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Universidad de Costa Rica Facultad de Ciencias Básicas Escuela de Química “Implementación del método cuantitativo para determinar el contenido de sodio en diferentes tipos de galletas producidas por Kraft Foods de Costa Rica por la metodología de espectroscopia de absorción atómica con llama.” Trabajo Final de Graduación presentado como requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura en Química. Marisol Rojas Ovares Ciudad Universitaria Rodrigo Facio San Pedro de Montes de Oca 2014
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Universidad de Costa Rica
Facultad de Ciencias Básicas
Escuela de Química
“Implementación del método cuantitativo para determinar el contenido de sodio
en diferentes tipos de galletas producidas por Kraft Foods de Costa Rica por la
metodología de espectroscopia de absorción atómica con llama.”
Trabajo Final de Graduación presentado como requisito parcial para optar por el grado
de Licenciatura en Química.
Marisol Rojas Ovares
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio
San Pedro de Montes de Oca
2014
i
Este proyecto de graduación. Ha sido aceptado por la Escuela de Química de la
Facultad de Ciencias Básicas de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial
para optar por el grado de Licenciatura en Química
________________ ________________
Dr. Cristian Campos Fernández MAE Paulina Silva Trejos
Director de la Escuela de Química Directora del Proyecto
Representante a.i.
Decano de la Facultad de Ciencias
________________ ________________
M. Sc Ana Lorena Alvarado Gámez M. Sc Miriam Barquero Quirós
Integrante del Comité Asesor Integrante del Comité Asesor
________________ ________________
Dr. Carlos León Rojas Marisol Rojas Ovares
Miembro del Tribunal Postulante
ii
Agradecimientos
A mi directora de tesis, MAE Paulina Silva Trejos, por su guía técnica y apoyo
incondicional durante la realización de este trabajo final de graduación.
A M. Sc Miriam Barquero y M. Sc Ana Lorena Alvarado, asesoras de éste trabajo final
de graduación, por la revisión del trabajo escrito y las recomendaciones brindadas para
la finalización exitosa de esta investigación.
Al Dr. Cristian Campos y al Dr. Carlos León, tribunal evaluador, por las correcciones y
recomendaciones realizadas a éste trabajo final de graduación. Además, un
agradecimiento por el otorgamiento de la mención honorífica.
A la empresa Kraft Foods por permitirme realizar ésta investigación en sus
instalaciones así como por brindarme todos los recursos necesarios para la validación
de la metodología (equipos, reactivos, insumos de los equipos) además por proveer
todas las muestras de galletas.
A mi mamá, mi papá, mi hermano y a Mauricio por su apoyo incondicional y su amor
que me ayudaron a finalizar con éxito este TFG.
iii
Índice general
Agradecimientos ..............................................................................................................ii
Índice general .................................................................................................................. iii
Índice de Cuadros .......................................................................................................... vii
Índice de Figuras ........................................................................................................... viii
Índice de Abreviaturas ..................................................................................................... x
Resumen .........................................................................................................................xi
Capítulo I ......................................................................................................................... 1
Introducción ..................................................................................................................... 2
Sodio ............................................................................................................................... 2
Absorción y excreción de sodio ................................................................................... 3
Funciones del sodio ..................................................................................................... 3
Otras funciones del sodio relacionadas con las propiedades de los alimentos............ 6
Consumo recomendado y fuentes alimentarias de sodio ................................................ 7
Dietas restringidas en sodio .......................................................................................... 10
Información sobre el contenido de sodio en etiquetas .................................................. 11
Iniciativas para la reducción del consumo de sodio ...................................................... 13
Hipertensión y enfermedades cardiovasculares ............................................................ 15
El problema de la hipertensión en Costa Rica .............................................................. 17
Estudios del contenido de sodio en alimentos alrededor del mundo ............................. 18
Cuantificación de sodio en los alimentos de la canasta básica en Costa Rica ............. 19
Análisis de sodio en alimentos ...................................................................................... 22
Métodos de tratamiento de la muestra .......................................................................... 24
Calcinación ................................................................................................................ 24
iv
Digestión por horno de microondas ........................................................................... 25
Fuentes de sodio en galletas dulces y saladas ............................................................. 26
Validación de un método analítico ................................................................................ 27
Parámetros de desempeño ........................................................................................... 27
Precisión .................................................................................................................... 28
Veracidad ................................................................................................................... 29
Recuperación ............................................................................................................. 29
Robustez .................................................................................................................... 30
Selectividad/Especificidad.......................................................................................... 30
Linealidad e intervalo de trabajo ................................................................................ 30
Límites de detección y de cuantificación .................................................................... 31
Sensibilidad ................................................................................................................ 31
Incertidumbre ................................................................................................................ 31
Control de Calidad en el Laboratorio Analítico .............................................................. 32
Justificación ................................................................................................................... 33
Objetivo ......................................................................................................................... 34
Objetivos específicos .................................................................................................... 34
Capítulo II ...................................................................................................................... 35
SECCIÓN EXPERIMENTAL ......................................................................................... 35
Validación de comprobación de parámetros de la metodología .................................... 36
Linealidad de la curva de calibración ............................................................................ 36
Límites de detección y límites de cuantificación ............................................................ 36
Sensibilidad ................................................................................................................... 37
Precisión ....................................................................................................................... 37
Veracidad ...................................................................................................................... 38
v
Cálculo de Incertidumbre .............................................................................................. 38
Control de calidad y desempeño del equipo ................................................................. 39
Tratamiento estadístico de los datos ............................................................................. 39
Galletas escogidas ........................................................................................................ 39
Muestreo ....................................................................................................................... 40
Preparación de las muestras ......................................................................................... 41
Tratamiento de las muestras ......................................................................................... 41
Determinación de humedad .......................................................................................... 42
Determinación del contenido de sodio .......................................................................... 42
Capítulo III ..................................................................................................................... 44
Resultados y Discusión ................................................................................................. 44
Validación de comprobación de parámetros de la metodología analítica...................... 45
Linealidad y ámbito de trabajo de la curva de calibración de sodio .............................. 45
Coeficientes de correlación de Pearson .................................................................... 45
Significancia estadística del Coeficiente de Pearson ................................................. 46
