UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LA SALUD...
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UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LA SALUD
CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
MACHALA2019
DA SILVA ALVES PALOMABIOQUÍMICA FARMACÉUTICA
JAEN SERRANO LORENA MISHELBIOQUÍMICA FARMACÉUTICA
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIASMETANOGÉNICAS DE SEDIMENTOS URBANOS DEL ESTERO EL
MACHO MEDIANTE UN ENFOQUE DE ECOSALUD.
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LASALUD
CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
MACHALA2019
DA SILVA ALVES PALOMABIOQUÍMICA FARMACÉUTICA
JAEN SERRANO LORENA MISHELBIOQUÍMICA FARMACÉUTICA
Aislamiento y caracterización de bacterias metanogénicas desedimentos Urbanos del Estero El Macho mediante un enfoque de
ecosalud.
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LASALUD
CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
MACHALA2019
DA SILVA ALVES PALOMABIOQUÍMICA FARMACÉUTICA
JAEN SERRANO LORENA MISHELBIOQUÍMICA FARMACÉUTICA
Aislamiento y caracterización de bacterias metanogénicas de sedimentos Urbanos delEstero El Macho mediante un enfoque de ecosalud.
MACHALA, 11 DE FEBRERO DE 2019
ROMERO BONILLA HUGO ITALO
TRABAJO TITULACIÓNTRABAJO EXPERIMENTAL
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U R K N DU
DEDICATORIA
A mi familia, quienes han sido siempre la base fundamental para mi crecimiento
profesional y han sido mi soporte en todos los momentos de mi vida, mi madre que ha
batallado toda su vida con valor, para mantenerme junto a ella de pie frente a la vida y
me ha orientado a ser mejor cada día y a corregir mis errores de la mejor manera. A mi
esposo, quien se ha convertido en mi pilar, y me empuja siempre hacia el camino del
éxito. Dedico este trabajo a Dios, que me da sabiduría y fortaleza para conseguir todo lo
que me propongo y a enfrentar con valentía todos los obstáculos que se me presente.
Paloma Da Silva
A Dios porque gracias a él tengo la vida, la protección y la fortaleza de salir adelante.
Todo es por su misericordia y su bondad que bendice mi vida y la de toda mi familia. A
mis padres que son mi guía y modelo a seguir en este camino hacia mi desarrollo
profesional, su apoyo y amor infinito siempre me han ayudado a alcanzar mis metas.
Querida madre sin tu esfuerzo, apoyo y amor, nunca hubiera llegado tan lejos, contigo a
mi lado, puedo lograr todo lo que me proponga. A mi hija amada Emily, el regalo más
lindo que me ha dado Dios, eres mi motivación y fortaleza, todo es para ti y quiero
brindarte un ejemplo de lucha hacia el éxito. A mi esposo que es mi apoyo incondicional,
por tu amor y comprensión en todo momento alcanzaremos todos los objetivos por los
que luchamos juntos.
Lorena Mishel Jaen Serrano
AGRADECIMIENTOS
A Dios, que me levanta y me mantiene de pie día a día. A mis padres, quienes han sido
mis impulsores y mi guía a lo largo de toda mi vida en cada paso que doy. Mi hermana,
quien me ha ayudado en cualquier cosa que haya necesitado. A mi amado esposo, que
lucha conmigo en cada batalla y es mi apoyo incondicional en toda mi vida. A nuestro
tutor que nos ha direccionado en la elaboración de este trabajo y estuvo ahí disponible en
cada inconveniente que presentamos.
Paloma Da Silva
A Dios por su misericordia porque me da la sabiduría de llegar a la meta, si tengo su
protección venceré cualquier obstáculo.
A toda mi familia por el apoyo infinito que me da la fuerza para perseverar cada día y ser
una persona con valores íntegros. A mi esposo y mi hija amada Emily por su motivación
y amor, sé que juntos somos fuertes.
A mi tutor Dr. Hugo Romero por motivarme a incursionar en nuevas fronteras de
aprendizaje, darle gracias infinitas por estar pendiente en todo momento, dándome sus
consejos y compartir risas y vivencias.
Lorena Mishel Jaen Serrano
RESUMEN
Las bacterias metanogénicas son microorganismos productores de metano, que necesitan
condiciones anaeróbicas para su metabolismo energético, su supervivencia depende de
las vías acetoclástica, metilotrópica o hidrogenotróficas, utilizan el dióxido de carbono,
sustratos de metilo y acetato que son esenciales para la codigestión anóxica de la materia
orgánica. El incremento de la población en la ciudad de Machala ha sido un factor
primordial para los altos índices de contaminación ambiental. Las descargas continuas de
aguas residuales, la sobreproducción de desechos orgánicos, los residuos del sector
bananero y el asentamiento a sus alrededores han ocasionado que este Estero se integre
de compuestos orgánicos e inorgánicos peligrosos y de una amplia carga bacteriana que
constituye un cuerpo de agua con lodos activados. El impacto de esta situación se
evidencia cuando estos residuos tóxicos llegan a los océanos ocasionando daños en los
ecosistemas y son perjudiciales para la salud de la población. La biotecnología es una
herramienta en el tratamiento de sedimentos activos, proceso en el cual se utilizan
bacterias metanogénicas que actúan estabilizando los lodos contaminados mediante la
reducción de patógenos, malos olores y condiciones de putrefacción. El objetivo del
presente trabajo de investigación fue aislar y caracterizar bacterias metanogénicas
mediante métodos microbiológicos en muestras del sedimento para evaluar el potencial
de oxidación anaeróbica de metano en el Estero El Macho de la ciudad de Machala. Se
realizó el aislamiento de las bacterias metanógenas de los géneros Methanococcus y
Methanobacterium mediante los medios de cultivo Standman-Barker y Barker-Taha
respectivamente. La siembra se realizó en medio sólido y líquido y se cuantificaron las
células viables estableciendo métodos de recuento de UFC (Unidades formadoras de
colonias) en placa y por el método NMP (Número más probable). La identificación
fenotípica se realizó con coloración de Gram y mediante la observación microscópica se
determinó las características morfológicas de cada especie. Además, se aplicaron pruebas
bioquímicas comparadas con valores referenciales de las cepas Methanococcus Deltae y
Methanobacterium Ruminantium, en las cuales se utilizaron los medios TSI agar (Hierro
triple azúcar), SIM medio (Sulfuro, indol y motilidad), citrato de Simmons y urea. Las
reacciones bioquímicas establecidas fueron: fermentación de la glucosa, sacarosa y
lactosa, producción de gas, presencia del sulfuro de hidrógeno, oxidación del triptófano,
movilidad, cambios de pH, reacciones enzimáticas y cambios de coloración en los
medios. Por otro lado, se armaron sistemas de biorreactores con materia orgánica
lignocelulosica (cáscara de arveja) más las cepas aisladas, en los cuales se generó biogás,
después de cada semana de codigestión anaerobia se efectuó la medición de gas metano
y dióxido de carbono por cromatografía gaseosa. Los resultados muestran el crecimiento
de bacterias de géneros Methanococcus y Methanobacterium, y se identificaron que los
dominios morfológicos de estas bacterias son estreptobacilos y cocáceas respectivamente.
Además, se definió que estas bacterias fermentan azúcares, generan gas sulfhídrico, son
móviles y producen turbidez en los medios de cultivo. El biorreactor que produjo mayor
cantidad de metano fue el que está constituido por ambas cepas de metanógenos
generando un 9% de gas metano a las tres semanas de digestión anaerobia. Las bacterias
del género Methanobacterium se encontraban en mayor cantidad que las del género
Methanococcus en medios sólidos y caldos, así como producen mayor cantidad de biogás.
PALABRAS CLAVES
Arqueas, Methanococcus, Methanobacterium, Biogás, Ecosalud.
ABSTRACT
Methanogenic bacteria are methane-producing microorganisms, which need anaerobic
conditions for their energy metabolism, their survival depends on the acetoclastic,
methylotropic or hydrogenotrophic pathways, they use carbon dioxide, methyl and
acetate substrates that are essential for the anoxic codigestion of the organic material. The
increase in population in Machala City has been a major factor in the high levels of
environmental pollution. The continuous discharges of wastewater, the overproduction of
organic waste, the waste from the banana sector and the settlement of its surroundings
have caused this Estero to be integrated with dangerous organic and inorganic compounds
and a large bacterial load that constitutes a body of water with muds activated. The impact
of this situation is evidenced when these toxic waste reach the oceans causing damage to
ecosystems and are harmful to the health of the population. Biotechnology is a tool in the
treatment of active sediments, a process in which methanogenic bacteria are used to
stabilize contaminated sludge by reducing pathogens, bad odors and putrefaction
conditions. The objective of this research work was to isolate and characterize
methanogenic bacteria by means of microbiological methods in sediment samples to
evaluate the anaerobic methane oxidation potential in El Macho Estuary in Machala City.
The methanogenic bacteria of the genus Methanococcus and Methanobacterium were
isolated by means of the culture media Stadtman-Barker and Barker-Taha respectively.
Seeding was carried out in solid and liquid medium and viable cells were quantified by
establishing methods for counting CFU (Colony Forming Units) in plaque and by the
NMP method (most probable number). The phenotypic identification was performed with
Gram stain and by microscopic observation the morphological characteristics of each
species was determined. In addition, biochemical tests were applied compared with
reference values of the strains Methanococcus Deltae and Methanobacterium
Ruminantium, in which TSI agar (triple sugar iron), medium SIM (Sulfur, indole and
motility), Simmons citrate and urea media were used. The established biochemical
reactions were: fermentation of glucose, sucrose and lactose, gas production, presence of
hydrogen sulfide, oxidation of tryptophan, mobility, pH changes, enzymatic reactions and
changes of coloration in the media. On the other hand, systems of bioreactors with
lignocellulosic organic matter (pea skin) plus isolated strains were assembled, in which
biogas was generated, after each week of anaerobic codigestion the measurement of
methane gas and carbon dioxide was made by chromatography gas. The results show the
growth of bacteria of the genus Methanococcus and Methanobacterium, and it was
identified that the morphological domains of these bacteria are streptobacilli and
cetaceans respectively. It was also defined that these bacteria ferment sugars, generate
hydrogen sulfide gas, are mobile and produce turbidity in the culture media. The
bioreactor that produced the greatest amount of methane was the one is constituted by
both strains of methanogens generating a 9% methane gas to the three weeks of anaerobic
digestion. The bacteria of the genus Methanobacterium were in greater quantity than those
of the genus Methanococcus in solid media and broths, as well as produce more biogas.
KEYWORDS
Archaea, Methanococcus, Methanobacterium, Biogas, Ecohealth.
ÍNDICE
Pág.
