC/MS/MScromatograIia de gases unida a espectroIotometria de masas (gas chromatography tandem mass spectrometry) HPLCcromatograIia liquida de alta eIicacia (high perIormance liquid chromatography) MIPSCentro de InIormacion de Munich para Secuencias de Proteinas (Munich InIormation Center Ior Protein Sequences) mRNARNA mensajero pbpares de bases PCRreaccion en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) RNAacido desoxi-ribonucleico rRNARNA ribosomico RT-PCRretrotranscripcion de la reaccion en cadena de la polimerasa (retrotranscription-polymerase chain reaction) SDSdodecil sulIato sodico SOTAAlgoritmo de Autoorganizacion en Arbol (SelI Organising Tree Algorithm) SSCNa3Citrato 0.15 M pH 7, NaCl 1.5 M Tris2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol UDPuridina diIosIatoUTPuridina triIosIato UVultravioleta PartedelosresultadospresentadosenloscapitulosIIIyIVhansidopublicadosenel articulo: Global analysis oI gene expression during development and ripening oI citrus Iruit Ilesh. A proposed mechanism Ior citric acid utilization. Plant Mol. Biol. 62: 513-27 (2006). Indice I. Introduccin general ............................................................................................. 1 1.1. Los frutos...................................................................................................... 3 1.1.1. Definicin de fruto................................................................................. 3 1.1.2. La maduracin de los frutos.....................................................................3 1.2. Los frutos ctricos.......................................................................................... 5 1.2.1. Morfologa............................................................................................ 5 1.2.2. Maduracin ........................................................................................... 6 1.3. Metabolismo de los cidos............................................................................. 7 1.3.1. Respiracin............................................................................................ 7 1.3.2. Degradacin del almidn y la sacarosa, y la gliclisis.......................... 7 1.3.3. Sntesis de cido ctrico ......................................................................... 10 1.3.4. Derivacin del gamma aminobutarato (GABA)................................... 13 1.4. Calidad interna de los frutos ctricos ........................................................... 15 1.5. Produccin mundial de ctricos. Relevancia de Espaa .............................. 15 II. Objetivos .............................................................................................................. 17 III. Anlisis global de la expresin gnica durante el desaroolo y la maduracin interna de los frutos de Clementina de Nules (Citrus Clementina)....................................... 21 3.1. Introduccin .................................................................................................. 23 3.2. Materiales y mtodos..................................................................................... 25 3.2.1. Material vegetal..................................................................................... 25 3.2.2. Cuantificacin del contenido en agua y de los metabolitosseleccionados ................................................................................................... 26 3.2.2.1. Contenido en agua............................................................................ 26 3.2.2.2. Carbohidratos solubles ..................................................................... 26 3.2.2.3. CloroIilas y carotenoides.................................................................. 26 3.2.2.4. Acido ascorbico................................................................................ 27 3.2.3. Hibridacin de micromatrices de cDNA .............................................. 28 3.2.3.1. Marcaje de las muestras ................................................................... 28 3.2.3.2. Hibridacion y lavado ........................................................................ 29 3.2.3.3. Adquisicion y analisis de datos......................................................... 30 3.3. Resultados y discusin................................................................................... 31 3.3.1. Identificacin y clasificacin funcional de genes involucrados en el desarrollo y la maduracin de la pulpa de los frutos ctricos........................ 31 3.3.2. Factores de transcripcin y otras proteinas reguladoras ..................... 35 3.3.3. Regulacin metablica ........................................................................... 38 3.3.3.1. Descripcion general .......................................................................... 38 3.3.3.2. Expansion celular en la Iase II.......................................................... 40 3.3.3.3. Acumulacion de agua: genes de acuaporinas .................................... 41 3.3.3.4. Metabolismo de los carbohidratos .................................................... 43 3.3.3.5. Metabolismo secundario. Sustitucion de pigmentos.......................... 45 3.3.3.6. Reduccion de los niveles de vitamina C ........................................... 47 3.3.3.7. Reduccion de lipidos ........................................................................ 48 IV. Degradacin del cido ctrico durante la maduracin ...................................... 51 4.1. Introduccin .................................................................................................. 53 4.2. Materiales y mtodos..................................................................................... 54 4.2.1. Material vegetal..................................................................................... 54 4.2.2. Cuantificacin de los slidos solubles totales ....................................... 55 4.2.3. Anlisis de cidos................................................................................... 55 4.2.3.1. Determinacion de la acidez total....................................................... 55 4.2.3.2. CuantiIicacion del acido citrico mediante cromatograIia ionica de adsorcion....................................................................................................... 55 4.2.4. Cuantificacin de gamma aminobutarato (GABA) y glutamato mediante cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas........................ 55 4.2.5. Anlisis Northern blot ........................................................................... 56 4.2.6. Cuantificacin de RNAs mensajeros por RT-PCR en tiempo real...... 56 4.2.7. Anlisis de la expresin gnica global mediante la hibridacin de micromatrices de cDNA de ctricos (7K) ........................................................ 58 4.2.8. Identificacin de los genes de aconitasa de ctricos.............................. 58 4.3. Resultados y discusin................................................................................... 59 4.3.1. Expresin de genes asociados al metabolismo del cido ctrico........... 59 4.3.2. Expresin y caracterizacin de los genes de la aconitasa .................... 67 4.3.2.1. Determinacion de acidos en las variedades Clementina de Nules y Fortune .......................................................................................................... 68 4.3.2.2. Induccion de la expresion de la aconitasa durante el desarrollo y lamaduracion del Iruto...................................................................................... 70 4.3.2.3. IdentiIicacion de la Iamilia genica de la aconitasa de citricos........... 71 4.3.2.4. PerIiles de expresion de los genes Aco-1, Aco-2 y Aco-3 en Clementina de Nules y Fortune ............................................................................................. 76 V. Acumulacin del cido ctrico durante el desarrollo del fruto........................... 79 5.1. Introduccin .................................................................................................. 81 5.2. Materiales y mtodos..................................................................................... 82 5.2.1. Material vegetal..................................................................................... 82 5.2.2. Tratamientos con cido arsanlico........................................................ 83 5.2.3. Cuantificacin de cidos y slidos solubles totales............................... 83 5.2.4. Anlisis de los cidos ctrico, mlico e isoctrico mediante cromatografa inica de adsorcin.......................................................................................... 83 5.2.5. Obtencin de un clon de cDNA de la enzima citrato sintasa de clementina........................................................................................................ 84 5.2.6. Hibridacin de micromatrices de cDNA de ctricos (7K) .................... 84 5.2.7. Cuantificacin de RNAs mensajeros por RT-PCR en tiempo real...... 85 5.3. Resultados y discusin................................................................................... 85 5.3.1. Efecto del tratamiento con cido arsanlico sobre la concentracin de cidos................................................................................................................ 85 5.3.2. Expresin de los genes de las principales enzimas implicadas en el metabolismo de los cidos.............................................................................. 88 5.3.3. Cambios de expresin gnica inducida por acido arsanlico....... 95 5.3.4. Comparacin de la expresin gnica en el endocarpio de las variedades Fortune y Clementina de Nules....................................................................... 100 VI. Discusin general ................................................................................................ 105 VII. Conclusiones ...................................................................................................... 117 VIII. Bibliografa....................................................................................................... 