UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

TRABAJO FIN DE GRADO

MÉTODOS ANALÍTICOS EXISTENTES

PARA DETERMINAR EL ESTADO

NUTRICIONAL DE VITAMINA K EN LA

POBLACIÓN

Autor: Cristina Velasco Hernández

Tutor: Elena Rodríguez Rodríguez

Convocatoria: Junio

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Índice:

1. Resumen ………………………………………………………………………………………3

2. Introducción y antecedentes …………………………………………………………….........3

• Estructura de la vitamina K ……………………………………………………………….3

• Fuentes de la vitamina K ………………………………………………………………….4

• Ingestas adecuadas de la vitamina K …………………………………………………...…5

• Funciones de la vitamina K ……………………………………………………………….5

• Causas por déficit de vitamina K …………………………………………………………6

• Metabolismo de la vitamina K ……………………………………………………………6

• Toxicidad y recomendaciones …………………………………………………………….7

• Métodos analíticos para evaluar el estado nutricional de vitamina K en la población …..7

o Métodos indirectos ……………………………………………………………………8

− Tiempo de protrombina …………………………………………………………...8

− Osteocalcina (OC) o proteina Gla matriz (MGP) …………………………………8

− Descarboxiprotrombina (PIVKA-II) ……………………………………………...9

− Metabolitos urinarios de la vitamina K …………………………………………...9

o Métodos directos ……………………………………………………………………...9

3. Objetivo ……………………………………………………………………………………...10

4. Metodología …………………………………………………………………………… …...10

5. Resultados y discusión …………………………………………………………… ………...10

• Métodos de extracción de la vitamina K ………………………………………………...10

• Métodos directos de determinación de la vitamina K …………………………………...12

− Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección ultravioleta

visible (UV-Vis) ……………………………………………………………………...12

− HPLC con detección de fluorescencia ……………………………………………….13

− HPLC con detección electroquímica (EC) …………………………………………...14

− HPLC acoplado a espectrometría de masas (MS) …………………………………....16

• Características generales de los métodos directos ……………………………………….18

6. Conclusiones ……………………………………………………………………........……...19

7. Bibliografía …………………………………………………………………………………..19

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1. RESUMEN

La vitamina K es una vitamina liposoluble esencial para la salud, ya que tiene un papel principal

como cofactor de la síntesis de proteínas de la coagulación sanguínea, además de participar en la

regulación del metabolismo óseo y vascular.

Actualmente existen métodos analíticos directos e indirectos para poder determinar la concentración

de vitamina K en la población, pero sigue siendo un problema crítico por presencia de limitaciones e

interferencias en los métodos directos, debido a los bajos niveles circulantes de vitamina K, el

carácter no polar de la misma y la interferencia de los lípidos extraídos conjuntamente, y de baja

sensibilidad en los métodos indirectos. Sin embargo, los métodos directos se pueden considerar los

más informativos para determinar la vitamina K y sus homólogos.

A partir de la revisión realizada en el presente trabajo, se concluye que a pesar de que el método es

más rápido, sensible, preciso y selectivo para determinar la vitamina K es la cromatografía líquida de

alta resolución (HPLC) acoplada a espectrometría de masas en tandem (MS/MS), en los laboratorios

el método más usado actualmente es el HPLC con detector de fluorescencia, ya que es más

económico y el proceso de prepurificación de la muestra es más rápido.

2. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

• ESTRUCTURA DE LA VITAMINA K

La vitamina K, agrupa a un conjunto de estructuras que, de forma natural, presentan un anillo

metilado de naftoquinona y una cadena lateral alifática, y según sus características se dividen en dos

grupos: filoquinonas o vitamina K1, que contiene en su cadena lateral cuatro residuos de

isoprenoides y menaquinonas o vitamina K2 que tienen una cadena lateral compuesta de un número

variable de residuos isoprenoides insaturados, generalmente asignados como MK-n, donde “n”

especifica el número de isoprenoides. También existe la menadiona o vitamina K3, que es de origen

sintético, y en su cadena lateral posee un grupo H (figura 1). Está aceptado que la naftoquinona sea el

grupo funcional, así que el mecanismo de acción es similar para todas las formas de la vitamina K.1

Sin embargo, se podrían esperar diferencias por su estructura en la absorción intestinal, transporte,

distribución de tejidos y biodisponibilidad. Estas diferencias son causadas por las distintas afinidades

por los lípidos de las cadenas laterales y por las diversas matrices de los alimentos en las cuales

ocurren. Todas las formas de la vitamina K son liposolubles, aunque los derivados bisulfíticos de la

K3 son solubles en agua.2,3

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Figura 1. Estructuras de la vitamina K.3

• FUENTES

En la dieta se encuentran dos formas naturales de esta vitamina, la filoquinona y menaquinona. Las

filoquinonas (K1) están presentes en vegetales de hojas verdes, tales como la col rizada

(882μg/100g), la espinaca (493μg/100g), las coles de bruselas (192μg/100g), la lechuga cruda de

hoja verde (174μg/100g) y el brócoli tanto hervido (141μg/100g) como crudo (100μg/100g), en

algunos aceites vegetales como soja, algodón, canola y oliva (60μg/100g), y en menor cantidad en

atún (44μg/100g), carnes (1,6μg/100g), quesos (2,68μg/100g), frutas y pan (1,9μg/100g).1

En los vegetales verdes, la vitamina K1 está estrechamente unida a la membrana tilacoide de los

cloroplastos, por esta razón la filoquinona tiene una baja tasa de absorción (5-15%, dependiendo de

la ingesta de grasas de cada persona).4

Las menaquinonas (K2) son principalmente de origen animal y/o bacteriano (la produce la flora

intestinal). Está contenida en carnes (1-10μg/100g), aceites vegetales, quesos (3,6-10μg/100g), huevo

cocido (7μg/100g), leche entero y yogurt (1μg/100g), y en el producto de soja fermentada Natto

(1103μg/100g), consumido principalmente en Japón.1

Esta vitamina tiene una mejor absorción, aunque a menudo se subestima su importancia desde el

punto de vista nutricional.1,4

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• INGESTAS ADECUADAS

El nivel de ingesta adecuada (IA) de la vitamina K1 en base a los niveles de consumo de individuos

saludables son se recogen en la Tabla 1.

