UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA148.206.53.84/tesiuami/UAMI11748.pdf · primitivo. Moore6 3. Las...
Transcript of UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA148.206.53.84/tesiuami/UAMI11748.pdf · primitivo. Moore6 3. Las...
UNIVERSIDAD AUTÓNOMAMETROPOLITANA
UNIDAD: IZTAPALAPA
DIVISIÓN: CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD (C.B.S)
TÍTULO DEL TRABAJO: EVALUACIÓN DE LA VIABILIDADDE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS CRIOPRESERVADASPOR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
NOMBRE DEL PARTICIPANTE: FERNÁNDEZ NOVALES ISRAEL
DIRECCIÓN ELECTRÓNICA: [email protected],[email protected]
NOMBRE Y FIRMA DE LOS ASESORES:
DR. RODOLFO VELAZCOLEZAMA
ASESOR INTERNO
M. en C. MA. DE LOSDOLORES OCHOA
DELGADOASESOR EXTERNO
LUGAR Y FECHA DE REALIZACIÓN: HOSPITAL JUÁREZDE MÉXICO, SECRETARÍA DE SALUD. 17/Sep/2003 –21/Jul/2004
ÍNDICE
CONTENIDO Pág
s
CAPITUO I. EMBRIOLOGÍA DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO1.1 Antecedentes..............................................................................................
.........
1.1.1Históricos.........................................................................................................1.1.2Embrionarios...................................................................................................
CAPÍTULO II.HEMATOPOYESIS.............................................................................2.1 Línea
eritroide.....................................................................................................2.2 Líneablanca........................................................................................................2.2.1 Granulocitos o
polimorfonucleares..............................................................2.2.1.1Neutrófilos....................................................................................................2.2.1.2 Eosinófilos
...................................................................................................2.2.1.3Basófilos.......................................................................................................2.2.1.4Mastocitos....................................................................................................
2.2.2.Mononucleares...............................................................................................2.2.2.1
11
2
78
10111315
16181819
21222324
282929
3233
34
Monocitos.....................................................................................................2.2.3
Linfocitos.........................................................................................................2.2.3.1 LinfocitosT..................................................................................................2.2.3.2 Linfocitos
B..................................................................................................2.2.4 Megacariocitos ytrombocitos.......................................................................
CAPÍTULO III. CULTIVOS DE CÉLULAS DE LA LÍNEABLANCA.........................3.1 Diferentescultivos.............................................................................................
3.1.1 Semi-sólido......................................................................................................3.1.2Metilcelulosa....................................................................................................
3.1.3Líquido.............................................................................................................
CAPÍTULO IV. CRIOPRESERVACIÓN
CELULAR...................................................
CAPITULO V. UTILIDAD DE LAS CÉLULASHEMATOPOYÉTICAS.....................
CAPÍTULO VI.JUSTIFICACIÓN...............................................................................
CAPÍTULO VII.
36
39
40
41
42
434547
47
48
74
75
OBJETIVOS.....................................................................................
CAPÍTULO VIII.HIPÓTESIS.....................................................................................
CAPÍTULO IX.
MATERIAL........................................................................................
CAPÍTULO X.METODOLOGÍA................................................................................
10.1 Cultivo de células hematopoyéticas de la líneablanca...............................10.2Viabilidad..........................................................................................................
10.3 Unidades Formadoras deColonias................................................................
CAPÍTULO XI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
.........................................................
CAPÍTULO XII.CONCLUSIONES.............................................................................
CAPÍULO XIII.BIBLIOGRAFÍA.................................................................................
AGRADECIMIENTOS
Primeramente a Dios que me permitió vivir y haber terminado mi carrera, porque
Él es quien le da al hombre la capacidad de realizar y entender la ciencia y todo lo
que en ella implica.
A mis padres por haberme apoyado aún en las situaciones difíciles de mi vida, que
aunque con desvelos y con hambres recibí su gran amor y su gran esfuerzo para
con mis desvelos.
A mis hermanos por su apoyo cuando me sentía solo.
Al Dr. Jorge Cruz Rico, Jefe de Hematología del Hospital Juárez de México por
haberme brindado una oportunidad para realizar la presente tesis y haberme
presentado a la M. en C. Ma. de los Dolores Delgado Ochoa, Jefa del Laboratorio
de Histocompatibilidad del Hospital.
A la M. en C. Ma. de los Dolores Delgado Ochoa, que a pesar de las llamadas de
atención que recibí y presiones, puedo decir que todo su esfuerzo, conocimiento
hacia mi persona no fue en vano, ya que he entendido que la vida tiene un
proceso de enseñanza y que se aplica lo que uno aprende en el tiempo que la vida
te lo permite.
A los compañeros del laboratorio, la Q.F.B. Rosa María Farfán, M.O. Víctor Piña,
Q.F.B. Fernando Vidal y Q. Araceli Rivero y a la Sra. Ma. Victoria por haberme
soportado todo este tiempo que estuve con ustedes.
Al Dr. Rodolfo Velasco Lezama por haber aceptado ser mi asesor interno y por su
apoyo en el conocimiento adquirido durante el año de proyecto de investigación.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
1
CAPÍTULO I
EMBRIOLOGÍA DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO
1.1. ANTECEDENTES
1.1.1. HISTÓRICOS
Antes de definir ¿qué es la sangre? Hablaremos de la historia del como los científicos de
antaño veían a la sangre, desde que Hipócrates (469-399 a.C.) y Aristóteles (384-32 a.C.)
sostenían que el corazón daba origen a la sangre, vasos sanguíneos y de un calor innato que
daba lugar al pulso y al latido cardíaco. El médico anatomista Galeno (129-199 d.C.)
demostró mediante una vivisección del ventrículo izquierdo contenía sangre, pero pensó
que ésta pasaba al ventrículo derecho por unos orificios invisibles existentes en el tabique
intermedio. La contracción del corazón impulsaba la sangre hacia las arterias desde el
ventrículo izquierdo, mientras que el derecho permitía la salida de «vapores» de desecho.
La contradicción de esta teoría fue demostrada por el médico árabe Ibn an-Nafis (hacia
1205-1288), quien observó que la sangre viajaba del ventrículo derecho al izquierdo
pasando por los pulmones; pero sus ideas no tuvieron aceptación y cayeron en el olvido1.2.
Esto fue la base para que investigadores como George Hayem (1841-1933) en quien se le
reconoce por su gran obra sobre la sangre (Du Sang, 1889). Fue uno de los primeros que
estudiaron la hematología, que era desconocida cuando él comenzó a trabajar en 18753.
Antes que Hayem fueron Nasse, Andral, Virchow, Schultze, después de Hayem fueron
Ehrlich y Metchnikov (entre 1835-1892). El exponente más famoso de una época anterior
fue Arthur Pappenheim (1870-1916), quien fue autor de la Hematología morfológica
(1910) y editor de Folia hoematologia (1904-1916), Ehrlich (1898) quien clasificó a los
leucocitos y fue partidario del origen polifilético de los mismos a partir de células madre
individuales, teoría confirmada por Florence Sabin (1920 –1922)3.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
2
Estos estudios permitieron definir a la sangre como un tejido líquido que se desplaza de
forma constante a través del sistema circulatorio o vascular por medio de vasos
sanguíneos, por venas, vénulas, arterias y arteriolas. La sangre está compuesta por
eritrocitos, leucocitos, plaquetas y plasma, que circulan por el torrente sanguíneo a
diferentes órganos del cuerpo, transporta substancias absorbidas en el tubo digestivo y el O2
a los tejidos, así como el CO2 a los pulmones y otros productos metabólicos a los
riñones4, 5.
Los leucocitos, eritrocitos y plaquetas se hallan suspendidos en el plasma. El volumen
sanguíneo circulante total (en una persona sana) es aproximadamente el 8% del peso
corporal ó 5,600 ml en un hombre de 70 Kg. Cerca del 55% de este volumen sanguíneo es
plasma.
1.1.2 EMBRIONARIOS
Su origen procede desde la fecundación empezando el proceso de diferenciación celular, la
cual permite la formación de 3 principales capas del huevo o cigoto. La primera capa que se
forma es el endodermo, cuya función principal es dar origen a todos los órganos internos
del cuerpo, la segunda capa que se forma es el mesodermo donde se origina el sistema
cardiovascular, tejido sanguíneo (aproximadamente por la tercera semana de gestación). La
última capa que se forma, es el ectodermo, la cual va a dar origen a la piel, cabello,
vellosidades y demás. Como se muestra en la figura 1.
Figura 1. Se ilustra las capas embrionarias germinales primarias. Moore6
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
3
La capa que nos interesa con mayor detalle es la segunda, la embrionaria y principalmente
el mesodermo extraembrionario del saco vitelino (figura 2), donde se da origen a los vasos
sanguíneos comunicando tanto al tallo como al corion6.
Figura 2. Muestra la región donde se encuentra el mesodermo extraembrionario del saco
vitelino en el huevo o cigoto. Moore6
La insuficiente formación del sistema cardiovascular se relaciona con la falta de una
cantidad importante de vitelo en el huevo y saco vitelino. En consecuencia, hay una
necesidad de vasos que proporcionan nutrición y oxígeno al embrión desde la circulación
materna6.
La formación de sangre y vasos sanguíneos es de la manera siguiente: 6
1. Células mesenquimatosas, que se agrupan para formar masas y cuerdas aisladas,
conocidas como islotes sanguíneos, como se muestra en la figura 3.
Figura 3. Saco vitelino y parte del saco coriónico a los 18 días aproximadamente. Vista
dorsal de un embrión de 19 días, expuesto después de eliminar el amnios (lado izquierdo).
En el lado derecho es un corte transversal de los islotes sanguíneos. Moore6
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
4
2. Aparecen espacios dentro de los islotes.
Figura 4. Corte de los islotes sanguíneos, donde se muestra la luz de un vaso sanguíneo
primitivo. Moore6
3. Las células se distribuyen alrededor de la cavidad para formar el endotelio
primitivo.
Esquema 5. Nos muestra algunas células sanguíneas primitivas originadas en el endotelio.
Moore6
4. Los vasos aislados se fusionan para formar redecillas de conductos endoteliales.
Esquema 6. Unión de los vasos adyacentes para formar las redes del sistema circulatorio.
Moore6
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
5
5. Los vasos se extienden hacia las zonas adyacentes mediante yemas endoteliales
y su fusión con otros vasos que se forman de manera independiente.
Las células sanguíneas primitivas se derivan principalmente de las células endoteliales de
los vasos sanguíneos del saco vitelino y alantoides. La formación de la sangre se inicia en
el embrión hasta el segundo mes, lo que ocurre por primera vez en el hígado y más adelante
en bazo, médula ósea y ganglios linfáticos, mientras tanto, la sangre que está circulando en
el feto es procedente de la madre.
Durante la etapa embrionaria la sangre bien oxigenada vuelve desde la placenta por la vena
umbilical. La mitad de esta sangre pasa por el hígado y va a través del conducto venoso.
Después de una trayectoria corta por la vena cava inferior, la sangre entra en la aurícula
derecha del corazón6. Estas condiciones se mantienen así durante todo el tiempo de
gestación hasta que, a la hora del nacimiento las condiciones cambian y comienza a circular
la sangre de una manera cerrada (sin la ayuda de la vena umbilical)6.
Cuando se origina la sangre se inicia el proceso denominado hematopoyesis, por el cual se
van a producir elementos sanguíneos y que van a conformar los grupos en que se divide la
sangre.
La hematopoyesis comienza en etapas embrionarias (aproximadamente entre la 2ª y 6ª
semana de gestación), la cual tiene tres etapas:
- La primera fase se llama mesoblástica, en la cual se puede detectar la formación
de la sangre en el mesénquima del pedículo del tronco y en las áreas vecinas del
saco vitelino. Donde lo que surge son las células mesenquimales que se diferencian
para formar los hemocitoblastos (eritrocitos primitivos, como se muestra en la
figura 5) que se originan en los islotes sanguíneos, los cuales van ha sintetizar
hemoglobina que va a diferenciarlos en eritroblastos polimocromatófilos, donde
pierden la basofilia citoplasmática para originar eritrocitos primitivos; nuevamente
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
6
se vuelven a diferenciar para originar eritrocitos postnatales que retienen el
núcleo7, 8.
- La segunda fase de la hematopoyesis es mieloblástica, donde los eritroblastos
definidos pasan a ser eritroblastos anucleados (esto ocurre aproximadamente a los 2
meses de gestación) Luego aparecen en las sinosoides hepáticas los leucocitos
granulares y megacariocitos, para que en el 4º mes de gestación ya existan los vasos
sanguíneos. Una vez formado los vasos se desaparecen las células mesenquimales y
se diferencian en osteoblastos y células reticulares, donde se forman el estroma de la
médula ósea para dar origen a la formación de la sangre en la médula ósea
primitiva7, 8.
- La tercera fase es la mieloide, se inicia en el hígado y en el bazo después empiezan
a declinar estos órganos para producir la médula ósea, donde las células madre
hematopoyéticas son totalmente pluripotenciales. Estas células (madre) constituyen
un 0.2% del total de todas las células que se producen en la médula ósea,
requiriendo su diferenciación cuando así lo necesite el cuerpo7,8.
En el recién nacido el sistema hematopoyético está formado por el timo, bazo y ganglios
linfáticos. Tiempo después a los 2 meses la hematopoyesis se establece en la médula ósea6.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
7
CAPÍTULO II
HEMATOPOYESIS
La médula ósea: es un tejido especial que se encuentra llenando las cavidades que se
forman dentro de los huesos, tanto las que pueden quedar entre las láminas de tejido óseo
esponjoso como las que existen en la parte central de los huesos blandos. La médula ósea
puede ser de dos tipos; amarilla y roja. La roja tiene gran cantidad de vasos sanguíneos y la
amarilla es rica en grasa. Al final del embarazo todas las cavidades óseas del feto están
ocupadas por medula ósea roja, pero progresivamente disminuye, siendo sustituida por la
amarilla, de tal forma que en el adulto sólo la médula ósea roja se encuentra en los huesos
del tronco (esternón, costillas, vértebras, huesos en general) y en las partes próximales de
los huesos de las extremidades más próximas al tronco1,2.
Las células tallo o stem cells responden a citocinas que son glucoproteínas, que estimulan
cada línea celular de la médula ósea, las que se conocen como Factores Estimuladores de
Colonias (SCF), dan origen a las Unidades Formadoras de Colonias (CFU) e interleucinas
(IL, que son glucoproteínas) que actúan junto con los SCF y forman las líneas celulares 11,
ya sea mieloide o linfoide. Figura 7.
