UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR€¦ · Test HSD de Tukey de la interrelación quinua-extracto de...
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2016 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO A PARTIR DE QUINUA, Chenopodium quinoa, PARA LA PRODUCCIÓN DEL HONGO Lentinus spp. TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA QUÍMICA AUTOR: MARTHA CECILIA ENRIQUEZ NIQUINGA TUTOR: ING. SERGIO HOMERO MEDINA ROMO QUITO
Transcript of UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR€¦ · Test HSD de Tukey de la interrelación quinua-extracto de...
2016
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO A
PARTIR DE QUINUA, Chenopodium quinoa, PARA LA PRODUCCIÓN DEL
HONGO Lentinus spp.
TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA QUÍMICA
AUTOR: MARTHA CECILIA ENRIQUEZ NIQUINGA
TUTOR: ING. SERGIO HOMERO MEDINA ROMO
QUITO
iii
© DERECHOS DE AUTOR
Yo, MARTHA CECILIA ENRIQUEZ NIQUINGA, en calidad de autor del trabajo de
titulación, modalidad proyecto de investigación: ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN
DE UN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO A PARTIR DE QUINUA, Chenopodium
quinoa, PARA LA PRODUCCIÓN DEL HONGO Lentinus spp., autorizo a la
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR hacer uso de todos los contenidos que
me pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos
o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
En la ciudad de Quito, a los 27 días del mes de septiembre del 2016
____________________________
Martha Cecilia Enríquez Niquinga
CI: 1720631694
iv
APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Ingeniero Sergio Homero Medina Romo en calidad de tutor del trabajo de titulación
modalidad proyecto de investigación, titulado “ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN
DE UN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO A PARTIR DE QUINUA, Chenopodium
quinoa, PARA LA PRODUCCIÓN DEL HONGO Lentinus spp.”, elaborado por la
estudiante MARTHA CECILIA ENRIQUEZ NIQUINGA de la Carrera de
INGENIERÍA QUÍMICA, Facultad de INGENIERÍA QUÍMICA de la Universidad
Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios
en el campo metodológico y el campo epistemológico, para ser sometido a la evaluación
por parte del jurado examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que
el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la
Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 27 días del mes de septiembre de 2016.
__________________________
Ing. Sergio Medina
PROFESOR TUTOR
v
A Dios quien supo guiarme
por el buen camino,
darme fuerzas para seguir adelante
y no desmayar en los problemas
que se presentaron.
A mis padres que siempre
han estado ahí para mí,
brindándome su apoyo incondicional,
hermanos, amigos, y profesores.
También se la dedico a mi hija hermosa
quien ha sido mi mayor motivación
para nunca rendirme en los estudios
y poder llegar a ser un ejemplo para ella.
vi
AGRADECIMIENTOS
Mis sinceros agradecimientos a:
A la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador.
Al Ing. Sergio Medina tutor de mi trabajo de titulación, por su guía durante el desarrollo
del presente trabajo.
A la Bioq. F. Magdalena Díaz por la cooperación brindada durante el desarrollo
experimental.
A las personas encargadas de los laboratorios de Biotecnología Aplicada y Micología
Aplicada.
A mis padres y hermanos por su apoyo incondicional durante mi carrera universitaria.
A mis amigos, amigas y familiares, personas que han formado parte de mi vida
estudiantil por su amistad, consejos, apoyo, ánimo y compañía.
vii
CONTENIDO
pág.
LISTA DE TABLAS ....................................................................................................... xi
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... xiii
LISTA DE ANEXOS .................................................................................................... xiv
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS ............................................................. xv
RESUMEN .................................................................................................................... xvi
ABSTRACT ................................................................................................................. xvii
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
1. MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 3
1.1. Quinua (Chenopodium quinoa) ................................................................................. 3
1.1.1. Variedades vigentes. ............................................................................................... 3
1.2. Carbohidratos ............................................................................................................ 4
1.2.1. Clasificación.. .......................................................................................................... 4
1.3. Medios de cultivos ..................................................................................................... 5
1.3.1. Agar papa dextrosa (PDA). ..................................................................................... 6
1.3.2. Análisis químico de la papa. ................................................................................... 6
1.3.3. Clasificación de los medios de cultivo .................................................................... 7
1.3.3.1.Por su consistencia................................................................................................ 7
1.3.3.2.Según su origen ................................................................................................... .7
1.3.3.3.Por su composición ............................................................................................... 7
1.4. Microorganismos ....................................................................................................... 8
1.4.1. Hongos. ................................................................................................................... 8
1.4.1.1. Partes del hongo ................................................................................................ 8
viii
1.4.1.2. Crecimiento. ....................................................................................................... 9
1.4.1.3. Reproducción...................................................................................................... 9
1.4.1.4. Requerimientos nutricionales ............................................................................. 9
1.4.1.5. Condiciones ambientales requeridas para el crecimiento................................... 9
1.4.1.6. Curva de crecimiento de hongos en medio sólido .............................................. 9
1.4.1.7. Clasificación por sus usos ................................................................................ 10
1.4.2. Bacterias. ............................................................................................................... 11
1.5. Evaluación de un medio de cultivo ........................................................................ 12
1.5.1. Productividad o Promoción de crecimiento de los medios de cultivo. ................. 12
1.5.2. Cepas ATCC.. ....................................................................................................... 14
1.5.2.1. Clasificación cepas ATCC ............................................................................... 14
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ...................................................................... 15
2.1. Diagrama de flujo del proceso ................................................................................. 15
2.2. Proceso Experimental seleccionado ........................................................................ 16
2.3. Diseño Experimental ............................................................................................... 16
2.3.1. Parámetros fijos ..................................................................................................... 19
2.3.2. Parámetros variables ............................................................................................. 19
2.4. Materiales y Equipos ............................................................................................... 20
2.5. Sustancias y Reactivos ............................................................................................ 21
2.6. Microorganismos ..................................................................................................... 22
2.7. Procedimiento .......................................................................................................... 22
2.7.1. Caracterización de la quinua ................................................................................. 22
2.7.1.1. Humedad .......................................................................................................... 23
2.7.1.2. Cenizas ............................................................................................................. 23
2.7.1.3. Proteína ............................................................................................................. 23
2.7.1.4. Fibra.................................................................................................................. 24
2.7.1.5. Grasa ................................................................................................................. 24
2.7.2. Elaboración del medio de cultivo .......................................................................... 26
2.7.2.1. Elaboración del medio de cultivo a partir de la cocción de quinua .................. 26
2.7.2.2. Cambio de pH y Temperatura a la combinación óptima de la elaboración. .... 26
2.7.3. Evaluación de un medio de cultivo ....................................................................... 27
ix
2.7.3.1. Método Ecométrico .......................................................................................... 27
2.8. Datos Experimentales .............................................................................................. 28
2.8.1. Caracterización de la quinua ................................................................................. 28
2.8.2. Área de crecimiento del hongo Lentinus spp., en medios formulados y PDA...... 29
2.8.3. Área de crecimiento del hongo Lentinus spp., a diferente temperatura y pH en
el medio de cultivo formulado óptimo. ........................................................................... 30
3. CÁLCULOS Y RESULTADOS ............................................................................... 31
3.1. Cálculos ................................................................................................................... 31
3.1.1. Cálculos para la caracterización ............................................................................ 31
3.1.1.1. Cálculo modelo de la humedad ........................................................................ 31
3.1.1.2. Cálculo modelo de cenizas ............................................................................... 31
3.1.1.3. Cálculo de proteína ........................................................................................... 32
3.1.1.4. Cálculo de grasa ............................................................................................... 32
3.1.1.5. Cálculo de fibra ................................................................................................ 33
3.1.1.6. Cálculo de carbohidratos .................................................................................. 33
3.1.1.7. Cálculo de calorías ........................................................................................... 33
3.1.2. Cálculo de la cantidad de quinua y extracto de malta para realizar la elabora-
ción en base a carbohidratos. ........................................................................................... 33
3.1.2.1. Cálculo de la cantidad de quinua. ..................................................................... 33
3.1.2.2. Cálculo de la cantidad de extracto de malta ..................................................... 34
3.1.2.3. Cálculo promedio del área de crecimiento micelial del hongo Lentinus spp. .. 34
3.1.3. Cálculos para la evaluación del medio de cultivo. ................................................ 35
3.1.3.1. Cálculo del Índice de crecimiento absoluto (ICA) ........................................... 35
3.1.3.2. Cálculo del Índice de crecimiento relativo (ICR) ............................................ 35
3.1.4. Análisis estadístico ................................................................................................ 35
3.2. Resultados ............................................................................................................... 36
3.2.1. Resultados de la caracterización de la quinua.. ..................................................... 36
3.2.2. Resultados área de crecimiento ............................................................................. 37
3.2.3. Resultados de la evaluación del medio ................................................................. 39
3.3. Análisis estadístico .................................................................................................. 41
3.3.1. Análisis estadístico para la elaboración del medio.. ............................................. 41
x
3.3.2. Análisis estadístico a diferentes condiciones de pH y temperatura. ..................... 42
3.4. Comparación de resultados del agar papa dextrosa (PDA) y el medio formulado. 43
3.4.1. Área de crecimiento del medio formulado y PDA. ............................................... 43
3.4.2. Productividad de los tres medios: medio formulado, agar nutritivo, PDA. .......... 44
3.4.3. Índice de crecimiento relativo ............................................................................... 44
4. DISCUSIÓN .............................................................................................................. 45
5. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 48
6. RECOMENDACIONES ............................................................................................ 50
CITAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 51
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 54
ANEXOS ........................................................................................................................ 55
xi
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Contenido mineral en la quinua en mg por cada 100 g de peso seco .................. 3
Tabla 2. Variedades de Quinua en Ecuador. ..................................................................... 4
Tabla 3. Composición del agar papa dextrosa (PDA) ....................................................... 6
Tabla 4. Composición química del tubérculo de papa ...................................................... 6
Tabla 5. Valores asignados para determinar la productividad de un medio de cultivo ... 13
Tabla 6. Requerimientos para realizar las pruebas de promoción de crecimiento .......... 14
Tabla 7. Parámetros fijos definidos para la experimentación .......................................... 19
Tabla 8. Valores considerados para la experimentación de los parámetros variables ..... 19
Tabla 9. Datos para la caracterización de la quinua ........................................................ 28
Tabla 10. Área de crecimiento del hongo Lentinus spp. ................................................. 29
Tabla 11. Área de crecimiento a diferente temperatura y pH .......................................... 30
Tabla 12. Resultados de la caracterización de la quinua. ................................................ 36
Tabla 13. Resultados del área de crecimiento promedio del hongo Lentinus spp., en
la elaboración y en medio PDA. ...................................................................................... 37
Tabla 14. Área de crecimiento promedio del hongo Lentinus spp a diferentes
temperaturas y pH con las concentraciones óptimas. ...................................................... 38
Tabla 15. Índice de crecimiento absoluto y Productividad en Agar Nutritivo ................ 39
Tabla 16. Índice de crecimiento absoluto y Productividad Medio de Prueba ................. 40
Tabla 17. Índice de crecimiento absoluto y Productividad Medio PDA ......................... 40
Tabla 18. Resultados del índice de crecimiento relativo (ICR) entre el Medio
formulado y Agar Nutritivo ............................................................................................. 40
Tabla 19. Resultados del índice de crecimiento relativo (ICR) entre el Medio
formulado y PDA ............................................................................................................ 41
Tabla 20. Análisis estadístico de área de crecimiento del hongo Lentinus spp., en
función de quinua y extracto de malta. ............................................................................ 41
xii
Tabla 21. Test HSD de Tukey de la interrelación quinua-extracto de malta en la
elaboración....................................................................................................................... 42
Tabla 22. Análisis estadístico de área de crecimiento del hongo Lentinus spp a
diferentes condiciones de pH y temperatura.................................................................... 42
Tabla 23. Test HSD de Tukey de la interrelación temperatura-pH. ................................ 43
Tabla 24. Productividades del medio prueba y dos medios de control ........................... 44
Tabla 25. Índices de crecimiento relativo del medio prueba y dos medios de control .... 44
xiii
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1. Clasificación de los carbohidratos. .................................................................... 5
Figura 2. Partes del hongo ................................................................................................ 8
Figura 3. Curva de crecimiento de hongos en medio sólido. ......................................... 10
Figura 4. Representación gráfica de marcaje y siembra en método ecométrico ............ 12
Figura 5. Diagrama de flujo con la descripción del proceso .......................................... 15
Figura 6. Diseño experimental para determinar las concentraciones óptimas de
quinua y extracto de malta a pH de 5,6 y T de 25 °C. .................................................... 17
Figura 7. Diseño experimental para determinar las condiciones óptimas de
crecimiento del hongo Lentinus spp. .............................................................................. 18
Figura 8. Diagrama de flujo para el método ecométrico. ............................................... 27
Figura 9. Hongo Lentinus spp. – Área de crecimiento = f (Días de ensayo), para la
elaboración...................................................................................................................... 37
Figura 10. Hongo Lentinus spp.-Área de crecimiento = f (Días de ensayo) a 25 °C ..... 38
Figura 11. Hongo Lentinus spp.-Área de crecimiento = f (Días de ensayo) a 30 °C ..... 39
Figura 12. Hongo Lentinus spp. - Área de crecimiento = f (Días de ensayo) en
medio óptimo y PDA ...................................................................................................... 43
xiv
LISTA DE ANEXOS
pág.