Análisis de la Regresión Lineal Simple ...................................................................... 47
Análisis de residuales y homogeneidad de varianzas ................................................ 49
Prueba de Homogeneidad de varianzas .................................................................... 50
Análisis del ANOVA de la regresión de la curva de calibración ................................. 53
Límite de Detección y Límite de Cuantificación ............................................................. 54
Sensibilidad ................................................................................................................... 55
Precisión bajo condiciones de repetibilidad ................................................................... 57
Veracidad ...................................................................................................................... 62
Sesgo ......................................................................................................................... 62
Prueba de t de student para una muestra .................................................................. 63
vi
Pruebas de recuperación ........................................................................................... 64
Cálculo de Incertidumbre para el contenido de sodio en las galletas. ........................... 66
Definición del mensurando......................................................................................... 67
Análisis de las variables involucradas ........................................................................ 68
Evaluación de la incertidumbre de las variables involucradas. .................................. 69
Definición del modelo. ................................................................................................ 70
Cálculo de la incertidumbre........................................................................................ 71
Planteamiento del sistema de control de calidad para la generación de datos. ............ 74
Replicados de muestras ................................................................................................ 75
Determinación de humedad en galletas ........................................................................ 76
Resultados del contenido de sodio en las muestras de galletas ................................... 76
Capítulo IV .................................................................................................................... 84
Conclusiones ................................................................................................................. 85
Anexos .......................................................................................................................... 97
Anexo 1 ......................................................................................................................... 98
Anexo 2 ......................................................................................................................... 99
Anexo 3 ....................................................................................................................... 100
Anexo 4 ....................................................................................................................... 101
Anexo 5 ....................................................................................................................... 102
Anexo 6 ....................................................................................................................... 104
Anexo 7 ....................................................................................................................... 105
Anexo 8 ....................................................................................................................... 106
vii
Índice de Cuadros
Cuadro I. Requerimientos mínimos estimados para sodio en personas sanas según
edad y peso. .................................................................................................................... 8
Cuadro II. Guía para la información nutricional sobre el sodio en las etiquetas de los
alimentos. ...................................................................................................................... 12
Cuadro III. Composición de la canasta básica costarricense. ...................................... 20
Cuadro IV. Parámetros de operación del digestor por microondas para la
determinación de sodio en galletas. .............................................................................. 42
Cuadro V. Resultados de las fuentes de variación del ANOVA. ................................... 53
Cuadro VI. Sensibilidad de calibración y sensibilidad analítica. ................................... 56
Cuadro VII. Datos para el estudio de repetibilidad y veracidad para la metodología de
determinación de sodio en el MCR 1846 en el nivel intermedio de la curva de
calibración. .................................................................................................................... 58
Cuadro VIII. Resultados de sodio para una muestra de galleta homogénea media en
dos días distintos. ......................................................................................................... 60
Cuadro IX. Porcentajes de recuperación de sodio obtenidos en una muestra
homogénea de galleta. .................................................................................................. 65
Cuadro X. Valores e incertidumbres en la determinación de sodio. ............................. 72
Cuadro XI. Resumen de los resultados de sodio en los diferentes tipos de galletas. .. 82
viii
Índice de Figuras
Figura 1. Diagrama del sistema de la bomba de Na/K/Ca/ATPasa. ............................... 6
Figura 2. Curva de calibración para sodio mediante el método de mínimos cuadrados
no ponderados e intervalos de confianza (IC) al 95 %. ................................................. 48
Figura 3. Límite de detección y límite de cuantificación según Meier and Zünd para el
sodio. ............................................................................................................................. 55
Figura 4. Diagrama completo de causa y efecto de las variables involucradas. .......... 68
Figura 5. Diagrama completo de causa y efecto reordenado de las variables
involucradas. ................................................................................................................. 70
Figura 6. Contribución a la incertidumbre de las variables involucradas en la
determinación de análisis de sodio. .............................................................................. 73
Figura 7. Cuadro de control para el desempeño del equipo de Absorción Atómica AA
400 para el análisis de sodio. ........................................................................................ 74
Figura 8. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta SSRG
según lote de producción. ............................................................................................. 77
Figura 9. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta SDSRG
según lote de producción. ............................................................................................. 78
Figura 10. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta
SISRG según lote de producción. ................................................................................. 79
Figura 11. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta
SDSRG según lote de producción. ............................................................................... 80
Figura 12. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta DCRG
según lote de producción. ............................................................................................. 81
Figura 13. Comportamiento de los residuales de la regresión lineal de la curva de
calibración de sodio....................................................................................................... 98
Figura 14. Prueba de homogeneidad de varianzas a través de los intervalos de
confianza al 95 % de las desviaciones estándar de la curva de calibración de sodio. .. 99
Figura 15. Gráfico de Residuales de la Curva de Calibración de Sodio. .................... 100
ix
Figura 16. Prueba de normalidad de los datos obtenidos experimentalmente para el
MCR 1846 bajo condiciones de repetibilidad. ............................................................. 101
Figura 17. Prueba de normalidad de los datos para la prueba de hipótesis de
repetibilidad en el día 1. .............................................................................................. 102
Figura 18. Prueba de normalidad de los datos para la prueba de hipótesis de
repetibilidad en el día 2. .............................................................................................. 103
Figura 19. Prueba de homogeneidad de varianzas para la prueba de hipótesis de
comparación de los resultados de sodio en la muestra de galleta homogénea medida
en el día 2. .................................................................................................................. 104
Figura 20. Prueba de hipótesis para la comparación de los resultados de sodio de una
muestra homogénea de galleta medida en días distintos. .......................................... 105
Figura 21. Prueba de hipótesis de una muestra para la comparación del promedio de
los resultados de sodio en el MCR contra del valor certificado. .................................. 106
x
Índice de Abreviaturas
AOAC: Association of Official Analytical Chemists
NIST: National Institute of Standards and Technology
NLEA: English Nutrition Labeling and Education Act
FDA: Food Drug Administration
RTCA: Reglamento Técnico Centroamericano
OMS: Organización Mundial de la Salud
FAO: Food and Agriculture Organization
OPS: Organización Panamericana de la Salud
ARP: Actividad de la Renina Plasmática
CBA: Canasta Básica de Alimentos
SSRG: Galleta Salada sin Relleno Graso
SDSRG: Galleta Semidulce sin Relleno Graso
SCRG: Galleta Salada con Relleno Graso
DCRG: Galleta Dulce con Relleno Graso
SISRG: Galleta Salada Integral sin Relleno Graso
RDAs: Recommended Dietary Allowances
EAA: Espectrometría de Absorción Atómica de Llama
MCR: Material Certificado de Referencia
xi
Resumen
Se validó y se implementó el método cuantitativo para determinar el contenido de sodio
en cinco tipos de galletas producidas por Kraft Foods de Costa Rica.
