U IVERSIDAD ACIO AL DEL LITORAL FACULTAD DE CIE CIAS ...

U IVERSIDAD ACIO AL DEL LITORAL

FACULTAD DE CIE CIAS VETERI ARIAS

MAESRIA E CIE CIAS VETERI ARIAS

ME CIÓ MEDICI A PREVE TIVA

EVALUACIÓ DE LA RESPUESTA I MU E I ATA E CARPI CHOS.

RELACIÓ CO EL ESTRÉS Y RELEVA CIA PARA LA I VESTIGACIÓ

ECO EPIDEMIOLÓGICA.

Autora: Vet. Cecilia Josefina Baldi

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE

MAGISTER SCIE TIAE E CIE CIAS VETERI ARIAS

Santa Fe, Octubre 2014

I

U IVERSIDAD ACIO AL DEL LITORAL

FACULTAD DE CIE CIAS VETERI ARIAS

MAESRIA E CIE CIAS VETERI ARIAS

ME CIÓ MEDICI A PREVE TIVA

EVALUACIÓ DE LA RESPUESTA I MU E I ATA E CARPI CHOS.

RELACIÓ CO EL ESTRÉS Y RELEVA CIA PARA LA I VESTIGACIÓ

ECO EPIDEMIOLÓGICA.

Autora: Vet. Cecilia Josefina Baldi

Director: Dra. Andrea Laura Racca

Codirector: Dr. Pablo Martín Beldomenico

Jurado

Dra. Cristina Scaglione

Magíster Onelia Lavaroni

Dra. Carolina Veaute

II

DEDICATORIA

Con amor a:

Mis hijos Lautaro y Manuela que son la razón de mi vida y a mi madre que siempre

confió en mí.

III

AGRADECIMIE TOS

En primer lugar un profundo agradecimiento a la Dra. Andrea Racca por ser mi

directora, brindarme la oportunidad de realizar este proyecto y por su ayuda y apoyo

incondicional.

A la Dra. Ayelen Eberhardt por su colaboración y permitirme usar información de su

trabajo de Tesis doctoral.

Al Dr. Pablo Beldomenico por facilitarme las instalaciones del laboratorio y

financiamiento para el desarrollo de este trabajo

Al Dr. Lucas Monje por su colaboración y aportes.

A todo el grupo de personas que conforman el Laboratorio de Ecología de

Enfermedades ICIVET LITORAL (UNL CONICET) que de una u otra forma han

colaborado.

A la Dra. Adriana Soutullo, Sonia Riccoti, Romina Russi y Maria Victoria Barcarolo

del Laboratorio de Diagnósticos e Investigaciones del Ministerio de la Producción, por su

apoyo.

A Matías Oscar Lapissonde por acompañarme y alentarme en este trayecto.

IV

Í DICE ABREVIATURAS ..............................................................................................................VII

ÍNDICE DE TABLAS..........................................................................................................XI

ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................XII

RESUMEN........................................................................................................................ XIII

SUMMARY ...................................................................................................................... XIV

CAPITULO I – INTRODUCCION ....................................................................................... 1

I.1. Aspectos generales ....................................................................................................... 1

I.2. Objetivo general ........................................................................................................... 5

I.3. Objetivos específicos ................................................................................................... 5

I.4. Hipótesis....................................................................................................................... 5

CAPITULO II REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA................................................................... 6

II.1. Contexto.......................................................................................................................... 6

II.2. Ecoinmunología .......................................................................................................... 8

II.3. Hydrochoerus hydrochaeris (carpincho) .................................................................... 9

II.4. Marcadores de inmunocompetencia evaluados ........................................................ 11

II.4.1 Anticuerpos Naturales (AcN) ............................................................................. 11

II.4.2 Citocinas ............................................................................................................. 14

II.4.2.1. Citocinas pro inflamatorias......................................................................... 16

II.4.2.1.1. IL 1 β .................................................................................................. 16

II.4.2.1.2. TNF...................................................................................................... 17

II.4.2.2. Citoquina anti inflamatoria ......................................................................... 18

II.4.2.2.1. IL 10 .................................................................................................... 18

CAPITULO III MATERIALES Y METODOS ................................................................ 20

III.1. Estudio experimental ............................................................................................... 20

III.1.1. Aclimatación y comparaciones de base............................................................ 22

III.1.2. Tratamientos ..................................................................................................... 23

V

III.2. Toma de muestras.................................................................................................... 24

III.3. Valoración del estrés ............................................................................................... 25

III.4. Valoración de parámetros de salud generales ......................................................... 26

III.4.1 Valoración del esfuerzo somático ..................................................................... 26

III.4.2. Evaluación de los parámetros hematológicos .................................................. 26

III.4.3. Determinación de proteínas totales y albúmina sérica .................................... 27

III.5. Valoración del sistema inmune innato ................................................................... 28

III.5.1. Determinación de anticuerpos naturales (AcN) ............................................... 28

III.5.1.1. Suspensión de glóbulos rojos: .................................................................. 28

III.5.1.2. Ensayos de hemoaglutinación: ................................................................. 29

III.5.2. Determinación de citocinas .............................................................................. 29

III.5.2.1. Extracción de ARN: ................................................................................. 30

III.5.2.2. Trascripción reversa ................................................................................ 311

III.5.2.3. Diseño de oligonucleótidos ..................................................................... 311

III.5.2.4. Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés: Polimerase Chain

Reaction PCR ) en tiempo real............................................................................... 33

III.6. Análisis estadístico .................................................................................................. 33

CAPITULO IV – RESULTADOS ....................................................................................... 35

IV.1. Valoración del estrés ............................................................................................... 36

IV.2. Valoración de parámetros de salud generales ......................................................... 36

IV.2.1. Valoración de esfuerzo somático ..................................................................... 36

IV.2.2. Evaluación de los parámetros hematológicos .................................................. 36

IV.2.3. Determinación de proteínas totales y albúmina sérica ..................................... 37

IV.3. Valoración de parámetros del sistema inmune innato............................................. 37

IV.3.1. Determinación de AcN..................................................................................... 37

IV.3.2. Determinación de citocinas .............................................................................. 38

IV.3.2.1. Diseño de los Oligonucleótidos (cebadores específicos) ......................... 38

IV.3.2.2. Condiciones de la PCR.............................................................................. 39

CAPITULO V – DISCUSION ............................................................................................. 42

VI

V.1. Sinopsis de los resultados relevantes del experimento............................................. 42

V.2. Estrés: masa corporal y condición corporal.............................................................. 43

V.3. Estrés e inversión inmunológica............................................................................... 44

CAPÍTULO VI – CONCLUSIÓN ....................................................................................... 49

CAPITULO VII REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................... 51

CAPITULO VIII ANEXO………………………………….…………….………………61

VII

ABREVIATURAS

A: albúmina

AcN: Anticuerpos Naturales

ACTB: beta actina

ADN: ácido desoxirribonucléico

ADNc: acidoácido desoxirribonucléico copia

Ag: antígeno

APCs: células presentadoras de antígenos profesionales

ARN: ácido ribonucléico

ARNm: ácido ribonucléico mensajero

°C: grados centígrados

C (CLR): receptores de lectinas tipo C

c/u: cada una

CD80 y CD86: moléculas coestimuladoras

CSIF: Factor Inhibidor de la Síntesis de Citocinas

Ct: Ciclo umbral (del inglés: cycle threshold )

DEPC: Agua tratada con dietil pirocorbonato

dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato

EDTA: ácido etildiaminotetraacético

EIE: Enfermedades Infecciosas Emergentes

g: fuerza centrífuga

VIII Gb: globulina

GB: glóbulos blancos

GLMM: modelos mixtos lineales generalizados

GR: glóbulos rojos

gr: gramo

IgM: inmunoglobulina M

IL 1: Interleuquina 1β

IL 10: Interleuquina 10

IL 17: interleuquina 17




kg: kilogramo

LB: linfocitos B

LMM: modelos lineales mixtos

LT: linfocitos T

MCI: Masa Corporal Inicial

mg: miligramo

MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad

Min: minutos

ml: mililitro

mM: milimol

IX ng: nanogramo

NK: célula asesina (de sus siglas em inglés natural killer)

NKT: célula asesina T (de sus siglas em inglés natural killer T)

nm: nanometro

NOD (NLR): receptores tipo NOD

PAMP: Patrones Moleculares Asociados a Patógenos

PBS: solución buffer fosfato

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

PPT: proteínas totales

RIG I (RLR): receptores tipo RIG I

Rpm: revoluciones por minuto

RRP: Receptores de Reconocimiento de Patrones

Seg.: segundo

T°: temperatura

TA: Temperatura Ambiente

TGF β: Factor de Crecimiento Transformante β

Th1: célula colaboradora T 1



TLR: receptores tipo Toll

TNF: Factor de necrosis tumoral α

TNFR: Receptores de Factor de Necrosis Tumoral

X Tr1: linfocitos T reguladores

U: unidades internacionales

UNL: Universidad Nacional del Litoral

l : microlitro

m: micrometro

XI

Í DICE DE TABLAS

Tabla 1. Parámetros de salud…………………………………………………………..... 35

Tabla 2: secuencia de los cebadores específicos………………………………………....39

Tabla 3: Condiciones de la PCR………………………………………………………... 40

XII

Í DICE DE FIGURAS

Figura 1: Respuesta inmune del hospedador frente a un desafío antigénico…………… 13

Figura 2: Diagrama de la distribución de los recintos para el experimento……………... 21

Figura 3: Alineamientos múltiples…………………………………………………...…. 32

Figura 4: El efecto de los tratamientos sobre la ganancia de masa corporal,

condición corporal y los parámetros inmunológicos………………………..……………. 38

Figura 5: Efecto de los tratamientos sobre la expresión de ARNm de las citocinas

evaluadas……………..……….…..………………………...…………….....……………..41

XIII

RESUME

Ciertos factores antropogénicos y/o ambientales pueden ocasionar diferentes tipos de

estrés influyendo sobre el sistema inmune de animales silvestres. La valoración del estado

inmunitario de estos individuos es fundamental para dilucidar la ecoepidemiología de

enfermedades que afectarían la salud del hombre y los animales. En el presente trabajo,

fueron evaluados componentes del sistema inmune innato (Anticuerpos naturales (AcN) y

citocinas: TNF α, IL 1β e IL 10) e índices genéricos de salud (condición corporal y

parámetros hematológicos), a partir de un modelo experimental de estrés en carpinchos

(Hydrochoerus hydrochaeris). El objetivo fue establecer si estos marcadores eran sensibles

al estrés crónico (estrés nutricional y psico físico).

Los resultados mostraron un impacto negativo de ambos tipos de estrés en la condición

corporal de los individuos y un efecto positivo en componentes inmune no específicos

(eosinófilos y AcN). La determinación de la expresión de ARNm de las citocinas evaluadas

no se vio modificada por el estrés.