121 IX. Anexos y tablas suplementarias.......................................................................... CD 1 I. Introduccin general 2 3 1.1.Los frutos 1.1.1.Definicin de fruto Los Irutos pueden ser deIinidos como ovarios maduros constituidos por tejidos carpelares y, en algunos casos, tejidos Ilorares extracarpelares. La Iuncion biologica de los Irutos es la de protegeralassemillasdurantesudesarrolloyIacilitarposteriormentesudispersion, asegurando de este modo la reproduccion de las plantas (Giovannoni, 2004). Dentro de los Irutos se pueden distinguir dos tipos, los Irutos dehiscentes, como por ejemplo, las legumbres o las silicuas (la dehiscencia es el mecanismo mediante el cual el Iruto se abre permitiendolaliberacionydispersiondelassemillas,revisadoenFerrandiz,2002)ylos Irutosindehiscentesocarnosos(porejemplo,lamanzana,eltomateoloscitricos),queno tienenestemecanismoyhanidoevolucionadoyadquiriendodiversasIormas,colores, sabores y aromas con el Iin de resultar atractivos a los animales que se encargan de digerirlos y dispersar las semillas (Giovannoni, 2004).UnaparticularidadimportantedeldesarrollodealgunosIrutos,comoporejemplolos citricos, es la partenocarpia que consiste en la capacidad de desarrollarse sin la necesidad de producirsemillasque,generalmente,sonlasresponsablesdeproducirlosestimulos necesariosapartirdeloscualesseproduceeldesarrollodelIruto(Agusti,2000).Esta capacidad de los Irutos partenocarpicos de desarrollarse sin el concurso de las semillas puede serdebidaaalteracionesgeneticasuhormonalesporlasquesemimetizanlosestimulos producidosporlassemillaso,enotroscasos,porlapresenciadepequeassemillascon embrionesabortadosquepresentanlacapacidadsuIicientedeproducirlosestimulos necesariosoporlaproducciondedichosestimulosporlapareddelovario(Mazzucato, 1998). 1.1.2.La maduracin de los frutos En general, la maduracion puede deIinirse como la Iase Iinal del desarrollo de los Irutos, tras lacualsedispersanlassemillas.EnlosIrutosdehiscentes,esteprocesocomprendela senescenciadeltejidocarpelarylaseparaciondelasvalvasporunazonadeabscision denominadazonadedehiscenciaqueseIormaentrelasvalvasyelreplum(revisadoen Ferrandiz, 2002). EnelcasodelosIrutoscarnososoindehiscentes,lamaduracionimplicacambios bioquimicos,IisiologicosyestructuralesquemodiIicanlaapariencia,textura,sabory aromas. Estos cambios hacen que los Irutos maduros sean atractivos para los animales que se 4 encargandedispersarlassemillas(Giovannoni,2004).LosIrutosindehiscentespuedenser clasiIicadosrespectoaltipodemaduracionenclimatericossidurantelamaduracion presentanunpicoenlabiosintesisdeetilenoyunincrementodelarespiracion(comopor ejemploeltomate,lamanzanaoelplatano),onoclimatericossiestosIenomenosnose producen (como por ejemplo, los citricos, la uva o la Iresa, Giovannoni, 2004). La maduracion de los Irutos climatericos va acompaada de una serie de cambios rapidos en sucomposicionquimica,comolahidrolisisdepolisacaridos,hidrolisisdelaparedcelular, aumentodelapermeabilidaddelasmembranascelulares,cambiosenacidosorganicos, aumento de aroma, cambios en la pigmentacion, etc. Estos cambios tambien se producen de IormagradualenlosIrutosnoclimatericos,aunquenovanacompaadosporaumentos respiratorios o de la produccion de etileno (Agusti, 2003). LamaduraciondelosIrutosclimatericoshasidoestudiadaconproIundidad,usandoel tomatecomoplantamodelo(Giovannoni,2004).Sinembargo,losmecanismosde maduracion de los Irutos no climatericos (entre los que se incluyen los citricos) son todavia practicamentedesconocidos,sibienenIresas(Irutosnoclimatericos)sehaobservadoque algunosIactoresdetranscripciondelaIamiliadelosMADS-boxseexpresandurantela maduracion (White, 2002). EnlosIrutosnoclimatericossehaobservadoqueapesardenopresentarelpicode respiracionsiquerespondenalasaplicacionesexogenasdeetilenoinduciendosemRNAs especiIicos y la pigmentacion de la corteza de las naranjas (Alonso, et al.,1995). ElhechodequecadatipodeIrutopresenteprogramasespeciIicosdedesarrolloy maduracionhace necesario el estudio de estos procesos en las distintas especies. El estudio del desarrollo y maduracion de los Irutos citricos resulta de gran interes economico, ya que loscitricossonunodelosprincipalescultivosIrutalesdelmundo.Ademas,laposible existencia de mecanismos especiIicos debidos a genes exclusivos de este genero (Forment et al., 2005) tiene un notable interes cientiIico.Finalmente,resultainteresantedestacarquelamaduracionaportaungrannumerode cualidadesycaracteristicasnutricionalesquesuponenuncomponentesigniIicativodela dieta humana. Por lo tanto, parece logico pensar que la comprension de los puntos clave del control de la regulacion de la maduracion o de procesos especiIicos de la maduracion como loscarotenoides,losIlavonoidesolosacidosorganicosnentreotros,nospermitiran manipularcaracteristicasnutricionalesodecalidadasociadasconlamaduracion (Giovannoni, 2004). 5 1.2. Los frutos ctricos 1.2.1.Morfologa LosIrutoscitricossonuntipoespecialdebayadenominadahesperidio,consistenteenun numerovariabledecarpelosunidosradialmente.Filogeneticamente,loscarpelosse consideran hojas modiIicadas orientadas verticalmente con sus margenes curvados y unidos en un haz central, Iormando loculos (segmentos) dentro de los cuales se Iorman las semillas y las vesiculas del zumo.EnlosIrutoscitricossepuedendistinguirdospartes:elpericarpoopielyelendocarpoo pulpa, que es la parte comestible del Iruto. Dentro del endocarpo se encuentran las vesiculas dezumo,queseIormanapartirdeunasprotuberanciasredondeadasqueaparecenenlas membranasdelosloculosdebidoalapresenciadeunamasadetejidomeristematico.Las vesiculasdezumoadultassonestructurasmulticelularesdeIormaalargadaqueseorientan hacia el haz central desde la periIeria del segmento, al que se unen mediante un pequeo tallo o pedunculo IiliIorme (Spiegel-Roy y Goldschmidt, 1996; Tadeo et al., 2003).Elpericarpo,asuvez,comprendeelexocarpooIlavedoIormadoporcelulas parenquimaticas densamente empaquetadas con una Iina cuticula en su parte mas externa y el mesocarpooalbedoIormadotambienporcelulasparenquimaticasperodebilmente empaquetadasdejandograndesespaciosintercelularesqueproporcionanaestetejidosu apariencia esponjosa caracteristica (Tadeo et al., 2003; Figura 1.1). Figura1.1.MorIologiadeunhesperidio.DibujodelcortetransversaldeunIrutomadurodecitricos.(Fuente: www.biologia.edu.ar/botanica/tema24/24-6Iruto.htm) 6 1.2.2.Maduracin Bain(1958)estudioelcrecimientodelanaranjaValencia(Citrussinensis|L.|Osbeck), dividiendo su desarrollo en tres Iases: la Iase I de division celular, que incluye la Iloracion y la Iormacion de los diIerentes tejidos que daran lugar al Iruto; la Iase II que se caracteriza por la elongacion de las celulas del Iruto; y la Iase III, periodo en el cual la tasa de elongacion de lascelulasesmuyreducidoyenelqueseproducenlamayoriadeloscambiosinternos (principalmentereducciondelaacidezyacumulaciondeazucaresenlapulpa)yexternos (IundamentalmenteelcambiodecolordelIlavedo)queconIormanlamaduraciondelos Irutos (Figura 1.2). LosIrutoscitricospresentanunaaltaconcentraciondeacidosantesdelamaduracion.El acido citrico el mas abundante en la pulpa de la mayoria de los citricos, seguido por el acido malico (Sinclair et al., 1945; Clements, 1964). Estos acidos se sintetizan en el Iruto y no son transportadosdesdelashojascomodemostroKoch(1984)alinjertarIrutosdevariedades masacidasen ramas de variedades menos acidas y viceversa y comprobar que laacidez de losIrutosnovariaba.SinclairyRamsey(1944)observaronquelasnaranjaspresentanuna rapida acumulacion de acido citrico en los Irutos jovenes, con un maximo alrededor de 100 diasdespuesdelapolinizacion.Laconcentraciondeacidocitricosereducedespues notablemente durante las Iases II y III del desarrollo del Iruto (Bain. 1958). El hecho de que elmaximodeacidez se produzca cuando el volumen del Iruto es el 50 delvolumen Iinal (Erickson,1968)sugierequelareducciondelaacidez no se debe unicamente ala dilucion producida por la acumulacion de agua durante la expansion del Iruto. La acumulacion de acidos en los Irutos citricos no es homogenea dentro del arbol, de manera queseproduceunamayoracumulaciondeacidosenlosIrutosconorientacionessurestey suroeste,siendoenelinteriordelacopadondelosIrutosacumulanmenosacidos.Asi mismo, se ha observado que la concentracion de acidos es mayor en la parte central del Iruto queenlaszonasperiIericas(SitesyReitz,1950).LaclimatologiatambienaIectaala acumulacion de acidos, pudiendose destacar que en las zonas aridas y con poca pluviometria seproduceunamayoracumulaciondeacidosenlosIrutosqueenlaszonashumedas (Erickson, 1968). Losacidossonsintetizadosenlamitocondriadelascelulasdelasvesiculasdelzumo, acumulandoseposteriormenteenlasvacuolasdeestasmismascelulastanprontocomo aumentalaconcentracion de acido en el citosol (Sinclair, 1984; Echeverria y Valich, 1988; Gout,1993).ProbablementeelIlujodeacidocitricoatravesdeltonoplastoseproduce 7 mediante la diIusion de la Iorma protonada, tal y como ocurre con el acido malico (Lttge y Smith,1984)ysuacumulacionenlavacuolaestadeterminadaporsuconcentracionenel citosol,queseasuvezsedebealbalanceentrelasintesisyladegradacion(Lobitetal., 2003). Figura 1.2. Frutos, enteros y seccionados, de mandarino de la variedad Clementina de Nules (Citrus clementina Hort. ex Tan.) durante las tres Iases del desarrollo. 1.3. Metabolismo de los cidos 1.3.1.Respiracin La respiracion permite la sintesis de acidos a partir de carbohidratos. Las vias metabolicas de la respiracion pueden dividirse en cuatro etapas: en la primera se produce la degradacion de almidon y sacarosa, para Iormar Iructosa 1,6-biIosIato. En una segunda etapa, la Iructosa 1,6-biIosIatoseoxidahastapiruvatoatravesdelaviaglicolitica.Enunaterceraetapa,el piruvatoentraenlamitocondriadondeseoxidaaCO2,produciendoselamayorpartedel NADH. En esta etapa se produce la sintesis de acido citrico. En la cuarta etapa, el NADH es Iinalmenteoxidado por la cadena de transporte electronico mitocondrial para producir ATP (Ribas-Carbo y Gonzalez-Meler, 2000; Dennis y Blakeley, 2000). 