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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN AGRIGENOMICA

Interacción de las proteínas OBAP1a y TCP14 de semilla de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana).

Alumna: María Paulina Torres Castro

Tutores: Ignacio López

Carlos Vicient

Barcelona, 2014

Máster Nutrición y Metabolismo 2

Interacción de las proteínas OBAP1a y TCP14 de semilla de Arabidospis (Arabidopsis thaliana).

RESUMEN

La proteína OBAP1a (oil body associated protein) ha sido localizada en la

superficie de los cuerpos lipídicos de las semillas de Arabidopsis (Arabidopsis

thaliana). No se conoce del todo su función pero su presencia es necesaria para

mantener la estructura de pequeñas esferas que constituyen los cuerpos lipídicos.

Los lípidos que se encuentran dentro de estas esferas son esenciales como

suministradores de energía en el proceso de germinación de las semillas.

Informaciones previas indicaban que la proteína OBAP1a podría estar

interaccionando con otras proteínas. En este trabajo se evaluó la interacción de la

proteína OBAP1a con el factor de transcripción TCP14. Para su estudio los genes

que corresponden a estas proteínas fueron clonados en los denominados

plásmidos de expresión, que permiten sobrexpresar las proteínas en bacterias.

Las proteínas fueron purificadas y para comprobar su posible interacción fue

utilizado el método de interacción de proteínas in vitro denominado pull down. No

se ha podido, por este método, demostrar la existencia de interacción entre

OBAP1a y TCP14.


I. INTRODUCCIÓN

Este trabajo ha sido realizado en la especie Arabidopsis thaliana que es

considerada la planta modelo más importante para el estudio del mundo vegetal.

Numerosos grupos de investigación concentran sus esfuerzos en el estudio de

esta especie con la finalidad de obtener conclusiones que puedan extrapolarse a

otras especies. Arabidopsis posee diversas características que la hacen una

especie modelo entre ellas tenemos: es planta de ciclo corto, de pequeño tamaño,

capaz de producir hasta 10000 semillas por planta, posee un genoma muy

pequeño que ha sido secuenciado (Becerra Baeza 2006). Además diversos

laboratorios han puesto a disposición de la comunidad científica numerosas

herramientas, como líneas mutantes, estudios masivos de expresión

(macromatrices), estudios de interacción entre proteínas etc.

El Grupo de Investigación Acumulación de lípidos de reserva en plantas que

pertenece al programa metabolismo e ingeniería metabólica del departamento de

genética molecular del CRAG, tiene como una de sus principales líneas de

investigación el estudio de proteínas asociadas a los cuerpos lipídicos (CLs) y la

investigación de estas proteínas en especies de interés agrícola como maíz y

colza para lo cual utilizan las herramientas disponibles en Arabidopsis para

avanzar en sus investigaciones.

1.1. Función, estructura y composición de los CLs en plantas:

Aunque los CLs se encuentran predominantemente en las semillas también

pueden estar presentes en frutas, tales como aceitunas y aguacates.

Las plantas almacenan energía y carbono en forma de lípidos, principalmente

triglicéridos (TAG), para ser utilizados en diversos procesos metabólicos, como el

crecimiento de las plántulas durante la germinación y la tolerancia al frio. Los

lípidos se almacenan en partículas lipídicas subcelulares llamadas CLs. Estos

orgánulos se han encontrado en una amplia gama de células de las plantas,

desde microalgas a las angiospermas. Los CLs mas estudiados son los que se


encuentran en las semillas principalmente en los embriones y otros tejidos como

hojas, flores y frutos (Murphy 2001, Chapman, Dyer et al. 2012, Murphy 2012). Los CLs se forman en el retículo endoplásmico (RE) (Murphy and Vance 1999) y

constan de un núcleo central compuesto por triglicéridos que está rodeado por

una única capa de fosfolípidos y por algunas proteínas unidas a su superficie.

Existen tres proteínas asociadas a CLs de función conocida como son la olosinas,

caleosinas y esteroliosinas y otras de las que se desconoce su función (Vance

and Huang 1987).

Figura1. Estructura de un Cuerpo Lipídico (CLs)

1.2. Nuevas funciones potenciales de los CLs en plantas

En estos últimos años ha habido una creciente apreciación en señalar que la

función de los CLs se extiende más allá de su papel como un simple depósito

estático para el almacenamiento de lípidos y en consecuencia existe un renovado

interés en el estudio de la ontogenia y la dinámica celular de este orgánulo.

Diversas investigaciones indican que en las células eucariotas los CLs también

están implicados en otras funciones como son:

• Depósitos de almacenamiento transitorios de proteínas e interacción con otras proteínas. En plantas los CLs se asocian a menudo con otros

orgánulos en la célula y puede permitir el tráfico de lípidos y proteínas

entre ellos (Murphy, Martin et al. 2009). Los estudios proteómicos y de

interacción de proteínas en plantas indican un posible papel de los CLs

como depósitos de almacenamiento transitorios de proteínas y en

animales se ha demostrado que pueden cumplir este papel (Fujimoto and


Ohsaki 2006, Fujimoto and Parton 2011). La asociación transitoria de las

proteínas con los CLs puede ser una manera de acumular proteínas que si

permanecen libremente en el citoplasma pueden interrumpir la función

celular, también puede ser una forma de proteger las proteínas de la

degradación, y a su vez puede servir como una plataforma para la

degradación de proteínas o para inactivar temporalmente proteínas al

separarla de su lugar de unión. El secuestro selectivo de proteínas por

parte de los CLs podría utilizarse también para distribuir proteínas a través

de las células utilizando los CLs como vehículos de transporte.

• Aplicaciones biotecnológicas. La producción de biofuel a partir del

aceite, la obtención de alimentos enriquecidos en lípidos, la utilización de

los CLs para usos cosméticos, para la producción y síntesis de proteínas o

moléculas de interés son alguna de las aplicaciones biotecnológicas más

interesantes de los estudios que se están realizando con los CLs

(Chapman, Dyer et al. 2012, Murphy 2012). Siendo un punto de interés su

posible aplicación para el aumento de la producción de biocombustibles en

los tejidos vegetativos.

