UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · Pérez, 2004). Diferentes...
Transcript of UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · Pérez, 2004). Diferentes...
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
GENOTIPIFICACIÓN DE Brucella spp., DE AISLAMIENTOS OBTENIDOS EN
BOVINOS FAENADOS EN DOS CAMALES DE LA PROVINCIA DE
PICHINCHA.
Trabajo de grado presentado como requisito para obtener el título de Médico
Veterinario y Zootecnista.
AUTOR:
Julian Omar López Balladares
TUTOR:
Prof. Washington Benítez Ortíz, Ph.D.
Quito, Diciembre 2015
ii
DEDICATORIA
Este logro se lo dedico a mi familia, por haberme brindado todo su apoyo
incondicional a lo largo de mi vida personal y mi carrera estudiantil. De manera
muy especial a mi madre por todo el amor y confianza.
Y por supuesto a mi hija Ariana, por ser mi mayor bendición y fortaleza.
Omar López
“All we need is love”, Canserbero.
iii
AGRADECIMINENTO
A Dios, por haberme brindado vida y salud para poder alcanzar esta meta.
Al Dr. Richar Rodríguez Ph.D., Director del Centro Internacional de Zoonosis,
por abrirme sus puertas y permitirme realizar el trabajo de titulación en tan
prestigioso centro.
Un agradecimiento especial a la Lcda. Maritza Celi por brindame la oportunidad
de participar en el proyecto: " Aislamiento y tipificación de brucella spp., en
reservorios animales sacrificados en seis camales de la sierra norte
ecuatoriana".
Sincero reconocimiento a la Ing. Elizabeth Minda A., Responsable del
Laboratorio de Biología Molecular por compartir su amplio conocimiento dentro
y fuera del laboratorio y facilitar el desarrollo de esta tesis.
Un especial reconocimiento a mi tutor: Dr. Washington Benítez Ph.D., quien
con mucha atención supo dirigir el trabajo hasta su culminación.
Finalmente, a todos los amigos, maestros, aquellos que marcaron cada etapa
de mi camino universitario, y que ayudaron de una u otra forma para culminar
con mi formación académica.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
v
INFORME DEL TUTOR
vi
APROBACIÓN DEL TRABAJO/ TRIBUNAL
TÍTULO DEL TRABAJO DE GRADO
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA ---------------------------------------------------------------------------------- ii
AGRADECIMINENTO ------------------------------------------------------------------------ iii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL --------------------------------- iv
INFORME DEL TUTOR ----------------------------------------------------------------------- v
APROBACIÓN DEL TRABAJO/ TRIBUNAL ------------------------------------------- vi
ÍNDICE DE CONTENIDO -------------------------------------------------------------------- vii
LISTA DE CUADROS -------------------------------------------------------------------------- x
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------------------- xi
TABLA DE ABREVIACIONES ------------------------------------------------------------- xii
Abreviatura -------------------------------------------------------------------------------------- xii
Significado -------------------------------------------------------------------------------------- xii
RESUMEN -------------------------------------------------------------------------------------- xiv
ABSTRACT -------------------------------------------------------------------------------------- xv
CAPÍTULO I -------------------------------------------------------------------------------------- 1
INTRODUCCIÓN -------------------------------------------------------------------------------- 1
CAPÍTULO II ------------------------------------------------------------------------------------- 4
REVISIÓN DE LITERATURA ---------------------------------------------------------------- 4
Antecedentes de la investigación ----------------------------------------------------- 4
Generalidades -------------------------------------------------------------------------------- 5
Sinonimias ------------------------------------------------------------------------------------ 6
Etiología ---------------------------------------------------------------------------------------- 6
Evolución y Clasificación taxonómica ----------------------------------------------- 7
Especies y biotipos del género -------------------------------------------------------- 8
Genética de la Bacteria ------------------------------------------------------------------ 10
viii
IS711 o IS6501 ------------------------------------------------------------------------------- 12
Secuencias de inserción (IS) ----------------------------------------------------------- 12
Epidemiología ------------------------------------------------------------------------------- 12
Brucelosis en el mundo ----------------------------------------------------------------- 12
Brucelosis en Latinoamérica ----------------------------------------------------------- 13
Brucelosis en el Ecuador ---------------------------------------------------------------- 13
Transmisión de la enfermedad -------------------------------------------------------- 14
Diagnóstico ---------------------------------------------------------------------------------- 17
Diagnóstico indirecto --------------------------------------------------------------------- 17
Pruebas serológicas ---------------------------------------------------------------------- 17
Diagnóstico Directo ---------------------------------------------------------------------- 17
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ------------------------------------ 18
IS711 PCR ---------------------------------------------------------------------------------- 20
AMOS PCR convencional -------------------------------------------------------------- 21
AMOS PCR modificado ----------------------------------------------------------------- 22
Electroforesis ------------------------------------------------------------------------------- 23
CAPÍTULO III ------------------------------------------------------------------------------------ 24
METODOLOGÍA -------------------------------------------------------------------------------- 24
Ubicación ------------------------------------------------------------------------------------- 24
Población de estudio --------------------------------------------------------------------- 24
Unidades de Muestreo ------------------------------------------------------------------- 24
Extracción de ADN bacteriano -------------------------------------------------------- 25
Pre-tratamiento ---------------------------------------------------------------------------- 25
Procedimiento ------------------------------------------------------------------------------ 25
IS711 PCR ------------------------------------------------------------------------------------ 26
AMOS PCR Convencional --------------------------------------------------------------- 27
AMOS PCR modificada ------------------------------------------------------------------- 28
Visualización de Resultados ----------------------------------------------------------- 29
Procedimiento ------------------------------------------------------------------------------ 29
ix
Análisis de datos --------------------------------------------------------------------------- 30
CAPÍTULO IV ----------------------------------------------------------------------------------- 31
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ------------------------------------------------------------- 31
CAPÍTULO V ------------------------------------------------------------------------------------ 36
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ------------------------------------------- 36
CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------- 36
RECOMENDACIONES -------------------------------------------------------------------- 37
Bibliografía -------------------------------------------------------------------------------------- 38
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------ 49
x
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Sinonimias de la brucelosis ---------------------------------------------------- 6
Cuadro 2. Clasificación taxonómica de Brucella spp. --------------------------------- 7
Cuadro 3. Especies y biotipos del género Brucella. ----------------------------------- 9
Cuadro 4. Brucelosis: Prevalencia en Latinoamérica --------------------------------- 13
Cuadro 5. División epidemiológica de brucelosis bovina en el Ecuador --------- 14
Cuadro 6. Supervivencia de Brucella spp., en el medio ambiente. --------------- 15
Cuadro 7. Flujograma: Infección con B. abortus en ganado bovino adulto ----- 16
Cuadro 8. Rangos de concentración final de los componentes del PCR. ------- 20
Cuadro 9. Secuencia de primers para IS711 PCR ------------------------------------ 21
Cuadro 10. Secuencia de primers para AMOS PCR convencional. -------------- 21
Cuadro 11. Secuencia de primers para AMOS PCR modificada. ----------------- 22
Cuadro 12. Elaboración de Master Mix. -------------------------------------------------- 26
Cuadro 13. Ejemplo del volumen final de la solución para la PCR.--------------- 26
Cuadro 14. Programación del Termociclador, para IS711 PCR. ------------------ 27
Cuadro 15. Elaboración de Master Mix. -------------------------------------------------- 27
Cuadro 16. Ejemplo de volumen final de la solución para la PCR. --------------- 28
Cuadro 17. Programación del Termociclador, para AMOS PCR Convencional.
------------------------------------------------------------------------------------------------------ 28
Cuadro 18. Elaboración de Master Mix. -------------------------------------------------- 28
Cuadro 19. Ejemplo volumen final de la solución para la PCR. ------------------- 29
Cuadro 20. Programación del Termociclador, para AMOS PCR Modificada. -- 29
Cuadro 21. Resultados de la PCR -------------------------------------------------------- 34
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Dendograma: Relación entre Brucella spp., y las bacterias más
importantes del subgrupo alfa-2 de la clase Proteobacteria. ------------------------- 8
Figura 2. Dendograma: Relación evolutiva de las especies del género
Brucella, tanto de cepas terrestres como de cepas marinas. ------------------------ 9
Figura 3. Representación circular de los dos cromosomas de B. suis cepa
1330. ----------------------------------------------------------------------------------------------- 11
Figura 4. Fases de amplificación deL ADN, por PCR. ------------------------------- 19
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa 2% de productos de amplificación de
IS711 PCR. MP: marcador de peso molecular. Líneas 1-9: muestras
analizadas. Líneas 10, 11, 14: controles negativos. Líneas 12, 13, 15: controles
positivos. ------------------------------------------------------------------------------------------ 31
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa 20%. A) AMOS PCR convencional.
B) AMOS PCR modificada. MP: marcador de peso molecular. Líneas 1-9 y 12-
20: muestras analizadas. Líneas 10 y 21: control negativo. Líneas 11 y 22:
control positivo. --------------------------------------------------------------------------------- 33
xii
TABLA DE ABREVIACIONES
Abreviatura Significado
ADN Ácido Desoxirribonucleico.
AFLPs Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados
(Amplified Fragment Length Polymorphism).
AGROCALIDAD Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad
del Agro.
AMOS Abortus, Melitensis, Ovis, Suis.
ARNr Ácido Ribonucleico ribosómico o ribosomal.
CFT Técnica de Fijación de Complemento.
CIZ Centro Internacional de Zoonosis.
DNTPs Desoxinucleótido trifosfato.
ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura
y la Alimentación.
GC Guanina y citosina.
IFI Inmunofluorescencia Indirecta.
IS Inserción.
LPS Lipopolisacárido.
MAG Ministerio de Agricultura y Ganadería.
MRT Anillo coloreado en leche (Milk Ring Test).
OIE Organización Mundial de la Sanidad Animal (World
Organisation for Animal Health).
ORF Marco abierto de lectura (Open Reading Frame).
PAT Técnica de aglutinación en placa (Huddleson).
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa.
PNSA Programa Nacional de Sanidad Animal.
PSO Polisacárido O.
RAPDs Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (Random
xiii
Amplification of Polymorphic DNA).
RB Rosa de Bengala.
RFLPs Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
(Restriction Fragment Length Polymorphism).
SAT-EDTA Sero-aglutinación lenta en tubo en presencia de EDTA.
TAT-2ME Técnica de aglutinación de 2- mercaptoetano.
UCE Universidad Central del Ecuador.
VNTRs Numero variable de repeticiones en tándem (Variable
Number of Tandem Repeats).
WHO Organización Mundial de la salud (OMS), (World Health
Organization).
xiv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
GENOTIPIFICACIÓN DE Brucella spp., DE AISLAMIENTOS OBTENIDOS EN BOVINOS FAENADOS EN DOS CAMALES DE LA PROVINCIA DE PICHINCHA.
Autor: Julian Omar López Balladares Tutor: Prof. Washington Benítez Ph. D.