Edad Hombres (μg/día) Mujeres (μg/día)

0-6 meses 2

7-12 meses 2,5

1-3 años 30

4-8 años 55

9-13 años 60

14-18 años 60

19-50 años 120 90

>50 años 120 90

Embarazo 75-90

Lactancia 75-90

Tabla 1. Ingestas recomendadas de vitamina K en la población según edad y sexo.1,4

El consumo medio de vitamina K es de 1-2μg/Kg/día y con ello se consigue mantener la hemostasis

normal en el organismo y evitar cualquier problema por el déficit del mismo, como podría ser una

alteración hemorrágica.1

La biodisponibilidad de la vitamina K ingerida está influenciada por la ingesta de grasa alimentaria

en la dieta, por lo que es muy importante tomar una dieta equilibrada con bajo nivel de grasas y así

mejorar la absorción de la vitamina K llegando a los niveles adecuados de ingesta diaria.4

• FUNCIONES

Esta vitamina es requerida para los procesos de la coagulación de la sangre y generación de glóbulos

rojos, aunque se ha propuesto recientemente como un nutriente clave en la regulación de la

calcificación de tejidos blandos.4

· Coagulación sanguínea: la vitamina K en el hígado participa en la síntesis de algunos factores que

forman parte de la cascada de coagulación, cuyo fin es detener la hemorragia de los vasos sanguíneos

dañados a través de la formación del coágulo. Por ello también es llamada “vitamina

antihemorrágica”. Es decir, regula la actividad de la coagulación sanguínea.2

· Metabolismo óseo: la vitamina K también participa en el metabolismo del hueso ya que una

proteína ósea, llamada osteocalcina, requiere de la vitamina K para su maduración, es decir,

promueve la formación ósea en nuestro organismo. La vitamina K ayudaría a aumentar la densidad

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ósea y evitaría fracturas en personas con osteoporosis. Por lo tanto prevendría la osteoporosis y las

calcificaciones vasculares, y protegería la masa ósea de fracturas.2

• CAUSAS POR DÉFICIT DE VITAMINA K

· Coagulación: Algunos de los factores de la coagulación requieren de vitamina K para su síntesis

completa. Estas proteínas incluyen a los factores II, VII, IX y X, así como a las dos proteínas

reguladoras, proteína C y proteína S. En ausencia de vitamina K o en el caso de tratamiento con

anticoagulante con antagonistas de la vitamina K, estos factores son sintetizados pero están

incompletos, carecen de la unión de calcio al ácido carboxiglutámico y en el plasma se encuentran

como factores no funcionales, incapaces de unirse adecuadamente a los iones Ca.5

Cabe destacar que las alteraciones hemorrágicas muchas veces no pueden ser evitadas por la simple

ingesta de alimentos, esto se debe a que el déficit de esta vitamina viene dada por otros problemas

como la falta de reservas hepáticas en el recién nacido, insuficiencia hepática, absorción deficiente e

ingestión de ciertos antibióticos o antagonistas de la vitamina K.2

· Osteoporosis: La vitamina K protege de la osteoporosis a través de dos mecanismos, por un lado

protege del exceso de actividad de las células que destruyen hueso, los asteoclastos, porque

disminuye la cantidad de sustancias pro-inflamatorios que los activa. Y por otro lado, activa a las

células que generan hueso, los osteoblastos, porque carboxila la proteína que genera estas células, la

osteocalcina.2,5

·Aterosclerosis: Las investigaciones apuntan que una proteína sintetizada en el tejido arterial, la

proteína Gla de la matriz, requiere vitamina K (especialmente K2) para ser activada. Esta proteína

inhibe la calcificación de los vasos sanguíneos, con lo que se evita su pérdida de elasticidad, que es

uno de los principales contribuyentes a la aparición de problemas cardiovasculares.2

• METABOLISMO

La vitamina K pasa a linfa como componente de los quilomicrones y se transporta en sangre a través

de las lipoproteinas. El transporte de filoquinonas se realizan principalmente a través de las

lipoproteinas VLDL y en menor parte a través de las LDL y HDL. Las menaquinonas también se

transportan a través de las VLDL y con una mayor implicación de las lipoproteinas LDL y HDL. La

vitamina K se almacena principalmente en el hígado y otros tejidos como el corazón. La vitamina se

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cataboliza en el hígado y se excreta en su mayoría en forma de bilis, aunque una pequeña cantidad

(menos del 10%) se elimina por la orina en forma de glucurónidos y sulfoconjugados.2,3

Aunque la vitamina K es una vitamina liposoluble, el cuerpo almacena cantidades muy pequeñas que

son rápidamente agotadas sin una ingesta regular. Tal vez, debido a su limitada habilidad de

almacenar vitamina K, el cuerpo la recicla a través de un proceso llamado ciclo de la vitamina K-

epóxido.3

El hígado tiene preferencia por captar la vitamina K1 para mejorar la coagulación y es la forma de

elección para los bebés recién nacidos y los pacientes a los cuales se les desea revertir el efecto de

los anticoagulantes. La vitamina K2, sin embargo, se distribuye uniformemente en varios tejidos, lo

que indica que los tejidos extra-hepáticos se benefician más de la forma K2 que de la K1.6