Estos resultados sugieren que durante períodos prolongados de estrés los carpinchos

invierten en componentes del sistema inmune como: AcN y eosinófilos, lo cual podría ser

considerado una profilaxis dependiente del estrés. Estos marcadores constituirían una

importante herramienta para el estudio de la dinámica de salud en poblaciones silvestres de

carpinchos.

Palabras claves: ecoinmunología, anticuerpos naturales, citocinas, animales silvestres.

XIV

SUMMARY

Some anthropogenic and/or environmental factors may cause different kinds of stress

influencing the immune system of wild animals. Assessing the immune competence of

these individuals is crucial to elucidate the eco epidemiology of many diseases of

importance for humans and animals. In this work, two components of innate immune

system: natural antibodies (NAb) and cytokines (TNF α, IL 1β and IL 10) and generic

indices of health (body condition and hematological parameters) were assessed as markers

in stressed capybara (Hydrochoerus hydrochaeris) from an experimental model. The goal

was to assess the effect of two types of chronic stress food restriction and physical

restraint on these markers.

The results showed that both stress treatments had a marked negative impact on body

condition, but they had a significant positive effect on some components of the immune

system (eosinophil and NAb). Expression of cytokines messenger ribonucleic acid levels

has not been affected by both types of stress.

These results suggest that during prolonged periods of stress capybaras preventively

invest in some components of their innate defenses: NAb and eosinophils, which could be

considered a stress dependent prophylaxis. These markers have the potential to be an

important tool for the study of dynamics of health in wild populations of capybaras.

Keywords: eco immunology, natural antibodies, cytokines, wild mammals.

1

CAPITULO I – I TRODUCCIO

I.1. Aspectos generales

La salud de los animales silvestres es actualmente objeto de creciente interés debido a su

alta relevancia para la salud pública, la conservación de especies y la producción animal

(Beldomenico, 2006). Las enfermedades infecciosas emergentes (EIE) constituyen una

carga significativa para la economía global y la salud pública (Morens et al., 2004). Una

gran parte de las EIE son zoonosis, y la mayoría de estas se originan en animales silvestres

(Pedersen et al., 2008). Asimismo, muchas zoonosis de alta incidencia en el país (por ej.

chagas, fiebre hemorrágica argentina., síndrome pulmonar por hantavirus, etc.) también

poseen reservorios silvestres. Por ende, el estudio de la dinámica y distribución de

patógenos en la fauna interesa a la salud pública. A su vez, se debe tener en cuenta que la

actividad humana puede volver a la fauna vulnerable a un sinfín de enfermedades

infecciosas. Están bien documentadas declinaciones poblacionales de animales silvestres

debidas a epidemias (Pedersen et al., 2008; Smith et al., 2009). Por esta razón, el estudio de

enfermedades infecciosas y parasitarias en poblaciones silvestres es de relevancia para la

conservación de biodiversidad. También hay varios ejemplos que demuestran un flujo de

patógenos a nivel de la interfase doméstico silvestre, por lo que la salud de los animales

silvestres es de importancia para la sanidad de planteles de animales domésticos

(Beldomenico, 2006)

2

Estudios recientes, tanto empíricos como teóricos, indican que la inmunocompetencia de

los individuos de una población es un factor crucial para explicar las dinámicas de

patógenos en sistemas naturales (Beldomenico y Begon, 2010; Lochmiller, 1996).

Se ha demostrado en roedores silvestres que individuos en condición nutricional y

psico física deteriorada, tienen más chances de ser parasitados (en el contexto de la

ecología el término parásito comprende de virus a artrópodos) y el parasitismo resultante

es de mayor intensidad (Beldomenico et al., 2009a; Beldomenico et al., 2009b). Estas

infecciones severas suponen una afección mayor en la condición de los individuos, lo que

desencadena un círculo vicioso (impacto sobre la conservación). Al mismo tiempo estas

infecciones de mayor intensidad genera individuos superpropagadores y aumenta la

densidad de patógenos, exponiendo al hombre y los animales domésticos a una mayor

cantidad de estos patógenos (impacto sobre la salud pública y la producción animal)

(Beldomenico y Begon, 2010). Asimismo, el estudio de la dinámica de los fenómenos de

salud y enfermedad en sistemas naturales permitiría un mejor entendimiento de estos

procesos biológicos, ya que no están influenciados por la medicina preventiva, la

instauración de tratamientos y las respuestas comportamentales ante brotes (por ej.

fumigaciones, uso de barbijo). Además, esta demostrado que las interacciones entre

patógenos en un mismo hospedador son uno de los principales determinantes del riesgo de

infección con patógenos zoonóticos en roedores silvestres, lo cual en gran parte de los

casos sucedería por mecanismos que involucran el sistema inmune como mediador (Telfer

et al., 2010). Indudablemente, nuestro entendimiento de la distribución y abundancia de

enfermedades zoonóticas en sus hospederos reservorios depende de que logremos

3

profundizar en las dinámicas del sistema inmune y su interacción con las infecciones. En

herbívoros silvestres, es de interés el sistema inmune innato ya que se encuentran bajo una

intensa presión de selección (Lochmiller y Deerenberg, 2000). Actualmente, un gran

desafío para el estudio de la inmunidad en poblaciones silvestres es el de discernir si los

niveles de marcadores inmunológicos observados en un individuo son resultado de una

exposición diferencial a ciertos patógenos, de una capacidad diferencial de respuesta

inmune, o de una combinación de ambos. Esto es especialmente cierto para el sistema

inmune adaptativo, pero resta determinar en qué medida lo es para el innato. Por lo

expuesto, la valoración del estado inmunitario de individuos silvestres es importante para

dilucidar la ecoepidemiología de muchas enfermedades de importancia para la salud en

animales silvestres, domésticos y del hombre.

Los esfuerzos para medir el estado de salud y el estado inmunitario de los individuos

silvestres han sido limitados. Si bien un número de estudios ha hecho énfasis en índices

genéricos de salud, son muy escasos aquellos que evalúan compartimentos específicos de la

inmunidad (Smits, 2007). Elementos de la inmunidad humoral innata, tales como

anticuerpos naturales (AcN), componentes del sistema complemento y ciertas citocinas,

estarían involucrados en la supervivencia de organismos por participar activamente en la

resistencia temprana a la infección (Lochmiller y Deerenberg, 2000).

Teniendo en cuenta lo anterior, es importante evaluar cómo, ciertos factores

antropogénicos y/o ambientales (estrés nutricional y psicofísico) podrían influir sobre el

sistema inmune humoral innato en animales silvestres (Hydrochoerus hydrochaeris,

Rodentia: Caviidae). De este modo se generan herramientas para el estudio de la dinámica

4

de salud de estas poblaciones, contribuyendo así a la ecoepidemiología y a la

ecoinmunología.

5

I.2. Objetivo general

Determinar experimentalmente el efecto del estrés (nutricional y psico físico) sobre

parámetros fisiológicos y del sistema inmune innato en un modelo experimental de

carpinchos (Hydrochoerus hydrochaeris).

I.3. Objetivos específicos

1) Evaluar niveles de anticuerpos naturales (AcN) mediante técnicas de hemoaglutinación

directa en carpinchos expuestos experimentalmente a diferentes niveles de estrés

psicofísico y nutricional.

2) Evaluar niveles de citocinas mediadoras de la respuesta inmune innata (TNF α, IL 1β e

IL 10) mediante técnicas de PCR en tiempo real en carpinchos expuestos

experimentalmente a diferentes niveles de estrés psicofísico y nutricional.

3) Relacionar el título de AcN y los niveles de citocinas con características del hospedero,

como ser la edad, condición corporal, parámetros hematológicos de las especies estudiadas

I.4. Hipótesis

1) Los marcadores del sistema inmune evaluados (títulos de AcN y citocinas) son

sensibles al estrés nutricional y psico físico.

2) Los marcadores del sistema inmune evaluados están asociados a la condición corporal y

otros índices genéricos de salud (hematología).

6

CAPITULO II REVISIÓ BIBLIOGRÁFICA

II.1. Contexto

Se ha propuesto que la inmunocompetencia podría ser un factor clave en la regulación

de poblaciones silvestres (Lochmiller, 1996). El sistema inmune de un individuo se

caracteriza por una serie de mecanismos celulares y humorales interrelacionados, en donde

la respuesta inmune innata juega un rol esencial como primera línea de defensa contra

patógenos invasores. Algunos autores sugieren que el componente innato del sistema

inmune sería el más importante para especies de corta vida bajo intensa presión de

selección (Lochmiller y Deerenberg, 2000), argumentando que la infección no persistiría

más de algunas horas o días antes que el animal sucumba a la depredación o a la inanición.

Sin embargo, otros estudios demostraron que, en dos especies de roedores, aquella que

poseía mayor capacidad de producción de anticuerpos, parte de la inmunidad adaptativa,

mostraba mayor capacidad invasora (Klein y Nelson, 1999). La influencia de cada

compartimiento del sistema inmune en las dinámicas poblacionales del hospedero y en las

dinámicas de infección está lejos de ser dilucidada.

La infección con patógenos es tradicionalmente estudiada en forma dicotómica, en

donde los individuos son clasificados como infectados o no infectados (Keeling y Eames,

2005). Sin embargo, luego de la exposición al patógeno, las consecuencias pueden variar

desde la falla del proceso infeccioso al desarrollo de una infección muy severa. El éxito del

proceso infeccioso dependerá en parte de características del patógeno (como por ejemplo,

patogenicidad, dosis infectiva) pero también de la integridad de las defensas del hospedero.

7

En los vertebrados estas defensas consisten en barreras físicas y químicas, componentes

del sistema inmune innato y de la respuesta inmune específica (Tizard, 2004). En la

economía fisiológica del hospedero, la asignación de recursos al sistema inmune depende

de la disponibilidad de nutrientes y demandas fisiológicas (Sheldon y Verhulst, 1996;

Lochmiller y Deerenberg, 2000; Demas, 2004). Diferencias del individuo relacionadas a la

edad, co infección, entre otras, determinan inversiones diferentes en los componentes del

sistema inmune (Boonstra et al., 2001; Jolles et al., 2008), pero dadas circunstancias

idénticas de historia de vida, es razonable asumir que un buen estado de salud prepara a un

individuo de mejor manera para combatir y/o limitar una infección (Beldomenico y Begon,

2010).

Patógenos endémicos relativamente benignos, al acaparar recursos de sus hospederos e

inducir en éstos una respuesta inmune nutricionalmente demandante, parecen capaces de

ejercer un efecto negativo en la reproducción y/o la supervivencia, como ha sido

demostrado para el virus cowpox en su especie hospedera reservorio (Microtus agrestis)

(Burthe et al., 2008). Al mismo tiempo, las dinámicas de infección pueden depender de la

vulnerabilidad del hospedero, ya que una condición deteriorada es factible que predisponga

a los individuos a enfermedades infecciosas y parasitarias (Nelson y Demas, 1996). Estas

nociones resultan en un claro potencial para el sinergismo entre infección y condición: una

condición empobrecida predispone a infecciones, las que a su vez empeoran aún más la

condición, y así sucesivamente. Datos obtenidos de poblaciones de roedores silvestres

avalan la noción que un sinergismo entre infección y condición generan un círculo vicioso

(Beldomenico et al., 2008a). Este círculo vicioso sugiere que la interacción entre los

8

patógenos y la inmunocompetencia es más importante para la dinámica de las poblaciones

de fauna que lo que se ha apreciado hasta el presente, y que el estudio del estado

inmunitario de los hospederos es de relevancia para comprender las dinámicas de infección.