1.3. Nueva proteína asociada a los cuerpos lipídicos OBAP1a Se están utilizando enfoques genéticos, moleculares y proteómicos para

identificar y caracterizar nuevas proteínas implicadas en la estructura y dinámica

de los CLs. Como modelos se están utilizando Arabidopsis, la colza y el maíz . En el laboratorio donde he realizado las practicas de máster se ha utilizado un

enfoque transcriptómico para identificar los genes expresados principalmente

durante la maduración en el escutelo de maíz (es el órgano de la semilla de maíz

que acumula la mayor cantidad de aceite), uno de los genes identificados fue

OBAP1a, que estaba descrito en las base de datos como una posible lipoproteína.

El genoma de Arabidopsis contiene cinco genes que codifican para proteínas

OBAP (oil body associated preotein), contiene dos genes de subfamilia 1 (obap1a

y obap1b) y tres genes de subfamilia 2 (obap2a, obap2b y obap2c) (López-Ribera,

La Paz et al. 2014). Actualmente se tiene un anticuerpo contra la proteína de

Arabidopsis OBAP1a, que pertenece a la familia 1, y se ha demostrado que el


mayor nivel de expresión de OBAP1a se produce durante la maduración de la

semillas y su expresión disminuye rápidamente después de la germinación.

Figura 2. Secuencia de aminoácidos de OBAP1a en Arabidopsis.

Un mutante knock-out de T-ADN para OBAP1a de Arabidopsis y una línea de

interferencia de ARN contra el mismo gen mostró una disminución en la tasa de

germinación, una disminución en el contenido de aceite en la semilla y que los

embriones tienen pocos, grandes e irregulares CLs. Este fenotipo sugiere que la

proteína OBAP1a está implicada en la estabilidad de los CLs, pero también

puede estar implicada en el control de la germinación de la semilla. Dos estudios

proteómicos diferentes en el maíz y Arabidopsis demuestran que la proteína

OBAP1a aumenta su presencia en los embriones durante el proceso de

envejecimiento artificial (Rajjou, Lovigny et al. 2008, Xin, Lin et al. 2011).

También se ha demostrado que la proteína OBAP1a está asociada a los CLs. Por

agroinfiltración de células epidérmicas de la hoja tabaco con OBAP1a fusionada a

una proteína fluorescente y por inmunodetección de secciones de embrión de

colza por microscopía electrónica de transmisión se comprobó que la proteína

OBAP1a se localiza principalmente en la superficie de los CLs. Análisis de

delección de proteínas demuestran que la región de la proteína OBAP1a que se

unen a los CLs es la parte más hidrofílica esto puede estar sugiriendo una

interacción con otra proteína en la superficie de los CLs.

El perfil de hidrofobicidad de OBAP1a es sensiblemente diferente al de las otras

proteínas conocidas asociadas a los CLs, los dominios hidrofóbicos son mas

pequeños y se ha demostrado que no son los que determinan su unión a los CLs.

Figura 3. Perfil de hidrofobicidad de OBAP1a.

1.5. Interacciones entre proteínas

MEKAVHLSTKNGPKVPGEPTKTGTSMVDTAASAVQSFAPINQIHQHLCAFHFYAYDMTRQVEA

HHFCGHINEDMRQCLIYDGPDANARLIGLEYIVTEKLFMTLPDDEKKLWHTHEWEVKGGFLFMP

GVPEAIQRQDLEKVAKTYGKVYHFWQVDLGHQLPIGLPNIMMAVTRDGQLYPEMIKETEKQFG

VSIDKERESRAYMKGPDHGIHPLANGGGKGLKLELREVDIKPVESVPRVFV


El estudio de las interacciones proteína-proteína tienen una importancia capital

en prácticamente todos los procesos en una célula viva. La información a cerca

de esas interacciones mejora nuestro conocimiento sobre su función. Un mapa de la red del interactoma proteína-proteína en Arabidopsis . BioGRID

(http://thebiogrid.org) que es una base de datos pública que difunden datos de

interacción genética de proteínas de organismos modelo y humanos, basado en

ensayos doble híbrido de levadura, ha mostrado que tres de las proteínas OBAP

(OBAP1a, OBAP1b, OBAP2c) interactúan entre sí y con factores de transcripción

implicados en la regulación de la dormancia y la germinación: TCP11, TCP14,

TCP15 y MARD1 (Boucher, Breitkreutz et al. 2014)

En esta base de datos hay información de tres posibles interacciones de la

proteína OBAP1a (AT1G05510) de Arabidopsis thaliana: con una ubiquitina

(UBQ3), con una hipotética proteína AT1G29680 (OBAP2c) y con factor de

trascripción At3g47620 (TCP14). Además observamos que el factor de

transcripción TCP14 presenta información de 121 interacciones dentro de las

cuales encontramos tres de las cinco proteínas OBAP localizadas en

Arabidopsis: At1g05510 (OBAP1a), At1g29680 (OBAP 2c) y At2g31985(OBAP1b)

(Boucher,Breitkreutz et al. 2014).

Figura 4. Interacciones de proteína OBAP (ensayos doble híbrido)


1.6. Factores de transcripción

Las células necesitan adaptarse constantemente a cambios ambientales,

modificando los patrones de la expresión génica. Los mismos genes están

presentes en todas las células de una especie, pero no todos están activos al

mismo tiempo. En la modulación de la expresión génica es necesaria la presencia

de secuencias reguladoras y proteínas capaces de direccionar la expresión de los

genes. La regulación de la expresión génica es uno de los eventos más

importantes en el control del desarrollo y de las respuestas a cambios

ambientales. Las proteínas maestras en la regulación de la expresión génica son

conocidas como factores de transcripción.

Los factores de transcripción son proteínas que se unen al DNA para controlar los

genes. Estas proteínas regulatorias, estimulan o reprimen la tasa transcripcional

de sus genes blanco al unirse a regiones promotoras específicas (i.e. elementos

cis). Esto activa o desactiva cascadas de señalización de genes. Los factores de

transcripción tienen funciones fundamentales en casi todos los procesos

biológicos (desarrollo, crecimiento y respuestas a factores ambientales) y se

asume que tienen un papel preponderante en la evolución de las especies. En

plantas, los factores de transcripción han sido empleados para manipular varias

rutas metabólicas, de crecimiento, desarrollo, y de respuestas al estrés. La

comparación entre especies y la identificación de módulos regulatorios

relacionados con los factores de transcripción, permitirán diseñar plantas con

mayor producción de biomasa o más tolerantes a diversos factores adversos del

medio como la sequía, o incluso manipular rutas de biosíntesis de metabolitos.