1.3.2.Degradacin de almidn y sacarosa y glicolisis. Elalmidoneselcarbohidratodereservamasimportantedelasplantas.Lasenzimas principalesencargadasdeladegradaciondelalmidonson:u-amilasa,-amilasayalmidon IosIorilasa, que degradan el almidon hasta glucosa o glucosa 1-IosIato. Lasacarosa,compuestaporunamoleculadeglucosayunadeIructosa,eselproducto Iotosinteticomasutilizadoparaeltransportedecarbohidratosatravesde la planta y puede serdegradadaaglucosayIructosamediantelainvertasaoUDP-glucosayIructosa,enel -/st . -/st . -/st . -/st . -/st .. -/st .. -/st .. -/st .. -/st ... -/st ... -/st ... -/st ...z:.cs.cs z:.cs.cs z:.cs.cs z:.cs.cs z.ct.cs z.ct.cs z.ct.cs z.ct.cs zs.c:.cs zs.c:.cs zs.c:.cs zs.c:.cs z.cs.cs z.cs.cs z.cs.cs z.cs.cs :.cs.cs :.cs.cs :.cs.cs :.cs.cs zs.c.cs zs.c.cs zs.c.cs zs.c.cs zt..cs zt..cs zt..cs zt..cs zs.z.cs zs.z.cs zs.z.cs zs.z.cs8 citosol por medio de la sacarosa sintasa (E.C. 2.4.1.13). Aunque la reaccion catalizada por la sacarosa sintasa es reversible se han encontrado concentraciones mas altas de esta enzima en tejidos donde se degrada sacarosa que en tejidos donde se sintetiza (Ribas-Carbo y Gonzalez-Meler, 2000; Dennis y Blakeley, 2000).Mediante la glicolisis se oxidanlas hexosas procedentes dela hidrolisis de la sacarosa para generarATPypiruvato,aunqueestarutatambienpuedeIuncionaralrevesgenerando hexosas a partir de compuestos de bajo peso molecular en un proceso dependiente de energia llamado gluconeogenesis. LashexosassonIosIoriladasporlahexoquinasa(E.C.2.7.1.1)ylaIructoquinasa(E.C. 2.7.1.4)paraserposteriormentecatabolizadasenlaglicolisis(Figura1.3).Estasenzimas Iormaran glucosa 6-IosIato y Iructosa 6-IosIato, respectivamente.Laglucosa6-IosIatosetransIormaenIructosa6-IosIatomediantelaenzimaglucosa6-IosIatoisomerasa(E.C.5.3.1.9)quecatalizareversiblementeestareaccion.LaIructosa6-IosIatoseIosIorilaaIructosa1,6-biIosIatoporlaacciondedosenzimasdiIerentes:la IosIoIructoquinasa(PFK;E.C.2.4.1.11),enzimaqueseinhibeenpresenciade IosIoenolpiruvatoyquecatalizalareacciondemanerairreversibleyla IosIoIructoIosIotransIerasa(PFP;E.C.2.4.1.90)cuyaaccionesreversible(Ribas-Carboy Gonzalez-Meler, 2000; Dennis y Blakeley, 2000).LaIructosa1,6-biIosIatoaldolasa(E.C.4.1..2.13)rompelaIructosa1,6-biIosIatoendos triosas-IosIato: la dihidroxiacetona IosIato (DHAP) y el gliceraldehido 3-IosIato (GAP), que pueden interconvertirse mediante la triosa-IosIato isomerasa (E.C. 5.3.1.1). Elgliceraldehido3-IosIatoesposteriormenteoxidadoaglicerato1,3-biIosIatomediantela enzimagliceraldehido3-IosIatodeshidrogenasa(E.C.1.2.1.12).Elglicerato1,3-biIosIato pierdeungrupoIosIatoconvirtiendoseen3-IosIoglicerato(3-PGA)enunareaccion reversible catalizada por la 3-IosIoglicerato quinasa (E.C. 2.7.2.3). La IosIoglicerato mutasa (E.C.5.4.2.1)transIormael3-IosIogliceratoen2-IosIoglicerato,elcualseconvierteen IosIoenolpiruvato (PEP) por una reaccion reversible catalizada por la enolasa (E.C. 4.2.1.11) (Ribas-CarboyGonzalez-Meler,2000;DennisyBlakeley,2000).ElIosIoenolpiruvato tambienpuedesersintetizadomedianteladescarboxilaciondelmalatoviaoxalacetatopor accion de la IosIoenolpiruvato carboxiquinasa (E.C. 4.1.1.49) (Blanke et al., 1988; RuIIner y Kliewer,1975).EnlareacciondeIosIorilacioncatalizadaporlaenzimapiruvatoquinasa (E.C. 2.7.1.40) el IosIoenolpiruvato se convierte en piruvato. Tambien se puede convertir el IosIoenolpiruvatoenoxalacetatoporlaacciondelaIosIoenolpiruvatocarboxilasa(E.C. 4.1.1.31) (Figura 1.3).9 Laenzimamalatodeshidrogenasacitosolica(E.C.1.1.1.37)reduceeloxalacetato produciendomalato.AdemaslaenzimamalicadependientedaNADP(E.C.1.1.1.40) ubicadaenelcitosolcatalizalareaccionreversibledelmalatoapiruvato(Wheeleretal., 2008). Figura 1.3. Esquema de la ruta de la glicolisis en plantas. EstudiosrealizadosporChollet,etal.(1996)yPlaxton(1996)indicanquelarutautilizada porlaIosoIoenolpiruvatocarboxilasa(E.C.4.1.1.31),lamalatodeshidrogenasacitosolica (E.C.1.1.1.37)ylaenzimamalicadependiantedeNADP(E.C.1.1.1.40)parasintetizar piruvato sin el concurso de la piruvato quinasa (E.C. 2.7.1.40) juega un papel importante en elaportedeintermediariosdelciclodelosacidostricarboxilicosen tejidos no Iotositeticos de plantas C4 y en en raices de Pisum sativum cuando hay escasez de Pi. Uno de los puntos clave para conocer la regulacion metabolica pasa por conocer los enzimas decisivosdelaglicolisis,locualresultabastantecomplicadodebidoalaexistenciade reaccionesalternativas,sinembargoalgunosestudiosdemuestranqueelcontroldela glicolisis es ejercido principalmente por las enzimas que catalizan las reacciones implicadas GLICERATO 1,3-BIFOSFATODHAP GLICERALDEHIDO 3-FOSFATOFRUCTOSA 1,6-BIFOSFATO3-FOSFOGLICERATO2-FOSFOGLICERATOFRUCTOSA 6-FOSFATOGLUCOSA 6-FOSFATOGLUCOSAFOSFOENOLPIRUVATOPIRUVATOHEXOQUINASAPFPGLUCOSA 6-FOSFATO ISOMERASAGLICERALDEHIDO 3-FOSFATO DESHIDROGENASAPFKALDOLASATRIOSAFOSFATO ISOMERASA3-FOSFOGLICERATO QUINASAFOSFOGLICERATO MUTASAENOLASAPIRUVATO QUINASAOXALACETATOFOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASAPIRUVATO CARBOXIQUINASAMALATOMALATO DESHIDROGENASA CITOSLICANADP ENZIMA MLICOGLICERATO 1,3-BIFOSFATODHAP GLICERALDEHIDO 3-FOSFATOFRUCTOSA 1,6-BIFOSFATO3-FOSFOGLICERATO2-FOSFOGLICERATOFRUCTOSA 6-FOSFATOGLUCOSA 6-FOSFATOGLUCOSAFOSFOENOLPIRUVATOPIRUVATOHEXOQUINASAPFPGLUCOSA 6-FOSFATO ISOMERASAGLICERALDEHIDO 3-FOSFATO DESHIDROGENASAPFKALDOLASATRIOSAFOSFATO ISOMERASA3-FOSFOGLICERATO QUINASAFOSFOGLICERATO MUTASAENOLASAPIRUVATO QUINASAOXALACETATOFOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASAPIRUVATO CARBOXIQUINASAMALATOMALATO DESHIDROGENASA CITOSLICANADP ENZIMA MLICO10 enlaconversiondelashexosasenhexosasIosIato,Iructosa6-IosIatoenIructosa1,6-biIosIato y IosIoenolpiruvato en piruvato (Copeland, 1987).Laviadelas pentosas IosIato esta estrechamente relacionada con la via glicolitica ycon la sintesisdenucleotidos,antocianos,ligninasyacidosgrasos.Almismotiempoque proporcionaintermediariosdelaviaglicolitica,comoelgliceraldehido3-IosIato,permite utilizar la glucosa 6-IosIato directamente como Iuente de energia (Ribas-Carbo y Gonzalez-Meler,2000;DennisyBlakeley,2000).EstaviacomprendedosIases,laprimeraconsiste esencialmenteenunaconversionirreversibledelaglucosa6-IosIatoenribulosa5-IoaIato catlizadoporlasenzimasglucosa6-IosIatodeshidrogenasa(E.C.1.1.1.49),6-IosIogluconolactonasa (E.C. 3.1.1.31) y 6-IosIogluconato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.44) , de IormaqueproporcionapoderreductorenlaIormaNADPHquepuedeserutilizadosenun amplio numero de rutas anabolicas (Dennis, et al. 1997); la segunda consiste en una serie de interconversionesentreazucaresIosIoriladosde3,4,5,6y7carbonoscatalizadosporlas enzimasribosa5-IosIatoisomerasa(E.C.5.3.1.6),ribulosa5-IosIato3-epimerasa(E.C. 5.1.3.1), transaldolasa (E.C. 2.2.1.2) y transquetolasa (E.C. 2.2.1.1). Con la excepcion de la transaldolasatodoslosdemasenzimassonaIibolicos,participandoasuvezenelciclode Calvin (Debman, et al., 1999) 1.3.3.Sntesis del cido ctrico. Losacidospiruvicoymalicosontransportadosalinteriordelamitocondriaparaser utilizadosenel ciclo de Krebs. La oxidacion del piruvato a acetil-coenzima A (acetil-CoA) dentrodelamitocondriaescatalizadaporelcomplejomultienzimaticopiruvato deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.51) (complejo que se encuentra tambien en los cloroplastos), que estacompuestoportressubunidadescataliticas:piruvatodeshidrogenasa,dihidrolipoil transacetilasa y dihidrolipoil deshidrogenasa.El acetil-CoA se condensa con el oxalacetato para producir citrato, en una reaccion catalizada irreversiblemente por la citrato sintasa (E.C. 2.3.3.1). En las plantas la mayor parte del citrato producido se exporta al citosol mediante un transportador especiIico que introduce malato y oxalacetato, en la mitocondria y libera citrato al citosol (Heldt, 2004).Eloxalacetato,necesarioparalasintesisdecitrato,seproduceenelciclodeKrebsporla accion de la malato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) (Hawker, 1969; RuIIner, 1976; Musrati et al., 1998); sin embargo, debido a la salida de citrato al citosol es necesario alimentar el ciclo conmetabolitosintermediariosmediantereaccionesanapleroticas.Unade estas reacciones, 11 catalizadaenelcitosolporlaIosIoenolpiruvatocarboxilasa(E.C.4.1.1.31),transIormael IosIoenolpiruvato en oxalacetato (Janc et al., 1992) de modo que este puede ser transportado alinteriordelamitocondria.Otrareaccionanapleroticaeslacatalizada,tambienenel citosol,porlamalatodeshidrogenasa(E.C.1.1.1.37)quetransIormaeloxalacetatoen malato;esta enzima esta codiIicada por una Iamilia multigenica y es dependiente de NAD en mitocondrias, citosol y peroxisomas, y de NADP en cloroplastos.Unavezenelinteriordelamitocondria,laenzimamalicamitocondrial(E.C.1.1.1.38, dependientedeNAD)catalizaladescarboxilacionoxidativademalatoapiruvato(Deuce, 1985), mientras que la malato deshidrogenasa mitocondrial (E.C. 1.1.1.37) cataliza la sintesis de oxalacetato a partir de malato. De esta Iorma se puede sintetizar citrato sin el concurso de todoslosintermediariosdelciclodelosacidostricarboxilicos,produciendoseademasuna gran cantidad de NADH.La enzima aconitasa (E.C. 4.2.1.3) cataliza la isomerizacion reversible del citrato a isocitrato, proceso en el que se produce el compuesto intermediario cis-aconitato. La aconitasa presenta dos isoenzimas, una en la mitocndria y otra en el citosol (Heldt, 2004). Dentro de la mitocondria el isocitrato se oxida irreversiblemente a u-cetoglutarato mediante la enzima NAD isocitrato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.41), que es activada por el citrato (Cox y Davies, 1970; Duggleby y Dennis, 1970). Existen dos isoenzimas de isocitrato deshidrogenasa siendo la dependiente de NAD, situada en la mitocondria, la responsable de la produccion de u-cetoglutarato en el ciclo de Krebs y la dependiente de NADP la que cataliza esta reaccion en el citosol. Se han encontrado altos niveles de actividad de esta ultima enzima en el citosol, siendo muy bajos en el cloroplasto y la mitocondria (MiIlin y Lea, 1982; Chen y Gadal, 1990; Cheng, 1998; Galvez et al., 1994; Gallardoetal.,1995;Kruseetal.,1998;Palomoetal.,1998).Elu-cetoglutarato,asi obtenido,puedesertransportadoalcitosolmedianteuntransportadorespeciIicoque introduce malato en la mitocondria, simultaneamente.Laoxidaciondelu-cetoglutaratoasuccinil-CoAestacatalizadaporelcomplejo multienzimaticou-cetoglutaratodeshidrogenasa(E.C.1.2.4.2).Eltioesterproducido, succinil-CoA,esricoenenergia,queseliberaenIormadeATPenlareaccionsiguiente catalizadaporlaenzimasuccinato-CoAligasa(E.C.6.2.1.5)quehidrolizaelsuccinil-CoA paradarsuccinato.ElsuccinatoesoxidadoaIumaratoporlaacciondelasuccinato deshidrogenasa (E.C. 1.3.99.1), enzima ubicada en la membrana mitocondrial.12 ElIumaratosehidrataconelconcursodelaenzimaIumarasa(E.C.4.2.1.2)paraIormar malatoenunareaccionreversible.Finalmentelamalatodeshidrogenasadependientede NAD (E.C. 1.1.1.37) oxida el malato, produciendose oxalacetato y NADH (Heldt, 2004). El citrato sintetizado en la mitocondria se exporta al citosol mediante un cotransportador que introduce malato y oxalacetato en la mitocondria al mismo tiempo. Desde el citosol, el citrato seintroduceenlavacuolaparasualmacenamiento.Ademas,existendosrutasde catabolizacion de citrato en el citosol. En la primera, el citrato se isomeriza a isocitrato por la acciondeunaaconitasacitosolica(Sadkaetal.,2000a),ymediantelaisocitrato deshidrogenasadependientedeNADP ubicada en el citosol (E.C. 1.1.1.41) el isocitratose convierte en u-cetoglutarato (MiIlin y Lea, 1982; Chen y Gadal, 1990; Cheng, 1998).En la segunda ruta, la enzima ATP citrato liasa (E.C. 2.3.3.8) utiliza al citrato presente en el citosolcomoprecursorparalasintesisdeacetilCoAyoxalacetato,talycomoseha demostradoenanimales,levadurasyhongos(RatledgeyEvans,1989).EnplantaslaATP citratoliasaesunaenzimaheterodimericacuyalocalizacionhaestadosometidaa controversia; mientras que en un principio algunos autores como Fritsch y Beevers (1979), la ubicaronenlosplastidiosIinalmenteKaethneryRees(1985);Maetal.