La metodología utilizada fue espectrometría de absorción atómica de llama basado en
la metodología oficial de la AOAC 985.35; la modificación realizada a la metodología
consistió en el proceso de digestión de las muestras, ya que se validó la digestión por
medio de horno de microondas con ácido nítrico concentrado.
El muestreo de las galletas se realizó directamente en la planta de producción. Se
tomaron 30 lotes diferentes, abarcando distintos turnos, días y lotes de materias
primas. Cada lote de galleta se molió en un procesador de alimentos y se guardó en
material laminado hermético para su conservación hasta su uso.
Los parámetros de desempeño evaluados para el proceso de validación de la
metodología fueron: linealidad y ámbito de trabajo de la curva de calibración de sodio,
límites de detección y de cuantificación, sensibilidad de calibración, sensibilidad
analítica, precisión y veracidad. Se cuantificó la incertidumbre de la metodología se
llevó a cabo el control de calidad del equipo de absorción atómica por medio de un
patrón trazable a la NIST con una concentración de sodio conocida a través de gráficas
de control.
La linealidad se evaluó dentro de un ámbito de 0,100 mg/L a 1,000 mg/L. El límite de
detección obtenido fue de 0,036 mg/L y el límite de cuantificación fue de 0,069 mg/L,
ambos calculados según el método de Meier and Zünd. La sensibilidad de calibración
obtenida fue de 0,536 A*L/mg y la sensibilidad analítica fue de 709 L/mg.
La veracidad se evaluó por medio del Material Certificado de Referencia 1846 Fórmula
de Infantes de la NIST a través de la medición del sesgo el cual fue de -5,92 mg/kg de
sodio y además se realizaron pruebas de recuperación con un promedio de 100,9 % y
un coeficiente de variación del 1,1 %.
xii
La precisión fue determinada a través de la medida repetitiva del mismo material
certificado de referencia, del cual se obtuvo una desviación estándar de 48 mg/kg y un
coeficiente de variación de 2 % a un nivel de confianza del 95 %, valores que cumplen
con el máximo permitido reportado en la metodología oficial de la AOAC 985.35.
La cantidad de sodio obtenida en la galleta tipo SCRG fue de (919 ± 53) mg/100 g
siendo la galleta con mayor contenido de éste mineral. Con un contenido intermedio se
encuentran las galletas tipo SSRG con un valor de (907 ± 53) mg/100 g, seguido por la
galleta tipo SISRG con un valor de (885 ± 51) mg/100 g y la galleta tipo SDSRG con un
contenido de (703 ± 41) mg/100 g. Por último, la galleta con menor cantidad de sodio
fue la tipo DCRG con un valor de (460 ± 27) mg/100 g.
1
Capítulo I
INTRODUCCIÓN
2
Introducción
Los nutrientes son factores esenciales de la dieta, entre ellos se encuentran las
vitaminas, grasas, carbohidratos, proteínas, agua y los minerales. Los nutrientes no
pueden ser sintetizados en el organismo en cantidad suficiente. Las funciones básicas
de los nutrientes son proveer materiales para el crecimiento y restauración de los
tejidos, lo cual significa proporcionar y mantener la estructura básica del cuerpo, y
suministrar la energía requerida para efectuar las actividades externas, así como
realizar sus propias actividades internas, por lo que la función de cada nutriente va a
depender de la composición del mismo. (1, 2)
Los organismos vivos están compuestos de once elementos: carbono, hidrógeno,
oxígeno, nitrógeno y los siete minerales principales: calcio, fósforo y magnesio que se
utilizan principalmente en los huesos, el azufre presente en los aminoácidos y el sodio,
potasio y cloro que son electrolitos. Estos tres últimos funcionan en conjunto para
regular la osmolaridad de los líquidos intra y extracelulares. De ésta forma, los
elementos más abundantes en los alimentos son el carbono, el hidrógeno, el oxígeno y
el nitrógeno y al menos 25 minerales, de los cuales algunos se encuentran en
cantidades muy pequeñas, microelementos y otros en mayor abundancia,
macroelementos. (1, 2)
Sodio
El sodio es un macromineral esencial en la nutrición y el metabolismo del organismo
humano, además es un metal muy reactivo. En los alimentos o en el cuerpo humano
está presente en forma de sal, como cloruro de sodio, por lo tanto se encuentra como
catión. El sodio representa el 2 % del contenido mineral de todo el cuerpo y se
encuentra distribuido en los líquidos corporales extracelulares e intracelulares,
3
principalmente en los extracelulares los cuales incluyen el plasma con concentraciones
de 140 mmol/L de sodio, fluidos intersticiales, con concentraciones de 145 mmol/L de
sodio, y en el agua del plasma con concentraciones de 150 mmol/L de sodio. Del 30 %
al 40 % del sodio total del organismo se ubica en el esqueleto pero solo una pequeña
parte de este sodio es intercambiable con el de los líquidos corporales. (2, 3, 4, 5)
Absorción y excreción de sodio
El método de absorción de sodio se refiere al proceso de transporte de las moléculas
de sodio a través de las células epiteliales que revisten el tubo digestivo del intestino
delgado. El yeyuno absorbe más de la mitad total del sodio y en el ileón y el colón se
absorbe el resto. El sodio luego es transportado a los riñones, donde es filtrado y
regresado a la sangre para mantener los niveles apropiados. La excreción se da
mayoritariamente por la orina, el resto se elimina en las heces y el sudor. Tanto la
cantidad absorbida como la excretada de sodio son proporcionales al consumo del
mismo. (4, 5)
El equilibrio del sodio es regulado por la hormona aldosterona, haciendo que aumente
la sensación de sed cuando aumentan las concentraciones sanguíneas de sodio. Si al