Sin embargo, los estudios que han intentado medir estado sanitario en poblaciones

silvestres y relacionarlos con su demografía son escasos, y generalmente han centrado su

interés en índices genéricos de salud (Smits, 2007; Beldomenico et al., 2008b).

II.2. Ecoinmunología

La ecoinmunologia es una disciplina que surge recientemente, con amplias perspectivas

empíricas y conceptuales en lo que concierne a la interacción entre la fisiología y la

ecología en el contexto de evolución de enfermedades y la respuesta inmune de la

población hospedera (Schulenburg, et al., 2009).

Esta disciplina ha comenzado a abordar la complejidad de la respuesta inmune en un

contexto ecológico y evolutivo. Tanto para los ecologistas como para los inmunólogos la

respuesta inmune es el resultado de una variedad de factores tales como: (a) la variabilidad

genética (alelos de MHC), (b) la historia de la infección (memoria inmunológica,

infecciones actuales), (c) el estado fisiológico (sexo, edad, estado reproductivo y la

historia), (d) la disponibilidad de recursos alimenticios, (e) las condiciones abióticas (la

estacionalidad y la temperatura) y (f) la historia co evolutiva entre el hospedero y el

patógeno (Pederson y Babayan., 2011).

Se sabe que las poblaciones silvestres son exogámicos y por lo tanto tienen un alto

grado de variación genética que probablemente afectan a los componentes que conforman

9

un respuesta inmune protectora (Abolins et al., 2011). Estas poblaciones están compuestas por

individuos de diferentes edades, sexo, madurez sexual, estado reproductivo (gravidez, lactancia),

además de presentar diferentes densidades entre comunidades. Todas estas variaciones, tanto

individualmente como a escala poblacional, influirán en la susceptibilidad del hospedero frente a

parásitos, afectando el inicio de la respuesta inmune, la memoria inmunológica y, como

consecuencia de ello, incidiendo en la condición física del mismo. A su vez, la supervivencia y la

reproducción afectarán la densidad de la población y la futura transmisión de patógenos

(Martin et al., 2008; Lazzaro y Little, 2009).

El objetivo de esta disciplina es crear beneficios sinérgicos entre la inmunología, la

ecología, la evolución y la salud de los individuos de una población.

II.3. (carpincho)

Los roedores son el grupo más grande de especies “reservorio” que involucran

problemas para la salud pública (Mills y Childs, 1998; Simpson, 2002). Por otra parte,

factores ambientales pueden actuar como fuente de estrés, lo cual afecta negativamente el

sistema inmune de los mamíferos, particularmente roedores (Geller y Christian, 1982;

Barnard et al.,, 1996). De este modo, la dinámica de un patógeno determinado en

poblaciones de roedores puede reflejar una dinámica subyacente en la inmunocompetencia

del hospedero.

Algunos roedores son importantes como recurso faunístico. El carpincho es el roedor

más grande del mundo, siendo autóctono de la Argentina y otros países de Sudamérica.

Vive en grupos formados por un macho dominante, varias hembras jóvenes y uno o más

machos subordinados. Se encuentra ampliamente distribuido en las zonas de llanos y

10

humedales, habitando desde Panamá hasta el sur de la provincia de Buenos Aires,

exceptuando Chile (Allekotte, 2003; Bolkovic y Ramadori, 2006). Es una especie

emblemática de nuestra región con gran potencial para su uso como recurso, ya que

representa una de las especies de fauna más utilizadas en el país y constituye una fuente

adicional de proteínas así como un ingreso económico de importancia para muchas

comunidades locales (Quintana et al., 1992, Bolkovic y Ramadori., 2006). En esta región,

el hábitat del carpincho está siendo invadido en gran medida por el ganado bovino (Belloso,

2007). Se ha observado que los carpinchos cambian sus patrones forrajeros cuando

comparten su hábitat con especies de herbívoros domésticos (Quintana et al., 2002). Estos

cambios, sumados a la disminución de territorio y la presión de caza, entre otros factores,

podrían estar influyendo sobre su estado sanitario, contribuyendo de este modo a la

declinación de la especie.

Los carpinchos son hospederos de una amplia comunidad de parásitos, entre ellos

varios helmintos y protozoos específicos que muestran una alta prevalencia y ubicuidad

(Freyre et al., 1979; Salas y Herrera, 2004; Vieira et al., 2006; Albuquerque et al., 2008;

Sinkoc et al., 2009; Eberhardt, 2013).

Estudios en la dinámica poblacional en carpinchos mostraron que la densidad de la

población se veía afectada por la ganancia de peso, la natalidad, la supervivencia de los

recién nacidos y la mortalidad de los adultos (Ojasti y Sosa Burgos 1985), pero la

participación de los patógenos y la inmunocompetencia de las poblaciones en esta

dinámica, no han sido aun investigados.

11

II.4. Marcadores de inmunocompetencia evaluados

II.4.1 Anticuerpos aturales (Ac )

Para estudiar en detalle las dinámicas de infección es imprescindible contar con

marcadores adecuados de inmunocompetencia. Un desafío para el estudio de dinámicas de

inmunidad en poblaciones silvestres es el de discernir si diferentes niveles de marcadores

inmunológicos resultan por una exposición diferencial a patógenos, o bien por una

capacidad diferencial de respuesta. Por ejemplo, un individuo silvestre puede tener niveles

elevados de un marcador de inmunocompetencia determinado por tener una alta capacidad

de respuesta, o bien por haber estado muy expuesto a patógenos, o una combinación de

ambos. Es necesario identificar marcadores que tengan el menor grado de ambigüedad

posible. Los AcN son un candidato a tener en cuenta (Schmid Hempe y Ebert, 2003;

Carrol y Prodeus, 1998), y es necesario llevar adelante investigaciones para evaluar su

potencial en estudios ecoepidemiológicos. Los AcN son moléculas producidas, en

mamíferos, por células B 1 CD5+ presentes en fluidos de cavidad peritoneal y pleural

(Murphy, 2012). Estos AcN son únicos entre las inmunoglobulinas, su síntesis no requiere

exposición previa a un antígeno (Ag) en particular; son codificados por genoma de línea

germinal y no sufren hipermutación somática ni recombinación genética durante la

ontogénesis (Casali y Schettino, 1996). Ha sido demostrada la presencia de AcN en

animales sin experiencia inmunológica, incluyendo aquellos desarrollados en ambientes

libres de patógenos (Pereira et al., 1986). Estos AcN reconocen, con afinidades diferentes,

una amplia variedad de antígenos tanto solubles como particulados. Entre estos últimos se

encuentran aquellos que forman parte de la membrana de glóbulos rojos y bacterias

(Ochsenbein et al., 1999). Las células B 1 crean anticuerpos, en su mayoría IgM, contra

12

oligosacaridos, los cuales se comportan como antígenos T independiente. Sin embargo,

esta respuesta podría aumentar mediante la colaboración de células T (Murphy, 2012)

Una amplia variedad de funciones ha sido propuesta para los AcN. Estas moléculas

neutralizan bacterias y virus presentes en circulación, protegiendo al animal de infecciones

virales y bacteriales, como por ejemplo el virus de la estomatitis vesicular y Streptococcus

pneumoniae (Ochsenbein et al., 1999). Además, son capaces de opsonizar patógenos

invasores e iniciar la cascada del sistema complemento, favoreciendo la destrucción del

microorganismo. La actividad hemolítica de los AcN asociada al sistema complemento ha

sido demostrada en animales domésticos, entre ellos patos, pollos, pavos (Barman y Das,

1997; Ellis et al., 1989) y en vertebrados silvestres, tanto superiores como inferiores

(Vestey y Lochmiller, 1994). Por otra parte, los AcN y el sistema complemento favorecen

el reclutamiento y permanencia de Ag en órganos linfáticos primarios estimulando la

repuesta tanto a antígenos T dependientes como T independientes. La interacción de AcN y

complemento es un importante nexo entre la inmunidad innata y la adaptativa (Carroll y

Prodeus, 1998; Oschsenbein y Zinkernagel, 2000).

Los AcN cumplirían, además, una importante función inmunorregulatoria (Boes, 2000)

por modular la reactividad de linfocitos T (LT) y linfocitos B (LB) hacia Ag propios.

Asimismo, jugarían un rol fisiológico fundamental desde el punto de vista de la evolución.

Ha sido propuesto que los AcN estarían involucrados en la supervivencia de las especies

por participar activamente en la resistencia temprana a la infección (Oschsenbein y

Zinkernagel, 2000) (Figura 1).

13

Dado que los AcN confieren inmunidad humoral inespecífica independiente de la

estimulación antigénica y son estables en el tiempo, tienen el potencial de ser buenos

indicadores de la inmunocompetencia humoral de animales silvestres. Sin embargo, rara

vez se han evaluado en estudios de ecología de enfermedades. Recientemente han sido

empleados como indicadores de inmunidad humoral inespecífica en aves silvestres

(Whiteman et al., 2006; Townsend et al., 2010) y reptiles (Sandmeier et al., 2012) pero

son escasos los trabajos en mamíferos silvestres (Gilot Fromont et al., 2012).

Figura 1: Respuesta inmune del hospedador frente a un desafío antigénico. Gran parte del antígeno se elimina tempranamente mediante mecanismos de la inmunidad innata mientras que a la inmunidad adaptativa le lleva días para desarrollarse plenamente. El nexo entre ambas son los componentes del compartimiento de “memoria natural” (células B1, NKT, ɣδ), que asegura la eliminación óptima y temprana del antígeno (Martin y Kearney, 2001)

14

II.4.2 Citocinas

Otro componente importante del sistema inmune son las citocinas. Estas comprenden un

grupo heterogéneo de proteínas de bajo peso molecular, las cuales son producidas y

secretadas no sólo por leucocitos, sino también por células epiteliales, endoteliales y

parenquimatosas de diferentes órganos, entre otras. Estas citocinas, a través de la

interacción con sus receptores específicos, median acciones tanto del sistema inmune innato

como adaptativo, en respuesta a procesos infecciosos, entre otros (Kourilsky y Truffa

Bachi, 2001). Las citoquinas son particularmente importantes en la polarización y

amplificación de la respuesta inmune (Germain, 2001). Asimismo, la magnitud y tipo de

respuesta de citocinas producidas frente a un proceso infeccioso, lo son también por influir

en la susceptibilidad e infectividad de enfermedades. La susceptibilidad del hospedero

hacia un parásito determinado se verá afectada por las respuestas de las citocinas que están

en curso en el momento de la exposición, como ser la respuesta a infecciones pre

existentes. La infectividad, sin embargo, puede depender de la respuesta dinámica de

citocinas en el transcurso de la coinfección (Graham el al., 2007).