Asesora Científica: Ing. Elizabeth Minda A. Fecha: Noviembre, 2015
RESUMEN
La brucelosis es una zoonosis de origen animal que, por sus características epidemiológicas y evolutivas, genera un importante impacto social y económico; ocasiona enormes pérdidas a la industria pecuaria y representa un verdadero problema para la salud pública. El objetivo de este estudio fue realizar la genotipificación de bacterias de género Brucella mediante técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), para lo cual se contó con un total de nueve aislamientos bacterianos, obtenidos de bovinos sacrificados en los camales de los cantones Mejía y Cayambe, pertenecientes a la provincia de Pichincha, y que, al ser sometidas a las técnicas moleculares: IS711 PCR, AMOS PCR Convencional y AMOS PCR Modificada, se determinó que las nueve muestras correspondían a Brucella abortus cepas de campo; de los cuales, ocho aislamientos corresponden a animales procedentes del cantón Mejía provincia de Pichincha y un aislamiento corresponde a un animal procedente del cantón El Carmen, provincia de Manabí.
Palabras claves: Brucella abortus, bovino, Pichincha, IS711 PCR, AMOS PCR Convencional, AMOS PCR Modificada.
xv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
SCHOOL OF VETERINARY MEDICINE AND ZOOTECHNICS
VETERINARY MEDICINE AND ZOOTECHNICS
GENOTYPING OF Brucella spp., FROM ISOLATIONS OBTAINED FROM
SLAUGHTERED BOVINES IN SLAUGHTERHOUSES, PICHINCHA
PROVINCE
Author: Julian Omar López Balladares
Tutor: Prof. Washington Benítez Ph. D.
Scientific Advice: Ing. Elizabeth Minda A.
Date: November, 2015
ABSTRACT
Brucellosis is an animal-borne zoonosis that, in accordance to epidemiologic and evolutionary characteristics, generates relevant social and economic impact. Large losses are caused to the livestock industry and are a true trouble for public health. The purpose of the current study was making a genotyping of bacteria Brucella gender, by using PCR technique (Polymerase Chain Reaction), for which a total of nine bacterial isolations were provided, obtained from bovines slaughtered in slaughterhouses of Mejía and Cayambe canton, Pichincha province, and that when submitted to molecular techniques: IS711 PCR, AMOS PCR conventional and AMOS PCR modified, it was determined that the nine samples were field strains of Brucella abortus; out of which, eight isolations correspond to an animal from El Carmen canton, Manabí province.
Keywords: Brucella abortus, bovine, Pichincha, IS711 PCR, Convectional
AMOS PCR, modified AMOS PCR.
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
La Brucelosis es una zoonosis que presenta una elevada tendencia a producir
infecciones crónicas, tanto en el hombre como en los animales (Orduña et al.,
2001). La diversidad de animales hospederos de la bacteria, complica en gran
medida las acciones de lucha contra esta infección (Castro et al., 2005).
La enfermedad es endémica en la mayoría de los países del mundo, excepto
en aquellos que han implementado programas de erradicación exitosos como
Canadá, Inglaterra y países del Norte de Europa (Lopetegui, 2005). En
Latinoamérica, se encuentra distribuida ampliamente en todo el continente,
presentando prevalencias altas como es el caso de México y Perú con valores
mayores al 10% y otros, como Uruguay con prevalencias menores al 1%,
debido a la implementación de programas de vigilancia epidemiológica (Gil &
Samartino, 2001).
En Ecuador, se estima que las pérdidas económicas directas e indirectas, para
el año 2000 fueron de 5 millones de dólares anuales y una prevalencia del 6%
según el estudio realizado por el antiguo PNSA (Programa Nacional de
Sanidad Animal) del MAG (Ministerio de Agricultura y Ganadería) en el año
1978-1979 (AGROCALIDAD, 2009); sin embargo, estos valores podrían ser
subestimados debido a la falta de datos de la enfermedad, ya que en el país se
practica una vigilancia pasiva (Ron et al., 2014). En la actualidad se estima que
la prevalencia promedio es de 2,37% a nivel de animales y 9,2% a nivel de
predios, lo que significaría que uno de cada diez predios tiene anticuerpos
circulantes contra Brucella spp., y las pérdidas económicas estimadas serían
de 20’000.000 de dólares (Com. pers., Benítez Ortíz, 2014).
Con el afán de conseguir una identificación rápida, segura y confiable de los
agentes patógenos causales de enfermedades infecciosas, la Microbiología
Clásica encontró, en la Biología Molecular, una gran herramienta para obtener
mayor eficacia del diagnóstico, sin desplazar los métodos tradicionales, más
2
bien como un siguiente paso hacia la confirmación de los resultados (Méndez &
Pérez, 2004).
Diferentes investigaciones y análisis moleculares, con los cuales se ha
estudiado a Brucella spp., sirven para conocer la genética de la especie y sus
biovariedades, además profundizan en el análisis de varios marcadores
moleculares para diagnóstico y tipificación.
Taxonomistas clásicos del género bacteriano desarrollaron un sistema de
clasificación que reconoce seis especies basadas en fenotipo (análisis
microbiológico), diferencias antigénicas y especificidad de los hospederos
(Whatmore et al., 2006). Este sistema taxonómico se mantiene desde 1963,
cuando el Subcomité de Taxonomía de Brucella de la Comisión Internacional
de Nomenclatura Bacteriológica, oficializó en su informe dicha clasificación
(FAO/OMS, 1986); sin embargo, con la aparición de herramientas
biotecnológicas como la hibridación ADN-ADN o análisis de la secuencia del
ARNr 16S, se propuso que el género Brucella es mono-específico, de ahí que
se considera a Brucella melitensis, por lo completo de su secuencia genómica,
como el nombre de la especie, con múltiples biovariedades; por ejemplo:
Brucella melitensis biovar abortus o Brucella melitensis biovar canis (Rodicio &
Mendoza, 2004; Michaux et al., 1997). Este planteamiento ha producido gran
controversia acerca de la taxonomía interna del género (Scholz et al., 2010);
sin embargo, otros estudios basados en la revisión de la estructura bacteriana y
el análisis de la diversidad genética demostraron que no existe suficiente
sustento científico para la aplicación del concepto genómico de especies, al
género Brucella, sino el mantener el concepto biológico amplio de la especie
(Moreno et al., 2002). Es así que, tomando en cuenta el rango de hospederos
como criterio biológico, ya reconocido, y la presencia de los marcadores
específicos de la especie, en genes externos de la proteína de membrana y en
otros genes, se demuestran que B. melitensis, B. abortus, B. ovis, B. canis y B.
neotomae no son solo patovares sino especies biológicamente significativas
(Moreno et al., 2002).
La biotipificación es la identificación de biotipos (conjunto de fenotipos que
corresponden al mismo genotipo) de una misma especie, la importancia de su
3
estudio radica en que permite determinar las fuentes de infección, indicando la
necesidad de clasificar los biotipos en los aislamientos múltiples antes de
establecer definitivamente el biotipo de cepa infectante, además de convertirse
en una valiosa herramienta epizootiológica (Jones et al., 1982). Desde el punto
de vista epidemiológico, la brucelosis se presenta como una zoonosis de
extraordinaria complejidad, debido a la variedad de especies y biotipos del
género, además de la aparición de variantes genéticas y a las características
epidemiológicas que presenta cada una de ellas. Según la FAO/OMS (1986),
siempre que sea posible, debe llevarse la identificación hasta la categoría de
biotipo, pues los biotipos a menudo tienen una distribución geográfica particular
y pueden proporcionar información epidemiológica importante.
Tomando en cuenta las consideraciones anteriores, los objetivos que se
plantearon para la realización de este trabajo de tesis, permitieron la
Genotipificación de Brucella spp., de aislamientos obtenidos de bovinos de dos
camales de la Provincia de Pichincha. Para alcanzar estos objetivos se
utilizaron técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), dentro de
las que tenemos: IS711 PCR, para determinar género bacteriano; AMOS PCR
convencional, para discriminar entre B. abortus biovar 1, 2 y 4, B. melitensis
biovar 1, 2 y 3, B. ovis y B. suis biovar 1 (Bricker & Halling, 1994) y AMOS
PCR modificada (Ewalt & Bricker, 2000; Bricker et al., 2003), para diferenciar
dentro de B. abortus la presencia de cepas vacunales (S19 y RB51) o de
campo (Bricker & Halling, 1995). Los métodos mencionados anteriormente,
utilizan como ADN target la secuencia de inserción (IS) llamada IS711, la
misma que es única en el género bacteriano y cuyo número de copias depende
de cada especie (Michaux et al., 1993). El desarrollo y validación de
marcadores altamente polimórficos aumentan la sensibilidad y poder de
resolución debido a la alta homología genética entre bacterias del género
(Mahillon & Chandler, 1998).
Esta investigación forma parte del proyecto: “Aislamiento y Tipificación de
Brucella spp., en reservorios animales sacrificados en seis camales de la sierra
norte ecuatoriana”, realizado en el Centro Internacional de Zoonosis (CIZ-
UCE); la información generada permitió obtener datos actualizados de las
especies de Brucella presentes en la región.
4
CAPÍTULO II
REVISIÓN DE LITERATURA
Antecedentes de la investigación
Para el diagnóstico e identificación de Brucella spp., la utilización de
herramientas biotecnológicas, con mayor especificidad, rapidez y confianza, es
la tendencia, en comparación con métodos tradicionales como
inmunodiagnóstico o biotipificación; considerando además que dichas
herramientas se las utiliza como métodos de confirmación.
En Ecuador se han realizado varios trabajos, utilizando técnicas de serología
como, Rosa de Bengala (RB) (Ron et al., 2003; Celi & Vizvaíno, 2004;
Sanchez, 2012), Sero-aglutinación lenta en tubo en presencia de EDTA (SAT-
EDTA) (Ron et al., 2003; Díaz & Lamiña, 2013), Anillo Coloreado en Leche
(MRT) (Neppas, 2013), ELISA competitivo (Ensayo por inmuno-absorción
ligado a enzimas), realizado por AGROCALIDAD (2009), entre otros; sin
embargo la aplicación de técnicas de aislamiento y tipificación de cepas no son
muy comunes (Ron et al., 2010; Carlosama, 2013). En cuanto a trabajos de
genotipificación empleando técnicas de biología molecular se refiere, los
estudios son escasos (Rodríguez-Hidalgo et al., 2015); razón por la cual la
utilización de estas herramientas biotecnológicas son fundamentales.
Varios son los estudios relevantes a nivel internacional, para el análisis
molecular de Brucella spp., mismos que fueron la base de los métodos
empleados en este estudio:
Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis,
Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR (Bricker & Halling, 1994).
Enhancement of the Brucella AMOS PCR Assay for Differentiation of
Brucella abortus Vaccine Strains S19 and RB51 (Bricker & Halling,
1995).
5
Validation of the Abbreviated Brucella AMOS PCR as a Rapid Screening
Method for Differentiation of Brucella abortus Field Strain Isolates and
the Vaccine Strains, 19 and RB51 (Ewalt & Bricker, 2000).
