Trabajo experimental

Callogénesis en zanahoria

Reguladores de crecimientoAF-5402

Arabela Vega AguilarNoviembre 2011

Introducción

George et al (2008) definen un cultivo de callos (o bien cultivo de tejidos) como el crecimiento y mantenimiento de masas de células enormemente desorganizadas que surgen del crecimiento descoordinado y desorganizado de pequeños órganos de la planta, piezas de tejido de la planta o células previamente cultivadas.

¿por qué zanahoria?

• Stewart y Reinert en 1958 descubrieron

embriogénesis somática a partir de tejido de

zanahoria.

• Establecida como sistema modelo.

• Fenómeno reportado en más de 300 especies.

• Demuestra totipotencia de plantas superiores.

Objetivo general

Estudiar el rol de dos diferentes auxinas en el establecimiento de cultivos de callos de

zanahoria (Daucus carota).

Materiales y métodos(dos protocolos distintos)

Laboratorio de Biotecnología del CIA

• Piezas de tejido de la raíz de zanahoria.

• Medio de cultivo sólido.

Murashige y Skoog (MS)

• 2 reguladores de crecimiento.

AIA y 2,4 D

Tejido vegetal: proceso de desinfección

1. Zanahorias de 20cm de longitud y 4cm de diámetro.

2. Lavar con agua y jabón en recipiente agitando.

3. Pelar eliminando 2mm de tejido.

4. Cortar rebanadas de 1 cm de grueso.

5. Sumergir en etanol al 70% por 30 seg.

6. Sumergir en NaClO al 10% por 10 min en agitación.

7. Inicio de trabajo en cámara de flujo laminar.

8. Lavar rebanadas 5 veces con agua destilada y estéril, agitando en Erlenmeyer por 30 seg.

Mc Donald et al (1995)

Regulador de crecimiento

AIA

Se preparó 1ppm y 2ppm a partir de la solución madre de 1000ppm.

2,4 D

Se preparó 1ppm y 2ppm a partir de la solución madre de 500ppm.

Protocolo 1•MS con 1,0 ppm de 2,4D o 1,0 ppm de AIA.

•25ml de medio por frasco.

•Cubos de tejido del cambium de 1cm.

• 1 cubo de tejido por frasco.

•10 repeticiones por tratamiento.

•Cada frasco fue pesado y etiquetado.

•Peso de explantes por diferencia.

Mc Donald et al (1995)

Protocolo 2•MS complementado con:1ppm de 2,4D, 2ppm de 2,4D,

1ppm de AIA y

2ppm de AIA •Capa uniforme y delgada de MS.

•Cortes región cambial, floema sec.

•4 cortes por placa.

•10 repeticiones por tratamiento.

•Cada placa fue pesada y etiquetada.

•Peso de explantes por diferencia.

•Placas con AIA en oscuridad. 4xPhytoTechnology Laboratories, Inc. (2003)

Cultivo de callos (ambos protocolos)

• 16 horas de luz por 8 horas de oscuridad,

• 28 °C

• observaciones cada 3 días,

• descarte de frascos contaminados,

• tiempo de aparición de los callos y

• peso semanalmente

Protocolo 1

• Aparición de callos 21 días después.

• Muchos descartes por contaminación.

• Cambio de balanza, posible fuente de error.

• Disminución en peso en todos los explantes.

• Aparición de tejido nuevo y coloraciones verdes, café y moradas.

• Desarrollo de raíz.

Resultados y discusión

deshidratación

Contaminación

Inicios de raíz

AIA

2,4D

21 días de cultivoprotocolo 1

2,4 D AIA

29 días en AIA

Fotoprotección

29 días en 2,4D

62 días de cultivoen AIA

Estrés y antocianinas

Raíces en AIA

• Semana 1 ningún cambio.

• Explantes con mayor superficie expuesta.

• Mala gelificación del medio.

• Presencia de azúcar: mayor contaminación.

• No representativo para curva de crecimiento.

• Muerte de tejido por desinfección.

• 41 días de cultivo: presencia de callo

Resultados y discusiónProtocolo 2

7 días en 2,4D

Tejido muerto

Contaminación

41 días de cultivoContaminación Cambio de

pigmentación

Conclusiones y recomendaciones

• Reducir tiempo y concentraciones de desinfección.

• Definir tipo de callo (E o NE).

• Definir material de origen.

Jiménez y Bangerth (2001) sugieren hipocótilos

Narayan y Venkataraman (2000) sugieren plántulas

• Comparar tipos de corte para explante en iguales

condiciones.

• Escoger recipiente más adecuado.

• Evaluar concentraciones y efecto del RC.

• Oscuridad evita degradación de AIA.

• Mejorar procedimiento de pesaje.

• Peso seco.

• Mayor número de repeticiones.

Conclusiones y recomendaciones

Mi protocolo

• Utilizar hipocótilos como tejido de origen.

• Desinfección con etanol no más de 1min.

• Desinfección con NaClO al 3% máximo.

• Placas de Petri.

• 2,4 D a 1ppm y 2ppm, AIA a 1ppm y 2ppm

• Mejor manejo del medio de cultivo.

• 6 explantes muy pequeños por placa.

• Cuarto oscuro.

• Pesaje directo dentro de cámara.

• Observaciones y peso semanal.

• Expresar datos como % de ganancia de

peso por explante, no curva de

crecimiento.

Otro protocolopara zanahoria

Arroz CIBCM

GRACIAS