ANEXO A. Equipos utilizados para caracterización de quinua. .................................... 56
ANEXO B. Equipos utilizados en la elaboración del medio de cultivo ......................... 60
ANEXO C. Equipos utilizados para evaluación del medio de cultivo ........................... 64
xv
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
%N Porcentaje de nitrógeno
�̅� Área de crecimiento promedio del hongo Lentinus spp.
Fs Estadístico para la distribución F
𝑆𝑎2 Varianza para la variable a
𝑆𝑏2 Varianza para la variable b
Ha Hipótesis alternativa
H0 Hipótesis nula
S Significación del análisis de varianza
gl Grados de libertad
F Factor de Fisher
pa Peso de agar
pq Peso de quinua
vm Volumen del medio de cultivo
pem Peso de extracto de malta
xvi
ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO A
PARTIR DE QUINUA, Chenopodium quinoa, PARA LA PRODUCCIÓN DEL
HONGO Lentinus spp.
RESUMEN
Elaboración de un medio de cultivo sólido a partir de quinua, extracto de malta y agar a
nivel de laboratorio para producción del hongo Lentinus spp. y posterior evaluación del
mismo con los siguientes microorganismos : Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans, Escherichia coli. y Aspergillus brasiliensis.
Se realizó la caracterización físico-química de la quinua. Luego se elaboró el medio,
mediante la cocción de tres cantidades de quinua: 3, 6, y 9 g, en 250 ml de agua durante
30 minutos y se tomaron 100 ml del líquido filtrado, a los cuales se les añadió 0,5; 1,0;
y 1,5 g de extracto de malta y a cada una de estas 1,5 g de agar, obteniendo nueve
combinaciones. Del análisis de la cinética de crecimiento del micelio del hongo
Lentinus spp. en las cajas Petri se determinó la mezcla óptima, la cual fue evaluada
mediante la comparación de la prueba de promoción de crecimiento con la del medio
agar papa dextrosa.
Se concluye que el medio de cultivo óptimo corresponde a la mezcla: 3 g de quinua y
0,5 g de extracto de malta y al realizar la evaluación de éste, se pudo constatar que la
productividad del medio es alta para las 4 primeras cepas y media para la quinta cepa.
PALABRAS CLAVES: / QUINUA / Chenopodium Quinoa / HONGOS / Lentinus spp/
EXTRACTO DE MALTA / EVALUACIÓN / MEDIO DE CULTIVO /.
xvii
PRODUCTION AND ASSESSMENT OF A QUINOA-BASED (Chenopodium
quinoa) SOLID CULTURE MEDIUM FOR CULTIVATING Lentinus spp.
ABSTRACT
This research work seeks producing a solid culture medium made from quinoa, malt
extract and agar at a laboratory level in order to cultivate the fungus Lentinus spp., to
then assess it with Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,
and Aspergilius brasiliensis.
To this end, the study conducted a physical-chemical characterization of quinoa and
proceeded to produce the medium with three different concentrations of cooked quinoa:
3, 6 and 9 g in 250 ml of water for 30 minutes, from which it extracted 100 ml of
filtered mixture. Then, this extract was mixed with 0.5, 1.0 and 1.5 g of malt extract and
1.5 g of agar, coming to a total of 9 combinations. The optimal combination was
established based on the analysis of the growth kinetics of the Lentinus spp. mycelium.
Said mixture was then assessed through comparative growth assays with potato dextrose
agar.
This study concludes that the optimal culture medium is achieved with 3 g of quinoa
and 0.5 g of malt extract; and upon assessment, we were able to determinate that this
medium is highly productive for the first 4 tested strains and moderately productive for
the fifth one.
KEYWORDS: / QUINOA / Chenopodium quinoa / FUNGI / Lentinus spp. / MALT
EXTRACT / ASSESSMENT / CULTURE MEDIUM/.
1
INTRODUCCIÓN
Desde la antigüedad los seres humanos han elaborado alimentos, como: pan, yogur o
vino, mediante procesos de fermentación, empleando especies concretas de
microorganismos.
En la actualidad se utilizan microorganismos en los diferentes campos como: industrias
alimentarias, industrias químicas, en el ámbito de la microbiología industrial, industrias
farmacéuticas; para la obtención de vacunas, antibióticos con microorganismos y
hongos filamentosos, como Penicillium o Cephalosporium, los mismos que producen la
mayoría de los antibióticos, en biotecnología aplicada a la agricultura, para la
producción de biofertilizantes, insecticidas, producción comercial de setas; las cuales
hoy en día, un gran porcentaje de las setas comestibles son producidas en industrias
agrícolas, en biotecnología ambiental, para biorremediación, producción microbiana de
compuestos biodegradables y para obtención microbiana de enzimas.
En la industria se han elaborado medios de cultivo sólidos para aislamiento de
microorganismos como hongos, bacterias y levaduras, con la finalidad de estudio
morfológico de las colonias, conservación de cepas identificadas, clasificación y
tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades bioquímicas en medios
diferenciales, cultivo y cosecha de bacterias para la elaboración de productos
biológicos, crecimiento micelial de los diferentes tipos de hongos. Por esta razón es de
gran importancia formular nuevos medios de cultivo que permitan el crecimiento de
microorganismos en menor tiempo y que conserven sus características originales.
El medio de cultivo de mayor uso en micología es el agar papa dextrosa (PDA), que es
un medio de cultivo existente, preparado a partir de infusión de papa, dextrosa y agar,
donde el valor nutritivo de la papa está compuesto principalmente por: carbohidratos,
proteínas, colorías y grasa. En el presente estudio se investiga un medio de cultivo
alternativo que se lo pueda realizar en el laboratorio de manera fácil y rápida, utilizando
un cereal con mayor valor nutritivo que la papa y otra fuente de azúcar, por esta razón
2
se utilizará la quinua que tiene los mismos compuestos pero en proporciones mayores a
los de la papa y como fuente de azúcar se utilizará el extracto de malta, que es una
mezcla de azúcares predominando la maltosa.
En el presente trabajo se formuló un medio de cultivo sólido a partir de la cocción de
quinua, extracto de malta y agar. El trabajo se desarrolló con la utilización del micelio
del hongo Lentinus spp., determinando el área de crecimiento micelial en cada una de
las combinaciones de la elaboración, además se determinaron las mejores condiciones
para el crecimiento de la cepa y se evaluó el medio formulado mediante la prueba de
promoción de crecimiento, para lo cual se utilizaron las cepas: Staphylococcus aureus,
Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus brasiliensis y Escherichia
coli.
Los resultados obtenidos del área de crecimiento micelial del medio formulado fueron
comparados con un medio de cultivo existente, siendo este el agar papa dextrosa (PDA).
Después de analizar los resultados obtenidos, se concluyó que bajo las condiciones de
experimentación analizadas si existen diferencias significativas entre el tiempo de
crecimiento micelial en el medio PDA y el propuesto a partir de la cocción de quinua,
resultando ser las mejores combinaciones: de 3 g de cocción de quinua; 0,5 g de
extracto de malta y 5 g de cocción quinua y 1,5 g de extracto de malta alcanzando un
área de 63,62 cm2 en aproximadamente 8 y 9 días respectivamente.
Se recomienda probar el medio de cultivo formulado con diferentes tipos de micelios de
hongos, los que pueden ser comestibles o medicinales y realizar un análisis económico
de la producción del medio para utilización industrial.
3
1. MARCO TEÓRICO
1.1. Quinua (Chenopodium quinoa)
La quinua es una planta de hermoso aspecto, alta, y erecta, cuya flor es una espiga
grande de colores vivos que produce una densa cabeza de granos nutritivos. Los granos
de quinua contiene hasta 23 % de proteína, entre 4 y 9 % de aceite de alta calidad
nutricional, también es alta en contenido de carbohidratos, de los cuales alrededor de 60
% son almidones y un 5 % azúcares, además buenas cantidades de calcio, fósforo y
hierro. [1]. La cantidad de proteínas en la quinua depende de la variedad, con un rango
comprendido entre un 10,4 % y un 17,0 % de su parte comestible [2].
En la tabla 1 se muestran los valores de minerales presentes en la quinua, mientras que
las vitaminas que están en mayor cantidad en la quinua son los complejos B, C y E [3].
Tabla 1. Contenido mineral en la quinua en mg por cada 100 g de peso seco
Mineral Quinua
Calcio 148,7
Hierro 13,2
Magnesio 249,6
Fósforo 383,7
Potasio 926,7
Zinc 4,4
1.1.1. Variedades vigentes. En el Ecuador la variedad de quinua más cultivada es la
Tunkahuan misma que representa cerca del 70 % del total de la producción nacional
debido principalmente a la adaptabilidad de suelos, climas de la sierra ecuatoriana,
rendimiento máximo, tolerante al exceso de humedad y granizada, menor contenido de
saponina, además es una semilla certificada.
4
Por los motivos señalados los agricultores escogen cultivar esta variedad para disminuir
riesgos de que la producción se pierda asegurando la producción [4].
Tabla 2. Variedades de Quinua en Ecuador.
Provincias Variedades Rendimiento máx. (qq/Ha)
Chimborazo Tunkahuan, Pata de
venado
40 qq/Ha
20 qq/Ha
Tungurahua Tunkahuan 30 qq/Ha
Cañar Tunkahuan, Pata de
venado 30 qq/Ha
Si se toma en cuenta la cantidad de proteína y demás minerales de las variedades de
quinua cultivadas en Ecuador, se puede mencionar que INIAP Tunkahuán contiene un
16.14 % de proteína en grano lavado (desaponificado), 0.06 % de Ca, 0.73 % de P, 0.68
% de K y 53 ppm de hierro; mientras que la variedad INIAP Pata de Venado posee el
17.45 % de proteína, 0.09 % de Ca, 0.65 % de P, 0.69 % de K y 93 ppm de hierro. [5].
1.2. Carbohidratos
Son compuestos orgánicos formados por carbono, oxígeno e hidrógeno. Su fórmula
química es Cn(H2O)n, variando la n desde tres hasta muchos miles de átomos de
carbono [6].
1.2.1. Clasificación. La clasificación en función de su comportamiento al hidrolizar.
Azúcares: los podemos agrupar en tres grupos: monosacáridos y oligosacáridos. Los
oligosacáridos contienen de dos hasta diez unidades de monosacáridos. Los
disacáridos están formados por dos moléculas de monosacáridos,
Sacarosa = glucosa + fructosa
Maltosa =glucosa + glucosa
Lactosa = glucosa + galactosa
5
Polisacáridos: Producen más de diez moléculas de monosacáridos por hidrólisis. La
mayoría son uniones de unidades de glucosa que difieren en el tipo de enlace
químico [7].
Esta clasificación se resume en el siguiente esquema.
Figura 1. Clasificación de los carbohidratos.
1.3. Medios de cultivos
Formulación de sustancias que contienen compuestos naturales y/o sintéticos, en forma
líquida, semi-sólida o sólida que tienen como propósito permitir la multiplicación, o
preservar la viabilidad de microorganismos [8].