Figura 7. Proceso de la hematopoyesis. Internet 1.1
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
8
La línea mieloide se divide en dos grupos, células de la serie roja y serie blanca. La serie
roja se le conoce como eritrocitos y a la blanca como leucocitos.
2.1 LINEA ERITROIDE
Los eritrocitos transportan el oxígeno desde los pulmones a todo el cuerpo, el cual atraviesa
las membranas de los alvéolos pulmonares y es captado por la hemoglobina de glóbulos
rojos. Se sabe que existen valores normales de eritrocitos en diferentes etapas de la vida.
Como se muestra en la siguiente tabla 1.
Tabla 1. Valores normales de eritrocitos (Tomada de Ganong 4 e Internet 1.2).
Edad de la personaPromedio
millones/mL
Recién nacido
3 meses
4.0 a 5.0
3.2 a 4.8
l año 3.6 a 5.0
3 y 5 años 4.0 a 5.3
5 a los 15 años 4.2 a 5.2
Hombre adulto 4.5 a 5.0
Mujer adulta 4.2 a 5.2
La evolución del eritrocito en la médula ósea es la siguiente:
Figura 8. (Fases del eritrocito. Internet 1.2)
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
9
Proeritroblasto, es la célula más inmadura de la serie roja capaz de ser identificada
ópticamente como tal. Su tamaño es grande (20-25 µm) con un núcleo redondo central de
gran talla que ocupa la mayor parte de la célula, por lo que la relación núcleo-
citoplasmática es elevada. La cromatina muestra una estructura finamente reticulada, y
posee uno o dos nucléolos mal limitados. El citoplasma es intensamente basófilo debido a
su gran riqueza en polirribosomas, y queda reducido a una delgada franja perinuclear en la
que se aprecia una zona más clara, de forma semilunar, que corresponde al centrosoma de
la célula. En ocasiones presenta unas protusiones citoplasmáticas a modo de casquetes
bastante característicos de este estadio madurativo. En condiciones normales está
desprovisto de inclusiones y vacuolas (figura 8)9,10.
Eritroblasto basófilo, es una célula de menor tamaño que su precursor (16-18 µm), y al
igual que él posee un núcleo central, pero cuya cromatina es algo más madura,
observándose algunas condensaciones cromatínicas que ocultan el nucleolo a nivel óptico.
El citoplasma todavía tiene un color basófilo intenso. La relación núcleo-citoplasmática
disminuye progresivamente debido al rápido descenso del tamaño nuclear (Esquema 8)10.
Eritroblasto policromático, tiene un tamaño inferior (8-12 µm) y un núcleo redondo y
central, cuya cromatina está fuertemente condensada, tal como corresponde a una célula
madura. La relación núcleo-citoplasma alcanza el 25% celular. El citoplasma, va perdiendo
basofilia y adquiere una tonalidad gris rosada, acidófila, conferida por la hemoglobina. Es
la última célula eritroblástica con capacidad mitótica (Figura 8)10.
Eritroblasto ortocromático, tiene un tamaño pequeño (7-10 µm) con núcleo intensamente
picnótico y cromatina muy condensada de aspecto homogéneo. El citoplasma es acidófilo
que va aumentando su contenido hemoglobínico hasta adquirir la tonalidad propia del
hematíe maduro. Este eritroblasto ya no posee capacidad mitótica, aunque puede sintetizar
proteínas y hemoglobina. El núcleo, una vez finalizada su maduración, es liberado de la
célula por un mecanismo no del todo conocido, siendo éste posteriormente fagocitado por
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
10
las células del sistema fagocítico mononuclear de la médula ósea (figura 8)10. En todo este
proceso interviene la eritropoyetina (EPO), se produce en las células instersticiales del
peritubular renal o células tubulares renales11. Actúa como el regulador fisiológico más
importante de la eritropoyesis. La EPO regula así mismo el ritmo de maduración de los
precursores donde se encuentran los hematíes que son células que se tiñen de color púrpura
a consecuencia de poseer una mayor cantidad de RNA citoplásmico que persiste en ellos
(macrocitos policromáticos, figura 8)10. Las primeras células que responden a la
eritropoyetina son las unidades formadoras de eritrocitos granulosos (BFU-E) que son las
células primitivas; también se requiere de Unidades Formadoras de Colonias de Eritrocitos
(CFU-E) que son células ya maduras. Las interleucinas que requiere la eritropoyesis son:
IL-3, IL-4, IL-9 y factores de crecimiento para formar eritrocitos11.
2.2 LINEA BLANCA
Las células de la serie blanca se pueden agrupar teniendo en cuenta la forma del núcleo y
por la tinción diferencial de gránulos citosólicos con la tinción hematoxilina eosina.
La serie blanca se divide en:
- Polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y basófilos)
- Mononucleares (mastocitos, monocitos)
- Megacariocitos (Plaquetas)
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
11
2.2.1. Granulocitos o Polimorfonucleares 2,9. Internet 1.3
Figura 9. Fases de desarrollo Polimorfonucleares. Internet 1.2
El mieloblasto, es una célula de tamaño comprendido entre 15-20 µm, de forma redondeada
u oval y de contorno liso. El núcleo, de gran tamaño en relación con el diámetro celular, es
redondo y está provisto de una cromatina finamente reticulada, con dos ó tres nucléolos
visibles. El citoplasma, de color basófilo, aunque menos intenso que el del proeritroblasto,
es escaso y está desprovisto ópticamente de granulación y vacuolas. A nivel ultraestructural
puede detectarse mieloperoxidasa en el retículo endoplásmico y aparato de Golgi. (figura 9)
El promielocito, tiene un tamaño ligeramente superior al de su precursor ( 16-25 µm), y es
la célula mayor de la granulopoyésis normal. Su forma es redondeada u oval. El núcleo,
también de aspecto redondeado, se sitúa en posición algo excéntrica. La cromatina, algo
más densa, presenta todavía algún nucleolo visible al microscopio óptico. El citoplasma es
amplio y basófilo, y contiene un número variable de gránulos primarios o azurófilos, que se
disponen alrededor del núcleo dejando una zona más clara, la granular, que corresponde a
la zona centrosómica. La granulación azurófila toma una coloración rojo-violácea con las
tinciones habituales. Los promielocitos son citoquímicamente positivos a la
mieloperoxidasa, fosfatasa ácida, arilsulfatasa y naftol-ASD-cloro-acetatoesterasa. Su
contenido en mieloperoxidasa es responsable de la positividad con el negro Sudán. El
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
12
citoplasma posee glucógeno, detectable citoquímicamente con la tinción del ácido
peryódico de Schiff (PAS, figura 9)
A medida que progresa la maduración del promielocito, éste se transforma en mielocito,
célula redonda de tamaño entre 12 y 18 µm. El núcleo, también redondo, posee cromatina
condensada en cúmulos, de color violeta oscuro y sin nucleolo visible. El citoplasma que ha
perdido toda su basofilia, contiene un gran número de gránulos. A partir de este estadio
comienza la formación de la granulación secundaria específica (neutrófila, eosinofilia,
basofilia), que junto a la primaria persiste en todos los elementos de la serie (figura 9).
El metamielocito1,2 tiene un tamaño entre 10 y 15 m, y posee las mismas características
morfológicas del mielocito, exceptuando la forma del núcleo, el cual adopta un aspecto
reniforme al iniciar su identificación, con la parte convexa situada en la periferia celular y
la cóncava dirigida hacia el centrosoma. El núcleo está dotado de cromatina condensada en
numerosos cúmulos cromáticos. Esta célula ha perdido la capacidad mitótica (figura 9).
Al progresar en su maduración el metamielocito estrecha su núcleo que se transforma en
una banda delgada, tiene un tamaño inferior a la del metamielocito, con sus características
morfológicas idénticas a las de su precursor. La mayor parte de estas células se localizan en
la médula ósea, donde constituyen el compartimiento de reserva granulocítica medular. En
condiciones normales 2 al 5% de ellos pasan a la sangre periférica, aunque esta proporción
aumenta, entre otros, en los procesos infecciosos (figura 9).
Granulocitos segmentados se originan a partir de las bandas por segmentación nuclear, y
son los elementos maduros de la granulopoyésis. Circulan por la sangre periférica donde
ejercen sus funciones de fagocitosis y bacteriólisis. Según el tipo de granulación específica
se identifican los neutrófilos, eosinófilos y basófilos (figuras 10, 11 y 12). Acorde con la
maduración de los polinucleares acontecen importantes cambios, entre ellos, aumento de
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
13
su capacidad de movilización, gracias a la presencia de proteínas contráctiles. En el
polimorfonuclear adulto, 10% de sus proteínas totales corresponden a la actina y 1% a la
miosina.
2.2.1.1. Neutrófilos
Presentan núcleo multilobulado, con aparato de Golgi poco desarrollado con gránulos
primarios (figura 10) que son de carácter lisosómico, donde se acumulan enzimas líticas
(elastasa, colagenasa inespecífica, glucosidasas) que desdoblan la elastina, la colágena, los
ácidos nucleicos y los hidratos de carbono, respectivamente. Estos gránulos contienen
también la enzima mieloperoxidasa, que cataliza la oxidación de los iones haluros por el
H2O2, con la formación resultante de ión haluro oxidados microbicidas. La función de
estos gránulos primarios es, la liberación de estas enzimas dentro de la célula tras la
fagocitosis12 para desdoblar las bacterias u otro material ingerido. Las enzimas de los
gránulos primarios escapan fuera de la célula durante la fagocitosis, por lo que pueden
amortiguar la respuesta inflamatoria al inactivar los quimiotácticos (es la unión de los
ligandos a los receptores en la superficie de los granulocitos donde se inicia las reacciones
de defensa fagocitaria)10, pero pueden atacar y lesionar tejidos circundantes donde se
encuentra el daño10.
Figura 10. Etapas de los neutrófilos granulocitos. Internet 1.2
Los gránulos secundarios (figura 10) sirven para trasladar materiales quimiotácticos desde
el citoplasma hasta la superficie de la célula durante el curso de la emigración y activación
del granulocito. Al situarse en la superficie de la membrana, dichos materiales pueden
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
14
participar en las reacciones responsables de la adherencia de los granulocitos, su
quimiotaxis (proceso mediante el cual las células fagocíticas son atraídas hacia la vecindad
de los patógenos invasivos12) y la degranulación parece depender de varios factores10:
1. La concentración del agente quimiotáctico.
2. El estado de afinidad del receptor superficial del quimiotáctico. Los receptores
en un estado de alta afinidad transducción de señales quimiotácticas mientras
que, si el estado de afinidad es bajo, la transducción es hacia las señales de las
otras respuestas.
3. Las propiedades de superficie de la membrana cambian, debido a la
translocación a ésta del conocimiento de los gránulos secundarios.
Los gránulos del neutrófilo en una coloración de Wright (figura 11) se reconocen porque el
citoplasma contiene gránulos que son finos y de color amarillo10.
Figura 11. Neutrófilo en tinción de Wright
El número de neutrófilos en la médula ósea es grande con relación al número circulante, los
que entran a la circulación y permanecen en ella durante toda su vida, sobreviviendo cerca
de 30 horas. La estancia promedio de un neutrófilo en la circulación es de 7 horas
aproximadamente. La cantidad de neutrófilos existentes en el cuerpo de una persona sana
con un peso de 70 Kg es aproximadamente 5,400 cels / mm3, como se muestra en la tabla 2.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
15
2.2.1.2 Eosinófilos
Los eosinófilos tienen un núcleo bilobulado. Presentan un aparato de Golgi poco
desarrollado, maduran en la médula ósea a través de estadios similares para los neutrófilos
(figura 12).
Se acumulan con frecuencia en los lugares de invasión de los helmitos en los tejidos y en
los sitios en donde se produce una reacción alérgica. En ambas circunstancias, ello puede
reflejar la liberación de materiales quimiotácticos para los eosinófilos, a partir de los
mastocitos hísticos activados. Los gránulos eosinófilos contienen grandes cantidades de dos
materiales –proteína básica principal y mieloperoxidasa eosinófila-, que se liberan cuando
se activan y se desgranulan los eosinófilos10.
Al liberarse, estos materiales pueden lesionar el tejido del estado de la larva de los parásitos
helmintos, que son demasiado grandes para ser ingeridos por las células fagocitarias. Esta
liberación de proteína básica principal y de mieloperoxidasa eosinófila puede provocar
también lesiones hísticas, lo que contribuye a las alteraciones anatomopatológicas que se
hallan en ciertos transtornos en los que los eosinófilos pueden acumularse en gran número
en los tejidos10. Los eosinófilos constituyen normalmente alrededor del 3% (270 cels /
mm3) de los leucocitos circulantes (Tabla 2).
Figura 12. Etapas de los eosinófilos. Internet 1.2
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
16
Los gránulos del eosinófilo en una coloración de Wright se reconocen porque son grandes y
de tono anaranjado brillante10, como se muestra en la figura 13.
Figura 13. Eosinófilo en tinción de Wright
2.2.1.3. Basófilos
Los basófilos son las células menos numerosas de los leucocitos humanos, maduran en la
médula ósea, y tienen núcleo con lobulaciones suaves (figura 14). Los basófilos
permanecen en la sangre solamente durante unas horas; su destino en los tejidos es
desconocido10. Tienen gránulos primarios, otros con cristaloides y estructuras laminares
concéntricas y gránulos pequeños con glucógeno. Su retículo endoplásmico rugoso y
aparato de Golgi están poco desarrollados6.
Figura 14. Etapas de los basófilos. Internet 1.3
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
17
Los gránulos del basófilo en una coloración de Wright se reconocen porque son de tamaño
grande y de color púrpura10 (figura 15). La cantidad de basófilos existente en el cuerpo de
una persona normal con un peso de 70 Kg es alrededor de 60 cels / mm3 en todo el cuerpo,
como se muestra en la tabla 2.