INTRODUCCIÓN 15
PROBLEMA GENERAL 18
PROBLEMAS ESPECÍFICOS 18
OBJETIVOS 19
Objetivo General 19
Objetivos Específicos 19
VARIABLES 19
Variables Independientes 19
Variables Dependientes 19
HIPÓTESIS 20
CAPITULO I 21
1. MARCO REFERENCIAL 21
1.1. Contaminación de agua y sedimentos 21
1.2. Digestión Anaerobia 22
1.2.1. Fases microbiológicas del proceso anaerobio 23
1.2.2. Factores indispensables para la Digestión Anaerobia 24
1.3. Arqueas Metanogénicas 24
1.3.1. Taxonomía de Bacterias Metanogénicas 25
1.4. Aplicaciones Biotecnológicas de microorganismos Metanogénicos 27
1.4.1. Biogás 27
1.5. Metano, Dióxido de carbono, Sulfuro de hidrógeno y los riesgos para el ser
humano y el ecosistema 28
1.6. Métodos de aislamiento y caracterización de metanógenos 29
1.7. Cromatografía Gaseosa 30
CAPÍTULO II 32
2. MATERIALES Y MÉTODOS 32
2.5. Toma de muestra 36
2.6. Aislamiento de Microorganismos Metanógenos 36
2.6.2. Inoculación de la muestra 38
2.7. Observación Macroscópica de los Medios de Cultivo 40
2.7.2. Observación en agar 40
2.8. Identificación Fenotípica 40
2.8.1. Tinción de Gram 41
2.8.1.1. Observación Microscópica 42
2.8.2. Pruebas Bioquímicas 42
2.8.2.1. SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad) Medio 42
2.8.2.2. TSI (Hierro Triple Azúcar) Agar 43
2.8.2.3. Citrato de Simmons Agar 45
2.8.2.4. Caldo de Urea 46
2.9. Medición de la Producción de Gas Metano 47
2.10. Análisis Estadístico de los Resultados. 49
CAPÍTULO III 50
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50
CAPÍTULO IV 73
4. CONCLUSIONES 73
CAPÍTULO V 74
5. RECOMENDACIONES 74
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75
ANEXOS 82
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Coordenadas Geográficas de los Sitios de Muestreo .................................................... 32
Tabla 2. Materiales, equipos y reactivos de Laboratorio ............................................................ 35
Tabla 3. Reactivos utilizados para la preparación de 1000 mL del medio Baker-Taha para aislar
bacterias del género Methanobacterium ...................................................................................... 37
Tabla 4. Reactivos utilizados para la preparación de 1000 mL del medio Standman-Barker para
aislar bacterias del género Methanococcus. ................................................................................ 38
Tabla 5. Morfología de las Metanobacterias en Tinción de Gram .............................................. 42
Tabla 6. Fórmula de SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad) Medio aproximada por litro de agua
destilada ...................................................................................................................................... 42
Tabla 7. Fórmula de TSI (Hierro Triple Azúcar) Agar aproximada para un litro de agua
destilada. ..................................................................................................................................... 43
Tabla 8. Fórmula de Agar citrato de Simmons aproximada por litro de agua destilada ............. 45
Tabla 9. Fórmula de Caldo de Urea aproximada por litro de agua destilada .............................. 46
Tabla 10. Composición de los reactores de producción de biogás. ............................................. 48
Tabla 11. Protocolo de medición de producción de biogás ......................................................... 48
Tabla 12. Morfología Colonial de las Bacterias Metanogénicas Aisladas en Medio sólido. ...... 52
Tabla 13. Recuento de UFC/mL de metanobacterias en Placa ................................................... 53
Tabla 14. Morfología Colonial de las Bacterias Metanogénicas Aisladas en Caldo. ................. 54
Tabla 15. Recuento de colonias metanógenas, técnica del número más probable ...................... 56
Tabla 16. Resultados Prácticos del SIM Medio - Methanococcus Aisladas ............................... 62
Tabla 17. Resultados Prácticos del Agar Citrato De Simmons ................................................... 63
Tabla 18. Resultados Prácticos del Agar TSI .............................................................................. 64
Tabla 19. Resultados Prácticos de Caldo de Urea. ...................................................................... 65
Tabla 20. Contenido de CH4 y CO2 obtenido de la muestra Patrón ............................................ 66
Tabla 21. Contenido de CH4 y CO2 obtenido del Reactor MC y MB en la primera semana de
producción de biogás .................................................................................................................. 67
Tabla 22. Contenido de CH4 y CO2 obtenido del Reactor MC y MB en la segunda semana de
producción de biogás .................................................................................................................. 69
Tabla 23. Producción de biogás en la tercera semana de codigestión anaerobia ........................ 70
Tabla 24. Recuento de Colonias en Agar mediante el conteo manual en placas. ....................... 93
Tabla 25. Recuento de Colonias en Caldo mediante la técnica del Número más Probable. ....... 94
Tabla 26. Promedio Morfológico de Bacterias Metanogénicas aisladas del medio Agar
Standman-Barker conteo en placas teñidas ................................................................................. 95
Tabla 27. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de Gram en el
medio Agar Standman-Barker..................................................................................................... 96
Tabla 28. Promedio Morfológico de Bacterias Metanogénicas aisladas del medio Agar Barker
conteo-Taha en placas teñidas. .................................................................................................... 97
Tabla 29. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de Gram en el
medio Barker-Taha ..................................................................................................................... 98
Tabla 30. Resultados cuantitativos y semicuantitativos de bacterias metanogénicas en todos los
campos de observación de la tinción de Gram. ........................................................................... 99
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Digestión Anaerobia ........................................................................................ 22
Figura 2. Fases del Proceso de la Digestión Anaerobia .................................................. 24
Figura 3. Clasificación de las bacterias metanogénicas según su orden. ........................ 26
Figura 4. Punto de Muestreo N° 1. ................................................................................. 33
Figura 5. Punto de Muestreo N° 2, descarga de agua residual. ...................................... 33
Figura 6. Punto de Muestreo N° 2. ................................................................................. 34
Figura 7. Punto de Muestreo N° 3 .................................................................................. 34
Figura 8. Punto de Muestreo N°4. .................................................................................. 35
Figura 9. Sistema de Biorreactores de generación de Biogás ......................................... 47
Figura 10. Medio Barker-Taha sin inóculo ..................................................................... 50
Figura 11. Medio Barker-Taha con crecimiento bacteriano. .......................................... 51
Figura 12. Medio Standman-Barker sin inóculo. ............................................................ 51
Figura 13. Morfología colonial en el medio Standman-Barker ...................................... 52
Figura 14. Recuento de UFC/mL de metanobacterias. ................................................... 53
Figura 15. Medio Barker-Taha en caldo sin inóculo. ..................................................... 54
Figura 16. Medio Barker-Taha en caldo, producción de gas en tubo Durham. .............. 54
Figura 17. Medio Standman-Barker en caldo sin inóculo. ............................................. 55
Figura 18. Medio Standman-Barker en caldo sin inóculo. ............................................. 55
Figura 19. Recuento de colonias metanógenas, técnica del número más probable ........ 56
Figura 20. Morfología Microscópica de Methanobacterium en la Tinción de Gram
aisladas en medio sólido ................................................................................................. 57
Figura 21. Morfología Microscópica de Methanobacterium en la Tinción de Gram
aisladas en caldo. ............................................................................................................ 57
Figura 22. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de Gram en
el medio Agar Barker-Taha ............................................................................................ 58
Figura 23. Morfología Microscópica de Methanococcus en la Tinción de Gram aisladas
en medio Sólido .............................................................................................................. 59
Figura 24. Morfología Microscópica de Methanococcus en la Tinción de Gram aisladas
en caldo. .......................................................................................................................... 59
Figura 25. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de Gram en
el medio Agar Standman-Barker. ................................................................................... 60
Figura 26. Género de predominio en placas teñidas. ...................................................... 61
Figura 27. Presencia de H2S, turbidez del medio y cepas móviles, sin cambio de color
ante el reactivo Kovac`s respectivamente. ...................................................................... 62
Figura 28. Índice de Alcalinidad, viraje azul .................................................................. 63
Figura 29. Reacciones de fermentación de azúcares. Ennegrecimiento del medio
indicativo de H2S. Presencia de gases ............................................................................ 64
Figura 30. Resultado Positivo en caldo ureasa. .............................................................. 65
Figura 31. Patrón de una mezcla gaseosa de CH4 y CO2. ............................................... 66
Figura 32. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos
Methanococcus y Methanobacterium en la primera semana. ......................................... 68
Figura 33. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos
Methanococcus y Methanobacterium en la segunda semana. ........................................ 69
Figura 34. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos donde
se encuentran ambas cepas en codigestión anaerobia de 15 días. .................................. 70
Figura 35. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos
Methanococcus y Methanobacterium en la tercera semana. ........................................... 71
Figura 36. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos donde
se encuentran ambas cepas en codigestión anaerobia de 20 días. .................................. 71
ÍNDICE DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Toma de muestra de sedimento en Estero El Macho ..................................... 82
Anexo B. Agares para la Identificación fenotípica ......................................................... 83
Anexo C. Dispensación de agares MB y MC. ................................................................ 84
Anexo D. Almacenado de muestras inoculadas en jarra de anaerobiosis por extinción
vela. Atmósfera libre de O2. ........................................................................................... 85
Anexo E. Dispensación de agar TSI, Agar SIM medio, Citrato de Simmons agar y Urea
para la realización de pruebas bioquímicas. ................................................................... 86
Anexo F. Proceso de tinción de Gram. ........................................................................... 87
Anexo G. Armado de biorreactores para la producción de gas metano. ........................ 88
Anexo H. Observación Microscópica ............................................................................. 89
Anexo I. Cromatógrafo de Gases FULI .......................................................................... 90
Anexo J. Autoclave ......................................................................................................... 91
Anexo K. Microscopio OLYMPUS................................................................................ 92
Anexo L. Tabulaciones de los resultados de análisis microbiológicos. .......................... 93
Anexo M. Tabla del número más probable (NMP) ...................................................... 100
Anexo N. Tabla de Limites de descarga a un cuerpo de agua marina. ......................... 101
15
INTRODUCCIÓN
En las últimas décadas, el incremento poblacional, la urbanización y el accionar negativo
del ser humano en la naturaleza, provocan elevados índices de contaminación que alteran
el medio ambiente produciendo el agotamiento futuro de los recursos naturales. El agua
es fuente de vida, nuestra tierra está formada por cuerpos de agua entre ellos los esteros
que son superficies pantanosas de gran caudal que desemboca en las zonas costeras, por
ello son gran preocupación debido a la contaminación que existe por ser ecosistemas de
amplia susceptibilidad y fragilidad, encontrándose entre las principales causas de
polución las descargas de aguas residuales y la falta de tratamiento para sedimentos
activos. 1
El medio ambiente tiene la capacidad de autodepuración ante la pequeña carga natural de
contaminantes, pero debido a los incrementos inmanejables, la naturaleza no puede
controlar estas amenazas de destrucción de ciclo continuo. La Ecosalud nos manifiesta
entre sus principios el saneamiento ecológico sostenible para el ser humano, actualmente
se utilizan procesos biotecnológicos para la conservación del medio ambiente. Estos
procesos utilizan microorganismos de reproducción anaeróbica que en sistemas
conocidos como biorreactores donde se produce aprovechamiento de los residuos
orgánicos para la producción de fuentes energéticas como el biogás. “2”, “3”
La digestión anaeróbica trata de un conjunto de reacciones de tipo óxido-reducción que,
con la ayuda de enzimas complejas, llegan a tener la capacidad de degradar algunos
compuestos. Este proceso se realiza comúnmente en residuos, mineralizan el material
orgánico que se encuentran sin oxígeno. 4
El proceso bioquímico de la digestión anaeróbica comprende cuatro etapas; hidrólisis,
acidogénesis, acetogénesis y metanogénesis. En la primera lo que sucede es la hidrólisis
de los compuestos de alto peso molecular, donde se digieren algunos elementos como son
los lípidos y las proteínas. 5
En la segunda etapa, la acidogénesis, es la que transforma los compuestos antes
mencionados en ácidos grasos volátiles. En la siguiente etapa, se transforman estos en
16
ácido acético y la última que es nuestro objeto de estudio, las bacterias metanogénicas
transforman estas moléculas en metano y dióxido de carbono. 6
Las arqueas metanógenas son bacterias que producen metano en medios anóxicos como
el sedimento de ríos, humedales y lagos debido a que los organismos micobiontes hacen
que la materia orgánica sea despolimerizada para que después estos monómeros se
fermentan a CO2, algunos alcoholes de cadena corta de ácidos grasos que posteriormente
van a ser reducidos por otros microorganismos sintrófilos hasta H2, CO2 y acetato. 7 Estas
son muy importantes en la degradación de la materia orgánica, siendo su producto final,
el metano. 8
Los microorganismos metanógenos se pueden diferenciar a las diversas especies por su
morfología; debido a que se encuentran en forma de cocos filamentosos, formando
cadenas, racimos o tétradas comúnmente se distinguen las Methanococaceas y
Methanosarcinas; bacilos cortos o largos observadas en el género Methanobacterium,
estas diversas especies pueden definirse como Gram negativos o positivos según su
afinidad específica por el mordiente. “9”,“14”
Teniendo en cuenta la importancia de estos microorganismos en los procesos en el
tratamiento de sedimentos residuales, este estudio se basa en la caracterización del
sedimento urbano del Estero el Macho de la ciudad de Machala.
17
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la ciudad de Machala en los años 90 se dio un significativo incremento en la población
y migración en busca de ofertas de trabajo. La necesidad de vivienda para nuevos
pobladores causó que la ciudad se expanda con invasiones en los alrededores del estero
lo que hoy en día es la fuente de mayor contaminación. 10
En la ciudad de Machala las aguas residuales urbanas son descargadas directamente a los
esteros el Macho y Huayla que la rodean. Por ello es fundamental controlar el impacto
ambiental que constituyen esta agresión a los mares y océanos, así como es un peligro
latente para la salud de los seres humanos.
En nuestro país hay escasas plantas de tratamiento de aguas residuales. Lo cual no es
ajeno a la ciudad de Machala, donde no se tratan sus lodos activados, siendo de gran
importancia los estudios que se realicen enfocados a la evaluación biológica y ecológica
de entornos con agua negras con grandes porcentajes de toxicidad y peligrosidad.
La composición residual de este Estero se puede evidenciar debido a la coloración
negruzca verdosa, que es índice de ser un canal de aguas contaminadas en donde se
pueden encontrar compuestos orgánicos e inorgánicos, así como una amplia carga
bacteriana con diferentes tipos de bacterias.
La falta de tratamiento de los lodos activados en El Estero el Macho es evidente debido a
los fuertes malos olores producidos por gases como el sulfhídrico, y otros que están
presentes en pequeñas concentraciones como el amoniaco, compuestos órgano sulfurados
como los tiofenos, sulfuros de dimetilo, algunos mercaptanos de bajo peso molecular,
fenoles y aminas como la cadaverina o la putrescina. Estos gases no solamente son causa
de fatiga nasal, sino que provocan en elevadas concentraciones, daños a nivel respiratorio
y nervioso en los seres humanos. 11
El metano y dióxido de carbono también son generados en este Estero gracias a la
existencia de grandes cantidades de residuos orgánicos presentes en el sedimento, los
mismos que proveen a las bacterias anaerobias compuestos carbonados, alcohólicos,
18
ácidos orgánicos y otras moléculas más pequeñas para la producción de estos gases, los
cuales son emitidos hacia la atmósfera terrestre ocasionando el efecto invernadero, que
ha producido un sin número de alteraciones en la naturaleza que en el futuro impedirán
la supervivencia del ser humano. 12
Por todo lo antes mencionado es importante la caracterización del sedimento del Estero
el Macho, debido a que se identifica bacterias anaerobias metanogénicas, antes no
estudiadas, proporcionando evidencia científica para el tratamiento residual con métodos
microbiológicos y biotecnológicos que lograrán mitigar el problema mediante el
aprovechamiento de residuos orgánicos presentes en nuestra ciudad.
PROBLEMA GENERAL
¿Es posible caracterizar bacterias metanogénicas mediante métodos microbiológicos en
muestras del sedimento para evaluar el potencial de oxidación anaeróbica de metano en
el Estero El Macho de la ciudad de Machala?
PROBLEMAS ESPECÍFICOS
¿Se puede aislar bacterias metanogénicas del sedimento del Estero El Macho a
través de medios de cultivo mediante la incubación en anaerobiosis?
¿Es posible Identificar por microscopia óptica la morfología fenotípica de
bacterias metanogénicas encontradas en el estero El Macho?
¿Es posible caracterizar metabólicamente mediante pruebas bioquímicas a las
bacterias metanogénicas?