Evaluation of the Brucella abortus species-specific polymerase chain
reaction assay, an improved version of the Brucella AMOS polymerase
chain reaction assay for catlle (Bricker et al., 2003).
Generalidades
Bruce, en 1887, señaló que la Fiebre de Malta del hombre la producía una
pequeña bacteria, a la cual llamó Micrococcus melitensis (López et al., 2008).
Bang y Stribolt, en 1896, lograron comprobar que el aborto infeccioso en las
vacas, lo causaba una bacteria que denominaron Bacillus infectiosi (Sbriglio et
al., 2007). Zammit, en 1905, informa que las cabras transmiten la enfermedad
al hombre y surge el concepto de zoonosis a partir del consumo de la leche
infectada (Laval, 2006). Evans, en 1918, comprueba el íntimo parentesco entre
el Micrococcus melitensis y el Bacillus abortus, estos resultados junto con los
de Meyer y Shaw en 1920 permitieron agrupar a estos microorganismos en un
solo género bacteriano: Brucella spp. (Benítez, 1979; citado por Rodríguez et
al., 2005).
La brucelosis es una zoonosis de origen animal, producida por bacterias del
género Brucella, la cual tiene una elevada virulencia y cuenta con una
distribución cosmopolita, además de representar un problema en la Salud
Pública, al ser una enfermedad de carácter ocupacional en aquellas personas
que trabajan con derivados pecuarios o por consumo de productos lácteos y/o
sus derivados no pasteurizados (John et al., 2010; Saegerman et al., 2010).
Sus características evolutivas y epidemiológicas, hacen que esta enfermedad
tenga un impacto social importante ya que representa cuantiosas pérdidas
económicas en la industria pecuaria en diferentes países (Sbriglio et al., 2007).
Esta enfermadad está relacionada con especies domésticas o semi-domésticas
que son ampliamente utilizadas para la carne, leche, pelo, lana, cueros,
fertilizantes, combustible, para llevar cargas o para el cultivo de la tierra (López-
Goñi & Moriyón, 2005).
6
Sinonimias
Existen varios nombres atribuidos a la enfermedad que dependen,
principalmente, de si la misma se presente en animales o humanos, así por
ejemplo:
Cuadro 1. Sinonimias de la brucelosis
HOSPEDADOR NOMBRES DE LA ENFERMEDAD
Humano Fiebre ondulante
Fiebre de Malta
Fiebre Mediterránea
Animal Aborto epizoótico,
Aborto contagioso,
Enfermedad de Bang
Fuente: (The Center for Food Security & Public Health, 2009)
Etiología
El agente causal de esta infección son bacterias del Género Brucella;
cocobacilos o bacilos, Gram negativos, que al ser observados por el
microscopio aparecen solos o en grupos. Su tamaño está entre 0.5-0.7µm de
diámetro x 0.6-1.5µm de largo, pueden llegar a ser pleomórficos (variable en
forma), no capsulados, no son capaces de formar esporas, poseen crecimiento
lento, son oxidasa y catalasa positivas, generalmente no fermentan los
carbohidratos (Fernández & Gómez, 2009). Son bacterias aerobias
intracelulares facultativas y algunas especies requieren CO2 adicional (5-10%)
para su crecimiento (Aréstegui et al., 2001).
La membrana externa de Brucella spp., es rica en fosfatidilcolina, a diferencia
de la perteneciente a las enterobacterias relacionadas con ella, la cual es rica
en fosfatidiletanolamina. Su componente más abundante es el
(lipopolisacárido) LPS, que se conoce también con el nombre de endotoxina;
en el que se distinguen tres regiones: el lípido A, inserto en la hoja externa de
la membrana, un oligosacárido intermedio, llamado núcleo, y el polisacárido O
(PSO), también conocido como cadena O (Castro et al., 2005). Según
7
Aréstegui y colaboradores (2001), otra característica importante del LPS, es
que en su extremo terminal, presenta moléculas de manosa que favorecen la
adherencia a las células del huésped a través de sus receptores.
Evolución y Clasificación taxonómica
El estudio de la secuencia del gen 16S rRNA, la composición lipídica y algunos
aspectos fisiológicos y biológicos ubican al género Brucella en la subdivisión
alfa-2 de la clase proteobacteria (Paulsen et al., 2002).
Cuadro 2. Clasificación taxonómica de Brucella spp.
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Proteobacteria alfa
Orden: Rhizobiales
Familia: Brucellaceae
Género: Brucella
Fuente: (Ficht, 2010; Koneman et al., 2005)
Los miembros de la clase Proteobacteria alfa incluyen las familias de
organismos considerados patógenos o simbiontes, ya sea de mamíferos o de
plantas (Jumas-Bilak et al., 1998; Boussau et al., 2004; López et al., 2008).
Varios estudios que utilizan análisis filogenéticos ponen en evidencia la
relación genética de Brucella spp., con plantas simbiontes y patógenos de
plantas como es el caso de Bartonella spp., una estrecha relación con
microorganismos de suelo tales como Ochrobactrum spp., con el cual
comparten hasta un 98% de similitud en el gen 16S RNA, e incluso se observa
vínculos genéticos con fitopatógenos como Agrobacterium spp., y simbiontes
de plantas como Rhizobium spp. (Scholz et al., 2012; Velasco et al., 1998;
Paulsen et al., 2002).
La particularidad de Brucella spp., de ser una bacteria intracelular estricta ha
sido muy estudiada, por ejemplo en condiciones biológicas naturales, las
bacterias del género son patógenos que no se multiplican en ambientes
abiertos y cuyo ciclo característico es de huésped a huésped (Meyer, 1990).
Por lo tanto, parece ser que la asociación intracelular con eucariotas es una
8
tendencia evolutiva, que comparte Brucella spp., con otros miembros de la
subdivisión alfa-2 (Jumas-Bilak et al., 1998 Moriyón et al., 2001).
Fuente: (Moriyón et al., 2001)
Figura 1. Dendograma: Relación entre Brucella spp., y las bacterias más
importantes del subgrupo alfa-2 de la clase Proteobacteria.
Especies y biotipos del género
La taxonomía clásica propuso un sistema de clasificación para el género
Brucella, con seis especies y sus diferentes biotipos (Allardet et al., 1988;
Whatmore et al., 2006), donde encontramos a B. abortus con sus siete
biovares, B. melitensis con tres biovares, B. suis con cinco biovares, B. canis,
B. ovis y B. neotomae (Corbel & Brinley, 1982). En la actualidad la cantidad de
especies ha aumentado, pero el número de cepas virulentas se ha mantenido
(Sbriglio et al., 2007). Es así que hoy en día el género Brucella está compuesto
por once especies, en el que se incluye: B. pinnipediae y B. ceti (Foster et al.,
2007), B. microti (Scholz et al., 2008), B. inopinata (scholz et al., 2010) y por
último B. papionis (Whatmore et al., 2014). De esta manera queda demostrado
que el género bacteriano cuenta con una gran variedad de especies, presentes
en mamíferos tanto marinos como terrestres; con lo cual, Bourg y
colaboradores (2007) al analizar la filogenia de las cepas marinas junto con las
terrestres, sugieren que la divergencia de los diferentes especies del género
Brucella, pudo haber tenido lugar hace 60 millones de años, concomitante con
9
la radiación de sus huéspedes mamíferos (Artiodactyla) de otros órdenes de
mamíferos .
Fuente: (Bourg et al., 2007)
Figura 2. Dendograma: Relación evolutiva de las especies del género
Brucella, tanto de cepas terrestres como de cepas marinas.
Cuadro 3. Especies y biotipos del género Brucella.
Especies Biotipos Huésped natural Primera Descripción
B. melitensis 1 – 3 Cabra, oveja, bovinos,
cánidos, hombre Meyer & Shaw, 1920
B. abortus 1 - 6, 9 Bovinos, cánidos,
hombre Meyer & Shaw, 1920
B. suis 1 – 5 Cerdo, cánidos, hombre Huddleson, 1929
B. ovis Ninguno Ovinos Buddle, 1956
B. neotomae Ninguno Rata del desierto Stoenner & Lackman,
1957
B. canis Ninguno Cánidos, hombre Carmichael & Bruner,
1968
B. pinnipediae Ninguno Focas, lobos marinos Cloeckaert et al., 2001;
Foster et al., 2007
B. ceti Ninguno Delfines, ballenas Cloeckaert et al., 2001;
Foster et al., 2007
10
B. microti Ninguno Zorros Hubalek et al., 2007;
Scholz et al., 2008
B. inopinata Ninguno Humanos De et al., 2008; Scholz
et al., 2010
B. papions Ninguno Babuinos
Schlabritz-Loutsevitch
et al., 2009; Whatmore
et al., 2014
Fuente: (Whatmore et al., 2014; Castro et al., 2005; Scholz et al., 2012)
Genética de la Bacteria
El material genético de estos microorganismos está contenido en dos
cromosomas, pero cabe destacar que son carentes de plásmidos, lo cual refleja
probablemente la adaptación a un nicho ecológico (el ambiente intracelular)
estable y sin competencia microbiana, en donde no es necesaria la plasticidad
genética que se deriva de los plásmidos y que es propia de ambientes con gran
cantidad de microorganismos (intestino, tierra, entre otros), (Moreno, 1998;
Rivers et al., 2006). En el 2002, dos genomas de Brucella fueron secuenciados
y analizados, B. melitensis 16M y B. suis 1330 (Sobral & Wattam, 2012)
demostrando que el genoma de estas bacterias consiste en dos cromosomas
circulares de aproximadamente 2.05 y 1.15 Mb, con un contenido de 58-59%
de GC (guanina y citosina); 3197 ORFs (Open Reading Frame) fueron
identificados, además de varios genes, operones, rutas metabólicas de
secreción adhesión y características de la pared celular (Michaux et al., 1997;
DelVecchio et al., 2002; Pappas et al., 2005; Sobral & Wattam, 2012). En
contraste, B. suis biovar 2 y 4 tienen dos replicones de 1.35 Mb y 1.85 Mb y B.
suis biovar 3 presenta un solo cromosoma de 3.1 Mb (Pappas et al., 2005;
Mantur & Amarnath, 2008).
11
Fuente: (Paulsen et al., 2002)
Figura 3. Representación circular de los dos cromosomas de B. suis cepa
1330.
El género Brucella, es altamente homogéneo entre si (95%), pero estudios que
analizan determindas secuencias de ADN, seguido de análisis de restricción
han dado evidencia de la existencia de polimorfismo en ciertos genes, como:
omp2, dnaK, htr y ery (Aréstegui et al., 2001). Por ejemplo: el gen omp2, es
considerado taxonomicamente importante porque determina sensibilidad a las
tinciones (crecimiento en medios coloreados), uno de los métodos utilizados
para tipficación de los diferentes biovares de Brucella spp. (Cloeckaert et al.,
2001). El gen dnaK de B. melitensis, es responsable de la síntesis del chaperón
Dna K, y cuando es cortado con enzimas de restricción el resultado es la
aparición de dos fragmentos, mientras que la restricción en otras especies del
género produce un fragmento simple (Cloeckaert et al., 1996). Por otra parte el
gen ery, común en la mayoría de cepas del género, se encuentra ausente en B.
abortus biovar 1 cepa 19 (cepa vacunal), lo cual es importante en el momento
de la genotipificación para diferenciar Brucela abortus, entre cepas de campo y
cepas vacunales (Sangari et al., 1994).