Figura 15. Basófilo en tinción de Wright
Tabla No. 2. Cifras normales de células polimorfonucleares, tanto en hombres como
mujeres. Ganong4
Nombre de
la célula
Células/mm3
(promedio)
Límites
normales
aproximados
Porcentaje (%)
del total de
leucocitos
Neutrófilos 5,400 3,000-6,000 50-70
Eosinófilos 270 150-300 1-4
Basófilos 60 0-100 0.1
Linfocitos 2,730 1,500-4,000 20-40
Monocitos 540 300-600 2-8
Plaquetas 300,000 200,000-500,000 -- --
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
18
2.2.1.4 Mastocitos
Durante un tiempo se creyó que mastocitos y basófilos eran el mismo tipo de células (la
primera en tejidos y la segunda en la sangre). Hoy se sabe que son dos líneas celulares
diferentes con funciones muy similares: en la liberación de mediadores inflamatorios (en
tejidos o en sangre)1. Los mastocitos tienen un núcleo sencillo y gran profusión de micro
vellosidades en su superficie. Existen diferencias entre ambos tipos celulares 6,7:
1. Los basófilos viven en sangre periférica y los mastocitos en el tejido
conectivo y mucosas.
2. Los basófilos tienen núcleo bilobulado y los mastocitos núcleo sencillo.
3. El diámetro de los basófilos es de 10 cc y los mastocitos llegan a las 30
4. Los basófilos tienen gránulos de glucógeno y los mastocitos no.
5. Los gránulos en los mastocitos son más pequeños y están en mayor
número.
2.2.2 MONONUCLEARES
Los monoblastos, son difícilmente identificables en la médula ósea de los sujetos normales;
no obstante, gracias a estudios citoquímicos y al aspecto morfológico al microscopio
traestructural observado en las leucemias agudas monoblásticas, se les considera
claramente diferenciables de los mieloblastos. El tamaño de los monoblastos es mayor al de
los mieloblastos, son células redondeadas con un gran núcleo, también redondo, provistas
de una cromatina muy laxa con numerosos nucléolos (generalmente más de cinco). Su
citoplasma es más abundante que el del mieloblasto, intensamente basófilo, adquiriendo
una tonalidad azul plomiza con las tinciones panópticas habituales. El dato más fidedigno
del monoblasto es la existencia de una intensa positividad esterasa inespecífica
fluorosensible13 (figura 16).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
19
Figura 16. Fases de desarrollo de las células mononucleares. Tomada de Internet 1.4
Los promonocitos4,10, se originan en la médula ósea pese a su escaso número, poseen un
tamaño de 15-20 m y una elevada relación núcleo-citoplasma. El núcleo, de aspecto
morfológico irregular, con pliegues posee una cromatina algo más condensada que la de su
precursor, con uno o más nucléolos visibles microscópicamente son visibles uno o dos
nucléolos. El citoplasma es intensamente basófilo por su gran riqueza en polirribosomas;
puede contener un número variable, aunque generalmente escaso, contiene además
granulaciones azurófilas, lo que hace a veces difícil su diferenciación con los promielocitos.
2.2.2.1 Monocitos
Se originan en la médula ósea los factores estimuladores de la formación de colonias
(SCF), estimuladores de la formación de gránulo-monocitos (MG-SCF) y estimuladores de
la formación de monocitos (M-CSF), son los responsables de la producción de los
monocitos a nivel de la médula ósea. Son producidos por diversas células, especialmente
por los linfocitos T13. Los monocitos liberan una substancia que inhibe la actividad de las
colonias (CIF)13.
Al salir de la médula ósea permanecen en circulación (figura 17) por unas 18 horas
(aproximadamente), para pasar luego de los vasos a los tejidos en donde se transforman en
macrófagos y permanecen ahí 60 días o más. Al penetrar en los tejidos, algunos de los
monocitos salidos de los vasos se convierten en células fagocitarias (macrófagos) fijas
como parte del sistema reticuloendotelial, de acuerdo con su morfología y el sitio donde se
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
20
localizan reciben nombre diferentes, cumplen funciones distintas y tienen procesos
metabólicos especializados13.
Figura 17. Monocito en tinción de Wright
En los tejidos los macrófagos se inmovilizan adhiriéndose a la red intercelular formada por
membranas, fibras de colágeno, proteoglicanos entre otros. Actúan en el proceso de
inflamación adhiriéndose a las partículas de fibrina y cuando encuentran geles de fibrina los
lisan secretando fibrolisina13.
La cantidad de monocitos existente en el cuerpo de una persona normal con un peso de 70
Kg es alrededor de 5% y 540 cels / mm3 (aproximadamente) como se muestran en la tabla
No. 2.
Los monocitos llevan a cabo diversas funciones e importantes para la defensa del
organismo y para las reacciones homeostáticas, estas funciones son las siguientes10:
1. La fagocitosis de microorganismos (p. ej., micobacterias)
2. Desnaturalización de proteínas plasmáticas.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
21
3. El procesado del antígeno para su presentación a los linfocitos en las respuestas
inmunitarias.
4. La secreción de materiales solubles (monocinas) con importante actividad biológica.
2.2.3 LINFOCITOS
Los linfocitos se divide en:
Linfocitos T.
Linfocitos B.
Figura 18. A) Etapas de los linfocitos T y B. Internet 1.1. B) Linfocito en tinción de Wright
A
B
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
22
2.2.3.1 LINFOCITOS T
Los linfocitos T (LT) provienen de la médula ósea y son transportados por la sangre hasta
la corteza del timo u otros órganos linfoides como el bazo, ganglios linfáticos donde van a
madurar, ocupando las zonas paracorticales de los ganglios linfáticos y las regiones
interfoliculares de los aparatos respiratorio y urinario10,12. Los linfocitos que sobreviven en
la corteza migran luego a la médula de la glándula, en donde continúa la diferenciación
celular, pero no la división. Cuando el procesado está terminado, el linfocito T posee un
receptor antigénico en la membrana superficial, que puede10 :
1. Responder selectivamente frente a secuencias inmunogénicas específicas de
determinantes antigénicos extraños.
2. Distinguir entre los determinantes de histocompatiblidad, en la membrana
superficial, que son propios y los que no lo son.
El proceso de los precursores de las células T en el timo comienza en la vida fetal y
continúa a través de la lactancia y la niñez. Esto proporciona un repertorio de linfocitos T
de larga supervivencia en los tejidos linfoides periféricos, programados para responder
selectivamente ante diferentes antígenos. Más tarde, declina el procesado de nuevas células
T (Esquema 14). De este modo, el timo tiene un peso de 70 g al final de la lactancia,
disminuye de tamaño después de la pubertad y en el anciano pesa solamente 3 g. La
involución de la glándula (con incapacidad para procesar nuevas células T y disminución
del apoyo hormonal tímico hacia las células T existentes) da lugar a una menor potencia de
las respuestas inmunitarias en los individuos de edad avanzada10.
Los linfocitos T se dividen en dos grupos principales10, los T ccoperadores y los T
supresores:
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
23
1. Después de una exposición a los antígenos extraños existentes sobre la superficie de
las células, en conjunción con los determinantes de histocompatibilidad (clase I)12,
se convierten en células citotóxicas o CD8, que pueden lisar a las células blanco.
2. Después de una exposición al antígeno, en conjunción con los determinantes de
histocompatibilidad (clase II)12, actúan como células T inmunosupresoras con
funciones cooperadoras CD4. Estas funciones cooperadoras apoyan:
a. El desarrollo de células T citotóxicas.
b. La adquisición de propiedades microbicidas por parte de los macrófagos.
c. La secreción de anticuerpos por parte de las células B.
2.2.3.2 LINFOCITOS B
Los linfocitos B (LB) se procesan en la médula ósea, la cual, es una semejanza de la
corteza tímica, contiene una fracción de linfocitos sometidos a una rápida división celular y
un elevado porcentaje de muerte celular. Durante el proceso de formación de linfocitos B,
cada precursor trata de combinar los segmentos de la línea germinativa del DNA para
recomponer los genes funcionales, de modo que se favorezca, en primer lugar, la síntesis de
la cadena pesada y, a continuación la de la ligera de una molécula de inmuglobulina
(glucoproteína compuesta por cadenas pesadas y ligeras que funciona como anticuerpo) 12
de tipo M10,12, que constituye el signo más precoz de que una célula está ligada a la línea
celular B. En el estadio siguiente, se forma una célula pre-B (imagen No. 15) que contiene
cadena µ en su citoplasma, como demostración de su dedicación a la síntesis de
inmunoglobulina. A continuación desaparecen las cadenas µ del citoplasma y son
reemplazadas por moléculas completas de IgM, enclavadas en la membrana superficial de
la célula B en maduración.
Esta IgM unida a la membrana es el lugar inicial que existe en la célula para el
reconocimiento del antígeno, es decir, un lugar de reconocimiento para el determinante
hapténico específico contra el que la células, mediante los reordenamientos de la línea
germinativa del DNA, ha quedado destinada a elaborar anticuerpos. En este estadio, si el
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
24
determinante hapténico se reconoce como propio, la célula es eliminada. Al proseguir el
desarrollo, una segunda inmunoglobulina IgG queda también enclavada en la superficie
celular10,12.
Cuando son activados los linfocitos B, sufren una diferenciación final a células plasmáticas.
Para una síntesis activa de proteínas, su retículo endoplásmico rugoso y Aparato de Golgi
ocupan gran parte del contenido celular y su núcleo pasa a ocupar menos espacio y presenta
una estructura de rueda de carro (la heterocromatina representa los radios)12.
La cantidad de linfocitos (ambos) existentes en el cuerpo de una persona sana cuyo peso de
70 Kg es de 2130 cels / mm3 (aproximadamente) como se muestra en la tabla 2.
2.2.4 MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS (Figura 19)
Figura 19. A) desarrollo de megacariocitos. Internet 1.2. B) Megatrombocito en tinción deWright. C) Plaquetas en tinción de Wright.
A
B C
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
25
Los promegacarioblastos, son células precursoras del megacarioblasto, no tiene
identificación morfológica. Se trata de un elemento mononucleado de aspecto, muchas
veces pseudosinoide, que precisa para su filiación certera10,12.
El megacarioblasto, es una célula de observación infrecuente en la médula ósea. Es el
elemento de menor tamaño de esta serie, de 6 – 24 µm. El núcleo es único, grande, ovalado
o bilobulado, con cromatina laxa y numerosos nucléolos (figura 19). El citoplasma es
intensamente basófilo, granular, sin vestigios de granulogénesis y puede presentar algunas
prolongaciones a modo de pseudópodos muy característicos10,12.
El promegacariocito inicia ya la granulogénesis en distintas áreas de su citoplasma. Su
tamaño oscila entre 30 y 50 µm. Es una células fácilmente identificable en la médula ósea
por su gran tamaño y por el aspecto característico de su citoplasma, que posee bordes mal
limitados y emite numerosas prolongaciones. El núcleo es multilobulado, con cromatina
densa y sin nucléolos. En el citoplasma persiste una tonalidad basófila, cubierta totalmente
por numerosas granulciones azurófillas10,12.
El megacariocito, posee como características destacables su gran tamaño (80 o más µm) y
su elevada ploidía. Se distinguen dos tipos de megacariocitos: el megacariocito granular y
el maduro. El granular tiene un núcleo multilobulado, con citoplasma de tonalidad rosada y
es de gran tamaño, de 16 – 56 µm. Presenta membranas de demarcación distribuidas de
forma asimétrica y gran número de gránulos. Los maduros, son los liberadores de
plaquetas, poseen un extenso citoplasma que ha perdido todo resto de basofília y está
cubierto totalmente por granulación azurófila. El núcleo, también multilobulado o
segmentado, posee una cromatina condensada sin nucléolos. Los gránulos azurófilos se
disponen especialmente en la periferia en cúmulos de 10 a 12 unidades rodeados por una
zona haliana citoplasmática correspondiente a las membranas de demarcación, claramente
visibles a nivel estructural y que irán delimitando las futuras plaquetas. La ruptura y
desprendimiento de los fragmentos citoplasmáticos delimitados por las membranas de
demarcación dará origen a los trombocitos10,12.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
26
Los trombocitos o plaquetas con cuerpos pequeños, gránulos de 2 – 4 µ de diámetro. En
una persona sana existen alrededor de 300,000 plaquetas / mm3 (tabla 2). Las plaquetas o
trombocitos contienen grandes cantidades de serotonina (5-hidroxitriptamina), y también
norepinefrina, epinefrina, histamina y ribonucleoproteína. Cuando existe una lesión en
alguna pared de un vaso sanguíneo, las plaquetas se agrupan en el sitio, adhiriéndose a la
pared vascular y liberan serotonina, que provoca vasocntricción local. Las plaquetas tienen
un gran contenido de glucógeno y sus reservas de glucogéno se agotan durante el proceso
de la coagulación.
Durante la hematopoyesis, desde célula tallo o stem cells hasta formar células ya
diferenciadas, presentan una actividad específica en la que intervienen factores estimulantes
de unidades formadoras de colonias (CFU), para cada linaje celular11,14,15, como también
citosinas e interleucinas, proveyéndole así los requerimientos necesarios a la sangre y
tejidos que lo necesiten.
En la tabla 3 se listan las citocinas que intervienen en el crecimiento de las colonias SCF-
GM o linfopohematopoyesis. Además de los factores de crecimiento, donde actúan
juntamente con la interleucinas (IL).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
27
Tabla 3. Actividad biológica de las citocinas en linfohematopoyesis o células tallo progenitoras (factores decrecimiento). Donde M-SCF, factor estimulante de colonias monocíticas; IL, Interleucinas; G-SCF, factorestimulante de colonias granulocíticos; GM-SCF, factor estimulante de colonias granulocitos-monocitos;GM-CFU, unidades formadoras de colonias granulocitos-monocitos; E-CFU, unidades formadoras decolonias de eritrocitos; CFU, unidades formadoras de colonias; E-BFU, unidades formadoras de eritrocitosgranulosos; IFN- , interferón gamma. Tomada de Bentter (11), Neidhart (14), Hampson (15), Ogawa (35)
Citosina Actividad principal
M-SCF Refuerza la producción y funciones de los monocitos
G-SCF Estimula la producción y función de los granulocitos. Es un ayudador en la estimulación temprana de
células progenitores existiendo una sinergia con otras citosinas. In vivo estimula la producción de
granulocitos
GM-SCF Estimula la producción de unidades formadoras de colonia granulocitos-macrófagos (GM-CFU), como
monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos.
IL-1 Induce la producción de otras citocinas. Refuerza la participación de las células tallo con otras citocinas.
Modula la respuesta inmune.
IL-2 Es el factor de crecimiento para las células T. Inhibe la eritropoyesis y mielopoyesis.
IL-3 Estimula la producción de neutrófilos, eritrocitos, linfocitos y, células megacariocíticas. In vivo incrementa
en sangre las cantidades de monocitos, neutrófilos, eosinófilos y plaquetas.