contrario, las concentraciones son bajas, disminuye la excreción de sodio a través de la
orina. (4)
Funciones del sodio
El sodio es el principal catión del fluido extracelular y desempeña un papel importante
en el funcionamiento de los nervios y músculos, regulación del volumen plasmático y el
balance ácido-base. Además, facilita la absorción de nutrientes como la glucosa y
aminoácidos. Un consumo diario de aproximadamente 400 mg a 500 mg es suficiente
para asegurar las funciones orgánicas de un adulto. En el organismo humano, la mitad
4
de la sal se encuentra en la sangre y en los líquidos corporales, más de un tercio en los
huesos y el resto en las células. (6, 7)
El sodio interviene en el mantenimiento de cuatro funciones importantes en el
organismo:
Equilibrio y distribución del agua.
Equilibrio osmótico: el agua fluye a través de una membrana semipermeable
desde un compartamiento donde la concentración de solutos es más baja hacia
otro compartimento con mayor concentración; el sodio en forma de sales
conforma estos solutos.
Equilibrio ácido-base: es el equilibrio en que interviene la concentración de ión
hidrógeno y que está determinado por el pH. El sodio juega un papel muy
importante en el mecanismo regulador del pH a nivel celular siendo parte del
sistema amortiguador a través de las sales correspondientes de los ácidos y
bases débiles que amortiguan la adición de un ácido o base fuerte que se
agrega al sistema. Los fosfatos (Na2HPO4) y las proteínas son los
amortiguadores intracelulares primarios mientras que el sistema bicarbonato
(NaHCO3)/ácido carbónico (H2CO3) es el principal amortiguador extracelular.
Diferenciales intracelulares/extracelulares de sus concentraciones como
resultado del funcionamiento de las membranas: esta función interviene en los
gradientes del potencial eléctrico a través de las membranas de todas las
células, de forma que los gradientes más altos se encuentran en las neuronas y
en las células musculares. El sistema de la “bomba” de Na/K/Ca/ATPasa es
importante en la regulación del volumen, el mantenimiento del potencial de
membrana y el transporte de azucares, aminoácidos y otras moléculas a través
de las membranas. (4, 8)
5
La bomba de sodio y potasio consiste en una proteína transmembrana ATP (adeninosin
trifosfato) que se encuentra en todas las membranas celulares de los animales. Su
función principal es el transporte de los iones de sodio y potasio entre el medio
extracelular y el citoplasma o el citosol. (4, 8)
En la figura 1 se observa el mecanismo de esta bomba, el cual es dirigido por la
degradación del ATP y se produce a través de una serie de cambios configuracionales.
Tres iones de sodio se unen al lado citoplásmico de la proteína provocando el cambio
de configuración de la misma. En esta nueva configuración, la molécula se fosforila a
través de una molécula de ATP provocando un segundo cambio de configuración que
desplaza los tres iones de sodio a través de la membrana, además la proteína tiene
poca afinidad por los iones de sodio y los tres iones de sodio unidos se separan y se
esparcen en el líquido extracelular. De esta forma, la nueva configuración presenta
gran afinidad por los iones de potasio, por lo que dos se unen al lado extracelular de la
proteína, seguidamente el fosfato unido a la proteína se separa para que la proteína
vuelva a su configuración original y expone los dos iones de potasio al citoplasma de la
célula. Al tener esta configuración poca afinidad con los iones de potasio, se separan
de la proteína y se esparcen en el citoplasma de la célula.
6
Figura 1. Diagrama del sistema de la bomba de Na/K/Ca/ATPasa. (59)
Otras funciones del sodio relacionadas con las propiedades de los
alimentos
Otros roles del sodio corresponden a proveer sabor a los alimentos, además funciona
como un potenciador de sabor. En la mayoría de los casos, el sodio se encuentra en
los alimentos como cloruro de sodio y por ejemplo se agrega a la levadura de pan, el
cual es esencial para el crecimiento de la masa y el control del crecimiento de bacterias
y hongos no deseados. Además, funciona como un acondicionador de masa para
fortalecer el gluten. La sal también se agrega a muchos alimentos congelados para
7
preservar la textura. Además reduce la actividad del agua de los alimentos ayudando a
controlar el crecimiento de bacterias patogénicas. (5)
Entre otras fuentes de sodio se encuentra el bicarbonato de sodio y el fosfato de
aluminio y sodio los cuales funcionan como agentes de fermentación en pan que no
posee levadura. Otros aditivos como el benzoato de sodio y el bisulfito de sodio son
preservantes de alimentos procesados. (5)
Consumo recomendado y fuentes alimentarias de sodio
Los requerimientos mínimos recomendados o RDAs por sus siglas en inglés
(Recommended Dietary Allowances) son los niveles de consumo de nutrientes
esenciales, basados en conocimiento científico, que son considerados adecuados para
cumplir con las necesidades nutricionales de prácticamente todas las personas
saludables. Estos requerimientos fueron por primera vez publicados en 1943 durante la
Segunda Guerra Mundial con el objetivo de proveer estándares que servirían como
objetivo para alcanzar una buena nutrición. Los requerimientos para infantes y niños
deben cumplir con las cantidades que mantengan una tasa de crecimiento y desarrollo
satisfactoria, y para el caso de adultos, debe cumplir con las cantidades que
mantengan el peso corporal y que prevendrán el agotamiento de los nutrientes según
estudios de balance y mantenimiento de la concentración en la sangre y tejidos.