La estructura proteica de un factor de transcripción típico (figura 5) consiste de

dos dominios: el dominio de unión al ADN, responsable de unirse a elementos

específicos que actúan en cis en las regiones del promotor, y el dominio

regulatorio responsable de la regulación transcripcional de los genes blanco, el

cual se une a la maquinaria de transcripción (Shen, Chen et al. 2009). De esta

manera, los factores de transcripción inducen (activadores) o inhiben (represores)

de la actividad de la ARN polimerasa II, y así regulan la expresión genética

(Saibo, Lourenco et al. 2009).


En las plantas hay diferentes familias de factores de transcripción, clasificadas

con fundamento en su dominio de unión al ADN.

Figura 5. Esquema de actuación de un factor de transcripción.

1.7 Factores de transcripción TCP El factor de transcripción TCP (teosinte branched/cycloidea/proliferating cell

factors [pcf]) mantienen conservado un dominio hélice-bucle-hélice no canónico (a

non-canonical basic-Helix-Loop-Helix o bHLP)( figura 6). Esta familia de factores

de transcripción que conserva el dominio bHLP ha sido denominada TCP (por las

proteínas TB1, CYC y PCFs que fueron primeramente identificadas). Dos de estas

proteínas se encuentran expresadas en los primordios florales en crecimiento, con

actividad en el control de la división celular y en la evolución de las plantas para

generar nuevos caracteres morfológicos.

Figura 6. Dominio hélice-bucle-hélice


En Arabidopsis thaliana , la familia TCP tiene 24 miembros que se asignan en los

cinco cromosomas, esta familia puede ser subdividida en dos subfamilias : TCP -

P y TCP - C , también conocida como TCP Clase I y II , respectivamente. La

mayoría de los estudios moleculares y genéticos realizados con los genes de TCP

se han realizado con la familia TCP - C y han mostrado que los genes están

generalmente implicados en el establecimiento de la flor y la morfología de la

hoja. Sin embargo, el papel de las proteínas TCP -P en el desarrollo vegetal está

mucho menos documentado , se sabe que algunos miembros participan en la

fijación de los límites de órganos y tienen una influencia en el crecimiento y la

proliferación celular (Kieffer, Master et al. 2011, Balsemão-Pires, Andrade et al.

2013).

Se ha demostrado que el factor de transcripción TCP14, que pertenece a la Clase I

regula el crecimiento embrionario durante la germinación de la semilla en

Arabidopsis thaliana y que es expresado predominantemente en el tejido vascular

del embrión (Tatematsu, Nakabayashi et al. 2008, Kieffer, Master et al. 2011).

Estudios de RT-PCR cuantitativa y de hibridación in situ mostraron que el gen de

tcp14 se expresa preferentemente en el embrión y no en el endospermo. En

concreto la acumulación de transcriptos de TCP14 se produce principalmente en

el hipocótilo.

Figura 7. Secuencia de aminoácidos de TCP14

Se ha demostrado que la regulación de la actividad celular mediada por TCP14

en el sistema vascular es un factor determinante para el desarrollo del embrión en

respuesta a las señales hormonales.

Numerosos conjuntos de datos de microarrays disponibles a través de la

Arabidopsis navegador EFP (http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi)

MQKPTSSILNVIMDGGDSVGGGGGDDHHRHLHHHHRPTFPFQLLGKHDPDDNHQQQPSPSSSSSLFSLHQHQQLSQS

QPQSQSQKSQPQTTQKELLQTQEESAVVAAKKPPLKRASTKDRHTKVDGRGRRIRMPALCAARVFQLTRELGHKSDGE

TIEWLLQQAEPSVIAATGTGTIPANFTSLNISLRSSGSSMSLPSHFRSAASTFSPNNIFSPAMLQQQQQQQRGGGVGFHH

PHLQGRAPTSSLFPGIDNFTPTTSFLNFHNPTKQEGDQDSEELNSEKKRRIQTTSDLHQQQQQHQHDQIGGYTLQSSNS

GSTATAAAAQQIPGNFWMVAAAAAAGGGGGNNNQTGGLMTASIGTGGGGGEPVWTFPSINTAAAALYRSGVSGVPSG

AVSSGLHFMNFAAPMAFLTGQQQLATTSNHEINEDSNNNEGGRSDGGGDHHNTQRHHHHQQQHHHNILSGLNQYGR

QVSGDSQASGSLGGGDEEDQQDRVFV


indican que TCP14 también se expresa altamente en otros órganos. Esto sugiere

que las funciones de TCP14 es poco probable que se limite a la regulación de las

semillas (Provart 2014).

1.8 interacción entre las proteínas OBAP1a TCP14

Cuando se quieren realizar estudios a gran escala de interacción de proteínas una

de las primeras técnicas que se utilizan es la de doble hibrido de levadura. Pero

no todos los resultados obtenidos son válidos, esta técnica se caracteriza por la

numerosa presencia de falsos positivos. Por eso es necesario comprobar las

interacciones con técnicas más refinadas como la de pull down que es una de las

técnicas de búsqueda de interacciones in vitro entre proteínas más utilizada

porque sus resultados suelen ser fáciles de interpretar. Durante el desarrollo del

experimento las dos proteínas, de las que se quiere comprobar su interacción,

se ponen en contacto directo por coinmunoprecipitación.

Se ha decidido comenzar la demostración de las interacciones descritas en la

base de datos BioGRID entre las proteínas OBAP y los factores de transcripción

TCP, con las proteínas OBAP1a y TCP14 por disponer en el departamento de los

genes y porque es el resultado que a priori parece mas sorprendente ya que la

expresión y función de TCP14 se produce en el núcleo y la de OBAP1a en el

citoplasma celular.

II. OBJETIVO OBJETIVO GENERAL

El objetivo del presente trabajo fue validar las interacciones de la proteína

OBAP1a con el factor de transcripción TCP14 indicadas en la base de datos

BioGRID.