• TOXICIDAD Y RECOMENDACIONES

La vitamina K resiste al calor y a la humedad pero es destruida ante un medio ácido, básico y agentes

oxidantes, siendo también inestable a la luz.3

Las personas que toman anticoagulantes deben tener una dieta equilibrada y monitorizada por su

médico, ya que los anticoagulantes disminuyen la formación de coágulos interfiriendo con la

vitamina K, por ello, una dieta rica en esta vitamina disminuiría la eficacia de los anticoagulantes.6

No se han encontrado efectos adversos asociados a una dosis excesiva de vitamina K1 o K2, pero no

ocurre lo mismo con la vitamina K3. Esta forma sintética puede interferir con la función del

glutation, un antioxidante que protege a las células de los radicales libres, lo cual genera daño

celular. En el recién nacido la vitamina K3 provoca daño hepático, ictericia y anemia hemolítica

(anemia dada por la ruptura de células sanguínea). Por ello se ha dejado de usar para el tratamiento

de la deficiencia de vitamina K.3,6

• MÉTODOS ANALITICOS PARA EVALUAR EL ESTADO NUTRICIONAL DE

VITAMINA K EN LA POBLACIÓN

Debido a que la vitamina K es muy liposoluble y poco abundante, existe una gran dificultad para

poder medir sus niveles en el organismo, habiendo limitado el desarrollo de técnicas existentes con

dicho objetivo. En general, los métodos para evaluar el estado en vitamina K pueden dividirse en

directos e indirectos.3,5

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Entre los métodos indirectos, se encuentra la medida del tiempo de protrombina, la determinación de

las proteinas subcarboxiladas (como la osteocalcina (OC) o proteína Gla matriz (MGP)), y de la

descarboxiprotrombina (PIVKA-II), así como el análisis de los metabolitos urinarios de la vitamina

K (7C-aglicona y 5C-aglicona).3,4

Entre los métodos directos se encuentran aquellos en los que se analiza la vitamina K o sus

metabolitos en plasma. Entre estos se encuentran la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

con detección ultravioleta visible (UV-Vis), HPLC con detección de fluorescencia, HPLC con

detección electroquímica (ECD), y HPLC acoplado a espectrometría de masas (MS).3,7

o MÉTODOS INDIRECTOS

- Tiempo de protrombina

Este método mide el tiempo que tarda la sangre en coagular. Se consideran valores normales de 11,1

a 13,1 segundos en adultos, de 2 a 3 segundos en neonatos, y de 3 a 5 segundos en neonatos

prematuros.

Es la técnica menos sensible para la determinación de vitamina K en el organismo y no se puede usar

como un indicador fiable del estado del mismo.3

- Osteocalcina (OC) o proteína Gla de la matriz (MGP)

La medida de estas proteínas son más sensibles en la detección de la deficiencia de la vitamina K que

el tiempo de protrombina. Sin embargo, la medida de MGP solo puede reflejar el estado de la

vitamina K a nivel vascular y no en otros órganos (en particular en hueso e hígado).3

La MGP es sintetizada predominantemente por los osteoblastos e incorporada en la matriz

extracelular del hueso, y actúa en las paredes de los vasos sanguíneos del organismo. Es el inhibidor

local más fuerte de la calcificación vascular en la pared del vaso y el inhibidor más potente de la

calcificación tisular actualmente conocido.8

La cantidad de osteocalcina parcialmente carboxilada (ucOC) podría representar un marcador

sensible del estado de vitamina K en plasma, sin embargo, aunque un alto porcentaje de ucOC indica

un estado pobre en vitamina K, esto refleja la ingesta reciente de la vitamina K y no el estado del

mismo a largo plazo. También hay que tener en cuenta que los niveles de osteocalcina están

influenciados por la vitamina D y por la paratohormona (PTH). Por ejemplo, aunque un paciente con

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hiperparatiroidismo presente los niveles de osteocalcina parcialmente carboxilada elevados en

sangre, no significa necesariamente que tenga un déficit en vitamina K.9,10

- Descarboxiprotrombina (PIVKA-II)

Esta proteína es un precursor inactivo de la protrombina y aumenta cuando existe deficiencia de

vitamina K. Por ello podría ser un marcador sensible para predecir la deficiencia de vitamina K,

especialmente en los recién nacidos.3

- Metabolitos urinarios de la vitamina K (7C-aglicona y 5C-aglicona)

Los metabolitos de la vitamina K, 7C-aglicona y 5C-aglicona, que son comunes para la filoquinona

como para la menaquinona, son excretadas por la orina, y dan una idea de la dieta que sigue el

paciente.

Uno de los inconvenientes es que el deterioro de la función renal podría interferir con la fiabilidad de

este marcador.3

o MÉTODOS DIRECTOS

Determinar la vitamina K en plasma es difícil por el hecho de sus bajos niveles circulantes en el

organismo, su carácter no polar, y a las interfierencias que presenta con los lípidos plasmáticos

extraídos conjuntamente.3

Además, hay varias interferencias con los componentes del plasma y los medicamentos

administrados, y la alta unión a lipoproteínas complica los procedimientos de extracción y confiere

resultados muy discrepantes (entre 1,6 ± 2,2 y 4,8 ± 2,9 nmol/L en estudios que utilizan diferentes

técnicas de extracción). Los procedimientos de preparación de muestras incluyen la extracción

líquido-líquido (LLE) o extracción en fase sólida (SPE). Cabe destacar que estos procedimientos

consumen mucho tiempo, mano de obra y grandes cantidades de disolventes orgánicos caros, tóxicos

y preligrosos para el medioambiente.11,12

Entre los métodos más usados actualmente para su detección y cuantificación se encuentran: la

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección ultravioleta visible (UV-Vis),

fluorescente, electroquímica (EC) y por espectrometría de masas (MS). Se utilizan para el análisis

directo de K1, así como para el de MK-4 y MK-7.3,7

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3. OBJETIVO

Revisar los métodos analíticos directos existentes para la determinación de vitamina K en la

población.

