5. Purificación de ADN plásmido

Cuando un biólogo molecular piensa en la producción de ADN plas-medio "a gran escala", el rango de 10-100 mg de ADN por lo general viene a la mente. Sin embargo, en un producto farmacéutico

figura 7. Etapas de purificación de plásmido de ADN a gran escala. Cada paso importante está aquí, junto con las opciones (izquierda) y los problemas de escala hacia arriba (derecha) para cada tecnología aplicable.

producción a gran escala, los requisitos de plásmidos de ADN pueden superar 50 g por lote. En casos extremos, se necesitarán muchos kilogramos de ADN plásmido por año para cubrir la demanda final-cialización de las vacunas de ADN actualmente en ensayos clínicos. La siguiente sección es para ser considerado en conjunto con varios comentarios publicados recientemente [110-112]. A continuación, destacamos especialmente el potencial de problemas de escala-up frente a las tecnologías de purificación de ADN plásmido existentes practicidad y.

Publica cultivo, la purificación de ADN plásmido en la gran escala (> 10 g) por lo general implica los pasos que se indican en el diagrama que se muestra en la figura. 7. El orden de los pasos es a menudo la siguiente manera: la recogida de células, lisis celular, la eliminación de restos celulares, la afinidad de la precipitación, adsorción e intercambio de tampón / concentración. En un primer momento, y para comprender mejor los peligros de gran escala de purificación de ADN plasmidial, es pertinente considerar las dificultades asociado a la ampliación directa de algunos procedimientos comunes de laboratorio.

Históricamente, purificación de ADN plasmídico se lleva a cabo a través del uso de bromuro de cesio (CsCl / EtBr) boyante separación por gradiente de densidad de cloruro / bromuro [113114]. Este método permite la separación de ADN de plásmido por densidad de flotación en bandas de diferentes formas (por ejemplo, superenrollado, circular abierta y lineal, multímeros) purificada cuando el CsCl / EtBr / mezcla de plásmido de ADN se somete a ultracentrifugación. La banda de plásmido ADN covalentemente cerrado se retira entonces de la botella ultracentrífuga (s) y de piel-Ther extrae y se precipitó el alcohol para eliminar tanto de CsCl y EtBr. Mientras se produce altamente purificado plásmido, este enfoque no es escalable debido a problemas de seguridad del personal y las consideraciones de residuos peligrosos asociados con el uso de cloruro de cesio y bromuro de etidio. Además, el uso de ultracentrifugación es también un obstáculo importante para la ampliación de esta tecnología. Sin embargo, este procedimiento todavía se considera el punto de referencia contra el cual pureza se evalúan todas las otras técnicas de purificación de ADN plásmido.

Métodos de purificación actuales a escala de banco emplean kits comercializados por empresas comerciales que se aprovechan de varias de las técnicas críticas a continuación, incluyendo lisis alcalina y el uso de columnas de cromatografía de desechables. Sin embargo, estas condiciones de purificación no se prestan ellos mismos a escala hasta porque pueden emplear sustancias químicas peligrosas, tales como fenol y cloroformo, requieren el uso de grandes cantidades de resina cromatográfica por miligramo de plásmido purificado, o necesitar el uso de relativamente gas- Sive enzimas para degradar los contaminantes (por ejemplo, RNasa y proteasa K). Por último, el uso de soluciones diluidas bastante conduciría a equipos de proceso extremadamente grande en la

> 50 g plásmido escala de producción de ADN y se traduciría en una considerable inversión de capital. Debido a su simplicidad, estos métodos de purificación son, sin embargo el método de elección para la purificación de pequeñas cantidades de ADN de plásmido (<20 mg) y se utilizan ampliamente en la investigación Laboratorios. Para una más detallada discusión de purificación de ADN plásmido a pequeña escala, Sambrook y Russell [114] ofrecen una extensa revisión y puesta al día de esta tecnología. A partir de la cosecha de células, las siguientes secciones siguen la progresión se muestra en la figura. 7 y detalles de cada etapa en la purificación de ADN plasmídico a gran escala típica. Además, común cuestiones de escala hasta se resumen.