Además, el requerimiento será la cantidad que prevenga el fallo de una función
específica o el desarrollo de una deficiencia. Los RDAs se expresan en función de la
edad y el género. (9)
Para el caso de sodio los requerimientos están basados en estimaciones de la cantidad
que se necesita para el crecimiento y que dependa de la tasa de expansión del
volumen del fluido extracelular, el cual varía con la edad y el estatus reproductivo,
además del peso. A continuación se presenta un cuadro que resume estos
requerimientos según edad y peso. (9)
8
Cuadro I. Requerimientos mínimos estimados para sodio en personas sanas según
edad y peso. (60)
Edad Peso corporal (Kg) Sodio (mg)
Meses
0-5 4,5 120
6-11 8,9 200
Años
1 11 225
2-5 16 300
6-9 25 400
10-18 50 500
˃ 18 70 500
Para el caso de los adultos se ha establecido un consumo mínimo de 500 mg de sodio
por día, tomando en cuenta la gran variedad de patrones de actividad física y
exposición climática. En un clima templado, se ha estimado una pérdida de sodio por
medio de la orina y por pérdidas fecales de 23 mg por día, además de la pérdida en el
sudor que normalmente equivale a una concentración de 0,025 mol/L. (9)
En las mujeres durante el embarazo, hay un incremento en la necesidad de sodio, ya
que aumenta el volumen del fluido extracelular en la madre, los requerimientos del feto
y el nivel de sodio en el fluido amniótico. Esta necesidad ronda los 69 mg por día
adicionales al requerimiento normal y se ve amortiguada por una respuesta fisiológica
9
del sistema de la renina-angiotensina-aldosterona y por el consumo de sal proveniente
de los alimentos. En la lactancia, el requerimiento aumenta en unos 135 mg por día
adicionales, ya que la secreción de la leche es aproximadamente de 750 mL, la que
contiene 180 mg de sodio, y se recupera mediante el sodio ingerido en la dieta. (9)
Para el caso de infantes menores de un año, el requerimiento de sodio es mayor
conforme el volumen del fluido extracelular se expande rápidamente con el crecimiento
del niño. Suponiendo que el infante consume 750 mL diarios de leche materna, la cual
contiene aproximadamente 161 mg de sodio por litro y tomando en cuenta la pérdida
de sodio que sucede a través de la piel (9,2 mg/kg a 16,1 mg/kg), una cantidad entre
120 mg y 200 mg de sodio por día es suficiente para asegurar el crecimiento saludable
de los infantes. Para el caso de niños que son alimentados con fórmula infantil, un
consumo de 750 mL diarios les proveerá de un mínimo de 100 mg y un máximo de 300
mg de sodio por día. (9)
Las fuentes alimentarias de sodio incluyen el cloruro de sodio que es conocido como
sal común o sal de mesa, alimentos salados o con sodio añadidos durante la
preparación o procesamiento, sodio propio de los alimentos y agua químicamente
reblandecida. (2, 4)
Los alimentos poseen niveles naturales de sodio que solamente alcanzan el 10 % de la
ingesta diaria recomendada, pero se añade sal en la elaboración de muchos de ellos.
Por ejemplo, aunque el contenido de sodio en la carne fresca sea bajo, el tocino, los
embutidos y las tortas entre otros, contienen cantidades mayores de dicho elemento.
Lo mismo sucede en el caso del pescado: el pescado fresco contiene poco sodio pero
el pescado ahumado puede ser muy salado. (2)
Por otro lado, los alimentos procesados y los alimentos que se sirven en restaurantes
aportan más del 75 % de sodio de la dieta, además de los alimentos muy salados como
los aperitivos, carnes y quesos procesados, algunos panes y cereales para el
desayuno, sopas, salsas, que en algunos casos pueden contener cerca de la ingesta
total diaria recomendada de sodio. (10)
10
A pesar de estar presente en tantos alimentos, muchas personas les gusta consumir
más sal, por lo que el sodio ingerido proviene principalmente de la sal de mesa
aproximadamente de un 5 % a un 10 % y está relacionado con la adición de sal durante
la cocción. Otro tercio proviene de los cereales y el pan, cerca de un sexto de la carne
y de sus derivados, y el restante de otros alimentos. Dependiendo de la dieta de la
persona, entre un 4 % y 27 % del sodio proviene del agua potable. (2, 10, 11)
Dietas restringidas en sodio
La restricción de sodio depende del individuo, pero la mayoría de los médicos
recomiendan una dieta restrictiva de 2 g de sodio al día. Los pacientes con insuficiencia
cardiaca moderada o grave están restringidos a una ingesta de 1 g/día. Las cinco
formas más comunes de dietas restringidas en sodio son: (4)
Dieta sin sal de mesa añadida 4 g de sodio por día: se limitan los alimentos ricos
en sodio como alimentos procesados, aperitivos, aderezos, salsas, alimentos
congelados, enlatados y quesos procesados. Se permite un consumo diario de
media cucharada de sal de mesa. (4)
Restricción leve de sodio 2 g de sodio por día: se eliminan alimentos ricos en
sodio, se limitan los alimentos moderados en sodio. Se permite un consumo
diario de un cuarto de cucharadita de sal de mesa. (4)
Restricción moderada de sodio 1 g de sodio por día: se eliminan alimentos ricos
en sodio y los alimentos moderados en sodio. No se permite el consumo diario
de sal de mesa. Se omiten alimentos procesados, congelados y enlatados. Se
limita el pan regular y los alimentos horneados. (4)
Restricción estricta de sodio 500 mg de sodio por día: se eliminan alimentos
ricos en sodio y los alimentos moderados en sodio. No se permite el consumo
diario de sal de mesa. Se omiten alimentos procesados, congelados y enlatados.