4. METODOLOGÍA

Para llevar a cabo la realización de este trabajo, se realizó una búsqueda sobre la vitamina K y los

métodos analíticos para su determinación en Science Direct, Pubmed y Google-académico, así como

en la biboteca on-line de la Universidad Complutense de Madrid.

Para poder elegir cuales serían los mejores artículos para realizar este trabajo, hubo que poner límites

en la búsqueda. Primero se eligieron artículos publicados hace 20 años como máximo, que fueran

revisiones, ensayos clínicos y la especie elegida humanos (aunque para la introducción del trabajo

tuve que eliminar este criterio).

Se usaron las siguientes palabras claves: “vitamin K”, para la cual salieron 1991 resultados,

“determination of vitamin K”, para la cual salieron 611, “metabolism of vitamin K”, para la cual se

obtuvieron 695, “structure of vitamin K”, para la cual salieron 40, y “biochemistry of vitamin K”,

para la cual se obtuvieron 34 resultados.

Finalmente se usaron 26 artículos para llevar a cabo la realización de este trabajo y su revisión

bibliográfica.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

• MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE LA VITAMINA K

Para poder determinar la vitamina K por diversos métodos hay que preparar primero la muestra y

purificarla con diversas sustancias para que los resultados obtenidos sean lo más fiables posible. Para

ello, siempre hay que tener cuidado con la muestra, porque aunque sea muy estable al calor y las

pérdidas durante los distintos tratamientos térmicos sea casi imperceptible, es muy susceptible a la

degradación fotoquímica.3,11

Para poder preparar la muestra, primero se realiza una extracción líquido-líquido para separar la

vitamina K y los metabolitos del plasma, y posterioremente se procede a la extracción en fase sólida

para separar la vitamina K de los compuestos lipídicos de la muestra.12

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El procedimiento comienza con una toma de muestra de sangre, separando posterioremente el suero

por centrifugación. Las muestras deben ser protegidas de la luz para no producir una

desestabilización de las mismas. Se ha observado que la estabilidad de las muestras se consigue

utilizando viales de color ambar para evitar que le dé la luz, y almacenándolas con unas condiciones

estratégicas de tiempo y temperatura con diversos ciclos de congelación-descongelación de la

misma. Se consigue que sean estables hasta 7 días en plasma almacenándolas a 4ºC y hasta 14 días a

15ºC. A temperatura ambiente, se mantienen estables hasta 72 horas cuando se almacenan en

oscuridad y hasta 24 horas cuando se almacenan en tubos transparentes con luz. Son estables hasta

12 semanas a 20ºC, y no se encuentra ningún cambio significativo en las concentraciones de los

metabolitos de la vitamina K después de uno o tres ciclos de congelación-descongelación.12

Los metabolitos de vitamina K se extraen del suero por extracción líquido-líquido. Se parte de unas

alícuotas de suero y se transfieren a un tubo de centrífuga de vidrio desechable que contiene agua

destilada. Una apropiada cantidad de suero estándar se añade por inyección. Se agregan unos

mililitros de etanol para precipitar así las proteínas con una breve agitación. A continuación, se

agregan unos mililitros de n-hexano y se mezclan vigorosamente a través de una centrifugación de

1500g (aproximadamente 3000rpm) unos 10 minutos a temperatura ambiente hasta la separación de

la capa superior de hexano de la capa inferior acuosa-etanólica y las proteínas precipitadas. La capa

superior de hexano se tranfiere cuantitativamente a un tubo de vidrio desechable, y de la capa más

baja se vuelven a extraer otros mililitros de hexano. Las capas orgánicas superiores se agrupan y

luego se someten a una evaporización para proceder al secado bajo una corriente suave de nitrógeno

a 50ºC.12

Una vez extraídos los metabolitos, se procede al aislamiento de la fracción de vitamina K de los

extractos lipídicos llevado a cabo mediante el uso de un sistema de extracción en fase sólida (SPE).

En primer lugar se acondicionan unos cartuchos de sílice con hexano para eliminar así los materiales

del cartucho que puedan interferir con el ensayo de la vitamina K. El extracto lipídico seco se

disuelve en n-hexano y se empuja a través del cartucho, y posteriormente el tubo se enjuaga con

hexano. El hexano se extrae a través de cada cartucho aplicando vacío para separar la fracción de

lípidos de los hidrocarburos. Los compuestos de vitamina K retenidos se eluyen con éter dietílico en

hexano y se recolectan en tubos de vidrio desechables. A continuación se procede al secado por

evaporización bajo una coriente de nitrógeno a 50ºC.

La fracción de vitamina K seca se disuelve en 2-propanol y se tranfiere a viales de vidrio para

realizar el análisis por HPLC.12

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• MÉTODOS DIRECTOS DE DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA K

- HPLC con detección ultravioleta visible

La vitamina K1 puede ser detectada en el plasma humano a través del método de HPLC con detector

de ultravioleta visible. La determinación por ultravioleta visible fue uno de los primeros métodos

utilizados para la detección de la vitamina K1 y se basa en la capacidad de esta vitamina en absorber

radiación ultravioleta. Se basa en un método de cromatografía líquida, generalmente en fase inversa,

usando una mezcla de acetonitrilo/diclorometano/metanol como eluyente a 20ºC. La detección del

metabolito se lleva a cabo mediante una longitud de onda de 248nm y normalmente la velocidad de

flujo es de 1ml/min.13

Para proceder a cuantificar la vitamina K, se deben preparar curvas estándar. Para su cuantificación

se comparan de manera directa la relación de las áreas y los picos obtenidos en el cromatograma.