La mayoría de hongos y bacterias fitopatógenas pueden cultivarse en medios de cultivos
artificiales, sólidos o líquidos. La mayoría de los hongos crecen en medios de cultivo de
alto contenido de carbohidratos, con un pH entre 5 y 6, mientras que las bacterias crecen
mejor a un pH próximo a 7. No existe un medio perfecto para el cultivo de hongos y
bacterias ya que las exigencias de las diferentes especies varían considerablemente [9].
Los medios de cultivo poseen varios componentes, entre los que están:
Esenciales: Agua, fuente de C,N y S (puede ser de tipo orgánico o inorgánico), otros
minerales (P, Ca, Mg,..), factores de crecimiento (vitaminas, aminoácidos, etc)
Alternativos: Agente solidificante, tampones, indicador de pH, etc [10].
Aldosas
Cetosas
Disacárido
hasta
decasacáridos
Monosacáridos
Carbohidratos
Oligosacáridos
Polisacáridos
Oligosacáridos
Polisacáridos
6
1.3.1. Agar papa dextrosa (PDA). Es un medio muy usado que sirve para aislar todo
tipo de hongos [11].
Tabla 3. Composición del agar papa dextrosa (PDA)
Papas peladas 200 g
Dextrosa 20 g
Agar 17 g
Agua destilada
hasta completar 1 L
En el laboratorio se lo prepara de la siguiente manera: se cocina las papas peladas y
partidas en 500 ml de agua por 1 hora, se filtra el extracto de papas, se le añaden los
demás ingredientes (dextrosa y agar), se restaura el volumen a 1 L con agua destilada y
se agita la mezcla a calentamiento, una vez disueltos todos los componentes se esteriliza
el medio a 15 libras de presión por 20 minutos [12].
1.3.2. Análisis químico de la papa.
Tabla 4. Composición química del tubérculo de papa [13].
Compuesto Contenido (%) Contenido
(mg/100g)
Parte comestible 100,0 Calcio 4
Agua 76,7 Fósforo 26
Proteínas 1,9 Hierro 1,2
Grasas 0,1 Calorías 84 Kcal/100 g
Carbohidratos 19,31 -------- --------
Azúcares invertidos 0,11 -------- --------
Fibra 1,0 -------- --------
Ceniza 1,0 -------- --------
7
1.3.3. Clasificación de los medios de cultivo. Los medios de cultivo pueden dividirse
según diferentes criterios: consistencia, origen y composición.
1.3.3.1. Por su consistencia
Medios líquidos. Son los denominados caldos que contiene nutrientes, con la adición
de algún tapón, capaz de mantener el pH adecuado. El medio líquido más utilizado es
el caldo nutritivo, el cual está compuesto de extracto de carne, peptona y agua.
Medios sólidos. Se preparan agregándoles agar-agar a los medios líquidos. El agar -
agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula
insoluble en agua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5 % p/v forma un
gel firme entre 32 y 39 ºC y no se funde por debajo de 85 ºC. Este medio presenta la
posibilidad de obtener colonias aisladas, en este caso se puede observar la existencia
de colonias separadas unas de otras.
1.3.3.2. Según su origen
Naturales. Son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o
vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se
conoce exactamente.
Sintéticos. Son los medios que contienen una composición química definida
cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. Los
medios semisintéticos son sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento
bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de
levadura
1.3.3.3. Por su composición
Medios comunes. son aquellos cuya única finalidad es el crecimiento de los
microorganismos poco exigentes. Pueden ser líquidos, de enriquecimiento, para
conseguir una gran cantidad de bacterias a partir del inóculo efectuado.
8
Medios enriquecidos. Son medios ordinarios o comunes, a los que se les añade
ciertos productos (sangre, suero, glucosa, etc.) que permitan el aporte de factores de
crecimiento. [14].
1.4. Microorganismos.
Son seres vivos diminutos que únicamente pueden ser apreciados a través de un
microscopio. Pueden ser parte de distintas clases, abarcado bacterias, levaduras y mohos
que se desarrollan en aerobiosis. [15].
1.4.1. Hongos. Los hongos son organismos eucariotes, por lo que poseen núcleos
verdaderos, así como todas las estructuras internas características de estas células.
Poseen, además, una pared gruesa, semejante en grosor y en composición química a la
pared de las células vegetales. Los hongos no son fotosintéticos y aunque algunos, como
las setas, semejan plantas, no poseen hojas, tallos ni raíces. Su micelio está formado por
estructuras ramificadas y filamentosas cuyos fructificaciones portan esporas.
1.4.1.1. Partes del hongo. En el hongo se pueden diferenciar dos partes fundamentales
que son el cuerpo vegetativo y el cuerpo reproductor, como se observa en la Figura 2. El
cuerpo vegetativo esta principalmente compuesto por un conjunto de filamentos
llamados hifas, las mismas que se unen para formar los micelios. El micelio es el
encargado de producir enzimas y absorber substancias minerales del suelo, se puede
decir que el hongo en realidad es el micelio, ya que la seta no es más que su aparato
reproductor, pero comúnmente se denomina hongo solamente a la seta. [16].
Figura 2. Partes del hongo
9
1.4.1.2. Crecimiento. El crecimiento distal o apical de los hongos se produce en los
extremos de las hifas. En este proceso, cada hifa se va ramificando en crecimiento
apical y así sucesivamente hasta que se forma una maraña visible de filamentos.
Mientras existan nutrimentos disponibles, el crecimiento por elongación de las hifas
puede continuar aunque, a la vez, las partes más viejas del micelio pierden poco a poco
su contenido citoplasmático y mueren.
1.4.1.3. Reproducción. La reproducción se lleva a cabo por medio de esporas y
también pueden desarrollarse a partir de cualquier fragmento de micelio, por pequeño
que sea.
1.4.1.4. Requerimientos nutricionales. Los hongos poseen la capacidad de utilizar
una gran variedad de materiales orgánicos, por lo que el carbono debe provenir de
compuestos orgánicos. Los carbohidratos, como la glucosa, sacarosa y maltosa, son una
fuente apropiada para la mayoría de los hongos.
1.4.1.5. Condiciones ambientales requeridas para el crecimiento.
pH. Por lo general los hongos, tienen un rango muy amplio de tolerancia al pH.
Pueden crecer en concentraciones relativamente altas de ácido, así como en medios
bastante alcalino. Para una gran mayoría de hongos el rango de pH es de 2,0 a 9,0,
pero casi todos crecen mejor en un pH ácido. El pH óptimo se encuentre alrededor de
5,6.
Temperatura. La mayoría de los hongos pueden ser considerados mesófilos, con
temperaturas óptimas de crecimiento entre 22 y 30 °C [17].
1.4.1.6. Curva de crecimiento de hongos en medio sólido. Sobre medio sólido se
observa el ritmo de crecimiento del hongo, el cual es constante y uniforme para los de
crecimiento indefinido o no estancable; se denomina crecimiento definido o estancable,
cuando el crecimiento no es uniforme y se detiene,. Cuando los factores ambientales no
son propicios, el ritmo de crecimiento puede variar. Cuando la temperatura es mayor
que la óptima, el incremento promedio puede ir en descenso, o puede aumentar cuando
el inoculo original proviene de un cultivo a diferente temperatura. En la figura 3 se
10
puede diferenciar las curvas de crecimiento en medios solidificados con agar, para los
tipos definidos o indefinidos.
Figura 3. Curva de crecimiento de hongos en medio sólido: tipos indefinido y definido.
Para que no se presente una fase estacionaria o de adaptacion, el inoculo debe proceder
del mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones ambientales. Generalmente se
presenta la fase estacionaria, cuando esta es inoculada con esporas. El crecimiento
procede con cierta aceleración hasta llegar a establecerse el ritmo de crecimiento
intrínseco que es lineal, excepto cuando el crecimiento es una serie de ondas
comúnmente acompañadas de alternancia de micelio vegetativo y propagativo o
esporulante. En el tipo de crecimiento definido, se presentan las fases de desaceleración,
estancamiento, y a veces de decadencia. El retraso del crecimiento se debe muchas
veces a la acumulacion de metabolitos toxicos [18].
1.4.1.7. Clasificación por sus usos: hongos comestibles, hongos medicinales y
tóxicos.
Hongos comestibles. Los hongos comestibles son un pequeño grupo dentro un gran
reino Mycota o Fungi de la naturaleza. En este gran reino están incluidas alrededor
de una 70.000 especies de hongos, de las cuales aproximadamente 5.000 son
comestibles; ahora bien, aunque las especies comestibles son muy numerosas, en el
mundo solamente se han desarrollado a escala industrial seis especies que son por
supuesto las más conocidas; estas son: Lentinus edodes (shiitake), Agaricus bisporus
(Champiñon de parís), Volvariella volvaceae (hongo de la paja), Pleurotus spp.
11
(hongo ostra, Orellana), Auricularia spp (hongo oreja de los árboles), Flamulina
velutipes (hongo de invierno).
El renombre de los hongos se debe no solamente a su valor culinario, sino también a
su valor como fuente de proteína, vitaminas; podríamos decir que los hongos tienen
un contenido dos veces más alto que la mayoría de los vegetales. Los hongos son
también una fuente de minerales como potasio, fósforo calcio, magnesio, hierro y
cobre, además de ácido fólico [19].
Hongos medicinales. De todos los hongos los medicinales son los más interesantes,
más estudiados, y que más nos pueden ayudar con muchas de las enfermedades. Hay
una gran variedad de hongos que ayudan con toda clase de dolencias y enfermedades
graves como el cáncer, pero el principal factor que hace a los hongos una tan buena
solución medicinal y de prevención es el hecho que ayudan a moderar el sistema
inmune, lo que nos cura de todas las enfermedades, es una dieta balanceada y
saludable junto con abundantes hongos nos mantendrá sanos y felices.
Hongos tóxicos. Muchas especies de hongos producen metabolitos secundarios que
pueden ser tóxicos, que alteran la mente, antibióticos, antivirales. Aunque hay sólo
un pequeño número de especies mortales, varios otros pueden causar síntomas
particularmente graves y desagradables. Una defensa contra el consumo y la
destrucción prematura es la evolución de los productos químicos que hacen que el
hongo comestible, ya sea haciendo que el consumidor a vomitar la comida. Además,
debido a la propensión de los hongos para absorber metales pesados, incluidos los
que son radiactivos [20].
1.4.2. Bacterias. Grupo de microorganismos que carecen de una membrana celular
definida y tienen una pared celular de composición exclusiva. La mayoría de las
bacterias son unicelulares, y su forma puede ser esférica, bastón, espiral, con forma de
coma o en forma de sacacorchos. En general sus tamaños oscilan entre los 0,5 y los 5
micrómetros. Las bacterias se reproducen asexualmente por simple división celular [21].
12
1.5. Evaluación de un medio de cultivo
Para evaluar un medio de cultivo se utiliza la prueba de promoción de crecimiento o
productividad.
1.5.1. Productividad o Promoción de crecimiento de los medios de cultivo. La
productividad es la evaluación de la capacidad de un medio de cultivo de favorecer o
permitir el desarrollo de un microorganismo que tenga una reacción positiva he dicho
medio. [22].
La prueba de promoción de crecimiento analiza cada medio de cultivo de manera de
verificar la aptitud del mismo para su uso. Si el medio se prepara a partir de los
ingredientes analizar todos los lotes obtenidos. Si se trata de medios listos para usar,
asegurar la calidad de los mismos.
Este método puede reemplazarse por el método ecométrico o por el método Miles
Misra. Las colonias desarrolladas deben mostrar las características originales del
microorganismo [23].
El Método Ecométrico permite medir la productividad que es la capacidad de los
medios de cultivo para favorecer el crecimiento y desarrollo de un microorganismo, esta
característica se determina a través de la comparación que se realiza entre el medio por
evaluar y un medio control
Figura 4. Representación gráfica de marcaje y siembra en método ecométrico
13
Se debe realizar el mismo procedimiento tanto para el medio prueba como el medio de
referencia, al realizar esto se verifica la productividad del medio.
Para llevar a cabo la prueba de control de calidad de medios de cultivo (Método
Ecométrico), se usa como medio de referencia, aquel medio de cultivo cuya
composición sea muy completa y permita el crecimiento de un gran número de
microorganismos; tales medios pueden ser: Agar tripticasa de soya, Agar BHI, Agar
nutritivo, Agar Standard plate Count.