5.1. Cosecha célula

Al completar el cultivo de células, casi todos los pasos de lisis de células se requiere el uso de una suspensión concentrada de células producido a través de una microfiltración [115] o centrifugación continua [116]. Además de proporcionar una suspensión concentrada de células, este paso elimina la mayoría del caldo de fermentación agotada, lo cual puede interferir con la lisis aguas abajo más común y / o pasos de purificación. Cuestiones de escala-up incluyen potencial ensuciamiento de la membrana y la limpieza de centrífugas continúas.

5.2. La lisis celular

Técnicas de lisis de células bacterianas más actuales (homogeneización, congelación / descongelación, extracción con detergente a base, etc) se han optimizado para la purificación de proteínas recombinantes y la mayoría no son aplicables a la purificación de ADN plásmido. Dado que la producción de ADN plásmido a gran escala está en su infancia, se utilizan actualmente sólo un puñado de técnicas de lisis. Por el momento, la técnica más común utilizado en la producción de ADN plásmido es la de lisis alcalina [117]. Este procedimiento se basa en el uso de hidróxido de sodio y el sulfato de sodio detergente dode-cil (SDS) cuyos efectos combinados dan como resultado la disrupción de la membrana celular, que conduce a la lisis y la liberación de los componentes intracelulares. Subsiguiente neutralización con acetato de sodio precipita proteínas y ADN genómico. Tras la neutralización, se hibrida superenrollado de ADN plásmido a partir de su estado de pH desnaturalizado mientras que el peso molecular grande (~ 200 kb) de ADN genómico no se puede difundir y recocido adecuadamente, lo que resulta en una sola hebra de ADN genómico precipitación. Además, a pH alto, el ARN se degrada, lo que beneficia posteriores etapas de separación. Sin embargo, esta lisis es bastante delicado como ADN plas-mid puede degradarse a pH alto si los altos con-diciones de corte se producen durante este procedimiento [118]. Dado que el ADN no se desnaturalizan durante este lisis, algunos de los ADN superenrollado se convierte a formas alternativas (por ejemplo, superenrollado desnaturalizado, multimérica círculo, abierta, y lineal). Además, la lisis alcalina puede provocar la fragmentación del ADN genómico, que puede hacer más difícil la eliminación abajo.

Otro método de lisis utilizado en la producción de ADN plas-mediados es el de la lisis celular de ebullición introducido por primera vez por Holmes y Quigley [119]. Este método de lisis utiliza una digestión lisozima para romper el peptidoglicano de la pared celular (a través de la hidrólisis de enlaces glicosídicos) seguido de calentamiento hasta el punto de que las membranas se disocian, que conduce a la liberación de ADN plasmídico a partir de su localización citosólica. Además, ADNasas indeseables son inactivadas y las proteínas se desnaturalizan y se precipitaron durante este paso de calentamiento. Cuestiones de escala-para arriba con la lisis de calor incluyen el diseño y la limpieza de intercambiadores de calor. En el ejemplo de ampliación principal de esta técnica LY-sis utiliza un intercambiador de calor continuo con un rápido calentamiento y

enfriamiento [120]. Esta lisis se ha llevado a cabo a la escala múltiple-gramo y es altamente escalable.

Además, lisozima sola puede ser utilizado para lisar las células en presencia de un detergente (por ejemplo, Triton X-100) [114]. Sin embargo, cabe señalar que la lisozima es tradicionalmente producida a partir de los blancos de huevo de gallina y no es un material en bruto deseable en la producción de cGMP de plásmido de ADN debido al riesgo de contaminación de este material aviar derivado. Una alternativa a la lisozima de huevo de gallina, aunque un poco más costosa, ha sido el uso de una lisozima recombinante, purificada a partir de E. coli [121122]. Desafíos Escala-up incluyen minimizar el uso de lisozima costo relativamente alto, sin embargo, el LY-sis es muy simple y se puede hacer en un tanque de proceso individual con muy altas recuperaciones de ADN plásmido. Una ventaja importante de una lisis lisozima basada, al lado de simplicidad, es que la degradación de pro-ducto no es un problema (por ejemplo, formación de desnaturalizada

superenrollado, círculo abierto y plásmido lineal). Una importante desventaja de la lisozima común frente a lisis alcalina procedi-miento es que la lisis lisozima libera contenido celular y no ayuda en la purificación.