IL-4 Estimula células B modulando la respuesta inmune. Ayuda en la estimulación de GM-CFU y E-CFU.
IL-5 Estimula células B y eosinófilos.
IL-6 Estimula a la formación de megacariocitos y actúa junto con IL-1, 2, 3, 4, GM-SCF y M-SCF.
IL-7 Actúa en la formación de células pre-B con el ligando KIT y en células tallo con función temprana.
IL-8 Estimula la producción y función de los neutrófilos después de una proceso pro-inflamatorio. Moviliza
células tallo de la médula.
IL-9 Ayuda a la estimulación de GM-CFU mezclando con CFU. Estimula a la formación de E-BFU con la
eritropoyetina. Refuerza la producción de células T con IL-3 en la producción de células plasmáticas.
IL-10 Inhibe la producción de citocinas, modulas a las células inmunes.
IL-11 La mayoría de las partes de IL-6 incrementa los neutrófilos y plaquetas en sangre en un modelo
experimental con monos.
IL-12 Incrementa la generación de células inmunocompetentes.
IL-13 Refuerza el ligando KIT e induce la proliferación de un linaje negativo en las células tallo, y un antígeno
positivo en células tallo de ratón. Inhibe la producción de citocinas por monocitos. Estimula la activación
de células B y T.
IL-14 Factor de crecimiento para células B.
IL-15 Modula la actividad de células T.
IL-16 Actúa como inmunomodulador de quimioatrayente del ligando de linfocitos CD-4.
IL-17 Induce la producción de otras citocinas como IL-6. 8 y G-SCF, reforzando la expresión de adhesión
molecular.
IL-18 Induce la producción de GM-SCF e Interferón gamma (IFN- ). Inhibe la producción de IL-10.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
28
CAPÍTULO III
CULTIVOS DE CÉLULAS DE LA LINEA BLANCA
Los primeros experimentos que describieron la clonación y el crecimiento de células
progenitoras hematopoyéticas de ratón, fueron realizados en una matriz de gel-suave in
vitro en medio fijo. La importancia de estas observaciones aparentemente era para
investigar los trabajos en hematología, sus estudios permitieron abrir un camino para la
cuantificación de células primitivas progenitoras que poseen la habilidad de proliferar,
diferenciar, y desarrollar fenotípicamente hacia las células mieloides funcionalmente
maduras. De hecho, este trabajo junto con un ensayo en la formación de colonias en el bazo
desarrollado por Till y McCulloch en 196122, forman la base de la hematología moderna y
promovieron el uso clínico de los factores estimulantes de colonias 23.
En estos experimentos se logró estimular in vitro a las células progenitoras de la
hematopoyesis (formando-colonias) usando una variedad de células en el medio como
nutrimentos para el crecimiento de diferentes cultivos de tejidos, sólo las colonias de
granulocitos y/o macrófagos, se observaron en este experimento 23. Sin embargo, las
colonias que contienen a los eosinófilos, megacariocitos y células eritroides se mezclaron
con otras líneas mieloides para saber como crecían y conocer que factores de estimulación
intervenían en los cultivos22.
En los últimos años los factores de crecimiento celular hematopoyético han sido un objeto
de estudio a nivel molecular para realizar clonas de dichas moléculas y poder se utilizadas
en la parte experimental23.
En los años 60’s los investigadores dieron importancia a la estimulación de las clonas con
factores de crecimiento celular para producir las Unidades Formadoras de Colonias (CFU).
Esto fue basado en evidencias de distribución cromosomal marcadas, indicando que cada
nódulo de células hematopoyéticas en vías de desarrollo (colonia del bazo) son clonas
originales.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
29
Esas clonas se destinan a una célula denominada Unidad Formadoras de Colonias (CFU).
Las CFU no siempre puede representar una verdadera célula tallo (stem cell).
En sus etapas más tempranas de desarrollo (de 7 a 8 días), la mayoría que las colonias (in
vivo) provienen del bazo, siendo de tipo eritropoyético o de naturaleza granulopoyética, no
puede ser de ambos al mismo tiempo27. Este trabajo vino a confirmar lo que otros
investigadores como Till et al.,22 Curry et al.,28 Siminovitch et al.,29 Lewis et al.,30
McCulloch31 dieron la pauta para continuar con sus estudios in vitro dentro de los
laboratorios y así poder desarrollar nuevas técnicas de cultivo.
La selección de las condiciones de cultivo para crecimiento de las colonias depende de los
objetivos del experimento24. Actualmente se pueden llevar a cabo cultivos hematopoyéticos
en medio semi-sólido, metilcelulosa y líquido.
3.1. DIFERENTES CULTIVOS
3.1.1. SEMI-SÓLIDO
Los primeros que propusieron este método fueron Sanders et al32 y McPherson et al33,
donde colocaron en una base de agar obteniendo una concentración final de 0.5%,
permitiendo colocar células tumorales con 20% de suero de caballo y agar al 0.37%25.
Pluznik25 realizó esta técnica y suspendió linfocitos de bazo con amortiguador salino de
fosfatos (BSF). Las células suspendidas fueron lavadas con BSF diluidas a un volumen de
0.2 mL y se agregó 1.5 mL de medio que contenía 0.37% de agar. La suspensión celular fue
colocada en una base de agar sólido (en una caja de Petri). Todo se incubó a 37°C con una
atmósfera húmeda conteniendo 10% CO225.
Esto permitió diseñar nuevas técnicas en cultivo, ya que se han considerado como cultivos
de largo plazo (por semanas). Las células estromales apoyan la hematopoyesis
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
30
proporcionando un microambiente apropiado para promover la supervivencia, renovación,
proliferación y diferenciación de las células tallo hematopoyéticas. Esta función
probablemente es una combinación de:34
1) La adherencia de moléculas que permiten el ensable de células tallo
hematopoyéticas con su descendencia a los elementos específicos de las células
estromales.
2) La comunicación intercelular entre las células estromales y las células
hematopoyéticas lo que permite el cambio de información génetica.
3) La síntesis, secreción y presentación de las células estromales y una
concentración apropiada de los factores estimuladores e inhibidores de
crecimiento son los responsables de regular la proliferación y desarrollo de
células progenitoras hematopoyéticas.
4) La síntesis de moléculas en la matríz extracelular de las células estromales tienen
una importancia en el microambiente, manteniendo las células hematopoyéticas
con los factores de crecimiento para un mejor desarrollo.
Las células más inmaduras permanecen dentro de la capa adherente y cuando estas células
se dividen y maduran dejan descendencia en el medio de cultivo. Las células que
predominan en el cultivo son neutrófilos maduros, sin embargo, existen células primitivas y
progenitoras comprometidas como las unidades formadoras de colonias estromales
(S-CFU) y con células formadoras de colonias (CFC)34, respectivamente.
Los cultivos a largo plazo que se reproducen in vitro contienen muchas de las células tallo
hematopoyéticas34. Lo importante es el sostén de células hematopoyéticas aún cuando no
cuentan con factores de estimulación de crecimiento (SGF), siendo dependientes de células
del estroma adheridas a la médula ósea.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
31
En este tipo de cultivo se mide la habilidad en la formación de colonias progenitoras
mieloides comprometidas {GM-CFC (factor de crecimiento celular granulo-monocitíco),
G-CFC(factor de crecimiento celular granulocítico), Eos-CFC (factor de crecimiento
celular eosinófilo)} de muestras normales de médula ósea o de sangre total. Es útil en casos
de enfermedades mielodisblásicas y también en leucemias mieloides agudas24.
En cultivos a largo plazo, hay reproducción de todas las células hematopoyéticas así, como
de la célula primitiva sin perder sus funciones. Se lleva a cabo mediante la formación de
células adheridas en el agar que permanecen de dos a cuatro semanas en cultivo.
Después, las células primitivas hematopoyéticas migran de abajo del cultivo se ubican entre
las células estromales y células hematopoyéticas establecidas, realizando un asociación
entre ellas.
Para realizar este medio de cultivo se requiere de una base de agar25 para provocar una
inmovilización de las células que están formando las colonias, donde se observan en forma
de halo (anillo) en el agar, indicando el crecimiento de las colonias que presentan
características con frecuencia en forma de CFU que contiene en promedio de 30 a 50
células24. Las condiciones de cultivo para células de línea blanca es de 21 días a 37°C con
una atmósfera húmeda del 5% de CO224
.
Este tipo de cultivo actualmente se utiliza poco, debido a que se requieren de 2 a 4
semanas de cultivo para obtener resultados.
El utilizar cultivos de Agar es muy barato y fácil de preparar. Logrando una mejor
inmovilización de células que en metilcelulosa. Una de las desventajas que presenta este
tipo de cultivo es, cuando se agrega agar al 3% tiene que estar bien fundido, de lo contrario
se solidifica y entonces atrapa a las células tallo impidiendo su proliferación en el cultivo24.
Además, se recomienda proporcionar los factores de crecimiento a las células en cultivo.
No existe una valoración citogénetica24.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
32
3.1.2. METILCELULOSA
En este tipo de cultivo es importante saber inocular células hematopoyéticas a una
concentración baja (5 X 104 / mL), evitando reducir hasta que la célula influya la
formación adicional de colonias. Se tiene que usar un factor de crecimiento concentrado en
lugar del medio condicionado24.
La concentración de metilcelulosa óptima puede variar entre 0.8-1.3 % y depende de la
viscosidad en la preparación. Las colonias deben crecer en suspensión y no en el fondo de
metilcelulosa24. Permite además la recuperación de colonias para identificarlas
morfológicamente y obtener una valoración citogenética24.
El cultivo facilita la proliferación de células progenitoras multipotentes que forman
colonias mixtas constituidas por células mieloides y linfoides, la formación de G-CFC, M-
CFC, GM-CFC, Eos-CFC, unidad formadora de gránulos de eritrocitos (BFU-E) y las
unidades formadoras de colonias de eritrocitos (CFU-E). Las condiciones de cultivo son de
14 días a 37°C en una atmósfera húmeda del 90% y 5% de CO224.
Actualmente, muchos laboratorios emplean este tipo de cultivo ya que es mucho más
rápido (14 días) en obtener resultados en comparación con el cultivo semi-sólido24. Esos
cultivos presentan una alta incidencia de GM-CFC, BFU-E y Meg-CFC aumentando el
número de estos obteniendo valores en un rango normal24. En cuanto a resultados
morfológicos, se puede apreciar mucho mejor en metilcelulosa que en el cultivo semi-
sólido24.
Sus desventajas son: que el cultivo es costoso, ya que, se tiene que contar con interleucinas
(IL) específicas para promover el crecimiento celular de la línea deseada, así como de
factores de crecimiento recombinados, además de eritropoyetina recombinada, también se
utiliza albúmina sérica de bovino (BSA) al 10% como medio de nutrientes.24
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
33
3.1.3. LÍQUIDO
El antecedente36 de este tipo de cultivo se basa en un trabajo en el cual se colocaron varios
tipos celulares hematopoyéticos con factores de crecimiento usando un soporte de gel, que
permitió el desarrollo de clonas de células hematopoyéticas de distintas líneas celulares26.
Este tipo de cultivo soporte de gel permite la identificación y caracterización de nuevos
factores de crecimiento y poblaciones de células progenitoras específicas, pero no se puede
realizar un estudio de los mecanismos moleculares que activan el factor de crecimiento en
células hematopoyéticas para estimular la proliferación y el desarrollo de las mismas26.
Al realizar el cultivo en medio líquido se requiere de aminoácidos solubles (alanina, valina,
y prolina, entre otros) y compuestos orgánicos que funcionan como factores de crecimiento
celular26. A diferencia de los otros dos cultivos, este medio de cultivo se realiza en 24 horas
como máximo y debe contar con equipo de espectofotometría para determinar la
absorbancia g absorbida por las células hematopoyéticas. Cuando se realiza la
identificación morfológica se requiere de una amplia experiencia en el conocimiento del
linaje celular hematopoyético26.
El desarrollo celular en este tipo de cultivo se evalúa usando varios parámetros: la pérdida
de potencial de clonación celular hasta alcanzar la madurez; la expresión de actividades
enzimáticas (realizando estudios bioquímicos) con las proteínas que se encuentran
asociadas con la maduración de las células. Los cambios morfológicos ocurren durante el
desarrollo celular y la expresión de actividades funcionales, (por ejemplo, la fagocitosis)
qué está asociada con la maduración celular.26
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
34
CAPÍTULO IV
CRIOPRESERVACIÓN CELULAR
El estudio de la viabilidad de células y tejidos criopreservados mide el daño producido y
permite optimizar, si fuera necesario, cualquiera de las fases de preservación50. Los
controles de viabilidad permiten medir la integridad física, la actividad metabólica, mitótica
y la función in vitro37.
El desarrollo de las técnicas de criobiología (es la ciencia que trata el comportamiento de
los seres vivos, o de sus constituyentes, a muy bajas temperaturas)37 y de criopreservación
(preservación de material biológico a temperaturas criogénicas)37 ha permitido el progreso
de muchas terapias de transplante y de reproducción asistida. Hay una gran variedad de
materiales biológicos que se criopreservan para su posterior uso (Tabla 4).
Tabla 4. Materiales biológicos que se pueden criopreservar. Torradabella37
- Arterias y venas - Hepatocitos - Tejido ovárico
- Cartílagos - Glándula tiroides - Tendones
- Células tallo hematológicas - Membrana amniótica - Tráquea
- Condrocitos - Ovocitos - Uretra
- Córneas - Piel - Válvulas cardiacas
- Embriones - Plaquetas
- Hematíes - Semen
Todos estos materiales tienen en común que son células individuales o tejidos en los que la
administración de crioprotectores y el cambio de temperatura de todo el material, puede
hacerse de manera homogénea.
Los crioprotectores son substancias que protegen del daño que se pueda producir en las
células debido a la congelación. El modo de acción de los crioprotectores es muy complejo;
su efecto protector proviene de su habilidad para vincularse al agua lo que evita formación
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
35
de cristales de hielo que pueden dañar los organelos intracitoplamáticos y de su capacidad
para reducir los efectos tóxicos de las altas concentraciones de sales y de solutos39.
Los crioprotectores más utilizados en estos casos son el dimetilsulfóxido (DMS) y el
glicerol. El 1,2-propanodiol se ha incorporado más recientemente como crioprotector útil
en la congelación de piel37,48.
