UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · A Daniel Pilco, testigo de mi...
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i UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DETECCIÓN DEL VIRUS DE INFLUENZA AVIAR EN Gallus gallus domesticus DE GRANJAS INDUSTRIALES DEL ECUADOR MEDIANTE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Trabajo de Grado presentado como requisito para obtener el Título de Médico Veterinario y Zootecnista AUTORA: KATHERINE PAMELA LUGO CEPEDA TUTORA: MVZ. Mg. María Revelo Quito, Mayo 2017
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
DETECCIÓN DEL VIRUS DE INFLUENZA AVIAR EN Gallus gallus
domesticus DE GRANJAS INDUSTRIALES DEL ECUADOR
MEDIANTE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
Trabajo de Grado presentado como requisito para obtener el
Título de Médico Veterinario y Zootecnista
AUTORA:
KATHERINE PAMELA LUGO CEPEDA
TUTORA:
MVZ. Mg. María Revelo
Quito, Mayo 2017
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DEDICATORIA
A Dios, por guiarme en todo momento, por no permitirme flaquear en los
momentos difíciles y darme la fuerza para llegar al final de esta gran meta
personal.
A mis padres, Guillermo Lugo y Dalila Cepeda, quienes me dieron apoyo
incondicional y han sido un ejemplo de superación y dedicación.
A mis hermanas, Andrea, Diana y Nicole por su compañía, amistad y por
permanecer junto a mí en todo momento.
A Daniel Pilco, testigo de mi desarrollo personal y profesional, por
haberme brindado su amor y apoyo día a día.
A mis abuelitos, Marco Lugo, Florí Cepeda, Guillermina Salazar y Bertha
Rodríguez por cuidarme desde donde estén.
Katherine Pamela Lugo Cepeda
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco a la Universidad Central del Ecuador y la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia, por haberme entregado todas las herramientas
para mi formación profesional. A todos los docentes que compartieron sus
conocimientos y experiencias con quienes apenas empezábamos a vivir
esta maravillosa experiencia.
A mi Tutora de Tesis, MVZ. Mg María Revelo, por haberme brindado la
oportunidad de realizar esta investigación con su guía y conocimiento, así
también por la paciencia y el tiempo que le dedico al desarrollo de esta
investigación.
A la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro
(AGROCALIDAD), por haber aceptado la realización de este estudio y
facilitar los recursos y espacios necesarios para el desarrollo de la
investigación realizada. De manera particular, se agradecen los
conocimientos y guía brindados por el MVZ. Javier Vargas y la MVZ.
Nataly Morales.
Finalmente a mis amigos y compañeros de aula con quienes durante
estos años compartimos un mismo sueño.
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v
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vii
viii
ix
ÍNDICE GENERAL
DEDICATORIA ........................................................................................... ii
AGRADECIMIENTO .................................................................................. iii
AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL ........................................ iv
INFORME DEL TUTOR ............................................................................. v
ÍNDICE GENERAL ..................................................................................... ix
LISTA DE CUADROS ............................................................................... xii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................ xiii
RESUMEN ............................................................................................... xiv
ABSTRACT ............................................................................................... xv
CAPÍTULO I ............................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
CAPÍTULO II .............................................................................................. 5
OBJETIVOS ............................................................................................... 5
2.1. OBJETIVO GENERAL .................................................................. 5
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................... 5
CAPÍTULO III ............................................................................................. 6
MARCO TEÓRICO .................................................................................... 6
3.1. DEFINICIÓN .................................................................................... 6
3.2. SINÓNIMOS .................................................................................... 6
3.3. SIGNIFICADO ECONÓMICO .......................................................... 7
3.4. SIGNIFICADO EN SALUD PÚBLICA .............................................. 8
3.5. HISTORIA ....................................................................................... 9
3.6. ETIOLOGÍA ................................................................................... 10
3.6.1. Clasificación ............................................................................ 10
3.6.2. Morfología ............................................................................... 11
3.6.3. Replicación del virus ............................................................... 11
3.6.4. Susceptibilidad a agentes químicos y físicos .......................... 12
x
3.6.5. Antigenicidad y Patogenicidad ................................................ 13
3.7. EPIDEMIOLOGÍA .......................................................................... 14
3.7.1. Transmisión y Transportadores .............................................. 14
3.8. PATOLOGÍA .................................................................................. 14
3.8.1. Signos clínicos ........................................................................ 14
3.8.2. Morbilidad y mortalidad ........................................................... 15
3.8.3. Lesiones Macroscópicas ......................................................... 16
3.8.4. Lesiones Microscópicas .......................................................... 16
3.8.5. Inmunidad ............................................................................... 17
3.9. DIAGNÓSTICO ............................................................................. 17
3.9.1. Serología ................................................................................ 18
CAPÍTULO IV ........................................................................................... 20
MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................... 20
4.1. Factores de estudio ....................................................................... 20
4.2. Población objeto de estudio .......................................................... 20
4.3. Unidades de muestreo .................................................................. 20
4.4. Tamaño de muestra ...................................................................... 21
4.5. Método .......................................................................................... 24
4.5.1. Fase de Campo (muestreo) .................................................... 24
4.5.2. Fase de Laboratorio ................................................................ 25
CAPÍTULO V............................................................................................ 32
RESULTADOS ......................................................................................... 32
5.1. Ausencia y presencia de Influenza aviar en muestras serológicas a
través de ELISA competitivo. ............................................................... 32
5.2. Serotipificación a través de HI para los serotipos H5N2 y H7N3 a
partir de los resultados obtenidos en ELISA ........................................ 40
CAPÍTULO VI ........................................................................................... 42
DISCUSIÓN ............................................................................................. 42
CAPÍTULO VII .......................................................................................... 46
CONCLUSIONES .................................................................................... 46
xi
CAPÍTULO VIII ......................................................................................... 47
RECOMENDACIONES ............................................................................ 47
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................ 48
ANEXOS .................................................................................................. 55
Anexo 1. Tabla de la muestra requerida para detectar enfermedad
según Cannon y Roe. ........................................................................... 55
Anexo 2. Hoja para vigilancia activa de AGROCALIDAD ..................... 56
Anexo 3. Registro de datos de las granjas muestreadas a nivel nacional
para Influenza Aviar. ............................................................................ 57
Anexo 4. Hoja de protocolo para la distribución de muestras en placa
multipocillo de ELISA. .......................................................................... 67
Anexo 5. Procedimiento ELISA competitivo. ........................................ 68
Anexo 6. Tabla para titulación de los antígenos de Influenza aviar
(H5N2 y H7N3). .................................................................................... 70
Anexo 7. Procedimiento de Inhibición de la hemoaglutinación (HI). ..... 71
Anexo 8. Hoja de distribución de muestras para la realización de prueba
HI. ......................................................................................................... 73
Anexo 9. Abstract certificado ................................................................ 74
xii
LISTA DE CUADROS
CUADRO pág.
1. Granjas muestreadas a nivel nacional para la detección de
Influenza Aviar ............................................................................. 23
2. Resultados de la prueba ELISA competitivo para las granjas
muestreadas en el Ecuador Continental. ...................................... 33
3. Resultados de ELISA competitivo descritos por estrato de
producción………………………………………………………………38
4. Serotipificación de las granjas para H5N2 mediante HI …………..39
5. Serotipificación de las granjas para H7N3 mediante HI….………..40
xiii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA pág.
1. Captura de pantalla del cálculo muestreal con el uso del software
libre ProMESA………………………………………………………….22
2. Proporción de granjas del Ecuador continental negativas,
sospechosas y positivas para Influenza aviar a través de la prueba
ELISA……………………………………………………………………37
xiv
DETECCIÓN DEL VIRUS DE INFLUENZA AVIAR EN Gallus gallus domesticus DE GRANJAS INDUSTRIALES DEL ECUADOR MEDIANTE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
Autora: Katherine Lugo Cepeda Tutora: MVZ. Mg. María Revelo
RESUMEN
Influenza aviar (IA) es una enfermedad causada por un virus perteneciente a la familia Orthomyxoviridae, al género Influenzavirus A e influenza tipo A. El genoma del virus se caracteriza por poseer ocho segmentos de ARN de cadena simple con polaridad negativa. La enfermedad es zoonótica y afecta a diferentes especies de aves. Por lo tanto, la detección del virus es importante para proporcionar una respuesta rápida y evitar la posible transmisión zoonótica, brotes incontrolables y pérdidas económicas derivadas de la enfermedad. Las pruebas serológicas permiten la deteccción de anticuerpos ante IA y constituyen una herramienta diagnóstica indirecta y efectiva. El trabajo de investigación realizado tuvo por objetivo detectar el virus de Influenza aviar en aves de corral de granjas industriales del Ecuador Continental mediante diagnóstico serológico, Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA) e Inhibición de la Hemoaglutinación (HI). El tipo de muestreo que se realizó fue aleatorio simple. El tamaño de muestra fue determinado a través de la fórmula para estimar detección de la presencia de la enfermedad, muestreándose al azar 152 granjas industriales, sin considerar número de granjas por provincias o categoría de producción. Para la prueba de ELISA competitivo se empleó el kit comercial de IDvet. En total fueron analizados 3.800 sueros. A partir de la prueba de ELISA se obtuvieron 3.95% de granjas positivas (6 granjas positivas), 1.97% de granjas sospechosas (3 granjas sospechosas) y 94.08% de granjas negativas (143 granjas negativas). Los sueros sospechosos y positivos obtenidos por ELISA fueron serotipificados para los subtipos H5N2 y H7N3 mediante la técnica HI. Los resultados obtenidos de la seropificación para H5N2 y H7N3 fueron negativos para las 9 granjas analizadas. Por consiguiente, no se detectó la presencia del virus de IA en aves de corral (Gallus gallus domesticus) de granjas industriales del Ecuador Continental. Palabras claves: Influenza, aves, Ecuador, detección, serología.
xv
DETECTION OF AVIAN INFLUENZA VIRUS IN Gallus gallus domesticus OF INDUSTRIAL POULTRY FARMS IN ECUADOR
THROUGH SEROLOGIC DIAGNOSIS
Author: Katherine Lugo Cepeda. Tutor: MVZ. Mg. María Revelo
ABSTRACT
Avian Influenza (AI) is diseases caused by a virus from Orthomyxoviridae family, Influenzavirus A virus and type A influenza. The virus genome is characterized for having eight RNA segments, simple chain and negative polarity. It is a zoonotic disease and affects bird species. Hence, virus detection is important to provide a quick response and prevent possible zoonotic transmission, uncontrollable outbreaks and economic losses derived from the disease. Serologic tests allowed for the detection of anti-AI antibodies and are an indirect and effective diagnosis tool. The investigation work was intended to detect the avian influenza virus in birds of industrial poultry farms of the continental Ecuador through serologic diagnosis, Enzymes-Linked Immune-absorption Test (ELISA) and Hemoagglutination Inhibition (HI). Simple at random sampling was conducted. The sample size was determined through the formula to estimate detection of the disease, with samples taken at random from 152 industrial farms, without taking account the amount of farms per provinces or production category. For ELISA competitive test and IDvet commercial test was used, with a total of 3.800 sera analyzed. From ELISA test 3.95% samples were taken from positive farms (6 positive farms), 1.97% of suspicious farms (3 suspicious farms) and 94.08% of negative farms (143 negative farms). Suspicious and positive sera obtained from ELISA were sera-typified for H5N2 and H7N3 through HI technics. Results were sera-typified for H5N2 and H7N3 were negative for the 9 farms analyzed. Hence, no AI virus was found in farm poultry (Gallus gallus domesticus) from industrial farms in the continental Ecuador. Key words: Influenza, birds, Ecuador, detection, serology.
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
La industria avícola en el Ecuador es uno de los sectores económicos con
mayor crecimiento debido al alto consumo y demanda de carne de pollo y
huevos (PP Digital, 2015). El consumo de carne de pollo para los
ecuatorianos ha crecido de 9kg/persona/año en 1990 a 35kg/persona/año
en 2015 (CONAVE, 2015; PP Digital, 2015). Así también, el consumo per-
cápita de huevos ha pasado de 90 huevos/persona/año a 140
huevos/persona/año en los mismos 25 años (CONAVE, 2015; El
Universo, 2014). El incremento sostenido del consumo de carne de pollo y
huevos está relacionado con su importancia como proteína de bajo costo
comparado a otras fuentes como la carne de res y de cerdo (El Universo,
2014; Ramírez, 2016).
La eficiencia en la producción por parte de las industrias avícolas, también
contribuye con el crecimiento de la actividad avícola (Ramírez, 2016).
Según el Censo Avícola 2015, las provincias con mayor cantidad de
granjas avícolas de pollo de engorde son: Guayas, Santo Domingo de los
Tsáchilas y Pichincha. En lo referente a aves ponedoras comerciales las
provincias de Tungurahua, Cotopaxi y Manabí poseen la mayor cantidad
de granjas. Mientras que las granjas de aves reproductoras pesadas se
encuentran localizadas principalmente en Guayas, Pichincha y Santo
Domingo de los Tsáchilas (MAGAP, 2015). Para el 2015, se estimó una
producción anual de 115.319.729 de aves dentro de la categoría de
engorde constituyéndose en una fuente importante de trabajo directo e
indirecto en el país. El progreso tan acelerado que ha tenido el sector
avícola en las últimas décadas conlleva al desarrollo de industrias de
2
piensos, incubadoras, faenadoras, entre otras (MAGAP, 2015; PP Digital,
2015). Sin embargo, el progreso del sector puede verse afectado por la
presencia de enfermedades que alteren el desempeño productivo de las
aves o que causen alta morbilidad y mortalidad en las mismas. La
Influenza aviar (IA) es una de las enfermedades que puede causar
grandes pérdidas económicas por la alta morbi-mortalidad (Abad &
Pizarro, 2006; OIE, 2016c).
Influenza aviar es una enfermedad causada por el virus perteneciente a la
familia Orthomyxoviridae y al género Influenzavirus A (Beldomenico &
Uhart, 2008; OIE, 2016d). El virus de influenza tipo A afecta a las aves así
como, a mamíferos incluyendo el hombre (Beldomenico & Uhart, 2008;
OIE, 2016c). Además diferentes subtipos del virus tipo A de Influenza se
encuentran distribuidos mundialmente, afectando muchos países y
regiones. Dentro de la lista de países que han notificado IA ante la OIE
(Organización Mundial de Sanidad Animal) durante el 2016 se destacan:
Bangladesh, Camerún, Canadá, China, Corea, Estados Unidos, Francia,
Hong Kong, India, Irak, Italia, Líbano, México y Rusia (OIE, 2016a). Según
el Código Sanitario para los Animales Terrestres de la OIE, en particular
los subtipos H5 y H7 son de declaración obligatoria (OIE, 2016b, 2016c).
Influenza aviar pertenece a la lista de enfermedades de declaración
obligatoria de esta organización (Buscaglia, 2004; OIE, 2016c). A esta
lista pertenecen enfermedades de importancia en el comercio
internacional y que son transmisibles muy rápidamente. Causan
consecuencias sociales y económicas debido al empleo de diversas
estrategias sanitarias como despoblamiento, cuarentenas, entre otras y
consecuencias de salud pública en el caso de enfermedades zoonóticas.
(Buscaglia, 2004; CFSPH, 2015; OIE, 2016b). El virus de IA que afecta a
los humanos, puede causar elevadas tasas de morbilidad y mortalidad.
Aproximadamente, 649 casos humanos causados por IA H5N1 fueron
confirmados y reportados a la Organización Mundial de Salud (OMS),
entre los años 2003 a 2013 (OMS, 2014). Dichos reportes fueron
realizados en países asiáticos, africanos, europeos y de Medio Oriente
3
(FAO, OIE, & WHO, 2011). Históricamente el origen de pandemias se da
por la transmisión del virus de aves al hombre (García & Ramos, 2006).