El uso de lisis mecánica es un nuevo desarrollo en el campo de la separación de ácidos nucleicos. Un problema común, y una ventaja de la lisis mecánica de purificación-ción de proteínas, que es de alta cizalladura degrada los ácidos nucleicos [123]. Se ha demostrado que un número relativamente bajo cizallamiento inducido por un molino de perlas puede liberar el ADN plasmídico a partir de E. coli mientras que lo mantiene hasta el 90% intacta [124]. Actualmente, el único trabajo publicado utilizando lisis mecánica en la purificación de ADN plásmido es a una escala relativamente pequeña, sin embargo, la lisis mecánica se utiliza en la fabricación de proteínas a gran escala y el equipo es fácilmente disponible.

5.3. Afinidad precipitación de ADN plásmido

La mayoría de los procesos de producción a gran escala utilizan una precipitación afinidad aguas arriba de ADN plásmido. Alcoholes, a saber, etanol e isopropanol, son bien conocidos agentes de precipitación de ADN. Además, polietilenglicol [125], de-detergentes catiónicos, por ejemplo, CTAB, [122,126], ciertas sales tales como LiCl y CaCl2 [127], poliaminas tales como espermidina [128], y polietileno imina [129], se utilizan para eliminar la mayo-ría de los contaminantes en una preparación a gran escala sin tener que recurrir a las costosas separaciones cromatográficas.

Un ejemplo práctico de la afinidad de la precipitación es el uso de CTAB. Cuando se emplea esta tecnología, los rendimientos de ADN plasmídico son normalmente mayor que 90% y este procedimiento de precipitación se ha utilizado en la escala de gramo múltiple por Lander et al. [122]. Un ejemplo adicional de la precipitación de afinidad, en la práctica es el uso de poliaminas,

específicamente espermidina. Una vez más los rendimientos son comúnmente mayor que 90% y Murphy et al. [128] han aplicado esta estrategia de purificación a escala de gramo.

Además, los ligandos de unión a ADN (interacción triplex) fijados a polímeros sensibles a la temperatura se han utilizado en la purificación de ADN plásmido. Estos polímeros son solubles a temperatura baja, pero son insolubles a temperaturas más altas que resultan de un agente de precipitación-litación afinidad controlable temperatura [130]. Más recientemente, la empresa Dr. Müller AG ha aplicado este enfoque y está comercializando una estrategia de separación de ADN plásmido a gran escala basada en ligandos de afinidad triplex unidos a un polímero sensible estímulo.

Problemas de escalabilidad con precipitaciones de afinidad principalmente en-Volve una mezcla adecuada, la separación de los precipitantes, el lavado de los precipitantes, y el método de adición del agente de precipitación affin-dad. Temperatura, pH, grado de mezcla, y el tiempo de mezcla pueden afectar el tamaño de partícula precipitante y el alcance de cualquier precipitación. La mezcla y el método de adición del agente de precipitación de afinidad también son importantes porque la alta concentración local de los agentes de afinidad puede causar la coprecipitación de impurezas. Además, la cantidad de líquido residual que queda antes de la re-suspensión puede afectar en gran medida los niveles de impurezas.

5.4. Separación sólido-líquido en la producción de ADN plasmídico

La separación de los sólidos de los líquidos es una necesidad en la producción de ADN plásmido. Con dosis de ADN de plásmido en el orden de miligramos por dosis y el límite de solubilidad del crudo que contiene ADN lisados a 1-2 mg / ml, extremadamente grandes volúmenes de solución con niveles moderados de volumen de sólidos necesitan ser procesados. Los medios más económicos de sólidos de compensación es una separación por centrifugación basada, sin embargo, este método de separación sólido-líquido no puede producir una solución altamente aclarado y sin tiempos de residencia sustanciales, en parte debido a la alta viscosidad del plásmido de ADN en solución. Tiempos de permanencia grandes requieren ya sea muy grande centrifugadoras o largos tiempos de procesamiento, ninguno de los cuales es óptimo en un entorno de fabricación. Además, se han reportado problemas de limpieza con centrifugadoras industrial actual [131].