Para ello, se prepara una solución madre del estándar disolviendo 100mg de vitamina K en 100ml de

hexano con una corriente de nitrogeno, y se almacena en un matraz ámbar a 18ºC. El día que se va a

realizar el ensayo, las soluciones estándar del trabajo se deben preparar diluyendo las cantidades

apropiadas en 90:10 de metanol/diclorometano. Las concentraciones de las soluciones se deben

confirmar mediante el análisis espectrométrico a 248nm con un espectrofotómetro con detector

ultravioleta visible.13

La integración del cromatograma y la regresión lineal de la curva de calibración se realiza utilizando

un programa de software especial para este tipo de métodos (HP Chemstation 3365).

Para poder estudiar la recuperación de la vitamina K se analizan por triplicado mediante el uso de

1ng de 20,30-dihidrofloiloquinona como patrón interno en las muestras. La recuperación de la misma

se calcula de la siguiente manera:

(Rt - Re) / Ra x 100

Donde Rt es la cantidad total de vitamina K1, Re es la cantidad de vitamina K1 endógena, y Ra es la

cantidad de vitamina K1 adicional.13

Este método de determinación es fácil de usar, rápido y capaz de medir la filoquinona en plasma

humano, y los datos que se obtienen a través de este método son similares a los reales, además es uno

de los más utilizados. Sin embargo, debido a su baja sensibilidad y selectividad, se recomienda que

se acompañe con determinaciones adicionales.13

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Figura 2. Detector de ultravioleta visible (UV-Vis).13

- HPLC con detección de fluorescencia

Este método permite determinar la vitamina K y sus derivados (K1, MK-4 y MK-7), sin embargo,

requiere una purificación de la muestra exhaustiva para reducir la interferencia cromatográfica

inducida por los lípidos.14

El sistema consiste en HPLC, un inyector, columna termostatizada a 35ºC y un detector de

fluorescencia configurado a una longitud de onda de 320nm para MK-4 y 240nm para K1 y MK-7.

Entre la columna de HPLC y detector de fluorescencia se encuentra la columna de reducción de

platino o zinc para purificar la muestra.15

Para la determinación de MK-4 se usa generalmente una fase móvil de 95:5 de metanol y agua,

mientras que para la determinación de K1 y MK-7 la fase móvil suele estar compuesta de metanol y

etanol (95:5). Una velocidad de flujo de 1ml/min en ambos sistemas suele ser adecuada para una

correcta determinación.16

La concentración de MK-4, K1 y MK-7 en plasma se calcula usando la fórmula de:

[MK-4], [K1] o [MK-7] = R·S / V

Donde R es la relación cuantitativa de vitamina K en la curva de calibración, S es la cantidad de

estándar interno (1ng), y V es el volumen de la muestra tomada para el ensayo.17

Para determinar la linealidad del método se realiza una curva de calibrado de MK-4, K1 y MK-7.

Los límites de detección de MK-4 y MK-7, basados en una relación señal-ruido de 3:1, son de

0.001 - 0.004ng por inyección, y el de K1 son de 0.01 - 0.002ng por inyección, respectivamente. Las

recuperaciones de MK-4, K1 y MK-7 calculadas por mediciones de la vitamina K en suero

enriquecido a baja, media y alta concentración de la misma son aproximadamente del 92-105%. Los

valores calculados de precisión intra e interensayo por mediciones del suero control y del plasma de

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los sujetos sanos son del 5.73 - 9.21% para MK-4, 4.86 - 9.64% para K1 y 6.32 - 19.31% para MK-7.

La sensibilidad y recuperación general combinada con una buena reproducibilidad para la medición

de tres tipos de vitamina K (MK-4, K1, MK-7) con solo 0,2ml de plasma, hace que sea un método

muy factible.18

En este método presenta una mayor sensibilidad y selectividad de reproducibilidad y precisión que la

detección ultravioleta visible, por lo que se considera un método adecuado para determinar el estado

de salud así como para realizar estudios nutricionales.14

- HPLC con detector electroquímico (EC)

Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse. Se mide la corriente

que pasa entre el electrodo de trabajo y un electro auxiliar, en función del tiempo. Con este detector

se debe trabajar en rigurosa ausencia de oxígeno y con disoluciones acuosas, o de disolventes

polares, que contengan electrolitos. Presentan una gran sensibilidad, con un límite de detección entre

el 0,01 y 1ng. Sin embargo, no pueden ser empleados en elución con gradiente, y dependen de la

temperatura y del caudal.19

Figura 3. Detector electroquímico.19

En este proceso se realiza la reducción de la estructura de quinona de la vitamina K a su

hidroquinona correspondiente, es decir, consiste en una reducción de dos electrones para producir la

hidroquinona correspondiente en la exploración catódica y la reoxidación a la quinona en la

exploración anódica. La separación entre los picos catódicos y anódicos es muy notable, y esto

quiere decir que la reacción es casi reversible. La naturaleza casi reversible del proceso de reducción

también se observa por el cambio de potencial máximo catódico con la tasa de exploración y por la

magnitud de los valores de α·na, los cuales se calculan a partir de la ecuación:

α·na = 0,048 / (Ep – Ep/2)