Se considera válida cualquier estría que tenga un crecimiento superior al 25 % de la
línea total, teniendo cada estría (Color Azul) un valor de 0,2 y la línea central (Color
Naranja) un valor de 1, por lo tanto el valor máximo para crecimiento en este ensayo es
de 5, y esto es denominado Índice de Crecimiento Absoluto (ICA). Por ello el Índice
de Crecimiento Absoluto indica la productividad del medio de prueba, para lo cual se
considera que (Véase Tabla 5) [24].
Tabla 5. Valores asignados para determinar la productividad de un medio de cultivo
ICA PRODUCTIVIDAD
4,5 – 5 ALTA
2,5 - 4,5 MEDIA
< 2,5 POCA
0 NO PRODUCTIVOS
Existe otro parámetro que se considera y es el Índice de Crecimiento Relativo (ICR) el
cual determina la capacidad que posee el medio de prueba para recuperar la flora,
respecto al medio de cultivo control.
Se determina aplicando la siguiente fórmula:
ICR =ICA(Prueba)
ICA (Control) (1)
14
Para realizar la prueba de promoción de crecimiento se utilizan los siguientes
microorganismos: [25].
Tabla 6. Requerimientos para realizar las pruebas de promoción de crecimiento
1.5.2. Cepas ATCC. Son herramientas indispensables en el control de calidad Interno
en microbiología.
1.5.2.1. Clasificación cepas ATCC
Cepas de Referencia. Las cepas de referencia deben obtenerse directamente de una
colección con la reseña nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido,
las mismas son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas. El número
máximo de repiques es de cuatro.
Cepas de Reserva. Son cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de
una cepa de referencia.
Cepas de Trabajo. Se obtienen por subcultivo de las cepas de reserva, se las
subcultivan en medios sólidos de enriquecimiento apropiados para cada
microorganismo. Nunca subcultivarlas para sustituir a las cepas de Reserva [26].
15
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Para la elaboración y evaluación del medio de cultivo sólido, el trabajo experimental se
dividió en tres partes. La primera consta de la caracterización de la quinua, la segunda
en la elaboración del medio a partir de la cocción de quinua, y la tercera en la
evaluación del medio mediante la prueba de promoción de crecimiento.
2.1. Diagrama de flujo del proceso
Figura 5. Diagrama de flujo con la descripción del proceso
Selección de la
quinua a utilizar
Caracterización:
Humedad, ceniza,
proteína, grasa,
fibra, carbohidratos
y calorías.
Obtención del
micelio del hongo
Lentinus spp.
Determinación de
los porcentajes de
quinua y extracto
de malta a utilizar.
Reproducción de la
cepa en los medios
formulados.
Determinación del
área de
crecimiento diario
Seleccionar el
medio óptimo
Variar el pH y
temperatura
Determinación del
área de crecimiento
diario
Obtención de las cepas ATCC:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli
Candida albicans, Aspergillus brasiliensis
Pseudomonas aeruginosa
Realizar la prueba
de promoción de
crecimiento
16
2.2. Proceso Experimental seleccionado
A partir de la bibliografía consultada se estableció la concentración de agar como
constante, siendo la concentración de agar óptima de 1,5 %p/v para que el medio
solidifique. Para la elaboración del medio se definieron los valores de pH y temperatura
constantes, siendo estas de 5,6 y 25 °C, en los porcentaje de quinua de 3; 6 y 9 %p/v y
en el porcentaje de extracto de malta de 0,5; 1,0 y 1,5 %p/v para 100ml de medio.
Además, una vez determinada la mejor combinación en la elaboración se cambiaron las
variables del proceso: el pH, temperatura, con la finalidad de ver si influencian en el
crecimiento del micelio, las mismas que serán de 3,5; 5,6 y 7 para el pH y 25 y 30 °C
para la temperatura.
2.3. Diseño Experimental
El objetivo del diseño experimental es determinar la cantidad óptima de quinua y
extracto de malta. Para lo cual, el diseño experimental consta de 9 diferentes ensayos a
pH y T constantes de 5,6 y 25°C respectivamente, luego a la combinación óptima se le
variará el pH y T, los que se detallan a continuación, en las Figuras 6 y 7:
Donde:
T1: Temperatura de crecimiento para el hongo Lentinus spp. a 25°C.
T2: Temperatura de crecimiento para el hongo Lentinus spp. a 30°C.
pH1, pH2, pH3: potencial de 5,6, potencial de 7, potencial de 3,5 respectivamente.
Q1: Concentración de quinua con respecto al medio 3%
Q2: Concentración de quinua con respecto al medio 6%
Q3: Concentración de quinua con respecto al medio 9%
EM1: Concentración de extracto de malta con respecto al medio 0,5%
EM2: Concentración de extracto de malta con respecto al medio 1%
EM3: Concentración de extracto de malta con respecto al medio 1,5%
R1, R2 y R3: Repetición 1, Repetición 2 y Repetición 3 respectivamente.
Q op: Concentración de quinua óptima con respecto al medio
EM op: Concentración de extracto de malta óptimo con respecto al medio
17
Figura 6. Diseño experimental para determinar las concentraciones óptimas de quinua y
extracto de malta a pH de 5,6 y T de 25 °C.
Micelio del
hongo
Lentinus spp.
T1
R1
Q1 ; EM1 R2
R3
R1
Q1 ; EM2 R2
R3
R1
Q1 ; EM3 R2
R3
R1
Q2 ; EM1 R2
R3
R1
Q2 ; EM2 R2
R3
R1
Q2 ; EM3 R2
R3
R1
Q3 ; EM1 R2
R3
R1
Q3 ; EM2 R2
R3
R1
Q3 ; EM3 R2
R3
pH1
18
Figura 7. Diseño experimental para determinar las condiciones óptimas de crecimiento
del hongo Lentinus spp.
Micelio del
hongo
Lentinus spp.
T1
T2
pH1
pH2
pH3
pH1
pH2
pH3
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
Q op, EM op
19
2.3.1. Parámetros fijos. Existen condiciones que se mantendrán fijas durante la
experimentación, que se detallan en la Tabla 7.
Tabla 7. Parámetros fijos definidos para la experimentación
Parámetro Fijo Valor
Concentración de agar 1,5 %p/v
2.3.2. Parámetros variables. Para aplicar el método experimental planteado se ha
considerado como variables independientes el potencial de hidrógeno del medio de
cultivo, la concentración de quinua y extracto de malta. Los valores de los niveles alto y
bajo se determinaron en referencia a bibliografía y experimentación previa.
Tabla 8. Valores considerados para la experimentación de los parámetros variables
Factor Niveles
Alto Bajo
pH 7 3,5
Concentración de quinua 9 % pq/vm 3 % pq/vm
Concentración de extracto de
malta 1,5 % pem/vm 0,5% pem/vm
20
2.4. Materiales y Equipos.
Cápsulas de aluminio
Cápsulas de porcelana
Balanza analítica (R: 220 g ; A± 0.0001 g)
Desecador
Estufa THELCO
Estufa MEMMERT ®
Pinza
Crisol
Cocineta
Sistema de extracción
Dedales de celulosa de 26 x 60 mm y un soporte para sostener 6 dedales.
Vasos de extracción de 60mm de alto
Núcleos de ebullición de vidrio esférico de 4mm de diámetro
Matraces Erlemeyers (R: 250 ml ; Ap: ± 50 ml)
(R: 500 ml ; Ap: ± 100 ml)
Bloque de digestión
Unidad de destilación
Bureta digital (R: 50 ml; Ap: ± 0,01 ml )
Bureta de vidrio (R: 50 ml; Ap: ± 0,1ml )
(R: 25 ml; Ap: ± 0,1 ml)
Licuadora Oster
Papel libre de nitrógeno
Probeta (R: 100 ml; Ap: ± 1 ml )
Papel filtro
Papel filtro cuantitativo
Calentador eléctrico
Cajas Petri (R: 40 ml ; D: 9 cm)
Asa de 1µL
Bisturís
Mango para bisturí
21
Ligas de caucho
Cámara de Flujo Laminar Biofase BBS-V1300
Parafilm M®
All-Purpose Laboratory Film
Mechero Fisher
Cofia
Guantes
Mascarilla
Reverbero Proctor-Silex 34101, 1000W
Malla de amianto (L: 15 cm; A: 15 cm )
Vasos de precipitación (R: 250 ml; Ap: ± 50 ml )
Autoclave Biobase Modelo BBS-V1300
Balanza Analítica mettler Toledo (R: 220 g ; Ap: ± 0,1 mg)
Varilla de agitación
Balones Aforados (R: 100 ml; Ap: ± 0,10 ml)
(R: 500 ml; Ap: ± 0,14 ml)
Tubos para muestra
Colador
Papel aluminio
Fundas autoclavables
Incubadora MEMMERT ® INCO med (R: 20 °C - 220 °C; Ap: ± 0,5 °C )
Fósforos
2.5. Sustancias y Reactivos
Quinua
Éter di etílico (C2H5)2O (L)
Ácido clorhídrico concentrado HCl (con.)
Agua destilada H2O(L)
Tabletas de catalizador de 5g
Solución de ácido bórico al 4% H3BO3(sol.)
Solución de hidróxido de sodio – tiosulfato de sodio NaOH-Na2S03 (sol.)
Ácido clorhídrico 0.1 N HCl (L)
22
Peróxido de hidrogeno 30% H2O2 (L)
Ácido sulfúrico concentrado H2SO4 (con.)
Ácido sulfúrico 1.25% H2SO4 (L)
Hidróxido de sodio 1.25% NaOH (L)
Agar
Agar papa dextrosa CRITERION ®
Agar Nutritivo DIFCOTM
Caldo de soya tripticasa DIFCOTM
Extracto de malta puro
Alcohol C2H5OH (sol.)
Citrato de sodio Na3C6H5O7 (s.)
Ácido cítrico C6H8O7 (s.)
2.6. Microorganismos
Lentinus spp.
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Candida albicans
Aspergillus brasiliensis
Escherichia coli
2.7. Procedimiento
2.7.1. Caracterización de la quinua. Para realizar la caracterización de la quinua
primero se prepara la muestra, la que consiste en triturar la muestra hasta lograr
partículas lo más finas posibles, trasvasar al recipiente de muestra correspondiente y
homogenizar bien la muestra mediante agitación antes de proceder a pesar.
23
2.7.1.1. Humedad
a) Colocar dos cápsulas de aluminio en una estufa a 130 ± 3 °C por alrededor de 30
minutos, transferir las cápsulas y colocarlas en un desecador hasta que se enfríe o
hasta que alcance la temperatura ambiente y pesarlas.
b) Pesar una cantidad de muestra bien mezclada entre 3 y 5 g en cada cápsula.
c) Coloque la cápsula con la muestra en una estufa por 1 hora a 130 ± 3 °C (el periodo
de una hora de secado empieza cuando la temperatura de la estufa es de 130 °C). Al
finalizar el tiempo de secado, transfiéralo a un desecador y pesar tan pronto como
alcance la temperatura ambiente, el ensayo se realiza por duplicado.
2.7.1.2. Cenizas
a) Preparación de la muestra: triturar la muestra hasta lograr partículas lo más finas
posibles, trasvasar al recipiente de muestra correspondiente y homogenizar bien la
muestra mediante agitación antes de proceder a pesar.
b) Colocar dos crisoles en una estufa a 130 ± 3 °C por alrededor de 30 minutos,
transferir las capsulas y colocarlas en un desecador hasta que se enfríe o hasta que
alcance la temperatura ambiente y pesarlas.
c) Pesar una cantidad de muestra bien mezclada de 1 a 3 g en cada crisol.
d) Coloque los crisoles con la muestra en una cocineta (al rojo leve) hasta obtener una
ceniza gris clara, o hasta tener peso constante.
e) Enfriar los crisoles en un desecador y pesarlos cuando alcance la temperatura
ambiente.