12
IS711 o IS6501
Secuencias de inserción (IS): Los elementos de inserción (IS) son segmentos
de DNA que pueden moverse de una posición cromosómica a otra dentro del
mismo cromosoma o a uno diferente (Stanier et al., 1996; Mahillon & Chandler,
1998); las secuencias de inserciones son responsables de un número de
reordenamientos genéticos, incluyendo la inactivación de genes por
mutagénesis insercional, supresión de la expresión génica o la activación de
genes, entre otras (Mahillon & Chandler, 1998).
Un estudio realizado en el año 1993 por Ouahrani y colaboradores, demostró la
identificación, clonación y caracterización de una IS de B. ovis, denominada
IS6501, conocida también como IS711, donde además se probó que esta IS se
encuentra presente únicamente en las especies del género Brucella (Halling et
al., 1993; Ouahrani et al., 1993). Cuando se utiliza RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism) basado en la secuencia IS6501, ésta es capaz de
distinguir entre especies de Brucella spp., donde el número de copias de la IS
varía ampliamente de una cepa a otra dentro de la misma especie (Ouahrani et
al., 1993). Así por ejemplo, el número de copias de la IS711, en el genoma de
Brucella spp., va desde siete en B. abortus, B. melitensis y B. suis a más de
30 en B. ovis y en las cepas de Brucella aisladas de los mamíferos marinos
(Ocampo-Sosa & García-Lobo, 2008).
La presencia de IS711 podría conferir una posible ventaja selectiva al
organismo; tales como, alterar la patogenicidad o modificando la especificidad
(Halling et al., 1993; Ouahrani et al., 1993).
Epidemiología
Brucelosis en el mundo
La brucelosis es considerada como una de las enfermedades zoonósicas de
mayor distribución en el mundo, causante de cuantiosas pérdidas económicas
y un verdadero problema de salud pública; por cuanto, los gobiernos de
muchos países, han optado por la implementación de un programa de
vigilancia epidemiológica, este es el caso de Inglaterra, el norte de Europa,
13
Japón, Canadá, Nueva Zelanda (Lopetegui, 2005; APHIS, 2012); donde el
programa funcionó y se logró erradicar la enfermedad.
Brucelosis en Latinoamérica
En Latinoamérica la brucelosis representa un verdadero problema, al estar
distribuida en todo el continente y presentar prevalencias alarmantes como es
el caso de Venezuela y Argentina, donde sobrepasa el 10%, por otro lado
algunos países han implementado programas de control de la enfermedad con
lo cual presentan mínimos valores de prevalencias, por ejemplo Uruguay con
0.04% (Gil & Samartino, 2001; APHIS, 2012).
Cuadro 4. Brucelosis: Prevalencia en Latinoamérica
PAIS PREVALENCIA %
ESTADOS UNIDOS 0,0001
URUGUAY 0,04
BRAZIL 0,06
CHILE 0,2
BOLIVIA 2,27
PARAGUAY 3,15
VENEZUELA 10,5
ARGENTINA 10-13
Fuente: (APHIS, 2012; Aznar et al., 2012)
Brucelosis en el Ecuador
El único estudio a nivel nacional, realizado por el organismo oficial (PNSA-
MAG) en el año de 1979, y reportado por AGROCALIDAD en el año 2009,
realiza la siguiente división epidemiológica.
14
Cuadro 5. División epidemiológica de brucelosis bovina en el Ecuador
REGIÓN PROVINCIAS PREVALENCIA %
1 (Alta prevalencia) Carchi, Imbabura, Pichincha,
Cotopaxi, Tungurahua y
Chimborazo
1.97-10.62
2 (Alta prevalencia) Esmeraldas, Manabí, Santa
Elena, Guayas, Los Ríos, El
Oro y Santo Domingo de los
Tsáchilas
4.2-10.62
3 (Baja prevalencia) Bolívar, Cañar, Azuay y Loja 1.3-2.6
4 (Baja prevalencia) Provincias amazónicas Sin datos 1-2
5 (Indemne) Islas Galápagos Indemne
Fuente: (AGROCALIDAD, 2009)
Transmisión de la enfermedad
En humanos presenta dos patrones epidemiológicos:
Patrón urbano-alimentario, por consumo de leche y quesos no
pasteurizados.
Patrón rural-laboral, por exposición profesional al ganado infectado o sus
productos, sea por contacto directo o aerosoles.
La bacteria puede incluso entrar por vía respiratoria (aerosoles), en el momento
de la manipulación de animales contaminados en la granja o al limpiar establos
o zonas de ordeño (WHO et al., 2006). En países desarrollados es una
enfermedad típicamente ocupacional donde las personas más expuestas son
veterinarios, peones de campo y trabajadores de la industria de la carne
(Dirección General de Epidemiología, 2012).
Brucella spp., tiene además afinidad por los tejidos de los órganos
reproductivos, en consecuencia los mamíferos sexualmente maduros o en
15
estado de preñez son más susceptibles a la infección (WHO et al., 2006). Los
animales infectados eliminan las bacterias después de un aborto o de un parto;
así como, a través de la leche, secreciones vaginales, semen, sangre, orina y
heces (Cuadro 6), contaminando así pastos, agua y el medio ambiente y;
sobreviviendo en dichos lugares durante variado tiempo (Quinn et al., 2002).
De esta forma se completa el ciclo infeccioso (Cuadro 7), asegurando la
contaminación de otros animales y la persistencia del microorganismo en la
naturaleza (Castro et al., 2005). Cabe mencionar que la brucelosis humana
únicamente puede admitirse en función de la existencia de la enfermedad en
los animales, ya que el contagio interhumano existe pero es excepcional
(Crespo-León, 1994)
Cuadro 6. Supervivencia de Brucella spp., en el medio ambiente.
MATERIAL TIEMPO DE
SUPERVIVENCIA
Suelo y estiércol 80 días
Polvo 15-40 días
Leche a temperatura ambiente 2-4 días
Fluidos y secreciones en verano 10-30 minutos
Fetos mantenidos a la sombra 6-8 meses
Paja 29 días
Grasa de ordeño 9 días
Heces bovinas naturales 1-100 días
Fuente: (Castro et al., 2005)
16
Cuadro 7. Flujograma: Infección con B. abortus en ganado bovino adulto
Fuente: (Quinn et al., 2002)
B. abortus
Por ingestión en animales adultos
Animal infectado
Localización en tejido linfoide
Bacterias transportadas por macrófagos al torrente sanguíneo
Animal preñado
Animal no preñado Hembra
Útero
Partos Posteriores
B. abortus presente en
feto, placenta, líquidos
fetales y descargas
uterinas
Placenta
Preñez
inicial
Aborto
Expulsión de B.
abortus en el parto
Orquitis, Epididimitis
Órganos reproductores
Macho
B. abortus permanece
en bazo, ganglios
supramamario y otros
tejidos linfoideos
Expulsa B.
abortus de forma
intermitente en la
leche
Glándula
mamaria
Infertilidad
B. abortus
presente en el
semen
17
Diagnóstico
Diagnóstico indirecto
Algunas de las pruebas de laboratorio para diagnóstico de brucelosis son las
que se enlistan a continuación:
Pruebas serológicas
Rosa de Bengala (RB)
Aglutinación lenta en tubo de Wright (SAT)
Milk Ring Test o Anillo Coloreado en Leche (MRT)
Técnica de aglutinación en placa (Huddleson) (PAT)
Técnica de aglutinación de 2- mercaptoetanol (TAT-2ME)
Precipitación con Rivanol
Prueba de Coombs
Inmunodifusión en agar
ELISA: directo, indirecto y competitivo
Fijación de Complemento (CFT)
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)
Diagnóstico Directo
Sin duda, a través del tiempo, el cultivo microbiológico, ha sido la principal
herramienta a la hora de diagnosticar e identificar Brucella spp. Se basa en
evidenciar la presencia de la bacteria en los tejidos de los animales o del
hombre (OIE, 2008).
Los cultivos deben mantenerse en incubación un tiempo, no menor a 30 días,
debido a que las bacterias del género son de crecimiento lento. La muestra a
utilizar para el aislamiento bacteriano, puede ser: sangre (hemocultivo),
ganglios linfáticos, hígado, bazo o leche. (Blasco et al., 2001).
Con el tiempo y la aparición de nuevas tecnologías, este procedimiento ha sido
complementado con la aplicación de técnicas de Biología Molecular, que
presentan una sensibilidad y especificidad más alta, haciendo el diagnóstico e
identificación mucho más confiable y determinando con mayor facilidad y
rapidez los biovares de las especies correspondientes al género.
18
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Uno de los descubrimientos más importantes de la historia que marcó el inicio
de una nueva era en el estudio y conocimiento de los ácidos nucleicos fue el de
Watson y Crick, al descifrar la estructura del ADN (ácido desoxirribonucleico)
(Mullis, 1990; Somma & Querci, 2012). Desde entonces, varios grupos han
mostrado un gran interés por desarrollar métodos sensibles y reproducibles que
les permitan estandarizar protocolos experimentales para estudiar los ácidos
nucleicos; probablemente la más importante sea la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), desarrollada por Kary Mullis (Saiki
et al., 1985; Tamay de Dios et al., 2013).
La PCR es una reacción enzimática in vitro que amplifica, de manera
exponencial, una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos,
en los que la secuencia blanco es copiada fielmente (Tamay de Dios et al.,
2013), aprovechando los mecanismos de replicación natural del ADN. Para
ello, la reacción aprovecha la actividad de la polimerasa, una enzima
termoestable, que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que sobrevive a
temperaturas de entre 79oC a 85oC, de ahí su nombre comercial de: Taq
polimerasa (Mullis, 1990).
Esta técnica contiene tres etapas repetitivas (Somma & Querci, 2012):
Desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada (rango
entre 94°C a 96°C), a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN
monocatenario.
Hibridación, unión (anillamiento) de los oligonucleótidos (primers),
utilizados como cebadores, al ADN diana, cuya temperatura oscila entre
45°C a 65°C.
Extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos (dNTP’s) a
partir de los cebadores utilizando la ADN polimerasa como catalizador,
en presencia de iones Mg2+. La temperatura a la que se realiza es de
72°C.
19
Fuente: (Somma & Querci, 2012)
Figura 4. Fases de amplificación del ADN, por PCR.