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donde α es el coeficiente de tranferencia, na es la cantidad de electrones implicados en el paso de

determinación de la velocidad, Ep es el potencial máximo, y Ep/2 es el potencial máximo a la mitad de

la corriente máxima.20

La función disminuye ligeramente con la velocidad de exploración de las corrientes catódicas pero

aumentó con las corrientes anódicas; esto sugiere que solo la forma reducida de la filoquinona se

adsorbe en la superficie del electrodo de carbono vítreo. Esto está en contraste con el

comportamiento que se puede observar en un electrodo de mercurio donde, en condiciones similares,

tanto la forma oxidada como la reducida de la vitamina se adsorben y el proceso de reducción es

reversible.20

El HPLC-EC se realiza con una bomba recíproca de flujo constante y un detector electroquímico,

también llamado amperométrico. Este dispone de un sistema de celda de tres electrodos, que

incorpora un electrodo indicador de carbono vítreo, un electrodo de referencia (calomelano saturado

o Ag-AgCl) y un contraelectrodo de platino. Las inyecciones de muestra se realizan a través de una

válvula de inyección de carga con una jeringa.

Es importante elegir los solventes y reactivos más adecuados para su determinación. Las soluciones

madre de filoquinona se preparan con etanol o metanol, diluyendolas posteriormente con el tampón

de acetato para llegar a la concentración adecuada. El tampón de acetato metanólico se desgasifica

con nitrogeno libre de oxígeno que habían pasado anteriormente de manera continua a través de

cloruro de vanadio (II) y metanol. Para mantener el vanadio en estado reducido, se añade una

amalgama de zinc a la solución de cloruro de vanadio (II), de esta manera se puede reducir el tiempo

requerido para la eliminación de oxígeno mediante la desgasificación previa al vacío.21

Las condiciones voltamperométricas que debe tener para poder llevar a cabo una buena detección

son: el potencial inical +1V mantenido durante 1 minuto antes del escaneo, la velocidad de

exploración de 10, 20, 50 y 100mVs-1, y el rango de 0,02mA. Entre las sucesivas ejecuciones, el

electrodo indicador se debe limpiar con agua destilada seguido de acetona y por último secarlo bien

con papel.

La voltametría hidrodinámica se realiza inyectando volúmenes fijos de una solución estándar de

filoquinona con un flujo de 1ml/min, y variando el potencial aplicado entre -0,5 y -0,8V. Entre cada

inyección se aplica un potencial de limpieza de +0,7V durante 3 minutos. Los voltamogramas

hidrodinámicos se construyen trazando la corriente máxima registrada contra el potencial aplicado.19

El gráfico de calibración de la altura del pico frente a la masa de filoquinona inyectada es lineal, en

el rango de 1-10ng. Los cromatogramas obtenidos para las muestras de plasma con filoquinona

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tienen unos picos bien definidos. La recuperación de la filoquinona con un rango del 0 - 0,8ng/ml es

lineal, siendo del 86 - 91%; y la precisión para las muestras es del 8,9%.

La sensibilidad de HPLC-EC para determinar filoquinona es aproximadamente tres veces mayor que

en HPLC-UV.19

El método es capaz de reducir el porcentaje de mala resolución que a menudo se caracteriza por el

aumento de las concentraciones totales de colesterol y triglicéridos en los pacientes, ya que se

elimina el exceso de lípidos e interferencias mediante el proceso de purificación de la muestra.20,21

- HPLC acoplado a espectrometría de masas (HPLC-MS)

El principal problema que surge al acoplar un espectómetro de masas (MS) al HPLC es la enorme

cantidad de disolvente que acompaña al analito procedente del HPLC. Para ello, se han desarrollado

técnicas para introducir y analizar muestras líquidas por MS. Una de ellas es la interfase de

ionización química a presión atmosférica (APCI), que además consigue la ionización de la muestra.

Con esta técnica se forma un spray a partir de la muestra y mediante una descarga eléctrica el analito

se convierte en iones que son conducidos hacia el espectrómetro de masas.22

Debido a que la vitamina K1 es un compuesto neutro y de baja polaridad, se utiliza una fuente de

APCI de iones positivo con una corriente de nebulizador de 3μA y una temperatura de sonda de

400ºC. Se usa nitrógeno de pureza ultra alta como gas de cortina y gas de colisión, y se usa aire cero

como gas nebulizador.22

De todos los analizadores de masas existentes, se han obtenido muy buenos resultados con

analizadores de triple duadruplo (MS/MS). Para entender su fundamento, primero se debe

comprender el funcionamiento de un duadruplo, consta de cuatro barras cilíndricas paralelas que

actúan como electrodos. Las barras opuestas se conectan eléctricamente, un par está unido al polo

positivo de una fuente variable de corriente contínua y el otro par se une al terminal negativo.

Además, se aplican a cada par de barras potenciales variables de corriente alterna de radiofrecuencia,

que están desfasados 180 grados. Los iones son acelerados a través del cuadrupolo. Las tensiones de

corriente contínua y alterna se incrementa simultáneamente manteniendo constante su relación, sólo

aquellos iones que tienen una adecuada relación m/z consiguen tener una trayectoria estable y pasan

al detector, el resto termina colisionando con las barras. (Figura, 4).23

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Figura 4. Partes de un duadruplo.23

El analizador MS/MS se trata de una configuración de tres cuadrupolos situados de forma secuencial,

de forma que el primero y último (Q1 y Q3) actúan como un cuadrupolo normal, mientras que el

segundo tiene unas características especiales y se denomina celda de colisión. En esta celda se

introduce una pequeña cantidad de gas (He, Ar), de forma que los iones que entran, colisionan con

los mismos fragmentándose. Los iones formados pasan al Q3 para finalmente ser analizados. (Figura