2.7.1.3. Proteína
a) Pesar entre 0,5 y 1 g de muestra homogenizada en papel libre de nitrógeno, se hace
bolita el papel con la muestra y se la transfiere a un tubo de digestión de 250 ml.
b) Colocar en el tubo de digestión 1 núcleo de ebullición y 1 tableta catalizadora
c) Colocar el tubo en una Sorbona, añadir 12 ml de H2SO4 concentrado y 2.5 ml de
H2O2 al 30 % con mucho cuidado, dejar que la reacción cese y colocar el tubo en el
bloque de digestión.
d) Digeste en rampa hasta llegar a 420 °C durante 30 minutos.
24
e) Retirar el tubo y dejar enfriar por aproximadamente 10 minutos, no permitir que
precipite, en caso de ocurrir volver a calentar.
f) Añadir cuidadosamente 50 ml de agua destilada.
g) Acoplar el tubo de digestión conteniendo el digestado diluido a la unidad de
destilación.
h) Colocar en el matraz colector 25 ml de solución de H3BO3 con el tubo del
condensador extendido por debajo de la superficie de la solución absorbente.
i) Destilar con vapor durante 4 minutos en el destilador automático (la solución
colectora se vuelve verde por el NH3 liberado)
j) Retire el tubo de digestión y el matraz colector.
k) Titular la solución absorbente con solución 0.1 N de HCl hasta el punto final de color
gris neutro y registre el volumen de ácido requerido.
2.7.1.4. Fibra. Para determinar fibra la muestra tiene que estar deshidratada, por esta
razón se toma la muestra en la que se determinó la humedad.
a) Pesar una porción bien mezclada de 0.5 a 2 g de muestra previamente deshidratada
en un Erlenmeyer de 250 ml, añadir 100ml de ácido sulfúrico 1,25 %, hervir por 30
minutos cuidando que no se forme espuma y de desborde, filtrar y lavar con agua
bien caliente hasta ausencia de asido.
b) Transferir el residuo del papel al Erlenmeyer original y añadir 100 ml de NaOH
1.25%, hervir nuevamente por 30 minutos teniendo cuidado.
c) Filtrar en papel filtro cuantitativo previamente tarado y pesado, lavar con agua
caliente hasta ausencia de hidróxido.
d) Una vez completado el lavado llevar el papel filtro y su contenido a la estufa, secar
por 45 minutos, enfriar en el desecador por 5 minutos y pesar.
2.7.1.5. Grasa
a) Pesar en un Erlenmeyer de 500 ml, entre 3 y 5 g de muestra, añadir 60 ml de ácido
clorhídrico concentrado y 70 ml de agua destilada.
b) Someter a hidrólisis mediante calentamiento a partir de que comienza a hervir
durante 30 minutos, todo el tratamiento realizar dentro de la Sorbona.
25
Para realizar la filtración se realiza lo siguiente.
c) Después de la hidrólisis se retira el Erlenmeyer de la cocineta.
d) Proceder a filtrar la muestra, sobre papel filtro debidamente doblado y previamente
humedecido para evitar perdida de la muestra.
e) Colocar agua caliente en el Erlenmeyer y verter sobre el papel filtro para evitar
perdida de muestra.
f) Lavar la muestra retenida en el papel filtro hasta ausencia total de ácido
(aproximadamente 500 ml de agua caliente).
g) Una vez concluido el lavado se procede a retirar con cuidado el papel filtro y se
coloca en una cápsula, se coloca en la estufa por 40 minutos a 130 ºC.
Para realizar la extracción se realizar lo siguiente:
h) Pesar exactamente un vaso de extracción, previamente lavado y secado a 130 ºC por
lo menos 1 hora.
i) Encender el extractor de grasa y abrir el flujo de agua del condensador.
j) Adherir a la columna de extracción el capuchón que contiene la muestra.
k) Añadir suficiente éter di etílico dentro del vaso para cubrir el capuchón cuando estén
en posición de inmersión.
l) Colocar el vaso debajo de la columna de extracción y fijarlos en el lugar
correspondiente cerrando el equipo con la palanca prevista.
m) Colocar las columnas de extracción en la posición de inmersión y asegurarse de que
los dedales se encuentren sumergidos en el solvente y hervir por 25 minutos.
n) Cuando ha transcurrido los 25 minutos levantar los capuchones y colocar en la
posición de lavado y extraer en esta posición por 30 minutos.
o) Después de corridos los 30 minutos cerrar las llaves de las columnas de extracción
para recuperar la mayor cantidad de solvente y alcanzar la sequedad aparente en el
vaso.
p) Remover el vaso de extracción del extractor de grasa y colocar en la estufa a 130 ºC
por 1 minuto, se lo saca y se lo coloca en el desecador por 30 minutos.
q) Tomar el peso del vaso más la grasa.
26
2.7.2. Elaboración del medio de cultivo
2.7.2.1. Elaboración del medio de cultivo a partir de la cocción de quinua
a) En base a la concentración estándar de agar en medios de cultivo se preparan todas
las siguientes muestras de medio con la misma concentración (1,5 %pa /vm).
b) Las muestras se preparan en base a las combinaciones porcentaje quinua y porcentaje
extracto de malta, obtenidas de un cálculo previo en base al PDA (carbohidratos y
azúcar), la cual se tomó como referencia para determinar un valor inferior y otro
superior de combinaciones. (nueve muestras diferentes con dos repeticiones).
c) Se pesa la cantidad de quinua establecida en un vaso de precipitación, se colocan 250
ml de agua, se hace hervir durante 30 minutos y se filtra.
d) Se toman 100 ml de la cocción de quinua, se coloca la cantidad de extracto de malta
establecida y se homogeniza la mezcla con un agitador.
e) A la mezcla se le ajusta el pH a 5,6 con una solución buffer.
f) Se coloca 15 g de agar a la mezcla y se lo disuelve en un reverbero.
g) Se toman 27 cajas petri de vidrio de 9 cm de diámetro y las muestras de medio
preparadas se colocan en frascos Erlenmeyer, se esterilizan en el autoclave a 1.5
bares manométricos, 121 ºC por 20 minutos.
h) Se dispensa 20 ml las muestras de medio en las cajas petri y se las deja solidificar.
i) Se siembra 0,5 cm2 del hongo (Lentinus spp.) en cada una de las cajas, se las
identifica con un nombre y se las sella con parafilm.
j) Colocar las cajas en la incubadora a 25 ºC.
k) Se determina el área de crecimiento micelial (cm2) de cada una de las cajas cada día
utilizando el programa photoshop hasta que el micelio colonice toda la caja,
mediante una foto tomada con una estructura metálica.
2.7.2.2. Cambio de pH y Temperatura a la combinación óptima de la elaboración.
a) Se selecciona el medio de cultivo óptimo de la elaboración anterior y preparar 120
ml, con un pH a 5,6.
b) Se toman 6 cajas petri de vidrio de 9 cm de diámetro y el medio preparado se coloca
en un frasco Erlenmeyer, se esterilizan en el autoclave a 1.5 bares manométricos, 121
ºC por 20 minutos.
27
c) Se dispensa el medio en las cajas petri y se siembra el hongo (Lentinus spp.) como se
había indicado anteriormente.
d) Colocar 3 cajas petri a 25 ºC y las otras 3 a 30 ºC.
e) Repetir el procedimiento a un pH de 3,5 y otro de 7.
2.7.3. Evaluación del medio de cultivo
2.7.3.1. Método Ecométrico
Figura 8. Diagrama de flujo para el método ecométrico.
Sembrar previamente el
microorganismo en el
caldo soya tripticasa e
incubar durante 18 – 24
horas a 37 °C.
Dividir la base de las cajas Petri en
cuatro cuadrantes y marcar cada
uno de estos como 1,2,3,4, trazar
cinco estrías en cada uno de ellos y
una línea en la intersección de los
cuadrantes (Ver Fig 4).
Disponer el medio
prueba y medio control
(en sus respectivas
cajas ya autoclavados y
esperar a que
solidifique.
Con un asa calibrada de 0,1 ml
tomar muestra del cultivo y
proceder a sembrar de acuerdo a la
secuencia de rotulado de la caja
1,2,3,4 sin volver a tomar inóculo,
realizando estrías en forma paralela
a las dibujadas en la base de la caja
Petri, por último, sembrar la línea
central (Ver Fig 4).
Incubar a la temperatura,
atmósfera y tiempo
indicado, según sea el
microorganismo
Transcurrido el tiempo de
incubación, realizar lectura de
resultados
28
2.8. Datos Experimentales
2.8.1. Caracterización de la quinua
Tabla 9. Datos para la caracterización de la quinua
Humedad
peso de la muestra, g peso cápsula, g peso cápsula +
muestra seca
m1= 3,3107 5,6939 8,5988
m2= 3,2864 5,5814 8,4639
Ceniza
peso de la muestra, g peso crisol vacío,
g
peso crisol+ceniza,
g
m1= 1,6 19,52 19,5576
m2= 1,479 16,6554 16,6896
Proteínas Vol HCl, ml 10,13
Conc. HCl, N 0,1024
Grasa peso muestra, g
peso vaso de
extracción
después de
secado, g
peso vaso de
extracción antes de
la extracción, g
m1= 3,5302 73,1355 72,8608
Fibra peso de la muestra, g
peso papel vacío,
g
peso papel + fibra,
g
m1= 0,3204 0,8622 0,9375
29
2.8.2. Área de crecimiento del hongo Lentinus spp., en medios formulados y PDA
Tabla 10. Área de crecimiento del hongo Lentinus spp.
qu
inu
a, g
extra
cto
de m
alta
, g
Nº R
epetició
n
Área de crecimiento del hongo Lentinus spp., cm2
Día
0 1 2 3 4 7 8 9 10 11
3 0.5
1 0,50 0,50 1,82 4,35 10,00 44,01 63,62 ----- ----- -----
2 0,50 0,50 1,70 4,39 10,28 42,72 63,62 ----- ----- -----
3 0,50 0,50 1,59 4,05 10,16 46,84 63,62 ----- ----- -----
3 1
1 0,50 0,50 1,28 3,63 8,16 32,57 40,15 44,99 52,95 63,62
2 0,50 0,50 1,04 4,39 8,47 31,41 39,53 45,75 53,08 63,62
3 0,50 0,50 1,43 4,03 7,57 31,86 37,32 45,87 53,74 63,62
3 1.5
1 0,50 0,50 1,48 3,59 7,00 25,72 32,06 43,69 50,27 63,62
2 0,50 0,50 1,13 2,75 6,72 28,78 35,92 43,17 48,19 63,62
3 0,50 0,50 1,17 3,43 7,53 30,00 36,01 43,43 54,00 63,62
6 0.5
1 0,50 0,50 1,38 3,62 7,53 25,22 31,23 38,48 51,68 63,62
2 0,50 0,50 1,40 3,53 7,21 25,95 32,06 38,26 51,94 63,62
3 0,50 0,50 1,72 3,88 7,83 27,99 33,16 43,94 52,65 63,62
6 1
1 0,50 0,50 1,46 4,75 9,81 36,08 45,83 53,45 63,62 -----
2 0,50 0,50 1,38 4,09 9,19 35,49 46,17 53,19 63,62 -----
3 0,50 0,50 1,45 4,48 9,24 34,76 43,68 53,46 63,62 -----
6 1.5
1 0,50 0,50 1,69 5,16 8,54 37,64 47,62 63,62 ----- -----
2 0,50 0,50 1,31 4,76 9,02 36,41 47,81 63,62 ----- -----
3 0,50 0,50 1,28 4,49 7,91 36,53 46,92 63,62 ----- -----
9 0.5
1 0,50 0,50 1,48 4,47 8,80 33,32 35,28 48,71 52,92 63,62
2 0,50 0,50 1,37 4,61 8,95 30,59 36,37 32,55 53,20 63,62
3 0,50 0,50 1,61 4,48 8,30 30,00 34,68 47,94 50,52 63,62
9 1
1 0,50 0,50 1,50 5,03 9,74 30,54 37,12 44,31 53,92 63,62
2 0,50 0,50 1,52 5,18 10,01 30,74 39,22 44,27 53,73 63,62
3 0,50 0,50 1,57 5,98 9,98 30,67 38,10 43,46 53,62 63,62
9 1.5
1 0,50 0,50 1,59 4,91 10,40 30,54 37,57 45,66 63,62 -----
2 0,50 0,50 1,62 4,72 9,98 30,54 37,80 45,91 63,62 -----
3 0,50 0,50 1,34 4,70 9,54 28,80 35,57 45,66 63,62 -----
PDA
1 0,50 0,50 1,28 4,90 9,24 23,69 28,00 35,16 44,78 63,62
2 0,50 0,50 1,23 3,56 8,60 23,37 28,08 36,90 44,66 63,62
3 0,50 0,50 1,71 4,73 8,26 23,73 27,67 34,69 45,91 63,62
30
De la tabla anterior se determinó la mejor combinación, siendo de 3 g de quinua y 0,5 g
de extracto de malta, a la que se le varió el pH y la temperatura, para determinar la
influencia en el crecimiento del hongo Lentinus spp.