El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores determinantes en
los resultados de la PCR, por lo que modificarlos optimizará la reacción. Otra
de los factores que se debe considerar al momento de ensamblar una reacción
de PCR es la concentración inicial y final de los componentes de la PCR, cuya
variación permite la estandarización de la misma (Cuadro 8). Pese al alto grado
de homología del ADN dentro del género Brucella, se han desarrollado varios
métodos que permiten, la diferenciación entre especies y sus biovariedades,
como por ejemplo análisis de polimorfismos de fragmentos de restricción
(RFLP) (Salehi et al., 2006), la hibridación tipo Southern, entre otras. Se ha
desarrollado también una electroforesis en campo pulsante que permite la
diferenciación entre varias especies de Brucella (OIE, 2008).
20
Cuadro 8. Rangos de concentración final de los componentes del PCR.
Reactivo Concentración
Inicial
Concentración
Final
Buffer TBE 10 X 1 X
dNTP’s 10 mM 50 - 200 µM
MgCl2 50 mM 2 - 4 mM
Primers ------ 0.2 - 1 µM
DNA Polimerase 5 U/µL 2 U/100 µL
Fuente: (Surzycki, 2002)
A nivel de Biología Molecular se manejan dos aspectos: el Diagnóstico
Molecular, el cual va a permitir reconocer la presencia del agente causal; y la
Tipificación Molecular o Genotipificación, misma que identifica al
microorganismo a nivel de especie y como en el caso de Brucella spp., hasta la
biovariedad.
Varias son la técnicas moleculares empleadas para la genotipificación, en el
caso de brucelosis, se han realizado análisis de RAPD’s (Random Amplification
of Polymorphic DNA) (Tcherneva et al., 2000), AFLP’s (Amplified Fragment
Length Polymorphism) (Fekete et al., 1992), RFLP’s (Restriction Fragment
Length Polymorphism) (Salehi et al., 2006), VNTRs (Variable Number of
Tandem Repeats) (Bricker et al., 2003), entre otros, con el objetivo no solo de
determinar la genética del género, sino además de diferenciar las especies
terrestres de las marinas (Ocampo-Sosa & García-Lobo, 2008).
IS711 PCR
Para la tipificación molecular de Brucella spp, la secuencia diana o target que
se maneja, para todas las metodologías, es el elemento multi-copy IS711, que
al ser única en el género permite discriminar de las demás alfa Proteobacterias.
Es decir, este método es una PCR simple y permite determinar el género
bacteriano (Grégoire et al., 2012; Clavareau et al., 1998) para ello se utiliza el
par de primers que se detallan a continuación:
21
Cuadro 9. Secuencia de primers para IS711 PCR
Primer (nombre) 5’-3’ Secuencia
IS6501 3' GAT AGA AGG CTT GAA GCT TGC GGA C
IS6501 5' ACG CCG GTG TAT GGG AAA GGC TTT T
Fuente: (Clavareau et al., 1998)
AMOS PCR convencional
Varios ensayos se han realizado con el objetivo de identificar especie y
biovariedad de Brucella spp., es así que, a la fecha, la prueba de PCR múltiple
específica más difundida para la identificación de Brucella spp., fue descrita por
Bricker & Halling en 1994, y la denominaron AMOS PCR, ya que se deriva de
las cuatro iniciales de las especies de Brucella capaz de identificar: B. abortus,
B. melitensis, B. ovis y B. suis (Ewalt & Bricker, 2000). Al tratarse de una PCR
multiplex, estamos hablando de reacciones que consiguen amplificar
simultáneamente y en un único tubo diferentes secuencias diana, permitiendo
la detección e identificación simultánea de distintos genes de interés (Méndez
& Pérez, 2004). El fundamento se basa en la identificación del polimorfismo
resultante de la localización específica de especie, de la secuencia de inserción
IS711, en el cromosoma de Brucella spp., para lo cual, incluye cinco primers,
donde uno hibridiza en una diana única y los cuatro restantes son específicos
de cada especie, obteniendo fragmentos de diferente tamaño según la especie
bacteriana: B. abortus biovar 1, 2 y 4: 498-bp, B. melitensis biovar 1, 2 y 3: 731-
bp, B. ovis: 976-bp y B. suis biovar 1: 285-bp (Bricker & Halling, 1995).
Cuadro 10. Secuencia de primers para AMOS PCR convencional.
Primer Secuencia (5’ – 3’)
B. abortus-specific primer GAC GAA CGG AAT TTT TCC AAT CCC
B. melitensis-specific primer AAA TCG CGT CCT TGC TGG TCT GA
B. ovis-specific primer CGG GTT CTG GCA CCA TCG TCG
B. suis-specific primer GCG CGG TTT TCT GAA GGT TCA GG
22
IS711-specific primer TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT
Fuente: (Bricker & Halling, 1994)
AMOS PCR modificado
Si bien la AMOS PCR convencional permite identificar y diferenciar especie de
Brucella spp., este método tiene el inconveniente de no distinguir entre cepas
vacunales (S19 y RB51) y cepas de campo de B. abortus, motivo por el cual se
modificó la metodología inicial, incluyendo tres nuevos primers para alcanzar
esta diferenciación (OIE, 2008; Ewalt & Bricker, 2000). Se observó un
polimorfismo que parecía ser único para RB51 y su cepa parental, la cepa
2308. Este polimorfismo, que se ubica en un locus dentro de la IS711. Estos
nuevos primers fueron diseñados para diferenciar B. abortus cepa 2308 y RB51
de otras cepas de B. abortus mediante amplificación de un producto de 364 bp
(Bricker & Halling, 1995). Y por último, para la diferenciación de la cepa vacunal
S19 de B. abortus biovar 1 (cepa de campo) se incluyó dos cebadores más, los
cuales reconocen el gen ery; mismo que se encuentra ausente en la cepa
mencionada a diferencia del resto, y cuyo producto tiene 178 bp (Bricker &
Halling,1995; Sangari et al., 1994).
Cuadro 11. Secuencia de primers para AMOS PCR modificada.
Primer Sequence (5’- 3’)
RB51/2308 primer CCC CGG AAG ATA TGC TTC GAT CC
eri primer 1 GCG CCG CGA AGA ACT TAT CAA
eri primer 2 CGC CAT GTT AGC GGC GGT GA
Fuente: (Bricker & Halling, 1995)
23
Electroforesis
La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas,
isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa,
acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las
moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que
poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable
por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los
fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis
(Posso & Ghneim, 2008).
24
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Ubicación
El trabajo fue realizado en los laboratorios del:
Centro Internacional de Zoonosis (CIZ); ubicado en las calles Jerónimo Leitón y
Gato Sobral, Ciudadela Universitaria, 3er Piso. Quito-Provincia de Pichincha.
Población de estudio
La población objeto de estudio, estuvo constituido por los aislamientos
obtenidos de un estudio previo que involucró la seroprevalencia, el aislamiento
e identificación microbiológica de bovinos faenados en dos camales de la
Provincia de Pichincha y que forman parte del banco de cepas del Laboratorio
de Microbiología del Centro Internacional de Zoonosis.
Unidades de Muestreo
El muestreo realizado fue de tipo observacional no probabilístico.
Las unidades de muestreo o suspensiones bacterianas, para este estudio
fueron en un total de 9, mismas que se aislaron en el Laboratorio de
Microbiología del CIZ, y de manera paralela, en el mismo Laboratorio, se
identificaron por pruebas bioquímicas.
Una vez obtenidas las bacterias, se toma 2-3 colonias diferenciadas en un
microtubo de 1.5 mL que contiene 500 µL de agua destilada; y se traslada al
Laboratorio de Biología Molecular (considerando las normas de bioseguridad)
para su posterior procesamiento.
25
Métodos específicos del experimento
Extracción de ADN bacteriano
Método de extracción de ADN por Chelex® en suspensión bacteriana
Protocolo de Chelex®-100 tomado y modificado de Al-Ajlan et al. (2011) y
Nishiguchi et al. (2002).
Pre-tratamiento
Considerando que el nivel de Bioseguridad (NB) para el manejo de Brucella
spp., es NB3, es necesario realizar un pre-tratamiento para inactivar a la
bacteria.
1. Inactivar la suspensión bacteriana a 65 oC por 45 minutos.
2. Centrifugar la suspensión bacteriana (SB) inactivada a 2000 g por 10
minutos.
3. Eliminar el sobrenadante y re-suspender las bacterias en 200 µL de
Buffer TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA).
Procedimiento
4. Añadir 100 µL de Chelex®-100 al 10%.
5. Añadir 3 µL de Proteinasa K (20 mg/mL).
6. Incubar durante 2 horas a 56oC en el Termomixer a 1300 RPM.
7. Incubar durante 10 minutos a 100oC en el Termomixer a 1300 RPM.
8. Esperar 20 minutos y dejar enfriar los viales.
9. Incubar durante 20 minutos a 70oC en el Termomixer a 1300 RPM.
10. Centrifugar la solución a 13000 g durante 5 minutos.
11. Transferir el sobrenadante a un nuevo microtubo de 1.5 mL y almacenar
a -20 oC hasta su utilización.
26
IS711 PCR
Para la IS711 PCR primero se realizó una master mix con: agua grado PCR
(miliQ), buffer, dNTP Mix, MgCl2, primers (Cuadro 9) y la Taq Polimerasa como
se muestra en el siguiente cuadro.
Cuadro 12. Elaboración de Master Mix.
Master Mix
Reactivo Concentración
Inicial Concentración
Final Una reacción/
volumen
Agua - - 14.50 µL
Buffer 10X 1X 2.0 µL
dNTP Mix 10 mM 0.2 mM 0.4 µL
MgCl2 50 mM 1.5 mM 0.6 µL
Primer 1 100 µM 1 µM 0.2 µL
Primer 2 100 µM 1 µM 0.2 µL
Taq 5 U/µL 2.5 U/100 µL 0.1 µL
Total
18.0 µL
Fuente: CIZ
Una vez obtenido la master mix dispensamos en tubos de reacción de 200 µL y
posteriormente añadimos 2 µL de la muestra, del control positivo y negativo.
Cuadro 13. Ejemplo del volumen final de la solución para la PCR.
Tubos de Reacción: Volumen final 20 µL
Componente Tubo # 1 Tubo # 2
Master Mix 18.0 µL 18.0 µL
ADN 2 µL -
Agua - 2 µL
Fuente: CIZ
Por último colocamos los tubos con las soluciones en el termociclador con la
programación para IS711 PCR, como se aprecia en el siguiente cuadro.
27
Cuadro 14. Programación del Termociclador, para IS711 PCR.
Termociclador: IS711 PCR
Programa (35 ciclos)
Temperatura Tiempo
94 oC 00:05:00
94 oC 00:01:00
62 oC 00:01:00
72 oC 00:00:45
72 oC 00:10:00
Fuente: CIZ
AMOS PCR Convencional
Para la realización de la AMOS PCR Convencional se prepara el master mix
con los componentes del PCR, tomando en consideración que al ser una PCR
Multiplex se manejan cinco primers (Cuadro 10), como se muestra en el
siguiente cuadro.
Cuadro 15. Elaboración de Master Mix.