La transmisión del virus de IA a mamíferos se puede dar principalmente
por contacto directo con aves infectadas o con sus tejidos. No obstante,
también se menciona que existe una transmisión indirecta por fomites
(Alexander, 2000). No existe signos patognomónicos para IA, por lo que
se debe diferenciar de enfermedades que produzcan signos respiratorios
similares (Beldomenico & Uhart, 2008; CFSPH, 2015). Por lo tanto, es
necesario la confirmación mediante pruebas de laboratorio para un
diagnóstico concluyente (Easterday, Hinshaw, & Halvorson, 2011; Saif et
al., 2008). El virus de IA puede ser identificado en el laboratorio mediante:
Inmunodifusión en Gel Agar (AGID), Ensayo por Inmunoabsorción Ligado
a Enzimas (ELISA), Inhibición de la Hemaglutinación (HI) y Reacción en
Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa (RT-PCR) (Saif et al.,
2008).
La serología es útil para la vigilancia epidemiológica y para demostrar la
ausencia de la enfermedad (OIE, 2016b; Vineza, 2005). En avicultura, la
prueba de ELISA es una herramienta importante para el análisis del
estado inmunitario del ave (OIE, 2016b; Vineza, 2005). Según el artículo
10.4.33. del Código Sanitario de Animales Terrestres de la OIE, la prueba
HI es fiable en las aves y además permite clasificar al virus en sus
diferente subtipos (OIE, 2016b).
La introducción del virus de IA traería terribles consecuencias
epidemiológicas causando morbilidad y mortalidad en humanos e
importantes pérdidas económicas a nivel de industria avícola, debido al
sacrificio de aves e inmunización de poblaciones expuestas (Easterday et
al., 2011; OIE, 2016b). Sin mencionar la drástica reducción del consumo
de carne de pollo y huevos como efecto secundario (Beldomenico &
Uhart, 2008). Por lo tanto, la detección del virus es importante para
proporcionar una respuesta rápida y evitar la posible transmisión
4
zoonótica, brotes incontrolables y pérdidas económicas derivadas de la
enfermedad.
El trabajo de investigación realizado tuvo por objetivo detectar el virus de
Influenza aviar en aves de corral de granjas industriales del Ecuador
mediante diagnóstico serológico. Para lo cual, se empleó sueros
sanguíneos tomados de aves de granjas de reproducción, postura y
engorde de todas las provincias del Ecuador Continental. Se utilizó la
prueba de ELISA competitivo comercial de ID Screen® Influenza A
Antibody Competition Multi-species (FLUAcA ver 0914 ES) (especificidad
del 100% y sensibilidad del 93%). Los resultados positivos y sospechosos
obtenidos mediante ELISA se serotipificaron a través de HI.
5
CAPÍTULO II
OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
Detectar el virus de Influenza aviar en Gallus gallus domesticus de
granjas industriales del Ecuador mediante diagnóstico serológico.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar la ausencia o presencia de Influenza aviar en muestras
serológicas provenientes de aves reproductoras, ponedoras
comerciales y pollos de engorde a través de ELISA competitivo.
• Serotipificar los resultados obtenidos en ELISA mediante la técnica de
Inhibición de la hemoaglutinación (HI) enfocándose a los serotipos de
interés H5N2 y H7N3.
6
CAPÍTULO III
MARCO TEÓRICO
3.1. DEFINICIÓN
La Influenza aviar (IA) es una enfermedad viral infecto-contagiosa,
causada por el virus de influenza tipo A, perteneciente a la familia
Orthoyxoviridae (Buscaglia, 2004; De Souza & Pippi, 2000; Easterday et
al., 2011; Saif et al., 2008). La enfermedad produce problemas
patológicos de alto impacto en aves pero también en seres humanos y
pequeños mamíferos (CFSPH, 2015; De Souza & Pippi, 2000; Easterday
et al., 2011). El virus de IA ha sido aislado de varias aves domésticas
incluyendo pollos, gallinas de Guinea, pavos, codornices, patos, gansos,
faisanes; y, de aves silvestres como: patos, gansos, gaviotas, gallinetas,
garzas, entre otras en todo el mundo (Buscaglia, 2004; De Souza & Pippi,
2000; Easterday et al., 2011).
3.2. SINÓNIMOS
Influenza aviar se conocía anteriormente como: gripe de las aves, “fowl
plague”, plaga de las aves de corral, peste aviar, Geflϋgel pest, Tifus
exudativo gallinarium, la peste de Brunswick y enfermedad de Brunswick
(Alexander, 2000; Buscaglia, 2004; De Souza & Pippi, 2000; Saif et al.,
2008).
7
3.3. SIGNIFICADO ECONÓMICO
En países como Australia, los brotes de IA han originado pérdidas de más
de dos millones de dólares debido a los gastos incurridos para la
erradicación del virus (Alexander, 2007; Easterday et al., 2011; Spickler,
Trampel, & Roth, 2008). En Estados Unidos-Pensilvania, también lA ha
generado importantes gastos económicos que alcanzaron más de 60
millones de dólares, para erradicar al virus H5N2 altamente patógeno
(Buscaglia, 2004; Easterday et al., 2011; García & Ramos, 2006).
La mayoría de los casos de Influenza aviar han originado impactos
económicos muy elevados y restricciones comerciales (Alexander, 2000;
CDC, 2017; García & Ramos, 2006). Sin embargo, no se puede predecir
las pérdidas económicas por brotes futuros de la enfermedad debido a
que IA tiene varias formas de presentación y puede afectar a diferentes
especies de aves (Alexander, 2000; Buscaglia, 2004; Easterday et al.,
2011). Además, a nivel industrial existen otros factores que influencian la
presentación de la enfermedad como: el número de granjas afectadas, las
estrategias de control y erradicación, estrés ambiental, edad y sexo de las
aves (Buscaglia, 2004; CDC, 2017; Easterday et al., 2011; Saif et al.,
2008).
El costo final por pérdidas económicas producidas por IA no está definido
exclusivamente por la mortalidad generada en las granjas avícolas, sino
también incluyen gastos correlacionados con el manejo del brote
(Alexander, 2000; De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011). Dentro
de los costos deben considerarse los gastos para: despoblamiento,
medicación contra bacterias secundarias, alimentación extra, cuarentena,
vacunas, limpieza, sanidad e indemnizaciones (Easterday et al., 2011;
OIE, 2016b; Saif et al., 2008). Adicionalmente, la industria avícola
enfrenta pérdidas económicas derivadas de la disminución de la calidad
de carne y huevos, así como la pérdida del comercio local e internacional
(Easterday et al., 2011; OIE, 2016b; Saif et al., 2008).
8
3.4. SIGNIFICADO EN SALUD PÚBLICA
Influenza aviar es una enfermedad zoonótica, es decir, puede ser
transmitida a los humanos (Alexander, 2007; Capua & Alexander, 2006;
OIE, 2016c). La transmisión puede darse por contacto con aves
infectadas, por lo que se recomienda usar ropa de protección a las
personas que trabajan con aves sospechosas a infección (Capua &
Alexander, 2006; FAO et al., 2011; OIE, 2016c). Solo algunas de las
cepas de Influenza aviar pueden afectar al hombre. Los dos subtipos de
IA reportados frecuentemente en la población China durante los últimos
años, han sido el virus de alta patogenicidad (IAAP) H5N1 y el virus de
baja patogenicidad (IABP) H7N9 (Capua & Alexander, 2006; Capua &
Alexander, 2002; CFSPH, 2015). El brote epidémico, ocurrido en 1997 en
Hong Kong, registró 16 casos de enfermedad en humanos con una
letalidad del 30% luego de que la infección se desarrollará en gallinas
domésticas (Beldomenico & Uhart, 2008; Buscaglia, 2004; CDC, 2015;
Suárez, 2005). El virus H5N1 sigue circulando y es endémico en países
como: Bangladesh, China, Egipto, Indonesia y Vietnam. Por lo tanto, IA es
una constante amenaza para la salud humana provocando esporádicos
casos de infección en varios países (Capua & Alexander, 2002; FAO et
al., 2011; OIE, 2016a). En el año 2011, se reportó a la OMS 565 casos
confirmados de enfermedad causada por H5N1 con una tasa de letalidad
del 58.6% (FAO et al., 2011; OIE, 2016a; OMS, 2014). A pesar del riesgo,
que representa H5N1 para la salud humana, la OIE afirma que es poco
probable que exista una propagación de la enfermedad entre humanos.
Así también, no es certero que se transmita por el consumo de carne de
pollo y huevos (OIE, 2016c). En consecuencia, es necesaria una
vigilancia epidemiológica frecuente para la detección, notificación y
caracterización del virus desde el aspecto de la salud pública (Capua &
Alexander, 2002; FAO et al., 2011; García & Ramos, 2006).
9
3.5. HISTORIA
El virus de IA ha ido evolucionando, es decir, cambiando genéticamente
mediante mutaciones, recombinación genética o reordenamiento
cromosómico (FAO et al., 2011; García & Ramos, 2006; Suárez, 2005).
Con el tiempo el virus de influenza ha circulado en poblaciones humanas
y animales rompiendo barreras interespecies (De Souza & Pippi, 2000;
FAO et al., 2011; Suárez, 2005). La primera aparición de IA conocida
como “Peste aviar”, tal y como lo mencionan varios autores, fue descrita
en Italia por Perroncito en el año de 1878 (Buscaglia, 2004; De Souza &
Pippi, 2000; Easterday et al., 2011). Saif (2008) y De Souza (2000) hacen
referencia a lo descrito por Centanni y Savunozzi, en 1901, quienes
mencionaron que IA era un virus. Pero fue hasta 1955 que se clasificó al
agente como virus de Influenza tipo A (De Souza & Pippi, 2000; Easterday
et al., 2011; Saif et al., 2008).
Durante el siglo XX se han presentado varios brotes de la enfermedad en
diferentes partes del mundo pero se debe mencionar que la mayoría de
problemas han sido causa de los subtipos H5 y H7 (Capua & Alexander,
2004; CDC, 2015; De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011).
Históricamente, el subtipo H7 altamente patógeno fue de mucha
importancia en la década de 1800. El subtipo H5, causó epizootias
durante los 90s en: Estados Unidos, Reino Unido y en México (Buscaglia,
2004; De Souza & Pippi, 2000; García & Ramos, 2006).
Debido a la aparición de diferentes brotes, en varias partes del mundo,
nace un interés mundial por lo que se han realizado varios simposios,
para tratar distintos aspectos de la enfermedad en los años 1981, 1986,
1997 y 2002 (Buscaglia, 2004; Easterday et al., 2011; García & Ramos,
2006). En el primero, se trató la definición de cepas altamente patógenas
e identificación de fuentes del virus. El segundo simposio de Influenza
aviar se enfocó en la búsqueda de soluciones y medidas contingentes
10
ante posibles brotes (Alexander, 2003; Easterday et al., 2011; García &
Ramos, 2006).
Las aves no son las únicas afectadas por el virus de Influenza aviar. El
virus altamente patógeno H5N1 causó muertes humanas por primera vez
en Hong Kong, en 1997 (CDC, 2015; De Souza & Pippi, 2000; Suárez,
2005). En el año 2002, en este mismo lugar, se registra por primera vez
mortalidad en aves silvestres causada por un virus de IA altamente
patógeno (Alexander, 2007; Capua & Alexander, 2006; OIE, 2016c). En
2006, aparece por primera vez el virus H5N1 en Nigeria (Alexander, 2007;
OIE, 2016c). En el año 2004, en Canadá se informa de una infección por
H7N3 en aves y humanos. Según la OMS, desde de 2014 se han
detectado brotes de Influenza H5 de alta patogenicidad en Canadá y
Estados Unidos en aves domésticas y silvestres. Durante el 2015, fueron
afectados 21 estados de Estados Unidos por los subtipos H5N2, H5N1 y
H5N8, detectándose casos de infección en aves domésticas de traspatio y
comerciales. En el año 2016 y en lo que va del año 2017 se han notificado
a la OIE los subtipos H5N2 y H7N3 en Canadá, México y Estados Unidos
(Beldomenico & Uhart, 2008; Capua & Alexander, 2006; OIE, 2016a). En
fin, el virus IA está distribuido por todo el mundo, en diferentes especies
de aves, lo que genera importantes consecuencias en la avicultura
mundial (De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011; OIE, 2016c).
3.6. ETIOLOGÍA
3.6.1. Clasificación El virus de Influenza aviar pertenece a la familia Orthomyxoviridae, al
género Influenzavirus A e influenza tipo A (CFSPH, 2015; García &
Ramos, 2006; Jofré et al., 2005; Saif et al., 2008).
11
3.6.2. Morfología La partícula vírica tiene un diámetro de 80-120 nm con forma esférica o
pleomórfica, pero en ocasiones se presenta en forma de filamentos. El
peso molecular de virión es de 250 x 106 (De Souza & Pippi, 2000;
Easterday et al., 2011; García & Ramos, 2006; Saif et al., 2008).
El genoma del virus se caracteriza por poseer ocho segmentos de ARN
de cadena simple y con polaridad negativa (Easterday et al., 2011; García
& Ramos, 2006; Jofré et al., 2005; Saif et al., 2008). Los ocho segmentos
codifican 10 proteínas: ocho proteínas son parte del virus (HA, NA, NP,
M1, M2, PB1, PB2 y PA) y dos proteínas son no estructurales (NS1 y
NS2) (De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011; Saif et al., 2008).
NS1 es la proteína de unión al ARN. NS2 es una proteína de exportación
nuclear y es identificada en células infectadas (Baraza, 2016; Easterday
et al., 2011; Saif et al., 2008).
La envoltura del virus posee dos glicoproteínas a manera de espículas:
hemaglutinina (HA, trímero en forma de varilla) y neuraminidasa (NA,
tetrámero en forma de hongo) (De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al.,
2011; Echániz, 2004; García & Ramos, 2006; Saif et al., 2008). M2 una
proteína pequeña también es parte de la envoltura lipídica (García &
Ramos, 2006; Saif et al., 2008). Debajo y protegida por la envoltura se
encuentra M1, una proteína estructural que rodea al ARN (ácido
ribonucleico) y la nucleocápside helical (Easterday et al., 2011; Saif et al.,
2008).
3.6.3. Replicación del virus El virus de IA ingresa generalmente al hospedador por vía respiratoria por
lo que, la replicación del virus tiene lugar en el epitelio respiratorio (Capua
& Alexander, 2006; De Souza & Pippi, 2000; Jofré et al., 2005). La
proteína HA es responsable de la adherencia del virión a los receptores
en la superficie de la célula huésped. La penetración del virus se da por
endocitosis (De Souza & Pippi, 2000; Jofré et al., 2005; Saif et al., 2008).
12
La proteína HA también permite la fusión de las membranas del virus con
la del endosoma. La fusión favorece a la salida de los segmentos
genómicos al citosol con la ayuda de la proteína M2 (De Souza & Pippi,
2000; Easterday et al., 2011; García & Ramos, 2006; Jofré et al., 2005;
Saif et al., 2008). En el núcleo ocurre la transcripción que genera ARNm
(ARN mensajero) y también se da la replicación de los ocho segmentos
del virus, ARNv (ARN virales) (De Souza & Pippi, 2000; Jofré et al., 2005;
Saif et al., 2008).
Los ARNm se trasladan al citoplasma y se unen con ribosomas donde
ocurre la producción de las diferentes proteínas estructurales (Easterday
et al., 2011; Jofré et al., 2005; Saif et al., 2008). Durante la replicación
ocurre también el desdoblamiento de HA en HA1 y HA2 por las células del
hospedador a través de proteasas (Alexander, 2000; Capua & Alexander,
2006; Saif et al., 2008).