¿Se puede determinar CH4 y CO2 por cromatografía gaseosa?
19
OBJETIVOS
Objetivo General
Caracterizar bacterias metanogénicas mediante métodos microbiológicos en muestras del
sedimento para evaluar el potencial de oxidación anaeróbica de metano en el Estero El
Macho de la ciudad de Machala.
Objetivos Específicos
● Aislar bacterias metanogénicas del sedimento del Estero El Macho a través de
medios de cultivo mediante la incubación en anaerobiosis.
● Identificar por microscopia óptica la morfología fenotípica de bacterias
metanogénicas encontradas en el estero El Macho.
● Definir mediante pruebas bioquímicas las características metabólicas de las
bacterias metanogénicas.
● Determinar por Cromatografía gaseosa la producción de gas metano mediante
codigestión anaerobia de las bacterias metanogénicas aisladas con biomasa
lignocelulosica.
VARIABLES
Variables Independientes
● Bacteria aislada
Variables Dependientes
● Característica morfología
● Concentración de gas metano generado
● Actividad metabólica
20
HIPÓTESIS
Los lugares de muestreo de sedimento del Estero el Macho influyen en el tipo de bacteria
metanogénicas aislada y en las características del gas metano obtenido mediante digestión
anaerobia.
21
CAPITULO I
1. MARCO REFERENCIAL
1.1. Contaminación de agua y sedimentos
La calidad de agua es uno de los aspectos más importantes en la actualidad ya que es el
principal recurso utilizado por la humanidad en casi todas las actividades diarias. No solo
su consumo, sino estar rodeada de ella también es un factor que puede ser causante de
riesgos o beneficios tanto para la salud humana como para el medio ambiente en el que
vivimos. El estero El Macho es un canal de gran extensión, en donde la actividad
antropogénica está en constante desarrollo. 13
Los sedimentos son aglomeraciones de tierra o arcilla que se encuentran en el fondo del
agua, acumuladas por producto del propio suelo o también por el proceso de
descomposición que sufren las plantas o material orgánico. El Estero El Macho, no tiene
tratamiento de aguas residuales, por ello es notorio que la materia orgánica sea arrastrada
por la corriente, produciendo residuos peligrosos que generan modificaciones
ambientales que el propio ser humano provoca. 13
En el sedimento, se concentran los microorganismos metanogénicos, donde aprovecha la
descomposición orgánica para subsistir en su medio anaerobio desprendiendo algunos
tipos de gases, pero en mayor proporción el metano y el dióxido de carbono. La desventaja
de estos gases es que se concentran en la atmósfera ocasionando así el efecto invernadero
en el medio ambiente, arrojando radiaciones en varias direcciones y provocando un
aumento de temperatura. 14
Si bien es cierto, el efecto invernadero es parte importante para el mantenimiento de la
temperatura atmosférica, pero el ser humano cada día realiza actividades que no son
propias de la naturaleza, contaminando y ocasionando más riesgos y efectos negativos
para la salud de la tierra y del mismo.
Un tratamiento de sedimentos urbanos para mejorar la salud en general, provocaría una
gran diferencia en el sector del Estero El Macho, aprovechando estos gases para beneficio
22
de las actividades humanitarias y reduciendo el riesgo de contaminación al medio
ambiente. 15
1.2. Digestión Anaerobia
La digestión anaerobia es un proceso en el cual la materia orgánica se degrada en carencia
de oxígeno, generando una aleación de gases producto de la fermentación microbiana. 16
El producto más importante de la digestión anaerobia es el biogás el cual está compuesto
por un conjunto de gases entre ellos el de mayor relevancia es el metano en una
aproximación de 50-70. 17 Otro importante es el dióxido de carbono en una proporción de
30-50, además existen algunas cantidades de otros gases como el hidrógeno, oxígeno,
nitrógeno y sulfuro de hidrógeno dependiendo de la materia orgánica de material
fácilmente biodegradable y del proceso de descomposición. “3”,“17”
La digestión anaeróbica actualmente se usa como un proceso de tratamiento residual en
donde se logra recuperar energía, así como controlar la contaminación ambiental. 18
Figura 1. Digestión Anaerobia
Fuente: Autores
23
1.2.1. Fases microbiológicas del proceso anaerobio
En el fondo del Estero El Macho, existen sedimentos acuosos, donde participan bacterias
anaeróbicas que se nutren de los residuos orgánicos produciendo varios tipos de gases.
Estas bacterias pasan por un proceso que genera el gas metano y CO2, que son los gases
que se encuentran en mayor abundancia como producto, este proceso de digestión
anaerobia consiste en 4 etapas: 19
Hidrólisis: Es la primera etapa que ocurre para que se desencadene el proceso de la
digestión anaerobia. Aquí participan algunas enzimas secretadas por bacterias hidrolíticas
encargadas de llevar a cabo el proceso de digestión de compuestos como lípidos,
polisacáridos, proteínas, entre otros, ya que las paredes de estos microorganismos no
permiten su descomposición. 19
La hidrólisis de los compuestos polisacáridos ocurre en pocas horas, ya los lípidos y las
proteínas demoran días. Y estos compuestos dan como resultados los azúcares, alcoholes,
ácidos, polipéptidos, los cuales ya son aptos para cruzar la pared celular de bacterias
fermentativas para dar el siguiente paso. 19
Acidogénesis: Luego de haber pasado por la etapa de la hidrólisis, el producto que queda
es asimilado por las bacterias acidogénicas, que son características de poseer un
crecimiento rápido, estas transforman a dichos azúcares, alcoholes, polipéptidos y ácidos
en ácidos grasos volátiles, alcoholes, cetonas, hidrógeno y otros más. “19”,“20”
Acetogénesis: Posteriormente, se acerca la etapa de la acetogénesis, bacterias que utilizan
hidrógeno, llegan al acetato a partir de hidrógeno y CO2, aquí ocurre la transformación
de los ácidos grasos volátiles en ácido acético. Esta etapa de la respiración anaeróbica
solamente va a ocurrir siempre y cuando el medio presenta concentraciones bajas del
producto generado, es decir, cuando existen otros microorganismos que lo consumen. 19
Metanogénesis: La metanogénesis es la fase donde termina la digestión anaerobia. A
partir de dos rutas metabólicas se forma el metano; es el primer lugar en donde se
producen bacterias que crecen con el sustrato acetato que son nombradas bacterias
acetoclásticas y la otra es la de los microorganismos que se alimentan con hidrógeno y
dióxido de carbono como sustrato a esta se denomina hidrogenotrófica. “19”,”21”
24
Figura 2. Fases del Proceso de la Digestión Anaerobia
1.2.2. Factores indispensables para la Digestión Anaerobia
Para que se lleve a cabo de manera correcta la digestión anaeróbica en el ciclo
metanogénico, es necesario la presencia de algunos factores condicionantes, como en es
en este caso los principales, la materia orgánica y la temperatura, para este estudio, las
principales bacterias involucradas son Methanobacterium y Methanococcus que se
reproducen en temperaturas de entre 30 y 46°C. Además, existen otros factores químicos
que influyen también en este proceso, como son el nitrógeno, el fósforo, el pH (grado
alcalino), la presencia de ácidos grasos volátiles y el medio anóxico fundamental para el
desarrollo de estas bacterias. 22
1.3. Arqueas Metanogénicas
Las arqueas metanogénicas tienen un estilo de vida estrictamente de tipo anaeróbico, no
necesitan oxígeno para subsistir. Estas son los únicos microorganismos distribuidos en el
medio ambiente que consiguen sobrevivir tomando la energía a partir de hidrógeno y
25
metano. Además de existir en el agua y en la tierra, estas bacterias metanogenas son
pobladoras del rumen. “23”,”24”
Las bacterias metanogénicas se nutren mediante tres vías que son:
● Metanógenos hidrogenotróficos: Por medio de esta vía, las bacterias crecen en
presencia de hidrógeno molecular quien dona los electrones y el dióxido de
carbono quien los acepta. 25
● Metanógenos acetoclásticos: En esta vía, ocurre el rompimiento del acetato en
metilo y carbonilo y reduce el metilo a metano oxidando el carbonilo a dióxido de
carbono. 25
● Metanógenos metilotrópicos: Viven en compuestos metilados. 26
1.3.1. Taxonomía de Bacterias Metanogénicas
Existen alrededor de ochenta y tres especies de estas bacterias, que, a su vez se subdividen
en tres grandes grupos. El primero, que contiene la mayor cantidad de especies, alrededor
de sesenta y uno, los metanógenos hidrogenotróficos que oxida el hidrógeno y reducen el
CO2 para formar así el gas metano. El segundo grupo son los metilotrofos que, para el
mismo fin, utilizan compuestos de metilo y por último los metanógenos acetotróficos que
utilizan al acetato. 27
Dentro de la clasificación taxonómica, las metanobacterias comprenden familias, la
primera que son denominadas Methanobacteriaceae que a su vez consta de cuatro
géneros distintivos morfológicamente, algunas de ellas son termofílicas (que resisten a
temperaturas extremadamente elevadas) y otras son alcalófilas (referente a
microorganismos que sobreviven a ambientes con pH de 8,5 a 11) ejemplo de ello son las
metanobacterias subterráneas. Todas las especies de metanobacterias pueden crecer en
hidrógeno y CO2, pero existen otros tipos de metanobacterias que pueden crecer en
formiato como son las M. formicicum, M. subterranium, M. thermoflexum, entre otras. El
género Methathermobacter forma parte de esta familia, el cual incluye tres especies
llamadas methanothermobacter thermoautotrophicus, Methanothermobacter Wolfeii, y
methanothermobacter marburgensis. Existen especies que sobreviven en el ganado
bovino como la M. ruminantium y otras que prevalecen en el tracto gastrointestinal de
animales y humanos y también en el fondo de las aguas residuales. Las M. Oralis
encontradas en la placa subgingival de seres humanos. En esta familia encontramos el
género Methanosphaera, que son Gram positivos aislados de las heces de humanos. 27
26
Figura 3. Clasificación de las bacterias metanogénicas según su orden.
Otra familia se conforma por las Methanothermaceae y Methanocaldococcaceae que son
las encontradas en manantiales volcánicos con una temperatura de ochenta grados
centígrados, adicional a estos también existen en esta familia los methanocorpusculaceae
que contiene un sólo género llamado Methanocorpusculum. Los Methanococcales son
los existentes en ambientes marinos y costeros. En ella está el género Methanococcus en
el cual han incluido nuevas especies que son las M. Fervens y M. Vulcanius. Los
methanomicrobiales que comprenden nueve géneros más. Se crea el género
Methanolacinia para incluir a los Methanomicrobium Paynteri, aislados de sedimentos
marinos. Finalmente, en la tercera familia está la Methanospirilaceae y además existen
las Methanosarcinaceae que son metanobacterias de vías acetotróficas. “27”,“28”
Las bacterias metanogénicas son microorganismo que disminuye el nivel de hidrógeno
en la producción de CH4, siendo parte de microbiota presente en la fermentación de los
alimentos con bacterias sacarolíticas que consumen los seres humanos. Debido a esto se
sugiere que estas bacterias colonias el tracto gastrointestinal promoviendo enfermedades
digestivas como el cáncer, obesidad y enfermedades inflamatorias en el intestino. Según
Jeroen está comprobado que las arqueas están presentes durante la etapa escolar, lo que
27
indica que la colonización de estas bacterias se da durante la infancia produciendo
problemas en la salud a largo plazo en la adultez de los seres humanos. 29
1.4. Aplicaciones Biotecnológicas de microorganismos Metanogénicos
1.4.1. Biogás
El biogás es una de las armas del futuro, será la fuente de energía utilizada para los años
siguientes, ya que es no contaminante y además reutiliza la materia orgánica que hace
daño al planeta. Siendo la forma más ingeniosa de obtención de energía. El biogás es
producido por el producto de la digestión anaeróbica, básicamente del gas metano y
dióxido de carbono, pero además de estos, el biogás contiene amoniaco, nitrógeno,
oxígeno, hidrógeno, monóxido de carbono y sulfuro de hidrógeno en pequeñas
cantidades. En Europa ya se utilizan sistemas de generación a gran escala de biogás, para
ser aprovechado como combustible mayoritariamente, y su uso sigue creciendo en
algunos países del mundo. 30
Los estudios tecnológicos de este tipo de gas ecológico siguen avanzando con el pasar de
los años, y se sabe que para su utilización a niveles industriales se necesita gran inversión
económica, para proteger al medio ambiente aprovechando residuos peligrosos. 31
El objetivo de esta tecnología, es sustituir además el gas de cocina por éste, aunque se
tendría que tener un valor elevado de concentración de metano para obtener el éxito. Si
se aumenta la presión utilizada en el biogás, a una menor concentración de metano, sería
la mejor forma de suministro de gas natural. Por ejemplo, el gas de cocina utiliza una
presión de 20 mbar, esta debería ser aumentada a 100 mbar con el gas metano. Con la
reutilización de la materia orgánica descompuesta, podemos no solo evitar la
contaminación ambiental, sino también utilizarla a nuestro favor. 32
La metanogénesis en sí, es la producción biológica del gas metano. Un gas que provoca
el efecto invernadero, sabemos que hoy en día se ha triplicado su concentración de este
gas en la atmósfera. Las metanobacterias se encuentran en abundancia en los lodos
residuales, su tratamiento ayudaría a reducir la producción de estas bacterias y por ende
el desprendimiento de este gas hacia la atmósfera pudiendo ser utilizado en otros
beneficios no contaminantes. 33
Si bien es cierto, la inversión para el tratamiento de lodos residuales es enorme, sin
embargo, es necesario tanto para el mejoramiento del medio ambiente, como para la
28
calidad de vida de los habitantes que rodean el sector del estero El Macho, ya que tendrían
un ambiente con mejor visibilidad y el Estero no llegaría a desprender malos olores como
lo es hoy en día, ni existiría ningún peligro contaminante para niños y adultos que deben
frecuentar esa ruta. 34
1.5. Metano, Dióxido de carbono, Sulfuro de hidrógeno y los riesgos para el
ser humano y el ecosistema
El calentamiento global es producto de las emisiones en altas concentraciones de gases
de efecto invernadero producto de las actividades del hombre, entre estos gases los
principales son el CH4 y CO2; los cuales ocasionan cambios desequilibrados de
temperatura de los océanos y del aire, provocando modificaciones geográficas como el
derretimiento de los polos y junto a ello la elevación del nivel del mar y todo tipo de
desastres naturales. “4”,”12”
Los patrones climáticos con altos índices de alteración, producen enfermedades en los
seres humanos, efectos directos como los cambios fisiológicos por frío o calor. Asimismo,
indirectamente la dinámica de enfermedades contagiosas derivadas de poblaciones de
vectores epidemiológicos emerge de zonas erradicadas por su incremento reproductivo.