5).23

Figura 5. Tiempo de residencia (dwell). Energía de colisiones.23

Las soluciones madres se preparan disolviendo los analitos en etanol para formar los patrones de

calibración y obtener así muestras de control enriquecidas posteriormente con K1, MK-4 y MK-7. Se

deben usar viales de color tupido, como el ámbar, para evitar la fotodegradación de la vitamina K y

guardarlas a -20ºC.24

La extracción de la muestra se consigue con una mayor recuperación de analitos si, seguido de la

extracción líquido-líquido, procedemos a la precipitación de proteínas. Se usa etanol y ciclohexano

como precipitante y extractante respectivamente para dar una mayor recuperación y menor

interferencia en la preparación de la muestra. Para alcanzar la respuesta máxima de la señal en un

tiempo de análisis más corto, se mantiene tan alto como sea posible el porcentaje de fase orgánica, al

mismo tiempo que se evita el primer pico que contiene la mayoría de interferencias endógenas que

suprimirían la respuesta.25

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LC-APCI-MS/MS es un método simple y rápido para la determinación cuantitativa de K1, MK-4 y

MK-7 en plasma humano. El procedimiento simple de preparación de las muestras evita métodos de

prepurificación intensivos, mientras que el corto tiempo de ejecución total permite un mayor

rendimiento. Aunque el método más comunmente utilizado es el HPLC con detector de

fluorescencia, este requiere una prepurificación muy extensa de la muestra para disminuir la

interferencia cromatográfica de los lípidos extraídos conjuntamente. Sin embargo, LC-APCI-MS/MS

para la medición de K1, MK-4 y MK-7 en plasma ofrece una mayor sensibilidad y selectividad en

comparación con otras técnicas, y muestra una excelente linealidad, recuperaciones consistentes

(92% para K1, 103% para MK-4 y 99% para MK-7) y un mayor rendimiento. Permite la

cuantificación reproducible de K1 en plasma a través de un amplio rango de concentraciones, con

una variación intra e inter-análisis de K1 y MK-4 de <10% y <12% para MK-7 a altas

concentraciones, y un límite de detección del 0,1 - 0,044ng/mL para K1 y MK-4 y 1 - 1,38ng/mL

para MK-7.26

Por lo tanto, este método es adecuado para la medición de K1 y podría serlo para medir MK-4 y

MK-7 en poblaciones que consumen mayores cantidades de las mismas, o para controlar el

tratamiento con estos metabolitos de la vitamina K.

• CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS DIRECTOS

HPLC-UV-Vis

(248nm)

HPLC-

fluorescencia

HPLC-EC HPLC-APCI-

MS/MS

Tiempo análisis Rápido Rápido Lento Lento

Sensibilidad Baja Alta Alta Muy alta

Límite de

detección

0,1 – 1ng 0,001 – 0,01ng 0,01 - 1ng 0,04 – 1,4ng

Precisión

(CV%)

2,2-5,6% K1=4,86-9,64%

MK-4=5,73-9,21%

MK-7=6,32-19,31%

8.9%

K1 y MK-4 = <10%

MK-7 = <12%

Recuperación 88% ± 3,6 92 - 105% 86 - 91% 92 - 103%

Temperatura

de trabajo

18-20ºC 35ºC 20ºC Automuestrador=15ºC

Columna=50ºC

Sonda=400ºC

Eliminación

interferencias

No Sí Sí No

Gradiente Sí Sí No Sí

Selectividad Baja Alta Alta Muy alta

Índice de flujo 1ml/min 1ml/min 1ml/min 1ml/min

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6. CONCLUSIONES

Después de comprobar varios métodos analíticos de determinación de vitamina K y sus análagos, se

ha determinado que aunque el más rápido, sensible, preciso y selectivo es el método HPLC-APCI-

MS/MS, en los laboratorios el más usado actualmente es el HPLC con detector de fluorescencia, ya

que es más económico y el proceso de prepurificación de la muestra es más rápido.

7. BIBLIOGRAFÍA

[1] Vermeer C. Vitamin K: The effect on health beyond coagulation-an overview. Food Nutrition

Res. 2012; 56: 5329-5337.

[2] El Amar MS, Naoum JJ, Arbid EJ. Vitamin K and the role of vitamin K2: A Review. Oman Med

J. 2014; 29: 172-177.

[3] Maria Furaso, Maurizio Gallieni, Maria Antonietta Rizzo, Andrea Stucchini, Pierre Delanaye,

Erienne Cavalier, et al. Vitamin K plasma levels determination in human health. Clin Chem Lab

Med. 2017; 55(6): 789-799.

[4] Donald B. Parrish, Alan J. Sheppard. Determination of Vitamin K in foods: A review. Critical

Review in Food Science and Nutrition. 1998; 1: 337-352.

[5] Mercedes Elena Mijares, Elena Nagy, Belsy Guerrero, Carmen Luisa Arocha-Piñago. La

Vitamina K: Bioquímica, función y deficiencias. Revisión. Invest Clin. 1998; 39(3): 213-229.

[6] D. W. Stanfford. The vitamin K cycle. Journal of Thrombosis and Haemmostasis. 2005; 3: 1873-

1878.

[7] Michael Swartz. HPLC detectors: A brief Review. Journal of Liquid Chromatography. 2010; 33:

1130-1150.

[8] Maria Fusaro, Marianna Noale, Valentina Viola, Francesco Galli, Giovanni Tripepi, Nicola

Vajente, et al. Vitamin K, Vertebral Fractures, Vascular Calcifications, and Mortality: Vitamin K

Italian (VIKI) Dialyis Study. Journal of Bone and Mineral Research. 2012; 34: 2271-2278.