Las proteínas HA y NA son glucosiladas en el retículo endoplasmático y
en el aparato de Golgi para ser expresadas en la membrana celular
(Capua & Alexander, 2006; De Souza & Pippi, 2000; Saif et al., 2008).
Luego de ensamblarse los segmentos del genoma y las diferentes
proteínas, en la membrana celular, ocurre el proceso de gemación y
liberación del virus (García & Ramos, 2006; Jofré et al., 2005; Saif et al.,
2008). La proteína NA cataliza la liberación de los viriones (De Souza &
Pippi, 2000; Easterday et al., 2011; García & Ramos, 2006).
3.6.4. Susceptibilidad a agentes químicos y físicos El virus de influenza aviar es inactivado por químicos como: aldehídos,
beta-propiolactona y etilenimina binara, fenoles, amonio cuaternario,
hipoclorito de sodio, 60-95% de etanol, yodo, ácidos diluidos,
hidroxilamina, detergentes orgánicos (CFSPH, 2015; De Souza & Pippi,
2000; Saif et al., 2008). Los virus son inestables en el medio ambiente por
lo que son inactivados por agentes físicos como: el calor (56-60ºC), luz
13
ultra violeta, pH y desecación extremos (CFSPH, 2015; De Souza & Pippi,
2000; Saif et al., 2008).
3.6.5. Antigenicidad y Patogenicidad La antigenicidad del virus de Influenza tipo A es determinada por los
antígenos de superficie, NA y HA (Buscaglia, 2004; De Souza & Pippi,
2000; Easterday et al., 2011; García & Ramos, 2006). Son 16 subtipos
dependientes del HA (H1-H16) y 9 subtipos descritos por NA (N1-N9)
(Abad & Pizarro, 2006; Saif et al., 2008; Swayne & Pantin, 2006). La
combinación de estas dos proteínas ha dado lugar a la formación de
varias cepas, propias de distintas aves domésticas y/o silvestres
(Easterday et al., 2011; Pantin & Swayne, 2009; Swayne & Pantin, 2006).
La patogenicidad, del virus de IA, está determinada por la capacidad de
causar mortalidad en las aves frente a la infección por este virus. De
acuerdo a esto se divide en dos grupos: los virus de baja patogenicidad
(IABP) y los virus de alta patogenicidad (IAAP) (García & Ramos, 2006;
Pantin & Swayne, 2009; Spickler et al., 2008). Los virus IABP son
aquellos que pueden presentar signos leves o no manifestarlos y provocar
bajas tasas de mortalidad; la replicación de estos virus tiene lugar
solamente en el tracto respiratorio y digestivo (Alexander, 2007;
Beldomenico & Uhart, 2008; García & Ramos, 2006). Los virus IAAP
causan elevadas tasas de mortalidad, llegando al 100% (Beldomenico &
Uhart, 2008; García & Ramos, 2006; Swayne & Pantin, 2006).
La nomenclatura de las cepas fue establecida por la OMS en el año 1980
(De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011). El nombre de una
determinada cepa consta de: el tipo de influenza, hospedador de origen,
lugar de aislamiento, año en que fue aislado y entre paréntesis la
clasificación de los antígenos (CFSPH, 2015; De Souza & Pippi, 2000;
Saif et al., 2008).
14
3.7. EPIDEMIOLOGÍA
3.7.1. Transmisión y Transportadores La transmisión del virus puede darse por contacto directo con aves
enfermas y susceptibles, la principal ruta es oral-fecal. También la
transmisión puede darse por contacto indirecto con aerosoles o fómites
contaminados con el virus (Beldomenico & Uhart, 2008; De Souza &
Pippi, 2000; Easterday et al., 2011). Varios autores como Beldomenico
(2008) y Brown y colaboradores (2007) mencionan la persistencia del
virus en aguas dulces y en humedales, convirtiendo estos sitios en fuente
de infección para diferentes aves (Beldomenico & Uhart, 2008; Brown,
Swayne, Cooper, Burns, & Stallknecht, 2007). Mientras que Alexander
(2001), menciona que puede haber 4 fuentes de introducción de IA en
explotaciones de aves domésticas: 1) transmisión entre aves domésticas
de diferentes especies en la misma granja, o de granjas muy cercanas, 2)
por aves exóticas en jaula, 3) por aves silvestres migratorias, 4)
transmisión por otros animales, como el porcino. Existe también
transmisión vertical, el virus está presente en el interior y superficie de los
huevos provenientes de gallinas infectadas (Alexander, 2001; De Souza &
Pippi, 2000; Easterday et al., 2011).
3.8. PATOLOGÍA
3.8.1. Signos clínicos El período de incubación de IA varía de acuerdo a la vía de exposición y
la especie afectada. Sin embargo, en aves de corral se menciona que el
período oscila entre 14 y 21 días (Buscaglia, 2004; De Souza & Pippi,
2000; Saif et al., 2008). La presencia y evidencia de signos clínicos
también varía en función de la edad, sexo y factores ambientales
(Buscaglia, 2004; De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011; Saif et
al., 2008). La presentación de IA puede variar desde una enfermedad
15
subclínica, problemas respiratorios leves, hasta una enfermedad
sistémica grave con altas tasas de mortalidad (Beldomenico & Uhart,
2008; Pantin & Swayne, 2009; Spickler et al., 2008).
3.8.1.1. Virus de Influenza aviar de baja patogenicidad
Los virus de IABP, causan infecciones subclínicas o enfermedad leve en
aves de corral y en otras aves. Las aves afectadas con IABP muestran
principalmente disminución en la producción de huevos, huevos
deformes, disminución de la fertilidad, signos respiratorios, letargo,
disminución del consumo de alimento y agua (Easterday et al., 2011; Saif
et al., 2008; Spickler et al., 2008).
3.8.1.2. Virus de Influenza aviar de alta patogenicidad
Los virus de IAAP causan enfermedad grave en pollos y en pavos. Los
signos asociados a IAAP son: depresión, signos respiratorios, disminución
del consumo de alimento y agua, muerte súbita, signos neurológicos,
edema, equimosis en tarsos, carencia de plumas en la cabeza,
disminución en la producción de huevos, huevos sin pigmentación, entre
otros (De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011; Spickler et al.,
2008).
3.8.2. Morbilidad y mortalidad Los valores para la movilidad y mortalidad dependen de la edad de las
aves, sexo, virus infectante, cepa, factores ambientales, entre otras
(Beldomenico & Uhart, 2008; García & Ramos, 2006; Pantin & Swayne,
2009). Consecuentemente, no se puede definir exactamente un
porcentaje, pero se sabe en IAAP la mortalidad y morbilidad llegan hasta
el 100% (Beldomenico & Uhart, 2008; Pantin & Swayne, 2009; Spickler et
al., 2008).
16
3.8.3. Lesiones Macroscópicas Las lesiones macroscópicas frecuentes incluyen: inflamación de senos
paranasales, exudado seroso o caseoso en casos de edema de la
mucosa traqueal, engrosamiento de sacos aéreos, peritonitis y enteritis
catarral o fibrinosa. En aves ponedoras se observa exudado en el
oviducto (De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011; Spickler et al.,
2008).
Cuando se trata de virus de alta patogenicidad las aves mueren
súbitamente al contagiarse con este virus (Beldomenico & Uhart, 2008;
De Souza & Pippi, 2000; Spickler et al., 2008). Sin embargo, se han
observado como alteraciones iniciales: edema de la cabeza, hinchazón de
barbillas, crestas cianóticas, piernas congestionadas o hemorrágicas y
necrosis en bazo, riñones, hígado y pulmones (De Souza & Pippi, 2000;
Easterday et al., 2011; Spickler et al., 2008). Ocasionalmente las aves
afectadas con IAAP presentan alteraciones congestivas, hemorrágicas,
transudativas y necróticas. Cabe aclarar que no todas las lesiones estarán
presentes en todas las infecciones por IA, esto dependerá de la cepa
infectante (Easterday et al., 2011; Spickler et al., 2008).
3.8.4. Lesiones Microscópicas Las lesiones microscópicas están estrechamente relacionadas con la
presencia y desarrollo de las lesiones macroscópicas. Por lo que se
describen las siguientes: necrosis linfoide multifocal, necrosis miocárdica y
pancreática; infiltración linfoide en bazo, miocardio, cerebro y músculos
esqueléticos; degeneración y necrosis parenquimatosas en riñón, hígado
y bazo. IA también genera lesiones a nivel nervioso causando: encefalitis
en cerebro y cerebelo, focos gliales, proliferación vascular y necrosis de
células neuronales (De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al., 2011;
Spickler et al., 2008).
17
3.8.5. Inmunidad La inmunidad ante el virus de IA, normalmente se da a través del IFNα
(interferón alfa) que obstaculiza la replicación viral. El IFNα, es detectado
en secreciones mucosas y en suero de animales que han sido expuestos
al virus y se encuentran en fase aguda de la infección (Buscaglia, 2004;
Easterday et al., 2011; Saif et al., 2008). Además, en los mismos fluidos
se encuentran presentes anticuerpos para las diferentes proteínas virales,
principalmente contra HA y NA. Las inmunoglobulinas, IgA e IgG, tratan
de neutralizar la infección e impedir la liberación de los nuevos viriones de
las células infectadas (García & Ramos, 2006).
A pesar de que la inmunidad celular es poco mencionada, García (2006)
describe que 3-4 días post infección las células T citotóxicas CD8 actúan
sobre las proteínas HA, M2, NP, PB2 (García & Ramos, 2006).
3.9. DIAGNÓSTICO
El diagnóstico presuntivo de la infección por IA se basa en los signos y
lesiones clínicas, pero debe recordarse que los signos son variables y en
ocasiones se tiene aves asintomáticas (De Souza & Pippi, 2000;
Easterday et al., 2011; Saif et al., 2008). Al no poseer signos
patognomónicos es necesario un diagnóstico diferencial con otras
patologías que presenten signos similares como: Newcastle,
micoplasmosis, clamidiasis y otras enfermedades bacterianas
(Beldomenico & Uhart, 2008; Buscaglia, 2004; Vineza, 2005). El
diagnóstico definitivo se realiza mediante el aislamiento o identificación
del virus. No obstante, las pruebas serológicas no son menos valiosas y
tienen la ventaja de detectar infección por mayor tiempo en los individuos
a diferencia de las pruebas virológicas. La detección de anticuerpos ante
IA constituyen una herramienta diagnóstica indirecta y efectiva (De Souza
& Pippi, 2000; Easterday et al., 2011; OIE, 2016b; Zamora, Percedo,
Abeledo, & Noda, 2008).
18
3.9.1. Serología La serología es un método diagnóstico útil para la vigilancia
epidemiológica y para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos
ante IA (Buscaglia, 2004; OIE, 2016b; Vineza, 2005). Existen varias
técnicas serológicas para el diagnóstico y vigilancia de la infección por IA:
Inhibición de la hemoaglutinación (HI), Neutralización del virus, Fijación
del complemento, Inhibición de la neuroaminidasa, Hemólisis radial
simple, Inmunodifusión en Gel Agar y ELISA (Buscaglia, 2004; OIE,
2016b; Saif et al., 2008).
3.9.1.1. Prueba de ELISA
Una herramienta importante para la avicultura es la prueba ELISA dado
que permite indirectamente conocer el estado inmune del ave. Además
ELISA permite conocer si hubo una respuesta adecuada ante vacunación
y realizar seguimiento y monitoreo de las granjas (Buscaglia, 2004;
Vineza, 2005).
La prueba ELISA emplea una enzima marcadora que permite revelar
cromogénicamente el complejo antígeno-anticuerpo. Existen kits
comerciales que permiten detectar anticuerpos contra IA y que tienen
buenos niveles de sensibilidad y especificidad (Dundon et al., 2007;
Guzmán, 2004). En el ELISA competitivo de la casa comercial IDvet para
Influenza aviar, las placas multipocillo están sensibilizadas con la
nucleoproteína (NP), sobre las cuales se colocará los sueros sanguíneos
(muestra) que posee o no anticuerpos no marcados. En presencia de
anticuerpos contra la NP se formará el complejo antígeno-anticuerpo. Se
adiciona anticuerpos monoclonales en forma de conjugado marcados con
peroxidasa. Puede fijarse sobre los espacios libres y formar el complejo
Ag-Ac-peroxidasa. Posteriormente la reacción es revelada y frenada. La
coloración que presente es proporcional a la cantidad de anticuerpos
presentes que serán medidos con una densidad óptica de 450nm
19
mediante un espectofotómetro (Dundon et al., 2007; Guzmán, 2004; Hill,
Hendrix, & Sirois, 2007).
3.9.1.2. Prueba de HI
HI se utiliza para clasificar los virus de influenza de tipo A en 16 subtipos
de hemaglutinina (Alexander, 2000; Capua & Alexander, 2006; OIE,
2016b). La técnica HI, se fundamenta por la reacción del antígeno
hemoaglutinante con su anticuerpo específico HA, produciendo la
inhibición del proceso hemoaglutinante. Para Influenza aviar, se realiza
inicialmente la titulación del antígeno, la cual corresponde a la última
dilución del virus que presente aglutinación de los glóbulos rojos. Las
muestras se cargan en microplacas de 96 pocillos con fondo en U. Se
realizan diluciones seriadas de las muestras, posteriormente se añade el
volumen del antígeno viral ajustado a las 4 unidades hemoaglutinantes.
Se incuba la placa a temperatura ambiente. Finalmente, se adiciona una
solución de glóbulos rojos de pollo al 0.5%. A la presencia de anticuerpos
ante hemaglutinina, se produce el complejo antígeno-anticuerpo,
consecuentemente la inhibición de la hemoaglutinación entre los glóbulos
rojos y el complejo formado. Esta reacción se observa en los pocillos con
la presencia de sedimentación o un punto rojo. Mientras que al no existir
anticuerpos ante IA, se produce hemaglutinación (Guitérrez, Belaunde, &
Cobos, 1996; Zamora et al., 2008). Se utiliza los antígenos de los subtipos
H5N2 y H7N3, que corresponde a las hemoaglutininas de notificación
obligatoria a la OIE (H5 y H7), por ser altamente patógenos. Además
estos subtipos se han presentado en el continente americano en los
países de Estados Unidos, Canadá y México en el año 2016 (OIE,
2016a).
20
CAPÍTULO IV
MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Factores de estudio
Variable independiente: muestras de sueros procedentes de granjas de
aves (Gallus gallus domesticus) de los sistemas de producción de
engorde, postura y reproducción.
Variable dependiente: anticuerpos de virus de Influenza aviar.
4.2. Población objeto de estudio
La población en estudio estuvo conformada por las granjas industriales de
Gallus gallus domesticus del Ecuador Continental. Se consideraron las
distintas categorías de producción: engorde, aves de postura y aves
reproductoras, que según el Censo Avícola 2015 suman un total de 1.802
granjas registradas en el país.
4.3. Unidades de muestreo
Las unidades de muestreo en la investigación realizada corresponden a
las aves de las granjas avícolas industriales que fueron seleccionadas al
azar. Sin embargo, las granjas estuvieron distribuidas en todas las
21
provincias pertenecientes a la región Sierra, Costa y Oriente del país. De
cada granja avícola, se recolectaron 25 sueros sanguíneos.
4.4. Tamaño de muestra
El tipo de muestreo que se planteó para la realización de la investigación
desarrollada fue aleatorio simple. En este tipo de muestreo, se garantiza
que cada elemento tenga igual probabilidad de ser seleccionado entre la
población y ser parte de la muestra (Martínez & Jaramillo, 2010;
Thrusfield, 2007).