Todo esto antes mencionado junto con la decadencia de recursos naturales impedirá la
supervivencia de la población a nivel mundial. 12
El H2S un gas de alta toxicidad para las personas, con un olor característico putrefacto,
que en concentraciones bajas de 0.3-0.0005 ppm en el aire. Este gas puede ser encontrado
en aguas termales, aguas estancadas, esteros y lagunas. Además, también es parte de
sistemas de alcantarillas municipales y plantas de tratamiento de lodos y aguas negras.
En nuestro organismo se puede encontrar cuando las bacterias del tracto digestivo cuando
se produce la digestión de alimentos de origen proteico. 35
El H2S en concentraciones entre los 0.00011-0.00033 ppm se han producido riesgos en la
salud presentándose en las personas expuestas afecciones a nivel respiratorio y nervioso.
Así mismo se producen daños a nivel de la mucosa respiratoria como nariz y garganta e
irritación de ojos. En concentraciones de 500 ppm se ha presentado en personas expuestas,
dificultad respiratoria incluyendo paro cardiorrespiratorio, cansancio y alteraciones
motoras. “35”,”36”
29
El dióxido de carbono se encuentra todo el tiempo en la atmósfera en su proporción
normal de 250-350 partes por millón, siendo así parte de la respiración, pero este gas en
altas concentraciones produce efectos negativos tanto para la salud como para el medio
ambiente. En cantidades bajas, de más o menos mil a dos mil partes por millón ya
contamos con una menor calidad de aire, en cambio ya con una concentración mayor a
dos mil, se empiezan a tener reacciones como mareos, pérdida de concentración,
problemas en la respiración y dolores de cabeza, y así a medida que se aumenta la
concentración de dióxido de carbono en la atmósfera se van incrementando los efectos
negativos para el ser humano como la asfixia. Este gas es uno de los principales causantes
del efecto invernadero, por ende, el calentamiento global, gracias a las actividades que
realiza el ser humano a diario, la liberación de CO2 es cada vez mayor, ya sea con el uso
de la gasolina, petróleo, entre otros, que contribuyen a una mayor contaminación hacia el
medio en el que vivimos. 12
1.6. Métodos de aislamiento y caracterización de Metanógenos
Existen algunos métodos accesibles para lograr el aislamiento y caracterización de las
bacterias metanogénicas, como es el aislamiento de colonias en cajas Petri donde se
aplican medios de cultivo como el medio fosfato buffer, normalmente utilizado por la
ventaja de que no es tóxico. También es utilizado el medio agar Barker-Taha para la
identificación de metanógenos del género Methanobacterium y el medio Standman-
Barker en el aislamiento de metanógenos del género Methanococcus. Por otro lado,
también se aplica la caracterización con otros medios de cultivo como el agar nutritivo,
el medio SPS en que se utiliza al Clostridium spp., como cepa de referencia debido a que
esta especie pertenece a la familia de las bacterias anaerobias estrictas. 37
En estos medios de cultivo existen también técnicas distintas que se pueden aplicar, como
es la siembra por inoculación, donde se toma la muestra y se la disuelve con un asa en el
medio, la siembra por estría que es donde se obtiene un medio sólido y se realiza una
estría en zig zag en el medio con cuidado por lo que se puede romper el medio, y la
siembra por picadura, donde se toma el asa con la muestra y se realizan algunas picaduras
al medio.
Además de los medios de cultivo también existe el método del número más probable
(NMP) que se trata de inocular las muestras en medios de cultivo en estado líquido,
previamente diluida en varias concentraciones y luego llevarlas a incubadora para la
30
observación del crecimiento de estas bacterias, se nota un cambio a color turbio o
presencia de un anillo para la confirmación de crecimiento. 38
La realización de pruebas bioquímicas es aplicada para la caracterización de las bacterias
metanogénicas, en donde se pueden aplicar los medios: TSI, glucosa, SIM medio, citrato,
triptófano, urea y fructosa. El medio ureasa se utiliza para la determinación de la
capacidad de una bacteria para separar la urea logrando la formación de dos moléculas de
NH3 por acción enzimática de la ureasa que produce una coloración rojiza en el medio.
La enzima ureasa es relevante para descomponer compuestos inorgánicos. 39
El SIM medio es un medio utilizado para la diferenciación de bacterias verificando la
producción de indol, producción de sulfuro de hidrógeno y la movilidad. El aminoácido
triptófano es parte de muchas peptonas, al ser oxidado produce la formación de indol que
se produce se conjuga con el reactivo Kovac’s formando una coloración roja. El tiosulfato
de sodio y el sulfato de amonio ferroso son parte importante como indicadores de H2S,
provocando un precipitado negro. 37
El agar de hierro triple azúcar (TSI) es un medio diferencial de bacilos gramnegativos en
base a la fermentación de carbohidratos y producción de H2S, el agar está formado por 3
azúcares dextrosa, sacarosa y lactosa; también rojo fenol como indicador de la
fermentación y el sulfato de amonio ferroso para la verificación de gas de H2S. 40
El medio citrato de Simmons agar es un medio de cultivo donde el citrato de sodio es la
única fuente de carbono y el monofosfato de amonio es la única fuente de nitrógeno,
indispensables para el desarrollo de las bacterias, las sales de fosfato conforman un buffer,
el cofactor enzimático es el magnesio. El indicador de pH es el Azul de Bromotimol, y el
componente que mantiene el balance de osmosis es el cloruro de sodio. 41
1.7. Cromatografía Gaseosa
Esta es una de las técnicas más avanzadas y más eficaces de separación de mezclas de
gases, en donde estos serán conducidos en dos fases, una móvil y una estacionaria, dos
fuerzas que atraerán los componentes a separar, los que sean más afines con la fase móvil
(donde se utiliza un gas inerte llamado gas portador), correrán a un sentido definido
rápidamente, y los que se mueven más despacio son los que serán adheridos a la fase
estacionaria que sucede debido a fenómenos de desorción y adsorción. 42
La cromatografía de gases contiene un alto grado de sensibilidad, pudiendo detectar de la
más mínima cantidad de gas involucrado. Generalmente, existen parámetros límites para
31
la separación de gases, como la temperatura que debe ser de máximo 400°C y los
compuestos deben tener un peso molecular menor a mil. Este proceso consta de un
sistema de repartición en donde la muestra inyectada a elevadas temperaturas atraviesa la
columna en donde los separarán y serán conducidos a un equipo de detección y arrojará
la columna resultante con las cantidades y gases contenidos. 43
32
CAPÍTULO II
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Unidad de estudio
El estero El Macho se encuentra situado en la ciudad de Machala al Norte con una
longitud de 6.5 Km y aproximadamente 27 m de ancho, la corriente del mismo tiene una
dirección Este-Oeste; el estero inicia en el Grupo Bolívar recorriendo la circunvalación
Norte siguiendo por la vía Ferroviaria cruzando por la Cdla. Acacias hasta la Cdla. 24 de
Septiembre y Rayito de Luz. 10
Según el Instituto Geográfico Militar este territorio posee un clima tropical megatérmico
seco, en el cual su periodo de máxima temperatura se encuentra en la temporada invernal
(marzo-abril), registrando temperaturas de 34°C; mientras que los periodos de menor
temperatura (agosto-octubre) varían de 21 a 26 °C. 10
2.2. Tipo de Estudio
El estudio es de tipo experimental.
2.3. Muestra
La selección del sitio de toma de muestra se priorizo por las comunidades expuestas, la
incidencia de descargas de aguas servidas y las fuentes contaminantes proximales al
Estero. La muestra es el Sedimento del Estero el Macho. La localización de cada punto
de muestra se detalla a continuación
Tabla 1. Coordenadas Geográficas de los Sitios de Muestreo
PUNTOS DE MUESTREO X Y
P1 3°15'34.0"S 79°55'29.1"W
P2 3°15'25.6"S 79°55'55.3"W
P3 79°56'19.5"W 79°56'19.5"W
P4 3°14'41.6"S 79°57'10.4"W
Fuente: Autores
33
2.3.1. Punto de Muestreo N° 1.
El muestreo se realizó en el sector de la Finca Bananera El Cornejo en el Barrio Rayito
de Luz en la conocida vía Limón de la Parroquia Providencia, Figura 4 donde existe gran
tráfico vehicular y efluentes de la producción bananera como pesticidas y residuos de
materia orgánica.
Figura 4. Punto de Muestreo N° 1.
Fuente: Autores
2.3.2. Punto de Muestreo N° 2.
Aproximadamente a 200 m del Colegio El Oro, entre las parroquias Jubones y la
Providencia, Figura 5 frente a la Planta de Asfalto de Machala se encuentra una fuente de
descarga de agua residual.
Figura 5. Punto de Muestreo N° 2, descarga de agua residual.
Fuente: Autores
34
Figura 6. Punto de Muestreo N° 2.
Fuente: Autores
2.3.3. Punto de Muestreo N° 3.
En los Vergeles Sector D por la antigua vía limón frente a la empresa cervecera Dica C
Ltda., fue el punto de recolección, Figura 7 en donde existen algunos tubos de descargas
de agua residual, así como mucha contaminación por parte de los habitantes del sector.
Figura 7. Punto de Muestreo N° 3
.
Fuente: Autores
2.3.4. Punto de Muestreo N°4.
En la vía la primavera a unos 500 m de redondel del burro está el puente de entrada del
sector los Sauces I, Figura 8 hay un gran asentamiento poblacional junto con numerosos
sitios de descargas de aguas servidas, además se observan lavadoras de carros y talleres
mecánicos por los alrededores.
35
Figura 8. Punto de Muestreo N°4.
Fuente: Autores
2.4. Materiales, Equipos y Reactivos de Laboratorio
Tabla 2. Materiales, equipos y reactivos de Laboratorio
EQUIPOS MATERIALES SUSTANCIAS MEDIOS DE
CULTIVO
● Microscopio
Óptico
Marca
OLYMPUS
BX53
● Estufa
● Incubadora
Marca
Memmert
● Mechero
● Cromatógraf
o de gases
Marca FULI
9790II
● Balanza
Analítica
Marca
RADWAG
modelo AS
● Guantes
● Mascarillas
● Zapatones
● Mandil
● Tubos de
Ensayo
● Tapones de
caucho
● 2 erlenmeyer de
1000 mL
● Cajas Petri
● Portaobjetos
● Hisopos
● Asa
bacteriológica
● Pipetas
Graduadas
● Micropipetas
● Vaso de
precipitación de
● Agua destilada
● Aceite de
inmersión
● Alcohol industrial
● Alcohol potable
● Suero fisiológico
● Agar Barker-Taha
● Agar Stadtman-
Barker
● Agar Base
REACTIVOS
● Cristal Violeta
● Solución de
Yodo
● Alcohol-cetona
● Safranina
MATERIA
LIGNOCELULÓSICA
● Cáscara de arveja
36
220.X2 serie
498176
● Cocineta
● PHmetro
● Contador de
colonias
manual
● Autoclave
marca
Memmert
250 mL,1000
mL
● Tubos Durham
● Gradilla de
Tinción
● Espátula
● Algodón
● Papel Aluminio
● Papel periódico
● Jabón liquido
● Puntas para
Micropipetas
● Equipos de
venoclisis
● Bolsa de Suero
Fisiológico de
100 mL
● Tijeras
● Fósforos
● Cinta maskin
Fuente: Autores
2.5. Toma de muestra
La zona de estudio se dividió en 4 sitios de muestreo. El muestreo de sedimento se realizó
en envases estériles de polipropileno de alta transparencia con tapa de polietileno de cierre
hermético de 150 mL de volumen; aproximadamente en la mitad del estero con un
muestreador tipo pala a unos 80 cm debajo del espejo de agua, luego de la recolección se
almaceno los envases con muestras en bolsas con cierre hermético de plástico para evitar
contaminación cruzada, para posteriormente ser transportadas en refrigeración al
laboratorio. Debido a que se realizó un estudio microbiológico las muestras fueron
trasladadas en una hielera a una temperatura de menos 10 °C, no exceder el análisis en un
tiempo de 48 horas después de la recolección. Durante el muestreo se determinaron las
coordenadas geográficas de cada punto de muestra.
2.6. Aislamiento de Microorganismos Metanógenos
Para el aislamiento microbiológico de las bacterias metanogénicas se utilizaron los agares
selectivos Standman-Barker para Methanococcus y Baker-Taha para Methanobacterium,
37
estos agares especializados están compuestos por un conjunto de sustratos que usan estas
bacterias como fuente de energía en las condiciones adecuadas de temperatura para su
metabolismo y reproducción en anaerobiosis. 37
2.6.1. Preparación de los Medios de Cultivo Barker-Taha Methanobacterium y
Stadtman-Barker para Methanococcus
Los medios de cultivo requieren de esterilización, por lo cual se preparan los agares
siguiendo la composición que se muestra en la tabla 3 y 4; en el medio MB se incorporan
las mezclas de sulfuro de sodio 0.1g en 10 mL de agua destilada y carbonato de sodio
0.50 g en 10 mL de agua destilada. 37
Para la pre-reducción de los medios de cultivo se realizó por 2 horas utilizando la jarra de
anaerobiosis por extinción con vela para obtener la atmósfera libre de O2, para el control
de la esterilidad de los medios se incubó un blanco de cada medio.