Existen métodos de congelación lenta y rápida. Para aplicar los métodos lentos se requiere
un congelador programable mediante un programa informático, capaz de realizar un
descenso lento, gradual y muy controlado de la temperatura, hasta alcanzar la deseada de
acuerdo al protocolo de ejecución (-80°C ó -120°C)37,49.
Los métodos rápidos incluyen la “vitrificación y la congelación ultrarrápida39. La técnica
de vitrificación consiste en la utilización de una solución altamente viscosa que, al se
enfriada, aumenta su viscosidad hasta alcanzar la consistencia de un vidrio; posee la gran
ventaja de que no se producen daños celulares causados por la formación de cristales de
hielo extracelulares37. De todas maneras, no hay que olvidar que las altas concentraciones
de crioprotectores necesarias en la vitrificación, son tóxicas para los embriones y por lo
tanto no se aconseja utilizar esta técnica en su congelación37.
Estas técnicas de criopreservación se realizan en centros sanitarios como hospitales, centros
de transfusión sanguínea, bancos de tejidos o clínicas de reproducción asistida, por personal
altamente calificado por el Centro Nacional de Transplantes (Cenatra) y lo pueden realizar
médicos, químicos y biólogos capaces de la correcta aplicación de las técnicas de
criopreservación.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
36
CAPÍTULO V
UTILIDAD DE LAS CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS
La médula ósea está constituida fundamentalmente por una red vascular y un conglomerado
celular que lo rodea. La red vascular se compone de sinusoides cuya tenue pared está
formada por células reticulares sin membrana basal y con sangre en su interior, este lecho
vascular representa la vía de comunicación de la médula ósea con el resto del organismo. El
conglomerado celular forma el tejido hematopoyético, cada una de las células que lo
integran se multiplican, al madurar se diferencian y finalmente pasan a la sangre40.
El sistema hematopoyético consta de tres componentes básicos: los factores de crecimiento,
las células progenitoras hematopoyéticas (stem cell) ó (CPH) y el microambiente de la
médula ósea.
Los factores de crecimiento incluyen: factores estimulantes de colonias, factores de células
progenitoras hematopoyéticas, interleucinas e inhibidores reguladores bidireccionales40.
La célula progenitora hematopoyética al ser estimulada se autoreplica, al dividirse da lugar
a dos células, una de ellas conserva las características originales y mantiene su
potencialidad funcional y de auto-renovación como unidad de reserva de la médula ósea. La
segunda célula se divide en las diferentes fases de maduración, su diferenciación es de
multilineaje40.
El transplante de médula ósea con células progenitoras hematopoyéticas (TMOCPH)
representa un procedimiento terapéutico alternativo para diferentes padecimientos
hematológicos, metabólicos, inmunológicos y neoplásicos41. Parte esencial del TMOCPH
son los aspectos éticos: la selección del paciente, la justificación del procedimiento, el
riesgo/beneficio, el momento adecuado de realizar el trasplante, considerar otras
alternativas terapéuticas y el consentimiento bajo información, entre otros.42
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
37
Las CPH se encuentran en la sangre y en número significativo en el cordón umbilical,
además de la médula ósea, por lo que, ésta ha dejado de ser la única proveedora. Desde la
década de los 80, Broxmeyer43 demostró la presencia de CPH en el cordón placentario
celular con capacidad de regenerar de la hematopoyésis en el receptor del transplante. En
la actualidad las CPH se pueden movilizar y recolectar de la sangre y al igual que las
provenientes de cordón placentario, mantenerse en congelación44 en bancos de
criopreservación.
Entre las ventajas atribuibles a los bancos de sangre de cordón se mencionan: la fácil y
práctica obtención de sangre de la placenta, la estandarización y control de calidad a que
son sometidos los procesos de congelación y descongelación, la disponibilidad inmediata;
la posibilidad de encontrar grupos HLA poco frecuentes; el bajo riesgo de transmisión de
agentes infecciosos; entre otros45. El número de CPH existentes en la sangre de cordón
guarda relación con el volumen de la sangre que se obtiene de la placenta, su viabilidad y
capacidad funcional están condicionadas al manejo durante la congelación, descongelación
y conservación.
En nuestro país, la Secretaría de Salud inauguró en el Centro Nacional de la Transfusión
Sanguínea el Banco de CPH (agosto de 1994), lo que permitió brindar apoyo a pacientes de
instituciones de salud, públicas y privadas que requerían trasplante autólogo o alogénico de
médula ósea40.
El transplante autólogo, está indicado generalmente para el tratamiento de neoplasias
malignas sensibles a dosis muy altas de radioquimioterapia46, una fracción de la médulas
ósea del paciente se extrae, se congela y se almacena; después al paciente se le administra
el tratamiento citotóxico, y posteriormente se lleva a cabo la reinfusión de su médula46.
El transplante alogénico, es aquél en el que se utiliza un donador genéticamente diferente
pero de la misma especie. La mayor parte de estos transplantes se practican entre
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
38
familiares HLA idénticos. Está indicado para el tratamiento de diversas enfermedades
benignas y malignas47, como se muestra en la tabla 4.
Tabla 4. Enfermedades en las que está indicado el transplantes de médula ósea. (León 47)
I. Enfermedades malignas II. Enfermedades no malignas
a. Leucemia aguda
mieloide
b. Leucemia aguda linfoide
c. Leucemia mieloblástica
crónica
d. Linfoma no-Hodgkin
e. Enfermedad de Hodgkin
f. Síndromes
mielodisplásticos
g. Mieloma múltiple
h. Algunos tumores sólidos
1. Adquiridas
a) Anemia Aplástica
b) Mielofibrosis
c) Hemoglobinuria paroxística nocturna
2. Congénitas
a) Inmunodeficiencias
- Inmunodeficiencia combinada
grave
- Síndrome de Wiscott-Aldrich
b) Alteraciones hematológicas
- Anemia de Fanconi
- Talasemia
- Enfermedad de Gaucher
- Neutropenia congénita
- Enfermedad granulosa
crónica
- Síndrome de Chedak Higashi
c) Osteoporosis
d) Mucopolisacaridósis
- Síndrome de Hunder
- Otros
e) Mucolípidos
f) Otras enfermedades lisosomales
- Síndrome de Lesch-Nyhan
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
39
CAPÍTULO VI
JUSTIFICACIÓN
En la hemato-oncología moderna se utiliza el transplante de células hematopoyéticas de
médula ósea, de sangre periférica o de cordón umbilical. La capacidad para realizar un
transplante de médula ósea (TMO) requiere de células tallo o stem cell, las cuales se
mantienen en condiciones de criopreservación, que de acuerdo con la literatura a – 4oC39
pueden tener una duración de 8 a 15 días; a – 80oC37,38 tienen una duración de 6 a 12 meses
y, a – 195oC38 donde tienen una duración de 15 años.
En el laboratorio de Histocompatibilidad del Hospital Juárez de México, las células tallo o
stem cells de médula ósea y de cordón umbilical colectadas se han mantenido
criopreservadas durante 2 y 6 años a –80°C, por lo que en el presente estudio se pretende
determinar su viabilidad y capacidad de proliferación in vitro.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
40
CAPÍTULO VII
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar la viabilidad de células tallo criopreservadas durante 2 y 6 años a –80°C, utilizando
como indicadores la proliferación de células de línea blanca en cultivo.
PARTICULARES
a) Determinar la viabilidad mediante azul de tripano, biometría hemática (BH),
cultivos de células de la línea blanca
b) Realizar la técnica de cultivo semisólido de células hematopoyéticas de la serie
blanca criopreservadas a – 80oC por 6 años
c) Analizar la cantidad de células CD34 en las muestras descongeladas
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
41
CAPÍTULO VIII
HIPÓTESIS
H1: Las células hematopoyéticas mantenidas a –80°C por 2 y 6 años matienen su viabilidad
H0: Las células hematopoyéticas mantenidas a –80°C por 2 y 6 no matienen su viabilidad
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
42
CAPÍTULO IX
MATERIAL Y EQUIPO
9.1 BIOLÓGICO
- Cordón umbilical
- Médula ósea
9.2 PLÁSTICO Y VIDRIO
- Bulbos para pipetas Pasteur
- Cajas de Petri de 10/35 mm
- Cajas de Petri de 100/85 mm
- Cámara de Neubauer
- Cubre objetos
- Gradillas
- Jeringas de 10 ml
- Jeringas de 5 ml
- Jeringas de 3 ml
- Jeringas de 1 ml
- Pipeta graduadas de 10 ml
- Porta objetos
- Pipetas Pasteur
- Tubos de Poliestereno
9.3 SOLUCIONES Y MEDIOS DE
CULTIVO
- Agar-Agar
- Agua inyectable
- Cloruro de benzalconio
- Factor de crecimiento para
granulocitos
- Medio McCoy 5 A-modificado
- Solución de azul de tripano
- Suero Fetal de Ternera
9.4 EQUIPO
- Autoclave
- Baño María
- Centrífuga
- Estufa con CO2
- Mecheros Bunsen
- Microscopio Invertido
- Microscopio Óptico
- Ultracongelador
- Vórtex
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
43
CAPÍTULO X
METODOLOGÍA1. Preparar el baño maría a 37°C
Figura 20. Preparación del baño maría
2. Sacar las muestras del ultracongelador
Figura 21. Muestras en el ultracongelador
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
44
3. Descongelar rápidamente las células hematopoyéticas
Figura 22. Descongelación de la muestra
4. Tomar 15 ml de la muestra y colocar en tubos con tapón morado para realizar una
biometría hemática (BH), tubos con tapón rojo para determinar contaminación
mediante cultivos de bacteriología y micología
Figura 23. A) Tubos de poliestiereno para cultivos semi-sólidos. B) Tubos con tapón
morado para una biometría hemática, y tubos con tapón rojo para cultivos bacteriológicos y
micológicos.
AB
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
45
5. Centrifugar los tubos a 200 X g durante 15 minutos.
6. Decantar los tubos y lavar con medio de McCoy
7. Centrifugar a 200 X g durante 15 minutos
8. Decantar los tubos y resuspender las células con medio de McCoy
9. Colocar una mínima cantidad de células en la cámara de Neubauer para contarlas al
microscopio óptico. En caso de que no se puedan contar, hacer una dilución 1:5,
como se muestra en la figura 24.
Figura 24. A) Exceso de células en la cámara de Neubauer. B) Células en la cámara deNeubauer
10.1. CULTIVOS DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS DE LA LÍNEA BLANCA
a. Tomar 0.35 ml de las células suspendidas (concentración final de 1X106
cel / mL) suspendidas en medio McCoy.
b. Agregar 6.0 ml de medio McCoy suplementado con suero fetal de ternera
(SFT) al 20%.
c. Adicionar 0.02 ml de factor de crecimiento de granulocitos.
d. Colocar 1.89 ml de Agar al 3%.
e. Mezclar cuidadosamente en el vórtex.
f. Vaciar todo en dos cajas de Petri (10/35 mm) que contienen una capa de
soporte de Agar al 5%.
Células de la línea blanca
A
B
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
46
g. Colocar las cajas de Petri (10/35 mm) en otra caja de Petri (100/85 mm)
junto con otra caja de Petri (10/35 mm) con agua. Como se muestra en la
figura 25.
Figura 25. Caja de Petri con las cajas chicas de Petri que contienen agua y cultivos
h. Incubar a 37 0C con una atmósfera del 90% de humedad y 5% de CO2
durante 21 días.
i. Revisar cada 3er día y agregar el medio de McCoy más SFT al 20%.
Figura 25. Estufa con cultivos de células de la línea blanca
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
47
10.2 VIABILIDAD
Se utiliza una mínima cantidad de células agregando azul de tripano a una concentración
final de 1:10. Colocándolas en la cámara de Neubauer. Se lee en el microscopio óptico para
determinar la viabilidad. Las células que se encuentran vivas tienen una coloración rosada y
en las muertas el colorante penetra al interior de las células tiñéndolas de azul. El
porcentaje se determina aplicando las siguiente fórmula:
10.3 UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS
Al término de la incubación se realizará una lectura de las unidades formadoras de colonias
(UFC) que crecieron en los cultivos utilizando para ello el microscopio invertido.
1. Se sacan los cultivos y se dejan a temperatura ambiente para su lectura.
2. Colocar las cajas de Petri (10/35 mm) sobre un contador milimétrico, el cual está
sobre la platina del microscopio invertido.
3. Contar 10 X 10 cuadros del contador por cada caja. Cada muestra contiene cuatro
cajas de Petri (10/35 mm).
4. Identificar las CFU como un conjunto de células agrupadas de un mismo color.
5. Sacar el promedio de las 4 cajas y anotarlo como resultado final.
6. Una vez contadas las CFU, realizar un frotis en un portaobjetos.
7. Se tiñen los frotis con colorante de Wright para conocer la morfología crecida en los
cultivos.
Número de células vivasViabilidad % = X 100
Número de células muertas
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
48
CAPÍTULO XI
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se analizaron diez muestras de células hematopoyéticas criopreservadas por 2 y 6 años a
– 80°C, de las cuales una es de cordón umbilical y las otras nueve son de médula ósea.
En la gráfica 1 se muestra que los leucocitos totales a 2 años de criopreservación, nos
muestra que conforme pasa el tiempo va disminuyendo la cantidad de células existentes.
En de las muestra 1 (cordón umbilical) tiene una concentración inicial leucocitaria (0 años)
de 2.84 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento
en la concentración final del 7.22 celsX103/mL (Gráfica 1). Esto nos indica que hubo un
aumento del 254.23 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 1.1).
Gráfica 1. Leucocitos a 2 años de criopreservación
050
100150200250300350400
0 1 2 3 4 5Número de muestra
Células X103/mL
0 años 2 añosCordón umbilical
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
49
En de las muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial leucocitaria (0 años) de
123.09 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución en la concentración final del 66.14 celsX103/mL (Gráfica 1). Esto nos indica
que hubo una disminución del 46.27 % de células muertas y 53.73. % de células vivas con
respecto al inicial (Gráfica 1.1).
Gráfica 1.1. Porcentaje de lecucocitos a 2 años decriopreservación
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5Número de muestra
%
0 años % Células vivas % Células muertas
En de las muestra 3 (médula ósea) tiene una concentración inicial leucocitaria (0 años) de
335 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución en la concentración final del 314 celsX103/mL (Gráfica 1). Esto nos indica que
hubo una disminución del 6.27 % de células muertas y 93.73. % de células vivas con
respecto al inicial (Gráfica 1.1).