2.8.3. Área de crecimiento del hongo Lentinus spp., a diferente temperatura y pH
en el medio de cultivo formulado óptimo.
Tabla 11. Área de crecimiento a diferente temperatura y pH
Tem
pera
tura
pH
Nº R
epetició
n
Área de crecimiento del hongo Lentinus spp., cm2
Día
0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14 15
25
5,6
1 0,50 0,50 1,82 4,35 10,00 44,01 63,62 ---- ---- ---- ---- ----
2 0,50 0,50 1,70 4,39 10,28 42,72 63,62 ---- ---- ---- ---- ----
3 0,50 0,50 1,59 4,05 10,16 46,84 63,62 ---- ---- ---- ---- ----
7
1 0,50 0,50 0,96 3,84 7,78 33,83 45,82 63,62 ---- ---- ---- ----
2 0,50 0,50 1,01 3,27 7,27 35,78 49,23 63,62 ---- ---- ---- ----
3 0,50 0,50 1,05 4,24 8,67 32,08 47,24 63,62 ---- ---- ---- ----
3,5
1 0,50 0,50 1,48 2,07 3,62 13,03 17,57 20,52 26,61 30,42 58,11 63,62
2 0,50 0,50 1,65 1,61 3,13 11,73 15,76 19,85 26,72 30,55 54,65 63,62
3 0,50 0,50 1,56 1,77 3,71 12,66 16,40 20,03 23,83 29,51 52,46 63,62
30
5,6
1 0,50 0,50 3,67 9,17 20,88 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
2 0,50 0,50 3,39 7,12 17,57 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
3 0,50 0,50 3,79 8,97 18,10 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
7
1 0,50 0,50 4,37 14,54 27,78 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
2 0,50 0,50 4,80 14,71 27,62 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
3 0,50 0,50 3,93 13,64 27,62 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
3,5
1 0,50 0,50 5,35 18,58 32,56 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
2 0,50 0,50 4,61 16,88 33,33 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
3 0,50 0,50 5,08 17,75 32,40 63,62 ---- ---- ---- ---- ---- ----
31
3. CÁLCULOS Y RESULTADOS
3.1. Cálculos
3.1.1. Cálculos para la caracterización
3.1.1.1. Cálculo modelo de la humedad
𝒉𝒖𝒎𝒆𝒅𝒂𝒅% =(𝑩−𝑪)∗𝟏𝟎𝟎
𝑨 (2)
𝒉𝒖𝒎𝒆𝒅𝒂𝒅% =(8.5988−5.5939)∗100
3.3107 (3)
𝒉𝒖𝒎𝒆𝒅𝒂𝒅% = 12,28
Siendo
A = gramos de muestra pesados
B = peso, en gramos, de la cápsula más muestra húmeda, y
C = peso, en gramos, de la cápsula más muestra seca.
3.1.1.2. Cálculo modelo de cenizas
𝒄𝒆𝒏𝒊𝒛𝒂% =(𝑩−𝑪)∗𝟏𝟎𝟎
𝑨 (4)
𝒄𝒆𝒏𝒊𝒛𝒂% =(19.5576−19.5200)∗100
1.6000 (5)
𝒄𝒆𝒏𝒊𝒛𝒂% = 2.35
Siendo
A = gramos de muestra pesados
B = peso, en gramos, del crisol más cenizas, y
C = peso, en gramos, del crisol vacío.
Reporte la ceniza como % en peso, con respecto a la muestra original.
32
3.1.1.3. Cálculo de proteína
%𝑵 =𝑉𝐴∗𝑂.𝑂14∗𝑁∗100
𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (6)
%𝑵 =10.13∗𝑂.𝑂14∗0.1024∗100
0.6223 (7)
%𝑵 = 𝟐. 𝟑𝟑
% 𝑷𝒓𝒐𝒕𝒆𝒊𝒏𝒂 = %𝑁 ∗ 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 (8)
% 𝑷𝒓𝒐𝒕𝒆𝒊𝒏𝒂 = 2.33 ∗ 6.25 (9)
% 𝑷𝒓𝒐𝒕𝒆𝒊𝒏𝒂 = 14.59
Siendo
VA= volumen de solución estándar de HCl requerida para la muestra
0.014 = peso mili equivalente de Nitrógeno
N= normalidad de la solución de HCl estandarizada; y
Factor de proteína: 6.25
Reporte la proteína como % en peso, con respecto a la muestra original.
3.1.1.4. Cálculo de grasa
𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂% =(𝑩−𝑪)∗𝟏𝟎𝟎
𝑨 (10)
𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂% =(73.1355−72.8608)∗100
3.5302 (11)
𝒈𝒓𝒂𝒔𝒂% = 7.8
Siendo
A = gramos de muestra pesados
B = peso, en gramos, del vaso de extracción después de secado, y
C = peso, en gramos, del vaso de extracción antes de la extracción.
33
3.1.1.5. Cálculo de fibra
𝒇𝒊𝒃𝒓𝒂 % =((𝑃𝑎𝑝+𝑓𝑖𝑏𝑟𝑎)−(𝑃𝑎𝑝 𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜))∗100
𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (12)
𝒇𝒊𝒃𝒓𝒂 % =(0.9375−0.8622)∗100
0.3204 (13)
𝒇𝒊𝒃𝒓𝒂 % = 23.50
3.1.1.6. Cálculo de carbohidratos
% 𝒄𝒂𝒓𝒃𝒐𝒉𝒊𝒅𝒓𝒂𝒕𝒐𝒔 = 100 − ( %ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 + %𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 + %𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 + %𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎) (14)
% 𝒄𝒂𝒓𝒃𝒐𝒉𝒊𝒅𝒓𝒂𝒕𝒐𝒔 = 100 − ( 12.28 + 2.33 + 14.59 + 7.80) (15)
% 𝒄𝒂𝒓𝒃𝒐𝒉𝒊𝒅𝒓𝒂𝒕𝒐𝒔 = 63
3.1.1.7. Cálculo de calorías
𝒄𝒂𝒍𝒐𝒓í𝒂𝒔 = 4𝑘𝑐𝑎𝑙 ∗ %𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 + 4𝑘𝑐𝑎𝑙 ∗ %𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 + 9 ∗ %𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 (16)
𝒄𝒂𝒍𝒐𝒓í𝒂𝒔 = 4𝑘𝑐𝑎𝑙 ∗ 63 + 4𝑘𝑐𝑎𝑙 ∗ 14.59 + 9 ∗ 7.80 (17)
𝒄𝒂𝒍𝒐𝒓í𝒂𝒔 = 380.56𝑘𝑐𝑎𝑙/100𝑔
3.1.2. Cálculo de la cantidad de quinua y extracto de malta para realizar la
elaboración en base a carbohidratos.
3.1.2.1. Cálculo de la cantidad de quinua. Para determinar la cantidad de
carbohidratos de quinua que se utilizaran en la elaboración, se tomará como referencia
la cantidad de carbohidratos de la papa en 100 ml de medio.
Si para preparar 1L de PDA se utiliza 200 g de papa, para 100 ml se utilizaran 20 g,
para lo cual se tomará como referencia el valor de la tabla 4.
100 𝑔 𝑝𝑎𝑝𝑎 ↔ 19,31 𝑔 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠
20 𝑔 𝑝𝑎𝑝𝑎 ↔ 𝑥
𝒙 =19,31∗20
100 (18)
𝒙 = 3,862 𝑔 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠
34
Determinación de la cantidad de quinua a utilizar
63 𝑔 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 ↔ 100 𝑔 𝑞𝑢𝑖𝑛𝑢𝑎
3,862 𝑔 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 ↔ 𝑦
𝒚 =3,862∗100
63 (19)
𝒚 = 𝟔, 𝟏 g de quinua
3.1.2.2. Cálculo de la cantidad de extracto de malta. En la elaboración de PDA se
utiliza dextrosa y para la elaboración en el medio a partir de quinua se utilizará extracto
de malta puro, se tomará como referencia la cantidad de 100 ml.
Para realizar el cálculo se basó en la estructura molecular de los 2 azúcares.
𝑫𝒆𝒙𝒕𝒓𝒐𝒔𝒂: 𝒎𝒐𝒏𝒐𝒔𝒂𝒄𝒂𝒓𝒊𝒅𝒐 → 𝟐 𝒈
𝑴𝒂𝒍𝒕𝒂𝒔𝒂: 𝟐 𝒎𝒐𝒏𝒐𝒔𝒂𝒄𝒂𝒓𝒊𝒅𝒐𝒔 → 𝒛
𝒛 =𝟐∗𝟐
𝟏 (20)
𝒛 = 𝟏 𝐠 de extracto de malta
3.1.2.3. Cálculo promedio del área de crecimiento micelial del hongo Lentinus spp.
�̅� =𝑹𝟏+𝑹𝟐+𝑹𝟑
𝟑 (21)
Donde
R1, R2 y R3 son repeticiones 1,2 y 3 respectivamente
Cálculo modelo de 3 g de quinua, 0,5 g de extracto de malta al segundo día.
�̅� =1,82+1,70+1,59
3 (22)
�̅� = 1,70 cm2
35
3.1.3. Cálculos para la evaluación del medio de cultivo.
3.1.3.1. Cálculo del Índice de crecimiento absoluto (ICA)
𝐈𝐂𝐀 = ∑ 𝐄𝐬𝐭𝐫𝐢𝐚𝐬𝟏,𝟐,𝟑,𝟒 ∗ 𝟎, 𝟐 + 𝐥í𝐧𝐞𝐚 𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐚𝐥 (23)
Donde
Línea central = 1 , cuando hay crecimiento
Línea central = 0 , cuando no hay crecimiento
Cálculo modelo para la cepa Escherichia coli del medio prueba.
𝐈𝐂𝐀 = 𝟐𝟎 ∗ 𝟎, 𝟐 + 𝟏 (24)
𝐈𝐂𝐀 = 5
3.1.3.2. Cálculo del Índice de crecimiento relativo (ICR)
𝐈𝐂𝐑 =𝐈𝐂𝐀 (𝐩𝐫𝐮𝐞𝐛𝐚)
𝐈𝐂𝐀 (𝐜𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥) (25)
Cálculo modelo para la cepa Escherichia coli.
𝐈𝐂𝐑 =5
5 (26)
𝐈𝐂𝐑 = 1
3.1.4. Análisis estadístico. El análisis estadístico se efectuó mediante el programa
estadístico SPSS, en el cual se realizó el análisis de la varianza con un factor (ANOVA),
el mismo que se basa en las siguientes expresiones lógicas.
𝐹𝑆 =𝑇′
𝐸 (29)
𝐻0: 𝑆𝑎2 = 𝑆𝑏
2 𝐻𝑎: 𝑆𝑎2 ≠ 𝑆𝑏
2 (30)
36
Si S > 0.05 se acepta H0 ; Si Si S ≤ 0.05 se acepta Ha (31)
Siendo
FS = Estadístico para la distribución F
𝑺𝒂𝟐 = Varianza para la variable a
𝑺𝒃𝟐 = Varianza para la variable b
H0 = Hipótesis nula. (El área de crecimiento micelial del hongo Lentinus spp. no puede
crecer en menor tiempo en un medio formulado a partir de quinua, extracto de malta y
agar que en el medio agar papa dextrosa)
Ha = Hipótesis alternativa. (El área de crecimiento micelial del hongo Lentinus spp.
puede crecer en menor tiempo en un medio formulado a partir de quinua, extracto de
malta y agar que en el medio agar papa dextrosa)
S = Significación del análisis de varianza.