Tabla 3. Reactivos utilizados para la preparación de 1000 mL del medio Baker-Taha
para aislar bacterias del género Methanobacterium
REACTIVO CANTIDAD
Etanol 10 ml
Fosfato dipotásico 5g
Sulfato de magnesio 7(H2O) 0.1g
Sulfato de amonio 0.3g
Sulfato ferroso 7(H2O) 0.02g
Autolisado de levadura 5 ml
Carbonato de calcio 100g
Agua destilada 1000ml
Fuente: Autores
38
Tabla 4. Reactivos utilizados para la preparación de 1000 mL del medio Standman-
Barker para aislar bacterias del género Methanococcus.
REACTIVO CANTIDAD
Formiato de Sodio 15 g
Sulfato de amonio 1 g
Cloruro de calcio 0.01g
Cloruro de magnesio 0.01g
Cloruro férrico 0.02g
Sulfato de magnesio 0.01 g
Molibdato de sodio 0.001g
Fosfato dipotásico 2g
Rojo de fenol 0.003 g
Azul de metileno 0.002 g
Tioglicolato de sodio 0.5 g
Fuente: Autores
2.6.2. Inoculación de la muestra
2.6.2.1. Medio sólido agar MC y MB
Los medios de cultivos fueron inoculados con 1 mL de muestra, en siembra de superficie,
fueron incubados en condiciones estrictas de temperatura de 37°C en anaerobiosis, los
indicios de crecimiento bacteriano se verifican en un periodo de 24 a 48 horas y a los 15
días de la siembra se verifica la reproducción de metanógenos por turbidez del medio.
Además, se observan las características morfológicas macroscópicas de las colonias como
forma y tamaño para luego proceder a la verificación microscópica mediante la tinción
de Gram. 37
39
Técnica de siembra por agotamiento de estría continua
1. Encender el mechero de alcohol.
2. Destapar la caja Petri cerca del mechero y flamear el asa hasta que torne de color
rojo vivo, dejarla enfriar antes de proceder a tomar la muestra con la punta del asa
de platino.
3. Estriar el agar con el asa impregnada de muestra en un cuarto de superficie, las
estrías deben ser varias y en forma de zigzag, se debe jalar la primera estría inicial
y luego proceder con un estriado de lado a lado sin tocar las otras estrías jalando
la cola final de la última estría y al final deben ser menos estrías y estar más
distantes una de la otra.
4. Después del estriado, flamear el asa nuevamente.
5. Tapar la caja Petri cerca del mechero y sellar para la incubación evitando que se
pueda contaminar con otros microorganismos. 45
6. Rotular los datos necesarios para la identificación de cada muestra, voltear las
cajas y depositarlas en un frasco para proceder a incubar en atmósfera anaerobia
por un tiempo de 15 días.
2.6.2.2. Medio líquido en caldo MC y MB
En la siembra de Metanógenos en caldo se inoculó con 1 mL de muestra introduciendo la
carga bacteriana con un asa calibrada depositando en el caldo las colonias en las
diluciones de caldo de forma vertical sin tocar los bordes del tubo de ensayo, después de
la siembra se procede a colocar un tubo Durham para determinar la producción de gas de
las bacterias en estudio.
Para el aislamiento en caldo se utilizaron diluciones seriadas en 0.1 mL, 1 mL y 10 mL
utilizando el método del NMP (Número más probable) en donde se evalúa
cuantitativamente las densidades de población bacteriana presente. 44
Técnica de NMP
1. Se rotulan tres tubos para las diluciones de 0.1 mL, 1 mL y 10 mL
2. Se homogenizan las muestras para optimizar resultados
3. Se colocan 9 mL del caldo Standman-Barker o Baker-Taha en cada tubo, tres
tubos para cada dilución.
40
4. Colocar tubos Durham para observar la producción de gas.
5. Incubar en anaerobiosis por un tiempo de 24 a 48 horas en una temperatura de 35-
45°C.
6. El crecimiento bacteriano se considera mediante la observación de tubos de
resultado positivo verificando la turbidez, coloración y la producción de gases
7. Se tabulan los resultados con los tubos positivos y se procede a ver la población
estimada en las tablas. 44
Los resultados se tabulan según el valor estimado de la población bacteriana mediante la
observación de tubos positivos, utilizando las tablas de NMP. El número más probable
que resulta de las tablas es dato para la aplicación de la siguiente formula. La tabla de
NMP se encuentra en el Anexo M. 44
NMP resultante de la Tabla x Factor de dilucion intermedio(10)
volumen de muestra = UFC/100 mL
2.7. Observación Macroscópica de los Medios de Cultivo
2.7.1. Observación en caldo
1. Visualización de la turbidez del medio
2. Formación de película o velo en la parte superficial.
3. Producción de gas en los tubos Durham depositados dentro de los medios.
4. Presencia de sedimento.
2.7.2. Observación en agar
Las UFC (unidades formadoras de colonia) se forman por un grupo de bacterias de una
misma especie, las colonias suelen identificarse según la textura, por la forma de la
colonia, el diámetro y la coloración, dependiendo al medio de cultivo donde fueron
sembradas, también depende de las condiciones de control de incubación y de la especie
en reproducción. 45
2.8. Identificación Fenotípica
En la identificación Fenotípica las bacterias aisladas fueron teñidas mediante la
coloración de Gram y también se realizaron pruebas bioquímicas para definir mediante la
actividad metabólica la confirmación de ser parte de la familia metanogénica, para esto
41
se utilizaron las siguientes cepas: ATTC 35294, cepas de la especie Methanococcus deltae
y ATTC 35063, cepa de la especie Methanobacterium ruminantium. 37
2.8.1. Tinción de Gram
1. Preparar la extensión: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, con un asa
bacteriológica colocar una colonia aislada del medio de cultivo.
2. Suspensión de pico máximo: Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de suero
fisiológico y después con el asa bacteriológica colocar una colonia pura de agar
MB y en otro tubo replicando el procedimiento del agar MC; sembrar por un
tiempo de 24 horas en la incubadora en anaerobiosis.
3. Colocar con la micropipeta 10 μL de la suspensión bacteriana en un portaobjetos
4. Secar al aire y luego se fija la placa pasándola por el mechero varias veces.
5. Colocar varias gotas de cristal violeta encima de la muestra fijada durante un
tiempo de 40 a 60 segundos para intensificar el color y luego enjuagar enseguida
con agua del grifo.
6. Agregar varias gotas de una solución de yodo permitiendo la formación del
complejo cristal violeta-yodo lo cual permite que se sature el péptidoglicano que
es parte de la pared celular de la bacteria; luego de esto enjuagar con agua después
de un tiempo de 30-60 segundos.
7. Luego se agrega alcohol acetona y lavar después de 5 segundos; este reactivo es
un decolorante que se encarga disolver lípidos de la pared Gram negativa, la
mezcla alcohol-acetona deshidrata la pared bacteriana y elimina la membrana
externa bacteriana Gram negativa debido a su solubilidad ante un solvente
orgánico.
8. Agregar safranina por un tiempo de 20 segundos y enjuagar enseguida, este es un
colorante de contratinción que tiñe bacterias que no quedaron en el complejo
cristal violeta-yodo.
9. Dejar secar al ambiente, luego colocar una gota de aceite de inmersión y observar
en el microscopio. 45
42
2.8.1.1. Observación Microscópica
Tabla 5. Morfología de las Metanobacterias en Tinción de Gram
Género Morfología
Methanobacteriaceae Bacilos largos o cortos, Gram positivos, no
móviles, contienen pseudomureina
Methanococcaceae Cocos irregulares, Gram negativos
Fuente: Autores
2.8.2. Pruebas Bioquímicas
Las pruebas bioquímicas fueron realizadas con las colonias aisladas de los agares MB y
MC para el análisis de los sustratos que se encargan de la degradación y fuente de energía
que utiliza cada bacteria, mediante los indicadores que posee cada medio de cultivo.
La caracterización fenotípica de las bacterias aisladas se evaluó con las siguientes
pruebas: Sim medio, TSI agar, citrato de Simmons, prueba de indol, caldo de urea. 37
2.8.2.1. SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad) Medio
Tabla 6. Fórmula de SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad) Medio aproximada por litro
de agua destilada
COMPOSICIÓN g/L
Digerido Pancreático de caseína 20 g
Digerido Péptico de tejido animal 6.1 g
Agar 3.5 g
Sulfato ferroso de amonio 0.2 g
Tiosulfato sódico 0.2 g
pH: 7.3 ± 0.2 at 25°C
Fuente: Autores
43
Preparación
1. En un litro de agua destilada suspender 30 g de polvo mezclando hasta lograr
disolver.
2. Calentar agitando con frecuencia y dejar que hierva durante un minuto
3. dispensar aproximadamente 4 ml del medio en tubos de ensayo y esterilizar en la
autoclave por 15 minutos a una temperatura de 121°C
4. Dejar que se solidifique en una posición vertical, destapar los tubos y enfriando
antes de usar los medios
5. Siembra: Mediante punción profunda sembrar una colonia pura con una aguja de
inoculación, en el centro del tubo abarcando dos tercios del medio de cultivo
comenzando desde la superficie.
6. Incubación: En anaerobiosis incubar por 24 horas a una temperatura de 37 °C,
después de este tiempo de incubación se debe agregar de 3 a 5 gotas del reactivo
de Kovac’s o Erlich.
Interpretación de los Resultados:
● Cepas móviles: Enturbiamiento alrededor del sitio de la punción, extendiéndose
sobre la línea de siembra.
● Cepas inmóviles: Solamente se visualiza el crecimiento en la línea de la
inoculación.
● Cepas H2S positivas: Ennegrecimiento en todo el medio de cultivo o en la línea
de la siembra.
● Cepas H2S negativas: No ocurre cambio de color del medio.
● Indol Positivo: Coloración roja en la superficie después de colocar el reactivo de
Kovac´s.
● Indol negativo: No ocurre el cambio de la coloración del medio.
2.8.2.2. TSI (Hierro Triple Azúcar) Agar
Tabla 7. Fórmula de TSI (Hierro Triple Azúcar) Agar aproximada para un litro
de agua destilada.
COMPOSICIÓN g/L
Extracto de carne 3 g
44
Tabla 8. (Continuación)
COMPOSICIÓN g/L
Digerido de Peptona de tejido animal 5 g
Tiosulfato de sodio 0.3 g
Extracto de levadura 3 g
Dextrosa 1 g
Sacarosa 10 g
Lactosa 10 g
Sulfato de hierro 0.2 g
Digerido pancreático de caseína 15 g
Cloruro de sodio 5 g
Agar 12 g
Rojo Fenol 0.024 g
pH 7.4 ± 0.2 35 ± 2°C
Fuente: Autores
Preparación
1. En un litro de agua destilada suspender 62 g de polvo, mezclando hasta disolver
2. Hervir durante un minuto, calentando con agitación hasta disolver todo el polvo.
3. En tubos de ensayo dispensar y autoclavar durante 15 minutos a una temperatura
de 121°C
4. Dejar enfriar los tubos en posición inclinada para lograr picos de flauta profundos
5. Siembra: La inoculación se realiza en la superficie del pico de flauta, se coge una
colonia aislada con asa bacteriológica y se realiza un estriado.
6. Incubación: En anaerobiosis durante 24 horas a una temperatura de 35 a 37°C. 40
Interpretación de Resultados
● K/A (Pico alcalino-Fondo ácido) Pico rojo/ Fondo amarillo: Se produce la
fermentación de la glucosa por la bacteria.
● A/A (Pico ácido-Fondo ácido) Pico amarillo/ Fondo amarillo: Se produce la
fermentación de la lactosa, sacarosa y glucosa.
45
● K/K (Pico alcalino-Fondo alcalino) Pico rojo/ Fondo rojo: La bacteria no
fermenta azúcares.
● Producción de H2S: Precipitado Negro, oscurecimiento del medio.
● Producción de Gas: Se presentan burbujas, desplazamiento del medio del fondo
o ruptura del medio quedando espacios. 40
2.8.2.3. Citrato de Simmons Agar
Tabla 8. Fórmula de Agar citrato de Simmons aproximada por litro de agua
destilada
COMPOSICIÓN g/L
Citrato de sodio 2 g
Cloruro de sodio 5 g
COMPOSICIÓN g/L
Monofosfato de amonio 0.2 g
Fosfato dipotásico 1 g
Sulfato de magnesio 0.2 g
Azul de Bromotimol 0.08 g
Agar 15 g
pH 6.9 ± 0.2 35 ± 2°C
Fuente: Autores
Preparación
1. En un litro de agua destilada suspender 23 g del polvo del medio
2. Mezclar hasta disolver y llevar a ebullición para lograr disolver por completo
3. Dispensar en los tubos de ensayo y autoclavar 15 minutos a 121°C
4. Dejar enfriar en posición inclinada para formar el pico de flauta
5. Siembra: Se debe inocular la superficie del medio en el pico de flauta con un asa
bacteriológica cogiendo una colonia aislada, realizando estriado superficial y en
el extremo punción
6. Incubación: Recomendado a una temperatura de 35° C en 48 horas en
anaerobiosis. 41
46
Interpretación de Resultados
Positivo: Si el medio cambio de coloración azul, significa alcalinidad.