La inflamación es uno de los principales mecanismos de la respuesta inmune innata, la

cual puede llevarse a cabo en forma localizada o sistémica en respuesta a diferentes

microorganismos: virus, bacterias, hongos, protozoos y aún macroparásitos, así como a

otros antígenos. Este proceso, que ocurre rápidamente luego del ingreso del patógeno, es

uno de los primeros mecanismos puesto en marcha en el individuo que intentan eliminar al

agente causal. Sin embargo, si esta respuesta no es adecuadamente sincronizada y regulada

puede conducir a daño persistente con destrucción de tejido (Natha, 2002).

15

A nivel molecular, la respuesta inmune inflamatoria es iniciada principalmente por

receptores de reconocimiento de patrones (RRP) y citocinas (Medzhitov, 2008). Los RRP

es una familia de receptores, entre los que se incluyen: receptores tipo Toll (TLR), tipo

NOD (NLR), tipo RIG I (RLR), de lectina de tipo C (CLR) y receptores depuradores; todos

ellos reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y/o señales

indicativas de daño tisular (Trevani y Geffner, 2011a). Muchas de las interacciones entre

los RRP y los PAMP conduce a la activación de vías de señalización, que determinan en

última instancia, la activación de factores de transcripción (NF κB y factor regulador de

interferón) promoviendo la expresión de genes que codifican citocinas, quemoquinas,

receptores celulares y moléculas capaces de mediar una reacción inflamatoria (Jackson et

al., 2011).

Entre las citocinas con acciones pro inflamatorias se destacan interleuquina 1β (IL 1β) y

el factor de necrosis tumoral α (TNF α). Se trata de citocinas pleiotrópicas que juegan un

rol fundamental en respuestas locales, como activación linfocitaria y del endotelio vascular,

necrosis y apoptosis, y en respuestas sistémicas, como aumento de proteínas de fase aguda,

movilización de proteínas y grasas, pudiendo producirse shock séptico (Rahman y

McFadden, 2006; Jackson et al., 2011). La IL 10, junto al factor de crecimiento

transformante β (TGF β), ejercen funciones moduladoras de las respuestas inflamatorias:

inhiben la proliferación linfocítica así como el incremento de expresión de moléculas clase

II del complejo mayor de histocompatibilidad y moléculas coestimuladoras, además de

inhibir los efectos mediados por IL 1β y TNF α. De este modo, regulan la respuesta inmune

16

y evitan efectos nocivos en el individuo frente al proceso infeccioso (Nathan, 2002;

Graham, 2007).

II.4.2.1. Citocinas pro inflamatorias

II.4.2.1.1. IL 1 β

La IL 1β es una molécula monomérica de bajo peso molecular formada por 153

aminoácidos La IL 1β es una citocina con importantes funciones pro inflamatorias, es

producida principalmente por macrófagos y células epiteliales y se encuentra dentro de

estas células de forma inactiva. En células estresadas, tales como aquellas expuestas a una

infección, se forma una estructura multiproteica llamada inflamasoma, que junto a la

caspasa 1, son responsables de la conversión del precursor de IL 1β en citocina activa

(Dinarello, 2011).

La IL 1β como el TNFα y la IL 6 poseen un amplio espectro de actividades biológicas.

Estas citocinas activan a los hepatocitos aumentando la síntesis de proteínas de fase aguda y

al endotelio de la medula ósea para la liberación de neutrófilos. Asimismo son pirógenos

endónenos por inducir la síntesis de prostaglandina E2, la cual actúa sobre el hipotálamo.

El aumento de la temperatura corporal disminuye la replicación bacteriana y viral como así

también aumentan la presentación antigénica y activación de linfocitos T favoreciendo el

desarrollo de la respuesta inmune adaptativa. (Ceciliani, et al., 2002).

.La IL 1β en presencia de IL 6 y TGF β sería inductora de un perfil inmune T colaborador

17 (Th17) en modelos murinos (se desconoce el efecto inductor TGF β en otras especies),

17

siendo la IL 23 la responsable del mantenimiento de esta respuesta (Weaver et al., 2006;

Dong, 2008; Van de Veerdonk et al., 2009).

Esta citocina también sería responsable de la producción de IL 17 por parte de las

células asesinas NKT (de sus siglas en inglés: natural killer T) (Moreira et al, 2011), y de

IL 22 por células NK (Hughes et al., 2010). Ambas células con importantes funciones en

mediar respuestas anti infecciosas.

II.4.2.1.2. T F El TNF es una proteína trimérica formada por 157 aminoácidos producida principalmente

por macrófagos, células NK y células T. Los efectos de TNF están mediados por cualquiera

de los dos receptores de TNF: TNFR I el cual se expresa en una amplia variedad de

células, incluyendo células endoteliales y macrófagos; mientras que TNFR II es expresado,

en gran medida, por linfocitos (Svanborg et al., 1999). El TNF actúa sobre las células

endoteliales estimulando la expresión de moléculas de adhesión y ayuda a la extravasación

de células como monocitos y neutrófilos en el sitio de infección. Otra acción importante

de TNF consiste en estimular a las células endoteliales, de pequeños vasos, para que las

mismas expresen proteínas activadoras de la coagulación sanguínea ocluyendo el flujo

sanguíneo. Esto puede ser particularmente importante en la prevención de la diseminación

de patógenos hacia otros órganos y mantener, de esta manera, la infección en forma

localizada. Sin embargo, una vez que la infección se ha diseminado al torrente sanguíneo

(sepsis), la liberación de TNF a partir de los macrófagos de bazo, hígado y otros órganos.

puede convertirse en nociva. Esta liberación sistémica de TNF provoca vasodilatación con

18

la consecuente pérdida de presión arterial y aumento de la permeabilidad vascular

conduciendo al shock séptico y coagulación intravascular diseminada (Dellinger, 2003).

Esta citocina también tiene un papel importante en la estimulación de la migración de

células dendríticas del tejido periférico a nódulos linfáticos, y en su proceso de maduración

como células presentadoras de antígeno (Ceciliani et al., 2002).

II.4.2.2. Citoquina anti inflamatoria

II.4.2.2.1. IL 10 La IL 10 es un homodímero de 160 aminoácidos secretada por una amplia variedad de

células, , tanto por células de la respuesta inmune innata: monocitos, células NKT, NK,

macrófagos, células dendríticas inmaduras; como de la respuesta inmune adaptativa:

linfocitos T colaboradores (la secreción de esta citocina se produce en procesos

inflamatorios crónicos en presencia de IL 27 por parte de perfiles Th1 y Th17 y es

constante en Th2), linfocitos T reguladores (Tr1) , y una subpoblación de linfocitos B con

funciones reguladoras (Kubo y Motomura, 2010).

La IL 10 es una de las citocinas claves en la regulación de la respuesta inflamatoria

(Berg et al., 2001). La IL 10 se identificó, originalmente, como el factor inhibidor de la

síntesis de citocinas (CSIF). Se secreta a partir de linfocitos T colaboradores tipo 2 (células

Th2) y suprime las funciones de diferenciación y efectoras de las células Th1 y Th17

(Fiorentino et al., 1989; McGeachy y Cua, 2008). Su función inhibitoria se explica por su

capacidad para suprimir la producción de citocinas pro inflamatorias tales como la IL 12 y

TNF a partir de macrófagos, células dendríticas. Disminuye la expresión de moléculas del

19

MHC II y moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 de las células presentadoras de

anfígenos profesionales (APCs), con la subsecuente inhibición de la activación de células T

(Fiorentino et al., 1991; Berg et al., 2001).Tanto IL 10 como el factor de crecimiento

transformante (TGF), inhiben la producción de IL 1, TNFα, IL 6 y quimocinas

inflamatorias producida por macrófagos y otros tipos celulares presentes en el entorno

inflamatorio (Abbas et al., 2012).

20

CAPITULO III MATERIALES Y METODOS

La especie animal utilizada en el presente trabajo fué Hydrochoerus hydrochaeris,

comúnmente conocida como carpincho. Se trata de roedores gregarios pertenecientes al

suborden Histricognatha (roedores cavimorfos). El peso adulto es de 60 Kg

aproximadamente y lo alcanza después de los 2 años de vida. El rango de vida es de 10 a 14

años (Herrera y Macdonald, 1984). Las hembras alcanzan la pubertad fisiológica entre los

12 y 18 meses de edad.

III.1. Estudio experimental

El experimento fue llevado a cabo con 26 hembras jóvenes, provenientes del criadero

Ayuí (Santo Tomé, Corrientes), donde se encontraban en semicautiverio y no recibían

ningún tratamiento medicamentoso.

Para evitar variaciones relacionadas al sexo y a la edad se utilizaron hembras de 6 a 12

meses de edad al iniciar el experimento.

Los individuos fueron distribuidos en seis grupos de 4 o 5 individuos cada uno, en

recintos acondicionados para tal fin. Éstos consistieron de un refugio de 3,5 x 7 m cada

uno, con piso de tierra; la mitad de su superficie se encontraba cubierta por media sombra y

el tejido que delimitaba los ambientes consistía en arpillera blanca (Figura 2). El estudio

experimental tuvo asiento en la estación experimental “Granja La Esmeralda”, Santa Fe

Capital, dependiente del Ministerio de la Producción de la Provincia de Santa Fe.

21

El número de individuos usados en el experimento fue intencionalmente bajo por dos

razones, por un lado para cumplir con las recomendaciones de “reemplazo, refinamiento y”

reducción” postuladas por Russell y Burch (Russell y Burch, 1959) en lo que concierne a

bienestar animal. Por otro lado, se evaluaron efectos no sutiles, es decir, aquellos de

magnitud suficiente para ser detectados con el poder estadístico disponible.

Figura 2: Diagrama de la distribución de los recintos para el experimento. Las paredes de los recintos estaban cubiertas con tela de tipo rafin para evitar el contacto visual entre los grupos de carpinchos

22

Previo a la distribución en grupos, se realizaron comparaciones de base con respecto a

los pesos y cargas parasitarias. Los individuos fueron asignados a sus respectivos recintos

al azar por un método de aleatorización estratificado, según masa corporal.

Los individuos tuvieron disponible agua ad libitum a lo largo de todo el experimento.

Diariamente los animales eran inspeccionados por veterinarios para asegurarse de la

ausencia de signos clínicos de enfermedad. El único tratamiento médico administrado

durante el experimento fue el uso de insecticida (Bactrobet Plata, laboratorio König) en

aerosol, el cual fue aplicado sobre heridas para prevenir miasis.