El más atractivo separación sólido-líquido de filtración basado en para el procesamiento a gran escala de ADN plásmido es la de una filtración de alimentación del cuerpo (por ejemplo, adición de un coadyuvante de filtración tal como di-atomaceous tierra (DE)). Esta torta de filtración de la capacidad de-aumenta la cantidad de ensuciamiento del filtro como la superficie de filtración se regenera continuamente como ayuda de filtro se deposita, lo que permite la eliminación de las grandes cantidades de residuos de células resultantes de la lisis de E. coli. Además, DE se sabe que se unen ARN [132], ayudando a etapas de purificación aguas abajo. Sin embargo, un inconveniente ma-jor en la ampliación de las filtraciones de alimentación del cuerpo es sólido la eliminación de

residuos. Con comunes lechadas DE AT ~ 50 g DE / l, métodos de producción a gran escala pueden producir toneladas de residuos sólidos contaminada por año.

Filtración de flujo tangencial (TFF) de lisados alcalinas de ADN que contiene el plásmido se ha demostrado como una operación de unidad de purificación factible. TFF se puede lograr para el intercambio de tampón y la eliminación de iones pequeña. Sin embargo, en una alta carga, las grandes moléculas biológicas no pueden ser eliminados adecuadamente durante TFF sin el uso de nucleasas caros, la exposición a largo plazo a un pH alto, y proteasas costosos debido a la formación de una capa de gel de ADN [133]. Además, a escala de arriba, los caudales de líquido elevados alcanzados necesitar el uso de bombas de alto cizallamiento que pueden degradar el sensibles al cizallamiento plasmediados ADN y el área de la membrana necesaria puede llegar a ser excesiva.

5.5. Separación de ADN plásmido adsorbente basado

Cromatografía, un sello distintivo de bioseparación, resulta ser un paso muy tedioso en la purificación de ADN plásmido. Resinas de cromatografía comunes utilizados en la separación de ácidos nucleicos son de intercambio aniónico (por ejemplo, grupos funcionales de amina cuaternaria (Q) y dietil aminoetil (DEAE)), fase inversa, interacción hidrófoba, hidroxiapatita, exclusión por tamaño, y cromatografía de afinidad por metales inmovilizados [78 , 95,134,135]. La mayoría de los medios de separación cromatográficos producidos actualmente están optimizados para la producción de pro-teínas. El tamaño de poro medio de cromatografía común contribuye a es menor que o aproximadamente el mismo tamaño que el radio de giro de una molécula de ADN plásmido [136].

Por lo tanto, el ADN plásmido no puede acceder a los poros de los medios de comunicación cromatográficas estándar y sólo puede unirse a la superficie externa de las partículas, por lo tanto, sólo aproximadamente el 0,2-2 g plasmediados de ADN se unen por litro de resina en contraste con las proteínas, donde la carga puede rango de 10 a 100 g por litro de resina. Esto significa que se necesita una cantidad sustancial de la cromatografía de los medios de comunicación en una separación de ADN plásmido a gran escala (~ 500-2000 l de resina / kg plásmido de ADN procesado). Sagar et al. [121] entra en más detalles acerca de la aplicación de las técnicas cromatográficas para la purificación de ADN plásmido.