(2001)y principalmenteFatlandetal.(2002)demostraronsulocalizacioncitosolica,nosiendo detectable en plastidios, mitocondrias ni peroxisomas.El acetilCoA generado en el citosol por la ATP citrato liasa se usa para la biosintesis de una granvariedaddeproductos.Sehacomprobadoqueseempleaparalasintesisdeceras cuticularesyIlavonoidesenArabidopsisthaliana(Fatlandetal.,2000),paralasinteisde lipidosensemillasdeBrassicanapus(RatledgeyRangasamy,2000)yparalasintesisde esteroles y otros isoprenoides mediante la ruta del acido mevalonico, en patata (Takeuchi et al., 1981) (Figura 1.4). 13 Figura 1.4. Esquema del ciclo de Krebs. 1.3.4.Derivacin del gamma aminobutarato (GABA) Laderivaciondel-aminobutirato(GABA)esunarutaporlacualseproducesuccinato evitandodospasosdelciclodelosacidostricarboxilicos.Laactividaddeestarutaenlas plantasseencuentraaltamenteintensiIicadadurantelarespuestaaestresesbioticosy abioticos (Snedden y Fromm, 1999).Estudiosrecientesrealizadosmediantelautilizaciondemutantesoplantascongenes antisentidodelasenzimasdelciclodelosacidostricarboxilicosindicanquelaestructura inherentealaderivaciondelGABAestaintimamenteligadaconelciclodelosacidos tricarboxilicos, puesto que alteraciones en las enzimas del ciclo de los acidos tricarboxilicos, anterioresalaproducciondesuccinatoalteranlaactividaddeladerivaciondelGABA (Lemaitre,2007),mientrasqueporelcontrario,laalteraciondelasenzimasposterioresno producenninguneIectoenelmetabolismodelGABA(Nunes-Nesi,2005).Deigualmodo, se observo que plantas transgenicas con una expresion de la succinil-CoA ligasa deIiciente se MALATOPIRUVATOACETIL-CoAOXALACETATO CITRATOMALATOMALATOFUMARATOSUCCINATO SUCCINIL-CoA -CETOGLUTARATOISOCITRATONAD ISOCITRATO DESHIDROGENASAMALATO DESHIDROGENASA MITOCONDRIALCOMPLEJO -CETOGLUTARATODESHIDROGENASASUCCINIL-CoA SINTASASUCCINATO DESHIDROGENSAFUMARASACITRATO SINTASAACONITASACOMPLEJO PIRUVATODESHIDROGENASANAD ENZIMA MLICOOXALACETATOCITRATOISOCITRATO -CETOGLUTARATOMITOCONDRIACICLO DE KREBSOXALACETATOACETIL-CoAATP CITRATO LIASAACONITASAMALATO DESHIDROGENASA CITOSLICANADP ISOCITRATO DESHIDROGENASAGLICOLISISPIRUVATOVACUOLACITRATONADP ENZIMA MLICOFOSFOENOLPIRUVATOFOSFOENOLPIRUVATOCARBOXILASAMALATOPIRUVATOACETIL-CoAOXALACETATO CITRATOMALATOMALATOFUMARATOSUCCINATO SUCCINIL-CoA -CETOGLUTARATOISOCITRATONAD ISOCITRATO DESHIDROGENASAMALATO DESHIDROGENASA MITOCONDRIALCOMPLEJO -CETOGLUTARATODESHIDROGENASASUCCINIL-CoA SINTASASUCCINATO DESHIDROGENSAFUMARASACITRATO SINTASAACONITASACOMPLEJO PIRUVATODESHIDROGENASANAD ENZIMA MLICOOXALACETATOCITRATOISOCITRATO -CETOGLUTARATOMITOCONDRIACICLO DE KREBSOXALACETATOACETIL-CoAATP CITRATO LIASAACONITASAMALATO DESHIDROGENASA CITOSLICANADP ISOCITRATO DESHIDROGENASAGLICOLISISPIRUVATOVACUOLACITRATONADP ENZIMA MLICOFOSFOENOLPIRUVATOFOSFOENOLPIRUVATOCARBOXILASA14 compensabamedianteladerivaciondelGABA.Todosestosestudiossugierenquela derivaciondelGABAdebeserconsideradacomounaparteintegraldelciclodelosacidos tricarboxilicos (Fait et al., 2007). LasintesisdeGABAenelcitosolapartirdel-cetoglutaratotienelugarmediantedos reacciones secuenciales: la primera de ellas consiste en la conversion del -cetoglutarato en glutamato y puede estar catalizada por las enzimas glutamato deshidrogenasa (E.C. 1.4.1.3), aspartatoaminotransIerasa(E.C.2.6.1.1)yalaninaaminotransIerasa(E.C.2.6.1.2).La segunda esta catalizada por la glutamato descarboxilasa (GAD; E.C. 4.1.1.15), que en plantas seencuentrareguladaporunaCa2/calmodulinacitosolica.PosteriormenteelGABAes transIormado por la enzima GABA transaminasa (E.C. 2.6.1.19) en succinato semialdehido, que mediante la accion de la succinato semialdehido deshidrogenasa (SSADH; E.C. 1.2.1.16) es oxidado a succinato (Bown y Shelp, 1997; Bouche et al., 2003).Figura 1.5. Esquema de la derivacion del GABA. Ademas de la adaptacion a los estreses, en las plantas, se le han atribuido otras Iunciones a esta ruta como el control del pH citosolico o el equilibrio entre el metabolismo del carbono y delnitrogeno(BownyShelp,1997;SneddenyFromm,1999;BuschyFromm,1999) (Figura 1.5). -CETOGLUTARATOSUCCINATOSUCCINIL-CoAGLUTAMATOASPARTATOOXALOACETATOALANINAPIRUVATOGABASUCCINATO SEMIALDEHIDOALANINAPIRUVATOGLUTAMATO -CETOGLUTARATODERIVACIN DEL GABACICLO DE KREBSSUCCINATO SEMIALDEHIDO DESHIDROGENASA GABA TRANSAMINASA GLUTAMATO DESCARBOXILASA GLUTAMATO DESHIDROGENASA ASPARTATO AMINOTRANSFERASA ALANINA AMINOTRANSFERASA -CETOGLUTARATOSUCCINATOSUCCINIL-CoAGLUTAMATOASPARTATOOXALOACETATOALANINAPIRUVATOGABASUCCINATO SEMIALDEHIDOALANINAPIRUVATOGLUTAMATO -CETOGLUTARATODERIVACIN DEL GABACICLO DE KREBSSUCCINATO SEMIALDEHIDO DESHIDROGENASA GABA TRANSAMINASA GLUTAMATO DESCARBOXILASA GLUTAMATO DESHIDROGENASA ASPARTATO AMINOTRANSFERASA ALANINA AMINOTRANSFERASA 15 1.4.Calidad interna en los frutos ctricos LamejoradelacalidaddelosIrutosdebeconstituirlaprincipalarmaparaaumentarla comercializaciondeloscitricosespaolesenloscadavezmascompetitivosmercados internacionales.Dentrodelascaracteristicasdecalidadquedebereunirunavariedadde citricosparaelconsumoenIrescodestacanlosaspectosrelacionadosconlascualidades organolepticas de los Irutos. LacalidadinternadelosIrutoscitricosseencuentraaltamenteinIluenciadaporla acumulacion de acidos organicos durante el desarrollo, hasta el punto de que la recoleccion de los Irutos viene condicionada por su acidez. El momento en el que se recolectan los Irutos viene determinado por el indice de madurez, que se deIine como la relacion entre los solidos solubles y los acidos totales (Davies et al., 1994, Marsh et al., 2000).Uno de los problemas mas importantes que presenta en la actualidad el cultivo de mandarinas clementinas(Citrus clementina Hort. ex Tan.) es la estacionalidad de la produccion, quese concentraenelperiododeseptiembreaenero.Entrelasdemandasprincipalesdelos citricultores espaoles se encuentra la obtencion de nuevas variedades que permitan ampliar dicho periodo comercial. Paraqueunavariedaddemandarinaclementinaadmitaunarecolecciontardiadebeposeer tresparticularidades:dosdeellasestanasociadasalcomportamientodelpericarpoyson el retraso en el cambio de la coloracion externa y una escasa tendencia al buIado y al colapso de lacorteza;laterceraestarelacionadaconlamaduracioninternayconsistenteenel mantenimiento de niveles aceptables de acidez hasta el momento de la recoleccion.Asipues,elconocimientodelosmecanismosmolecularesinvolucradosenlamaduracion interna de los Irutos citricos resulta necesario para poder disear herramientas agronomicas o biotecnologicas que actuen sobre este proceso. 1.5. Produccin mundial de ctricos. Relevancia de Espaa Los citricos constituyen el primer cultivo Irutal del mundo, con una produccion mundial de 108 millones de toneladas anuales y una superIicie cultivada de 7,4 millones de hectareas en 2004 (FAO, 2005). El 64 de la produccion anual mundial de Irutos citricos se produce en los seis primeros paises productores, que son, por orden cuantitativo Brasil, Estados Unidos, China, Espaa, Mexico e India. LaproduccionmundialdenaranjassedistribuyedeIormasimilar,llegandosearecolectar entre los seis primeros productores mundiales (Brasil, Estados Unidos, China, Mexico, India 16 y Espaa) un 65 del total anual. En cuanto a la produccion de mandarinas China y Espaa producen el 53 del mundial anual. EnEspaaloscitricosconstituyenelprimercultivoIrutal,conunaproduccionde6,2 millonesdetoneladasyunasuperIiciecultivadadeunas300.000hectareas. Aproximadamente el 45 de la produccion es de naranjas dulces, el 42 de mandarinas y el 13 de limones. EspaatambientieneunagranrelevanciamundialcomopotenciaexportadoradeIrutos citricosenIresco.ActualmenteeselprimerpaisexportadordeIrutoscitricos,exportando alrededordel30deltotalanualmundial.Tambieneslaprimeraexportadoradelos subgrupos citricos naranja, mandarina y limon, de Iorma independiente, con el 28 , 52 y 26 del total mundial exportado, respectivamente (FAO, 2005).Las regiones Espaolas mas importantes en relacion con la produccion de citricos son la Comunidad Valenciana con el 56,71 de la superIicie de cultivo, Andalucia con el 24,98 y la Region de Murcia con el 13,56 (MAPA. 2008). Los datos anteriores demuestran la importancia del sector citricola Espaol a nivel mundial, destacando su papel como productor de mandarinas y como exportador. Lasvariedadespertenecientesalgrupodelasmandarinasclementinas(Citrusclementina Hort. ex Tan.) se adaptan mejor al clima mediterraneo que a los climas humedos tropicales o subtropicales(DaviesyAlbrigo,1994).Ademas,losIrutosdeestasvariedadesson generalmente Iaciles de pelar, presentan un elevado contenido en zumo y no tienen semillas (Agusti, 2003). Estos Iactores Iavorecen que de la produccion total de mandarinos en Espaa, lasclementinasconstituyancasiel65,9,siendolaComunidadValencianalaprincipal productora de mandarinas de este grupo con el 81,4 de la produccion (Anuario 2006).Dentro del grupo de mandarinas clementinas la variedad Clementina de Nules destaca sobre elrestoalconstituiraproximadamenteel57delaproducciontotaldeclementinasenla Comunidad Valenciana (Balance de la cosecha de citricos. Campaa 2005/2006). 17 II. Objetivos 18 19 Elobjetivogeneraldeestetrabajoesrevelarporprimeravezloscambiosenlaexpresion genicaqueseproducenduranteeldesarrolloylamaduraciondelapulpadelosIrutos citricos, y en particular aquellos asociados a los mecanismos de regulacion de la acidez. En este trabajo tambien pretendemos identiIicar el conjunto de genes inducidos y reprimidos que regulanlasintesisyladegradaciondelacidocitricodurantelamaduracioninternadelos Irutoscitricos.Desdeunpuntodevistametabolicoseestudiaralaevoluciondelos principales acidos de los Irutos en cuatro variedades que presentan diIerencias en su periodo de maduracion, con la intencion de determinar los correspondientes patrones de acumulacion ydegradacion.Atendiendoalaexpresiondelosprincipalesgenesimplicadosenel metabolismodelosacidosseincidirasobrelosmecanismosderegulaciondesusintesis durantelasIasesIyIIdeldesarrollodelIruto,ydesudegradacionenlasIasesIIyIIIde maduracion del Iruto.Asi, los objetivos concretos de este trabajo son: 1.Estudiarloscambiosenlaexpresingnicayloscambiosmetablicosprincipales que tienen lugar durante el desarrollo y maduracin del endocarpo del fruto. ParaelloseidentiIicaranloscambiosdeexpresiongenicamediantehibridacionde micromatricesdecDNAdecitricos(7K)conmuestrasdeRNAdepulpadeIrutosde ClementinadeNulesendiIerentesestadiosdemaduracion.Losprincipalescambios metabolicos predichos por los estudios globales de expresion genica se conIirmaran mediante cuantiIicacion de metabolitos seleccionados. 