En de las muestra 4 (médula ósea) tiene una concentración inicial leucocitaria (0 años) de
359.5 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución en la concentración final del 26.1 celsX103/mL (Gráfica 1). Esto nos indica
que hubo una disminución del 92.74 % de células muertas y 7.26 % de células vivas con
respecto al inicial (Gráfica 1.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
50
En la gráfica 2 nos muestra el comportamiento de células mononucleares a 2 años de
criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene una concentración inicial
mononuclear (0 años) del 1.6 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en
criopreservación se notó un aumento en la concentración final del 6.67 celsX103/mL
(Gráfica 2). Esto nos indica que hubo un aumento del 416.88 % de células vivas con
respecto al inicial (Gráfica 2.1).
Gráfica 2. Mononucleares a 2 años de criopreservación
050
100150200250300350
0 1 2 3 4 5Número de muestra
Células X103/mL
0 años 2 años
En la muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial mononuclear (0 años) del
56.73 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento
en la concentración final del 61.37 celsX103/mL (Gráfica 2). Esto nos indica que hubo un
aumento del 8.18 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 2.1).
En la muestra 3 (médula ósea) tiene una concentración inicial mononuclear (0 años) del
226.2 celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento
en la concentración final del 291 celsX103/mL (Gráfica 2). Esto nos indica que hubo un
aumento del 28.65 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 2.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
51
Gráfica 2.1. Porcentaje de mononucleares a 2 años decriopreservación
0
100
200
300
400
500
0 1 2 3 4 5
Número de muestra
%
0 años % Células vivas
En la muestra 4 (médula ósea) tiene una concentración inicial mononuclear (0 años) de 112
celsX103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución en
la concentración final del 291 celsX103/mL (Gráfica 2). Esto nos indica que hubo una
disminución del 0.99 % de células vivas, lo que significa que el 99.01% murieron en este
lapso de tiempo con respecto al inicial (Gráfica 2.1).
En la gráfica 3 nos muestra el comportamiento de la hemoglobina a 2 años de
criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene una concentración inicial de
hemoglobina (0 años) del 5.4 g/dL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se
notó una disminución en la concentración final del 2.6 g/dL (Gráfica 3). Esto nos indica
que hubo una disminución del 51.85% de células muertas y el 48.15% de células vivas con
respecto al inicial (Gráfica 3.1).
En la muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial de hemoglobina (0 años) del
0.3 g/dL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento en la
concentración final del 0.8 g/dL (Gráfica 3). Esto nos indica que hubo un aumento del
266.67% de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 3.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
52
Gráfica 3. Hemoglobina a 2 años de criopreservación
0
1
2
3
4
5
6
0 1 2 3 4 5Número de muestra
g/dL
0 años 2 años
En la muestra 3 (médula ósea) tiene una concentración inicial de hemoglobina (0 años) del
1.9 g/dL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución en la
concentración final del 0.9 g/dL (Gráfica 3). Esto nos indica que hubo una disminución del
52.63 % de células muertas y el 47.37 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica
3.1).
Gráfica 3.1. Porcentaje de Hemoglobina a 2 años decriopreservación
050
100150200250300
0 1 2 3 4 5
Número de muestra
%
0 años % Células vivas % Células muertas
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
53
En la muestra 4 (médula ósea) tiene una concentración inicial de hemoglobina (0 años) del
3.8 g/dL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución en la
concentración final del 0.8 g/dL (Gráfica 3). Esto nos indica que hubo una disminución del
78.95 % de células muertas y el 21.05 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica
3.1).
En la gráfica 4 nos muestra el comportamiento del hematócrito a 2 años de
criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene una concentración inicial de
hemoglobina (0 años) del 15 cel X 103/mL. A los 2 años de haber estado en
criopreservación se notó una disminución en la concentración final del 0.4 cel X 103/mL
(Gráfica 4). Esto nos indica que hubo una disminución del 97.33 % de células muertas y el
2.67 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 4.1).
Gráfica 4. Hematócrito a 2 años de criopreservación
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5Número de muestra
Células X103/mL
0 años 2 años
En la muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial de hematócrito (0 años) del
0.2 cel X 103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento en
la concentración final del 0.3 cel X 103/mL (Gráfica 4). Esto nos indica que hubo un
aumento del 50 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 4.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
54
Gráfica 4.1. Porcentaje de Hematócrito a 2 años decriopreservación
0
50
100
150
200
0 1 2 3 4 5Número de muestra
%
0 años % Células vivas % Células muertas
En la muestra 3 (médula ósea) tiene una concentración inicial de hematócrito (0 años) del
4.7 cel X 103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución en la concentración final del 0.4 cel X 103/mL (Gráfica 4). Esto nos indica que
hubo una disminución del 91.49 % de células muertas y el 8.51 % de células vivas con
respecto al inicial (Gráfica 4.1).
En la muestra 4 (médula ósea) tiene una concentración inicial de hematócrito (0 años) del
20.3 cel X 103/mL. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución en la concentración final del 0.2 cel X 103/mL (Gráfica 4). Esto nos indica que
hubo una disminución del 99.01 % de células muertas y el 0.99 % de células vivas con
respecto al inicial (Gráfica 4.1).
En la gráfica 5 nos muestra el comportamiento de la viabilidad medido con azul de
tripano a 2 años de criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene una
concentración inicial de viabilidad (0 años) del 88 % de células vivas. A los 2 años de
haber estado en criopreservación se notó una disminución en la concentración final del 86
% (Gráfica 5). Esto nos indica que hubo una disminución del 2.27 % de células muertas y
el 97.73 % de células vivas con respecto al inicial (Gráfica 5.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
55
Gráfica 5. Viabilidad con azul de tripano a 2 años decriopreservación
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5Número de muestra
%
0 años 2 años
En la muestra 2 (médula ósea) tiene una concentración inicial de viabilidad (0 años) del
92% de células vivas. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución en la concentración final del 87 % (Gráfica 5). Esto nos indica que hubo una
disminución del 5.43 % de células muertas y el 94.57 % de células vivas con respecto al
inicial (Gráfica 5.1).
Gráfica 5.1. Porcentaje de Viabilidad a 2 años decriopreservación
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5Número de muestra
%
0 años % Células vivas % Células muertas
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
56
En la muestra 3 (médula ósea) tiene una concentración inicial de viabilidad (0 años) del
83% de células vivas. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución en la concentración final del 79 % (Gráfica 5). Esto nos indica que hubo una
disminución del 4.82 % de células muertas y el 95.18 % de células vivas con respecto al
inicial (Gráfica 5.1).
En la muestra 4 (médula ósea) tiene una concentración inicial de viabilidad (0 años) del
60% de células vivas. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución en la concentración final del 55 % (Gráfica 5). Esto nos indica que hubo una
disminución del 8.83 % de células muertas y el 91.67 % de células vivas con respecto al
inicial (Gráfica 5.1).
En la gráfica 6 nos muestra el comportamiento de las unidades formadoras de colonias a
2 años de criopreservación. En la muestra 1 (cordón umbilical) tiene un cantidad de
colonias formadas iniciales (0 años) de 30 CFU. A los 2 años de haber estado en
criopreservación se notó una disminución de unidades formadoras de colonias finales de 11
CFU (Gráfica 6). Esto nos indica que hubo una disminución del 63.33 % de CFU no
crecidas en el medio y un 36.67 % de CFU crecidas con respecto a las unidades formadoras
de colonias iniciales (Gráfica 6.1).
Gráfica 6. Cultivo de leucocitos a 2 años decriopreservación
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5Número de muestra
CFU
0 años 2 años
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
57
En la muestra 2 (médula ósea) tiene un cantidad de unidades formadoras de colonias
iniciales (0 años) de 25 CFU. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de unidades formadoras de colonias finales fueron de 8 CFU (Gráfica 6). Esto
nos indica que hubo una disminución del 68 % de CFU no crecidas en el medio y un 32 %
de CFU crecidas con respecto a las unidades formadoras de colonias iniciales (Gráfica 6.1).
Gráfica 6.1. Porcentaje de Unidades Formadoras deColonias a 2 años de criopreservación
020406080
100
0 1 2 3 4 5
Número de muestra
%
0 años % Células vivas % Células muertas
En la muestra 3 (médula ósea) tiene un cantidad de unidades formadoras de colonias
iniciales (0 años) de 34 CFU. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de unidades formadoras de colonias finales fueron de 17 CFU (Gráfica 6).
Esto nos indica que hubo una disminución del 50 % de CFU no crecidas en el medio y un
50 % de CFU crecidas con respecto a las unidades formadoras de colonias iniciales
(Gráfica 6.1).
En la muestra 4 (médula ósea) tiene un cantidad de unidades formadoras de colonias
iniciales (0 años) de 38 CFU. A los 2 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de unidades formadoras de colonias finales fueron de 7 CFU (Gráfica 6). Esto
nos indica que hubo una disminución del 81.58 % de CFU no crecidas en el medio y un
18.42 % de CFU crecidas con respecto a las unidades formadoras de colonias iniciales
(Gráfica 6.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
58
En la gráfica 7 nos muestra el comportamiento de los leucocitos totales a 6 años de
criopreservación. En la muestra 5 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de
44.9 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de 3.54 cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo una disminución
del 92.12 % de células muertas y el 7.88 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se
notó un aumento en comparación con los 3 años a 4.02 cel X 103/mL y una disminución
con respecto a la concentración inicial. Esta disminución nos indica que el 91.05 % de
células muertas y el 8.95 % de células vivas (Gráfica 7.1).
Gráfica 7. Leucocitos a 6 años de criopreservación
0
50
100
150
4 5 6 7 8 9 10 11Número de muestra
Células X103/mL
0 años 3 años 6 años
En la muestra 6 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 19.5 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de 1.32
cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo una disminución del 93.23 % de
células muertas y el 6.77 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se notó un
aumento en comparación con los 3 años de 16.93 cel X 103/mL y una disminución con
respecto a la concentración inicial. Esta disminución nos indica que el 13.18 % de células
muertas y el 86.82 % de células vivas (Gráfica 7.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
59
Gráfica 7.1. Porcentaje de lecucocitos a 6 años decriopreservación
0
20
40
60
80
100
4 5 6 7 8 9 10 11 Número de muestra
%
0 años, 100%% células vivas a 3 años% células vivas a 6 años
En la muestra 7 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 6.58 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento de 6.63 cel
X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo un aumento del 0.73 % de células vivas
(Gráfica 7.1). En los 6 años se notó un aumento en comparación a los 0 años y 3 años de
6.69 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial. Este aumento
nos indica que el 1.67 % de células vivas (Gráfica 7.1).
En la muestra 8 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 3.35 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución del
1.32 cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo un aumento del 60.60 % de
células vivas y el 39.40 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se notó una
dismincuín en comparación a los 0 y 3 años del 1.26 cel X 103/mL con respecto a la
concentración inicial. Este aumento nos indica que el 62.39 % de células muertas y el
37.61 % de células vivas (Gráfica 7.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
60
En la muestra 9 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 123.49 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución del
63.01 cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo una disminución del 48.98 % de
muertas y el 51.02 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se notó una disminución
en comparación a los 0 años y 3 años del 9.09 cel X 103/mL con respecto a la
concentración inicial. Esta disminución nos indica que el 92.64 % de células muertas y el
7.36 % de células vivas (Gráfica 7.1).
En la muestra 10 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 16.5 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución del
15.86 cel X 103/mL (Gráfica 7). Esto nos indica que hubo una disminución del 3.88 % de
muertas y el 96.12 % de células vivas (Gráfica 7.1). En los 6 años se notó una disminución
en comparación a los 0 años y 3 años del 13.31 cel X 103/mL con respecto a la
concentración inicial. Esta disminución nos indica que el 19.33 % de células muertas y el
80.67 % de células vivas (Gráfica 7.1).
En la gráfica 8 nos muestra el comportamiento de células mononucleares totales a 6 años
de criopreservación. En la muestra 5 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años)
de 22.8 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de la concentración a 1.92 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que hubo
una disminución del 91.58 % de células muertas y el 8.42 % de células vivas (Gráfica 8.1).
En los 6 años se notó un aumento en la concentración celular en comparación con los 3
años a 3.65 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial. Esta
disminución nos indica que el 83.99 % de células muertas y el 16.01 % de células vivas
(Gráfica 8.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
61
Gráfica 8. Mononucleares a 6 años de criopreservación
020406080
100120
4 5 6 7 8 9 10 11Número de muestra
Células x103/mL
0 años 3 años 6 años
En la muestra 6 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 10 cel X 103/mL.
A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento en la concentración a
11.31 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que el aumento es del 13.18 % de células
vivas (Gráfica 8.1). En los 6 años se notó un aumento en la concentración celular en
comparación con los 0 y 3 años de 12.63 cel X 103/mL. Este aumento nos indica que el
26.30 % son de células vivas (Gráfica 8.1).
Gráfica 8.1. Porcentaje de células mononucleares totaless a6 años de criopreservación
0
50
100
150
200
250
4 5 6 7 8 9 10 11 Número de muestra
%
0 años, 100 %
% células vivas a 3años% células vivas a 6años
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
62
En la muestra 7 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 2.77 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento en la
concentración a 4.41 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que el aumento es del
59.21 % de células vivas (Gráfica 8.1). En los 6 años se notó un aumento en la
concentración celular en comparación con los 0 y 3 años de 6.05 cel X 103/mL. Este
aumento nos indica que el 118.41 % son de células vivas (Gráfica 8.1).
En la muestra 8 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 18.9 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la
concentración a 10.06 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que hubo una disminución
del 46.77 % de células muertas y el 53.23 % de células vivas (Gráfica 8.1). En los 6 años
se notó una disminución en la concentración celular en comparación con los 0 y 3 años a
1.22 cel X 103/mL. Esta disminución nos indica que el 93.54 % de células muertas y el
6.43 % de células vivas (Gráfica 8.1).
En la muestra 9 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 106.3 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la
concentración a 52.36 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que hubo una disminución
del 50.74 % de células muertas y el 49.26 % de células vivas (Gráfica 8.1). En los 6 años
se notó una disminución en la concentración celular en comparación con los 0 y 3 años a
9.05 cel X 103/mL. Esta disminución nos indica que el 91.49 % de células muertas y el
8.51 % de células vivas (Gráfica 8.1).