III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Proteínas

Las proteínas OBAP1a (Atlg05510) y TCP14 (AY103304) son de semilla de

Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). La proteína OBAP1a fue obtenida por

screening de una investigación previa en el grupo de investigación y la proteína

TCP14 fue donada por un grupo de investigación de Madrid. Al inicio del trabajo

los genes que codifican las proteínas se encontraban almacenadas a -80ºC

clonadas en un vector de entrada pENTR (invitrogen).

3.2. Vectores de clonaje y cepas bacterianas Para el clonaje y transformación de proteínas se utilizaron los siguientes

vectores, cepas bacterianas, antibióticos y medio de cultivo:

3.2.1 Plásmidos: pENTRTM TOPO (invitrogen), vector resistente a la kanamicina como vector de

entrada.

pDESTTM 15 (invitrogen), vector resistente a la ampicilina con proteína de fusión

GST Tag como vector de destino.

pDESTTM 17 (invitrogen), vector resistente a la ampicilina con proteína de fusión

His Tag (6x) como vector de destino.

3.2.2 Cepas de Escherichia coli. DB3, cepa usada para clonación de genes.

DH5α, cepa usada para transformación con plasmidos.

LB21, cepa usada para la expresión de proteína con IPTG.

3.2.3 Antibióticos Carbanicilina, se usó para la clonación de vectores destino y en todos los medios

de cultivo usados en la transformación con plasmidos y expresión de proteína con

IPTG.


Kanamicina, se usó para la clonación de proteína con vector de entrada.

3.2.4. Medio de cultivo Se uso medio de cultivo y agar LB (Luria-Bertani) durante toda la

experimentación.

3.3. Preparación de ADN plasmidico Se usó Kit Miniprep (QIAprep Spin) y se siguió el protocolo diseñado para la

purificación de plasmidos DNA que contengan sobre 20μg en un volumen de 1-

5ml de caldo de cultivo LB con Escherichia coli. Finalmente se realizó la lectura de

concentración de ácidos nucleicos usando micro espectrofotómetro (Nano Drop

ND-1000)

3.4. Reacción de recombinación La recombinación entre un vector de entrada y un vector destino se realizó

usando la enzima LR clonasa (Invitrogen) para lo cual se siguió el siguiente

procedimiento:

Se realizó una recombinación y sé obtuvieron 4 tubos. En cada tubo de 1,5ml se

colocó lo que se detalla en la tabla a continuación:

MUESTRA CONCENTRACION

(ng/μl)

TCP14 121.8

OBAP1a 181.7

pDEST15 62.26

pDEST17 62.98


Componente TCP14 OBAP 1

Proteína de estudio* 2,5µl 2.5µl 2.0µl 2.0 µl

pDEST15 3.0µl ----------------- 3.0µl ------------------

pDEST17 ----------------- 3.0µl ----------------- 3.0µl

Enzima LR clonasa 4.0µl 4.0µl 4.0µl 4.0µl

TE Buffer, pH 8.0 * 6.5µl 6.5µl 7.0µl 7.0µl

Total 16µl 16µl 16µl 16µl

* La cantidad de proteína de estudio y TE buffer varía de acuerdo con la concentración de ácidos

nucleicos que tuvieron los vectores de destino y entrada. Lo recomendado para el plásmido de

entrada es de 50-150ng y para el plásmido destino 150ng.

Los tubos fueron incubados a 25ºC por 1 hora (incubador GRANT LTC1).

Finalmente se añadió 2 µl de proteinasa K y se incubó a 37ºC por 10 minutos

(incubador GRANT LTC1). Finalmente se realizó el clonaje y la transformación

como se detalla en el punto 3.5

3.5. Transformación en cepas Escherichia coli.

Se tomó 50 μl de cepa Escherichia coli y 2 μl de proteína o plásmido, se colocó

en hielo por 30 minutos, Se realizó un choque térmico 30 segundos a 42ºC y

hielo. Se añadió 450 μl de caldo de cultivo LB y se colocó en agitación a 35ºC por

1 hora y a 200rpm (New Brunswick). Con este preparado se realizó una siembra

en placa con medio del cultivo LB (Luria-Bertani) con antibiótico y se colocó 100ul

y 400 μl en cada placa. Se incubó a 35ºC durante 24 horas en incubadora

(GallenKamp). Finalmente se tomo una colonia en 4ml de caldo de cultivo LB

(Luria-Bertani) con antibiótico carbanicilina (100µg/ μl) y se colocó en agitación

a 35ºC por 24 horas y a 200rpm (New Brunswick).

3.6. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para verificar la efectiva recombinación y transformación se usó la técnica de

PCR.


Se seleccionó al azar 20 y 15 colonias para OBAP y TCP14 respectivamente de

las placas obtenidas dentro del proceso de transformación, que fueron

transferidas a placas con medio de cultivo LB con carbenicilina y a microtubos

para PCR que contenían 20 µl de agua.

Se adicionó 30 µl de solución para reacción PCR con los oligos respectivos para

OBAP y TCP14 según sea el caso.

La solución de reacción para PCR estaba compuesta por: 5µl Buffer 10xB, 4 µl de

nucleótidos, 0,5 µl de oligos1, 0,5 µl de oligos2, 0,2 µl de TAC y 19,75 µl de agua.

Finalmente se colocaron en el termociclador (MJ Research) con diferentes

programas de amplificación para OBAP y TCP14.

Para OBAP se programó un ciclo de desnaturalización inicial a 94 ºC por 10 min,

seguido de 30 ciclos de amplificación a 94 ºC por 30 seg., 47 ºC por 45 seg, y 72

ºC por 1 min, y un ciclo final de extensión a 72 ºC por 10 min.

Para TCP14 se programó un ciclo de desnaturalización inicial a 94 ºC por 10 min,

seguido de 30 ciclos de amplificación a 94 ºC por 30 seg., 55 ºC por 45 seg, y 72

ºC por 1,5 min, y un ciclo final de extensión a 72 ºC por 10 min.

La separación de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa 1%

corridos por 2 h a 80 V y visualizados con Bromuro de etídio bajo luz UV.

Se escogió 2 colonias obtenidas como positivas, se clonaron y transformaron

como se detalla en el punto 3.5 .

3.7. Expresión de proteínas con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)

Se evaluó 3 concentraciones de IPTG al 0,1%, 0,5% y 1%, para lo cual:

-Se inoculó una cepa resultado de la transformación en LB21 en 4ml de caldo de

cultivo LB con antibiótico carbenicilina (100µg/ μl) por 24 horas.