2.Estudiarlaexpresindelosgenesquecodificanlasprincipalesenzimasimplicadas enlareduccindelaacidezdelosfrutos.Yproponerunmodeloqueexpliqueeste mecanismo. ParaelloseanalizaranmediantemicromatricesdecDNA,RT-PCRentiemporealy northern-blot la expresion de los genes que codiIican las principales enzimas implicadas en la degradacion de los Irutos. Con la inIormacion generada se intentara proponer un modelo de eliminacion de los acidos. 20 3.Identificarlosprocesosmetablicosdeterminantesdelaacumulacindecidosy estudiar la expresin de los genes asociados a dichos procesos. ParaelloseutilizarandosvariedadesquesediIerencianensucontenidoenacidos (ClementinadeNulesyFortune)yseestudiaranloseIectosdeltratamientoconacido arsanilico,unagentereductordelaacidez.Seanalizaranelcontenidoenacidosyla expresiondelosgenesmediantemicromatricesdecDNAdecitricos(7K)yRT-PCRen tiempo real. 21 III. Anlisis global de la expresin gnica durante el desarrolloylamaduracininternadelosfrutosde Clementina de Nules. 22 23 3.1. Introduccin LosestudiosrealizadossobrelacomposiciondelosIrutoscitricosindicanquedurantelas ultimasIasesdesudesarrolloestospresentanunaltoporcentajedeagua,ademasdeotros compuestoscomocarbohidratos,acidosorganicos,vitaminaCycarotenoides(Seymouret al.,1993;DaviesyAlbrigo,1994).DurantelasIasesIIyIIIdesudesarrolloseproducen alteraciones Iisiologicas y bioquimicas que aIectan a procesos relacionados con la expansion celular,laacumulaciondeagua,laacumulaciondesacarosa,lareducciondelaacidez,la sustituciondepigmentos,eldescensodevitaminaCylareducciondelipidos(Baldwin, 1993; Davies y Albrigo, 1994). Hastaelmomento,casitodoslosesIuerzossehanenIocadoalarealizaciondeestudios descriptivos de tipo Iisiologico y bioquimico (Baldwin, 1993) pero poco se sabe acerca de la regulaciondelaexpresiongenica,porloqueexistengrandesincognitasconrespectoalos mecanismos que controlan el desarrollo y la maduracion interna de los Irutos.Enlosultimosaossehaproducidounextraordinariodesarrollodelastecnologiasparala secuenciaciondeDNAquehapermitidolaacumulaciondegrannumerodesecuenciasde organismosmodelotalescomoHomosapiens,Escherichiacoli,Arabidopsisthaliana,y Orv:a sativa. La inIormacion disponible tanto de secuencias genomicas como de secuencias parcialesdegenesexpresados(expressedsequencetags,ESTs),dediversosorganismosha hechoposiblelacomparaciondesecuenciasentreespeciesylaidentiIicaciondegenes basandose en su homologia. El conocimiento de las secuencias genicas ha constituido la base paralaconstrucciondemicromatricesdeoligonucleotidosodecDNA.Estasultimas,se construyenapartirdeclonesdecDNAsecuenciadosporsuextremo5`yampliIicadospor PCR. Las micromatrices permiten el estudio de la expresion de miles de genes a la vez en un solo experimentoyresultandeextremautilidadalahoradeevaluarlasdiIerenciasdela expresiongenicaglobalentredistintostejidos,diIerentesestadiosdeldesarrollo,mutantes Irentealgenotiposilvestre,etc.Laimportanciadelatecnologiadelasmicromatricespara aproximacionesenladescripciondeltranscriptomaengenomicaIuncionalseesta incrementando de manera exponencial en practicamente todas las plantas y, en particular, en muchos cultivos agricolas.ElestudiodelaexpresiondelosgenesqueregulanlamaduraciondelosIrutosno climatericoshasidoabordadoenmuypocasespeciescomo:pia(Moyleetal.,2004), uva (daSilvaetal.,2005)ysandia(Levietal.,2006).Aunquealgunosestudioscomolos 24 realizadosenIresasporAharoni,etal.(2002)mostraronquedurantelamaduracionse inducianproteinasrealcionadasconelmetabolismoprimariocomolasrealcionadasconla modiIicaciondelaparedcelularylapigmentacion,locualpresumiblementereIlejaba cambiosenelsabor,aroma,texturaycolor.Ademas,Marin-Rodriguezetal.(2002) observaronquedurantelamaduraciontantodeIrutos climatericos como no climatericosse inducialaexpresiondeenzimascomolapectatoliasa,lapectinesterasaylas poligalacturonasas, las cuales deben jugar un papel signiIicativo en la textura del Iruto. Recientemente, se han realizado algunos estudios en citricos sobre la expresion de multiples genespertenecientesadiIerentesrutasbiosinteticas.Entreellossepuededestacarun proyecto de secuenciacion a pequea escala en el que se aislaron 297 ESTs, identiIicandose un20deelloscomocodiIicantesdelaproteinametalotioneina(Moriguchi et al., 1998), unestudiorealizadomediantelautilizaciondeunamicromatrizdecDNAcon2213genes independientes, con la que se determino la diIerencia de expresion de los genes presentes en la micromatriz en dos tejidos diIerentes (Shimada et al., 2005) y un estudio de identiIicacion de genes con respuesta a etileno mediante la utilizacion de una matriz de oligonucleotidos de 22 K (Fujii et al., 2007). Sin embargo, no se ha proIundizado en ninguno de estos casos, en losprocesosbioquimicosolasrutasmetabolicasrelacionadasconlaacidezenlosIrutos citricos. EnelmarcodelConsorcioespaoldegenomicaIuncionaldecitricos(CitrusFunctional GenomicsProject,CFGP)sehaconstruidounacolecciondeESTsdecitricosmediante secuenciacion de clones extraidos al azar de genotecas de cDNA de distintos tejidos, estadios de desarrollo y condiciones de estres. A partir de esta coleccion de ESTs se ha desarrollado unamicromatrizdecDNAcon12.672sondasquecorrespondena6875unigenesputativos (Forment et al., 2005). Enestecapitulosedescribenloscambiosdeexpresiongenicaduranteeldesarrolloyla maduracion (Iases I, II y III) de la pulpa de Irutos de la variedad Clementina de Nules. Los resultados han contribuido a dilucidar los principales procesos y rutas metabolicas implicadas en la maduracion del endocarpo de los Irutos citricos. 25 3.2. Materiales y mtodos 3.2.1. Material vegetal EnelpresenteestudioseemplearonIrutosdelavariedadClementinadeNules,(Citrus clementina Hort. ex Tan.) injertada sobre el patron citrange Carrizo (Citrus sinensis (L.) Osb. xPoncirustrifoliata(L.)RaI.),queesunhibridodelnaranjodulce Washington Navel y el naranjotriIoliado(Ortiz,1985).LosIrutosutilizadosprocediandetresarbolescultivados bajopracticasnormales,enunaparcelahomogeneasituadaenelInstitutoValencianode Investigaciones Agrarias (IVIA, Moncada, Valencia). El suelo de cultivo se caracterizaba por serIrancoarenoso,conpHneutro-alcalino,pobreenmateriaorganicayconmuybajo contenido en carbonatos. Las condiciones climaticas de la zona de cultivo no interIerieron en laepocademaduracion,siendoescasoelriesgodeheladas.Enelcultivo,seemplearon herbicidasyriegolocalizado,noserealizoninguntratamientoquetendieseaIavorecerel aumento de tamao del Iruto, el cuajado, o el mantenimiento del Iruto en el arbol, pero si se realizaronlospertinentestratamientosdecontroldeplagasparapermitiruncrecimiento vegetativo normal. Las muestras de Irutos para la hibridacion de micromatrices Iueron recolectadas durante las tres Iases del desarrollo durante la campaa 2003/2004. Las Iechas de muestreo se indican en latabla Tabla 3.1. Los Irutos Iueron tomados al azar a partir de todas las orientaciones del arbol (norte, sur, este y oeste), y agrupados en grupos correspondientes a cada uno de los tres arboles. Una vez en el laboratorio, los Irutos Iueron pelados y tras eliminar las semillas y las columnelas la pulpa se congelo en nitrogeno liquido y se conservo congelada a 80 C. Tabla3.1. Fechas de muestreo con su equivalente en diasdespuesdeantesis(DDA).Sehatomadocomo dia de antesis el 30 de abril. FechaDDA 27 de mayo27 28 de julio89 14 de septiembre137 21 de octubre174 27 de diciembre241 26 3.2.2. Cuantificacin del contenido en agua y de los metabolitos seleccionados 3.2.2.1. Contenido en agua ElcontenidoenaguadelosIrutossedeterminomediantepesajedelosmismosantesy despues de ser desecados en estuIa de aire caliente a 65 C durante 72 horas. 3.2.2.2. Carbohidratos solubles LaextracciondecarbohidratosserealizosiguiendoelprotocolodescritoporMehouachiet al. (1995). Se aadio 1 ml de etanol 80 a 100 mg de tejido, se agito durante 10 minutos, posteriormentesecentriIugo10minutosyserecogioelsobrenadante.Esteprocesode extraccionserealizo3veces.AcontinuacionsepuriIicoelextractomediantecolumnasde intercambio cationico y anionico y seguidamente mediante cartuchos C18. Se analizaron los contenidos en sacarosa, glucosa y Iructosa mediante un equipo HPLC (Waters) equipado con una columna para carbohidratos (4,6 X 256 mm, Waters) y un reIractometro diIerencial 2410 (Waters). 3.2.2.3. CloroIilas y carotenoides LasextraccionesdecloroIilasycarotenoidesserealizosiguiendoelmetododescritopor Rodrigo et al. (2003). Se aadieron 2 ml de metanol y 1,5 ml de Tris-HCl (50mM pH 7,5) a 0,5 g de Ilavedo congelado y se agito durante 5 minutos. Posteriormente, se aadieron 4 ml decloroIormo,seagitodurante5minutos,secentriIugoa4.500r.p.m.5minutosyse recuperolaIaseinIerior(cloroIormo).EsteprocesoserepitiohastaquelaIaseinIeriorIue incolora(3a5veces).Acontinuacion,seevaporoasequedadenrotavapor.Elsedimento resultanteseresuspendioen200ldeacetonayseguidamenteseaadieron2,8mlde solucion A (eter de petroleo 40-60: eter etilico 9:1 v/v). Las concentraciones de cloroIila a, cloroIila b y cloroIila total (ab) se calcularon a partir de las medidas de absorbancia a 644 y 662 nm (A644 y A662) aplicando las ecuaciones de Smith y Benitez (1955): CloroIila a (g/g) [(10,05A662)(0,76A644)] V / P CloroIila b (g/g) [(16,37A644)(3,14A662)] V / P CloroIila total cloroIila a cloroIila b Siendo V volumen del extracto (ml); P Peso de la muestra (g) 27 Tras la cuantiIicacion de cloroIilas, se secaron los extractos en rotavapor y se saponiIicaron con1,8mldemetanoly200ldeKOH60durante12horas.Parare-extraerlos carotenoidesseaadieron2mldeaguay6mldesolucionA,serecogiolaIasesuperior (eter) y se reextrajo con 3 ml de solucion A hasta que la Iase inIerior quedo incolora. Se tomo unaalicuotaparalacuantiIicaciondeloscarotenoidestotales.Paraellosemidiola absorbancia a 450 nm y se utilizo el coeIiciente de extincion del -caroteno (Davies, 1976). La Iormula utilizada Iue la siguiente: Carotenoides totales (equivalentes caroteno / g tejido) [A450 V] / [1 100 P] Siendo 1 coeIiciente de extincion del caroteno 2,500; P peso de la muestra (g);V volumen de la muestra (ml). Todas las manipulaciones se realizaron manteniendo las muestras en hielo y con luz tenue a IindeevitarIotodegradacion,isomerizacionesycambiosestructuralesenloscarotenoides. Se realizaron 3 extracciones independientes de cada muestra. 3.2.2.4. Acido ascorbico SeutilizouncromatograIoionicoICS-2000(Dionex)equipadoconinyectorautomatico AS40(Dionex)conectadoaunacolumnadedetecciondeanionesAS11-HC(IonPac)con una columna supresora incorporada que Iunciona segun la metodologia de supresion quimica (Skoog y Leary. 1994).LamuestrautilizadaparaelanalisisIuezumocentriIugadoa13.000rpm(BeckmanJ2-21, rotorJA-14)paraeliminarlasparedesdelasvesiculas.EleluidoseIiltroconunIiltrode nylonde0,22m(Cameo).Setomaron0,75mlysediluyeronen3,25mldeagua, Iiltrandose nuevamente con un Iiltro de nylon de 0,22 m (Cameo).El Ilujo de inyeccion Iue de 1 ml/minuto. La identiIicacion de los acidos y aniones se realizo traslainyecciondeestandaresdelosacidosaidentiIicar(acidoascorbico).Unavez identiIicados se realizan curvas de calibrado con un estandar. La cuantiIicacion se realizo con el programa Chromeleon (Dionex). Se analizaron tres alicuotas por muestra. 