Cromatografía de afinidad de metal inmovilizado se ha aplicado recientemente a la purificación de ADN plásmido. Por ejemplo, se encontró una resina de ácido iminodoacetic (IDA), encargado de Cu (II) para vincular bases de purina libres en solución. Por lo tanto, el ADN dañado y se unen ARN a una resina de IMAC en el modo de flujo a través mientras que el ADN plásmido no se conserva, permitiendo de ese modo pulido corriente abajo de manejar> 100 g de ADN plasmídico por litro de resina IMAC (para una alimentación con 2% ( w / w) RNA contaminación de) [135]. IMAC sólo se

ha aplicado en el ADN plásmido en la escala de 10 mg a este punto, sin embargo, debido a la escalabilidad de flujo a través de cromatografía (no degradados o pasos), las cuestiones de escala deberán ser mínimas.

Cromatografía de perfusión ofrece altas velocidades de flujo y moderadamente más altas capacidades de unión de ADN plásmido [121]. Los medios de perfusión típicas por ejemplo, tiene ~ 4000 Å con-poros convectiva, junto con el estándar de ~ 100-1000 Å poros de un medio de comunicación típicos. El flujo de convección a través de los medios de comunicación (normalmente ~ 5% del flujo total de líquido) disminuye la caída de presión y los poros más grandes convectivas pueden permitir algo de ADN plas-mediados para entrar en los medios de cromatografía, el aumento de la capacidad de unión al plásmido de ADN. Además, las velocidades lineales de 1000-5000 cm / h son alcanzables utilizando una perfusión de los medios de comunicación cromatografía (en oposición a 50-400 cm / h para medios de cromatografía convencionales).

Tentáculo soportes cromatográficos también se han utilizado en la producción a gran escala de ADN plásmido. Estas resinas contienen largas cadenas poli-electrolito con grandes enlazadores que se extienden desde la superficie de la resina cromatográfica. Esto aumenta el número de sitios cargados en la resina, y posiblemente la capacidad de carga. Para este punto, sin embargo, sólo ha habido publicaciones limitados que detallan el uso de resinas de tentáculos para la purificación de plásmido de ADN [137].

Se han completado estudios usando aditivos para incrementar la carga de ADN plásmido en las columnas por redu-ciendo el tamaño efectivo de moléculas de ADN plásmido en solución [121138]. Sin embargo, incluso con condensados par-tículas, la unión de ADN a cromatografía de medios de comunicación es bastante baja (típicamente menos de 5 mg de ADN / ml de resina de plásmido).

Además de la cromatografía en columna clásica, el uso de la cromatografía de lecho expandido ha sido para ser aplicado a la separación de ADN plásmido [139140]. El diseño de cromatografía de lecho expandido es una rama de un lecho fluidizado estándar, sin embargo, el lecho expandido se opera en un rango en el que se apoyan las partículas y no se mezclan de nuevo, permitiendo para las placas de separación para todavía existen. Además, este tipo de separación cromatográfica permite lisados para ser purificados con partículas limitadas y permite velocidades lineales en el modo de lecho expandido de ~ 300 cm / h. El principal inconveniente de adsorbentes de lecho expandido para la purificación de ADN plásmido es la de la capacidad de carga. Dado que el plásmido no penetra en los poros de los medios de comunicación más cromatográficas, área de superficie (y por lo tanto del tamaño de partícula) escalas con capacidad de carga. Debido adsorbentes de lecho expandido suelen tener grandes tamaños de partículas, las capacidades de carga son típicamente mucho menor que el de las columnas de cromatografía de lecho fijo clásicos. Para combatir este problema inherente con adsorbentes de lecho expandido, prototipos de adsorbentes con tamaños de partícula más pequeños y ligandos cromatográficos basados en

imina de polietileno (que actúan como un ligando tentáculo) se han utilizado con cierto éxito [141].

Con los problemas inherentes con purificación-ción de ADN plásmido cromatográfico, se han intentado otras formas de separación por adsorción. Para este fin, adsorción discontinua de contaminantes de proceso se puede realizar en lugar de cromatografía en columna, cuando se utiliza un adsorbente bajo costo. Un ejemplo de este enfoque se demostró con el uso de un silicato de calcio hidratado basado en la adsorción por lotes de ADN y otros contaminantes [142]. En este enfoque hidratado de silicato de calcio se utiliza para unirse al ADN genómico, círculo abierto plásmido, endotoxinas, proteínas, y detergentes residuales dejando-ING plásmido superenrollado en solución.