Master Mix
Reactivo Concentración
Inicial Concentración
Final Una reacción/
volumen
Agua - - 14.55 µL
Buffer 10X 1X 2.0 µL
dNTP Mix 10 mM 0.2 mM 0.4 µL
MgCl2 50 mM 1.5 mM 0.6 µL
Primer Esp. 100 µM 0.2 µM 0.04 µL x 4
IS711 100 µM 1 µM 0.2 µL
Taq 5 U/µL 1 U/45 µL 0.09 µL
Total
18.0 µL
Fuente: (Bricker & Halling, 1994)
Luego de haber obtenido la master mix añadimos 2 µL de ADN, ya sea de la
muestra como, de los controles positivos y negativos.
28
Cuadro 16. Ejemplo de volumen final de la solución para la PCR.
Tubos de Reacción: Volumen final 20 µL
Componente Tubo # 1 Tubo # 2
Master Mix 18.0 µL 18.0 µL
ADN 2 µL -
Agua - 2 µL
Fuente: (Bricker & Halling, 1994)
Y por último colocamos los tubos con las soluciones en el termociclador con la
programación para AMOS PCR.
Cuadro 17. Programación del Termociclador, para AMOS PCR Convencional.
Termociclador: IS711 PCR
Programa (35 ciclos)
Temperatura Tiempo
95 oC 00:05:00
95 oC 00:01:15
55.5 oC 00:02:00
72 oC 00:02:00
72 oC 00:05:00
Fuente: (Bricker & Halling, 1994)
AMOS PCR modificada
Para la AMOS PCR modificada, al igual que en las anteriores técnicas,
preparamos una master mix con las químicas de PCR, tomando en cuenta la
utilización de primers (Cuadro 11) como se muestra en el siguiente cuadro.
Cuadro 18. Elaboración de Master Mix.
Master Mix
Reactivo Concentración
Inicial Concentración
Final Una reacción/
volumen
Agua - - 14.75 µL
Buffer 10X 1X 2.0 µL
dNTP Mix 10 mM 0.2 mM 0.4 µL
MgCl2 50 mM 1.5 mM 0.6 µL
Primers (4) 100 µM 0.2 µM 0.04 µL x 4
Taq 5 U/µL 1 U/45 µL 0.09 µL
Total
18.0 µL
Fuente: (Bricker & Halling, 1995)
29
Así mismo, luego de haber obtenido la master mix añadimos 2 µL de ADN ya
sea de la muestra como de los controles positivos y negativo.
Cuadro 19. Ejemplo volumen final de la solución para la PCR.
Tubos de Reacción: Volumen final 20 µL
Componente Tubo # 1 Tubo # 2
Master Mix 18.0 µL 18.0 µL
ADN 2 µL -
Agua - 2 µL
Fuente: (Bricker & Halling, 1995)
Y por último colocamos los tubos con las soluciones en el termociclador con la
programación para AMOS PCR modificada.
Cuadro 20. Programación del Termociclador, para AMOS PCR Modificada.
Termociclador: IS711 PCR
Programa (35 ciclos)
Temperatura Tiempo
95 oC 00:05:00
95 oC 00:01:15
55.5 oC 00:02:00
72 oC 00:02:00
72 oC 00:05:00
Fuente: (Bricker & Halling, 1995)
Visualización de Resultados
Para la visualización de resultados, la técnica empleada fue electroforesis en
geles de agarosa.
Procedimiento
Preparar el gel de agarosa al 2% utilizando como disolvente Buffer TBE
(Tris-HCl, borato, EDTA) 0,5X.
En los pocillos del gel colocar el marcador de peso molecular, los
controles positivos, control negativo, y las muestras a analizar.
Para la corrida electroforética, programar la fuente de poder a 30
minutos y a 100 voltios.
30
Observar el gel mediante la utilización de luz ultravioleta y una cámara
digital (sistema de foto-documentación).
Análisis de datos
Una vez culminado el trabajo en el laboratorio de Biología Molecular y haber
obtenido los resultados, estos fueron reportados mediante fotografías y
cuadros, utilizando el software Excel 2010 de microsoft office, emparentándolos
con la procedencia de los animales sacrificados en los diferentes camales.
31
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Existe una amplia variedad de métodos descritos para genotipificar especies
del género Brucella. Algunos nos ayudan a diferenciar Brucella spp., del gran
número de microorganismos que se pueden encontrar en órganos como
ganglios, bazo o hígado; y se los utiliza preferentemente como diagnóstico
molecular de la enfermedad (Bricker, 2002). Según los resultados obtenidos de
la IS711 PCR, tras la lectura de electroforesis, tenemos que la totalidad de las
muestras analizadas (nueve), dieron positivo (+), esto se corrobora
visualizando en el gel de agarosa un fragmento de 261 bp; indicando la
pertenencia de las muestras al género Brucella, como lo sugieren Ouahrani y
colaboradores (1993); y también Halling y colaboradores (1993); al decir que la
inserción IS711 es específica de dicho género bacteriano y ayuda en el
reconocimiento de las bacterias dentro del mencionado género, como lo
demostraron Bricker & Halling (1994).
Fuente: El autor
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa 2% de productos de amplificación de
IS711 PCR. MP: marcador de peso molecular. Líneas 1-9: muestras
analizadas. Líneas 10, 11, 14: controles negativos. Líneas 12, 13, 15: controles
positivos.
MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
MP 13 14 15
32
Una vez ubicado las cepas en el género Brucella se procedió a realizar el
AMOS PCR Convencional y su posterior visualización por electroforesis en
geles de agarosa, se obtuvo que las nueve muestras del estudio dieron como
producto un fragmento de 498 bp; con lo cual tendríamos que las muestras
pertenecen a Brucella abortus, biovar 1, 2 o 4; según lo planteado por Bricker &
Halling (1994) y validado por Ewalt & Bricker (2000). Esta técnica es un paso
para establecer la identidad de las variantes genéticas de la especie y así
identificar posibles brotes y diseminación de la enfermedad, ya que todas las
cepas patógenas de éste género son potencialmente diseminadoras (Bricker,
2004).
Dentro del complejo B. abortus bv. 1, se pueden encontrar cepas de campo y
cepas vacunales. Para la diferenciación entre cepas vacunales (RB51 y S19) y
cepas de campo se empleó la AMOS PCR Modificada, desarrollada por Bricker
& Halling (1995) y validado por Ewalt & Bricker (2000); dando como resultado,
en las nueve muestras sometidas a la prueba, un producto de 178 bp;
perteneciente al gen ery (ausente en B. abortus cepa S19) ya que la cepa S19
no posee habilidad para catabolizar el eritritol, resultado de una deleción de
700 bp en el operon eryCD (Whatmore & Gopaul, 2012; Sangari & Agüero,
1994). Adicionalmente, no se observó amplificación del fragmento de 364 bp
(presente en B. abortus cepa RB51) confirmando que todas las muestras
pertenecen a cepas de campo y no vacunales.
33
Fuente: El autor
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa 20%. A) AMOS PCR convencional.
B) AMOS PCR modificada. MP: marcador de peso molecular. Líneas 1-9 y 12-
20: muestras analizadas. Líneas 10 y 21: control negativo. Líneas 11 y 22:
control positivo.
Así tenemos que, las 9 muestras aisladas y tras ser sometidas a las técnicas
moleculares de PCR planteadas en este estudio, como son la IS711, AMOS
PCR Convencional y AMOS PCR Modificada, arrojaron como resultados que
en su totalidad se trataba de bacterias del género Brucella especie abortus
cepas de campo, lo cual concuerda con los trabajos realizados por Rodríguez-
Hidalgo y colaboradores (2015), en la provincia de Santo Domingo de los
Tsáchilas, aplicando genotipificación por PCR y el trabajo de Carlosama
(2013), en aislamiento y tipifiación, en Tulcán; quienes reportan como resultado
de sus estudios, unicamente la precencia de B. abortus cepa de campo. Siendo
hasta el momento la única especie de Brucella reportada en el Ecuador.
MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
MP 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
A)
B)
34
Cuadro 21. Resultados de la PCR
RESULTADOS PCR
Muestra N°
IS711 PCR
AMOS PCR Convencional
AMOS PCR Modificada
1 Brucella abortus cepa de campo
2 Brucella abortus cepa de campo
3 Brucella abortus cepa de campo
4 Brucella abortus cepa de campo
5 Brucella abortus cepa de campo
6 Brucella abortus cepa de campo
7 Brucella abortus cepa de campo
8 Brucella abortus cepa de campo
9 Brucella abortus cepa de campo
Fuente: El autor
Los resultados obtenidos en el presente estudio mediante la aplicación de
métodos de Biología Molecular (PCR) concuerdan y confirman los resultados
obtenidos por Ortega (2015), mediante aislamiento y biotipificación. Dicho
estudio en conjunto con el presente, forman parte del proyecto: “Aislamiento y
tipificación de Brucella spp., en reservorios animales sacrificados en seis
camales de la Sierra Norte Ecuatoriana”, por lo cual en las dos investigaciones
se trabajó exactamente a partir de los mimos animales muestreados, contando
para nuestro estudio, con los aislamientos bacterianos obtenidos por Ortega
(2015), razón por la cual los resultados obtenidos pretenden ser una
herramienta de ayuda, para la confirmación de resultados obtenidos en
microbiología.
Sin embargo la presente investigación a diferencia de los estudios realizados
en aislamiento y tipificación por Carlosama (2013) y Ortega (2015); no logró,
identificar los biovares de las muestras procesados, por lo cual convendría
aplicar la técnica molecular de VNTR (Número Variable de Repeticiones en
Tándem), como lo realizado por Rodríguez-Hidalgo y colaboradores (2015),
quienes luego de aplicar la IS711 PCR, AMOS PCR Convencional y AMOS
PCR Modificada, someten las muestras a la técnica de VNTR, para determinar
el biovar de las cepas con exactitud.
35
Cabe mencionar que de un total de 1211 animales sacrificados en los camales
de los cantones Mejía y Cayambe, las nueve muestras de aislamiento
bacteriano fueron obtenidas a partir de los animales muestreados en el camal
del Cantón Mejía. Esto no significa que Cayambe esté libre de Brucelosis,
pues en estudios serológicos realizados a nivel de predios ganaderos por
Sánchez (2012) y Neppas (2013) se ha demostrado la presencia de
anticuerpos para Brucella spp, lo que propone llevar a cabo un estudio a nivel
de predios empleando técnicas de PCR similares como lo planteado por
Hamdy & Amin (2002) y Rentería y colaboradores (2005), quienes utilizan la
secreción láctea para el diagnóstico de brucelosis, por PCR. Además Bricker y
colaboradores (2003), mencionan que las técnicas de PCR pueden alcazar un
100 % de sensibilidad y especificidad, por lo que, los errores se atribuyen al
mal procesamiento, por parte de las personas.
De las 9 muestras PCR positivas, 8 corresponden a animales procedentes del
cantón Mejía y una al cantón El Carmen, lo cual respalda la investigación de
Miño & Pico (2003), quienes mencionan la presencia de brucelosis en
explotaciones ganaderas del cantón Mejía, lo que representa un gran problema
al ser una de las mayores cuencas lecheras del país.