- Se midió la densidad óptica (DO) a 595nm en un espectrofotómetro (Shimadzu

UV-1603) y se inoculó hasta obtener una densidad óptica de 0.6-0.9.

- Se añadió la concentración de IPTG 0,1%, 0,5% y 1% y se midió su densidad

óptica por 3 horas tomando alícuotas de 1ml cada hora las mismas que se

evaluaron mediante electroforesis para escoger el tiempo y la concentración de

IPTG adecuadas para tener la mayor expresión de la proteína.

3.8. Obtención de proteínas fusionadas a GST (pDEST 15)

-Se inoculó un precultivo con una cepa resultado de la transformación en LB21 en

50ml de caldo de cultivo LB con antibiótico carbenicilina (100µg/μl) por 24 horas.

-Se diluyó el precultivo 50ml en 450ml de caldo de cultivo LB y se incubó a 37ºC

con agitación a 200rpm (New Brunswick) hasta obtener una densidad óptica

(DO595) de 0.6-0.9.

- Se añadió IPTG y se incubó, la concentración y el tiempo adecuado para cada

proteína determinada anteriormente en la expresión de proteínas (OBAP

0,5%IPTG por 3 horas y TCP14 1%IPTG por 2 horas).

- Se centrifugó a 8000rpm por 20 minutos a 4ºC, se eliminó el sobrenadante y las

células se resuspendieron en 10ml de tampón NETN (20mMTris(pH 8); 10mM

NaCl;1mM EDTA; 0,5%NP40) al cual se le añadió los inhibidores de proteasas 1

μl/ml (PMSF, Leuperina, Aprotinina, Pepstatina y E-64)

- Se añadió la lisozima a una concentración 1mg/ml e incubó en hielo por 1 hora.

- Sonicar a 35W, 3 pulsos de 30 segundos con una amplitud de 17%.

- Centrifugar 8000rpm a 4ºC durante 45 minutos.

- Se guarda el sobrenadante para la purificación.

3.9. Purificación de proteínas fusionadas a GST (pDEST 15) Las proteínas de fusión a GST son purificadas de lisados de bacterianos mediante

cromatografía de afinidad, inmovilizando glutathione a una matriz de sefarosa.

Cuando añadimos el lisado bacteriano a esta matriz, la proteína de fusión se une

a su ligando, mediante lavados se eliminan todas las impurezas. Finalmente se


recupera la proteína eluyéndola en glutathione reducido. Se siguió el siguiente

procedimiento:

- Se usó una columna con 1,5ml de glutatión sepharose (GE Healhcare).

- Se eliminó residuos de etanol de la resina mediante el paso por la columna

de 5 veces 1ml con solución salina PBS.

- Se añadió el sobrenadante y se incubó 30 minutos en agitación constante.

- Con la ayuda de una bomba peristáltica se eluyó por la columna todo el

sobrenadante.

- Se eluyó 3 veces 5 ml de PBS con la finalidad de eliminar residuos de

sobrenadante retenidos en la columna.

- Finalmente se eluyó la proteína de interés retenida por el glutatión

realizando 3 eluciones de 1.5ml con la solución de elusión recomendada

por la casa comercial de glutatión sepharose (50mM Tris-HCL, 10mM

glutatión reducido; pH 8)

- La elusión se recogió en 10 microtubos eppendorf de aproximadamente

0,5ml)

- Se evaluó mediante electroforesis los microtubos de mayor concentración

de la proteína de interés.

3.10. Diálisis de proteína fusionadas a GST (pDEST 15).

- Se seleccionó los microtubos de mayor interés y se colocó en una bolsa

para diálisis.

- Se dejó toda la noche en agitación a 4ºC sumergido en solución de PBS

- Se midió la concentración de proteína mediante el método de Bradford.

3.11. Expresión de proteínas con pDEST 17

La transcripción y traducción de las proteínas unidas a pDEST 17 se realizó

utilizando el Kit TNT® (Coupled Reticulocyte Lysate Syste de Promega). Se siguió

las instrucciones del fabricante.

Se verificó la traducción mediante un Western blot como se indica en el punto

3.13 de materiales y métodos.


3.12. Ensayo de Pull Down La interacción de las proteínas TCP14 y OBAP1 se realizó mediante la técnica de

Pull Down técnica que se basa en a expresión de una de las dos proteínas a

evaluar fusionada la una a histidina y la otra a la enzima glutatión S-transferasa

(GST), permite demostrar interacciones proteína-proteína en sistemas in vitro.

- Se incubó en un tubo de 0,5ml las proteínas fusionada a GST (OBAP1) la

cantidad correspondiente a 1-5μg inmovilizada con glutatión sepharose

previamente purificada, teniendo un volumen final de 90 μl.

- Se dejó sedimentar el glutatión sepharose y se eliminó el sobrenadante.

- Se añadió 180μl de solución tampón de unión (20mM HEPES-KOH pH 7.9,

50mM KCl, 2.5mM MgCL2, 10% glicerol, 1mM DTT, 0,2% Nonidet P40,

100µM PMSF)

- Se incubó durante 1 hora a 4ºC con rotación suave.

- Se dejó sedimentar el glutatión sepharose y se eliminó el sobrenadante.

- Se añadió 40μl de la proteína TCP14 expresada mediante TNT.

- Se añadió solución de tampón de unión hasta un volumen final de 100μl.

- Se incubó toda la noche a 4ºC con rotación suave.

- Se traspaso a un tubo de 1,5ml y se dejo sedimentar el glutatión

sepharose.

- Se añadió 1ml de solución tampón Ripa ( 100mM Tris-HCl pH 7,5, 150mM

NaCl, 1mM EDTA, 0,2% Nonidet P40) , se dejó sedimentar y se eliminó el

sobrenadante. Este paso se repitió `por 9 veces.

- Se añadió 20μl de TM 1x con 10% β-mercaptoetanol y se escaldo a 95ºC

durante 5 minutos.

- Se verificó mediante un Western blotting indicado en el punto 13 de

materiales y métodos.


3.13. Western blot para proteínas con residuos de lisina biotinilada (obtenidas por kit TNT)

Western blot es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas

en una muestra determinada. Mediante una electroforesis en gel se separó las

proteínas por su peso molecular. Luego se transfirieron a una membrana

adsorbente de nitrocelulosa usando el transfer por 30 minutos a 25V.