El tamaño de muestra fue determinado a través de la fórmula para estimar
detección de la presencia de la enfermedad. Este cálculo es utilizado por
el investigador cuando desea saber si una enfermedad está presente o no
en un grupo de animales, en el sitio de interés (Martínez & Jaramillo,
2010; Thrusfield, 2007). El tamaño de la muestra está relacionado con la
probabilidad de encontrar un animal enfermo, es decir, a mayor
prevalencia menor será la muestra (Martínez & Jaramillo, 2010;
Thrusfield, 2007). La fórmula toma en cuenta los siguientes parámetros:
Donde:
N= tamaño de la población.
d= número mínimo de animales afectados esperados en la población.
n= tamaño de muestra necesario.
p1= probabilidad de encontrar al menos un caso en la muestra (nivel de
confianza deseado (95%)).
n = {1- (1-p1)1/d} (N- d/2) + 1
22
La aplicación de la fórmula y en consecuencia, el establecimiento del
tamaño de la muestra se realizó con el empleo del software libre
ProMESA (Programme for Statistical Sampling in Animal Population)
(Figura 1).
Figura 1. Captura de pantalla del cálculo muestreal con el uso del software libre
ProMESA.
Fuente: ProMESA (L)
Para que el programa pueda realizar el cálculo de la muestra requiere el
ingreso de datos como:
Prevalencia mínima esperada: cuando se supone que el evento no
existe en la población de interés, este valor debe ser el mínimo que se
esperaría encontrar ante la eventualidad de su ingreso. La selección
de la prevalencia en particular debe basarse en la situación
epidemiológica predominante o histórica según el Código Sanitario de
los Animales Terrestres (OIE, 2016b). En el Ecuador, en el último
monitoreo por vigilancia activa para Influenza aviar realizada en el
2014, se determinó la ausencia de la enfermedad. Por lo tanto, la
23
prevalencia no podría ser superior al 5%, pero se decidió trabajar con
una prevalencia del 2% (0.02) dado que la OIE menciona que el
tamaño de la muestra tendrá que ser lo suficientemente grande para
detectar la infección.
Tamaño de la población: 1802 granjas avícolas a nivel nacional.
Nivel de confianza: 95%
Error aceptado: 5% (0.05)
Sensibilidad: 93% (0.93)
Especificidad: 100% (1)
El tamaño de muestra obtenido mediante el programa resultó ser de 152
granjas (Figura 1). Esta cantidad es superior a lo establecido por Canon y
Roe, citados por Thrusfield (2007) en la Tabla de muestra requerida para
detectar enfermedad. Dicha tabla menciona los tamaños de muestra
considerando un nivel de confianza del 95%, para detectar al menos un
caso de enfermedad (Anexo 1). Sin embargo, estos autores consideran
una sensibilidad y especificidad para la prueba a emplear del 100%; por lo
que, se optó por emplear el tamaño de la muestra calculado con el
programa. En el programa ProMESA se colocó los datos de sensibilidad y
especificidad propios del kit comercial de ELISA empleado en la
investigación.
Las granjas fueron seleccionas al azar sin considerar el número de
granjas por provincias o categoría de producción, obteniéndose la
distribución que se muestra en la Tabla 1.
24
Tabla 1. Granjas muestreadas a nivel nacional para la detección de Influenza
aviar.
Fuente: MAGAP- Dirección de Vigilancia Zoosanitaria, 2016.
4.5. Método
4.5.1. Fase de Campo (muestreo) El muestreo fue realizado en los meses de Mayo a Agosto del año 2016.
Las granjas para el muestreo se seleccionaron completamente al azar de
entre el total de granjas industriales existentes en el país. La visita a las
granjas seleccionadas fue realizada en conjunto con los técnicos de
AGROCALIDAD de cada provincia. Se utilizó la georeferenciación
obtenida en el Censo Avícola de 2015 para ubicar las granjas y realizar
Provincia Granjas a muestrear
Engorde Ponedoras Reproductoras TOTAL Azuay 12 1 1 14 Bolívar 1 1 0 2
Cañar 2 0 0 2 Carchi 0 0 1 1
Chimborazo 2 5 0 7 Cotopaxi 1 10 0 11
El Oro 10 1 1 12 Esmeralda 0 0 1 1
Guayas 3 1 3 7 Imbabura 5 0 2 7
Loja 2 1 0 3 Los Ríos 0 0 4 4 Manabí 3 5 1 9
Morona Santiago 1 0 0 1 Napo 0 0 3 3
Orellana 1 0 0 1 Pastaza 3 0 6 9
Pichincha 12 5 3 20 Santa Elena 0 1 1 2
Santo Domingo de los Tsáchilas
8 2 1 11
Sucumbíos 1 0 0 1 Tungurahua 1 22 0 23
Zamora Chinchipe 0 1 0 1 TOTAL 68 56 28 152
25
las visitas correspondientes. Por bioseguridad la toma de muestras
sanguíneas fue realizada por el veterinario de AGROCALIDAD o el
técnico de cada plantel avícola.
Se seleccionaron 25 aves al azar de cada granja avícola. Para la toma de
muestra se utilizaron jeringuillas de 3 ml y tubos vacutainer tapa roja. La
extracción se realizó a partir de la vena braquial/ulnar. Luego se esperó a
la separación del suero, colocando el tubo con inclinación de 45 grados
durante 2 horas, para facilitar la formación del coágulo. Posteriormente se
colocó el suero en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Los tubos Eppendorf se
identificaron del 1 al 25. Además se obtuvieron datos específicos para
cada granja empleando la hoja de registro de vigilancia activa de
AGROCALIDAD (Anexo 2).
Las muestras recolectadas fueron colocadas y fijadas en gradillas. Luego,
las muestras se transportaron en cajas térmicas con geles refrigerantes.
La cadena de frío fue garantizada hasta la llegada de las muestras al
laboratorio de Sanidad Animal de AGROCALIDAD.
4.5.2. Fase de Laboratorio En el laboratorio las muestras fueron nuevamente identificadas mediante
códigos por granja y muestra. El código alfanumérico para las granjas
incluía las siglas MNA (Muestreo Nacional Avícola), más un número por
orden de llegada. El código para cada suero poseía la identificación SE-
a0000-0000, que hace referencia a serología de aves y el número
asignado por la base de datos general del laboratorio. El registro de estos
códigos, además de los datos indispensables de la granja fueron
registrados en Hojas Microsoft Excel® (Anexo 3). Las muestras fueron
almacenadas a -40ºC, hasta el momento del procesamiento.
26
4.5.2.1. ELISA
Las muestras fueron procesadas con la prueba de ELISA competitivo
comercial ID Screen® Influenza A Antibody Competition Multi-species
(FLUAcA ver0914 ES) de Innovative Diagnostics (IDvet). Para la
realización de la prueba de ELISA se consideró el protocolo señalado por
la casa comercial.
Previo a la realización de la prueba de ELISA, se equilibró los reactivos
del Kit a temperatura ambiente (21ºC) (Anexo 5). Los reactivos con los
que cuenta el kit y que fueron empleados son: conjugado concentrado
(10x); control positivo; control negativo; diluyente buffer 3; diluyente buffer
2; solución de lavado concentrada (20x); solución de revelado y solución
de frenado (0.5 M). Adicionalmente, antes de empezar con la prueba se
llena la hoja de protocolo para la distribución de las muestras en la
correspondiente placa multipocillo (Anexo 4).
A continuación, se procedió a colocar 90 µl del diluyente buffer 2 en todos
los pocillos de la microplaca empleando una micropipeta multicanal de 10-
100 µl (Brand; Transferpette) (Anexo 5). Luego se colocó 10 µl del control
positivo en los dos primeros pocillos de la microplaca (A1 y B1).
Inmediatamente, se cargó la misma cantidad de control negativo en los
pocillos C1 y D1 de la microplaca. Después, se adicionó 10µl de cada
muestra en los pocillos restantes según la hoja de protocolo señalada.
Una vez que se terminó de realizar la dilución en la microplaca, se
procedió a incubar por 60 minutos a 37ºC en el agitador de placas ELISA
(MRC; Modelo: MB100-4ª) (Anexo 5). Pocos minutos antes de que
culmine el tiempo esperado, se procedió a preparar la solución de lavado
con una dilución 1:10. Además, se diluyó el conjugado con una
concentración 1x, utilizando el diluyente 3 del kit. Transcurrido los 60
minutos se lavó la microplaca utilizando el lavador manual de placas
ELISA (Bio-tek; Modelo: Inlet). Se realizaron 5 lavados con
aproximadamente 300 µl de la solución de lavado previamente preparado
27
(Anexo 5). Se debe mencionar que se evitó que los pocillos se sequen
completamente entre lavados.
Posteriormente se distribuyó 50 µl de la dilución del conjugado (1x) en
todos los pocillos, con una pipeta multicanal (Anexo 5). Se incubó durante
30 minutos a 21ºC en el agitador de microplacas (VWR; Modelo: 980140)
(Anexo 5). Una vez transcurrido el tiempo, se procedió a lavar la
microplaca por 3 ocasiones. Enseguida se colocó 50 µl de solución de
revelado en todos los pocillos con una micropipeta multicanal (Anexo 5).
Se incubó por 10 min a 21ºC en obscuridad. Luego se distribuyó 50 µl de
solución de parada en todos los pocillos para detener la reacción (Anexo
5).
En seguida se efectuó la lectura de la microplaca utilizando un
espectofotómetro (Bio-tek modelo: ELx800) con una densidad óptica de
450 nm (Anexo 5). El ordenador conectado al espectofotómetro arrojó un
esquema exacto a la microplaca, mostrando en cada pocillo la densidad
óptica obtenida y si esta corresponde a Positivo, Negativo o Sospechoso.
Además los resultados también se presentaron en histogramas realizados
por el mismo programa software IDSoftTM de la casa comercial IDvet del
kit (Anexo 5).
Validación
El ensayo ELISA fue validado antes de emitir los resultados. La validación
se basó en la densidad óptica (DO) de los controles, que fue medida con
el espectofotómetro. Así la DO media del control negativo (DOCN) debe
ser superior a 0.7. Mientras tanto la densidad óptica del control positivo
(DOCP) debe ser inferior al 30% de la DOCN.
Interpretación
Para la interpretación de resultados para cada muestra, se calculó el
porcentaje de competición (S/N%), con la siguiente fórmula:
28
S/N%= (DO muestra / DOCN) x 100
Donde:
S/N%= Porcentaje de competición
DOCN= Densidad óptica media del control negativo
DOmuestra= Densidad óptica de la muestra
Los cálculos fueron realizados directamente por el software IDSoftTM
provisto por IDvet. Por tanto, los resultados para cada muestra se
interpretaron considerando los criterios establecidos por el fabricante del
kit:
Muestras con un S/N% superior o igual al 50% son consideradas como
negativas.
Muestras con un S/N% entre 45% y 50% son consideradas dudosas o
sospechosas.
Muestras con un S/N% inferior o igual al 45% son consideradas como
positivas.
4.5.2.2. Inhibición de la Hemaglutinación
Los resultados obtenidos mediante ELISA que fueron positivos y
sospechosos, pasaron a ser serotipificados empleando la prueba HI. Del
total de las muestras procesadas mediante la prueba de ELISA, sólo 11
sueros resultaron positivos o sospechosos a IA.
Preparación de glóbulos rojos (GR) al 0,5%
Primero se recolectó una muestra de sangre de pollo en un tubo
vacutainer con anticoagulante. La muestra de sangre fue centrifugada por
29
tres ocasiones a 1000 r.p.m. por 10 minutos cada vez. Luego se diluyó 0,5
ml (50 µl) de GR en 99,5 ml (9950 µl) de PBS (Anexo 7).
Preparación de los antígenos de Influenza aviar
En primera instancia se debió titular los antígenos (Ag) H5N2 y H7N3 de
Influenza aviar. Para el efecto, se utilizó microplacas de fondo en U de 96
pocillos. En la microplaca, se colocó 25 µl de PBS en las filas A y B para
un Ag y C y D para el otro, es decir se realiza 2 réplicas para cada Ag. En
la fila H, se realizó el control de GR, colocando la misma cantidad de PBS
con una micropipeta multicanal de 10-100 µl (Brand; Modelo:
Transferpette). Luego se procedió a colocar 25 µl de los antígenos H5N2
(Aphis; Lote: 8/12) y H7N3 (Aphis; Lote: 1/14), en el primer pocillo de la
fila correspondiente. Posteriormente, se realizó diluciones seriadas
transfiriendo 25 µl de pocillo en pocillo. Las diluciones del virus van desde
½ hasta 1/4096 (Anexo 6). Se añadió 50 µl de GR al 0,5%, en todos los
pocillos y se homogenizó. Se esperó 40 minutos a temperatura ambiente,
hasta que se observó sedimentación de glóbulos rojos (formación de un
punto rojo en fondo de pocillos) en la fila H (Anexo 7).
El título hemoaglutinante correspondió a la última dilución del virus que
presente aglutinación completa de GR. Este título contiene 1 unidad
hemoaglutinante (UHA), por lo tanto se preparó a 4 UHA que son
necesarias para realizar la Inhibición de la hemaglutinación. El cálculo se
realizó dividiendo el título obtenido para 4. La preparación de las 4 UHA
dependerá del número de muestras y el volumen total a utilizar (Anexo 7).
A continuación, se realizó el control de las 4 UHA del antígeno,
empleando una microplaca de 96 pocillos, pero sólo se empleó las cuatro
primeras filas y 6 primeras columnas (24 pocillos) de la misma. Se colocó
25 µl de PBS en cada pocillo. Se añadió en la primera fila 25 µl de 4 UHA
para el antígeno H7N3 en las columnas 1 y 2, y 25 µl de 4 UHA para el
antígeno H5N2 en las columnas 3 y 4. Se homogenizó y se efectuaron
30
diluciones seriadas hasta la fila D. Inmediatamente se adicionó 50 µl de
GR al 0,5% y se esperó 40 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido
este tiempo, se procedió a interpretar el control de las 4 UHA,
obteniéndose hemoaglutinación completa (+++) en los dos primeros
pocillos de cada columna del antígeno (Anexo 7).
Protocolo para Inhibición de la hemaglutinación
Los sueros positivos a ELISA antes de ser procesados por HI, fueron
inactivados a 56ºC durante 30 minutos a Baño María (MEMMERT;
Modelo: WNB22) (Anexo 7). Igualmente, antes de empezar el
procesamiento de las muestras se rotuló las microplacas de fondo en U y
se estableció la disposición de los sueros, control de GR, control del Ag y
control de las 4 UHA, empleando la hoja de distribución de muestras
(Anexo 7 y 8). En los pocillos designados para muestras se colocó 25 µl
de PBS (Anexo 7). Luego, se añadió 25 µl del suero muestra en la
primera columna, según correspondía, y se realizaron diluciones seriadas
(Anexo 7). Para que se dé la reacción Ag-Ac se adicionó 25 µl de las 4
UHA de antígeno H7N3 y H5N2 (Anexo 7). En los pocillos asignados para
el control de GR se añadió 50 µl de PBS y 50 µl de GR; mientras tanto
para el control del Ag se colocó 50 µl de PBS, 25 µl de antisuero y 25 µl
de GR. Finalmente para el control de las 4 UHA se puso 25 µl de PBS y
25 µl de las 4 UHA. Inmediatamente concluido este procedimiento, se
dejó reposar por 30 min a temperatura ambiente (Anexo 7). Finalmente en
los pocillos para muestras se colocó 50 µl de GR al 0,5% y se dejó en
reposo por 30-40 min a temperatura ambiente (Anexo 7).