III.1.1. Aclimatación y comparaciones de base

Antes de que fueran establecidos los tratamientos, los animales permanecieron en su

nuevo ambiente durante 4 semanas con el fin de ser aclimatados. Durante dicho período

fueron alimentados ad libitum y no estuvieron sujetos a capturas ni restricción física.

Este período de adaptación fue implementado para asegurase homogeneidad entre cada

grupo de tratamiento al comienzo del experimento. A tal fin, se tuvo en cuenta el peso

corporal, índice de masa corporal, huevos de parásitos en materia fecal y conteo de

ooquistes. Estas comparaciones fueron realizadas usando pruebas paramétricas (ANOVA) y

no paramétricas (Kruskal Wallis), dependiendo de la distribución de la variable respectiva.

Para todas las comparaciones basales, α fue establecida en 0,1. Una prueba estadísticamente

significativa (P < 0,1) indicaba que la aleatorización debía repetirse.

En esta instancia, la alimentación de todos los animales consistió en un 60% de alfalfa y

avena fresca, y un 40% de fardo de moha o heno de maíz, suplementando con arrocín y

23

afrecho de arroz; fraccionado en 2 comidas diarias. De esta manera cada individuo recibió

diariamente 500gr de alfalfa y avena fresca, 300 gr de fardo de moha o heno de maíz más

el suplemento con 800 gr de arrocin o afrecho de arroz. La misma fue suministrada sobre el

suelo en raciones individuales.

III.1.2. Tratamientos

Los individuos de cada recinto recibieron uno de los tres siguientes tratamientos:

III.1.2.1. Tratamiento I: “Alimentación restringida o estrés nutricional”: los animales de 2

de los recintos recibieron alimentación restringida la cual consistió en un 50 % menos de

afrechillo de arroz (400gr/animal) y 40% menos de fardo y alfalfa fresca (150 y

300gr/animal respectivamente) en comparación con la alimentación ad libitum que

recibieron durante el periodo de aclimatación. Las dietas de restricción pudieron lograrse

evitando la desnutrición con un 20 a 60% de reducción en la media del consumo ilimitado,

incluyendo una reducción balanceada en calorías, proteínas, vitaminas y minerales (Yu,

1996; Weindruch y Walford, 1998).

24

III.1.2.2. Tratamiento II: “Manipulación o estrés psico físico”: en otros dos de los

recintos los animales fueron restringidos físicamente tres veces por semana (días lunes,

miércoles y viernes), para ello fueron capturados utilizando una red y restringidos

sosteniendo sus extremidades por un lapso de 10 minutos. La alimentación de este grupo

continuó siendo la misma que la del período de aclimatación.

III.1.2.3. Tratamiento III: “Control": los animales de este grupo no fueron sometidos a

ninguno de los tratamientos descriptos anteriormente. La alimentación fue la misma que

durante el período de aclimatación.

Todos los tratamientos fueron implementados durante 12 semanas consecutivas y

comenzaron inmediatamente después de finalizado el período de aclimatación. La densidad

de carpinchos fue representativa en cada uno de los tratamientos.

Después de las 12 semanas de tratamiento, todos los animales fueron anestesiados con

10mg/kg de peso corporal de ketamina (Plano3, Zoovet) y 0.5mg/kg de peso corporal de

xilazina (Kensol, Köning) y eutanaciados por exanguinación inmediatamente después de

tomar una muestra de sangre por punción de la vena cava, obtención del peso corporal y

medidas morfométricas. Posteriormente, los animales fueron sometidos a necropsia para

obtener muestras de diferentes órganos.

III.2. Toma de muestras

Se evaluaron los efectos de cada uno de los tratamientos sobre parámetros asociados con

el sistema inmune innato y salud general de los individuos a partir de muestras de sangre

entera y bazo. Para ello, una vez que los animales fueron anestesiados, se tomaron 15 20 ml

25

de sangre entera a partir de la vena cava. Una fracción de la misma fue recolectada en

tubos de polipropileno (DeltaLab, Argentina) sin anticoagulante y otra con adicionado de

EDTA 10%.(SB, Argentina) Estas últimas fueron refrigeradas y procesadas dentro de las 8

horas posteriores a la extracción. Aquellas sin anticoagulante fueron centrifugadas y el

suero obtenido fue congelado a 20°C hasta su utilización.

En el momento de la necropsia, se separó el bazo, el cual fue pesado para calcular el

índice de masa esplénica (peso del órgano/ peso inicial); una fracción del órgano fue

conservada a 80 °C para su utilización en técnicas de biología molecular. Asimismo se

separó la glándula adrenal la cual fue fijada en formol al 10% en solución amortiguadora,

para su posterior examen histopatológico.

III.3. Valoración del estrés

Para evaluar si los tratamientos indujeron estrés sobre los carpinchos, se comparó la

proporción de la corteza adrenal correspondiente a la porción fascicular (parte de la

glándula que sintetizan glucocorticoides) que es estimulada en respuesta al estrés (Jubb et

al., 1990). Las glándulas adrenales se fijaron en formol bufferado al 10% y luego

deshidratados en diferentes graduaciones de etanol, 70°, 96°, 100°, por dos horas en cada

uno de ellos; posteriormente se aclaró la muestra en xilol (disolvente de parafina), y luego

se embebieron en parafina. Se cortaron secciones seriales de 5 m utilizando un micrótomo

(Microtom HM315R), las cuales fueron montados en portaobjetos y teñidos con

hematoxilina y eosina (Biopur, Argentina). A continuación, cada sección fue examinada

26

bajo microscopio de luz con un aumento de 1000X y la media de porción fascicular fue

realizada utilizando un ocular milimetrado.

III.4. Valoración de parámetros de salud generales

III.4.1 Valoración del esfuerzo somático

Antes y después del experimento todos los individuos fueron pesados (peso inicial; peso

final, respectivamente) en una balanza mecánica (Macro Line Spring Scale, precisión 0.2

kg). La medida morfométrica usada en el estudio fue largo total final.

Los parámetros de esfuerzo somático utilizados fueron: (a) Ganancia de peso (peso

inicial – peso final); (b) Índice de masa corporal (peso final/largo total final); (c) Condición

corporal. Este último parámetro fue estimado por palpación del tejido adiposo y grosor del

músculo ubicado sobre las vértebras torácicas y pelvis (longissimus dorsis) medidos

mediante regla de precisión de 1mm. De esta manera se estableció un score con una escala

del 1 al 5 con el que fue puntuado cada animal (Burthe et al., 2006)

III.4.2. Evaluación de los parámetros hematológicos

A partir de las muestras con anticoagulante se realizó recuento total de glóbulos rojos

(GR) y recuento total y diferencial de glóbulos blancos (GB), lo que nos permitió evaluar

capacidad aeróbica y comenzar con la evaluación del estado inmune del individuo,

respectivamente (Beldomenico et al., 2008). La sangre entera fue diluida en solución salina

1:10. A partir de esta suspensión se obtuvieron dos diluciones finales: 1:20 en solución de

Türk (3% de ácido acético 0,5% azul de metileno); y 1:200 en solución salina, utilizadas

27

para el recuento de GR y GB, respectivamente. Para tal fin se utilizaron cámaras de

Neubauer (Boeco, Germany)(Arouca et al. 2000; Madella et al., 2006).

El recuento diferencial de GB se realizó a partir de extendidos sanguíneos (frotis), los

cuales fueron secados al aire, fijados durante 6 minutos en May Grunwald y teñidos con

Giemsa 30 min (Biopur, Argentina). El recuento se realizó sobre un total de 200 GB.

III.4.3. Determinación de proteínas totales y albúmina sérica

Se determinó la concentración de proteínas totales (PPT), albúmina (A) y globulina

(Gb) en muestras séricas provenientes de cada uno de los individuos del experimento. A

partir de estos datos se obtuvo la relación Albúmina/Globulinas totales. Las variaciones en

la relación A/Gb pueden indicar la subproducción (alta relación) o sobreproducción (baja

proporción) de anticuerpos, o subproducción de la albúmina (baja proporción) (Latimer et

al., 2003). Para tal fin, se utilizó un kit comercial colorimétrico (Proti2, Wiener lab, de

Rosario, Argentina) y se procedió según instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción

para la determinación de proteínas totales fue leída a 540nm y para la de albúmina a 625

nm. En ambos casos se utilizó un espectrofotómetro (Labnet, EEUU). En forma paralela se

realizó un blanco de muestra y un patrón de proteínas totales o albúmina, según

corresponda.

28

III.5. Valoración del sistema inmune innato

III.5.1. Determinación de anticuerpos naturales (Ac )

La determinación de los títulos de AcN se llevó a cabo mediante un ensayo de

hemoaglutinación según describe Matson (Matson et al., 2005) con algunas

modificaciones.

Los AcN tienen una alta reacción cruzada y ligan con baja afinidad a estructuras de

carbohidratos compartidos por una gran variedad de patógenos y células de mamíferos

(Murphy, 2012). Por este motivo fue necesario obtener una suspensión de GR de especies

que expresaran altos niveles de α –N acetil galactosamina (Cotter et al., 2005) tales como

la ovina o cunicola.

III.5.1.1. Suspensión de glóbulos rojos:

Se extrajeron semanalmente 3 ml de sangre entera, tanto de ovino como de conejo, los

cuales se anticoagularon con 40 l de EDTA. La toma de muestra se realizó siempre a

partir del mismo individuo, tanto de ovino que pertenecía a la Escuela de Agricultura,

Ganadería y Granja de Esperanza, como del conejo que se encontraba alojado en el Centro

de Experimentaciones Biológicas y Bioterio (FCV UNL). Las muestras fueron tomadas por

personal idóneo.

La sangre entera fue centrifugada a 4000 rpm durante 5 min, se separó el plasma de las

células y se procedió al lavado de los GR 3 veces con solución buffer fosfato 1X (PBS

1X). La concentración final de GR fue ajustada al 1% en PBS 1X. La suspensión de GR

29

fue realizada en PBS 1X y utilizada en un período no mayor a 24 horas y almacenada a

4°C.

III.5.1.2. Ensayos de hemoaglutinación:

Se utilizaron microplacas de 96 pocillos con fondo en U (Corning Costar). En los

pocillos 1 al 11 se colocaron 25 l de plasma de conejo al 1% en PBS 1X. En la primera

columna fueron colocados 25 l de las muestra de suero o plasma., a continuación se

procedió a realizar diluciones seriadas al medio, transfiriendo 25 l con microdiluidor del

primer pocillo al consecutivo hasta el pocillo 11 de cada fila, dejando el pocillo número 12

como control negativo (únicamente plasma de conejo al 1% en PBS 1X). Una vez

realizadas las diluciones correspondientes se agregaron en todos los pocillos 25 l de la

suspensión de GR de conejo/ovino homogeneizada. Luego se agitaron las placas

mecánicamente por algunos segundos y se incubaron por el plazo de 2 horas a temperatura

ambiente. La aglutinación resultó de la acción de los AcN. El título fue registrado como

log2 de la última dilución en la que se evidenció claramente aglutinación.

