Cocos Gram Negativos Curso AulaMIR 2011 Pedro Alarcón Blanco.
Tinción gram 2011
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METODOS DE METODOS DE OBSERVACION DE LOS OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS
DEPARTAMENTO DE DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA
Observación microbiana
• En vivo: exámen en fresco de una suspensión bacteriana, se usa principalmente para visualizar Hongos unicelulares, protozoos y helmintios.
• Ayuda a observar movimiento y forma de los Mo,s
•Preparado coloreado: frotis o extendido que al ser teñido permite visualizar la forma, tamaño y disposición de los diferentes tipos de bacterias o la observación de elementos no habituales (flagelos, cápsula ó esporas).
Técnica (observación in vivo)
• Colocar parafina o vaselina en los bordes del cubreobjeto.
• Depositar una gota en el cubreobjetos
• Cubrir con el cubreobjetos primero desde una arista al total de la superficie.
• Observación.
• Desventajas: falta de contraste y resolución,
Técnica ( observación coloreada)
• Con un portaobjeto limpio y desgrasado y con el asa y la pipeta se le coloca una gota de agua destilada estéril.
• Se toma con el asa y se coloca en el portaobjeto y se le homogeniza con el agua estéril,
• Se extiende la muestra sin tocar los cuatro bordes del cubreobjetos
• Se deja que el portaobjeto se seque al aire o se le mantiene a 40 cm de la llaman y se fija
• La fijación tiene el objeto de que las bacterias queden adheridas al vidrio.
fijación
• Existen dos métodos:• 1. Método de Koch (físico):• Consiste en hacer tres pasajes lentos sobre
el mechero dejando enfriar entre cada uno de ellos.
• 2. Metanol (químico): • Extendido con alcohol metílico por 5
minutos y despues colorear
Colorantes
• Productos químicos derivados del Alquitrán, especialmente el benceno
• La molécula del colorante está formada por dos segmentos el Cromóforo y el auxócromo, el primero tiene color y el segundo la afinidad
• La afinidad esta dada por la disociación electrolítica de este segmento y la formación de sales insolubles con las proteínas, glucoproteínas y lipoproteinas de los tejidos y paredes.
• El grupo auxocromo determina que se los clasifique en básicos o catiónicos, ácidos o aniónicos.
• Colorantes Básicos: violeta de Genciana, Fucsina básica, rojo neutro, etc.
• Colorantes Acidos: Fucsina ácida, eosina
• Neutros: eosianato de azul de metileno.
Coloración Simple
• Son las que emplean un solo colorante y tiñen todos los elementos por igual.
• Técnica: fijar, cubrir, lavar y observar
• Ventajas: Observ. Rápida y sencilla de la morfología bacteriana.
• Desventajas: no es posible diferenciar si la muestra es monoespecífica o mixta.
Compuestas o diferenciales
• Usan dos colorantes lo que permite teñir de distintos modos las diversas clases de bacterias, los métodos más empleados son:
• Tinción de Gram. y de Ziehl-Neelsen
• En estas coloraciones se usan cuatro componentes de manera progresiva:
• 1. Colorante principal o primario: colorante básico que al entrar en contacto con las células cargadas negativamente las colorea
• 2. Mordiente: le da mas intensidad y más fijación (sales metálicas, solución yodada o lugol, taninos y fenol)
• 3. Agente decolorante: Disolvente orgánico como el alcohol, ácido o alcohol acetona
• 4. Contracolor o colorante secundario:
• Colorante básico de distinto color que el primero.
Tinción de Gram
• Utilizada más habitualmente
• Facilita la observación bacteriológica
• Permite diferenciar entre gram positivo y gram negativo.
Fundamento
• La afinidad por el color depende en gran medida de la composición química de la pared celular
• Después de realizar los primeros cuatro pasos, todas las bacterias se ven color violeta.
• Al finalizar la técnica las que conservan el color violeta se denominan Gram Positivas
• Y las que no lo conservan Gram Negativas.
Cont. fundamento
• Los decolorantes orgánicos utilizados abren los poros de la membrana externa de las bacterias gram negativas (constituidas principalmente por lipoproteínas y lipopolisacáridos) y permiten la salida del colorante principal quedando desprovistos de color.
• Al agregar el contracolor éstos quedan teñidos de rojo (fucsina o safranina).
Diferencias estructurales
Técnica
1. Una vez fijado el extendido cubrir la superficie con cristal violeta (colorante primario) y dejar en contacto un minuto
2. Lavar con agua abundantemente.
3. Cubrir con Lugol(mordiente) por 1 minuto.
4. Lavar con abundante agua
Cont. Tinción de gram.
• Inclinar el portaobjeto y dejar gotear el alcohol acetona (decolorante) hasta que el preparado deje de perder color.
• Lavar con agua
• Agregar el (contracolor) fucsina básica por 1 minuto
• Lavar, secar al aire, observar.
Ventajas y desventajas
• Es un método rápido y sencillo
• Permite observar: forma, tamaño y disposición.
• Hace diferenciación entre biota mixta o monoespecífica
• Proporciona orientación terapéutica.
• Se conservan los preparados.
• Gram. + vrs. Gram -
• Algunas micobacterias y hongos pueden no tomar la coloración
• Bacterias sin pared las tiñe débilmente (mollicutes)
• La técnica es más laboriosa que la técnica simple.
Otras tinciones
• Coloración de Zielh Nielsen:• Bacterias del género Mycobacterium, la
especie Nocardia, las especies Corynebacterium y ocasionalmente actinomicetos no se tiñen con la coloración Gram.
• Estas bacterias tiene la capacidad de resistir la decoloración por ácidos y alcohol
Cont. Otras tinciones
• Esta propiedad se debe al alto contenido de lípidos complejos (ácidos micólicos) y ceras que poseen algunos microorganismos en su pared celular.
• Acido Alcohol resistentes (AAR): Mo,s que resisten la decoloración se ven de color rojo.
• No Acido Alcohol resistentes (No AAR):• No resisten la acción de los decolorantes y se ven
de color azul.
Coloración de Giemsa
• Utilizada para la diferenciación intra y extracelular de parásitos en sangre circulante. (plasmodium y especies de Leishmania, Candida, Hisptoplasma capsulatum, y Pneumocystis carinii, inclusiones virales, Mollicutes, Rickettsia y Chlamydia.
• Se observan también los elementos celulares de la respuesta inflamatoria.
• La Cápsula: Por sus características químicas no se tiñe con colorantes básicos para ello se utiliza la Tinción negativa o indirecta.
• No tiñe sino que se deposita alrededor resaltando los contornos.
• Se utiliza Tinta china (suspensión de partículas de carbón coloidal) Moléculas grandes que no entran en la cápsula.
• La utilidad de esta técnica es que revela cápsulas bacterianas y micóticas.
Tinción de endosporas
• Sin teñir se ven como estructuras refringentes intracelulares
• Con la tinción de gram se ven como zonas incoloras dentro de las células teñidas
• Con calor + verde de malaquita y safranina. (El calor permite la penetración del del colorante).
Tinción de flagelos y cilios
• Fuera del poder de resolución del microscopio óptico común por delgadas.
• Para verlos se agrega una suspensión coloidal de sales de ácido tánico (mordiente)
• Formara un precipitado que engrosara el tamaño de las estructuras
• Se aplica fucsina ácida y se visualizan como estructuras rojas.