Al estar las proteínas con lisina biotinilada para poder visualizarlas se hace

reaccionar con Stretavidin Horseradish Peroxidasa. Finalmente, se detectó por

quimioluminiscencia siguiendo las instrucciones indicadas por la casa comercial

Promega.

3.14. Western blot por Inmunodetección

Mediante una electroforesis en gel se separó las proteínas por su peso molecular.

Luego se transfirieron a una membrana adsorbente de nitrocelulosa usando el

transfer por 30 minutos a 25V.

- Se bloqueó la membrana con 5% de leche en polvo en PBS a 4ºC con

agitación.

- Se lavó tres veces consecutivas con solución PBS por 10 minutos cada

uno.

- Se realizó la reacción con el primer anticuerpo Anti-rabbit B (Abyntek) en

una concentración 1:500 diluido en una solución de 5% de leche en polvo

en solución PBS. Se incubó toda la noche a 4ºC con agitación.


lavado.

- Se incubó por 50 minutos en 30ml de solución de PBS con 5% de leche en

polvo con el segundo anticuerpo Anti-rabbit IgG(H+L)HRP (Promega) en

una concentración de 1:5000.


lavado.


- Se preparó la solución de revelado con 100μl de cada reactivo solución

peróxido y solución luminol/enhancer, se mezcló y finalmente se incubó

por 5 minutos y se expuso a quimioluminiscencia (LAS400 Fujifilm).

3.15. Electroforesis de proteínas

Uno de los métodos de electroforesis más comúnmente aplicado para

proteínas es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE =polyacrylamide

gel electrophoresis) en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato

sódico (SDS).

Se preparó un gel en vertical que está formado por un gel de separación de

15% de acrilamida y un gel concentrador 5% acrilamida, de la siguiente

manera:

Gel de separación: Agua destilada 3,71ml

Acrilamida Bisacrilamida (solución 40%

w/v)

3,75ml

Tris 1.5 M pH 8,8

2,5ml 0,4% SDS

10% (p/v) persulfato de amonio (APS) 40 µl

TEMED 5 µl

Gel de concentración: Agua destilada 2,6ml

Acrilamida Bisacrilamida (solución 40%

w/v)

0,4ml

Tris 0.5 M pH 6,8

1 ml 0,4% SDS

10% (p/v) persulfato de amonio (APS) 40 µl

TEMED 4 µl


El APS y el TEMED inician la reacción de polimerización, por lo que se

deben añadir en último lugar. Se prepara primero el gel separador se deja

polimerizar por 30 minutos y se añade el gel de concentración.

Las muestras se prepararon añadiendo 1/3 de loading buffer del total del

volumen y 10% v/v de β-mercapto etanol seguido por un escaldo a 90°C

por 1 minuto. Se colocó 30μl de muestra en cada pocillo.

Se usó un marcador de proteína de 10 a 245kDa que generalmente se

corrió en el primer pocillo y se colocó 3 µl del mismo.

Las condiciones de la transferencia fueron a 150V por un tiempo

aproximado de hora y media, luego del cual se tiñe el gel con Azul de

Cromassie seguido con lavados con una solución de metanol 30% y

etanol 10%. Y en caso de que el gel vaya ser usado para western blot no

sé realizó la tinción si no que se siguió el procedimiento para hacer la

transferencia a membrana.


IV. RESULTADOS

5.1. Clonaje por recombinación 5.1.1 pDEST-OBAP1a La comprobación del paso de los genes OBAP1a desde el plásmido pENTR a los

plásmidos pDEST 15 y 17 se realizó por PCR. Se evaluaron 20 colonias para

cada uno de los genes y plásmidos pDEST. En la figura 8 observamos la

presencia del gen OBAP1a, que tienen un tamaño de 725 pares de bases, los 20

carriles iniciales corresponden a pDEST15 y los 20 finales corresponde a pDEST

17, se usó dos carriles de DNA lambda digerido con los enzimas Hind III + EcoRI

para comprobar el tamaño de las secuencia amplificada.

Figura 8: Proteína OBAP1a transformado en pDEST 15 y pDEST 17.

5.1.2. pDEST-TCP14 En la figura 9 se muestra la verificación del clonaje por recombinación del gen

TCP14 en pDEST 15 y 17. La secuencia amplificada tiene un tamaño de 1470

pares de bases que es el esperado para el gen TCP14. Se verificaron 15 colonias

para cada vector destino. Las 15 columnas iniciales corresponden a pDEST15 y

las 15 columnas finales corresponden a pDEST17. Se usó marcador de DNA

lambda digerido con los enzimas Hind III + EcoRI para comprobar el tamaño de

las secuencia amplificada.


Figura 9: Proteína TCP14 transformado en pDEST 15 y pDEST 17.

5.2 Expresión de la proteína OBAP1a y TCP14 en pDEST15 En la figura 10 se presenta el resultado de la sobreexpresión de la proteína

OBAP1a y TCP14 en el vector destino pDEST15 inducida con diferentes

porcentajes de IPTG. El tamaño de la proteína OBAP1a es de 53,5kDa que es el

resultado de la suma del peso molecular de la proteína de estudio mas el peso

molecular de la proteína GST que se expresa conjuntamente y para TCP14 es de

78,5kDa. Se usó un marcador con pesos de 0 a 245kDa. Se evaluó 3

concentraciones de IPTG como se menciona en materiales y métodos en el punto

3.7. Las mejores condiciones de sobreexpresión fueron para OBAP1a 0,5% de

IPTG por 3 horas y para TCP14 1% de IPTG por 2 horas.

Figura 10. Gráfico A

PAGE-SDS de proteína

OBAP1a y gráfico B

PAGE-SDS de proteína

TCP14 ambas en

pDEST 15 expresada

con diferentes

concentraciones de

IPTG.