3.2. Resultados
3.2.1. Resultados de la caracterización de la quinua. En la tabla 12 se muestran los
resultados obtenidos de la caracterización de la quinua.
Tabla 12. Resultados de la caracterización de la quinua.
Composición de la quinua
Humedad (g/100g) 12,28
Ceniza (g/100g) 2,33
Proteína (g/100g) 14,59
Grasa (g/100g) 7,80
Fibra (g/100g) 23,50
Carbohidratos (g/100g) 63
Calorías (kcal/100g) 380,56
37
3.2.2. Resultados área de crecimiento
Tabla 13. Resultados del área de crecimiento promedio del hongo Lentinus spp., en la
elaboración y en medio PDA.
qu
inu
a, g
extra
cto
de
malta
, g
Área de crecimiento promedio, cm2
Día
0 1 2 3 4 7 8 9 10 11
3 0,5 0,50 0,50 1,70 4,26 10,15 44,52 63,62 ---- ---- ----
3 1 0,50 0,50 1,25 4,02 8,06 31,95 39,00 45,54 53,26 63,62
3 1,5 0,50 0,50 1,26 3,26 7,08 28,17 34,66 43,43 50,82 63,62
6 0,5 0,50 0,50 1,50 3,67 7,53 26,39 32,15 40,23 52,09 63,62
6 1 0,50 0,50 1,43 4,44 9,42 35,45 45,23 53,37 63,62 ----
6 1,5 0,50 0,50 1,43 4,80 8,49 36,86 47,45 63,62 ---- ----
9 0,5 0,50 0,50 1,49 4,52 8,68 31,30 35,45 43,06 52,21 63,62
9 1 0,50 0,50 1,53 5,39 9,91 30,65 38,15 44,01 53,76 63,62
9 1,5 0,50 0,50 1,51 4,78 9,98 29,96 36,98 45,75 63,62
PDA 0,50 0,50 1,41 4,39 8,70 23,59 27,92 35,58 45,12 63,62
En la figura 9 se representa el área de crecimiento del hongo Lentinus ssp., en función
del tiempo para las diferentes concentraciones de quinua y extracto de malta
Figura 9. Hongo Lentinus spp. – Área de crecimiento = f (Días de ensayo), para la
elaboración.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Áre
a d
e cr
ecim
ien
to (
cm2)
Tiempo (días)
Lentinus spp. – Área de crecimiento = f (Días de
ensayo).
3;0,5 3;1 3;1,5 6;0,5 6;1
6;1,5 9;0,5 9;1 9;1,5
38
Tabla 14. Área de crecimiento promedio del hongo Lentinus spp. a diferentes
temperaturas y pH con las concentraciones óptimas.
Tem
pera
tura
Ph
Área de crecimiento promedio del hongo Lentinus spp., cm2
Día
0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14 15
25
5,6 0,50 0,50 1,70 4,26 10,15 44,52 63,62
7 0,50 0,50 1,01 3,78 7,90 33,89 47,43 63,62
3,5 0,50 0,50 1,56 1,82 3,49 12,47 16,57 20,13 25,72 30,16 55,07 63,62
30
5,6 0,50 0,50 3,62 8,42 18,85 63,62
7 0,50 0,50 4,37 14,30 27,67 63,62
3,5 0,50 0,50 5,01 17,74 32,76 63,62
En la figura 10 se representa el área de crecimiento del hongo Lentinus ssp., en función
del tiempo para los diferentes pH a 25°C.
Figura 10. Hongo Lentinus spp.-Área de crecimiento = f (Días de ensayo) a 25 °C
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
dia 0 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 7 dia 8 dia 9 dia 10 dia 11 dia 14 dia 15
63,62 63,62
0,50
63,62
Áre
a (
cm2)
Lentinus spp.-Área de crecimiento = f (Días de ensayo)
a 25 °C
pH=5,6 pH=7 pH=3,5
39
En la figura 11 se representa el área de crecimiento del hongo Lentinus ssp., en función
del tiempo para los diferentes pH a 30°C.
Figura 11. Hongo Lentinus spp.-Área de crecimiento = f (Días de ensayo) a 30 °C
3.2.3. Resultados de la evaluación del medio. A continuación se indican los
resultados obtenidos del índice de crecimiento absoluto y productividad del medio
control, siendo este el agar nutritivo.
Tabla 15. Índice de crecimiento absoluto y Productividad en Agar Nutritivo
Cepa ATCC ICA Productividad
Staphylococcus aureus 25923 5 Alta
Pseudomonas aeruginosa 9027 5 Alta
Escherichia coli 25922 5 Alta
Candida albicans 10231 4,2 Media
Aspergillus brasiliensis 16404 3,2 Media
A continuación se indican los resultados obtenidos del índice de crecimiento absoluto y
productividad del medio de prueba, siendo este 3 g de quinua y 0,5 g de extracto de
malta.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
dia 0 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 7
Áre
a (
cm2)
Lentinus spp.-Área de crecimiento = f (Días de ensayo)
a 30 °C
pH=5,6
pH=7
pH=3,5
40
Tabla 16. Índice de crecimiento absoluto y Productividad Medio de Prueba
Cepa ATCC ICA Productividad
Staphylococcus aureus 25923 5 Alta
Pseudomonas
aeruginosa 9027 5 Alta
Escherichia coli 25922 5 Alta
Candida albicans 10231 5 Alta
Aspergillus
brasiliensis 16404 3,6 Media
A continuación se indican los resultados obtenidos del índice de crecimiento absoluto y
productividad del medio agar papa dextrosa (PDA)
Tabla 17. Índice de crecimiento absoluto y Productividad Medio PDA
Cepa ATCC ICA Productividad
Staphylococcus aureus 25923 4,4 Media
Pseudomonas
aeruginosa 9027 3,2 Media
Escherichia coli 25922 3,6 Media
Candida albicans 10231 5 Alta
Aspergillus
brasiliensis 16404 5 Alta
Tabla 18. Resultados del índice de crecimiento relativo (ICR) entre el Medio formulado
y Agar Nutritivo.
Cepa ICR
Staphylococcus aureus 1
Pseudomonas aeruginosa 1
Escherichia coli 1
Candida albicans 1,2
Aspergillus brasiliensis 1,125
41
Tabla 19. Resultados del índice de crecimiento relativo (ICR) entre el medio formulado
y PDA.
Cepa ICR
Staphylococcus aureus 1,14
Pseudomonas aeruginosa 1,6
Escherichia coli 1,4
Candida albicans 1
Aspergillus brasiliensis 0,72
3.3. Análisis estadístico
En las siguientes tablas se presentan los resultados obtenidos para el análisis estadístico
de los resultados, en los cuales se muestra: la suma de cuadrados, los grados de libertad
(gl), la media cuadrática, el factor de Fisher (F) y la significancia (Sig)
3.3.1. Análisis estadístico para la elaboración del medio. Para realizar el análisis
estadístico se tomaron los datos del día 7 de la tabla 10, ya que estos datos permitieron
identificar de manera clara la relación existente entre las combinaciones.
Tabla 20. Análisis estadístico de área de crecimiento del hongo Lentinus spp., en
función de quinua y extracto de malta.
Suma de
cuadrados gl
Media
Cuadrática F Sig.
Quinua 81,056 2 40,528 21,763 ,000
Extracto Malta 26,321 2 13,161 7,067 ,005
Quinua * Extracto Malta 610,108 4 152,527 81,905 ,000
a. R2 = 0,955 (R
2 corregido = 0,936)
42
Tabla 21. Test HSD de Tukey de la interrelación quinua-extracto de malta en la
elaboración.
Quinua_extracto de
malta
N de
casos
Subgrupos para alfa = 0,05
1 2 3 4 5
6 g quinua - 0.5 g malta 3 26,3867 ___ ___ ___ ___
3 g quinua - 1.5 g malta 3 28,1667 28,1667 ___ ___ ___
9 g quinua - 1.5 g malta 3 29,9600 29,9600 ___ ___ ___
9 g quinua - 1.0 g malta 3 ___ 30,6500 ___ ___ ___
9 g quinua - 0.5 g malta 3 ___ 31,3033 ___ ___ ___
3 g quinua - 1.0 g malta 3 ___ 31,9467 31,9467 ___ ___
6 g quinua - 1.0 g malta 3 ___ ___ 35,4433 35,4433 ___
6 g quinua - 1.5 g malta 3 ___ ___ ___ 36,8600 ___
3 g quinua - 0.5 g malta 3 ___ ___ ___ ___ 44,5233
Sig. __ ,088 ,062 ,100 ,927 1,000
3.3.2. Análisis estadístico a diferentes condiciones de pH y temperatura. Para
realizar el análisis estadístico se tomaron los datos del día 4 de la tabla 11, ya que en el
día 7 colonizaron tres de las muestras y no se pudo observar claramente los resultados.
Tabla 22. Análisis estadístico de área de crecimiento del hongo Lentinus spp a
diferentes condiciones de pH y temperatura.
Fuente Suma de cuadrados gl Media Cuadrática F Sig.
Temperatura 1667,379 1 1667,379 2471,622 ,0000
pH 48,118 2 24,059 35,664 ,0000
Temperatura * pH 318,087 2 159,043 235,756 ,0000
R2 = 0,996 (R
2 corregido =0 ,994)
43
Tabla 23. Test HSD de Tukey de la interrelación temperatura-pH.
Temperatura_pH N de
casos
Subgrupos para alfa = 0,05
1 2 3 4 5
25 ºC - 3.5 3 3,4851 ____ ____ ____ ____
25 ºC - 7.0 3 ____ 7,9048 ____ ____ ____
25 ºC - 5.6 3 ____ 10,1490 ____ ____ ____
30 ºC - 5.6 3 ____ ____ 18,8510 ____ ____
30 ºC - 7.0 3 ____ ____ ____ 27,6738 ____
30 ºC - 3.5 3 ____ ____ ____ ____ 32,7615
Sig. ___ 1,000 ,051 1,000 1,000 1,000
3.4. Comparación de resultados del agar papa dextrosa (PDA) y el medio
formulado.
3.4.1. Área de crecimiento del medio formulado y PDA. En la figura 12 se
representa el área de crecimiento del hongo Lentinus ssp., en función del tiempo para las
concentraciones de quinua y extracto de malta óptimas y el PDA.
Figura 12. Hongo Lentinus spp. - Área de crecimiento = f (Días de ensayo) en medio
óptimo y PDA.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Áre
a d
e cr
ecim
ien
to (
cm2)
Tiempo (días)
Área de crecimiento = f (Días de ensayo)
3;0.5 PDA
44
3.4.2. Productividad de los tres medios: medio formulado, agar nutritivo, PDA.
Tabla 24. Productividades del medio prueba y dos medios de control
Cepa
Productividad
3 g quinua; 0,5 g
extracto de malta
Agar
Nutritivo PDA
Staphylococcus aureus Alta Alta Media
Pseudomonas aeruginosa Alta Alta Media
Escherichia coli Alta Alta Media
Candida albicans Alta Media Alta
Aspergillus brasiliensis Media Media Alta
3.4.3. Índice de crecimiento relativo
Tabla 25. Índices de crecimiento relativo del medio prueba y dos medios de control
Cepa
ICR
medio prueba
/Agar nutritivo
medio prueba
/PDA
Staphylococcus aureus 1 12,5
Pseudomonas aeruginosa 1 1,6
Escherichia coli 1 1,4
Candida albicans 1,2 1
Aspergillus brasiliensis 1,125 0,72
45
4. DISCUSIÓN
Al caracterizar la quinua, se pudo determinar que los componentes de la quinua son
mayores en relación a los de la papa, en cuanto a los carbohidratos y la proteína son
3,3 y 7,7 veces más que los de la papa, respectivamente.
Para preparar 100 ml de agar papa dextrosa se utilizan 200 g de papa y 20 g de
dextrosa, mientras que para preparar el mismo volumen a partir de quinua se utilizan
3 g de quinua y 0,5 g de extracto de malta.
En las 9 combinaciones de concentración de quinua y extracto de malta, se logró
identificar que el tipo de curva es indefinida en todas las combinaciones (Véase
figura 9) y el menor tiempo en colonizar la caja fue de 8 días, mientras que el mayor
fue de 11 días a 25 °C y pH=5,6.