III.5.2. Determinación de citocinas

En esta instancia se evaluaron los niveles de expresión de los ARN mensajeros

(ARNm) de las citocinas TNF α, IL 1β e IL 10 mediante técnica de PCR en tiempo real, a

partir de muestras de tejido linfoide (bazo) proveniente de cada uno de los animales de

experimentación.

30

III.5.2.1. Extracción de AR :

Las muestras de bazo fueron homogenizados directamente en reactivo Trizol (Life

Technology, Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente: 0,50 gr de

tejido fueron disgregados y homogeneizados en 1000 l de Trizol dejando reposar a

temperatura ambiente durante 5 min. A continuación se agregaron 200 l de cloroformo

(Merck), y luego de agitar vigorosamente durante 15 segundos se incubó durante 3 min a

temperatura ambiente (TA). Posteriormente se centrifugaron las muestras a 12000g durante

15 min a 4°C (Thermo Scientific), la fase acuosa fue transferida a un tubo eppendorf estéril,

al cual se le añadieron 500 l de isopropanol y, luego de invertir hasta mezclar las fases, se

incubó durante 30 min a 4°C. Seguidamente fueron centrifugados a 12000g durante 20

min. a 4°C, el sobrenadante fue removido con pipeta y el pellet lavado con 800 l de etanol

al 75%. Luego de centrifugar a 7500g durante 5 min a 4°C y descartar el sobrenadante, el

pellet se dejó secar por 20 min. y fue resuspendido en 40 l de agua ultra pura estéril (F. J.

Llamas S.A., Argentina). Para mejorar la resuspensión, las muestras se incubaron a 55 60°C

durante 10 min. homogeneizando cada 2 min.

La concentración y pureza de ARN total de cada muestra fue evaluada en un

espectrofotómetro SPECTROstar Nano y su programa de análisis MARS Data Analysis

Software (BMG Labtech, Germany). El ARN obtenido se mantuvo a 80°C hasta su

utilización.

31

III.5.2.2. Transcripción reversa

Para la obtención del ADN copia (ADNc), en primera instancia, se mezclaron 2 g de

ARN de cada muestra con 1 g de cebadores al azar (random primers, Promega) llevando a

un volumen de 10 l con agua tratada con dietil pirocorbonato (DEPC) (según instrucciones

del fabricante). Posteriormente, las muestras se colocaron en baño a 70°C durante 5 min,

con el fin de abrir las estructuras secundarias y permitir el pegado de los primers,

inmediatamente se colocaron en hielo. A continuación se procedió con la segunda etapa de

la transcripción reversa en la cual, cada muestra fue incubada con una mezcla de la

siguiente composición: mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) (Genbiotech)

en una concentración final de 20mM total, 25U de inhibidor de ribonucleasas (RNaseOUT,

Invitrogen), 1 U de transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M

MLV, Promega), con su buffer 1X y agua ultra pura estéril en cantidad suficiente para

completar los 15 l finales. Las muestras, luego de ser incubadas por 60 minutos a 37°C, se

conservaron a 20ºC hasta su utilización.

III.5.2.3 Diseño de oligonucleótidos

Para la confección de los oligonucleótidos, se buscaron en primera instancia las

secuencias de ARN de cada citocina de la especie en estudio: Hydrochoerus hydrocheari.

Al no encontrarse indexadas en la bases de datos, se buscaron las especies

filogenéticamente mas relacionadas con el carpincho (Honeycutt, 2009) y se verificó que la

secuencia de dichas citocinas se encontraran indexadas en la base de datos de GenBank

(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). A partir de aquellas secuencias de ARN de las especies

32

encontradas (Cavia porcellus, Rattus norvergicus, Peromyscus maniculatus, Mus musculus,

Microtus agrestes, Mesocricetus auratus), se procedió a la realización de alineamientos

múltiples; para tal fin se utilizó el programa VectorNTI versión 6.0. Luego de seleccionar

regiones conservadas entre las especies analizadas, se procedió al diseño de los cebadores

usando como secuencia molde estas regiones de la especie Cavia porcellus, la cual es la

especie filogenéticamente más próxima al carpincho (Figura 3). Se utilizaron los programas

informáticos de libre acceso: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) y The Primer Express® Software v3.0.1 para la

confección de los mismos. En caso de que las regiones, correspondientes a los

oligonucleótidos, no hayan presentado 100% homología entre las especies analizadas, se

procedió a generar oligonucleótidos degenerados.

Figura 3: Alineamientos múltiples: alineamientos múltiples para el diseño de oligonucleótidos de la citocina IL 10 utilizando el programa VectorNTI versión 6.0.

33

III.5.2.4. Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés:

) en tiempo real

La cuantificación relativa de la expresión de los genes codificantes de cada una de las

citocinas evaluadas, se realizó mediante PCR en tiempo real. En todos los casos se trabajó

con un volumen final de 20 l. La composición de la mezcla de reacción consistió en ADN

polimerasa (Phire Hot Star, Thermo) (0,1 l), y su buffer en concentración final 1X,

dNTPs 0,8mM total final (100mM total, Life Technologies), SYBR Green 1X final

(Cambrex Corp.) en concentraciones recomendadas por el fabricante. La concentración de

los cebadores específicos (Life Technologies) fue establecida empíricamente. La

concentración de ADNc que se utilizó fue obtenida a partir de la curva de eficiencia para

cada molécula. Por último se llevó a un volumen final de 20 l con agua ultra pura estéril.

Los controles negativos se realizaron reemplazando el volumen de ADNc por agua ultra

pura estéril.

Todas las reacciones fueron llevadas a cabo en un termociclador StepOne™ Real Time

PCR System (Applied Biosystems). La pureza de los productos de PCR fue confirmada

mediante curvas de disociación y secuenciación. La beta actina (ACTB) fue utilizada como

gen de control interno.

III.6. Análisis estadístico

El análisis se realizó utilizando modelos lineales mixtos (LMM):

Parámetros inmunológicos (variable respuesta) ∼ Tratamiento + MCI (masa corporal

inicial) + Tratamiento * MCI; factor al azar = recinto

34

MCI y Tratamiento*MCI fueron incluidos para considerar el potencial enmascaramiento

o modificación de efecto de la masa corporal inicial de los carpinchos, respectivamente. La

significancia del término de interacción fue evaluada mediante un “Likelihood ratio test”.

“Recinto” fue incluido como un factor aleatorio para tener en cuenta la falta de

independencia de observaciones del mismo recinto (Chavez, 2010; Paterson y Lello, 2003).

Las variables respuestas, cuyas distribuciones no se aproximaban a la normal, fueron

convertidas mediante exponenciación.

Los LMM fueron realizados utilizando paquetes 1me4 (Douglas el al, 2013) y

languageR (Baayen, 2011) del software estadístico R (funciones 1mer y pvals.fnc,

respectivamente).

Se exploró la existencia de asociaciones significativas entre las citocinas y las demás

variables evaluadas mediante pruebas de correlación de Pearson.

35

CAPITULO IV – RESULTADOS

Los análisis estadísticos descriptivos de los parámetros medidos en los carpinchos se

muestran en la Tabla 1.

Parámetros de Salud

Grupos control Grupos con restricción de alimentos

Grupos Estresado Físicamente

IL IP IL IP IL IP Media (Rango) Media (Rango) Media (Rango) Media (Rango) Media (Rango) Media (Rango)

Proporción fascicular de la adrenal (%) ∗∗∗∗

73,7 (64,0 86,7) 75,6 (72,7 77,4) 76,9 (68,9 82,3) 78,8 (77,4 81,2) 82,2 (78,2 85,7) 74,8 (66,7 81,1)

Masa corporal ganada (kg) ∗∗∗∗

4,2 (3,0 5,5) 4,4 (3,0 6,5) 1.0 (0,5 3,0) 1,5 (1,5 1,5) 3,6 (1,5 6,9) 1,2 ( 1,0 4,0)

Condición corporal ∗∗∗∗

6,5 (6,0 7,0) 7,6 (7,0 8,0) 4,6 (3,0 5,5) 6,0 (6,0 6,0) 5,8 (5,5 6,5) 7,3 (6,0 8,0)

Índice de masa corporal ∗∗∗∗

0.198 (0.19,0.21) 0.262 (0.23,0.30) 0.158 (0.10,0.18) 0.240 (0.22,0.27) 0.193 (0.14,0.25) 0.246 (0.22,0.29)

GR

(1x106cel/ul) 2,97 (2,06 3,75) 3,43 (2,30 5,05) 4,09 (3,00 4,95) 3,80 (3,27 4,34) 3,49 (3,41 3,64) 4,08 (3,25 5,30)

GB

(1x103cel/µl) 6,58 (9,20 4,80) 6,58 (7,50 5,40) 6,37 (9,85 3,55) 8,5 (6,45 11,40) 6,57 (4,20 9,35) 6,59 (5,42 7,55)

L (1x103cel/µl) 3,10 (1,84 4,44) 3,24 (2,51 4,29) 3,05 (2,16 4,44) 4,20 (3,20 5,03) 3,17 (1,99 3,93) 3,20 (2,33 4,28)

(1x103cel/µl) 2,97 (2,46 3,79) 2,75 (2,08 3,73) 2,25 (1,09 3,41) 3,50 (2,59 5,24) 2,59 (1,83 4,12) 2,62 (1,97 3 ,22)

E (células/µl) ∗∗∗∗ 229 (170 391) 315 (70 716) 730 (121 2036) 702 (428 975) 580 (304 971) 477 (181 587)

B (células/µl) 124 (0 222) 158 (0 422) 151 (0 415) 72 (0 185) 120 (60 185) 128 (26 219)

M (células/µl) 126 (50 261) 108 (0 214) 168 (69 258) 83 (0 153) 101,23 (0 145) 166 (20 330)

Log2 titulos de Ac ∗∗∗∗

7,0 (6 9) 7,8 (6 9) 8, 8 (7 12) 11,3 (10 13) 6,7 (6 7) 5,8 (4 7)

Índice de masa espléndica ∗∗∗∗

3,61 (2,84 4,37) 3,07 (2,27 3,75) 2,99 (1,97 4,69) 2,81 (2,50 3,28) 3,23 (3,02 3,37) 2,74 (2,22 3,81)

PPT (g/dl) 4,26 (3,14 5.26) 5,14 (4,54 6,22) 5,10 (4,46 5,59) 5,44 (3,90 7,02) 4,72 (4,09 5,59) 5,58 (4,85 7,01)

A (g/dl) 2,81 (1,64 3,60) 2,99 ( 2,80 3,60) 3,17 (2,58 3,58) 3,15 (2,88 3,42) 3,06 (2,69 3,28) 3,20 (2,52 3,84)

A/Gb (g/dl) 2,04 (1,10 3,18) 1,46 (1,02 1,84) 1,72 (1,04 2,36) 1,78 (0,81 2,82) 1,99 (1,35 2,73) 1,59 (0,56 2,18)

Abreviaciones: IL: individuos más livianos al comienzo del experimento; IP individuos más pesados al comienzo del experimento; GR: glóbulos rojos; GB: glóbulos blancos; L:linfocitos; :neutrófilos; E: Eosinófilos; B:Basófilos; M: Monocitos; Ac : anticuerpos naturales; PPT: proteínas plasmáticas totales; A: albúmina; Gb: globulinas. (*) Indican donde se encontraron diferencias significativas respecto al grupo control.