Negativo: Permanece con una coloración verde no hay crecimiento de bacterias.41
2.8.2.4. Caldo de Urea
Tabla 9. Fórmula de Caldo de Urea aproximada por litro de agua destilada
COMPOSICIÓN g/L
Peptona 1 g
Glucosa 1 g
Cloruro de sodio 5 g
Fosfato de disodio 1.2 g
Fosfato dipotásico 0.8 g
Rojo de Fenol 0.08 g
Agar 15 g
pH 6.8 ± 0.2 35 ± 2°C
Fuente: Autores
Preparación
1. En 95 mL de agua destilada suspender 2.4 g de polvo del medio
2. Calentar con frecuencia hasta hervir para disolver por completo.
3. En tubos de ensayo dispensar el caldo y autoclavar en un tiempo de 20 minutos a
115 °C
4. Dejar que se enfríe en forma de pendiente.
5. Siembra: Inocular una colonia aislada en el medio con una aguja bacteriológica
6. Incubación: En anaerobiosis en un tiempo de 18 a 24 horas de 35 a 37°C. 46
Interpretación de Resultados
● Positivo: Coloración Rosada en la superficie.
● Negativo: Medio mantiene su color amarillo. 46
47
2.9. Medición de la Producción de Gas Metano
Armado de los Biorreactores
La determinación de la producción de biogás se realizó armando cinco biorreactores con
las bacterias aisladas más el sedimento estableciendo diferentes sustratos para cada
biorreactor. 47
Se dispuso de cinco tubos de 30 mL de capacidad, estos constan cada uno de una
alargadera de silicón que sale del tapón de corcho cerrando el biorreactor y una salida con
aguja de jeringa que se conecta a un extremo de la bolsa de propileno de solución salina
de 100 mL limpia y seca en donde se recolecta el gas producido por las bacterias; el otro
extremo de la bolsa recolectora se encuentra sellada para evitar la pérdida de gas. 47
La cáscara de arveja es un residuo útil en biorreactores para la producción de biogás
mediante la codigestión anaerobia con bacterias metanogénicas las cuales utilizan esta
materia orgánica lignocelulosica como fuente de carbono para su metabolismo. 48
Figura 9. Sistema de Biorreactores de generación de Biogás
Fuente: Autores
48
Los Biorreactores se establecieron en las siguientes relaciones:
Tabla 10. Composición de los reactores de producción de biogás.
REACTOR COMPOSICIÓN
Reactor MB I-II 10 g de cáscara de arveja + cepas aisladas
del género Methanobacterium
Reactor MCI-II 10 g de cáscara de arveja + cepas aisladas
del género Methanococcus
Reactor MC-MB 10 g de cáscara de arveja +bacteria aislada
del género Methanococcus + cepas aisladas
del género Methanobacterium
Fuente: Autores
2.9.2. Monitoreo de la Producción de Biogás
Se realizó el seguimiento de producción de biogás de las bacterias con la materia
lignocelulosica tres veces en la semana de la obtención del gas, y se midió tres veces el
volumen generado en cada semana de recolección utilizando las bolsas de propileno
estériles.
Tabla 11. Protocolo de medición de producción de biogás
Semana de medición de
gas
Días de codigestión
anaerobia
Reactor
Primera semana 7 días MB y MC
Segunda semana 15 días MB, MC y MC-MB
Tercera semana 20 días MB, MC y MC-MB
Fuente: Autores
49
2.9.3. Determinación de la concentración de Biogás producido en el biorreactor por
materia lignocelulosica y bacterias metanogénicas aisladas.
La medición del gas producido fue realizada en el laboratorio de Electroanalítica y
Bioenergía de la Universidad Técnica de Machala, por medio del cromatógrafo de gases
marca FULI 9790II.
En el análisis de la composición del biogás se utilizó el hidrógeno como gas portador, a
una temperatura de 250° C en el horno e inyector y el detector de ionización de llama
(FID) a una temperatura de 350°C.
Se realizó una curva de calibración con Metano y Dióxido de Carbono siendo estos
patrones referenciales. Las lecturas del volumen del gas generado se realizaron por
triplicado.
2.10. Análisis Estadístico de los Resultados.
El análisis cuantitativo de resultados se realizó en el software de Excel 2018.
50
CAPÍTULO III
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los medios de diferenciación para bacterias metanogénicas Barker-Taha
(Methanobacterium) y Standman-Barker (Methanococcus) en caldo y en agar indicaron
el crecimiento positivo bacteriano en el aislamiento debido a que estos agares contienen
los sustratos de nutrición que requieren este tipo de bacterias para su metabolismo y
reproducción en las condiciones controladas de anaerobiosis.
El aislamiento microbiológico sugiere que las bacterias aisladas tienen las características
similares a la morfología colonial de arqueas metanógenas descrita en la literatura;
mediante la observación macroscópica.49 El Agar MB sin inóculo es un medio amarillento
pálido (figura 10) y el MC es un medio verde (figura 12).
Luego de 15 días con una incubación en jarra de anaerobiosis por extinción con vela se
observó los cambios en el proceso de aislamiento obteniéndose las siguientes
características evidenciadas en la Tabla 12.
Figura 10. Medio Barker-Taha sin inóculo
Fuente: Autores
En la figura 11 del Agar MB se presentan colonias con formas irregulares y tamaños
variados con una superficie rugosa de bordes enteros que al reflejo de la luz brillan,
poseen un aspecto húmedo denotando una elevación convexa; el color de las colonias en
este medio en los primeros días fue blanco debido a la precipitación del carbonato de
sodio y al final del aislamiento se produce el oscurecimiento del medio por la presencia
de H2S y otros gases, por lo antes mencionado las colonias adquieren una coloración café.
51
Figura 11. Medio Barker-Taha con crecimiento bacteriano.
Fuente: Autores
En la figura 13 del Agar MC se observó la presencia de colonias irregulares y puntiformes
pequeñas con superficie lisa de elevación plana y consistencia cremosa, también poseen
bordes filamentosos irregulares que provocan al reflejo de la luz un aspecto brillante
translúcido, características representadas en la tabla 12. La coloración de las colonias a
los 6 días de siembra fue de color blanquecina lechosa y al cumplir los 15 días de
incubación tomaron un color amarillo pálido.
Figura 12. Medio Standman-Barker sin inóculo.
Fuente: Autores
52
Figura 13. Morfología colonial en el medio Standman-Barker
Fuente: Autores
Tabla 12. Morfología Colonial de las Bacterias Metanogénicas Aisladas en Medio
sólido.
Agar MB Características Agar MC Características
Tamaño Grandes Tamaño Pequeña
Forma Irregular Forma Irregular-
Puntiforme
Luz Transmitida Translúcida Luz
Transmitida
Translúcido
Luz Reflejada Brillante Luz
Reflejada
Brillante
Superficie Rugoso Superficie Lisa
Borde Entero Borde Filamentoso-
Irregular
Aspecto Húmedo Aspecto Húmedo
Color Blanco-café Color Blanco-amarillo
pálido
Elevación Convexo Elevación plana
Consistencia Pegajosa Consistencia Cremosa
Fuente: Autores
53
El recuento de colonias en placa se indica en la Tabla 13, se muestra el promedio de
crecimiento bacteriano de 730 UFC/mL para el género Methanococcus y 896,25 UFC/mL
para el género Methanobacterium, demostrando en la Figura 14 que entre los dos géneros
existe un mayor crecimiento por parte del género Methanobacterium. Los resultados se
presentan en la Tabla 24 del Anexo L.
Tabla 13. Recuento de UFC/mL de metanobacterias en Placa
GÉNERO BACTERIANO RECUENTO TOTAL
UFC/mL
Methanococcus 730 UFC/ml
Methanobacterium 896,25 UFC/ml
UFC: Unidad Formadora de Colonia
Fuente: Autores
Figura 14. Recuento de UFC/mL de metanobacterias.
Fuente: Autores
La evaluación del crecimiento bacteriano también se realizó en caldo, donde se pudo
verificar la presencia de bacterias metanogénicas, en la figura 16 del Caldo MB la
presencia de sedimento, producción de gas y turbidez del medio cambiante su coloración
de amarillo claro a amarillo pardo, resultados de la tabla 14, que fueron obtenidos de la
siembra en las mismas condiciones de incubación.
54
Tabla 14. Morfología Colonial de las Bacterias Metanogénicas Aisladas en Caldo.
MB Resultado MC Resultado
Sedimento Positivo Sedimento Positivo
Producción de
Gas
Positivo Producción de
Gas
Positivo
Película Negativo Película Positivo
Turbidez Positivo Turbidez Positivo
Fuente: Autores
Figura 15. Medio Barker-Taha en caldo sin inóculo.
Fuente: Autores
Figura 16. Medio Barker-Taha en caldo, producción de gas en tubo Durham.
Fuente: Autores
55
En la figura 18 del Caldo MC se observó la presencia de una película o velo superficial,
sedimento, producción de gas mediante la observación de espacio vacío en los tubos
Durham y la turbidez del medio mediante las variantes de coloración representada en la
tabla 14 a los 10 días de incubación en atmósfera de anaerobiosis.
Figura 17. Medio Standman-Barker en caldo sin inóculo.
Fuente: Autores
Figura 18. Medio Standman-Barker en caldo sin inóculo.
Fuente: Autores
En la figura 15 y 17 se muestran los caldos del medio Standman-Barker y Barker-Taha
donde se evidencias las características antes de la siembra. El recuento de colonias en
Caldo, se realizó con la técnica del número más probable en donde se obtuvo el
crecimiento óptimo de metanógenos, las cepas Methanococcus presentaron 6730 UFC en
100 mL de medio inoculado y las cepas Methanobacterium 7800 UFC en 100 mL,
56
mismos valores representados en la tabla 15 y Figura 19. Los resultados del análisis
también se presentan en la tabla 25 del Anexo L.
Figura 19. Recuento de colonias metanógenas, técnica del número más probable
Fuente: Autores
Tabla 15. Recuento de colonias metanógenas, técnica del número más probable
GÉNERO BACTERIANO Índice del NMP por
100 mL
Methanococcus 6730 UFC/100mL
Methanobacterium 7800 UFC/100mL
UFC: Unidad Formadora de Colonia
Fuente: Autores
La evaluación macroscópica de la morfología colonial en los agares y en caldo permitió
comprobar el óptimo crecimiento bacteriano de metanógenos en las muestras analizadas
del sedimento del Estero el Macho de la ciudad de Machala. También se corrobora que
las bacterias metanogénicas utilizan CO2, H2, formiato y acetato para su codigestión
anaerobia. Las metanobacterias desprenden un olor característico putrefacto, producto del
gas sulfhídrico, el cual se hallaba presente en formas de burbujas en cajas y tubos.
6000 6500 7000 7500 8000
Methanococcus
Methanobacterium
Recuento de UFC/ mL de bacterias Metanogenicas en Caldo por NMP(Numero mas probable) por 100 mL
57
La fenotipificación se identificó por microscopía óptica, con tinción de Gram se logró
reconocer las características morfológicas de las bacterias metanogénicas. Se observó en
el caldo MB la presencia de estreptobacilos, diplobacilos y bacilos Gram positivos.
Mientras que, en la identificación de medio sólido, después de haber realizado una
suspensión (pico máximo de concentración de una cepa), se observó el crecimiento de
bacilos y estreptobacilos Gram positivos que no habían podido ser observados en
muestras directas.
Figura 20. Morfología Microscópica de Methanobacterium en la Tinción de Gram
aisladas en medio sólido
Fuente: Autores
Figura 21. Morfología Microscópica de Methanobacterium en la Tinción de Gram
aisladas en caldo.
Fuente: Autores
58
En las figuras 20 y 21 se pueden observar morfologías bacilares en medio sólido y en caldo
del género Methanobacterium, las cuales contienen pseudomureina y no son móviles. El
análisis del conteo en placas de observación microscópica, por sitio de muestreo, generó
un 68 % en frecuencia relativa de estreptobacilos en medio sólido, indicando entre todos
los sectores estudiados que las cepas que fueron aisladas de la muestra que proviene del
Barrio los Sauces I se encontraba con mayor cantidad de bacterias.
Así mismo, se contabilizó un 74% en frecuencia relativa de estreptobacilos en caldo,
muestra que provino del muestreo cerca de la planta de Asfalto en el Barrio Rayito de Luz,
indicando de la misma manera que esta muestra contenía mayor cantidad de bacterias que
las otras en estudio.
En la figura 22 se pueden apreciar los resultados de la cuantificación microscópica en
donde se reflejan las muestras con predominios bacterianos en caldo y agar del medio
Barker-Taha para el género Methanobacterium, mismos valores que se encuentran
tabulados en las tablas 28 y 29 del anexo L.
Figura 22. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de
Gram en el medio Agar Barker-Taha.
Fuente: Autores
En el Caldo MC también se observó la presencia de estos microorganismos productores
de CH4, en donde se produjo el crecimiento de estreptococos, diplococos y cocos Gram
negativos y en agar estableciendo una suspensión (pico máximo de concentración de una
59
cepa pura), se obtuvieron cocos y estreptococos con característica Gram negativa en todas
las muestras.
Figura 23. Morfología Microscópica de Methanococcus en la Tinción de Gram
aisladas en medio Sólido
Fuente: Autores
Figura 24. Morfología Microscópica de Methanococcus en la Tinción de Gram
aisladas en caldo.