5.3 Purificación de proteínas OBAP1a y TCP14 en pDEST15 Con los resultados obtenidos y mostrados en las figuras 10, se realizó la

sobreexpresión y purificación de las proteínas OBAP1a y TCP14 usando una

columna de resina de glutatión sepharosa como se detalla en el apartado 3.9 de

materiales y métodos. De la purificación se obtuvieron 8 microtubos con 0,5ml

aproximadamente de proteína purificada para el OBAP1a y 7 microtubos para la

proteína TCP14 los mismos que fueron evaluados mediante electroforesis los

resultados se presentan en las figuras 11. Se observó que para la proteína

OBAP1a la mayor concentración se encontró en los microtubos 3,4 y 5 y para la

proteína TCP14 en los microtubos 5,6 y7. El contenido de estos microtubos se

agrupó y se realizó la diálisis para eliminar el glutatión como se indica en el

apartado 3.10 de materiales y métodos.

Figura 11. PAGE-SDS A) Proteína OBAP1a en pDEST15 purificada, peso equivalente a 53.5kDa.

B)Proteína TCP14 en pDEST 15 purificada, peso equivalente a 78.5kDa.

5.4 Transcripción y traducción in vitro de las proteínas OBAP1a y TCP14 en pDEST17

Fue realizado usando la transcripción y traducción in vitro con el kit TNT apartado

3.11 de materiales y métodos, en la figura 12 se presenta el resultado del análisis

de proteína mediante un western blot.


Figura 12. Proteínas obtenidas por transcripción y transducción in vitro. A) Proteína TCP14

pDEST17 B) OBAP1a PDEST17.

5.5 Ensayos de Pull-Down 5.5.1 Interacción de proteína OBAP1a pDEST15 con TCP14 pDEST17 Se realizó el ensayo de Pull Down como se indica en el apartado 3.12 de

materiales y métodos. En la figura 13 se presenta el resultado de dicha

interacción, en la columna 1 se colocó la muestra resultado de la interacción la no

presencia de proteína TCP14 indica que no habido interacción, en la columna 2

una muestra del sobrenadante de la proteína TCP14 antes de realizar los lavados

y en la columna 3 una muestra del primer lavado con solución tampón Ripa. Se

observó presencia de la proteína TCP14 biotinilada únicamente en la columna 2.

Figura 13. Resultado de western blot de

interacción de proteínas OBAP1a pDEST15

y TCP14 pDEST17.

Con este resultado y a la misma membrana se aplicó la técnica para un western

blot de inmunodetección para asegurar la presencia de la proteína OBAP1a


mediante el uso de anticuerpos específicos anti-OBAP1a. En la figura 14 se

muestra el resultado. En la columna 1 se observa la presencia de la proteína

OBAP1a fusionada a la proteína GST con peso molecular de 53,5kDa y en la

columna 2 se observa la presencia de la proteína TCP14 pDEST17 cuyo peso es

de 54,8kDa.

Figura 14. Resultado de western blot de inmunodetección de ensayo de interacción

de proteínas mediante técnica Pull Down.

5.5.2 Interacción de proteína OBAP1a pDEST17 con TCP14 pDEST15

Se realizó el ensayo de Pull down de interacción de proteína TCP14 pDEST15 y

OBAP1a pDEST17 cambiando la proteína de unión a la resina glutatión

sepharosa, el resultado de esta interacción se presenta en la figura 15. Se

observa presencia de la proteína OBAP1a pDEST17 en las columnas 3,4 y 5.

Figura 15. Resultado de western

blot de interacción de proteínas

TCP14 pDEST15 y OBAP1a

pDEST17.

En la columna 2 se colocó la muestra resultado de la interacción y no se observa

la presencia de la proteína OBAP1a, en la columna 3 se encuentra una alícuota


control de la transcripción y traducción in vitro, en la columna 4 el sobrenadante

antes de realizar los lavados y en la columnas 5 muestra de los lavados con

solución Ripa.

6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Ha sido demostrada la asociación entre OBAP1a y los CLs de las semillas de las

plantas y el papel que juega esta proteína en mantener la estructura y el tamaño

de los CLs, además se ha comprobado que esta nueva proteína es acumulada

durante la maduración de la semilla y desaparece después de la germinación.

Todavía es necesario demostrar de una manera más precisa la función que

OBAP1a realiza a nivel celular. Por otra parte se ha comprobado la existencia en

Arabidopsis de 5 proteínas que pertenecen a la familia OBAP.

Dentro de las numerosas herramientas disponibles en internet existe una base de

datos denominada BioGRID que tiene como objetivo el estudio de las

interacciones que existen entre las proteínas de diferentes especies utilizando la

tecnología del doble hibrido de levadura. En la información disponible para

Arabidopsis se informa que tres de las proteínas OBAP interaccionan entre sí y

con factores de trascripción.

Uno de los factores que interaccionan con las proteínas OBAP es un factor muy

conocido denominado TCP14, que juega un papel muy destacado durante la

germinación de las semillas. Diferentes trabajos ponen de relieve que este factor

de transcripción interacciona con distintas proteínas (Rueda-Romero, Barrero-

Sicilia et al. 2012).

La base de datos BioGRID muestra 121 interacciones en ensayos de doble

hibrido en levadura cuando se utiliza TCP14 como proteína cebo, entre las cuales

se encuentran 3 de las proteínas OBAP presentes en Arabidopsis: la proteína

OBAP1b (At2g31985), OBAP2c (At1g29680) y OBAP1a (At1g05510). Así mismo

cuando se utiliza como cebo una de estas proteínas OBAP aparece TCP14 como

proteína que interacciona.


Es bien conocido que los resultados obtenidos de interacción de proteínas

realizando solo la tecnología del doble hibrido en levadura no es suficiente para

demostrar de manera categórica una interacción proteína-proteína debido a la

gran cantidad de falsos positivos que aparecen, se ha de comprobar mediante

otro tipo de experimento como el de pull- down.

Utilizado esta técnica no hemos podido demostrar la interacción entre OBAP1a y

TCP14. Una de las razones que pueden hacer dudar de que estas dos proteínas

estén interaccionando es que las proteínas de este estudio cumplen sus funciones

en diferentes sitios de la célula, así TCP14 como todos los factores de

transcripción son proteínas que cumplen su función en el núcleo celular mientras

que la proteína OBAP1a se localiza en el citoplasma asociada a los CLs, por lo

que a priori se podía pensar que no exista una interacción de estas dos proteínas.