Se omiten verduras con alto contenido de sodio en forma natural como las
11
remolachas, zanahorias, apio, entre otros. Se reemplaza el pan regular por pan
bajo en sodio. Se restringe el consumo de carne. (4)
Restricción severa de sodio/ 250 mg de sodio por día: se eliminan alimentos
ricos en sodio y los alimentos moderados en sodio. No se permite el consumo
diario de sal de mesa. Se omiten alimentos procesados, congelados y enlatados.
Se utiliza pan y leche baja en sodio. Se eliminan alimentos ricos en sodio
natural. (4)
Información sobre el contenido de sodio en etiquetas
En el año 1990 en Estados Unidos se aprobó el Acto de Nutrición, Educación y
Etiquetado (NLEA: por sus siglas en inglés Nutrition Labeling and Education Act) el cual
provee a la Administración de Drogas y Alimentos (FDA: por sus siglas en inglés Food
Drug Administration) de los reglamentos para el etiquetado nutricional y declaraciones
nutricionales; en el caso de sodio se modificaron los reglamentos y se proporcionaron
las siguientes definiciones legales para diferentes términos. Además el valor diario para
sodio se estableció en 2 400 mg/día. (12) Ver cuadro II.
12
Cuadro II. Guía para la información nutricional sobre el sodio en las etiquetas de los
alimentos. (61)
Definición Características por porción*
Libre de sodio Menos de 5 mg por porción, no puede
contener cloruro de sodio
Bajo sodio 140 mg o menos por porción
Muy bajo sodio 35 mg o menos por porción
Reducido en sodio Por lo menos 25 % menos sodio por
porción que el alimento regular
“Light” en sodio Por lo menos 50% menos sodio por
porción que el alimento regular
Sin sal Libre de sodio
*La porción está determinada según el alimento y se declara en la etiqueta de la
información nutricional.
En el caso de Centroamérica, el Reglamento Técnico Centroamericano RTCA
67.04.60:10 para el etiquetado nutricional de productos alimenticios pre envasados
para consumo humano para la población a partir de tres años de edad, establece que
el sodio se debe declarar en la etiqueta y cuando el aporte de sodio en el alimento sea
menor a 5 mg, se declara como 0 mg. El etiquetado sigue las mismas reglas establece
el NLEA. (13)
13
Iniciativas para la reducción del consumo de sodio
En el año 2002, la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización de las
Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO: por sus siglas en inglés
Food and Agriculture Organization) en conjunto con un grupo de 30 expertos,
prepararon un reporte con recomendaciones para ayudar a los distintos gobiernos a
luchar contra las enfermedades crónicas, incluyendo las enfermedades
cardiovasculares que han crecido de manera rápida por todo el mundo. En el 2001,
estas enfermedades fueron responsables del 60 % de las 57 millones de muertes en el
mundo y de un 46 % de la mortalidad mundial. Las enfermedades han sido ligadas a la
hipertensión, hipercolesterolemia, obesidad y falta de ejercicio físico. Las dietas no
balanceadas, incluyendo los altos consumos de sal, tienen un impacto negativo en la
presión sanguínea, y fueron identificadas como las causantes de estas enfermedades
crónicas. (7)
En América, el consumo de sal por persona ronda los 11,5 g a 17 g por día, por
ejemplo en Brazil el consumo promedio es de 11 g/día; en Argentina de 12 g/día; en
Chile de 9,8 g/día; en los Estados Unidos de 8,7 g/día y en Canadá de 7,7 g/día. Estos
valores duplican al recomendado por la OMS-FAO menor a 5 g de sal. En el 2009, la
OPS (Organización Panamericana de la Salud) respondió ante esta situación, por
medio de la Iniciativa de “Prevención de las enfermedades cardiovasculares en las
Américas mediante la reducción del consumo de sal alimentaría en toda la población”.
El grupo de expertos estableció una declaración de la política que recomienda a la
población de América una disminución gradual y sostenible del consumo de sal
alimentaria hasta el 2020. (14, 15)
Este proyecto tiene el propósito de iniciar un proceso de fortalecimiento de la capacidad
en la región, para implementar políticas de reducción del consumo de sal en toda la
población, así como promover la introducción de opciones saludables, como el
reemplazo del sodio con el potasio. (16)
14
Latinoamérica y el Caribe están experimentando un proceso de transición
epidemiológica ya que la mayor parte de la carga de morbilidad se debe a
enfermedades no transmisibles. La hipertensión es el factor de riesgo más importante
de enfermedades cardiovasculares y de muerte en todo el mundo, y aunque se sabe
que el consumo excesivo de sal es la causa principal de hipertensión, se ha prestado
poca atención al tema. (16)
Varias organizaciones internacionales han reconocido la existencia de una relación
entre el consumo excesivo de sal y el aumento de la presión arterial, en América la
prevalencia de hipertensión se sitúa entre un 21 % y 35 %. La OMS recomienda que el
consumo diario de sal sea menor a 5 g por persona y que corresponde a: (16)
Menos de 87 mmol de sodio o sal
Menos de 2000 mg de sodio
Menos de 0,87 cucharadita de sal
Además de ser un factor de riesgo para cardiopatías y accidentes cerebrovasculares, el
alto consumo de sal puede provocar:
Obesidad: el consumo de sal aumenta la sed por lo que se consume más
líquidos que pueden contener carbohidratos simples que agregan calorías.