36
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
CONCLUSIONES:
Mediante la aplicación de la técnica molecular de IS711 PCR se logró
identificar nueve muestras del Género Brucella spp., a partir de
aislamientos bacterianos.
Las nueve muestras identificadas fueron B. abortus, lo que fue
comprobado utilizando la AMOS PCR convencional.
Con la utilización de la AMOS PCR Modificada para la diferenciación
entre cepas de campo y cepas vacunales de B. abortus, se demostró
que las nueve muestras del presente trabajo corresponden a B. abortus
cepas de campo.
37
RECOMENDACIONES:
Se sugiere ampliar el número de aislamientos para obtener información
a nivel nacional, mediante la colaboración interinstitucional.
En caso de replicar el modelo del presente estudio, se recomienda
complementar la genotipificación bacteriana con la aplicación de la
técnica de VNTR’s (Número Variable de Repeticiones en Tándem), para
poder identificar especies y biovariedades bacterianas que la
metodología AMOS no contempla.
Realizar la toma de muestras y el diagnóstico de brucelosis del personal
que trabaja en los camales, para evaluar el riesgo sanitario y establecer
medidas de control oportunas.
38
Bibliografía
AGROCALIDAD. (2009). Programa Nacional de Brucelosis Bovina. (H. Torres,
& P. Sandoval, Edits.) Recuperado el 18 de Marzo de 2015, de
http://www.agrocalidad.gob.ec/agrocalidad/images/pdfs/sanidadanimal/pr
ograma_nacional_brucelosis_bovina.pdf
Allardet, A., Bourg, G., Ramuz, M., Pages, M., Bellis, M., & Roizes, G. (1988).
DNA Polymorphism in Strains of the Genus Brucella. Journal of
Bacteriology, 4603-4607.
APHIS. (2012). Veterinary Services Centers for Epidemiology and Animal
Health National Surveillance Unit. National Bovine Brucellosis
Surveillance Plan, 1-22.
Aréstegui, M., Gualtieri, C., Domínguez, J., & Scharovsky, G. (2001). El Genero
Brucella y su Interacción con el Sistema Mononucler Fagocítico.
Veterinaria México, 131-139.
Aznar, MN, Samartino, LE, Humblet, M-F, Saegerman C. (2012). Bovine
brucellosis in Argentina and bordering countries: update. Transboundary
Emerging Diseases, (2):121-33.
Blasco, J., Rodríguez, A., Orduña, A., Ariza, X., Moriyón, I., Díaz, R., y otros.
(2001). Brucelosis Animal: La Enfermedad y Medidas para su control y
erradicación. En: Manual de Brucelosis, España: Junta de Castilla y
León, 33-43.
Bourg, G., Callaghan, D., & Boschiroli, M. (2007). The Genomic Structure of
Brucella Strains Isolated from Marine Mammals Gives Clues to
Evolutionary History Within the Genus. Veterinary Microbiology, Elsevier,
125 (3-4), 375-80.
Bricker, B. (2002). PCR as a diagnostic tool for brucelosis. Veterinary
Microbiology, 90:435-446.
39
Bricker, B. (2004). Molecular diagnostics of animal brucelosis: A review of PCR-
bassed assays and approaches, In López-Goñi I., Moriyon I., (eds).
Brucella: Molecular an Cellular Biology, Biosciences Horizon, 25-51.
Bricker, B., & Halling, S. (1994). Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and
4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR.
Journal of Clinical Microbiology, 2660-2666.
Bricker, B., & Halling, S. (1995). Enhancement of the Brucella AMOS PCR
Assay for Differentiation of Brucella abortus Vaccine Strains S19 and
RB51. Journal of Clinical Microbiology, 1640-1642.
Bricker, B., Ewalt, D., & Halling, S. (2003). Brucella 'HOOF-Prints': strain typing
by multi-locus analysis of variable number tandem repeats (VNTRs).
BMC Microbiology, 1-13.
Bricker, B., Ewalt, D., Olsen, S., & Jensen, A. (2003). Evaluation of the Brucella
abortus species–specific polymerase chain reaction assay, an improved
version of the Brucella AMOS polymerase chain reaction assay for cattle.
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 374-378.
Carlosama Yépez, M. H. (Julio de 2013). Aislamiento y biotipificación de
Brucella spp., de reservorios animales seropositivos, en el centro de
faenamiento de Tulcán.Trabajo de grado.Universidad Cental del
Ecuador. Facultad de MedIcina Veterinaria y Zootecnia. Quito, Ecuador.
Castro, H., Prat, M., & Gonzáles, S. (2005). Brucelosis: Una Revisión Practica.
Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, 203-216.
Celi, M., & Vizcaíno, L. (2004). Determinación de la seropresencia de
anticuerpos contra Brucella spp., en trabajadores de explotaciones
ganaderas del cantón Mejía. Quito-Ecuador. (Tesis de grado de tercer
nivel), Universidad Central del Ecuador.
Clavareau, C., Wellemans, V., Walravens, K., Tryland, M., Verge, J., Grayon,
M., y otros. (1998). Phenotypic and molecular characterization of
Brucella strain isolated from a minke whale (Balaenoptera acutorostrata).
Microbiology, 144: 3267-3273.
40
Cloeckaert, A., Verger, J., Grayon, M., & Grépinet, N. (1996). Polymorphism at
the dnaK locus of Brucella species and identification of a Brucella
melitensis speciesspecific marker. Journal of Medical Microbiology, 200-
205.
Cloeckaert, A., Verger, J., Grayon, M., Paquet, J., Garin, B., Foster, G., y otros.
(2001). Classification of Brucella spp. isolated from marine mammals by
DNA polymorphism at the omp2 locus. Microbes and Infection, 729-738.
Corbel, M., & Brinley, W. (1982). Clasificación del género Brucella: Situación
presente. Revue scientifique et technique (International Office of
Epizootics), 301-310.
Crespo-León, F. (1994). Influencia de los elementos y factores geográficos en
la epidemiología de la Brucelosis del ganado ovino y caprino. Papeles de
Geografía, 189-209.
De, B., Stuaffer, L., Koylass, M., Sharp, S., Gee, J., Helsel, L., y otros. (2008).
Novel Brucella strain (BO1) associated with a prosthetic breast implant
infection. Journal of Clinical Microbiology, 43-49.
DelVecchio, V., Redkar, R., Patra, G., Mujer, C., Los, T., Ivanova, N., y otros.
(2002). The genome sequence of the facultative intracellular pathogen
Brucella melitensis. Proceedings of the National Academy of Sciences,
443-448.
Díaz, R., & Lamiña, O. (2013). Determinación de la Seroprevalencia y Análisis
de Factores de Riesgo de Brucelosis en Bovinos, en las Provincias de
Zamora Chinchipe, Loja y el Oro.Trabajo de grado.Universidad Central
de Ecuador. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Quito,
Ecuador.
Dirección General de Epidemiología. (Septiembre de 2012). Manual de
procedimientos estandarizados para la vigilancia epidemiológica de la
brucelosis, IEPSA, Delegación Iztapalapa, C.P. 09830, Distrito federal,
México.
41
Ewalt, D., & Bricker, B. (2000). Validation of the Abbreviated Brucella AMOS
PCR as a Rapid Screening Method for Differentiation of Brucella abortus
Field Strain Isolates and the Vaccine Strains, 19 and RB51. Journal of
Clinical Microbilogy, 1-2.
FAO/OMS. (1986). Comite Mixto FAO/OMS de Experots en Brucelosis, sexto
informe, Organización Mundial de la Salud, Ginebra-Suiza, 1-145.
Fekete, A., Bantle, J., Halling, S., & Stich, W. (1992). Amplification Fragment
Length Polymorphism in Brucella Strains by Use of Polymerase Chain
Reaction with Arbitrary Primers. Journal of bacteriology, 7778-7783.
Fernández , E., & Gómez , F. (2009). Brucelosis: Revisión Bibliográfica. Revista
Médica de Costa Rica y Centroamérica(LXVII), 1-6.
Ficht, T. (2010). Brucella taxonomy and evolution. Future Microbiology, 5(6)
859–866.
Foster, G., Osterman, B., Godfroid, J., Jacques, I., & Cloeckaert, A. (2007).
Brucella ceti sp. nov. and Brucella pinnipedialis sp. nov. for Brucella
strains with cetaceans and seals as their preferred hosts. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2688-2693.
Gil, A., & Samartino, L. (2001). Soonosis en los sistemas de producción animal
de las áreas urbanas y periurbanas de América Latina. Livestock
Information and Police Branch, AGAL.
Grégoire, F., Hanrez, D., Michaux, C., Walravens, K., & Linden, A. (2012).
Serological and bacteriological survey of brucellosis in wild boar (Sus
scrofa) in Belgiun. BMC Veterinary Research, 8:80.
Halling, S., Tatum, F., & Bricker, B. (1993). Sequence and characterization of
an insertion sequence, IS711, from Brucella ovis. Elsevier Scrence
Publishers, 123-127.
Hamdy, M., & Amin, A. (2002). Detection of Brucella Species in the Milk of
Infected Cattle, Sheep, Goats and Camels by PCR. The Veterinary
Journal , 299-305.
42
Hubalek, Z., Scholz, H., Sedlacek, I., Mezler, F., Sanogo, Y., & Nesvadbova, J.
(2007). Brucellosis of the common vole. Vector Borne Zoonotic
Diseases, 679-687.
John, K., Fitzpatrick, J., French, N., Kazwala, R., Kambarage, D., Mfinanga, G.,
y otros. (2010). Quantifying Risk Factors for Human Brucellosis in Rural
Northern Tanzania. PLoS ONE, 1-6.
Jones, R., Deyoe, B., Meyer, M., Buening, G., & Falles, W. (1982). Isolation of
Two Brucella abortus Biotypes from Tissues of a Naturally Infected Cow.
Journal of Clinical Microbiology, 641-643.
Koneman, E., Janda, P., Allen, S., & Winn, W. (2005). Diagnóstico
Microbiológico: Bacilos Gam Negativos. Médica Panamericana, 424-430.
Laval, E. (2006). A contribution to historical understanding of brucellosis in
Chile. Revista Chilena de Infectología, 362-366.
Lopetegui, P. (Marzo de 2005). Avances de la Erradicación de Brucelosis
Bovina en Chile. Boletin Veterinario Oficial, 1-14.
López, C., Ariza, R., & Rodríguez, F. (2008). Brucelosis. Una Infección Vigente
. Acta Médica Grupo Ángeles, 158-165.
López-Goñi, I., & Moriyón, I. (2005). Brucella: Molecular and Cellular Biology.
Norfolk, UK: Taylor & Francise-Library.
Lucero, N., Escobar, G., Ayala, S., & Deborah, H. (2008). Manual de
Procedimientos: Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana.
WHO Global Salm Surv, 1-72.
Mahillon, J., & Chandler, M. (1998). Insertion Sequences. MICROBIOLOGY
AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, 725-774.
Mantur, B., & Amarnath, S. (2008). Brucellosis in India – a review. J. biosci,
539-547.