28 3.2.3. Hibridacin de micromatrices de cDNA 3.2.3.1. Marcaje de las muestras LaextracciondelRNAdelapulpadelosIrutosIuerealizadamedianteelmetododescrito porSambrooketal.(1989)conalgunasmodiIicaciones.Aungramodematerialvegetal, congelado a 80 C y triturado, se le aadio 1 ml del tampon de extraccion (Tris-HCl 0,2 M pH 8, NaCl 0,2 M, EDTA 50 mM y SDS 2 ), 1 ml de Ienol y 0,02 ml de -mercaptoetanol, la mezcla se incubo a 50 C durante 5 minutos. Se centriIugo a 3.600 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se lavo con cloroIormo: alcohol isoamilico (24:1). El RNA se precipito con 0,5volumenesdeLiCl6Mdurante2diasa4C.Elprecipitadoselavoconetanol70, dejandolosecaratemperaturaambienteyseresuspendioenaguatratadacon dietilpiricarbonato(DEPC)segunelprotocolodescritoporSambrooketal.(1989).Los restos de DNA se eliminaron mediante digestion con DNasa A a 37 C durante 45 minutos. SerealizarontresextraccionesindependientesdeRNAyseprocesaronysemarcaron independientemente e hibridaron en tres micromatrices diIerentes.ElRNAtotalextraidoapartirdecadamuestraIueampliIicadoparasintetizarcRNA antisentido segun el metodo de Eberwine (Van Gelder et al., 1990), consistente en la sintesis decDNAdedoblecadenaquellevaensuextremo3'elpromotordelIagoT7seguidade transcripcion in vitro con la RNA polimerasa del Iago T7. Durante la etapa de transcripcion invitroserealizoelmarcajeindirectodelRNAmedianteincorporaciondeaminoalil-UTP paralaposteriorconjugacionquimicaconlosNHS-esteresdelosIluoroIorosCy3yCy5, basicamente siguiendo las condiciones descritas por Wellmer et al. (2004).Para la sintesis del cDNA, 5 g de RNA total Iueron retrotranscritos durante 2 horas a 42 C con 200 unidades de transcriptasa reversa SuperScript II (Invitrogen), 0.1 g de T7-oligo(dT) 24(Ambion),0,5gdeproteinadelgen32delIagoT4(Amersham)y40unidadesde inhibidor de RNasas (RNaseOUT, Invitrogen) en un volumen total de 20 l. La sintesis de la segunda cadena de cDNA se realizo aadiendo a la mezcla de la primera cadena 40 unidades deDNApolimerasaIdeE.Coli(NewEnglandBiolabs),2unidadesdeRNasaH (Invitrogen)yaguatratadaconDEPChastaalcanzarunvolumende150leincubando2 horasa16C.ParaobtenerextremosromosenelcDNAseaadieron3unidadesdeDNA polimerasa del Iago T4 (New England Biolabs) y se incubo a 16 C 15 minutos y a 70 C 10 min.LoscDNAsdedoblecadenaresultantes,quecontenianelpromotordelIagoT7enel 29 extremo3`,sepuriIicaronconelQIAquickPCRPuriIicationKit(Qiagen)siguiendolas instrucciones del Iabricante. ParalatranscripcioninvitroseutilizoelkitMEGAscriptT7(Ambion)siguiendolas instruccionesdelIabricante,aexcepciondeltiempodeincubacionqueIuede4 horas, y la adicionde1ldeUTP75mMy2ldeaminoalil-UTP50mM(Ambion).LoscRNA resultantes se puriIicaron utilizando columnas RNeasy (Qiagen). El rendimiento y pureza de loscRNAsseevaluoporespectroIotometriaUV(Sambrooketal.,1989).Mediante electroIoresisengel de agarosa se determino elrango de tamaos de los cRNAs marcados. Se obtuvo un smear comprendido entre 1000 y 4000 pb con un tamao medio de 1500-2000 pb. ParalareaccionquimicadeacopleconlosIluoroIoros,setomaron3gdecRNAyse llevaron a sequedad en speed-vac, se disolvieron en 4 l de tampon carbonato sodico 0,1 M, pH8,5,ysemezclaroncon4ldelosNHS-esteresdelosIluoroIorosCy3yCy5, basicamentesiguiendolascondicionesdescritasporWellmeretal.(2004).Seincuboa temperaturaambienteenoscuridadduranteunahoraysepuriIicaronloscRNAmarcados concolumnasRNeasy(Qiagen).ElporcentajedeincorporaciondelosIluoroIorosyla concentracion del cRNA recuperado se determino mediante espectroIotometria (Bittner et al., 2003).ElRNAtotalextraidoapartirdecadamuestraseutilizoparasintetizarcRNAantisentido marcadoconCy5queIuehibridadojuntoconcRNAantisentidomarcadoconCy3 sintetizadoapartirdeunamuestradereIerenciaIormadaporunamezclaquecontenialas mismas cantidades de cada una de las muestras utilizadas para el experimento. A Iin de evitar arteIactos debidos a los IluoroIoros, se utilizo siempre Cy5 para marcar lasmuestras y Cy3 para la reIerencia. 3.2.3.2. Hibridacion y lavados Para la hibridacion de las micromatrices, las mezclas de cRNA de la muestra y la reIerencia conteniendo60pmoldecadaIluoroIoro,sehidrolizaronparcialmentehastagenerar Iragmentos de 150-200 pb con el RNA Fragmentation Reagent (Ambion). Posteriormente se desnaturalizaron durante 2 minutos a 80 C, se mezclaron con 50 l de tampon de hibridacion precalentado(SSC5X,Iormamida50,SDS0,1yDNAdeespermadesalmon0,1 mg/ml)yseaplicaronsobrelamicromatrizpreviamentepre-hibridadaconSSC5X,SDS 0,1, BSA 1.30 La hibridacion se realizo en una camara humedecida con SSC 2X durante 20 horas a 42 C. Tras la hibridacion, se realizaron los siguientes lavados: 2 lavados de 5 minutos a 42 C con SSC2X,SDS0,1,2lavadosde5minutosatemperaturaambienteconSSC0,1X,SDS 0,1,5lavadosde1minutoatemperaturaambienteconSSC0,1Xyunbrevelavadocon SSC0,01X.Trasloslavados,lasmicromatricessesecaronmediantecentriIugaciona300 rpm durante 3 minutos. Apartirdecadamuestraserealizaron3extraccionesindependientesdeRNA,quese retrotranscribieron,ampliIicaron,marcaronehibridaronindependientementeen3 micromatrices diIerentes. 3.2.3.3. Adquisicion y analisis de los datos LasmicromatriceshibridadasseescanearonconunlectorGenePix4000Butilizandoel programadeanalisisdeimagenGenePixPro4.1(AxonInstruments).Losvaloresde gananciadelosIotomultiplicadoresseajustarondemaneraquelarelacionentrelas intensidadestotalesdelosdoscanalesIueseaproximadamenteiguala1yelporcentajede spotssaturadosalrededordel1.Elbarridoserealizoconunaresolucionde10m, promediando dos lecturas por linea.Los datos que se utilizaron en los analisis posteriores Iueron las medianas de las intensidades delospixelesdelosspotsydelIondoparacadaunosdeloscanales.Seeliminarondel analisislosspotsnodetectadosporellector,losqueteniandeIectosenlahibridacion,los spots saturados y tambien aquellos en los que el cociente entre la seal y el Iondo era menor que2.Unicamenteseutilizaronparalos analisis posteriores los datos de hibridacion de las sondas Iormadas por productos de PCR que habian dado una banda unica e intensa en geles de agarosa (Forment et al., 2005). AIindecompensarlasdiIerenciasdebidasalmarcajedelasmuestrasyaotrasIuentesde variabilidad no biologica se normalizaron los datos mediante el metodo de estabilizacion de lavarianza(vsn;Huberetal.,2002).LaidentiIicaciondelassondasquepresentaron diIerencias de expresion estadisticamente signiIicativas entre las distintas muestras se realizo utilizando el programa LIMMA (linear models in microarrays, Smith, 2004) perteneciente al paqueteinIormaticoBioconductor(Gentlemanetal.,2004).SeconsiderarondiIerencias signiIicativas aquellas que tenian asociado un valor de P inIerior a 0,001 y una induccion o represion de al menos 2 veces. 31 3.3. Resultados y discusin 3.3.1. Identificacin y clasificacin funcional de genes involucrados en el desarrollo y la maduracin de la pulpa de los frutos ctricos Mediante analisis de micromatrices de cDNA se ha comparado la expresion genica durante el desarrollo(IasesIyII)ylamaduracion(IasesIIyIII)delapulpadelosIrutosde ClementinadeNules.LasmuestrasdelaIaseIIcorrespondientesalosdias137y174 despues de antesis y la muestra de la Iase III del dia 241, se compararon con la muestra del dia 89 despues de antesis (Iase II).El resultado de estos analisis indico que 3588 sondas de la micromatriz, que se corresponden con2243posiblesunigenes(el33delosgenesrepresentadosenlamicromatriz), mostraron cambios signiIicativos de expresion (P0,001) iguales o mayores a dos veces en al menosunodeloscontrastes.Ademas,393deestosgenes(6)maniIestaroncambiosde expresion de mas de 5 veces. Shimada et al. (2005), con este mismo nivel umbral obtuvieron un porcentaje similar en un analisis con un conjunto menor de genes de citricos. LosperIilesdeexpresiondelas3588sondassigniIicativasIueronagrupadosenbaseala similitud de tendencias usando el algoritmo SOTA (Herrero et al. 2001); para ello se utilizo el coeIiciente de correlacion de Pearson como Iuncion de distancia. El analisis indico que los cambios de expresion asociados con el desarrollo y la maduracion interna de la pulpa de los Irutos citricos se ajustaba a cinco patrones diIerentes (Figura 3.1; Tabla 3.2).DeltotaldesondassigniIicativas,1955presentaroninduccionduranteeldesarrolloyla maduraciondelIruto.Elcluster1,compuestopor1088sondas,presentounincremento continuo de los niveles de transcritos, mientras que las 867 sondas incluidas en el cluster 2 se indujerontransitoriamentedurantelaIaseII.Los1633genesquesereprimieronse distribuyerondelasiguienteIorma:1253sondas(cluster3)experimentaronunareduccion progresivaduranteeldesarrolloylamaduraciondelosIrutos,256mostraronunrapido descensodelosnivelesdetranscrito,manteniendosebajosposteriormente(cluster4)ylas restantes124sondassereprimierontemporalmente,alcanzandolosnivelesdeexpresion iniciales durante la Iase de maduracion (cluster 5). La clasiIicacion Iuncional de los genes se llevo a cabo mediante comparacion con la base de datosMIPS(MunichInIormationCenterIorProteinSequences).Previamente,lassondas habiansidoclasiIicadasasignandolescategoriasIuncionalesapartirdesusortologosde Arabidopsis (Forment et al., 2005). De las 3588 sondas signiIicativas, 2647 tenian asignado 32 unortologoenArabidopsis(Tabla3.2).Elanalisisdeladistribuciondelosgenes signiIicativosenlascategoriasIuncionalesMIPS,indicoquelareprogramacion transcripcionalduranteeldesarrolloylamaduraciondelIrutodeloscitricoscomprendia genes de todas las categorias Iuncionales principales (Tabla 3.2).La comparacion de la distribucion de los genes en categorias Iuncionales entre el conjunto de todaslassondassigniIicativasycadaclusterindividualreveloenriquecimientos signiIicativosenlassiguientescategorias:i)destinoproteicoydegradacionproteolitica (cluster 1), ii) interaccion con el medioambiente y proteinas virales y plasmidicas (clusters 3, 4 y 5), y iii) transcripcion y mecanismos de transduccion de seales (cluster 2). Elenriquecimientodelcluster1engenesimplicadosendestinoproteicoydegradacion proteolitica(principalmenteproteasasdecisteinayproteinasimplicadasenlarutade proteolisis mediada por ubiquitina) puede estar relacionado con la iniciacion del proceso de senescencia de los Irutos (Thomas et al., 2003), debido a que estos dos sistemas proteoliticos jueganpapelesimportantesenladegradaciondelasproteinasyelrecicladodurantela senescencia (Gepstein et al., 2003). Paraabordarconprecisionelenriquecimientodelosclusters3,4y5,engenesque pertenecenalascategoriasdeinteraccionconelmedioambienteyproteinasviralesy plasmidicas, serian necesarios estudios adicionales que no entran dentro de los objetivos de esta tesis. 