La razón que nos llevó a realizar de todos modos el estudio del pull -down fue, a

parte de la información suministrada por las bases de datos BioGrid, la

constatación avalada por varios estudios (Fujimoto and Parton 2011) de que los

CLs pueden actuar como depósitos de almacenamiento transitorios de proteínas e

interaccionar con otras proteínas. Esta función podría servir para impedir que las

proteínas al permanecer libremente en el citoplasma puedan interrumpir la función

celular, también puede ser una forma de proteger las proteínas de la degradación,

puede servir como una plataforma para la degradación de proteínas o para

inactivar temporalmente proteínas al separarla de su lugar de unión. El secuestro

selectivo de proteínas por parte de los CLs podría utilizarse también para

distribuir proteínas través de las células utilizando los CLs como vehículos de

transporte.

Aunque no se ha podido demostrar la interacción entre OBAP1a y TCP14 usando

la técnica de pull down estos resultados no descartan totalmente que dicha

interacción no se pueda producir. Hay que tener en cuenta que para el pull down

se utilizan proteínas que se han sintetizado en bacterias y que podrían carecer de

algunas de las modificaciones postraduccionales propias de las células Eucariotas.

Para poder descartar por completo la interacción entre OBAP1a y TCP14 sería

necesario realizar más experimentos, uno de los cuales podría ser usando el


fenómeno FRET (Fluorescence Resonance Energy Trasfer) que es una de las

técnicas más usadas para la evaluación de interacciones proteína-proteína.

7. CONCLUSIONES

• Los resultados obtenidos nos indican que no existe interacción de las

proteínas OBAP1a y TCP14 mediante el método de pull-down.

• Sería necesario la realización de experimentos alternativos para confirmar

estos resultados.

8. REFERENCIAS

• Balsemão-Pires, E., L. R. Andrade and G. Sachetto-Martins (2013). "Functional study of

TCP23 in Arabidopsis thaliana during plant development." Plant Physiology and

Biochemistry 67: 120-125.

• Becerra Baeza, C. M. d. C. (2006). Genes implicados en el desarrollo de la semilla de

Arabidopsis thaliana (L.): Caracterización de los genes AtAnkTm. Doctor en Biotecnología,

Universidad Aútonoma de Barcelona.

• Boucher, L., A. Breitkreutz, B.-J. Breitkreutz, C. Chang, A. Chatr-Aryamontri, D. Chen, K.

Dolinski, S. Heinicke, J. Hirschman, N. Kolas, M. Livstone, J. Nixon, L. O’Donnell, R.

Oughtred, J. Rust, A. Sellam, C. Stark , C. Theesfeld and M. Tyers (2014). "The Biological

General Repository for Interaction Datasets (BioGRID)."

• Chapman, K., J. Dyer and R. Mullen (2012). "Biogenesis and functions of lipid droplets in

plants. Thematic review series. Lipid droplet synthesis and metabolism: from yeast to

man." The Journa of Lipid Research 53: 215-226.

• Fujimoto, T. and Y. Ohsaki (2006). "Cytoplasmic lipid droplets: rediscovery of an old

structure as a unique platform." Annals of the New York academy of sciences 1086: 104-

115.

• Fujimoto, T. and R. G. Parton (2011). "Not just fat: the structure and function of the lipid

droplet. Cold Spring Harb Perspect Biol 3:1-17." Cold Spring Harb Prespectives in Biology

3: 1-17.

• Kieffer, M., V. Master, R. Waites and B. Davies (2011). "TCP14 and TCP15 affect

internode length and leaf shape in Arabidopsis." The Plant Journal 68: 147-158.


• López-Ribera, I., J. L. La Paz, C. Repiso, N. García, M. Miquel, M. L. Hernández, J. M.

Martínez-Rivas and C. M. Vicient (2014). "The evolutionary conserved oil body associated

protein OBAP1 participates in the regulation of oil body size." Plant Physiology 164: 1-13.

• Murphy, D. (2001). "The biogenesis and functions of lipid bodies in animals, plants and

microorganisms." Progress in Lipid Research 40: 325-438.

• Murphy, D. (2012). "The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to

mammals. Protoplasma. 2012 Jul;249(3):541-85." Protoplasma 249(3): 541-585.

• Murphy, D. J. and J. Vance (1999). "Mechanisms of lipid-body formation. Trends Biochem

Trends Biochemical Sciences 24: 109-115.

• Murphy, S., S. Martin and R. G. Parton (2009). "Lipid droplet-organelle interactions;

sharing the fats. Biochim Biophys Acta 1791: 441–447." Biochimica et Biophysica Acta

1791: 441-447.

• Provart, N. J. (2014). "The Bio-Array Resource Arabidopsis eFP Browser.", from

http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi.

• Rajjou, L., Y. Lovigny, S. P. Groot, M. Belghazi, C. Job and D. Job (2008). "Proteomewide

characterization of seed aging in Arabidopsis: a comparasion between artificial and natural

aging protocols." Plant Phisilogy 148: 620-641.

• Rueda-Romero, P., C. Barrero-Sicilia, A. Gómez-Cadenas, P. Carbonero and L. Oñate-

Sanchez (2012). "Arabidopsis thaliana DOF6 negatively affects germination in non-after-

ripened seeds and interacts with TCP14." Journal of Experimental Botany 63(5): 1937-

1949.

• Saibo, N. J. M., T. Lourenco and M. M. Oliveira (2009). "Transcription factors

and regulation of photosynthetic and related metabolism under en-vironmental stresses."

Annals of Botany 103: 609-623.

• Shen, H., F. Chen and R. A. Dixon (2009). "A bioinformatic analysis of NAC genes for plant

cell wall development in relation to lignocel-lulosic. ." Bioenergy Research 2: 217-232.

• Tatematsu, K., K. Nakabayashi, Y. Kamiya and E. Nambara (2008). "Transcription factor

AtTCP14 regulates embryonic growth potential during seed germination in Arabidopsis

thaliana." The plant Journal 53: 42-52.

• Vance, V. B. and A. H. C. Huang (1987). "The major protein from lipid bodies of maize.

Characterization and structure based on cDNA cloning." Journal of Biological Chemistry

262: 11275-11279.

• Xin, X., X. H. Lin, Y. C. Zhou, C. X.L., X. Liu and X. X. Lu (2011). "Proteome analysis of

maize seeds: the effect of artificial ageing." Physiology Plant 143: 126-138.

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