[9] Lianpu Wen, Jiepeng Chen, Lili Duan, Ahuzhuang Li. Vitamin K dependent proteins involved in

bone and cardiovascular health (Review). Molecular medicine reports. 2018; 17: 2433-2440.

[10] Caren M. Gundberg, Sherril D. Nieman, Steven Abrams, Harold Rosen. Vitamin K Status and

Bone Health: An Analysis of Methods for Determination of Undercarboxylated Osteocalcin. Journal

of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1998; 83(9): 3258-3266.

[11] Mohammed K. Azharuddin, Denis St. J. O’Reilly, Andrew Gray, Dinesh Talwar. HPLC Method

for Plasma Vitamin K1: Effect of Plasma Triglyceride and Acute-Phase Response on Circulating

Concentrations. Clinical Chemistry. 2007; 53(9): 1706-1713.

[12] Milka Marinova, Dieter Lutjohann, Philipp Wesrhofen, Matthias Watzka, Olof Breuer, Johannes

Oldenburg. A Validated HPLC Method for the Determination of Vitamin K in Human Serum – First

Application in a Pharmacological Study. The Open Clinical Chemistry Journal. 2011; 4: 17-27.

[13] Semith Otles, Ozlem Cagindi. Determination of Vitamin K1 content in olive oil, chard and

human plasma by RP-HPLC method with UV-Vis detection. Food Chemistry. 2007; 100: 1220-

1222.

Este

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una

fina

lidad

doc

ente

. La

Facu

ltad

de F

arm

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no

se h

ace

resp

onsa

ble

de la

info

rmac

ión

cont

enid

a en

el m

ism

o.

~ 20 ~

[14] Maya Kamao, Yoshitomo Suhara, Naoko Tsugawa, Toshio Okano. Determination of plasma

Vitamin K by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection using Vitamin K

analogs as internal standards. Journal of chromatograohy B. 2005; 816: 41-48.

[15] Laura Y. Wang, Chris J. Bates, Liya Yan, Dominic J. Harrington, Martin J. Shearer, Ann

Prentice. Determination of phylloquinone (vitamin K1) in plasma and serum by HPLC with

flourescence detection. Clinica Chimica Acta. 2004; 347: 199-207.

[16] Maya Kamao, Yoshitomo Suhara, Naoko Tsugawa, Toshio Okano. Determination of plasma

Vitamin K by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection using Vitamin K

analogs as internal standards. Journal of Chromatography B. 2005; 816: 41-48.

[17] Rita Paroni, Elena Maria Faioni, Cristina Razzari, Gessica Fontana, Marco Cattaneo.

Determiantion of vitamin K1 in plasma by solid phase extraction and HPLC with fluorescence

detection. Journal of Chromatography B. 2009; 877: 351-354.

[18] Sameh Ahmed, Ashraf M. Mahmoud. A novel salting-out assisted extraction coupled with

HPLC-fluorescence detection for trace determination of vitamin K homologues in human plasma.

Talanta. 2015; 144: 480-487.

[19] John P. Hart, Martin J. Shearer, Patrick T. McCarthy, Seema Rahim. Voltammetric Behavioir of

Phylloquinone (Vitamina K1) at a Glassy-carbon Electrode and Determination of the Vitamin in

Plasma Using High-performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection. Analyst.

1998; 109: 477-481.

[20] JeeEun Yang, Jang-Hee Yoon, Mi-Sook Won, Yoo-Bo Shim. Electrochemical and

Spectroelectrochemical Behaviors of Vitamin K1/Lipid Modified Electrodes and the Formation of

Radical Anion in Aqueous Media. Bull Korean Chem Soc. 2010; 31(11): 3133-3138.

[21] Hiroyuki Wakabayashi, Kenji Onodera, Susumu Yamato, Kenji Shimada. Simultaneous

Determination of Vitamin K Analogs in Human Serum by Sensitive and Selective High-Performance

Liquid Chromatography With Electrochemical Detection. Basic Nutritional Investigation. 2003; 19:

661-665.

[22] Ineke J. Riphagen, Jan C. van der Molen, Martijn van Faassen, Gerjan Navis, Martin H. de

Borst, Fritis A.J.Muskiet, et al. Measurement of plasma vitamin K1 (phylloquinone) and K2

(menaquinones-4 and -7) using HPLC-tandem mass spectrometry. De Gruyter. 2015; 1: 1-10.

[23] Alessandra Gentili, Arturo Cafolla, Tecla Gasperi, Simona Bellante, Fulvia Caretti, Roberta

Curini, Virginia Pérez Fernández. Rapid, high performance method for the determination of vitamin

K1, menaquinone-4 and vitamin K1 2,3-epoxide in human serum and plasma using liquid

chromatography-hybrid quadrupole linear ion trap mass spectrometry. Journal of Chromatography A.

2014; 1338: 102-110.

[24] Alessandra Gentili, Alfredo Miccheli, Pierpaolo Tomai, Maria Elisabetta Baldassare, Roberta

Curini, Virginia Pérez-Fernández. Liquid Chromatography-tandem mass sectrometry method for the

determination of vitamin K homologues in human milk after overnight cold saponification. Journal

of Food Composition and Analysis. 2016; 47: 21-30.

[25] Qinxin Song, Aidong Wen, Li Ding, Li Dai, Lin Yang, Xiemin Qi. HPLC-APCI-MS for the

determination of vitamin K1 in human plasma: Method and clinical application. Journal of

Chromatography B. 2008; 875: 541-545.

[26] Yoshitomo Suhara, Maya Kamao, Naojo Tsugawa, Toshio Okano. Method for the

Determination of Vitamin K Homologues in Human Plasma Using High-Performance Liquid

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 2005; 77(3): 757-763.

Este

trab

ajo

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una

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ente

. La

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