Interpretación
Para la realización de la lectura de la placa e interpretación de resultados,
se comprobó que exista una sedimentación completa en el control de
31
glóbulos rojos. Además en el control de las 4 UHA, se verificó que los
primeros dos pocillos presenten hemoaglutinación (Anexo 7).
En el caso de las muestras, la presencia de hemoaglutinación se
consideró como resultado negativo, mientras que la inhibición de la
hemaglutinación fue determinada como resultado positivo (Anexo 7). El
título del suero será la última dilución donde se observe el botón. Los
títulos menores o iguales a 1:4 son negativos, títulos de 1:8 son
sospechosos y títulos iguales o mayores a 1:16 son positivos.
32
CAPÍTULO V
RESULTADOS
Las muestras serológicas, provenientes de las granjas industriales de
Gallus gallus domesticus, seleccionadas fueron procesadas y analizadas
a través de la prueba de ELISA competitivo. Posteriormente dichas
muestras se serotipificaron para los subtipos H5N2 y H7N3 mediante HI.
5.1. Ausencia y presencia de Influenza aviar en muestras
serológicas a través de ELISA competitivo.
Los datos resultantes ante el análisis de cada una de las muestras
serológicas por el test ELISA Competitivo de IDvet se presentan en un
cuadro de doble entrada (Tabla 2). Los datos se organizaron por
provincia y el número de granjas correspondientes a cada una de ellas.
Se muestrearon 152 granjas industriales en todo el Ecuador Continental,
entre granjas de aves reproductoras (28 granjas), ponedoras comerciales
(56 granjas) y pollos de engorde (68 granjas).
La distribución por provincia fue la siguiente: para Azuay (14 granjas),
Bolívar (2 granjas), Cañar (2 granjas), Carchi (1 granja), Chimborazo (7
granjas), Cotopaxi (11 granjas), El Oro (12 granjas), Esmeraldas (1
granja), Guayas (7 granjas), Imbabura (7 granjas), Loja (3 granjas), Los
Ríos (4 granjas), Manabí (9 granjas), Morona Santiago (1 granja), Napo (3
33
granjas), Orellana (1 granja), Pastaza (9 granjas), Pichincha (20 granjas),
Santa Elena (2 granjas), Santo Domingo de los Tsáchilas (11 granjas),
Sucumbíos (1 granja), Tungurahua (23 granjas) y Zamora Chinchipe (1
granja). A cada granja se le asignó un código bajo el cual se colocó los
resultados. De cada granja se obtuvieron 25 sueros, por lo tanto para
ELISA competitivo fueron analizados 3.800 sueros en todo el país sin
tomar en cuenta la región insular.
De los 3.800 sueros analizados por ELISA competitivo, 3 sueros fueron
interpretados como sospechosos, 8 sueros como positivos y 3.879 como
negativos. Los sueros positivos pertenecían a las granjas: granja MNA-
038 (1 suero positivo), granja MNA-062 (1 suero positivo), granja MNA-
096 (1 suero positivo), granja MNA-098 (1 suero positivo), granja MNA-
127 (1 suero positivo) y granja MNA-140 (3 sueros positivos).
Corresponden a las provincias de Azuay, Pichincha, Bolívar, Pastaza,
Chimborazo y Cotopaxi respectivamente. En tanto que, los sueros
sospechosos corresponden a las granjas: granja MNA-066 (1 suero
sospechoso), granja MNA-128 (1 suero sospechoso) y granja MNA-131 (1
suero sospechoso). Las dos primeras granjas pertenecen a la provincia
de Tungurahua y la otra a Imbabura. Por lo tanto, como resultados finales
de ELISA competitivo se obtuvo 3.95% de granjas positivas (6 granjas
positivas), 1.97% de granjas sospechosas (3 granjas sospechosas) y
94.08% de granjas negativas (143 granjas negativas) (Figura 2).
34
Tabla 2. Resultados de la prueba ELISA competitivo para las granjas
muestreadas en el Ecuador Continental.
Provincia Código
de granja
Resultado ELISA Total
N Total
S Total
P Negativo (N)
Sospechoso (S)
Positivo (P)
Azuay
MNA-036 25 0 0
349 0 1
MNA-037 25 0 0
MNA-038 24 0 1
MNA-100 25 0 0
MNA-101 25 0 0
MNA-102 25 0 0
MNA-103 25 0 0
MNA-132 25 0 0
MNA-134 25 0 0
MN1-135 25 0 0
MNA-136 25 0 0
MNA-133 25 0 0
MNA-145 25 0 0
MNA-149 25 0 0
Bolívar MNA-095 25 0 0
49 0 1 MNA-096 24 0 1
Cañar MNA-035 25 0 0
50 0 0 MNA-114 25 0 0
Carchi MNA-137 25 0 0 25 0 0
Chimborazo
MNA-003 25 0 0
174 0 1
MNA-026 25 0 0
MNA-047 25 0 0
MNA-068 25 0 0
MNA-069 25 0 0
MNA-126 25 0 0
MNA-127 24 0 1
Cotopaxi
MNA-073 25 0 0
272 0 3
MNA-074 25 0 0
MNA-075 25 0 0
MNA-089 25 0 0
MNA-090 25 0 0
MNA-121 25 0 0
MNA-122 25 0 0
MNA-140 22 0 3
MNA-141 25 0 0
MNA-142 25 0 0
MNA-143 25 0 0
El Oro
MNA-001 25 0 0
300 0 0
MNA-005 25 0 0
MNA-006 25 0 0
MNA-007 25 0 0
MNA-008 25 0 0
35
Provincia Código
de granja
Resultado ELISA Total
N Total
S Total
P Negativo (N)
Sospechoso (S)
Positivo (P)
MNA-009 25 0 0
MNA-028 25 0 0
MNA-041 25 0 0
MNA-042 25 0 0
MNA-060 25 0 0
MNA-067 25 0 0
MNA-076 25 0 0
Esmeraldas MNA-058 25 0 0 25 0 0
Guayas
MNA-048 25 0 0
175 0 0
MNA-053 25 0 0
MNA-054 25 0 0
MNA-088 25 0 0
MNA-109 25 0 0
MNA-108 25 0 0
MNA-110 25 0 0
Imbabura
MNA-019 25 0 0
174 1 0
MNA-046 25 0 0
MNA-059 25 0 0
MNA-072 25 0 0
MNA-094 25 0 0
MNA-113 25 0 0
MNA-131 24 1 0
Loja
MNA-061 25 0 0
75 0 0 MNA-082 25 0 0
MNA-107 25 0 0
Los Ríos
MNA-004 25 0 0
100 0 0 MNA-027 25 0 0
MNA-077 25 0 0
MNA-092 25 0 0
Manabí
MNA-115 25 0 0
225 0 0
MNA-123 25 0 0
MNA-125 25 0 0
MNA-138 25 0 0
MNA-139 25 0 0
MNA-146 25 0 0
MNA-150 25 0 0
MNA-151 25 0 0
MNA-152 25 0 0
Morona Santiago
MNA-144 25 0 0 25 0 0
Napo
MNA-013 25 0 0
75 0 0 MNA-014 25 0 0
MNA-052 25 0 0
Orellana MNA-104 25 0 0 25 0 0
Pastaza MNA-079 25 0 0
224 0 1 MNA-080 25 0 0
36
Provincia Código
de granja
Resultado ELISA Total
N Total
S Total
P Negativo (N)
Sospechoso (S)
Positivo (P)
MNA-084 25 0 0
MNA-085 25 0 0
MNA-098 24 0 1
MNA-099 25 0 0
MNA-124 25 0 0
MNA-147 25 0 0
MNA-148 25 0 0
Pichincha
MNA-015 25 0 0
499 0 1
MNA-016 25 0 0
MNA-017 25 0 0
MNA-018 25 0 0
MNA-020 25 0 0
MNA-021 25 0 0
MNA-022 25 0 0
MNA-023 25 0 0
MNA-033 25 0 0
MNA-034 25 0 0
MNA-049 25 0 0
MNA-062 24 0 1
MNA-081 25 0 0
MNA-097 25 0 0
MNA-105 25 0 0
MNA-116 25 0 0
MNA-117 25 0 0
MNA-118 25 0 0
MNA-119 25 0 0
MNA-120 25 0 0
Santa Elena
MNA-093 25 0 0 50 0 0
MNA-106 25 0 0
Santo Domingo de
los Tsáchilas
MNA-002 25 0 0
275 0 0
MNA-012 25 0 0
MNA-039 25 0 0
MNA-040 25 0 0
MNA-045 25 0 0
MNA-057 25 0 0
MNA-063 25 0 0
MNA-064 25 0 0
MNA-078 25 0 0
MNA-111 25 0 0
MNA-112 25 0 0
Sucumbíos MNA-091 25 0 0 25 0 0
Tungurahua
MNA-010 25 0 0
573 2 0
MNA-011 25 0 0
MNA-024 25 0 0
MNA-025 25 0 0
MNA-029 25 0 0
37
Provincia Código
de granja
Resultado ELISA Total
N Total
S Total
P Negativo (N)
Sospechoso (S)
Positivo (P)
MNA-030 25 0 0
MNA-031 25 0 0
MNA-032 25 0 0
MNA-043 25 0 0
MNA-044 25 0 0
MNA-050 25 0 0
MNA-051 25 0 0
MNA-055 25 0 0
MNA-056 25 0 0
MNA-065 25 0 0
MNA-066 24 1 0
MNA-070 25 0 0
MNA-071 25 0 0
MNA-086 25 0 0
MNA-087 25 0 0
MNA-128 24 1 0
MNA-129 25 0 0
MNA-130 25 0 0
Zamora Chinchipe
MNA-083 25 0 0 25 0 0
TOTAL: 3800 sueros 3789 3 8
PORCENTAJE (%): 100 99,71
0,07
0,21
Resultados de la prueba ELISA Influenza A Antibody Competition Multi-species
de IDvet. Se resalta en color amarillo las granjas positivas y sospechosas.
Fuente: La Autora
38
Figura 2. Proporción de granjas del Ecuador continental negativas, sospechosas
y positivas para Influenza aviar a través de la prueba ELISA.
Fuente: La Autora.
94,08%
1,97% 3,95%
Negativos
Sospechosos
Positivos
39
A pesar de que el estudio no fue estratificado por categoría de producción
(engorde, ponedoras comerciales y reproductoras), se considera
importante presentar los datos de esta manera para corroborar que la
infección por el virus de influenza aviar no tiene preferencia alguna por
estrato de producción (Tabla 3). En granjas de ponedoras comerciales se
encontró 2 granjas sospechosas y 2 granjas positivas; en granjas de
engorde se hallaron 1 granja sospechosa y 2 granjas positivas, y en
granjas de reproductoras 2 granjas positivas.
Tabla 3. Resultados de ELISA competitivo descritos por estrato de producción.
Estrato de Producción
Granjas totales muestreadas
Resultados de ELISA
Negativo Sospechoso Positivo
Ponedoras 56 52 2 2 Engorde 68 65 1 2
Reproductoras 28 26 0 2 TOTAL 152 143 3 6
Total de granjas negativas, sospechosas o positivas por estrato de producción.
Fuente: La Autora.
40
5.2. Serotipificación a través de HI para los serotipos H5N2 y H7N3
a partir de los resultados obtenidos en ELISA
Los sueros sospechosos y positivos obtenidos por ELISA fueron
serotipificados para los subtipos H5N2 y H7N3 por la técnica HI. Los
resultados obtenidos de la seropificación para H5N2 fueron negativos
para las 9 granjas analizadas (Tabla 4). De la misma manera las 9 granjas
examinadas para el serotipo H7N3 resultaron negativas (Tabla 5). Es
decir, no hubo presencia de anticuerpos ante hemaglutinina H5 y H7 en
las muestras. Por lo tanto, se descarta la presencia de los serotipos H5N2
y HN3 en Gallus gallus domesticus de las granjas industriales del Ecuador
Continental.
Tabla 4. Serotipificación de las granjas para H5N2 mediante HI.
Caso Resultados de HI para H5N2
Negativo Positivo
MNA-038 MNA-062 MNA-066 MNA-096 MNA-098 MNA-127 MNA-128 MNA-131 MNA-140
(√)Resultados negativos para el subtipo H5N2 de las 9 granjas analizadas.
Fuente: La Autora
41
Tabla 5. Serotipificación de las granjas para H7N3 mediante HI.
Caso Resultados de HI para H7N3
Negativo Positivo
MNA-038 MNA-062 MNA-066 MNA-096 MNA-098 MNA-127 MNA-128 MNA-131 MNA-140
(√)Resultados negativos para el subtipo H7N3 de las 9 granjas analizadas.
Fuente: La Autora.
42
CAPÍTULO VI
DISCUSIÓN
Influenza aviar, pertenece a la lista de enfermedades de declaración
obligatoria de la OIE. Según esta institución, Influenza aviar es una
enfermedad de relevancia para el mundo, debido a los constantes
reportes de brotes en diferentes países (OIE, 2016a, 2016b). En Ecuador,
IA es considerada una enfermedad exótica, siendo necesario realizar el
monitoreo y vigilancia epidemiológica activa para dictaminar el estado
sanitario del país ante IA (MAGAP, 2015; OIE, 2016a, 2016b). El Código
Sanitario de Animales Terrestres de la OIE menciona que la vigilancia
epidemiológica activa de IA es exclusivo para aves de corral. Por lo tanto,
la región insular del país no fue considerada en el estudio realizado dada
la diversidad de fauna silvestre que posee. Además el monitoreo en las
Islas Galápagos requieren consideraciones muestreales particulares y
según AGROCALIDAD debe ser realizado por la Agencia de Regulación y
Control de la Bioseguridad y cuarentena para Galápagos (ABG), entidad
técnica adscrita al Ministerio de Ambiente.
La selección de las granjas muestreadas en cada provincia se realizó de
manera completamente al azar y no se tuvo en cuenta el estrato de
producción, el número de granjas por estrato, tamaños poblacionales por
granja, ni edad de las aves. Cuevas y colaboradores (2009) así como
Snyder y colaboradores (1985) señalan que las aves de corral son
afectadas gravemente por IA sin importar la edad, ya sea por inoculación
experimental o por exposición natural al virus (desafío de campo).
43
Para el monitoreo de Influenza aviar se optó por utilizar un ELISA
competitivo comercial de IDvet. El Kit comercial empleado detecta
anticuerpos ante nucleoproteína (NP) del virus de Influenza. El empleo de
dicho kit se consideró idóneo tomando en cuenta que en el Código
Sanitario de Animales Terrestres de la OIE recomienda la detección de la
presencia de anticuerpos ante NP para efectuar la vigilancia de la
infección de IA en aves no vacunas (OIE, 2016b; Zamora et al., 2008).
Adicionalmente, la OIE indica que se puede emplear AGID o ELISA para
la detección de dichos anticuerpos, pero los estudios realizados por Zhou
y colaboradores (1998) aseveran que la prueba de ELISA competitivo
tiene una especificidad del 99.8%, mientras que AGID del 85.5%. Por lo
que, ELISA podría usarse como prueba de elección en lugar de AGID.
Consecuentemente, el estudio realizado con el empleo del kit de IDvet
Influenza A, Antibody Competition Multi-species, que posee una
sensibilidad del 93% y una especificidad del 100%, es confiable y originó
resultados altamente fiables.
Los resultados de la prueba de ELISA mostraron 3,95% de granjas
positivas, 1.97% de granjas sospechosas y 94,08% de granjas negativas.