Separaciones de membrana de adsorción también muestran alguna promesa con el aumento de la capacidad de carga de ADN plásmido (~ 10 mg / ml de membrana), pero relativamente alto costo de la membranas prohíbe su uso a gran escala [143]. Ade-más, la adsorción de ADN genómico de E. coli en los filtros basados en nitrocelulosa se ha discutido, pero la capacidad de carga baja de ADN genómico de nitrocelulosa, los hace poco prácticos a gran escala [144].

5.6. Intercambio de búfer / concentración

TFF basada en membrana se puede utilizar para el intercambio de tampón y la eliminación de iones pequeña, sin embargo, a una alta carga, biomoléculas grandes no pueden ser permeados debido a la formación de una capa de gel de ADN. Posibles temas de escala-hasta que enfrenta esta tecnología incluyen tanto los requisitos para la amplia zona de superficie de la membrana y las altas tasas de flujo de fluido con el fin de mantener las membranas de ensuciamiento prematuramente.

El cambio de tampón y la concentración también puede efec-tuarse mediante una precipitación con base de alcohol. Esto permite la precipitación del ADN y la producción de un mayor sólido se secó a vacío, que es más estable y ocupa significativamente menos espacio de almacenamiento que un típico <10 mg / ml de solución de ADN plásmido [95145].

5.7. El producto final

Vacuna de ADN final o producto de terapia génica ha de ser 0,22 m esterilizó por filtración y se debe cumplir con la liberación mínima especificaciones después de la purificación. Especificaciones autorización puede variar debido al hecho de que los organismos reguladores no han fijado valores definidos para los contaminantes principales en la vacuna de ADN preparaciones. Un ejemplo de una especificación de corriente de la pureza del producto se muestra en la Tabla 3.

Formulación y la entrega de vacunas de ADN final son un área extremadamente importante de la investigación para mejorar las vacunas de ADN en su conjunto. Aunque las vacunas de ADN desnudo se ha demostrado que sea eficaz, un sistema de suministro eficiente podría re-ducir requerimientos de dosis y aumentar la efectividad del producto, mientras que la reducción de costes del producto. Para obtener más información Luo y Saltzman [146] y Lian y Ho [147] dar los exámenes a fondo de algunas de las estrategias de administración de ADN actuales.

6. Conclusión

A medida que avanza siguen en el campo de las vacunas de ADN y / o terapias génicas basadas en plásmidos, y emergen como productos comerciales, fábricas capaces de producir kilogramos de plásmido de ADN por año deben ser construidos. Los avances en el vector de-signo, la fermentación, purificación y formulación de ADN plásmido están siendo impulsados por esta nueva necesidad de grandes cantidades de ADN de plásmido y el marco regulador actual.

Para usos comerciales, las consideraciones de las restricciones pro-piedad intelectual se deben hacer al seleccionar vec-tores específicos, líneas de células huésped, y tecnologías de producción. Un gran número de patentes y solicitudes de patentes que específicamente o potencialmente cubren este campo se han emitido para el diseño vector [148,149], los métodos de cultivo [104], y la purificación ción procedimientos [150-152]. Estos ejemplos se enumeran aquí para recordar al lector que se debe prestar atención a este campo. Sin embargo, hay que recordar que las patentes sólo tienen una duración temporal. Además, mientras que aplica-ciones publicadas son a menudo bastante amplia en su alcance, las indemnizaciones concedidas tras la emisión pueden ser mucho más estrecho, y las reclamaciones pueden ser más limitada (es decir invalidado) a través de recurso judicial. Por lo tanto, en estrecha relación con un equipo legal de revisar cuidadosamente el entorno de la propiedad intelectual aplicables es el camino más adecuado a seguir.

Las tecnologías de fermentación y el proceso de ADN plásmido farmacéutica escala aquí reseñados son un buen comienzo hacia la meta de la vacuna de ADN producción a gran escala rentable.