Fuente: Autores
En las figuras 23 y 24 se pueden observar morfologías cocáceas en medio sólido y en caldo
del género Methanococcus, las cuales son motiles. El análisis del conteo en placas teñidas,
generó un 67 % en frecuencia relativa cocos en medio sólido entre todas las muestras
analizadas, bacterias que fueron aisladas de la muestra que proviene del Barrio los Sauces
I. Así mismo, se produjo un 60 % en frecuencia relativa de cocos en caldo, predominando
las bacterias de la muestra que provino del mismo sector antes mencionado. Además, en la
60
Figura 25 se pueden apreciar los resultados de la cuantificación microscópica del medio
Standman-Barker para el género Methanococcus, mismos valores que se encuentran
tabulados en las Tablas 26 y 27 del Anexo L.
Figura 25. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de
Gram en el medio Agar Standman-Barker.
Fuente: Autores
Generalmente las bacterias del género Methanobacterium suelen observarse en formas de
bacilos largos o cortos y las del género Methanococcus en forma de cocos irregulares
según lo que data la literatura. Sin embargo, la variación morfológica de las bacterias
aisladas puede ser a causa de la difícil adaptación y reproducción de estos
microorganismos in vitro.
El análisis de la identificación fenotípica según el recuento microscópico de la morfología
bacteriana sugiere que el predominio morfológico de las bacterias aisladas en el Estero el
Macho es el tipo cocáceas Gram negativas para el medio MC sólido y caldo, bacterias del
género Methanococcus. Así como estreptobacilar Gram Positivos para el medio MB
sólido y en caldo en el género Methanobacterium evidenciado en el conteo en placa,
obteniendo un promedio de todas las muestras en cada género. El análisis se presenta en
la tabla 30 del Anexo L.
La cuantificación general de las bacterias en el campo microscópico en cada muestra,
reporta altos índices de presencia de estos microorganismos en todas las muestras, pero
61
las del sector Rayito de Luz, planta de asfalto y en el sector Sauces I son las que contienen
mayores índices de carga metanogénica en el sedimento del estero El Macho.
Figura 26. Género de predominio en placas teñidas.
Fuente: Autores
Según la experimentación se puede ratificar que estas bacterias no colonizan solas en sus
entornos naturales, sino que su supervivencia depende del metabolismo simbiótico de
otras, las cuales les proporcionan nutrientes indispensables para la producción de energía,
convicción que se refleja al evaluar la coloración de Gram en muestras en directo de los
medios sólidos se reportan características morfológicas diferentes a lo reportado en la
literatura sobre microorganismos metanogénicos.
Los resultados de pruebas bioquímicas para la identificación fenotípica fueron
comparados con valores referenciales de las cepas Methanococcus deltae y
Methanobacterium ruminantium.
En la tabla 19 se muestran los resultados obtenidos del SIM Medio en donde se evalúa la
presencia de sulfuro de hidrógeno en las cepas aisladas de los géneros Methanobacterium
y Methanococcus, así como se demuestra que estas son móviles y no rompen el indol del
triptófano debido a que no se muestra la coloración roja en la superficie.
62
Tabla 16. Resultados Prácticos del SIM Medio - Methanococcus Aisladas
MUESTRAS
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
SH2 MOVILIDAD INDOL
Cepa de referencia Methanococcus deltae + + -
Cepa de referencia Methanobacterium
ruminantium
+ + -
Methanococcus Muestra I + + -
Muestra II + + -
Methanobacterium Muestra I + + -
Muestra II + + -
Fuente: Autores
Figura 27. Presencia de H2S, turbidez del medio y cepas móviles, sin cambio de
color ante el reactivo Kovac`s respectivamente.
Fuente: Autores
En la Tabla 17 se manifiesta que las cepas aisladas en ambos géneros de bacterias
metanogénicas desdobla el citrato de sodio a piruvato y oxalacetato que en medio alcalino
dan origen a ácidos orgánicos que son usados como fuentes de carbono, el color azul es
indicativo del citrato permeasa.
63
Tabla 17. Resultados Prácticos del Agar Citrato De Simmons
Muestra
PRUEBAS
BIOQUÍMICAS
VERDE AZUL
Cepa de referencia Methanococcus deltae - +
Cepa de referencia Methanobacterium ruminantium - +
Methanobacterium Muestra I - +
Muestra II - +
Methanococcus Muestra I - +
Muestra II - +
Fuente: Autores
Figura 28. Índice de Alcalinidad, viraje azul
Fuente: Autores
En la tabla 18 se describe la reacción de la muestra ante el agar Hierro Triple azúcar,
donde se produjo la acidificación del medio donde se confirma la fermentación de
glucosa, razón por la cual se produjo un color rojo en el pico y en el fondo amarillo en las
muestras del género Methanobacterium. En cuanto al género Methanococcus también se
produjo la misma reacción que indica la fermentación de glucosa siendo el resultado K/A,
pico alcalino-fondo acido. La producción de gas es positiva para Methanobacterium y
Methanococcus ya que se observa un espacio producido en el tubo y la presencia de SH2
64
ya que la muestra se volvió de color negro por lo que se produjo una reducción de sales
de hierro en ambas muestras de ambos géneros. Ilustración de resultados en la Figura 29,
Tabla 18.
Tabla 18. Resultados Prácticos del Agar TSI
MUESTRA PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Pico/Fondo Producción
de Gas
H2S
Cepa de referencia Methanococcus deltae
ATTC 35294
K/A + +
Cepa de referencia Methanobacterium
ruminantium ATTC 35063.
K/A + +
Methanobacterium Muestra I K/A + +
Muestra II K/A + +
Methanococcus Muestra I K/A + +
Muestra II K/A + +
Fuente: Autores
Figura 29. Reacciones de fermentación de azúcares. Ennegrecimiento del medio
indicativo de H2S. Presencia de gases
Fuente: Autores
65
La tabla 19 indica el estudio en caldo de urea, para el género Methanobacterium y
Methanococcus muestras I y II respectivamente, mantuvieron una coloración rosada en
la superficie lo cual es positiva, siendo esta bacteria capaz de romper la urea, quien
participa en el proceso de descomposición inorgánica. Resultado plasmado en la Figura
30.
Tabla 19. Resultados Prácticos de Caldo de Urea.
Muestra
PRUEBAS
BIOQUÍMICAS
Caldo de Urea
Cepa de referencia Methanococcus deltae ATTC
35294
+
Cepa de referencia Methanobacterium ruminantium
ATTC 35063.
+
Methanobacterium Muestra I +
Muestra II +
Methanococcus Muestra I +
Muestra II +
Fuente: Autores
Figura 30. Resultado Positivo en caldo ureasa.
Fuente: Autores
66
En el análisis cromatográfico de la composición del biogás producido por las bacterias
aisladas del género Methanococcus y Methanobacterium se evalúo la capacidad de estas
bacterias para generar metano y dióxido de carbono. Para lo cual, a través de un patrón
de una mezcla gaseosa de 5187 ppm de CH4 y 1025 ppm de CO2 presentado en la Figura
30, se estableció que, los tiempos de retención se encontraron entre los 4.50 min para CH4
y entre 10.58 min para CO2 respectivamente. Tabla 20.
Una vez obtenido los tiempos de retención de los gases antes mencionados se procedió a
cuantificar la composición del biogás obtenido a partir de los biorreactores preparados
con las cepas metanógenas aisladas.
Tabla 20. Contenido de CH4 y CO2 obtenido de la muestra Patrón
SEÑAL COMPONENTE TIEMPO DE
RETENCIÓN
CONTENIDO ÁREA DE
PICO (𝝁𝑽/𝒔)
AREA
(%)
4 CH4 4.50 40.47 36089.8 40.47
5 CO2 10.58 35.64 31818.3 35.64
Fuente: Autores
Figura 31. Patrón de una mezcla gaseosa de CH4 y CO2.
Fuente: Autores
67
Se muestra en las figuras A y B los cromatogramas del Biogás obtenido del Reactor I de
bacterias Metanogénicas del género Methanococcus. Indicándose en la Tabla 21 que en
los tiempos de retención del Reactor MC son 4.41 minutos para CH4 y de 10.55 minutos
para CO2, en los cuales hay una concentración de 0.20 % de CH4 y 22.87% para CO2
generados en la primera semana de digestión anaerobia. El pico de la figura 31 A
representa el pico verde de la figura 32 B.
Tabla 21. Contenido de CH4 y CO2 obtenido del Reactor MC y MB en la primera
semana de producción de biogás
TRATAMIENTO C%
CH4
ÁREA DE
PICO
(µV/s)
CH4
C%
CO2
ÁREA
DE
PICO
(µV/s)
CO2
DÍAS
DE
Co-A
TR
CH4
TR
CO2
Methanococcus 0,2 3325.4 22.87 377633.4 7 4.41 10.55
Methanobacterium 0,63 3325.4 28.10 347999.5 7 4.40 10.49
*C= concentración * TR=Tiempo de Retención * Co-A= Cogestión Anaerobia
Fuente: Autores
También se visualiza en la figura 32 los cromatograma del Biogás obtenido del Reactor I
de bacterias Metanogénicas del género Methanobacterium, Figuras C y D, que indican
entre los 4.40 minutos para CH4 y de 10.49 minutos para CO2 las concentraciones de 0.63
% de y 28.10% para CH4 y CO2 respectivamente, generados en la primera semana de
digestión anaerobia. Según la tabla se interpretó que las muestras analizadas del Reactor
MB pertenecientes al género Methanobacterium tienen mayor contenido de gas metano
comparando el resultado de los cromatogramas de la figura 32, B y D.
68
Figura 32. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos
Methanococcus y Methanobacterium en la primera semana.
Fuente: Autores
En la segunda semana de producción de gas se obtuvo en el Reactor MC, las
concentraciones de 2.11 % y 10.97 % para CH4 y CO2 respectivamente, y en el Reactor
MB concentraciones de 2.57% para CH4 y 15.73 para CO2 generados en los tiempos de
retención establecidos según el patrón antes mencionado. Los valores de los resultados se
encuentran plasmados en la tabla 22. Además, se estima que el género
Methanobacteriaceae continúa generando mayor cantidad de CH4 demostrado según el
cromatogramas de la figura 33 H.
69
Figura 33. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos
Methanococcus y Methanobacterium en la segunda semana.
Fuente: Autores
Tabla 22. Contenido de CH4 y CO2 obtenido del Reactor MC y MB en la segunda
semana de producción de biogás
TRATAMIENTO C%
CH4
TR
CH4
ÁREA
DE
PICO
(µV/s)
CH4
C %
CO2
ÁREA
DE
PICO
(µV/s)
CO2
TR
CO2
DÍAS
DE
Co-A
Methanococcus 2,11 4.91 4011,9 10,97 24020,7 10.90 15
Methanobacterium 2,57 4.90 2019,2 15,73 12339,1 10.95 15
Methanococcus-
Methanobacterium 5,08 4.42 14061,5 72,44 11478,5 10.56 15
*C= concentración * TR=Tiempo de Retención * Co-A= Cogestión Anaerobia
Fuente: Autores
70
Figura 34. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos
donde se encuentran ambas cepas en codigestión anaerobia de 15 días.
Fuente: Autores
En la tercera semana de producción de biogás se obtuvo en el Reactor MC, las
concentraciones de 3.81 % y 24.33 % para CH4 y CO2 respectivamente, figura 35 K y L.
En el Reactor MB concentraciones de 7.64 % para CH4 y 70.84 para CO2 generados en
los tiempos de retención establecidos según el patrón antes mencionado. Figura 34 M y
N. Los valores están representados en la tabla 23.
Tabla 23. Producción de biogás en la tercera semana de codigestión anaerobia
TRATAMIENTO C%
CH4
TR
CH4
ÁREA
DE
PICO
(µV/s)
CH4
C%
CO2
TR
CO2
ÁREA
DE
PICO
(µV/s)
CO2
DÍAS
DE
Co-A
Methanococcus 3,81 4.50 56349,2 24,33 10.50 359472
,1
20
Methanobacterium 7,64 4.44 25401,4 70,84 10.83 235304
,1
20
Methanococcus-
Methanobacterium
9,03 4.47 10071,5 29,35 10.60 32699,
4
20
*C= concentración * TR=Tiempo de Retención * Co-A= Cogestión Anaerobia
Fuente: Autores
71
Figura 35. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos
Methanococcus y Methanobacterium en la tercera semana.
Fuente: Autores
Figura 36. Cromatogramas de la producción de gas del Reactor de metanógenos
donde se encuentran ambas cepas en codigestión anaerobia de 20 días.
Fuente: Autores
72
Los resultados cromatográficos del biogás producido establecen la relación bacterias
aisladas/ materia orgánica lignocelulosica, producción de metano, donde se puede
interpretar que entre mayor sea el tiempo de codigestión anaerobia y temperatura mayor
será la cantidad de biogás producido, lo cual se demuestra en la concentración obtenida
en la última semana de medición.
También podemos interpretar que el área de pico de dióxido de carbono es mayor que la
de metano indicando así, que la concentracion de CO2 es mayor para ambos géneros en
el proceso de codigestion anaeróbica de metanógenos aislados según los cromatogramas
analizados.
Las mediciones de CO2 indicaron que las bacterias metanogénicas también producen
grandes cantidades de este gas, según los cromatogramas analizados, con el tiempo de
retención del patrón, se demuestra que de la misma manera que en Metano, las bacterias
del genero Methanobacterium generan grandes porcentajes de CO2.
Además, se definió que el Reactor en donde se encontraban inoculadas las cepas de ambos
géneros, produjo mejores resultados de CH4 con un 9.03 % en la tercera semana de
producción evidenciados en la tabla 23.
Las bacterias del género Methanobacterium muestran mayor productividad de metano
según nuestra investigación, además esto se corrobora con los resultados obtenidos de
Mauerhofer y Reischl que establecen la producción de un 97% de metano biológico a
partir de esta especie. 50
Según el Anexo 1 de la Normativa INEN del Libro VI donde se establece la Norma de
Calidad Ambiental de descargas de efluentes del recurso Agua, del Texto Unificado de la
segunda Legislación del Ministerio de Ambiente, se puede evidenciar que no existe
parámetro de calidad que especifiqué el control de las bacterias metanogénicas.51 En los
límites máximos permisibles para descargas a un cuerpo de agua marina como es el Estero
el Macho, solamente se establecen los indicadores de bacterias coliformes fecales y DBO.