En la muestra 10 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 14.5 cel X
103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la
concentración inicial a 13.68 cel X 103/mL (Gráfica 8). Esto nos indica que hubo una
disminución del 5.66 % de células muertas y el 94.34 % de células vivas (Gráfica 8.1). En
los 6 años se notó una disminución en la concentración celular en comparación con los 0 y
3 años a 12.32 cel X 103/mL. Esta disminución nos indica que el 15.03 % de células
muertas y el 84.97 % de células vivas (Gráfica 8.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
63
En la gráfica 9 nos muestra el comportamiento de hemoglobina total a 6 años de
criopreservación. En la muestra 5 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de
0.6 g/dL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó un aumento de la
concentración a 5 g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que hubo un aumento del 733.33 % de
células rojas vivas (Gráfica 9.1). En los 6 años se notó una disminución en la concentración
celular en comparación con 3 años a 3.2 g/dL y un aumento con la concentración inicial.
Esta disminución nos indica que el 433.33 % de células vivas (Gráfica 9.1).
Gráfica 9. Hemoglobina a 6 años de criopreservación
02468
1012
4 5 6 7 8 9 10 11Número de muestra
g/dL
0 años 3 años 6 años
En la muestra 6 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 9.1 g/dL. A los 3
años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la concentración a
6.9 g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que hubo una disminución del 24.18 % de células
muertas y un 75.82 % de células vivas (Gráfica 9.1). En los 6 años se notó una disminución
en la concentración celular en comparación con 0 y 3 años a 6.1 g/dL. Esta disminución nos
indica que el 32.97 % de células muertas y un 67.03 % de células vivas (Gráfica 9.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
64
En la muestra 7 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 6.5 g/dL. A los 3
años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la concentración a
2.4 g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que hubo una disminución del 63.08 % de células
muertas y un 36.92 % de células vivas (Gráfica 9.1). En los 6 años se notó una disminución
en la concentración celular en comparación con 0 años y un ligero aumento con respecto a
los 3 años a 2.5 g/dL. Esta disminución con respecto a la inicial nos indica que el 61.54 %
de células muertas y un 38.46 % de células vivas (Gráfica 9.1).
En la muestra 8 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 4.8 g/dL. A los 3
años de haber estado en criopreservación se notó un aumento de la concentración a 6.9
g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que hubo un aumento del 43.75 % de células vivas
(Gráfica 9.1). En los 6 años se notó una disminución en la concentración celular en
comparación con 0 y 3 años a 3.0 g/dL. Esta disminución nos indica que el 37.50 % de
células muertas y un 62.50 % de células vivas con respecto a la inicial (Gráfica 9.1).
En la muestra 9 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 9.9 g/dL. A los 3
años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la concentración a
0.2 g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que hubo una disminución del 97.98 % de células
muertas y un 2.02 % de células vivas (Gráfica 9.1). En los 6 años se notó una disminución
en la concentración celular en comparación con 0 y 3 años a 0 g/dL. Esta disminución nos
indica que el 100 % de células murieron (Gráfica 9.1).
En la muestra 10 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de 2.7 g/dL. A los
3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución de la concentración a
0.2 g/dL (Gráfica 9). Esto nos indica que la disminución es del 92.59 % de células muertas
y un 7.41 de células vivas (Gráfica 9.1). En los 6 años se notó un aumento en la
concentración celular en comparación con 3 años y una disminución a 0 años a 1.5 g/dL.
Esta disminución nos indica que el 44.44 % de células muertas y un 55.56 % de células
vivas (Gráfica 9.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
65
En la gráfica 10 nos muestra el comportamiento del hematócrito total a 6 años de
criopreservación. En la muestra 5 (médula ósea) tiene una concentración inicial (0 años) de
2.3 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de la concentración a 0.1 cel X 103/mL (Gráfica 10). Esto nos indica que hubo
una disminución del 95.65 % de células muertas y el 4.35 % de células vivas (Gráfica
10.1). En los 6 años se notó un aumento en la concentración celular en comparación con los
3 años a 0.4 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial (0
años). Esta disminución nos indica que el 82.61 % de células muertas y el 17.39 % de
células vivas (Gráfica 10.1).
Gráfica 10. Hematócrito a 6 años de criopreservación
01020304050
4 5 6 7 8 9 10 11
Número de muestra
Células X103/mL
0 años 3 años 6 años
En la muestra 6 (médula ósea) del hematocrito tiene una concentración inicial (0 años) de
26.9 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de la concentración a 0.4 cel X 103/mL (Gráfica 10). Esto nos indica que hubo
una disminución del 98.51 % de células muertas y el 1.49 % de células vivas (Gráfica
10.1). En los 6 años se notó en la concentración celular igual con los 3 años a 0.4 cel X
103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial (0 años). Esta
disminución nos indica la misma que con los 3 años (Gráfica 10.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
66
En la muestra 7 (médula ósea) de hematócrito tiene una concentración inicial (0 años) de 19
cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una disminución
de la concentración a 0 cel X 103/mL (Gráfica 10). Esto nos indica que hubo una
disminución del 100 % de células muertas (Gráfica 10.1). En los 6 años se notó un
aumento en la concentración celular en comparación con respecto a los 3 años a 3.5 cel X
103/mL y una disminución con respecto a la concentración inicial (0 años). Esta
disminución nos indica que el 81.58 % de células muertas y el 18.42 % de células vivas
(Gráfica 10.1).
Gráfica 10.1. Porcentaje de células vivas de hematócrito a 6años de criopreservación
0
20
40
60
80
100
4 5 6 7 8 9 10 11 Número de muestra
%
0 años, 100 %
% células vivas a 3años% células vivas a 6años
En la muestra 8 (médula ósea) de hematócrito tiene una concentración inicial (0 años) de
44.3 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de la concentración a 0.4 cel X 103/mL (Gráfica 10). Esto nos indica que hubo
una disminución del 99.10% de células muertas y el 0.90 % de células vivas (Gráfica
10.1). En los 6 años se notó un ligero aumento en la concentración celular en comparación
con los 3 años a 0.5 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración
inicial (0 años). Esta disminución nos indica que el 98.87 % de células muertas y el
1.13 % de células vivas (Gráfica 10.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
67
En la muestra 9 (médula ósea) de hematócrito tiene una concentración inicial (0 años) de
31 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de la concentración a 0.6 cel X 103/mL (Gráfica 10). Esto nos indica que hubo
una disminución del 98.06 % de células muertas y 1.94 % de células vivas (Gráfica 10.1).
En los 6 años se mantuvo la concentración celular igual a la de 3 años 0.6 cel X 103/mL.
(Gráfica 10.1).
En la muestra 10 (médula ósea) de hematócrito tiene una concentración inicial (0 años) de
11.9 cel X 103/mL. A los 3 años de haber estado en criopreservación se notó una
disminución de la concentración a 0.2 cel X 103/mL (Gráfica 10). Esto nos indica que hubo
una disminución del 98.32% de células muertas y el 1.68 % de células vivas (Gráfica
10.1). En los 6 años se notó un ligero aumento en la concentración celular en comparación
con los 3 años a 1.7 cel X 103/mL y una disminución con respecto a la concentración
inicial (0 años). Esta disminución nos indica que el 85.71 % de células muertas y el 14.29
% de células vivas (Gráfica 10.1).
En la gráfica 11 nos muestra la viabilidad total a 6 años de criopreservación, analizada
con azul de tripano.
En la muestra 5 (médula ósea) tiene una viabilidad inicial (0 años) del 87 % de células
vivas. A los 3 años al haber analizado esta muestra en criopreservación se notó una
disminución en la viabilidad del 70 % de células vivas (Gráfica 11). Lo que nos indica que
hubo una disminución del 19.54 % de células muertas y el 80.46 % de células vivas
(Gráfica 11.1). A los 6 años de haber analizado se notó un aumento en la viabilidad en
comparación con los 3 años del 83 % de células vivas y, una disminución con respecto a la
concentración inicial (0 años). Esta disminución nos indica que el 4.60 % de células
muertas y el 95.40 % de células vivas (Gráfica 11.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
68
Gráfica 11. Viabilidad con azul de tripano a 6 años decriopreservación
50
60
70
80
90
100
4 5 6 7 8 9 10 11Número de muestra
%
0 años 3 años 6 años
En la muestra 6 (médula ósea) tiene una viabilidad inicial (0 años) del 80 % de células
vivas. A los 3 años al haber analizado esta muestra en criopreservación se notó una
disminución en la viabilidad del 71 % de células vivas (Gráfica 11). Lo que nos indica que
hubo una disminución del 11.25 % de células muertas y el 88.75 % de células vivas
(Gráfica 11.1). A los 6 años de haber analizado se notó un aumento en la viabilidad en
comparación con los 3 años del 73 % de células vivas y, una disminución con respecto a la
concentración inicial (0 años). Esta disminución nos indica que el 8.75 % de células
muertas y el 91.25 % de células vivas (Gráfica 11.1).
Gráfica 11.1. Porcentaje de células vivas, evaluadas conazul de tripano a 6 años de criopreservación
50
70
90
110
130
4 5 6 7 8 9 10 11 Número de muestra
%
0 años, 100 %
% células vivas a 3años% células vivas a 6años
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
69
En la muestra 7 (médula ósea) tiene una viabilidad inicial (0 años) del 83 % de células
vivas. A los 3 años al haber analizado esta muestra en criopreservación se notó un aumento
en la viabilidad del 90 % de células vivas (Gráfica 11). Lo que nos indica que el aumento
fue del 8.43 % de células vivas (Gráfica 11.1). A los 6 años de haber analizado se notó una
disminución de la viabilidad en comparación con los 0 y 3 años del 73 % de células vivas.
Esta disminución nos indica que el 12.05 % de células muertas y el 87.95 % de células
vivas (Gráfica 11.1).
En la muestra 8 (médula ósea) tiene una viabilidad inicial (0 años) del 82 % de células
vivas. A los 3 años al haber analizado esta muestra en criopreservación se notó una
disminución en la viabilidad del 71 % de células vivas (Gráfica 11). Lo que nos indica que
hubo una disminución del 13.41 % de células muertas y el 86.59 % de células vivas
(Gráfica 11.1). A los 6 años de haber analizado se notó un aumento en la viabilidad en
comparación con los 3 años del 78 % de células vivas y, una disminución con respecto a la
concentración inicial (0 años). Esta disminución nos indica que el 4.88 % de células
muertas y el 95.12 % de células vivas (Gráfica 11.1).
En la muestra 9 (médula ósea) tiene una viabilidad inicial (0 años) del 92 % de células
vivas. A los 3 años al haber analizado esta muestra en criopreservación se notó una
disminución en la viabilidad del 90 % de células vivas (Gráfica 11). Lo que nos indica que
hubo una disminución del 2.17 % de células muertas y el 97.83 % de células vivas (Gráfica
11.1). A los 6 años de haber analizado se notó una disminución en la viabilidad en
comparación con los 0 y 3 años del 83 % de células vivas. Esta disminución nos indica que
el 9.78 % de células muertas y el 90.22 % de células vivas (Gráfica 11.1).
En la muestra 10 (médula ósea) tiene una viabilidad inicial (0 años) del 95 % de células
vivas. A los 3 años al haber analizado esta muestra en criopreservación se notó una
disminución en la viabilidad del 87 % de células vivas (Gráfica 11). Lo que nos indica que
hubo una disminución del 8.42 % de células muertas y el 91.58 % de células vivas
(Gráfica 11.1). A los 6 años de haber analizado se notó una disminución en la viabilidad en
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
70
comparación con los 0 y 3 años del 82 % de células vivas. Esta disminución nos indica que
el 13.68 % de células muertas y el 86.32 % de células vivas (Gráfica 11.1).
En la gráfica 12, nos muestra las unidades formadoras de colonias (CFU) a 6 años de
criopreservación crecidas con los cultivos de leucocitos.
En la muestra 5 (médula ósea) tenemos que a 0 años se tuvieron 23 CFU. A los 3 años de
criopreservación se notó que disminuyeron las CFU a 15 (Gráfica 12), lo que implica que
hubo una disminución del 34.78 % de CFU no crecidas y del 65.22 % de CFU crecidas
(Gráfica 12.1). En los 6 años se manifestó un ligero crecimiento con respecto a los 3 años,
pero una disminución con los 0 años de 17 CFU (Gráfica 12), implicando una disminución
(con respecto a 0 años) del 26.09 % CFU no crecidas y del 73.91 % de CFU crecidas
(Gráfica 12.1).
Gráfica 12. Cultivo de leucocitos a 6 años
05
101520253035
4 5 6 7 8 9 10 11Número de muestra
CFU
0 años 3 años 6 años
En la muestra 6 (médula ósea) tenemos que a 0 años se tuvieron 25 CFU. A los 3 años de
criopreservación se notó que disminuyeron las CFU a 20 (Gráfica 12), lo que implica que
hubo una disminución del 20 % de CFU no crecidas y del 80 % de CFU crecidas (Gráfica
12.1). En los 6 años se manifestó una disminución de las CFU con respecto a los 0 y
3 años de 17 CFU (Gráfica 12), implicando una disminución (con respecto a 0 años) del
32 % CFU no crecidas y del 68 % de CFU crecidas (Gráfica 12.1).
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
71
Gráfica 12.1. Porcentaje de colonias formadas a 6 años decriopreservación
0
20
40
60
80
100
4 5 6 7 8 9 10 11 Nümero de muestra
%
0 años, 100 %
% de colonias formadasa 3 años% de colonias formadasa 6 años
En la muestra 7 (médula ósea) tenemos que a 0 años se tuvieron 30 CFU. A los 3 años de
criopreservación se notó que disminuyeron las CFU a 28 (Gráfica 12), lo que implica que
hubo una disminución del 6.67 % de CFU no crecidas y del 93.33 % de CFU crecidas
(Gráfica 12.1). En los 6 años se manifestó una disminución de las CFU con respecto a los
0 y 3 años de 25 CFU (Gráfica 12), implicando una disminución (con respecto a 0 años) del
16.67 % CFU no crecidas y del 83.33 % de CFU crecidas (Gráfica 12.1).
En la muestra 8 (médula ósea) tenemos que a 0 años se tuvieron 32 CFU. A los 3 años de
criopreservación se notó que disminuyeron las CFU a 20 (Gráfica 12), lo que implica que
hubo una disminución del 37.50 % de CFU no crecidas y del 62.50 % de CFU crecidas
(Gráfica 12.1). En los 6 años se manifestó un aumento de las CFU con respecto a los 3 años
y un disminución con respecto a 0 años de 27 CFU (Gráfica 12), implicando una
disminución (con respecto a 0 años) del 15.63 % CFU no crecidas y del 84.38 % de CFU
crecidas (Gráfica 12.1).