Varios estudios han demostrado que un 20 % a 30 % de las calorías excesivas
en niños provienen del alto contenido de sal.
Asma: alimentos con alto contenido de sal podrían contribuir a la reactividad de
las vías respiratorios en el asma, ya que interviene en los mecanismos
biológicos que regulan los músculos lisos en las vías respiratorias. Esto aún no
se ha sido comprobado.
Cálculos renales: el alto contenido de sal aumenta la excreción de calcio en la
orina y la formación de cálculos de calcio por preferencia en la absorción de
sodio.
Osteoporosis: debida a la excreción elevada de calcio en la orina. El cloruro de
sodio induce una expansión del volumen, con un aumento de la velocidad de la
15
filtración glomerular, y en parte, por la competencia entre los iones de sodio y
calcio en el túbulo renal.
Cáncer gástrico: podría deberse a la presencia de agentes carcinógenos
(nitratos) en los alimentos con alto contenido de sal, además de que grandes
dosis de sodio pueden resultar en la destrucción de barreras mucosas como las
del estómago, permitiendo ser más fácilmente invadidas por carcinógenos. (4, 5,
16)
Algunas estrategias de países desarrollados como Estados Unidos, Reino Unido y
Finlandia incluyen:
Campañas de educación pública para alertar a la población del contenido de
sodio en alimentos empacados.
Consulta nutricional.
Etiquetado nutricional para alertar al consumidor del contenido de sal en el
producto.
Reducción de sodio voluntario de las industrias.
Políticas de compras de sectores públicos y privados.
Regulaciones de la FDA. (17)
Hipertensión y enfermedades cardiovasculares
La hipertensión es el factor de riesgo que lidera la mortalidad en el mundo. Numerosos
estudios basados en observaciones han proporcionado evidencia de la relación directa
entre la presión arterial y enfermedades cardiovasculares. Se estima que el 47 % de las
enfermedades coronarias, el 54 % de las enfermedades cerebrovasculares, el 25 % de
los paros cardiacos y el 20 % de los casos de insuficiencia renal pueden ser atribuidos
una presión arterial sistólica superior a 115 mm Hg. (16, 17, 18)
Esto se debe a que la presión arterial se ve afectada por la interacción del volumen de
sangre y la vasoconstricción (estrechamiento de los vasos sanguíneos), y el volumen
16
de sangre está determinado por el contenido de sal y de agua. Además el aumento del
consumo de sodio puede asociarse con el aumento de la masa ventricular izquierda. La
ingesta de sodio también influye en la actividad de la renina plasmática (ARP), la cual
incrementa la cantidad de angiotensinógeno en la sangre, y que finalmente aumenta la
presión arterial. Ésta incrementa la secreción de aldosterona, una hormona que ayuda
a controlar el equilibrio hídrico y de sales del cuerpo. (19)
Se ha comprobado que reducir la ingesta de sodio en 100 mmol (unos 5,9 g de sal) al
día, puede reducir la presión sanguínea de 3,1 a 6,0 mm Hg. La Organización Mundial
de la Salud ha estimado que reducir el consumo a 2,99 g de sal diarios puede resultar
en la reducción del 22 % de muertes debidas a enfermedades cerebrovasculares y una
reducción del 16 % de muertes debidas a enfermedades coronarias. Se estima que en
los Estados Unidos, al reducir el 25 % del contenido de sodio en los 10 principales
productos contribuyentes de la ingesta de sodio, puede resultar en una reducción de un
11 % del consumo promedio diario. (20, 21, 22)
La hipertensión afecta a personas de todas las edades, el riesgo de hipertensión inicia
con el consumo de sal en las primeras etapas de la vida ya que la exposición a los
alimentos salados aumenta la preferencia del niño por éstos alimentos y a su vez
aumenta el riesgo de sufrir enfermedades del corazón y cerebrovasculares en etapas
posteriores de la vida. Reducir un 42 % de sal en los niños puede disminuir la presión
arterial entre 1,2 mm Hg y 1,3 mm Hg, mientras que en lactantes una reducción del 54
% puede bajar la presión arterial 2,5 mm Hg. (14)
Hay que tener en cuenta que no todas las personas reaccionan igual al consumo de
sodio en cuanto al aumento de la presión arterial, lo cual hace que surja el término de
sensibilidad sódica. Por ejemplo las personas que son sensibles experimentan
reducciones de 10 mm Hg cuando siguen dietas bajas en sal. Por otro lado, las
personas de raza negra tienen presiones arteriales más altas que las personas blancas
pero son más sensibles a la sal, reduciendo en mayor proporción la presión arterial si
se reduce el consumo de sodio. (23)
17
El problema de la hipertensión en Costa Rica
En Costa Rica, las enfermedades del sistema circulatorio constituyen desde 1970 la
principal causa de muerte, representando un 33 % tanto en hombres como mujeres
mayores de 30 años. En el año 2000, la isquémica coronaria representó el 48 % de las
muertes de este grupo de enfermedades. En un estudio realizado entre 1993 y 1994
en los tres hospitales nacionales principales demostró que en todos los casos de
personas internadas con un primer infarto agudo de miocardio, el 55 % poseían
hipertensión arterial. (24)
Según los resultados de la Encuesta para Diabetes y Factores de Riesgo
Cardiovascular realizada en el Área Metropolitana de San José en el año 2004, se
encontró que un 25 % de la población adulta padece de esta enfermedad, de los cuales
el 16,2 % refirió ser hipertenso y el 9,4 % correspondió a casos nuevos y otro 25 % es
portador de pre-hipertensión. La distribución por sexo corresponde a un 25 % en
mujeres y un 26,1 % fueron hombres. (24)
Por los datos que se presentaron anteriormente, el país se ha unido a la iniciativa de la
OPS, logrando que el Ministerio de Salud desarrolle o implemente en un periodo 5 de
años al menos, una estrategia para reducir el consumo de sodio en la dieta de la
población nacional. (10)
La ingesta real de sodio en la población costarricense no es conocida actualmente, la
Encuesta Nacional sobre el consumo de sal doméstica en el hogar realizada en 1984,
demostró un consumo promedio de sal de 10,6 g/día a 13,5 g/día equivalente a 4,2 g a
5,3 g de sodio por día, distribuida entre pan francés, arroz, queso fresco, margarina y el
pan dulce. (3, 25)
En el 2001, una encuesta en Cartago mostró un consumo de 3 661 mg de sodio o un
consumo aparente de 7 g de sal por día, identificando como fuentes principales la sal
doméstica (61 %), pan y galletas (12 %), consomé (7 %), embutidos (6 %), carnes (3
%), leche y queso (3 %) y otros (4 %). Otro dato importante fue que el mayor consumo
18
de sodio se dió en hogares donde los jefes de familia tienen estudios universitarios.