Jin y colaboradores (2004) empleando un ELISA casero estandarizado y
un ELISA comercial evaluaron 150 sueros provenientes de aves
infectadas experimentalmente, obteniendo una concordancia del 95%
entre las pruebas y concluyendo que la prueba ELISA competitivo permite
mostrar el estado inmunitario de las aves y provee información clave para
establecer el estado sanitario de las aves. Por lo tanto, en la investigación
llevada a cabo los resultados revelan la ausencia de la enfermedad en el
Ecuador Continental por la ausencia de anticuerpos contra NP en las
muestras analizadas a través de ELISA competitivo (C-ELISA). Además,
según García y Ramos (2006) la difusión del virus dentro de las granjas
industrializadas se da al instante por el tipo de manejo que se realiza y al
estar las aves en estrecho contacto una con la otra. Dado el manejo
intensivo que reciben las aves en el país, podemos afirmar que no existe
difusión del virus de IA en las granjas muestreadas.
44
ELISA y HI son pruebas que presentan dentro del monitoreo serológico
resultados semejantes. Zhou y colaboradores (1998) menciona que los
resultados de ELISA tienen una concordancia entre 82% y 93,6 % con los
resultados de HI. Mientras que en el estudio realizado por Jin y
colaboradores (2004) se obtuvo una diferencia no significativa para el
reconocimiento de muestras positivas entre C-ELISA (74% positivos) y HI
(71,3%). Basado en la similitud de estas dos pruebas en la investigación
realizadas se procesó únicamente los sueros positivos y sospechosos
resultantes de la prueba ELISA competitivo para realizar la serotipificación
a través de HI.
Para la realización de la prueba HI en el estudio efectuado se utilizaron
los subtipos H5N2 y H7N3. Estos subtipos fueron seleccionados por los
constantes reportes a la OIE en el continente Americano, de brotes
relacionados con dichos subtipos. Cuevas y Gonzalez (2009) afirman la
presencia de Influenza A H7N3 de baja patogenicidad en patos silvestres
que migran desde de Estados Unidos y Canadá hacia México. Después
de una secuenciación genómica viral se encontró un 100% de similitud
entre el subtipo aislado en México y el subtipo H7N3 aislado en Nueva
York en el año 2003 a partir de codornices. Hecho que revela que a pesar
del transcurrir del tiempo y de las diversas condiciones ambientales, los
virus de influenza aviar son persistentes en aves exóticas y migratorias,
pudiendo corroborar que un mismo subtipo pueda infectar a varias
especies de aves domésticas o silvestres. Lo mismo se evidencia en el
brote ocurrido en aves industriales de Pensilvania entre 1983 y 1984
causado por el subtipo H5N2 (De Souza & Pippi, 2000; Easterday et al.,
2011; García & Ramos, 2006). A pesar, de las medidas sanitarias
empleadas, el subtipo H5N2 sigue siendo aislado en granjas y mercados
de aves vivas de los Estados Unidos (Easterday et al., 2011). Según la
OIE mediante el portal web de “Actualización de Influenza aviar”, se
reportaron en el año 2016 brotes tanto de H5N2 y H7N3 en países como,
China, México, Francia y Estados Unidos. En México se presentaron 6
focos de H7N3 en gallinas, eliminándose alrededor de 20.000 aves. En
45
enero de 2017, fueron afectados pavos con el subtipo H5N2 en los
Estados Unidos. Rivera (2016) también afirmó la presencia del subtipo
H5N2 en alrededor de 14.000 patos en Canadá. Al estar presentes estos
subtipos en países de la región, Ecuador y América del Sur se encuentran
vulnerables a su ingreso.
Al ser analizadas las 9 granjas por la prueba de HI, todas las granjas
resultaron negativas a la serotipificación para los subtipos utilizados. Por
consiguiente, se descarta la presencia de los serotipos H5N2 y H7N3 en
el Ecuador Continental. A diferencia de Chile que en el año 2003 detectó
un brote de IAAP en pollos y pavos, relacionado con el subtipo H7N3
mismo que se introdujo por migración de aves silvestres hacia el sur;
declarándose en ese país la presencia de IA (Pérez, Zaccagnini, &
Pereda, 2011). Consecuentemente, al encontrarse negatividad en la
serotipificación de las granjas industriales se puede afirmar la ausencia de
influenza aviar en el Ecuador Continental.
46
CAPÍTULO VII
CONCLUSIONES
No se detectó la presencia del virus de IA en aves de corral (Gallus
gallus domesticus) de granjas industriales del Ecuador Continental,
luego de realizar el monitoreo por vigilancia activa y mediante
diagnóstico serológico.
El análisis realizado a través de ELISA competitivo dio como resultado
la ausencia de anticuerpos contra Influenza aviar en 98,8% de granjas
del Ecuador Continental.
Las muestras sospechosas y positivas provenientes de la prueba de
ELISA resultaron negativas para la serotipificación con los subtipos
H5N2 y H7N3.
47
CAPÍTULO VIII
RECOMENDACIONES
Realizar el monitoreo activo de Influenza aviar anualmente. Llevar
acabo también vigilancia pasiva, tal y como lo dispone la OIE, con el
objetivo de evitar el ingreso de una enfermedad exótica que traería
terribles consecuencias económicas, sociales y epidemiológicas.
Analizar otras especies aviares domésticas como los patos,
considerados los principales transmisores de la infección entre las
aves silvestres y las aves domésticas. También debería considerarse
para el monitoreo las aves de traspatio y de pelea.
Colaborar con el monitoreo de la región insular del Ecuador dada la
presencia de aves migratorias, reservorios de Influenza aviar.
48
BIBLIOGRAFÍA
Abad, J., & Pizarro, M. (2006). Influenza aviar algunas consideraciones
sobre el virus y la enfermedad. Profesión Veterinaria, 16(63), 6–13.
Alexander, D. (2000). A review of avian influenza in different bird species.
ELSEVIER Veterinary Microbiology, 74(1–2), 3–13.
https://doi.org/10.1016/S0378-1135(00)00160-7
Alexander, D. (2001). Ecology of avian influenza in domestics birds. In B.
Dodet & M. Vicari (Eds.), Emerging Diseases. Emergence and Control
of Zoonotic ortho-and paramyxovirus diseases. (pp. 25–31). París:
John Libbey Eurotext. Retrieved from
https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=U1lIR14667cC&oi=fnd&
pg=PA25&dq=ALEXANDER+2001+INFLUENZA+AVIAR&ots=5q3rhvf
oUo&sig=1s7PGvn28uI4pq5moYDDHnByvGQ#v=onepage&q=ALEX
ANDER 2001 INFLUENZA AVIAR&f=false
Alexander, D. (2003). Report on Avian Influenza in the Eastern
Hemisphere during 1997-2002. Bio One American Association of
Avian Pathologists, 47(3), 792–797.
https://doi.org/http://dx.doi.org/10.1637/0005-2086-47.s3.792
Alexander, D. (2007). Summary of avian influenza activity in Europe, Asia,
and Africa, 2002-2006. Avian Diseases, 51(1 Suppl), 161–166.
https://doi.org/10.1637/8949-053109-Reg.1
Baraza, E. (2016). Principales enfermedades en avicultura- Infecciones
víricas. (SERVET, Ed.).
Beldomenico, P., & Uhart, M. (2008). Ecoepidemiología de los virus de
Influenza aviar. FAVE Revista Veterinaria, 7, 18.
49
Brown, J., Swayne, D., Cooper, R., Burns, R., & Stallknecht, D. (2007).
Persistence of H5 and H7 Avian Influenza Viruses in Water. Avian
Diseases, 51, 285–289. https://doi.org/10.1637/7636-042806R.1
Buscaglia, C. (2004). Influenza aviar. Invet, 6, 20. Retrieved from
http://www.fvet.uba.ar/publicaciones/archivos/ant/volumen6art7.pdf
Capua, I., & Alexander, D. J. (2002). Avian influenza and human health.
ELSEVIER Acta Tropica, 83(1), 1–6. https://doi.org/10.1016/S0001-
706X(02)00050-5
Capua, I., & Alexander, D. J. (2004). Human Health Implications of Avian
Influenza Viruses and Paramyxoviruses. Eur J Clin Microbiol Infect
Dis. 23, 1–6. https://doi.org/10.1007/s10096-003-1059-3
Capua, I., & Alexander, D. J. (2006). Avian influenza infections in birds - a
moving target. Blackwell Publishing Ltd, 1(1), 11–18.
https://doi.org/10.1111/j.1750-2659.2006.00004.x
CDC. (2015). Virus de la influenza aviar A (H5N1) altamente patógena de
origen asiático. Center for Disease Control. Retrieved from
https://espanol.cdc.gov/enes/flu/avianflu/h5n1-virus.htm
CDC. (2017). Influenza (gripe). Center for Disease Control. Retrieved from
https://espanol.cdc.gov/enes/flu/avianflu/avian-in-birds.htm
CFSPH. (2015). Avian Influenza. Iowa State University "The Center for
Food Security & Public Health, (November), 1–37.
https://doi.org/10.3201/eid1503.081661
CONAVE. (2015). Estadísticas al día. Corporación Nacional de Avicultores
del Ecuador. Retrieved from http://www.conave.org/estadisticas.html
Cuevas, E., & Gonzalez, C. (2009). Detección de orthomyxovirus H7N3 en
50
anátidos del Estado de México. Redvet, 10(4). Retrieved from
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n040409/040909.pdf
De Souza, H., & Pippi, C. (2000). Influenza Aviária. In M. Macari & A.
Berchieri (Eds.), DoenÇas das Aves (pp. 283–291). Brasil: OESP
Gráficas.
Dundon, W. G., Terregino, C., Tuttoilmondo, V., Pizzuto, M., Busani, L.,
Mancin, M., … Capua, I. (2007). PRELIMINARY VALIDATION OF A
COMMERCIAL AVIAN INFLUENZA N1 ANTIBODY COMPETITIVE
ELISA KIT THAT CAN BE USED AS PART OF A DIVA STRATEGY.
Epizone, 2(3), 1. Retrieved from http://www.id-vet.com/produit/id-
screen-influenza-a-antibody-competition-multi-species/
Easterday, B., Hinshaw, V., & Halvorson, D. (2011). Influenza. In
Enfermedades de las aves (pp. 597–619).
Echániz, G. (2004). Enfermedades emergentes. Salud Publica de Mexico,
46(2), 2–3.
El Universo. (2014, May 12). Consumo de pollo subió cinco veces más
frente a 1990. El Universo, p. 2. Guayaquil. Retrieved from
http://www.eluniverso.com/noticias/2014/05/12/nota/2951971/consum
o-pollo-subio-cinco-veces-mas-frente-1990
FAO, OIE, & WHO. (2011). FAO-OIE-WHO Technical Update: Current
evolution of avian influenza H5N1 viruses. Food and Agriculture
Organization. Retrieved from http://www.fao.org/avianflu/en/index.html
García, J., & Ramos, C. (2006). La influenza, un problema vigente de
salud publica. Salud Publica de Mexico, 48(3), 244–267.
https://doi.org/10.1590/S0036-36342006000300009
Guitérrez, V., Belaunde, L., & Cobos, M. (1996). Manual de
51
procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de Arbovirosis.
Instituto Nacional de Salud, 16, 23–25.
Guzmán, E. (2004). Las pruebas de ELISA. Artemias, 140(3), 48–49.
Hill, E., Hendrix, C., & Sirois, M. (2007). Immunology, Serology, and
Molecular Diagnostics. In T. Merchant (Ed.), Laboratory procedures
(Fifth, pp. 271–276). Canada: ELSEVIER.
Jin, M., Wang, G., Zhang, R., Zhao, S., Li, H., Tan, Y., & Chen, H. (2004).
Development of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay with
Nucleoprotein as Antigen for Detection of Antibodies to Avian
Influenza Virus. Avian Diseases, 48(4), 870–878.
https://doi.org/10.1637/7226-062204r
Jofré, L., Perret, C., Dabanch, J., Abarca, K., Olivares, R., Luchsinger, V.,
… Olea, A. (2005). Influenza : reemergencia de una antigua
enfermedad y el potencial riesgo de una nueva pandemia. Rev Chil
Nfect 2005, 22(1), 75–88.
MAGAP. (2015). Censo avícola. Ministerio de Agricultura, Ganadería,
Acuacultura y Pesca. Retrieved from http://www.agrocalidad.gob.ec/
Martínez, J., & Jaramillo, C. (2010). Búsqueda de información en la
investigación epidemiológica. In J. Morales (Ed.), Epidemiología
Veterinaria (pp. 110–119). México D.F.: El Manual Moderno.
OIE. (2016a). Actualización sobre Influenza aviar. Organización Mundial
de Sanidad Animal. Retrieved from http://www.oie.int/es/sanidad-
animal-en-el-mundo/actualizacion-sobre-la-influenza-aviar/2016/
OIE. (2016b). Código sanitario para los animales terrestes. Organización
Mundial de Sanidad Animal. Retrieved from
http://www.oie.int/es/normas-internacionales/codigo-terrestre/
52
OIE. (2016c). Influenza aviar- Fichas de información general sobre
enfermedades animales. Organización Mundial de Sanidad Animal.
Retrieved from http://www.oie.int/doc/ged/D13948.PDF
OIE. (2016d). Preguntas y respuestas sobre la influenza A(H7N9).
Organización Mundial de Sanidad Animal. Retrieved from
http://www.oie.int/es/para-los-periodistas/comunicados-de-
prensa/detalle/article/questions-and-answers-on-influenza-ah7n9/
OMS. (2014). World : Affected areas with confirmed cases of H5N1 avian
influenza since 2003, status as of 24-Jan-2014 (latest available
update). Organización Mundial de la Salud. Retrieved from
http://gamapserver.who.int/mapLibrary/Files/Maps/2003_2013_AvianI
nfluenza_GlobalMap_24Jan14.png
Pantin, J., & Swayne, D. E. (2009). Pathogenesis and pathobiology of
avian influenza virus infection in birds. Revue Scientifique et
Technique (International Office of Epizootics), 28(1), 113–136.
Pérez, A., Zaccagnini, E., & Pereda, A. (2011). La Influenza Aviar y sus
implicancias para la salud de las aves silvestres de América del Sur.
Hornero, 26(1), 29–44.
PP Digital. (2015, August 24). El consumo de pollo y huevos cada vez es
mayor. PP Digital, p. 4. Guayaquil. Retrieved from
http://www.ppdigital.com.ec/noticias/economia/6/el-consumo-de-pollo-
y-de-huevos-cada-vez-es-mayor
Ramírez, S. (2016, January 17). La competitividad es el reto para el sector
avícola. LIDERES, p. 3. Retrieved from
http://www.revistalideres.ec/lideres/competitividad-reto-sector-avicola-
alimentos.html
53
Rivera, O. (2016). Gripe aviar: Febrero- Marzo- Abril-2017 máxima alerta
para América. Pronavícola, No 78, 2.
Saif, Y., Fadly, A., Glisson, J., McDougald, L., Nolan, L., & Swayne, D.
(2008). Influenza. In Disseases of Poultry (12 th, pp. 153–183).
Blackwell.
Snyder, D. B., Marquardt, W. W., Yancey, F. S., & Savage, P. K. (1985).
An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibody
against avian influenza virus. Avian Diseases, 29(1), 136–144.
Spickler, A. R., Trampel, D. W., & Roth, J. a. (2008). The onset of virus
shedding and clinical signs in chickens infected with high-
pathogenicity and low-pathogenicity avian influenza viruses. Avian
Pathology : Journal of the W.V.P.A, 37(6), 555–577.
https://doi.org/10.1080/03079450802499118
Suárez, G. (2005). “Historia Natural de la Influenza Aviar o ‘gripe del
pollo’. Análisis sanitario actual y prospectivo.” Real Academia
Nacional de Medicina, TOMO CXXII(340634), 215–227. Retrieved
from http://www.ranm.es/sesiones-y-actos/archivosesiones/2005/239-
sesion-del-dia-8-de-marzo-del-2005.html?showall=&start=1
Swayne, D. E., & Pantin, J. (2006). Pathogenicity of avian influenza
viruses in poultry. Developments in Biologicals, 124, 61–67.