33 Figura3.1.AgrupamientoportendenciasdelosperIilesdeexpresiondelosgenesduranteeldesarrolloyla maduraciondelapulpadelosIrutosdeClementinadeNules.Lasmuestrasrecogidaseldia89despuesde antesis secompararon conlasmuestras de 137,174y241 DDA. Para el agrupamiento con el algoritmo SOTA seutilizarontodaslassondasquemostraroncambiossigniIicativosdelaexpresionenalmenosunodelos contrates.Losdatossonelresultadodelosvaloresmediosdeexpresionelerrorestandar(barrasdeerror menores que el simbolo). Se indica el numero de sondas signiIicativas en cada cluster.-3-2-10DDA89 137 174 241-2-10012Cluster 4(256 sondas)Cluster 5(124 sondas)Cluster 2(867 sondas)012Cluster 1(1088 sondas)log2 (ratio)-2-10Cluster 3(1253 sondas)34 Tabla3.2.DistribucionencategoriasIuncionalesMIPS de losgenesque mostraron cambios signiIicativos de expresion duranteel desarrollo y lamaduracionde la pulpade Clementina de Nules. Categoria IuncionalTotalCluster 1Cluster 2Cluster 3Cluster 4Cluster 5 a Metabolismo16.3215.62(221)15.03(171)17.02(328)19.32(80)15.63 (30) Energia5.014.73(67)4.13(47)6.38(123)1.45(6)6.25 (12) Ciclo celular y procesamiento de DNA4.364.66(66)4.39(50)3.84(74)5.80(24)4.17 (8) Transcripcion5.174.81(68)7.47(85)4.00(77)5.07(21)6.25 (12) Sintesis de proteinas 5.763.04(43)3.34(38)8.20(158)8.70(36)9.38 (18) Plegamiento, modiIicacion y destino de proteinas6.218.20(116)7.47(85)4.51(87)4.59(19)4.69 (9) Degradacion de proteinas3.075.23(74)3.43(39)1.45(28)2.66(11)2.08 (4) Transporte celular y mecanismos de transporte8.678.34(118)7.21(82)10.28(198)6.04(25)9.38 (18) Comunicacion celular / Mecanismos de transduccion de seales6.747.63(108)10.19(116)4.51(87)6.04(25)3.65 (7) DeIensa 7.247.35(104)8.26(94)7.42(143)4.59(19)4.17 (8) Regulacion sistemica / interaccion con el medioambiente2.361.41(20)1.67(19)2.18(42)6.76(28)5.73 (11) Desarrollo (Sistemico)4.293.82(54)4.75(54)4.41(85)4.59(19)3.13 (6) Elementos transponibles, proteinas virales y plasmidicas1.360.28(4)0.53(6)2.80(54)0.72(3)1.04 (2) Control de la organizacioncelular0.590.49(7)0.35(4)0.57(11)0.97(4)2.08 (4) DiIerenciacion celular4.053.11(44)3.87(44)4.36(84)5.80(24)5.21 (10) Localizacion subcelular6.555.65(80)5.62(64)7.11(137)7.97(33)9.90 (19) Proteinas no clasiIicadas5.376.86(97)6.85(78)3.94(76)3.86(16)3.13 (6) Sin clasiIicacion MIPS del ortologo de Arabidopsis6.888.76(124)5.45(62)7.01(135)5.07(21)4.17 (8) aFrecuenciadelassondasdelasmicromatricesquetienenortologosdeArabidopsis(Formentetal.,2005).Elnumerototaldesondasseencuentraentreparentesis.Los numerosennegritaindicanunenriquecimientosigniIicativodelacategoriaenungrupoparticularencomparacionconelconjuntodedatostotal.(P0,01despuesdela correccion de BonIerroni para tests multiples). 35 3.3.2. Factores de transcripcin y otras protenas reguladoras Masdel10delconjuntodesondassigniIicativascorrespondioagenesincluidosenlas categorias detranscripcion, transduccion de seales y mecanismos de comunicacion celular (Tabla3.2).LamicromatrizdecDNAutilizadacontenia197sondascorrespondientesa ortologos de Iactores de transcripcion de Arabidopsis. Estos ESTs pertenecian a 30 de las 42 IamiliasdeIactoresdetranscripcionincluidasenel'ArabidopsisGeneRegulatory InIormationServer(AGRIS;Davulurietal.,2003).ElconjuntodedatossigniIicativos incluia 61 sondas que se correspondian con 55 genes de Iactores de transcripcion distribuidos en 22 de dichas Iamilias (Tabla 3.3). Tabla3.3.NumerodeIactoresdetranscripcionporIamiliaque muestrancambiossigniIicativosenlaexpresion,basadosen analisis de micromatrices durante el desarrollo y la maduracion de la pulpa de Irutos de la mandarina Clementina de Nules. Familia Inducidos (clusters 1, 2) Reprimidos (clusters 3, 4, 5) NAC9- CCAAT-HAP51- WRKY1- C2C2-YABBY1- C2H21- TUB1- ABI3VP11- HSF1- VOZ-91- ARF-2 bZIP-1 C2C2-CO-like-1 TCP-1 C2C2-Gata-1 MADS52 MYB52 C3H42 BHLH32 HB24 GRAS21 AP2-EREBP11 MYB-related11 36 NuevedeestasIamilias(NAC,CCAAT-HAP5,WRKY,C2C2-YABBY,C2H2,TUB, ABI3VP1, HSF y VOZ-9) contenian solamente Iactores de trascripcion inducidos (clusters 1 y 2) mientras que cinco (ARF, bZIP, C2C2-CO-like, TCP y C2C2-Gata) incluian solamente genes reprimidos (clusters 3, 4 y 5). Finalmente, ocho Iamilias (MYB, MADS, C3H, BHLH, HB,GRAS,AP2-EREBPyMYB-related)poseiangenes,inducidosyreprimidos.Nose observaron cambios signiIicativos en la expresion de los genes de las restantes ocho Iamilias representadasenelchip(G2-like,GRF,C2C2-DoI,CAMTA,SBP,AlIin-like,CCAAT-DR1,yEIL),presumiblementedebidoasuparticipacionenIuncionescelularesde housekeeping. La Iamilia mas abundante de Iactores de transcripcion inducidos Iue la Iamilia NAC (Tabla 3.3)queconstituye una Iamilia ampliade Iactores de transcripcion especiIicos de plantas y caracterizados por poseer un dominio N-terminal conservado (Aida et al., 1997; Olsen et al., 2005).NoseconocenlasIuncionesdelosIactoresNACaunquesehadescritoqueesta Iamilia se encuentra relacionada con un amplio espectro de procesos biologicos (revisado en Ooka et al., 2003 y Olsen et al., 2005). Su relacion con la maduracion de los Irutos ha sido sugerida especialmente para el Iactor SENU5, que se induce durante la maduracion del Iruto de tomate (John et al., 1997). Resulta interesante que las nueve sondas de la micromatriz que representan siete genes NAC de citricos se indujeron durante el desarrollo y la maduracion de la pulpa de los Irutos. Tres de estos Iactores NAC inducidos eran ortologos de los genes de ArabidopsisAtNAC2,NAPyAt3g04070quehabiansidopreviamenterelacionadoscon procesosvegetativos(Takadaetal.,2001)yreproductivosdeldesarrollo(Tabla3.4).Por ejemplo,SablowskiyMeyerowitz(1998)demostraronqueNAPestaimplicadoenla transiciondeladivisioncelularalaexpansioncelularduranteeldesarrollodelosorganos Ilorales de Arabidopsis. Nuestros resultados sugieren que estos genes pueden jugar tambien un papel durante el desarrollo del Iruto, puesto que en los citricos se produce una transicion mas gradual pero equivalente entre la Iase I y la Iase II (Bain, 1958). De igual Iorma, otros dos Iactores NAC de citricos eran ortologos de los genes ATAF1 y ATAF2 de Arabidopsis, quehabiansidopreviamenteimplicadosenlarespuestaIrenteaheridasyataquespor patogenosbasandoseenlaexpresionensusortologosdepatata(CollingeyBoller,2001). Ademas, se ha descrito que muchos genes implicados en la respuesta a heridas, patogenos e insectos se inducen durante el desarrollo de los Irutos (Shimada et al., 2005). Dado que los Irutos citricos se cultivan en explotaciones al aire libre y por lo tanto estan permanentemente expuestos a heridas o al ataque de los insectos, resulta razonable pensar que la expresion de los dos Iactores ATAF podrian estar relacionados con estas condiciones. Las condiciones de 37 sequiadelveranoenlaszonasdelmediterraneocuandoseproducelaexpansioncelularde losIrutoscitricos(IaseII)puedeserlarazonporlaqueseproducelainducciondeotros Iactores NAC de citricos ortologos de RD26 (Tabla 3.4), un gen inducido por sequia, estres salino y acido abcisico (Fujita et al., 2004). Tabla 3.4. Factores de transcripcion NAC inducidos durante el desarrollo y la maduracion de la pulpa de Irutos de mandarina Clementina de Nules. Cluster Numero de acceso del EST de citricos Ortologo deArabidopsis Nombre del gen Proceso biologicoReIerencias 1CX289558At3g15510AtNAC2 Desarrollo del meristemo apicalTakada et al., 2001 1CX291911At1g69490NAPDesarrollo de la Ilor Sablowski y Meyerowitz, 1998 1CX292873At3g04070Desarrolloa 1CX292958At3g04070Desarrolloa 1CX290892At4g27410RD26Sealizacion por estresFujita et al., 2004 1CX306190At4g27410RD26Sealizacion por estresFujita et al., 2004 2CX292209At1g01720ATAF1 Respuesta a patogenos y heridas Collinge y Boller, 2001 2CX292637At5g08790ATAF2 Respuesta a patogenos y heridas Collinge y Boller, 2001 2CX289140At4g35580Desconocidos a Sin evidencia experimental, proceso biologico deducido a partir de la similitud estructural o de secuencia (http://www.tigr.org) Tambien se encontraron otras Iamilias de Iactores de transcripcion aparentemente implicadas en el desarrollo y la maduracion de los Irutos (Tabla 3.3). Aunque una discusion detallada de su signiIicado Iisiologico o Iuncion durante el desarrollo de los Irutos se encuentra Iuera de los objetivos de este estudio, merece la pena destacar que, por ejemplo, al menos cinco y dos genesMADS-Box,seindujeronyreprimieronrespectivamenteduranteeldesarrolloyla maduracion de la pulpa de los Irutos citricos. Esta Iamilia se ha relacionado Irecuentemente con el desarrollo y la maduracion de diIerentes especies de Irutos, incluidas las manzanas y las Iresas (revisado en Giovannoni, 2001). Ademas de los Iactores de transcripcion se encontraron tambien numerosas sondas de genes que codiIicaban proteinas implicadas en mecanismos de transduccion de seales (Tabla 3.2). Entreestas,seincluiantresprotein-IosIatasas,seisproteinasdeunionaGTPdelaIamilia Ras y dieciseis protein-quinasas, de las cuales diez correspondian a serina/treonina quinasas, sugiriendounaposibleactivaciondeestarutadesealizacionduranteeldesarrolloyla maduracion de los Irutos. 38 El mayor enriquecimiento de genes de proteinas reguladoras se detecto en el cluster 2 (Tabla 3.2),IormadoporgenesqueseinducenaproximadamenteenlamitaddelaIasede crecimientorapidodelIruto(Figura3.1).EstosugierequelosIrutosenestaIaseestan reprogramando la maquinaria celular para aIrontar las complejas modiIicaciones implicadas en la transicion de la Iase II a la Iase III. 3.3.3. Regulacin metablica 3.3.3.1. Descripcion general DentrodelconjuntototaldesondasquemostraronresultadossigniIicativossedetectoun gran numero de genes que codiIicaban enzimas implicadas en procesos metabolicos. A pesar de ello, no se observo ningun enriquecimiento signiIicativo de los genes del metabolismo en ningunodelosclusters.Losresultadosobservadospuedenserexplicados,porelhechode quelosperIilesdeexpresiondelosgenesimplicadosenredescomplejasquecomparten multiplesrutasmetabolicasmuestranpatronesdeexpresion'compensatoriosconcambios simultaneos en direcciones opuestas, tal y como se describe en Ruuska et al. (2002). Paraanalizarloscambiosenlaexpresiondelosgenesasociadosarutasmetabolicas,los resultadosdeexpresiondelassondasqueresultaronsigniIicativasserepresentaron graIicamentesobrelasrutasmetabolicasdeArabidopsisutilizandolaherramientaAraCyc OmicsViewer(Muelleretal.,2003).Eltotaldelosdatosobtenidosconesteanalisisse encuentra representado en la figura suplementaria 1, mientras que la Tabla 3.5 resume los resultados de las rutas metabolicas principales.Esinteresantedestacarque,aunquelamicomatrizdecDNAutilizadacontienepocos unigenesaislados de los tejidos dela pulpa (Forment et al., 2005), los resultados obtenidos incluyengenesqueIormanpartedelosprocesosIisiologicosprincipalesquetienenlugar duranteeldesarrollodelapulpa.EstoconIirmaquedichosprocesospueden ser estudiados mediante el abordaje aqui descrito. 