En la muestra 9 (médula ósea) tenemos que a 0 años se tuvieron 24 CFU. A los 3 años de
criopreservación se notó que aumento las CFU a 25 (Gráfica 12), lo que implica que hubo
un aumento del 4.17 % de CFU crecidas (Gráfica 12.1). En los 6 años se manifestó una
disminución de las CFU con respecto a los 0 y 3 años de 19 CFU (Gráfica 12), implicando
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
72
una disminución (con respecto a 0 años) del 20.83 % CFU no crecidas y del 79.17 % de
CFU crecidas (Gráfica 12.1).
En la muestra 10 (médula ósea) tenemos que a 0 años se tuvieron 30 CFU. A los 3 años de
criopreservación se notó que disminuyeron las CFU a 15 (Gráfica 12), lo que implica que
hubo una disminución del 50 % de CFU no crecidas y del 50 % de CFU crecidas (Gráfica
12.1). En los 6 años se manifestó una disminución de las CFU con respecto a los 0 y
3 años de 11 CFU (Gráfica 12), implicando una disminución (con respecto a 0 años) del
63.33 % CFU no crecidas y del 36.67 % de CFU crecidas (Gráfica 12.1).
Después de haber obtenido las CFU se procedió a realizar frotis de los cultivos de
leucocitos y se tiñeron con la técnica de Wright para identificar la morfología celular
crecida.
Tabla 5. Morfología observada con la técnica de tinción de Wright. En la muestra 1 es de
cordón umbilical, el resto es de médula ósea.
No. de muestra Morfología celular
1 Linfocitos, trombocitos
2 Linfocitos, trombocitos
3 Linfocitos, basófilos, monocitos, neutrófilos, trombocitos, megacariocitos
4 Linfocitos, basófilos, trombocitos y megacariocitos
5 Linfocitos, trombocitos
6 Linfocitos, trombocitos, mielocitos, eosinófilos
7 Linfocitos, trombocitos
8 Linfocitos, basófilos, eosinófilos, trombocitos
9 Linfocitos, basófilos, trombocitos, eritrocitos
10 Linfocitos, mielocitos, eosinófilos
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
73
En el presente estudio hemos realizado el análisis de la viabilidad de células de la línea
blanca criopreservadas por 2 y 6 años a –80°C.
De acuerdo con Borbolla38 plantea que las “células progenitoras hematopoyéticas para ser
usadas en transplantes autólogos de médula ósea, el tiempo adecuado para criopreservarlas
es de seis meses”. Esta determinación que tanto Borbolla38, Torradabella37, Pirnay39 y
Pegg48 se basaron en diversos experimentos, sin embargo, nosotros podemos decir que de
acuerdo con nuestros resultados si se pueden criopreservar por más tiempo y refutar lo
establecido en la literatura.
Si podemos notar en las gráficas de leucocitos y mononucleares totales (Gráficas 1; 1.1; 2;
2.1; 7; 7.1; 8 y 8.1) tanto a dos como a seis años de haber estado en criopreservación a
pesar de mostrar en algunas muestras niveles de concentración muy baja en comparación
con la concentración inicial, se pudo constatar que hubo crecimiento celular en los cultivos
de leucocitos, ya que fueron capaces de formar unidades formadoras de colonias (CFU) en
cantidades aceptables (Gráficas 6; 6.1; 12; 12.1). Esto se puede ver en la tabla 5 las
morfologías celulares observadas en el microscopio óptico, en lo cual nos indica que si no
hubiese habido una viabilidad aceptable entonces no se hubiera manifestado el crecimiento
y morfología celular.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
74
CAPÍTULO XII
CONCLUSIONES
• Existe viabilidad celular aceptable en las células hematopoyéticas criopreservadas a–80°C por dos y seis años, por lo que pueden ser utilizadas en un transplantesalogénicos o autológos a un futuro.
• El promedio de criopreservación a –80°C adecuado se encuentra entre los dos y tresaños, tiempo adecuado para mantener las células hematopoyéticas de la línea blancaen criopreservación ya que, no pierden su capacidad de proliferación. Pasando esetiempo, la cantidad de células de la línea blanca van disminuyendo su capacidad deproliferación.
• Las condiciones de criopreservación que se utilizan en el Hospital Juárez deMéxico, son las adecuadas para guardar células hematopoyéticas de médula ósea yde cordón umbilical.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
75
CAPÍTULO XIII
BIBLIOGRAFÍA
1. Rodger L. Bick., Immunohematology., Hematology, clinical and laboratory
practice. Ed. Mosley. USA. 1993, Vol. 2, 231-256
2. Lee, G.,R., Bithell C. Thomas, et al., The normal henmatopoietic system.
Wintrobe’s clinical hematology. San J. B. London, Lea & Febiger. USA. 1993,
Vol.1., 41-79; 101-145; 223-484
3. Fieldin H. Garrison., El Siglo XIX., Historia de la medicina. Ed. Interamericana, 4ª
Edición, México, D. F. 1966; 409; 454
4. Ganong, W., Líquidos orgánicos circulantes. Fisiología Médica. Ed. Interamericana.
México, D.F. 1976; 426-435.
5. Velasco Lezama, R., “Manual de Prácticas de Hematología”. Universidad
Autónoma Metropolitana, Iztapalapa. División de Ciencias Biológicas y de la
Salud., México, D., F. 1992. p.1
6. Moore, L. K., Etapas del desarrollo embrionario y Tercera semana del desarrollo.
Embriología Básica. Ed. Interamericana. México, D.,F. 1976; 9-11, 40
7. Ham, W. A., Sistema circulatorio., Tratado de Histología. Ed. Interamericana.
1982; 368-395
8. Fawcett, W. D., Tejido linfohematopoyético. Tratado de Histología. Duodécima
edición. Ed. Interamericana-McGraw-Hill. 1988; 468-488
9. Handia. I. R., “Blood, principles and Practice of Hematology”. San J.B. Lippincott.
Company. Philadelphia. 1995; 78-92
10. Rappaport, S., Eritropoyesis y Leucocitos: propiedades, producción y funciones.,
Introducción a la Hematología. Ed. Salvat. 1989; 1-9, 211-229
11. Beutler, E. et al., Clinical evaluation of the patient and Hematopoietic stem cells,
progenitor cells, and Cytokines. Williams Hematology., Sixt Edition. McGraw-
Hill. 2001; 22-24, 153-164
12. Stites, P, D., Abba I. Terr. Inmunología Básica y Clínica. 7ª Edición. Ed. Manual
Moderno. México, D.F. 1993. p. 129
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
76
13. Rojas Montoya, W., Fagocitosis., Inmunología. 8a Edición. Corporación para
Investigaciones Biológicas. Medellín, Colombia. 1990; 28-63
14. Neidhart, J. A., “Hematopoietic Cytokines” Cancer Supplemment 1993, 72: 3381-
86.
15. Hampson, L., Dexter, M. T., and Hampson, I., “The Biology of Haemapoiesis”
1996. http://haem.nus.edu.sg/ishapd/1996/1996/082.pdf (consultado en marzo 2004)
16. Barnes D. W., Loutit, J. F., “Haemopoietic stem cells in the periperal blood” The
Lancet. 1967: Nov. 25, 1138-1141
17. Humphries, R. K., Eaves, A. C., Eaves, C. J., “Self-renewal of hemopoietic stem
cells during mixed colony formation in vitro” Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981, 78:
6: 3629-3633
18. Nakahata, T., Ogawa, M., “Identification in cultures of a class of hemopoietic
colony-forming units with extensive capability to self-renew and generate
multipotential hemopoietic colonies” Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982, 79: 3843-
3847.
19. Lord, B.I. and Marsh C.W., “Enrichment of progenitor cell populations from murine
and human haemopoietic tissue” Haemopoiesis. A Practical Approach, New York,
Oxford University Press, 1993, 21-35
20. Worton, R. G., McCulloch, E. A. and Till, J. E., “Physical Separation of
Hemopoietic Stem Cells from Cells Forming Colonies in Culture”. J. Cell Physiol.,
1969. 74: 171-182.
21. Metcalf, D., T. R. Bradley and W. Robinson., “Analysis of colonies developing in
vitro from mouse bone marrow cells stimulated by kidney feeder layers or leukemic
serum”, J. Cell. Physiol., 1967; 73: 191
22. Till, J. E., and McCulloch, E. A., “A direct measurement of the radiation sensitivity
of normal mouse bone marrow cells”. Rad. Res., 1961, 14: 213-222.
23. Heyworth, C. M. and Spooncer, E., “In vitro clonal assays for murine
multipotential and lineage restricted myeloid progenitor cells”. Haemopoiesis. A
practical approach. Edited by N. G. TESTA and G. MOLINEUX. Oxford
University Press. 1993; 37-53
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
77
24. Coutinho, L. H., Gillece, E. A. et al., “Clonal and long-term cultures using human
bone marrow”, Haemopoiesis. A practical approach. Edited by N. G. TESTA and G.
MOLINEUX. Oxford University Press. 1993; 75-106
25. Pluznik D. H., Sachs L. “The cloning of normal “mast” cells in tissue culture” J.
Cell Physiol., 1966: 319-324
26. Kan, O. A. D. Whetton, and Heyworth C. M., “Development of haemopoietic cells
in liquid culture”, Haemopoiesis. A practical approach. Edited by N. G. TESTA and
G. MOLINEUX. Oxford University Press. 1993; 123-137
27. Wolf, N. S. and Threntin, J. J., “Effect of Hemopoietic Organ Stroma on
Diferentiation of Pluripotent Cells”, Hemopoitic Colony Studies. Bayolor
University College of Medicine, Houston, Texas.1968; 205-214
28. Curry, J. L., and Trentin J. J., “Hemopoietic spleen colony studies: I. Growth and
differentiation” Develop. Biol. 1967; 15: 395-410
29. Siminovitch, L., McCulloch, E. A. and Till, J. E., “The distribution of colony-
forming cells among spleen colonies” J. Cell. Comp. Physiol. 1963; 62, 327-336
30. Lewis, J. P., and Trobaugh, F. E. Jr., “Haemopoietic stem cells” Nature, 1964;
204:589
31. McCulloch, E. A., “Les clones de cellules hematopoietiques in vivo” Rev. Franc
Etudes Clin. et Biol.., 1963; 8: 15-19
32. Sanders, F. K., and Burford, B. O., “Asocites tumors from BHK 21 cells
transformed in vitro by polyoma virus” Nature, 1964; 2201: 786-789
33. McPherson, I., and Montagnier, L., “Agar suspension culture for the selective assay
of cells transformed by polyoma virus”. Virol., 1964; 23; 291-294
34. Spooncer, E., Eliason, J., and Dexter, T. M., “Long-term mouse bone marrow
cultures”, Haemopoiesis. A practical approach. Edited by N. G. TESTA and G.
MOLINEUX. Oxford University Press. 1993; 55-73
35. Ogawa, M., “Differentiation and proliferation of Hematopoietic Stem Cells”. Blood
1993; 81: 2844-2853
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
78
36. Heyworth, C. M., and Spooncer, E., “In vitro clonal assays for murine
multipotential and lineage restricted myeloid progenitor cells”, Haemopoiesis. A
practical approach. Edited by N. G. TESTA and G. MOLINEUX. Oxford
University Press. 1993; 37-53
37. Torradadella, M., “Criopreservación celular”, Gac. Méd. Mex. 2002; 138: 128-129
38. Borbolla Escoboza, J. R., “Nuevo método de criopreservación de células
progenitoras hematopoyéticas vuelve más accesible la realización de transplantes de
médula ósea” Revista Digital de Postgrado, Investigación y Extensión del Campus
Monterrey, 2001; Año l4, Núm. 56
http://www.mty.itesm.mx/die/ddre/transferencia/57/57-III.02.html (consultado enmarzo 2004)
39. Pirnay, J. P., Hanon, P., et al., “ultrarapid freezing: a simple methods for skin
preservation”. European Association of Tissue Banks. 5th International Conference
on Tissue Banking: 1996; 14
40. Córdova-Caballero, M. S., “Transplante de células progenitoras hematopoyéticas”.
Gac. Méd. Méx. 2002, Vol. 138, Suplemento No. 1;, S-126 - 127
41. Armitage, J. O., “Bone marrow transplantation”. N Engl J Med 1994; 330: 827-
831.
42. Haley R, Harvath L, Sugarman J., “Ethical issues in cord blood banking: summary
of a workshop”. Transfusion 1998; 38: 863-867.
43. Broxmeyer, H. E., Douglas, G. W., Hangoc, G., et al., “Human umbilical cord
blood as a potencial source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells”.
Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:3828-3832.
44. Rubinstein, P., Dobrila, L., Rosenfield, R. E., et al., “Processing and
cryopreservation of placental umbilical cord blood for unrelated marrow
reconstitution”. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:3828-3832.
45. Rubinstein, P., et al., “Outcomes among 562 recipients of placental-blood
transplants from unrelated donors”. N Engl J Med 1998; 339:1565-77.
46. Dicke, K. A., Jagannath, S., Spitzer, G., et al., “The role of autologous bone marrow
transplantation in varius malignancies”. Semin. Hematol. 1984; 21; 109-22
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICASCRIOPRESERVADAS POR 2 Y 6 AÑOS A –80°C
79
47. León, R. E., “Transplante de médula ósea alogénico”. Rev. Inv. Clin. 1993; 45; 77-
84.
48. Villalba, R., Benitez, J., et al., “Criopreservation of human skin with propane-1,2-
diol” Cryobiology, 1996; 33; 525-529
49. España; Real Decreto 400/1996 sobre aparatos y sistema de protección para uso en
atmósferas explosivas. Reglamento Aparatos a Presión. MIE AP-10, 1996
50. Pegg, D. E., “Viability assays for preserved cells, tissues, and organs”. Cryobiology.
1997; 26: 212-231
FUENTES ELECTRÓNICAS
1.1 http://www.udl.es/dept/medicina/citoweb/pregrau/hemato/hemopoyesis/index.htm. (Noviembre
de 2003)
1.2 http://www.tuotromedico.com/temas/eritrocitos.htm. (Noviembre de 2003)
1.3 http://www.udl.es/dept/medicina/citoweb/pregrau/hemato/mo/index.htm. (Noviembre de 2003)
http://www.med.uva.es/~pingo/Inmunologia/Apuntes/tema2.htm (Noviembre de 2003)