Thrusfield, M. (2007). Surveys. In Veterinary Epidemiology (Third, pp.
228–245). Oxford: Blackwell.
Vineza, C. (2005). Interpretación y uso de exámenes de ELISA en
Avicultura. Revista Elctrónica de Veterinaria REDVET, VI(7), 1–7.
Zamora, A., Percedo, M., Abeledo, M., & Noda, J. (2008). Algunas pautas
para establecer una estrategia de Vigilancia Epidemiológica de la
54
Influenza Aviar. Rev. Salud Anim., 30(2), 69–77.
Zhou, E., Chan, M., Heckert, R., Riva, J., & Cantin, M. (1998). Evaluation
of a Competitive ELISA for Detection of Antibodies against Avian
Influenza Virus Nucleoprotein. American Association of Avian
Pathologigts Allen Press, 42(3), 517–522. https://doi.org/18-10-2015
17:58 UTC
55
ANEXOS
Anexo 1. Tabla de la muestra requerida para detectar enfermedad
según Cannon y Roe.
Tamaño de la
población (N)
Porcentaje de animales enfermos en la población (d/N)
50% 40%
30%
25%
20%
15%
10%
5% 2% 1% 0.5% 0.1%
10 4 5 6 7 8 10 10 10 10 10 10 10 20 4 6 7 9 10 12 16 19 20 20 20 20 30 4 6 8 9 11 14 19 26 30 30 30 30 40 5 6 8 10 12 15 21 31 40 40 40 40 50 5 6 8 10 12 16 22 35 46 50 50 50 60 5 6 8 10 12 16 23 38 55 60 60 60 70 5 6 8 10 13 17 24 40 62 70 70 70 80 5 6 8 10 13 17 24 42 68 79 80 80 90 5 6 8 10 13 17 25 43 73 87 90 90 100 5 6 9 10 13 17 25 45 78 96 100 100 120 5 6 9 10 13 18 26 47 86 111 120 120 140 5 6 9 11 13 18 26 48 92 124 139 140 160 5 6 9 11 13 18 27 49 97 136 157 160 180 5 6 9 11 13 18 27 50 101 146 174 180 200 5 6 9 11 13 18 27 51 105 155 190 200 250 5 6 9 11 14 18 27 53 112 175 228 250 300 5 6 9 11 14 18 28 54 117 189 260 300 350 5 6 9 11 14 18 28 54 121 201 287 350 400 5 6 9 11 14 19 28 55 124 211 311 400 450 5 6 9 11 14 19 28 55 127 218 331 450 500 5 6 9 11 14 19 28 56 129 225 349 500 600 5 6 9 11 14 19 28 56 132 235 379 597 700 5 6 9 11 14 19 28 57 134 243 402 691 800 5 6 9 11 14 19 28 57 136 249 421 782 900 5 6 9 11 14 19 28 57 137 254 437 868 1000 5 6 9 11 14 19 29 57 138 258 450 950 1200 5 6 9 11 14 19 29 57 140 264 471 1102 1400 5 6 9 11 14 19 29 58 141 269 487 1236 1600 5 6 9 11 14 19 29 58 142 272 499 1354 1800 5 6 9 11 14 19 29 58 143 275 509 1459 2000 5 6 9 11 14 19 29 58 143 277 517 1553 3000 5 6 9 11 14 19 29 58 145 284 542 1895 4000 5 6 9 11 14 19 29 58 146 268 556 2108 5000 5 6 9 11 14 19 29 59 147 290 564 2253 6000 5 6 9 11 14 19 29 59 147 291 569 2358 7000 5 6 9 11 14 19 29 59 147 292 573 2437 8000 5 6 9 11 14 19 29 59 147 293 576 2498 9000 5 6 9 11 14 19 29 59 148 294 579 2548
10000 5 6 9 11 14 19 29 59 148 294 581 2588 ∞ 5 6 9 11 14 19 29 59 149 299 598 2995
Nota: Se resalta con subrayado amarillo el tamaño de muestra a emplear según
selección de prevalencia del 2%. Fuente: Thrusfield M., 2007.
56
Anexo 2. Hoja para vigilancia activa de AGROCALIDAD
57
Anexo 3. Registro de datos de las granjas muestreadas a nivel
nacional para Influenza aviar.
58
N° Nombre del Predio
N° de Caso N° Etiqueta N° de orden Provincia Cantón Parroquia Edad Categoría producción
1 Avícola Asanza MNA-001 SE-a1604-2620 07-2016-05 El Oro Balsas Balsas 6 sem
Engorde
2 Exporavic MNA-002 SE-a1604-2647 23-2016-45 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Santo Domingo
46 días
Engorde
3 Granja avícola Casco
MNA-003 SE-a1604-2672 06-2016-03 Chimborazo Penipe Matus 24 sem
Ponedoras
4 Nueva Esperanza MNA-004 SE-a1604-2702 12-2016-15 Los Ríos Montalvo Montalvo 18 sem
Reproductoras
5 Nueva Guinea
MNA-005 SE-a1604-2727 07-2016-09 El Oro Balsas Balsas 5 sem
Engorde
6 Avícola Chenoa MNA-006 SE-a1604-2752 07-2016-10 El Oro Piñas Piñas 36 días
Engorde
7 Palmerita Iglesia
MNA-007 SE-a1604-2753 07-2016-06 El Oro Marcabelí Marcabelí 7 ½ sem
Engorde
8 El Palmal
MNA-008 SE-a1604-2802 07-2016-07 El Oro Balsas Balsas 6 sem
Engorde
9 Avícola El Arbolito
MNA-009 SE-a1604-2827 07-2016-08 El Oro Piñas La Bocana 47 días
Engorde
10 Avícola San Mateo MNA-010 SE-a1604-2852 18-2016-25 Tungurahua Ambato Constantino Fernández
50 sem
Ponedoras
11 Avícola Pérez MNA-011 SE-a1604-2877 18-2016-24 Tungurahua Ambato Augusto Martínez
58 sem
Ponedoras
12 La Florida MNA-012 SE-a1604-2902 23-2016-46 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Alluriquín 39 sem
Reproductoras
13 El Edén MNA-013 SE-a1605-2966 15-2016-02 Napo El Chaco El Chaco 15 sem
Reproductoras
14 La Primavera MNA-014 SE-a1605-2991 15-2016-01 Napo Quijos Borja 8 sem
Reproductoras
15 El Llano
MNA-015 SE-a1605-3016 17-2016-75 Pichincha Quito Puéllaro 65 sem
Ponedoras
16 Avicamp 02 MNA-016 SE-a1605-3041 17-2016-74 Pichincha Quito Puéllaro 66 sem
Ponedoras
17 S/N MNA-017 SE-a1605-3066 17-2016-77 Pichincha Quito Puéllaro 61 días
Engorde
59
18 S/N MNA-018 SE-a1605-3091 17-2016-73 Pichincha Quito Puéllaro 8 sem
Engorde
19 San Antonio MNA-019 SE-a1605-3116 10-2016-007 Imbabura Urcuquí Tumbabiro 36 sem
Reproductoras
20 Avícola Reio Blanco
MNA-020 SE-a1605-3141 17-2016-81 Pichincha S.M. los Bancos
Los Bancos 5 sem
Engorde
21 Avícola Joro MNA-021 SE-a1605-3166 17-2016-80 Pichincha S.M. los Bancos
S. M. de los Bancos
5 sem
Engorde
22 Granja avícola "Clarita"
MNA-022 SE-a1605-3191 17-2016-79 Pichincha P.V. Maldonado
P. V. Maldonado
6 sem
Engorde
23 Avícola Gramitor MNA-023 SE-a1605-3216 17-2016-78 Pichincha Puerto Quito
Puerto Quito
7 sem
Engorde
24 Avícola Pérez MNA-024 SE-a1605-3275 18-2016-26 Tungurahua Ambato A. Martínez 70 sem
Ponedoras
25 Avícola El Rosario MNA-025 SE-a1605-3300 18-2016-27 Tungurahua Ambato A. Martínez 38 sem
Ponedoras
26 Granja Oñate MNA-026 SE-a1605-3325 06-2016-04 Chimborazo Penipe Matus 50 sem
Ponedoras
27 La Avelina MNA-027 SE-a1605-3350 12-2016-021 Los Ríos Montalvo Montalvo 21 sem
Reproductoras
28 Avícola Hermanos Romero
MNA-028 SE-a1605-3375 07-2016-11 El Oro Balsas Balsas 5 ½ sem
Engorde
29 Avícola San Luis MNA-029 SE-a1605-3400 18-2016-28 Tungurahua Ambato A. Martínez 45 sem
Ponedoras
30 Avícola Marquito MNA-030 SE-a1605-3425 18-2016-24 Tungurahua Ambato Atahualpa 52 sem
Ponedoras
31 Avícola Moreta (S/N)
MNA-031 SE-a1605-3450 18-2016-30 Tungurahua Ambato Picaigua 7 sem
Engorde
32 Avícola López MNA-032 SE-a1605-3475 18-2016-31 Tungurahua Ambato Atahualpa 76 sem
Ponedoras
33 S/N MNA-033 SE-a1605-4291 17-2016-100 Pichincha Quito Puéllaro 36 días
Engorde
34 S/N MNA-034 SE-a1605-4316 17-2016-76 Pichincha Quito Puéllaro 65 sem
Ponedoras
35 Avícola Vittorio MNA-035 SE-a1605-4341 003-2016-109 Cañar La Troncal Manuel I. Calle
38 días
Engorde
60
36 Avícola María Auxiliadora
MNA-036 SE-a1605-4366 01-2016-232 Azuay Cuenca Tarqui 67 sem
Ponedoras
37 S/N MNA-037 SE-a1605-4391 01-2016-233 Azuay Cuenca Santa Ana 7 sem
Engorde
38 Gigantones (Caledoneas)
MNA-038 SE-a1605-4416 01-2016-236 Azuay Girón Caledoneas 7 sem
Engorde
39 Granja El Jacalito MNA-039 SE-a1605-4441 23-2016-49 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Las Mercedes
53 sem
Ponedoras
40 Granja San Antonio
MNA-040 SE-a1605-4466 23-2016-48 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Las Mercedes