Méndez, S., & Pérez, E. (2004). La PCR múltiple en microbiología clínica.
Enferm Infecc Microbiol Clin, 183-192.
43
Michaux, S., Bourg, G., Jumas, E., Guigue, P., Allardet, A., Callaghan, D., y
otros. (1997). Genome Structure and Phylogeny in the Genus Brucella.
Journal of Bacteriology, 3244-3249.
Michaux, S., Paillisson, J., Carles , M., Bourg, G., Allardet, A., & Ramuz, M.
(1993). Presence of Two Independent Chromosomes in the Brucella
melitensis 16M Genome. Journal of Bacteriology, 701-705.
Miño, E., & Pico, V. (2003). Estudio de la presencia de brucelosis bovina en
explotaciones ganaderas del Cantón Mejía. (Tesis doctoral), Universidad
Central del Ecuador.
Moreno, E. (1998). Genome evolution within the alpha Proteobacteria; why
dosome bacteria not possess plasmids and others exhibit more than one
diferent chromosome? FEMS Microbiology Reviews, 22: 255-275.
Moreno, E., Cloeckaert, A., & Moriyón, I. (2002). Brucella evolution and
Taxonomy. Veterinary microbiology, 209-227.
Moriyón, I., Rodrírguez, A., Orduña, A., Ariza, X., Díaz, R., Blasco, J., y otros.
(2001). Bacteriologia del Género Brucella. Manual de Brucelosis, 21-30.
Mullis, K. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am.,
262: 56-61.
Neppas, M. (2013). Prevalencia de brucelosis bovina mediante la prueba de
Anillo en Leche (Ring Test) y Rosa de Bengala en la Asociación
Agropecuaria el Ordeño de la Chimba-Cayambe. (Tesis de grado de
tercer nivel), Universidad Politécnica Salesiana.
Ocampo-Sosa, A., & García-Lobo, J. (2008). Demonstration of IS711
transposition in Brucella ovis and Brucella pinnipedialis. BMC
Microbiology, 1-10.
OIE. (2008). Brucelosis Bovina. Manual de la OIE sobre animales terrestres,
682-719.
44
Orduña, A., Rodriguez, A., Ariza, X., Miriyón, I., Díaz, R., Blasco, J., y otros.
(2001). La Brucelosis: Etiología y Origen de la Infección Humana.
Manual de Brucelosis, 13-20.
Ouahrani, S., Michux, S., Widada, J., Bourg, G., Tournebize, R., Ramus, M., y
otros. (1993). Identification and Sequence Analysis of IS6501, an
Insertion Sequence in Brucella spp. : Relationship Between Genomic
Structure and the Number of IS6501 Copies. Journal of General
Microbiology, 3265-3273.
Pappas, G., Akritidis, N., Bosilkovski, M., & Tsianos, E. (2005). Brucellosis. The
New England Journal of Medicine, 2325-2336.
Paulsen, I., Seshadri, R., Nelson, K., Heidelberg, J., Read, T., Dodson, R., y
otros. (2002). The Brucella suis genome reveals fundamental similarities
between animal and plant pathogens and symbionts. PNAS, 13148-
13153.
Posso, D., & Ghneim, T. (2008). Manual De Laboratorio: Uso De Marcadores
Microsatélites Para La Estimación De Diversidad Genética En Plantas.
Caracas: Instituto Venezolano De Investigaciones Científicas.
Quinn, P., Markey, B., Leonard, F., Hartigan, P., Fanning, S., & FitzPatrick, E.
(2002). Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Wiley-Blackwell.
Rentería, T., Organes, H., Licea, A., Medina, G., Klaus, N., Montaño, M., y
otros. (2005). Evaluación de la prueba Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) a partir de muestras de leche y cultivos puros en el
diagnóstico de la brucelosis bovina. Tec Pecu Méx, 117-226.
Rivers, R., Andrews, E., González-Smith, A., Donoso, G., & Oñate, A. (2006).
Brucella abortus: inmunidad, vacunas y estrategias de prevención
basadas en ácidos nucleicos. Arch. Med. Vet. 38, 1-11.
Rodicio, M., & Mendoza, M. (2004). Identificación bacteriana mediante
secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones
en microbiología clínica. Enfermedades Infecciosas Microbiología
Clínica, 81-87.
45
Rodríguez, R. I., Guerrero, K., Contreras, J., Salcan, H., Benítez, W., Minda, E.,
y otros. (2015). Circulating strains of Brucella abortus in cattle in the
province of Santo Domingo de los Tsáchilas - Ecuador. Frontiers in
PUBLIC HEALTH, 1-11.
Rodríguez, Y., Ramírez, W., Antúnez, G., Pérez, F., Ramírez, Y., & Igarza, A.
(2005). Brucelosis bovina, aspectos históricos y epidemiológicos.
Revista Electrónica de Veterinaria REDVET, 1-9.
Ron, J. (2003). Validación de técnicas diagnosticas para la detección de
brucelosis y estudio epidemiológico en una región andina del Ecuador.
(Tesis presentada para la obtención del grado de Master en Ciencias en
Salud Animal), Amberes-Bélgica: Instituto de medicina Tropical Prince
Léopold. Departamento de Sanidad Animal Tropical Thesis No 118.
Ron, J., Ron, L., Abatih, E., Celi, M., Vizcaíno, L., Calva, J., y otros. (2014).
Human Brucellosis in Northwest Ecuador: Typifying Brucella spp.,
Seroprevalence, and Associated Risk Factors. VECTOR-BORNE AND
ZOONOTIC DISEASES in press, 1-10.
Saegerman, C., Berkvens, D., Godfroid, J., & Walravens, K. (2010). Bovine
brucellosis . (P. Lefevre, J. Blancou, R. Chermette, & G. Uilenberg,
Edits.) Infectus an Parasitic Diseases of Livestock, Chapter 77, 1-57.
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn , G., Erlich, H., y otros. (1985).
Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and restriction
site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350.
Salehi, M., Pishva, E., Salehi, R., & Rahmani, M. (2006). Isolation of Brucella
abortus Using PCR-RFLP Analysis. Iranian J Publ Health, 22-27.
Sánchez, C. (2012). Prevalencia de brucelosis bovina mediante el método de
Card-Test (Rosa de Bengala) en la comunidad de Pisillo Cayambe-
Ecuador. (Tesis de grado de tercer nivel), Universidad Politécnica
Salesiana.
46
Sangari, F., & Agüero, J. (1994). Identification of Brucella abortus B19 Vaccine
strain by the detection of DNA polimorphism at the ery locus. Vaccine,
12(5): 435-438.
Sangari, F., Garcia-Lobo, J., & Agüero, J. (1994). The Brucella abortus vaccine
strain B19 carries a deletion in the erythritol catabolic genes. FEMS
Microbiology Letters, 337-342.
Sbriglio, J., Sbriglio, H., & Sainz, S. (2007). BRUCELOSIS: Una patología
generalmente subdiagnosticada en Humanos y que impacta
negativamente en la producción pecuaria y desarrollo de nuestros
paices. Bioanálisis, 1-5.
Schlabritz-Loutsevitch, N., Whatmore, A., Quance, C., Koylass, M., Cummins,
L., Dick, E., y otros. (2009). A novel Brucella isolate in association with
two cases of stillbirth in non-human primates – fi rst report. Journal of
Medical Primatology, 70-73.
Scholz , H., Kampfer, P., & Cloeckaert, A. (2012). Brucella: Relationship to
Other Alphaproteobacteria, Current Taxonomy and the Emergence of
New Species. (López-Goñi, & D. O'Callaghan, Edits.) Brucella: Molecular
Microbiologyand Genomics.
Scholz, H., & Vergnaud, G. (2013). Molecular characterisation of Brucella
species. Revue scientifique et technique (International Office of
Epizootics, 149-162.
Scholz, H., Hubalek, Z., Sedlácek, I., Vergnaud, G., Tomaso, H., Al Dahouk, S.,
y otros. (2008). Brucella microti sp. nov., isolated from the common vole
Microtus arvalis. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 375-382.
Scholz, H., Nöckler, K., Göllner, C., Bahn, P., Vergnaud, G., Tomaso, H., y
otros. (2010). Brucella inopinata sp. nov., isolated from a breast implant
infection. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 801-808.
47
Sobral, B., & Wattam, A. (2012). Comparative Genomics and Phylogenomics of
Brucella. (I. López-Goñi, & D. O`Callaghan, Edits.) Brucella: Molecular
Microbiology and Genomics.
Somma, M., & Querci, M. (2012). Análisis de la Presencia de Organismos
Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos: Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR). JRC European Commission, 1-34.
Stanier, R., Ingraham, J., Wheelis, M., & Painter, P. (1996). Microbiología
(Segunda edición ed.). Editorial REVÉRTE.
Surzycki, S. (2002). Basic Techniques in Molecular Biology. Springer Lab
Manual.
Tamay de Dios, L., Ibarra, C., & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.
Medigraphic, 70-78.
Tcherneva, E., Rijpens, N., Jersek, B., & Herman, L. (2000). Differentiation of
Brucella species by Random Amplified Polymorphic DNA analysis.
Journal of Applied Microbiology , 69–80.
The Center for Food Security & Public Health. (2009). Brucelosis. Collage of
Veterinary Medicine, 1-15.
Velasco, J., Romero, C., López-Goñi, I., Leiva, J., Díaz, R., & Moriyón, I.
(1998). Evaluation of the relatedness of Brucella spp. and Ochrobactrum
anthropi and description of Ochrobactrum intermedium sp. nov., a new
species with a closer relationship to Brucella spp. International Journal of
Systematic Bacteriology, 759-768.
Whatmore, A., & Gopaul, K. (2012). Recent advances in molecular approaches
to Brucella diagnostics and epidemiology. In López-Goñi I., Callaghan D.
(edes). Brucella: Molecular Microbiology and Genomics. Caister
Academic Press, 57-88.
Whatmore, A., Davison, N., Cloeckaert, A., Al Dahouk, S., Zygmunt, M., Brew,
S., y otros. (2014). Brucella papionis sp. nov., isolated from baboons
48
(papio spp.). International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 4120-4128.
Whatmore, A., Shankster, S., Perrett, L., Murphy, T., Brew, S., Thirlwall, R., y
otros. (2006). Identification and Characterization of Variable-Number
Tandem-Repeat Markers for Typing of Brucella spp. Journal of Clinical
Microbiology, 1982-1993.
WHO, FAO, OIE. (2006). brucellosis in humans and animals. World Health
Organization, 1-89.
49
ANEXOS
50
EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO: Incubación en termomixer
Foto: CIZ, 2015
ELABORACIÓN DE MASTER MIX:
Cámara de flujo
Foto: CIZ, 2015
MONTAJE DE PCR: Termociclador
Foto: CIZ, 2015
51
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Foto: CIZ, 2015
REACTIVOS PARA MASTER
MIX: Gradilla térmica
Foto: CIZ, 2015
SISTEMA DE FOTO-DOCUMENTACIÓN
Foto: CIZ, 2015