52 La Demanda Bioquímica de Oxígeno enmarca una estimación del consumo de oxígeno
de una población de microorganismo. Los lodos activados poseen una composición
bacteriana diversa, dentro de la cual pueden existir bacterias, hongos y protozoarios, por
lo antes mencionado es necesario establecer un parámetro que controle estos
microorganismos patógenos de alta peligrosidad para el medio ambiente y la salud
poblacional.53
73
CAPÍTULO IV
4. CONCLUSIONES
En esta investigación se aisló bacterias metanogénicas pertenecientes a los
géneros Methanobacterium spp., y Methanococcus spp., evidenciado en el
crecimiento bacteriano en los medios de cultivo selectivos, Baker-Taha y
Standman-Barker. Se confirmó que estos microorganismos son de crecimiento
lento debido a que su proliferación se dio en 15 días.
La identificación de las especies se dio con un porcentaje de fiabilidad de 95% a
partir del reconocimiento morfológico microscópico de estreptobacilos para el
género Metanobacterium y cocos para el género Methanococcus.
La fenotipificación mediante pruebas bioquímicas se confirmó según las cepas
referenciales en SIM medio, Caldo de urea, Citrato de Simmons y Hierro triple
Azúcar, presentando resultados positivos en ambos géneros de bacterias
metanogenas.
La producción de metano en biorreactores fue de 9 % a escala piloto, a partir de
10g de cáscara de arveja más el inóculo de las dos especies en estudio en conjunto.
La especie que dio índices de mayor crecimiento fue la del género
Methanobacteriaceae en medio y caldo de cultivo, así como en recuento
morfológico en placa. Además, fue la cepa que rindió la mayor producción de gas
metano en los biorreactores.
74
CAPÍTULO V
5. RECOMENDACIONES
● Consideramos que para el reconocimiento morfológico sería más factible el
conteo de bacterias metanogénicas por medio de un microscopio de lámpara de
alta precisión de mercurio epifluorescente con el acoplamiento de cámaras de
Newbauer donde se utiliza la capacidad de estos microorganismos metanógenos
hidrogenotróficos de ser autoflorecientes bajo una luz de 420nm de longitud de
onda, debido a que estos poseen la coenzima 420F que produce esta diferencia
metabólica actuando como un fluoróforo.
● Para mejorar los rendimientos de producción de biogás, es recomendable
aumentar la materia lignocelulosica tras la medición en cada semana de
producción, aumentando la codigestión y por ende el contenido de CH4 y CO2.
● Difundir los resultados obtenidos de la investigación para que se realicen más
estudios sobre metanógenos anaerobios que pudieran habitar el Estero para que a
nivel local, se tomen acciones diligentes que colaboren al tratamiento de estos
lodos activados que tienen alta peligrosidad y toxicidad para el ser humano y el
medio ambiente.
75
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82
ANEXOS
EVIDENCIA FOTOGRÁFICA
Anexo A. Toma de muestra de sedimento en Estero El Macho
Fuente: Autores
83
Anexo B. Agares para la Identificación fenotípica
Fuente: Autores
84
Anexo C. Dispensación de agares MB y MC.
Fuente: Autores
85
Anexo D. Almacenado de muestras inoculadas en jarra de anaerobiosis por
extinción vela. Atmósfera libre de O2.
Fuente: Autores
86
Anexo E. Dispensación de agar TSI, Agar SIM medio, Citrato de Simmons agar y
Urea para la realización de pruebas bioquímicas.
Fuente: Autores
87
Anexo F. Proceso de tinción de Gram.
Fuente: Autores
88
Anexo G. Armado de biorreactores para la producción de gas metano.
Fuente: Autores
89
Anexo H. Observación Microscópica
Fuente: Autores
90
Anexo I. Cromatógrafo de Gases FULI
Fuente: Autores
91
Anexo J. Autoclave
Fuente: Autores
92
Anexo K. Microscopio OLYMPUS.
Fuente: Autores
93
Anexo L. Tabulaciones de los resultados de análisis microbiológicos.
Tabla 24. Recuento de Colonias en Agar mediante el conteo manual en placas.
GÉNERO
BACTERIANO
N° DE MUESTRA
RECUENTO DE
COLONIAS
1.1 1.2 1.3 TOTAL
UFC/mL
Methanococcus Muestra 1: Sector de la
Finca Bananera
506 465 687 553
Muestra 2: Frente a la
Planta de Asfalto de
Machala
968 1000 756 908
Muestra 3: Vergeles
Sector D
600 425 501 509
Muestra 4: Sauces I 869 1000 986 952
valor incontable = estimado 1000 P= 730
Methanobacterium Muestra 1: Sector de la
Finca Bananera
798 801 799 799
Muestra 2: Frente a la
Planta de Asfalto de
Machala
1000 1000 1000 1000
Muestra 3: Vergeles
Sector D
782 897 678 786
Muestra 4: Sauces I 1000 1000 1000 1000
valor incontable = estimado 10000 P= 896
*P=Promedio
Fuente: Autores
94
Tabla 25. Recuento de Colonias en Caldo mediante la técnica del Número más
Probable.
N° de muestra
Tubos con reacciones
positivas
Límite de
confiabilidad de
95% NMP
3
tubos
con
10
mL
3
tubo
s con
1 mL
3
tubo
s
con
0,1m
L
Índice
del NMP
por 100
mL
Inferior Superior
Muestra 1: Sector de
la Finca Bananera
3 3 1 460 90 2000
Muestra 2: Frente a la
Planta de Asfalto de
Machala
3 3 2 1100 180 4100
Muestra 3: Vergeles
Sector D
3 3 1 460 90 2000
Muestra 4: Sauces I 3 3 2 1100 180 4100
Methanoccoccus PROMEDIO 780
Muestra 1: Sector de
la Finca Bananera
3 3 1 460 90 2000
Muestra 2: Frente a la
Planta de Asfalto de
Machala
3 3 2 1100 180 4100
Muestra 3: Vergeles
Sector D
3 3 1 460 90 2000
Muestra 4: Sauces I 3 3 3 >1100 420 ----
Methanobacterium PROMEDIO 673
Fuente: Autores
95
Tabla 26. Promedio Morfológico de Bacterias Metanogénicas aisladas del medio
Agar Standman-Barker conteo en placas teñidas
N° de
muestra
Morfolo
gía
Microscó
pica
SÓLIDO CALDO Promedio
Morfológico Total
Conteo total
en placa
Conteo total
en placas
1.1 1.2 1.3 1.1 1.2 1.3 SÓLIDO CALDO
Muestra 1:
Sector de la
Finca Bananera
El Cornejo
Cocos 43 39 52 68 46 50 45 55
Diplococos 0 0 0 18 25 17 0 20
Estreptococos 52 44 38 21 19 35 45 25
Total 90 100
Muestra 2:
Frente a la
Planta de
Asfalto de
Machala
Cocos 98 92 86 77 83 65 92 75
Diplococos 0 0 0 20 17 26 0 21
Estreptococo
s
66 74 52 33 40 32
64 35
Total 156 131
Muestra 3: Vergeles
Sector D
Cocos 46 69 50 50 51 49 55 50
Diplococos 0 0 0 16 18 20 0 18
Estreptococo
s
41 46 45 35 30 25
44 30
Total 99 98
Muestra 4:
Sauces I
Cocos 97 99 98 92 88 90 98 90
Diplococos 0 0 0 42 40 38 0 40
Estreptococo
s
46 50 48 19 16 25
48 20
Total 146 150
Fuente: Autores
96
Tabla 27. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de
Gram en el medio Agar Standman-Barker
N° de
muestra
Morfología
Microscópica
Frecuencia en
placas teñidas
Frecuencia Relativa
Decimal Porcentaje
SÓLIDO CALDO SÓLIDO CALDO SÓLIDO CALDO
Muestra 1:
Sector de la
Finca
Bananera El
Cornejo
Cocos 85 60 0,57 0,48 57% 48%
Diplococos 0 40 0,00 0,32 0% 32%
Estreptococos 65 25 0,43 0,2 43% 20%
Total 150 125 1 1 100% 100
Muestra 2:
Frente a la
Planta de
Asfalto de
Machala
Cocos 62 65 0,58 0,59 58% 59%
Diplococos 0 21 0,00 0,19 0% 19%
Estreptococos 45 25 0,42 0,23 42% 23%
Total 107 111 1 1 100% 100%
Muestra 3:
Vergeles
Sector D
Cocos 65 65 0,60 0,58 60% 58%
Diplococos 0 18 0,00 0,16 0% 16%
Estreptococos 44 30 0,40 0,27 40% 27%
Total 109 113 1 1 100% 100%
Muestra 4:
Sauces I
Cocos 98 90 0,67 0,60 67% 60%
Diplococos 0 40 0,00 0,27 0% 27%
Estreptococos 48 20 0,33 0,13 33% 13%
Total 146 150 1 1 100% 100%
Fuente: Autores
97
Tabla 28. Promedio Morfológico de Bacterias Metanogénicas aisladas del medio
Agar Barker conteo-Taha en placas teñidas.
N° de
muestra
Morfología
Microscópica
SÓLIDO CALDO Promedio
Morfológico Total
Conteo total en
placa
Conteo total en
placas
1.1 1.2 1.3 1.1 1.2 1.3 SÓLIDO CALDO
Muestra 1:
Sector de la
Finca
Bananera El
Cornejo
Estreptobacilos 63 71 62 78 56 70 65 68
Diplobacilos 0 0 0 1 3 2 0 2
Bacilos 52 48 55 49 40 42 52 44
Total 117 114
Muestra 2:
Frente a la
Planta de
Asfalto de
Machala
Estreptobacilos 77 68 83 98 97 99 76 98
Diplobacilos 0 0 0 16 10 19 0 15
Bacilos 51 50 58 19 18 23 53 20
Total 129 133
Muestra 3:
Vergeles
Sector D
Estreptobacilos 67 71 63 39 50 49 67 46
Diplobacilos 0 0 0 1 3 2 0 2
Bacilos 51 47 58 35 34 27 52 32
Total 119 80
Muestra 4:
Sauces I
Estreptobacilos 97 99 95 85 73 82 97 80
Diplobacilos 0 0 0 2 1 3 0 2
Bacilos 45 43 47 59 46 51 45 52
Total 142 134
Fuente: Autores
98
Tabla 29. Frecuencia Relativa de la Morfología Microscópica en la Tinción de
Gram en el medio Barker-Taha
N° de
muestra
Morfología
Microscópica
Frecuencia en placas
teñidas
Frecuencia Relativa
Decimal Porcentaje
SÓLIDO CALDO SÓLIDO CALDO SÓLIDO CALDO
Muestra 1:
Sector de la
Finca
Bananera
El Cornejo
Estreptobacilos 65 68 0,56 0,60 56% 60%
Diplobacilos 0 2 0,00 0,02 0% 2%
Bacilos 52 44 0,44 0,39 44% 39%
Total 117 114 1 1 100% 100%
Muestra 2:
Frente a la
Planta de
Asfalto de
Machala
Estreptobacilos 76 98 0,59 0,74 59% 74%
Diplobacilos 0 15 0,00 0,11 0% 11%
Bacilos 53 20 0,41 0,15 41% 15%
Total 129 133 1 1 100% 100%
Muestra 3:
Vergeles
Sector D
Estreptobacilos 67 46 0,56 0,58 56% 58%
Diplobacilos 0 2 0,00 0,03 0% 3%
Bacilos 52 32 0,44 0,40 44% 40%
Total 119 80 1 1 100% 100%
Muestra 4:
Sauces I
Estreptobacilos 97 80 0,68 0,60 68% 60%
Diplobacilos 0 2 0 0,01 0% 1%
Bacilos 45 52 0,31 0,39 32% 39%
Total 142 134 1 1 100% 100%
Fuente: Autores
99
Tabla 30. Resultados cuantitativos y semicuantitativos de bacterias metanogénicas
en todos los campos de observación de la tinción de Gram.
GÉNERO
BACTERI
ANO
N° DE
MUESTRA
SÓLIDO CALDO
GRAM SC PTC GRAM SC PTC
Met
han
oco
ccu
s
Muestra 1:
Sector de la
Finca Bananera
- +++ 90 - +++ 100
Muestra 2:
Planta de
Asfalto de
Machala
- Campo
lleno
156 - Campo
lleno
131
Muestra 3:
Vergeles Sector
D
- +++ 99 - +++ 98
Muestra 4:
Sauces I
- Campo
lleno
146 - Campo
lleno
150
Met
han
obact
erIu
m
Muestra 1:
Sector de la
Finca Bananera
+ +++ 117 + +++ 114
Muestra 2:
Frente a la
Planta de
Asfalto de
Machala
+ Campo
lleno
129 + Campo
lleno
133
Muestra 3:
Vergeles Sector
D
+ +++ 119 + +++ 80
Muestra 4:
Sauces I
+ Campo
lleno
142 + Campo
lleno
134
* SC=SEMI- CUANTIFICACIÓN
*PTC= PROMEDIO DE TODOS LOS CAMPOS
Fuente: Autores
100
Anexo M. Tabla del número más probable (NMP)
Fuente: Norma Mexicana NMX-AA-42-1987
101
Anexo N. Tabla de Limites de descarga a un cuerpo de agua marina.
Fuente: Anexo 1 del Libro del Texto Unificado de Legislación Secundaria del Ministerio
del Ambiente: Norma de Calidad Ambiental y de Descarga de Efluentes al Recurso Agua