52 sem
Ponedoras
41 Flor Angélica Zambrano Hidalgo
MNA-041 SE-a1605-4491 07-2016-12 El Oro Balsas Balsas 45 días
Engorde
42 Arturo Tinoco Loaiza
MNA-042 SE-a1605-4516 07-2016-13 El Oro Piñas Moromoro 6 sem
Engorde
43 Avícola la Perla MNA-043 SE-A1605-4541 18-2016-32 Tungurahua Patate Patate 23 sem
Ponedoras
44 Avícola la Perla MNA-044 SE-a1605-4566 18-2016-33 Tungurahua Patate Patate 23 sem
Ponedoras
45 El Carmen MNA-045 SE-a1605-4591 23-2016-50 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Rio Verde 44 días
Engorde
46 San Guillermo MNA-046 SE-a1605-4616 10-2016-008 Imbabura Ibarra La Carolina 42 días
Engorde
47 Granja Avícola el Sol
MNA-047 SE-a1605-4641 06-2016-05 Chimborazo Guano La Providencia
25 sem
Ponedoras
48 San Carlos 1 MNA-048 SE-a1605-4813 09-2016-1965 Guayas Cnel. Marcelino
Marcelino Maridueña
34 sem
Reproductoras
49 Santa Teresa MNA-049 SE-a1605-4838 17-2016-123 Pichincha Quito Amaguaña 9 sem
Reproductoras
50 Avícola Alexandrita
MNA-050 SE-a1605-4863 18-2016-36 Tungurahua Pelileo Cotaló N/A Ponedoras
51 Avícola Bilbao MNA-051 SE-a1605-4888 18-2016-35 Tungurahua Pelileo Cotaló 55 sem
Ponedoras
52 El Vergel MNA-052 SE-a1605-4913 15-2016-03 Napo Archidona Cotundo 33 sem
Reproductoras
53 San Carlos 3 MNA-053 SE-a1605-4938 09-2016-1966 Guayas Cnel. Marcelino
Marcelino Maridueña
51 sem
Reproductoras
61
54 San Carlos 4 MNA-054 SE-a1605-4963 09-2016-1967 Guayas Cnel. Marcelino
Marcelino Maridueña
61 sem
Reproductoras
55 Avícola Avisan MNA-055 SE-a1605-4988 18-2016-37 Tungurahua Pelileo Cotaló 69 sem
Ponedoras
56 Avícola Avimajo MNA-056 SE-a1605-5013 18-2016-38 Tungurahua Pelileo Cotaló 26 sem
Ponedoras
57 Granja Rigoberto MNA-057 SE-a1605-5038 23-2016-52 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Las Mercedes
49 días
Engorde
58 Granja avícola El Cristal
MNA-058 SE-a1605-5063 08-2016-003 Esmeraldas San Lorenzo
Alto Tambo 12 sem
Reproductoras
59 El Cóndor MNA-059 SE-a1605-5088 10-2016-009 Imbabura Antonio Ante
San José Chaltura
58 sem
Reproductoras
60 Agrolomas CIA.LTDA.
MNA-060 SE-a1605-5113 07-2016-17 El Oro Piñas San Roque 32 sem
Ponedoras
61 Cajanuma 2 MNA-061 SE-a1605-5138 11-2016-075 Loja Loja San Sebastián
56 días
Engorde
62 Las Palmas MNA-062 SE-a1605-5172 17-2016-131 Pichincha Mejía Tandapi 27 sem
Reproductoras
63 La Virgen MNA-063 SE-a1605-5224 23-2016-57 SD Tsáchilas
Santo Domingo
San Jacinto 52 días
Engorde
64 AvícolaDayanita MNA-064 SE-a1605-5249 23-2016-56 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Puerto Limón
42 días
Engorde
65 Avícola Cecilita MNA-065 SE-a1605-5274 18-2016-40 Tungurahua Mocha Pinguili 55 sem
Ponedoras
66 Avícola San Juan MNA-066 SE-a1605-5299 18-2016-41 Tungurahua Mocha Mocha 60 sem
Ponedoras
67 San Roquito MNA-067 SE-a1605-5324 07-2016-18 El Oro Balsas Balsas 8 sem
Engorde
68 Avícola Río blanco MNA-068 SE-a1605-5349 06-2016-07 Chimborazo Riobamba Quimiag 18 días
Engorde
69 Avícola Plavalle MNA-069 SE-a1605-5374 06-2016-06 Chimborazo Penipe Matriz 30 sem
Ponedoras
70 Avícola San José MNA-070 SE-a1605-5399 18-2016-42 Tungurahua Pelileo Pelileo 79 sem
Ponedoras
71 AvícolaElinita MNA-071 SE-a1605-5424 18-2016-43 Tungurahua Pelileo Cotaló 64 sem
Ponedoras
62
72 Portales MNA-072 SE-a1605-5449 10-2016-12 Imbabura Cotacachi Quiroga 35 días
Engorde
73 Regalo de Dios MNA-073 SE-a1605-5768 05-2016-0021 Cotopaxi Salcedo San Miguel 82 sem
Ponedoras
74 Avícola Herrera MNA-074 SE-a1605-5793 05-2016-0020 Cotopaxi Latacunga San Buena Ventura
70 sem
Ponedoras
75 Mazavicultura MNA-075 SE-a1605-5818 05-2016-0022 Cotopaxi Salcedo Panzaleo 64 sem
Ponedoras
76 La Francesa MNA-076 SE-a1605-5843 07-2016-19 El Oro Pasaje Progreso 23 sem
Reproductoras
77 La Esmeralda MNA-077 SE-a1605-5868 12-2016-027 Los Ríos Montalvo Montalvo 27 sem
Reproductoras
78 Granja Ochoa MNA-078 SE-a1605-5893 23-2016-60 SD Tsáchilas
Santo Domingo
San Jacinto 37 días
Engorde
79 Los Cedros MNA-079 SE-a1605-5918 16-2016-24 Pastaza Santa Clara San José 62 sem
Reproductoras
80 Los Laureles MNA-080 SE-a1605-5943 16-2016-23 Pastaza Santa Clara San José 27 sem
Reproductoras
81 Hacienda La Primavera
MNA-081 SE-a1605-5968 17-2016-138 Pichincha Quito Puembo 73 sem
Ponedoras
82 Avícola Damián MNA-082 SE-a1605-5993 11-2016-079 Loja Chaguarpamba
Santa Rufina
8 sem
Engorde
83 ZhunioFarez MNA-083 SE-a1605-6018 19-2016-113 Zamora Chinchipe
El Pangui Pachicutza 24 sem
Ponedoras
84 Granja Guayabal MNA-084 SE-a1605-6242 16-2016-28 Pastaza Mera Madre tierra 50 sem
Reproductoras
85 Amalia MNA-085 SE-a1605-6267 16-2016-27 Pastaza Mera Madre tierra 33 sem
Reproductoras
86 Los Girasoles MNA-086 SE-a1605-6292 18-2016-44 Tungurahua Cevallos Cevallos 38 sem
Ponedoras
87 Ana María MNA-087 SE-a1605-6317 18-2016-45 Tungurahua Pelileo Guambaló 45 sem
Ponedoras
88 San Fernando MNA-088 SE-a1605-6342 9-2016-2204 Guayas El Empalme Velasco Ibarra
79 sem
Ponedoras
89 Avícola Brazales MNA-089 SE-a1605-6367 05-2016-0023 Cotopaxi Latacunga Alaques 76 sem
Ponedoras
63
90 Avícola Alex MNA-090 SE-a1605-6392 05-2016-0024 Cotopaxi Latacunga Belisario Quevedo
56 sem
Ponedoras
91 El Bosque MNA-091 SE-a1605-6417 21-2016-079 Sucumbíos Lago agrio Jambelí 12 días
Engorde
92 Vista Hermosa MNA-092 SE-a1605-6442 12-2016-030 Los Ríos Montalvo Montalvo 36 sem
Reproductoras
93 Santa Elena MNA-093 SE-a1605-6467 74-2016-001 Santa Elena Santa Elena
Chanduy 8 sem
Ponedoras
94 Grupo Avícola Santa Rita
MNA-094 SE-a1605-6492 10-2016-14 Imbabura Ibarra Lita 38 días
Engorde
95 Achachi MNA-095 SE-a1605-6517 02-2016-0038 Bolívar Chimbo La Magdalena
7 sem
Engorde
96 S/N MNA-096 SE-a1605-6542 02-2016-0037 Bolívar Guaranda Guanujo 36 sem
Ponedoras
97 Avícola Libertad MNA-097 SE-a1605-6567 17-2016-146 Pichincha Quito La Merced 35 días
Engorde
98 Avícola Araza
MNA-098 SE-a1606-6629 16-2016-30 Pastaza Mera Madre tierra 27 sem
Reproductoras
99 Flor Canela
MNA-099 SE-a1606-6654 16-2016-29 Pastaza Mera Madre tierra 59 sem
Reproductoras
100 El Tablón MNA-100 SE-a1606-6679 01-2016-288 Azuay Pucara El Tablón 20 sem
Reproductoras
101 Diana Yanza MNA-101 SE-a1606-6704 01-2016-292 Azuay Gualaceo Jadán 5 sem
Engorde
102 San José de Zhidmad
MNA-102 SE-a1606-6729 01-2016-290 Azuay Gualaceo Zhidmad 8 sem
Engorde
103 Isabel Paucar MNA-103 SE-a1606-6754 01-2016-291 Azuay Gualaceo Jadán 8 sem
Engorde
104 Los Almendros MNA-104 SE-a1606-6779 22-2016-021 Orellana Joya de Sachas
Sachas 45 días
Engorde
105 Avícola Yurasnuco MNA-105 SE-a1606-6804 17-2016-147 Pichincha Quito Tumbaco 36 días
Engorde
106 Atahualpa MNA-106 SE-a1606-6829 24-2016-002 Santa Elena Santa Elena
Atahualpa 44 sem
Reproductoras
107 La Hacienda MNA-107 SE-a1606-6854 11-2016-088 Loja Loja San Sebastián
27 sem
Ponedoras
64
108 AVIPACIFIC S.A. MNA-108 SE-a1606-6879 09-2016-2313 Guayas Durán Eloy Alfaro 35 días
Engorde
109 Avícola Mafer MNA-109 SE-a1606-6904 09-2016-2314 Guayas Bucay Bucay 35 días
Engorde
110 Granja Ave Campo
MNA-110 SE-a1606-6929 09-2016-2315 Guayas Bucay Bucay 35 días
Engorde
111 Normandia MNA-111 SE-a1606-6954 23-2026-63 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Santo Domingo
49 días
Engorde
112 Golden Chiken MNA-112 SE-a1606-6979 23-2016-62 SD Tsáchilas
Santo Domingo
Santo Domingo
36 días
Engorde
113 La Victoria MNA-113 SE-a1606-7132 10-2016-15 Imbabura Ibarra San Antonio
50 días
Engorde
114 AvícolaUrdiales MNA-114 SE-a1606-7157 03-2016-127 Cañar Cañar Ducur 6 sem
Engorde
115 Avicola Zapallo MNA-115 SE-a1606-7182 13-2016-0202 Manabí Portoviejo Calderon 7 sem
Engorde
116 Avícola María Natividad
MNA-116 SE-a1606-7207 17-2016-151 Pichincha Pedro Moncayo
Tocachi 30 sem
Ponedoras
117 Avícola Cubinche MNA-117 SE-a1606-7232 17-2016-149 Pichincha Quito La Esperanza
45 días
Engorde
118 Avícola Lilia Elena MNA-118 SE-a1606-7257 17-2016-150 Pichincha Pedro Moncayo
Tocachi 42 días
Engorde
119 Granja Tabacundo MNA-119 SE-a1606-7282 17-2016-153 Pichincha Pedro Moncayo
La Esperanza
63 sem
Reproductoras
120 María Elizabeth MNA-120 SE-a1606-7307 17-2016-152 Pichincha Pedro Moncayo
Malchingui 35 días
Engorde
121 Avícola Manuel MNA-121 SE-a1606-7332 05-2016-0027 Cotopaxi Latacunga Eloy Alfaro 64 sem
Ponedoras
122 AvícolaMishell MNA-122 SE-a1606-7357 05-2016-026 Cotopaxi Saquisilí Chantilin chico
72 sem
Ponedoras
123 Granja Juliet MNA-123 SE-a1606-7931 13-2016-206 Manabí Santa Ana Lodana 7 sem
Engorde
124 S/N MNA-124 SE-a1606-7956 16-2016-31 Pastaza Pastaza Fátima 36 días
Engorde
125 Avipechichal Maravilla 1
MNA-125 SE-a1606-7981 13-2016-207 Manabí Rocafuerte Rocafuerte 6 sem
Engorde
65
126 Avícola del Valle MNA-126 SE-a1606-8006 06-2016-08 Chimborazo Pallatanga Matriz 42 sem
Ponedoras
127 Avícola Adriansito 1
MNA-127 SE-a1606-8031 06-2016-09 Chimborazo Pallatanga Matriz 41 días
Engorde
128 AvícolaCarmita MNA-128 SE-a1606-8056 18-2016-46 Tungurahua Píllaro Píllaro 75 sem
Ponedoras
129 Avícola Santa Lucia
MNA-129 SE-a1606-8081 18-2016-47 Tungurahua Píllaro San Andrés 80 sem
Ponedoras
130 Avícola Villacís MNA-130 SE-a1606-8106 18-2016-48 Tungurahua Ambato Augusto Martínez
80 sem
Ponedoras
131 Granja Chamanal MNA-131 SE-a1606-8131 10-2016-15 Imbabura Urcuquí Urcuquí 49 días
Engorde
132 S/N MNA-132 SE-a1606-8156 01-2016-316 Azuay Gualaceo Jadán 9 sem
Engorde
133 S/N MNA-133 SE-a1606-8275 01-2016-312 Azuay Guachapala Guachapala 5 sem
Engorde
134 María Rosario MNA-134 SE-a1606-8300 01-2016-318 Azuay Gualaceo Jadán 8 sem
Engorde
135 Avícola Delgado MNA-135 SE-a1606-8325 01-2016-317 Azuay Gualaceo Jadán 9 sem
Engorde
136 Granja Rita MNA-136 SE-a1606-8350 01-2016-319 Azuay Gualaceo Jadán 10 sem
Engorde
137 Granja Paraíso MNA-137 SE-a1606-8375 04-2016-031 Carchi Mira Mira 49 sem
Reproductoras
138 María Esther MNA-138 SE-a1606-8400 13-2016-203 Manabí Sucre Leonidas Plaza
78 sem
Ponedoras
139 Avícola Santa Clara
MNA-139 SE-a1606-8425 13-2016-212 Manabí Montecristi Montecristi 95 sem
Ponedoras
140 Avícola Los Pinos MNA-140 SE-a1606-8450 05-2016-0032 Cotopaxi Latacunga Eloy Alfaro 90 sem
Ponedoras
141 Avícola la Dolorosa
MNA-141 SE-a1606-8475 05-2016-0033 Cotopaxi Salcedo Mulalillo 40 sem
Ponedoras
142 Avícola San Pedro MNA-142 SE-a1606-8516 05-2016-0034 Cotopaxi Salcedo San Miguel 50 días
Engorde
143 Avícola Valeria MNA-143 SE-a1606-8541 05-2016-0035 Cotopaxi Latacunga Mulaló 81 sem
Ponedoras
66
144 Granja Avícola Sol de Oriente
MNA-144 SE-a1606-8566 14-2016-141 Morona Santiago
LimonIndaza
General Plaza
37 días
Engorde
145 S/N MNA-145 SE-a1606-8591 01-2016-325 Azuay Paute Zhumir 5 sem
Engorde
146 Avianhalzer Manantiales
MNA-146 SE-a1606-8616 13-2016-223 Manabí Montecristi Montecristi 57 sem
Reproductoras
147 Narcisa MNA-147 SE-a1606-8641 16-2016-34 Pastaza Pastaza Tarqui 6 sem
Engorde
148 S/N MNA-148 SE-a1606-8666 16-2016-33 Pastaza Mera Mera 5 sem
Engorde
149 Granja Pilonan MNA-149 SE-a1606-8691 01-2016-324 Azuay Santa Isabel
Santa Isabel
8 sem
Engorde
150 Mi granjita MNA-150 SE-a1606-8716 13-2016-224 Manabí Chone Santa Rita 72 sem
Ponedoras
151 AvícolaVélez Valarezo
MNA-151 SE-a1606-8741 13-2016-209 Manabí Sucre Leonidas Plaza
90 sem
Ponedoras
152 AvícolaMaría Laura
MNA-152 SE-a1606-8766 13-2016-0225 Manabí Portoviejo Picoasa 75 sem
Ponedoras
Nota: sem: semanas
Fuente: La Autora.
67
Anexo 4. Hoja de protocolo para la distribución de muestras en placa
multipocillo de ELISA.
DATOS GENERALES
Análisis:
Fecha de Análisis:
No. Caso:
No. y tipo de muestra:
No. Lote:
Caducidad:
DISEÑO DE LA PLACA ELISA
Análisis
# Tira 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CP M M M M M M M M M M M
B CP M M M M M M M M M M M
C CN M M M M M M M M M M M
D CN M M M M M M M M M M M
E M M M M M M M M M M M M
F M M M M M M M M M M M M
G M M M M M M M M M M M M
H M M M M M M M M M M M M
Nota: CP: control positivo, CN: control negativo, M: muestra.
Fuente: La Autora.
68
Anexo 5. Procedimiento ELISA competitivo.
a. Preparación del material y ambientación de los reactivos.
b. Dilución de sueros en la microplaca sensibilizada con la nucleoproteína de Influenza Aviar.
c. Incubación de sueros más reactivos por 60 min a 37ºC.
d. Lavado de la microplaca.
e. Colocación del conjugado 1x.
f. Incubación de conjugado por 30 min a 21ºC.
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
69
Continuación del procedimiento de la prueba de ELISA
g. Distribución de la solución de revelado.
h. Colocación de la solución de parada.
i. Lectura de la densidad óptica a 450 nm.
j. Lectura de resultados por el Software IDSoft
TM.
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
70
Anexo 6. Tabla para titulación de los antígenos de Influenza aviar (H5N2
y H7N3).
Muestras 1/
2
1/
4
1/
8
1/
16
1/
32
1/
64
1/
12
8
1/
25
6
1/
51
2
1/
10
24
1/
20
48
1/
40
96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1/2 A Ag1 d d d d d d d d d d d
1/4 B Ag1 d d d d d d d d d d d
1/8 C Ag2 d d d d d d d d d d d
1/16 D Ag2 d d d d d d d d d d d
1/32 E
1/64 F
1/128 G
1/256 H CGR CGR CGR CGR CGR CGR CGR CGR CGR CGR CGR CGR
Nota: Ag1= H5N2, Ag2= H7N3, d= dilución, CGR= Control de glóbulos rojos.
Fuente: La Autora.
71
Anexo 7. Procedimiento de Inhibición de la hemoaglutinación (HI).
a. Material utilizado para HI.
b. Preparación de glóbulos rojos al 0,5%.
c. Titulación de los Antígenos de Influenza aviar.
d.Preparación de los Antígenos a 4UHA.
d. Control de las 4 UHA.
f.Inactivación de sueros a Baño María.
g. Rotulado según la disposición de los sueros.
h.Distribución de PBS en todos los pocillos que corresponde a las muestras.
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
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Continuación del procedimiento de HI
i.Colocación de los sueros en la primera columna de la microplaca.
j. Sueros- muestras en la primera columna de la microplaca.
k.Dilución de 25 µl en toda la microplaca.
l. Distribución del Antígeno en la microplaca.
m.Reposo de las placas 30 min a temperatura ambiente.
n. Distribución de la solución de GR al 0,5%.
ñ. Lectura de controles de GR, Ag y 4 UHA.
o. Lectura de muestras.
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
Fuente: La Autora Fuente: La Autora
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Anexo 8. Hoja de distribución de muestras para la realización de prueba
HI.
Análisis/ Enfermedad: _____________________________________________
Fecha de análisis: ________________________________________________
Caso: __________________________________________________________
LOTE RDE: ____________________ Fecha elaboración: ________________
Glóbulos rojos: _______% Fecha extracción GR: ____________________
Muestras 1/
2
1/
4
1/
8
1/
16
1/
32
1/
64
1/
12
8
1/
25
6
1/
51
2
1/
10
24
1/
20
48
1/
40
96
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1/2 A M D D D D D D D D D D D
1/4 B M D D D D D D D D D D D
1/8 C M D D D D D D D D D D D
1/16 D M D D D D D D D D D D D
1/32 E M D D D D D D D D D D D
1/64 F M D D D D D D D D D D D
1/128 G GR GR GR GR Ag Ag Ag Ag UHA UHA UHA UHA
1/256 H GR GR GR GR Ag Ag Ag Ag UHA UHA UHA UHA
Nota: M: muestra, D: dilución, GR: control de glóbulos rojos, Ag: control de antígenos,
UHA: control de 4 unidades hemoaglutinantes.
Fuente: La Autora.
74
Anexo 9.