Tabla 1. Parámetros de salud (incluidos los valores fisiológicos, los parámetros inmunológicos, el crecimiento y las medidas de condición corporal) de carpinchos en cautiverio bajo tres tratamientos diferentes. Para la confección de la tabla se utilizó la mediana de la masa corporal inicial (17 kg) como el criterio para dividir en dos clases a los carpinchos: individuos más livianos (IL) y más pesados (IP).

36

IV.1. Valoración del estrés

El análisis de la histo arquitectura de la corteza adrenal reveló que, en los individuos

que pertenecían a ambos grupos de tratamientos (estrés psico físico y estrés nutricional), la

porción fascicular era significativamente mayor con respecto a los animales del grupo

control. La diferencia entre los animales del grupo control y los individuos estresados

físicamente fue mayor en aquellos que iniciaron el experimento con menor peso

comparados con los que lo hicieron con mayor peso. Esta tendencia también se observó en

los animales sometidos a estrés nutricional pero el término de interacción no fue muy

significativo (p = 0,089).

IV.2. Valoración de parámetros de salud generales

IV.2.1. Valoración de esfuerzo somático

El efecto de ambos tratamientos fue evidente en la ganancia de peso, índice de masa

corporal y condición corporal; sin embargo fue fuertemente significativo en aquellos

individuos sometidos a alimentación restringida. Mientras que los individuos del grupo

control ganaron una media de 4,3 kg durante el experimento, los animales sometidos a

estrés nutricional y estrés psico físico solo ganaron el 25% (p=0,0005) y 50% (p=0,0178)

de ese valor respectivamente (Tabla 1 Figura 4).

IV.2.2. Evaluación de los parámetros hematológicos

No se observaron diferencias entre tratamientos en el recuento de GR, linfocitos,

neutrófilos y monocitos. La única diferencia significativa entre tratamientos fue en el

37

recuento de eosinófilos; los individuos sometidos a estrés nutricional y estrés psico físico

tuvieron un recuento de eosinófilos mayor comparados con los individuos pertenecientes al

grupo control (p=0,0113 y p=0,0494 respectivamente) (Tabla 1 Figura 4).

IV.2.3. Determinación de proteínas totales y albúmina sérica

En ninguno de los dos tratamientos se observó efectos significativos sobre PPT, A, Gb y

relación Albúmina/Globulina totales, como así tampoco en la masa esplénica; sin embargo

una tendencia casi significativa se manifestó en los animales sometidos a restricción

nutricional los cuales mostraron una masa esplénica menor que los animales del grupo

control (p=0,053) (Tabla 1).

IV.3. Valoración de parámetros del sistema inmune innato

IV.3.1. Determinación de Ac

Para la optimización de la técnica se emplearon GR de carnero y conejo donde se

obtuvieron mejores resultados con GR de conejo. Asimismo la concentración de la

suspensión de GR en PBS 1X fue establecida al 1,2% a partir del resultado de varios

ensayos. Para llevar a cabo las diluciones se estableció el agregado de plasma de conejo al

1% en PBS 1X

Los individuos del grupo de restricción alimentaria mostraron significativamente

mayores títulos de AcN que los controles y los animales estresados físicamente (p = 0,011

y p = 0,002, respectivamente). Los animales físicamente estresados mostraron una

tendencia (p = 0,051) a tener menores títulos de AcN que los controles. (Tabla 1 Figura 4)

38

IV.3.2. Determinación de citocinas

IV.3.2.1. Diseño de los Oligonucleótidos (cebadores específicos)

Los cebadores que se confeccionaron tal como se describe en el punto III.5.2.3 de

Material y Métodos. Los resultados se muestran el la Tabla 2.

Figura 4: El efecto de los tratamientos sobre la ganancia de masa corporal, condición corporal y los parámetros inmunológicos. Diagramas de caja que muestran el efecto de tres tratamientos en, (A) la ganancia de masa corporal durante el experimento; (B) el índice de la condición corporal, (C) la concentración de eosinófilos en sangre, y (D) los títulos de anticuerpos naturales. El diagrama de cajas representan la mediana (barra negra), 25 75% cuartiles (caja), 10 90% cuantiles (bigotes) y valores atípicos (puntos). (*) Indican diferencias significativas respecto al grupo control

* *

* *

39

ombre

úmero de acceso GenBank

Secuencia

Tamaño amplificado

ACTB sense

GYTCACCATGGATGACGATA

ACTB

antisense

NM_001172909

TCCCACGTAGGAGTCCTTCT

172 pb

TNF α sentido

TGGTGCCTCAGCCTCTTCTC

TNF α antisentido

NM_001173025

GCTGATCTGAGTGTGAGCGTCTG

155 pb

IL 1β sense

CGCCTGGTGTTGTCTGACCC

IL 1β antisense

NM_001172968 ATTCTTCCCCTTGAGGCCCA

150 pb

IL 10 sense

TYGGCMRGGTGAAGACTTTCT

IL 10 antisense

NM_001260485.1 TTYTCTGCCTKGGGCATCAC

157 pb

IV.3.2.2. Condiciones de la PCR

Para cada gen analizado se puso a punto el programa de ciclado y se verificó la

identidad y pureza del producto mediante curva de disociación y secuenciación. A partir de

la curva de eficiencia se obtuvo el rango dinámico de trabajo.

El programa genérico utilizado fue:

Etapa de desnaturalizacion inicial

Paso1: 3 min 98ºC

Etapa de ciclado

Paso 1: 5 seg 98ºC desnaturalizacion

Paso 2: 10 seg * ºC – hibridación (T° especifica para cada oligonucleótido, Tabla 3)

Paso 3: 20 seg 65ºC – extensión

Tabla 2: Secuencia de los cebadores específicos utilizados en la reacción de PCR. (K= T+G; R= A+G; M= A+C; Y= C+T)

40

Paso 4: 10 seg 80ºC – lectura de fluorescencia

Etapa de curva de fusión (en inglés: melting curve)

Paso 1: 15 seg 95ºC

Paso 2: 1 min 70ºC

Paso 3: gradiente 70 95ºC, lectura de fluorescencia cada 0,3ºC

Luego de cada real time PCR los resultados se obtuvieron de la siguiente manera: se

promediaron los valores de ciclo umbral (Ct; del inglés: cycle threshold) de cada muestra

correspondiente a cada citocina y del gen de control interno. Posteriormente se obtuvo Ct

de cada muestra (Ct de cada citocina – Ct del gen de control interno) y el Ct

correspondiente a la muestra de referencia (pool de muestra de todos los individuos del

experimento). A partir de estos valores se obtuvo el Ct mediante la resta del Ct

correspondiente a la muestra de referencia al Ct de cada muestra para cada una de las

citocinas evaluadas. El valor que se utilizó para los análisis estadísticos fue el 2 Ct.

Nombre Concentración de

ADNc Concentración de

cebadores específicos Temperatura de

hibridación ACTB

2 ng 0,5 M c/u 60°C

TNF α

5 ng 0,25 M c/u 61°C

IL 1β

2 ng 0,5 M c/u 60°C

IL 10

2ng 0,5 M c/u 57°C

Tabla 3: Condiciones de la PCR: datos obtenidos en forma empírica para la evaluación de la expresión de cada uno de los genes.

41

Mediante pruebas de correlación se comprobó que no hubo diferencias significativas en

los niveles de ARNm de las citoquinas estudiadas IL 1β, IL 10 y TNF (Figura 5) entre los

grupos de tratamiento (p>0.1 en todos los casos). Además, no hubo relación entre estas

moléculas y las otras variables evaluadas (histo arquitectura de la corteza adrenal, esfuerzo

somático, parámetros hematológicos, proteínas totales y albúmina sérica, determinación de

AcN).

Figura 5: Efecto de los tratamientos sobre la expresión de AR m de las citocinas evaluadas: Diagramas de caja que muestran el efecto de tres tratamientos en, (A) IL 10 (B) IL 1β, y (C) TNF. El diagrama de cajas representa la mediana (barra negra), 25 75% cuartiles (caja), 10 90% cuantiles (bigotes) y valores atípicos (puntos).

42

CAPITULO V – DISCUSIO

V.1. Sinopsis de los resultados relevantes del experimento

En el presente experimento, los resultados ecológicamente más significativos consisten

en que los animales estresados (nutricional como físicamente), han sufrido un marcado

impacto negativo en lo que refiere a ganancia de peso, índice de masa corporal y condición

corporal, más manifiesto en aquellos sometidos a estrés nutricional. Asimismo, hay un

aumento de la porción correspondiente a la corteza de la glándula adrenal, lo que indica

estrés con producción de glucocorticoides en los animales sometidos a estrés con respecto

al grupo control, siendo mas marcado en aquellos que iniciaron el experimento con menor

masa corporal.

No obstante, se observa un efecto positivo en los componentes no específicos del

sistema inmune: el recuento de eosinófilos es mayor en animales estresados con respecto a

los del grupo control. Además, los títulos de AcN son mayores en aquellos individuos del

grupo de estrés nutricional en relación a los del grupo control. En cuanto a la masa

esplénica, existe una tendencia a la disminución de tamaño en aquellos individuos

nutricionalmente estresados.

En la determinación de la expresión de ARNm de las citocinas IL 1β; IL 10 y TNFα no

existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos.

43

V.2. Estrés: masa corporal y condición corporal

Teniendo en cuenta que estos animales están en crecimiento (6 a 12 meses de edad al

inicio del experimento), la evidente disminución en la ganancia de peso y masa corporal de

los animales sometidos a estrés se explicaría con el principio de asignación dinámica de la

energía a las funciones fisiológicas (Oli, 1999). Este principio propone que: aunque los

animales ingieran una cantidad limitada de alimentos, solo asimilan parte de la energía de

esa ingesta. Luego de cubrir los costos energéticos necesarios para lograr un metabolismo

activo quedaría un “potencial excedente” (Stearns, 1992). Ese excedente es dividido en dos

importantes procesos biológicos (Hirschfield y Tinkle, 1975; Perrin y Sibly, 1993; Stearns,

1992), el esfuerzo somático (crecimiento y desarrollo), y esfuerzo reproductivo

(maduración, comportamiento reproductivo, pariciones). Hasta la madurez sexual, la

energía es asignada completamente al esfuerzo somático para permitir un rápido

crecimiento y desarrollo. Luego, el esfuerzo somático y reproductivo compiten

directamente por este “potencial excedente”. Este tipo de conflicto en la asignación de

energía es el resultado entre los rasgos de historia de vida y redistribución de la energía

(Trade off) (Stearns, 1992). Ante la ausencia de una palabra específica que defina “trade

off” en idioma español, se opta por definir el término como: intercambios entre

compartimentos/sistemas que suponen un compromiso en la disponibilidad de recursos. Por

tal motivo se reemplaza la palabra “trade off” por el vocablo “intercambio”.