De las 9 combinaciones se seleccionó la de menor tiempo y se la comparó con el
medio agar papa dextrosa (PDA), en la que se puede observar que el tiempo de
crecimiento micelial en la caja Petri es menor que el PDA con tres días (Véase figura
12), a pesar de que la concentración de quinua y extracto de malta son menores a las
calculadas con respecto al PDA y hay crecimiento micelial en menor tiempo, esto
pudo deberse a que la quinua es un cereal que tiene un alto valor nutricional.
A la combinación óptima de 3 g quinua y 0,5 g de extracto de malta, se variaron las
condiciones de crecimiento del hongo Lentinus spp, con la finalidad de determinar
las condiciones óptimas de crecimiento, para lo cual se varío el pH a 3,5; 5,6 y 7
(Véase figura 10), donde se puede observar que a 25 °C si hay diferencia
significatvas en el crecimiento micelial, mientras que en el área de crecimiento a 30
°C (Véase figura 11), se puede observar que el crecimiento micelial en toda la caja
petri para los tres casos se da en el día 7, esto se da a que el crecimiento del hongo
prefiere las temperaturas altas.
46
En la tabla 24 se compara la productividad de tres medios, dos control (Agar
nutritivo y PDA) y el medio prueba (formulado), en donde, en el medio prueba (3 g
quinua; 0,5 g extracto de malta) la productividad es alta para las cepas ATCC:
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Candida
albicans y media para Aspergillus brasiliensis, mientras que para el Agar Nutritivo
es alta para las tres primeras cepas antes mencionadas y productividad media para las
dos últimas, en cambio para el PDA es media para las tres primeras cepas y tiene
una productividad alta para las dos últimas cepas.
En la tabla 25 se compara el Índice de Crecimiento Relativo (ICR) del medio prueba
con el agar nutritivo y el PDA, en donde el medio prueba es mejor que el agar
nutritivo para las 5 cepas ATCC, mientras que con el PDA es mejor para las 4 cepas:
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Candida
albicans y para recuperar el Aspergillus brasiliensis es mejor el PDA.
En la tabla 20 se pueden observar los resultados del ANOVA, donde, los p-valores
son todos menores que 0,05; esto quiere decir, que tanto las variables de quinua,
extracto de malta y la interacción quinua*extracto de malta influyen en el área de
crecimiento. El sistema también muestra el R2 que vale en este caso 0,955, lo que
indica que el 95,5 % del área de crecimiento es explicado por el modelo.
En la tabla 21 se observa que existe nueve combinaciones diferentes, los resultados
apuntan a que las combinaciones de: 6 g de quinua; 0,5 g de extracto de malta; 3 g de
quinua; 1,5 g de extracto de malta y 9 g de quinua; 1,5 g de extracto de malta, tienen
los peores resultados, mientras que, los mejores resultados en área de crecimiento
son 3 g de quinua y 0,5 g de extracto de malta.
En la tabla 22 se pueden observar los resultados del ANOVA, donde, los p-valores
son todos menores que 0,05; esto quiere decir, que tanto las variables de temperatura,
pH y la interacción temperatura*pH influyen en el área de crecimiento. El sistema
también muestra el R2 que vale en este caso 0,996, lo que indica que el 99,6 % del
área de crecimiento es explicado por el modelo.
47
En la tabla 23 se observa que existe 6 combinaciones diferentes de temperatura y pH,
los resultados apuntan que la combinación de: 25ºC - 3.5, es la peor, mientras que, la
mejor condición para que crezca el hongo Lentinus spp., es 30 ºC y pH=3.5.
48
5. CONCLUSIONES
El medio de cultivo formulado a partir de la cocción de quinua, extracto de malta y
agar tuvo mejores resultados que el agar papa dextrosa (PDA).
Los carbohidratos de la quinua son 3,3 veces más que los de la papa y en cuanto a la
proteína son 7,7 veces más que los de la papa.
Las concentraciones óptimas de quinua y extracto de malta, son 3 g de quinua y 0,5 g
de extracto de malta para 100 ml de medio sólido.
En las concentraciones óptimas antes mencionadas el micelio del hongo Lentinus
spp., alcanzó un área de 63,62 cm2 en 8 días en el medio óptimo formulado y en 11
días en el agar papa dextrosa (PDA) a 25 °C y pH=5,6.
El mejor pH a 25 °C para el crecimiento del micelio del hongo Lentinus spp, es de
5,6 alcanzando un área de crecimiento 63,62 cm2 en 8 días.
El mejor medio para favorecer el desarrollo de un microorganismo es el formulado
con las concentraciones óptimas ya que la productividad es alta para 4 cepas y media
para 1 cepa.
El Índice de Crecimiento Relativo (ICR) es mejor para el medio formulado con las
concentraciones óptimas en relación al Agar Nutritivo, ya que recupera la flora desde
el 100 % hasta el 120 % y en relación al PDA recupera desde el 72 % hasta el 160 %.
Existen diferencias estadísticamente significativas entre la quinua, extracto de malta
y la interacción quinua*extracto de malta.
Existen diferencias estadísticamente significativas entre el pH, temperatura y la
interacción pH*temperatura.
49
Las mejores condiciones para que crezca el hongo Lentinus spp., son 30 ºC y
pH=3.5.
50
6. RECOMENDACIONES
Para futuros trabajos de investigación sobre el crecimiento micelial de hongos, se
recomienda utilizar el medio de cultivo formulado con las concentraciones óptimas
de quinua y extracto de malta con otros hongos filamentosos, con el fin de
comprobar el efecto del medio con otros micelios de hongos.
Debido a que la investigación en el país sobre microorganismos ha aumentado, se
recomienda analizar todas las posibles aplicaciones del medio formulado con
diferentes microorganismos ya que estos tienen una amplia aplicación en diferentes
campos.
Se recomienda realizar un estudio económico para producción del medio de cultivo
formulado con las concentraciones óptimas a nivel industrial.
51
CITAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] RAMIREZ, Marleni y WILLIAMS, David E. Guía Agro-Culinaria de Cotacachi,
Ecuador y alrededores. IPGRI-Américas. Cali, Colombia. 2003. p. 33
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nutricional de diferentes variedades de quinua de la región Andina. Avances e
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pp.35-68.
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Chimborazo y la demanda en Miami - Estados Unidos. Trabajo de Grado. Ingeniera
en Comercio Exterior y Negociación Comercial Internacional. Universidad
Politécnica Estatal del Carchi. Escuela de Comercio Exterior y Negociación
Comercial Internacional. Tulcán 2014. p. 46
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quinua y amaranto, para la Sierra ecuatoriana. INIAP. Estación Experimental Santa
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Miscelánea N° 1512009. Quito. 2013. p.24
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y nutrición: manual teórico-práctico. Madrid-Buenos, Aires. 2005. p. 1
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Procedimiento Evaluación de Medios de Cultivo. PRT-712.00-105.Chile. 2012. p. 1
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Interamericano de Ciencias Agrícolas de la O.E.A. Lima, Perú. 1967. p. 44
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instituto Catalán de la Salud, Volumen II, Editorial Mad, S.L. España, 2006. p. 138.
52
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Hongos Entomopatógenos. Centro Internacional de la papa (CIP), Lima, Perú,
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[12]ECHANDI, Op. Cit, p. 44.
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biodegradables: el caso del almidón residual derivado de la industrialización de la
papa Bogotá,. Revista EAN, (72): 180-192, Junio 2012.
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alimentos. Madrid España, 2002. p. 62.
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San Carlos de Guatemala. Tesis de Maestría en Docencia Universitaria con
Especialidad en Evaluación Educativa, 2007, pp. 1, 3, 4.
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Universidad Estatal a Distancia, San José, Costa Rica. 1995. pp. 96, 97.
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Instituto Interamericano de Ciencias Agrícolas, Editorial IICA, San José, Costa
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Casera de Hongos Comestibles Pleurotus sp. Editorial Risaralda, Colombia 2001,
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[20]VENGOECHEA, Felipe. Tipos de hongos y setas, Setas de Siecha. Colombia,
Bogotá. Abril 2016. [Fecha de consulta: 12 Mayo 2016]. Disponible en:
http://www.setasdesiecha.com/tipos-de-hongos.html.
[21]VV.AA. Diccionarios de Medicina Oxford. Editorial Complutense, S. A. Primera
edición. España 2001. pp. 81,82
[22] Instituto de Salud Pública Ministerio de Salud, Op. Cit, p. 1.
[23]Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica
FARMACOPEA, Buenos Aires, Argentina, 7ma Edición. Vol VI , p. 84
[24] Universidad Tecnológica de Pereira. Vicerrectoría de Investigaciones, Innovación
y Extensión. Instructivo para el control de calidad de medios de cultivo método
ecométrico. Colombia. 2012. pp. 1,2, 8, 9.
53
[25]AGIS, Josue. Control de calidad microbiológico en el laboratorio de Análisis
Clínicos. Pruebas de promoción de crecimiento de medios. México. 2012. p. 3.
[26]MONTOYA, María. Las cepas ATCC, Instituto Colombiano de Medicina Tropical.
Colombia, 2014. pp. 5, 6, 8, 9.
54
BIBLIOGRAFÍA
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moulds and yeasts: an attempt at standardization at the international level. Journal of
Applied Bacterioioqy. 1983. pp. 313-327.
3) SOLER, J.P. Validación secundaria de número más probable y recuento en placa
para coliformes totales y termotolerantes en muestras de ensalada y arroz basado en
la norma ISO NTC 17025. Trabajo de grado. Microbiología Industrial. Pontificia
Universidad Javeriana, Departamento de Microbiología. Bogotá, Colombia. 2006.
4) TORTORA, G.J. Introducción a la Microbiología. Editorial Acribia S.A. Zaragoza,
España. 1993.
55
ANEXOS
56
ANEXO A. Equipos utilizados para caracterización de quinua.
Figura A.1. Estufa Thelco para determinación de humedad y cenizas de la quinua.
Figura A.2. Balanza analítica para pesar y determinar el porcentaje de humedad, ceniza,
grasa, proteína y fibra.
57
Figura A.3. Desecador para secar las muestras de quinua
Figura A.4. Equipo bloque de digestión para determinar proteína
58
Figura A.5. Unidad de destilación
Figura A.6. Bureta digital
59
Figura A.7. Sistema de Extracción para determinación de grasa.
60
ANEXO B. Equipos utilizados en la elaboración del medio de cultivo
Figura B.1. Autoclave para esterilizar los medios de cultivo
Figura B.2. Incubadora memmert para controlar la temperatura de crecimiento del
hongo Lentinus spp.
61
Figura B.3. Reverbero para realizar infusiones de quinua
Figura B.4. Cámara de Flujo Laminar para obtener un medio aséptico para realizar
siembras.
62
Figura B.5. Micelio del hongo Lentinus spp. en 3 g de quinua y 0,5 g de extracto de
malta desde el día 2 hasta el día 8.
Figura B.6. Micelio del hongo Lentinus spp. en PDA desde el día 2 hasta el día 10.
63
Figura B.7. Micelio del hongo Lentinus spp. en 3 g de quinua y 0,5 g de extracto de
malta a diferentes condiciones de pH y temperatura en el día 4.
pH=3.5 T= 30°C pH=5.6 T= 30°C pH=7 T= 30°C
pH=3.5 T= 25°C pH=7 T= 25°C
64
ANEXO C. Equipos utilizados para evaluación del medio de cultivo
Figura C.1. Activación de cepas ATCC en agar Nutritivo
Figura C.2. Reproducción de cepas ATCC en caldo soya tripticasa
65
Figura C.3. Método ecométrico en el medio quinua, medio nutritivo y PDA con el E.
coli.
Figura C.4. Método ecométrico en el medio quinua, medio nutritivo y PDA con la P.
aeruginosa.
Figura C.5. Método ecométrico en el medio quinua, medio nutritivo y PDA con el S.
aureus.
E. coli Medio quinua E. coli Medio Nutritivo
P. aeruginosa en Medio quinua P, aeruginosa en Medio Nutritivo
E. coli en PDA
P. aeruginosa en PDA
S. aureus en PDA S. aureus en Medio Nutritivo S. aureus en Medio quinua