39 Tabla3.5.Rutasmetabolicasinducidasyreprimidasduranteel desarrolloylamaduraciondelapulpadeClementinadeNulesbasado en el analisis de micromatrices. InducidosReprimidos Sintesis de celulosaHidrolisis de sacarosa Oxidacion de acidos grasosBiosintesis de almidonBiosintesis de carotenoidesGlicolisis Hidrolisis de conjugados de auxinasRuta de las pentosas IosIato Ciclo de Calvin Biosintesis de acidos grasos Biosintesis de acido ascorbico Biosintesis de lignina Biosintesis de suberina Biosintesis de antocianina Biosintesis de Ilavonoides Biosintesis de cloroIila Lasrelacionesexistentesentrelaexpresiongenica,losnivelesdelosmetabolitosylos principalesprocesosIisiologicosqueseproducenenlosIrutoscitricos,talescomo:la expansion celular, la acumulacion de agua, el incremento del contenido de carbohidratos, la reduccion del acido citrico y los procesos del metabolismo secundario como: el intercambio depigmentos,lareducciondelavitaminaCyeldescensodelcontenidodelipidos;se describenacontinuacion,conlaexcepciondelareducciondelaconcentraciondelacido citrico que se describe de manera mas detallada en el capitulo siguiente. LaTabla3.6muestraelcontenidoenagua,carbohidratossolublesyacidoascorbico (vitaminaC)enIrutosdelavariedadClementinadeNulesrecolectadoslosdias89y241 despues de la antesis. Tabla3.6.Contenidodeaguaynivelesdelosmetabolitosseleccionadosenla pulpadelamandarinaClementinaNulesdurantelaacumulacion(89DDA)y despues del descensodela acidez (241 DDA). Los datos sonmedias ( ES, n 3) de un set de resultados tipico. Metabolitos89 DDA241 DDA Agua (mg /g Peso Iresco)767.5 + 12.5855.0 + 5.0 Carbohidratos solubles(mg/g Peso Iresco) Sacarosa5.7 + 0.632.1 + 1.7 Glucosa1.7 + 0.415.7 + 1.6 Fructosa1.9 + 0.417.3 + 1.4 Acido ascorbico (vitamina C) (mg/ml extracto de zumo) 0.6 + 0.070.3 + 0.04 40 3.3.3.2. Expansion celular en la Iase II ElcrecimientoqueseproducedurantelaIaseIIdeldesarrollodelosIrutosesdebido principalmentealaexpansioncelular(Bain,1958),loquerequieredelasintesisde componentesdelaparedcelular.Losresultadosobtenidosindicanqueseproduceun incrementopronunciadoenlaexpresiondelgendelacelulosasintasa(Figura3.2),la enzimaresponsabledelasintesisdecelulosaqueeselprincipalconstituyentedelapared celulardelasplantas.Sinembargo,labiosintesisdecomponentesdelaparedsecundaria como la lignina y la suberina se encuentra reprimida (Tabla 3.5), puesto que la expresion de laenzimaIenilalaninaamonioliasa,enzimaquecatalizaelprimerpasodelasdosrutas anteriores, se reduce (Figura 3.2). La lignina es abundanteen los haces vasculares, y actua aumentandolaresistenciayIirmezadelasparedescelulares,mientrasquelasuberinales conIierehidroIibicidad.ApesardequenoexistendatosespeciIicosdelasproporcionesde losdistintoscomponentesdelasparedescelularesenlosIrutoscitricos,lamaduracion implicaunciertoreblandecimientodelasmembranasdelossegmentosydeloshaces vasculares de la pulpa (Saunt, 1990), consecuencia probablemente de la seleccion dirigida, ya que mejora la comestibilidad de la Iruta. Ademas, se produce un incremento en la expresion delaindol-3-acetil-alaninahidrolasa(Figura3.2),quepresumiblementeintervieneenla hidrolisisdelosconjugadosdelasauxinas(Tabla3.5).DadoquelasauxinassonIactores hormonaleslimitantesenelcontroldelaexpansioncelulardurantelaIaseII(Takahashi et al., 1965; Agusti et al., 2002) esta observacion sugiere que la liberacion de auxinas a partir deIormasconjugadasesunprocesoactivoparaaumentarladisponibilidaddeestas hormonas durante el desarrollo de la pulpa. 41 Figura3.2.PerIilesdeexpresiongenicadeproteinasimplicadasenlaexpansioncelularquepresentaron cambiossigniIicativosalolargodelamaduraciondelendocarpiodelaClementinadeNules.Elnumerode acceso del GenBank de cada EST se indica en la leyenda. Los datos son media + E.S de 3 replicas. 3.3.3.3. Acumulacion de agua: genes de acuaporinas DentrodelconjuntodedatossigniIicativossedetectaronsietesondascorrespondientesa cuatro genes de acuaporinas de citricos. Uno de ellos, que se encontraba inducido durante el desarrollo de la pulpa de los Irutos, era el ortologo de la acuaporina gamma-TIP (Tonoplast-IntrinsicProtein)deArabidopsis,queselocalizaeneltonoplasto.Losotrostresse Celulosa sintasa-1012CX289616 CX308043 CX287929 CX294620 Fenilalanina amonio liasalog2 (ratio)-4-20CX308098 CX307909 CX288585 Indol-3-acetilalanina hidrolasaDDA27 89 140 176 2430,00,51,01,5CX289852 CX294339 42 encontrabanreprimidosysecorrespondianconunaacuaporinadelta-TIPdeltonoplastoy dos acuaporinas de la membrana plasmatica (Tabla 3.7). Tabla 3.7. Acuaporinas con cambios signiIicativos de expresion durante el desarrollo y la maduracion de la pulpa de Irutos de la mandarina Clementina de Nules. Datos basados en el analisis de micromatrices. Grupo Numero de acceso del EST de Citrus Ortologo de Arabidopsis Nombre del genLocalizacionReIerencias 1CX293832At2g36830Gamma-TIPTonoplastoSaito et al., 2002 1CX288750At2g36830Gamma-TIPTonoplastoSaito et al., 2002 3CX299889At3g16240Delta TIPTonoplastoDaniels et al., 1996 3CX289173At4g00430TMP-CMembrana plasmaticaJohanson et al., 2001 3CX300866At4g23400MIP Iamily proteinMembrana plasmatica a 3CX291733At4g23400MIP Iamily proteinMembrana plasmatica a 3CX288560At4g23400MIP Iamily proteinMembrana plasmatica a a SinevidenciaexperimentalperoconlocalizacioninIeridaapartirdesimilitudesestructuralesodesecuencia (http://www.tigr.org) DadoqueduranteelcrecimientodelIrutoseproduceunincrementopronunciadodel contenido en agua (Tabla 3.6), estos resultados sugieren que existe un importante transporte simplasticodeaguaenlosIrutosmaduros.Jauhetal.(1999),observaronquelasvacuolas conIuncionesdiIerentesconteniandiIerentesclasesdeproteinas intrinsecas del tonoplasto. Deestemodo,lasvacuolasquealmacenanpigmentosyproteinasvegetativascontienen acuaporinas delta-TIP, mientras que las vacuolas en las que predominan las Iunciones liticas contienenacuaporinasgamma-TIP.Enloscitricos,elcambioprogresivoqueseproduce durante el desarrollo de los Irutos de la Iorma delta-TIP (crecimiento temprano del Iruto) a la Iormagamma-TIP(IinaldelcrecimientodelIruto)parecereIlejaruncambioenlaIuncion vacuolar.Porotrolado,eldescensoenlaexpresiondelasacuaporinasdelamembrana plasmatica sugiere que en los Irutos maduros predomina el transporte simplastico de agua. 43 3.3.3.4. Metabolismo de los carbohidratos DuranteeldesarrollodelosIrutoscitricos,existendoscomportamientosclaramente diIerenciadosenrelacionconelmetabolismodeloscarbohidratos.Enunaprimeraetapa, coincidiendo con la Iase de division celular, los Irutos actuan como sumideros de utilizacion decarbohidratos,mientrasqueapartirdelperiododealargamientocelular,pasanaserde sumideros de almacenamiento (Mehouachi et al., 1995; Gomez-Cadenas et al., 2000). En los Irutosmaduros,tantolasacarosa(elcarbohidratonormalmentetransportado)comola glucosaylaIructosa(lasprincipaleshexosasdelosIrutos)seacumulanengrancantidad (Tabla3.6).EstaactividadsumiderodelosIrutoscitricossecorrelacionaconlosdatos obtenidos de la micomatriz, que indican que la sintesis de carbohidratos a traves del ciclo de Calvinsereprimealolargodeldesarrollo(Tabla3.5),mientrasquelaexpresiondeun posible transportador de azucares (el ortologo del gen At2g48020 de Arabidopsis) se induce signiIicativamente (Figura 3.3). Figura3.3.PerIilesdeexpresiongenicadeproteinasdelmetabolismodeloscarbohidratosquepresentaron cambiossigniIicativosalolargodelamaduraciondelendocarpiodelaClementinadeNules.Elnumerode acceso del GenBank de cada EST se indica en la leyenda. Los datos son media + E.S de 3 replicas. Invertasa neutraDDA27 89 140 176 243-2-101CX288884CX292157CX293903CX289243Invertasa cidalog2 (ratio)-1,0-0,50,00,51,0CX292858CX292157CX293903CX289243Sacarosa sintasaDDA27 89 140 176 243-3-2-10123CX292858CX306010CX291012Posible transportador de azcareslog2 (ratio) 0123CX29249344 En consonancia con la observacion de que los niveles de sacarosa, glucosa y Iructosa en los Irutosmadurosalcanzanunaratiode2:1:1(Tabla3.6)seencuentraelresultadodequela expresion de los genes que intervienen en el catabolismo de la sacarosa, la sacarosa sintasa y lasinvertasasneutrasyacidas,disminuye(Figura3.3)demaneraimportanteenlosIrutos maduros. Estareduccioncoincideconlarepresiondelabiosintesisdealmidon(glucosa-6-IosIato isomerasa),lainducciondelagluconeogenesis(IosIoglucomutasa)(Figura3.4)yla utilizaciondelaglucosa-6-IosIatoatravesdelarutadelaspentosasIosIato(Tabla3.5). Ademas,seobservaquelosenzimasrelacionadosconlarutaglicolitica,engeneral,se reprimendurantelamaduracion,aunquenotodoslosenzimasglicoliticospresentanuna regulacion similar, tal y como se describe en otros sistemas (Hening et al., 2004; Ruuska et al.,2002).Todosestosdatosdeexpresiongenicasecorrelacionanconelaumentode sacarosa y hexosas que se produce durante el desarrollo de la pulpa (Tabla 3.6). Figura3.4.PerIilesdeexpresiongenicadeproteinasdelabiosintesisdealmidonquepresentaroncambios signiIicativosalolargodelamaduraciondelendocarpiodelaClementinadeNules.Elnumerodeaccesodel GenBank de cada EST se indica en la leyenda. Los datos son media + E.S de 3 replicas. FosfoglucomutasaDDA27 89 140 176 243-1012CX303891 CX303946 CX303888 Glucosa-6-fosfato isomerasalog2 (ratio)-4-20CX29113745 3.3.3.5. Metabolismo secundario. Sustitucion de pigmentos Entreloscambiosdeexpresiongenicaqueseproducenenlasrutasdelmetabolismo secundariosepuededestacarlainducciondelaexpresiondelgendelaIitoenosintasa (Figura 3.5), enzima clave de la ruta de la biosintesis de los carotenoides (Figura 3.6), y la represion de la enzima protocloroIilida reductasa (Figura 3.5), implicada en la biosintesis de cloroIilas. Figura3.5.PerIilesdeexpresiongenicadeproteinasdelmetabolismodelospigmentosquepresentaron cambiossigniIicativosalolargodelamaduraciondelendocarpiodelaClementinadeNules.Elnumerode acceso del GenBank de cada EST se indica en la leyenda. Los datos son media + E.S de 3 replicas. EstosresultadossoncompatiblesconlasdeterminacionesdecloroIilasycarotenoides (Figura3.6)queindicanqueenlosIrutosmadurosseproduceunaacumulacionde carotenoides (25 veces) acompaada de una perdida de cloroIila (80 ). Protocloroflida reductasaDDA27 89 140 176 243-4-202CX289541 CX290222 CX290183 Fitoeno sintasalog2 (ratio)-2-1012CX289541 46 Figura3.6.EvoluciondelaconcentraciondecloroIilasy-caroteno enla pulpadela variedadClementina de Nules en Iuncion del tiempo (dias despues de la antesis). Porotroladolareduccionobservadaenlaexpresiondelosgenesdelachalconasintasa, chalcona isomerasa y Ilavonoide 3`-monooxigenasa (Figura 3.7) indica una reduccion de las rutas de sintesis de I