Martin (Martin, 2008) define a esta redistribución de energía (“intercambio”) como la

interacción antagonista, directa o indirecta, entre dos procesos fisiológicos, lo cual (pero no

44

necesariamente), a largo plazo tiene consecuencias en la aptitud física de un organismo. En

los individuos del ensayo esta interacción estaría dada por el crecimiento y el estrés

V.3. Estrés e inversión inmunológica.

En el presente ensayo se observa que los individuos estresados están desviando parte de

su energía disponible limitada (potencial excedente), a algunos compartimentos del sistema

inmune innato, ya que poseen mayores recuentos de eosinófilos y elevados títulos de AcN

(este último sólo en los animales sometidos a estrés nutricional).

Los glucocorticoides son el producto final, efectores primarios y principales reguladores

negativos de un importante eje neuroendocrino (hipotálamo pituitaria adrenal (HPA)).

La interacción de los glucocorticoides y el sistema inmune es compleja y bidireccional.

Factores estresantes inductores de elevada concentración de glucocorticoides puede

modular la actividad inmune, sin embargo, la activación del sistema inmune derivaría en la

producción de esta hormona (Turnbull y Rivier 1996; McEwen et al., 1997). Los

glucocorticoides tienden a suprimir la inflamación pero son inducidos por estímulos pro

inflamatorios; estos han sido conceptualizados como “frenos” sobre el sistema inmune para

evitar la diseminación de la inflamación y promover una respuesta inmune adecuada

(Sapolsky et al., 2000).

Existe evidencia que los glucocorticoides, dependiendo de la situación del individuo,

pueden mejorar ciertos aspectos de la respuesta inmune. Uno de ellos consistiría en una

inmuno redistribución de sus componentes provocando una inmunosupresión aparente

(Braude et al., 1999).

45

El aumento de eosinófilos y AcN que se observan en estos animales, estaría

demostrando un “intercambio” tendiente a adecuar el sistema inmune bajo estas

condiciones de estrés experimental.

Los eosinófilos son leucocitos multifuncionales implicados en la patogénesis de

numerosos procesos inflamatorios, incluyendo infecciones de parásitos helmintos. Sin

embargo, existen evidencias que han cambiado esta perspectiva mostrando que estas

células son leucocitos pleiotrópicos multifuncionales, que participan en la iniciación y

propagación de diversas respuestas inflamatorias y modulan la respuesta inmune

adaptativa mediante la activación directa de linfocitos T favoreciendo un perfil Th2. En la

respuesta inmune innata actúan, como fagocitos y productores de una variedad de citocinas

pro y anti inflamatorias.

Trabajos realizados en el Laboratorio de Ecología de Enfermedades ICIVET

LITORAL (UNL CONICET) demuestran que las consecuencias de ambos tratamientos

sobre la dinámica de parásitos gastrointestinales dependen del tipo de parásito y del tamaño

del individuo al inicio del experimento. Los animales estresados tienen una intensidad de

infección por coccidios significativamente mayor que los animales del grupo control

(siendo mas marcada en los animales del grupo de restricción nutricional). Por lo contrario

se encuentra una mayor intensidad de helmintos en los individuos del grupo control, sobre

todo en animales más livianos, y en consecuencia los más joven (Eberhardt et al., 2013). El

aumento de eosinófilos en los animales sometidos a ambos tratamientos coincide con el

menor recuento de helmintos y el mayor de coccidios, lo que indicaría una mayor

46

asignación de recursos a la respuesta inmune contra macroparásitos (Martin et al., 2008;

Råberg et al., 2009).

Por otra parte, los AcN por ser inespecíficos y constitutivos, estarían actuando como

importante herramienta del sistema inmune innato otorgando defensas genéricas contra

gran variedad de micro y macroparásitos en los individuos sometidos a estrés. En otras

experiencias llevadas a cabo por el Laboratorio de ecología de enfermedades ICIVET

LITORAL (UNL CONICET), en las cuales también se evalúan los niveles de AcN

comparándolos entre dos herbívoros sudamericanos en su hábitat natural (guanaco (Lama

guanicoe) y carpincho (Hydrochoerus hydrochaeris)), los resultados sugieren una fuerte

diferencia en la inversión de la inmunidad humoral constitutiva entre estas dos especies.

Los AcN, y quizás el resto de los componentes de la inmunidad humoral innata

constitutiva serian mayores en carpinchos con respecto a guanacos lo que podría ser

resultado de la evolución en relación a la exposición de parásitos, como así también,

atribuidos a la adaptación a diferentes entornos (Racca et al., 2014).

Si bien se ignora el modo en que el estrés nutricional afecta a los AcN, los resultados de

este experimento sugieren que su producción es sensible al estrés nuticional.

Las citocinas estudiadas (TNF, IL 1β, IL 10) juegan un rol importante en procesos anti

infecciosos y se han visto niveles aumentados de las mismas en situaciones de estrés.

La influencia de las citocinas en las respuestas efectoras es tan poderosa que muchos

parásitos manipulan la respuesta inmune en beneficio propio. Es así como las vías

mediadas por TNF son utilizadas por diversos microparásitos como lo hacen algunos virus

que inhiben al TNF o bien modulan la señalización del mismo (Rahman y Mc Fadden,

47

2006). Mientras que aquellas mediadas por TGFβ e IL–10 podrían ser usados por

macroparásitos (Gomez Escobar et al., 2000). Se ha descrito al TNF no solo como un

mediador de la respuesta inmune innata (respuesta inflamatoria local y sistémica), sino

también como un mediador de la respuesta Th1; promoviendo mecanismos (fagocitosis,

estallido respiratorio) que controlan infecciones producidas por patógenos intracelulares

(bacterias intracelulares, virus, protozoos)(Abbas el al., 1996). En muchas infecciones por

helmintos existe una respuesta predominante Th2, la cual se sostiene a lo largo de la

infección favorecida por la respuesta inmune innata. La IL 10 juega un rol fundamental en

este tipo de respuesta ya que media la supresión de las poblaciones Th1 y Th17. Esta

molécula estaría producida principalmente por macrófagos activados alternativamente; los

cuales fueron previamente activados por IL 4 e IL 13, producidas por células Th2. La

principal función de esta citocina junto al TGFβ es detener la respuesta inflamatoria

producida por el parásito (ejemplo: migración del parásito hacia otros tejidos) y favorecer a

continuación, la cicatrización del tejido afectado (Allen y Maizels, 2011).

La carga de coccidios hallados en los animales sometidos a estrés en ambos grupos de

tratamiento es mayor que en los animales control, este debería presuponer un aumento de

la respuesta Th1. Por otro lados, los individuos controles presentaron mayor carga de

parásitos helmintos, lo que sugeriría un aumento de IL 10. A pesar de esto, las citocinas

evaluadas no mostraron diferencias entre los diferentes grupos de tratamientos (control,

estrés nutricional y estrés psico físico) como así tampoco entre individuos.

Como se mencionó previamente, los glucocorticoides producidos en un estrés

determinado, dependiendo de la intensidad y duración del mismo, llevarían a una

48

inmunosupresión que no sería aplicable para todo el sistema inmune. Ciertos estudios

indican que la respuesta inmune innata tiende a aumentar minutos a horas post aplicación

del factor estresante, este efecto disminuye a lo largo de días a semanas pero tiende a

reactivarse luego de varias semanas a meses en el caso de persistir el factor estresante

(Martin, 2009; Medzhitov, 2008). Las citocinas IL 1, IL 10 y TNF evaluadas en estos

animales tampoco mostraron diferencias en función del estrés al cual fueron sometidos.

49

CAPÍTULO VI – CO CLUSIÓ

Teniendo en cuenta los resultados que se presentan en este trabajo se vislumbra la

necesidad de realizar más estudios de AcN en estas y otras especies de animales silvestres,

comparando la inversión inmunológica y exposición a agentes patógenos y estresantes

dentro y entre especies. De este modo, los AcN constituirían una importante herramienta

para el estudio de la dinámica de salud de estas poblaciones.

Las citocinas IL 1β, IL 10, TNF estudiadas no demuestran asociación a la condición

corporal ni los otros índices genéricos de salud (hematología), como así tampoco a los

hallazgos parasitológicos de estos individuos. Por esta razón, no pueden considerarse como

indicadores de salud en estas condiciones.

Es de destacar que el experimento con estos carpinchos, originalmente, fue diseñado

para la evaluación de parásitos gastrointestinales en relación con el estrés nutricional y

psico físico; con lo cual no se procedió a una toma de muestra de sangre periférica en el

periodo de aclimatación de los animales ni en otro momento durante el ensayo para hacer

comparaciones seriadas de los marcadores del sistema inmune escogidos. También es

probable que el tamaño de la muestra (n) no supere el ruido de la variación individual. En

animales endogámicos (animales de laboratorio) el número de muestras es n = 5 por

tratamiento y es factible que esta “n” sea baja para animales exogámicos (como lo es en

este caso), con un alto grado de variación genética que afectaría a los componentes que

conforman un respuesta inmune protectora; además, hay que tener en cuenta la variabilidad

ambiental existente en este ensayo.

50

Los animales asumen la respuesta al estrés de forma tal de maximizar sus perspectivas

de aptitud física dentro del ambiente en el cual viven (Wingfield et al., 1998). Aunque el

estrés afecta muchas veces la inmunidad de los individuos, no significa obligatoriamente

una supresión de la misma. En muchos contextos, la inmunidad podría mejorar y contribuir

a la supervivencia del animal o bien, a recuperarse de los factores estresantes. Esta

perspectiva modificada del estrés e inmunidad debería conducir a una nueva visión de

cómo los animales de una población superan condiciones adversas en su ambiente. Para

ello es determinante identificar los factores estresantes, su intensidad y duración para luego

determinar cuándo y cómo se ajusta el sistema inmune a dichos factores.

Uno de los objetivos más importantes de la ecoinmunología en animales silvestres, es

comprender los mecanismos que regulan la tolerancia y resistencia a parásitos en especies

reservorio. Esto significaría un aumento de nuestra capacidad de predecir el lugar y

frecuencia de aparición de enfermedades infecciosas emergentes que afectan al hombre y al

ganado, con impacto positivo en salud pública y animal, económica global, y conservación

de la biodiversidad.

51

CAPITULO VII REFERE CIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO VIII – A EXO

Parte de los resultados que se describen en este trabajo han sido dados a conocer en las

siguientes publicaciones y presentaciones a congresos

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CONGRESO:

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