(26)
Otro estudio realizado en el 2011 a un grupo de mujeres entre 20 años y 64 años
residentes de Escazú y Santa Ana demostró que el consumo de sal es de 7,6 g diarios
por persona o un equivalente a 2 997 mg de sodio por día. De este consumo total de
sal, los cereales y derivados representan un 48 %, las carnes y embutidos un 10 %, las
comidas rápidas y los huevos preparados un 8 %, lácteos y derivados un 7 %, comidas
mixtas y sopas y consomés un 6 %, vegetales y frutas un 4 %, grasas y azúcares un 2
% y las bebidas un 1 %. (27)
Este estudio indica que específicamente para el caso de las galletas, se demostró que
las galletas integrales representan el mayor consumo de sodio de todos los cereales
que se evaluaron, lo cual es relevante ya que muchas personas tienden a utilizar estos
alimentos como meriendas. (27)
Todos estos estudios comienzan a dar una idea del verdadero consumo de sodio y/o
sal de los habitantes de nuestro país, lo que constituye uno de los objetivos del Plan
Nacional para la Reducción del Consumo de Sal/Sodio en la población de Costa Rica
2011-2021.
Estudios del contenido de sodio en alimentos alrededor del mundo
A través del tiempo, se han desarrollado varias investigaciones para intentar entender
cuál es el contenido de sodio en algunos alimentos y en las dietas de ciertas
poblaciones, además de implementar ciertas medidas para disminuir el contenido de
sal. En el año 1997, investigadores mexicanos estudiaron el contenido de sodio por
fotometría de llama y tratamiento de muestra por calcinación y digestión ácida en
cereales mexicanos y aperitivos, encontrando altas cantidades de sal en los productos,
sobrepasando lo recomendado por la OMS. Ese mismo año, el gobierno de Australia
lanzó un programa donde se reformularon 12 cereales para desayuno, realizando una
19
reducción de aproximadamente 40 % en el contenido de sal. En el 2008, este mismo
país, elaboró un reporte donde se evaluaba el contenido de sodio en la dieta
australiana, encontrando que el 53 % de los alimentos evaluados poseían un nivel de
sodio por encima del recomendado y haciendo notable la necesidad de reducir el
mismo. En el año 2009, investigadores portugueses realizaron un estudio del contenido
de sodio en pan, encontrando grandes diferencias en la cantidad según el tipo de pan y
su origen, además encontraron que la mayoría de sodio provenía de la sal agregada y
no de la propia del cereal. Ese mismo año, en Estados Unidos se realizó un estudio de
la cantidad de sodio que se consume dentro de esta población, encontrando que los
alimentos procesados y provenientes de restaurantes contribuyen en un 77 % del total
de sodio ingerido, además se confirmó la variabilidad del contenido de sodio en los
productos alimenticios, sobre todo en las comidas rápidas, para así crear conciencia de
la necesidad de identificar esta variabilidad. (28, 29, 30, 31, 32)
En el caso de Latinoamérica, por ejemplo Argentina, en el presente año, se realizó una
encuesta en donde se midió el contenido de sal en productos horneados, al mismo
tiempo que se realizaba una reducción de sal en los mismos, logrando que los
consumidores no detectaran de forma sensorial la diferencia y provocando un
descenso en la presión arterial de las personas evaluadas. (33)
Cuantificación de sodio en los alimentos de la canasta básica en
Costa Rica
La Canasta Básica de Alimentos (CBA) se define “como un conjunto de alimentos
seleccionados de acuerdo con su aporte calórico y a su frecuencia de consumo;
expresados en cantidades que permiten satisfacer, por lo menos, las necesidades de
calorías promedio de un individuo de una población de referencia”. (34)
20
La canasta básica en Costa Rica está conformada por 17 grupos los cuales cada grupo
incluyen diferentes clases de alimentos según sea la zona rural o urbana. Estos
alimentos se muestran a continuación:
Cuadro III. Composición de la canasta básica costarricense. (62)
Grupos Artículos de la zona urbana Artículos de la zona rural
Lácteos y queso Leche semidescremada, Queso
tierno, blanco
Leche semidescremada, Queso
tierno, blanco
Carne de res Bistec de res, Carne molida de
res, Posta y hueso de res
Bistec de res, Carne molida de
res
Carne de cerdo Chuleta de cerdo, Posta de cerdo No se incluye
Carne de pollo Muslo de pollo, Pechuga de pollo,
Pollo entero
Muslo de pollo, Pollo entero
Embutidos Mortadela, Salchichón, Chorizo Mortadela, Salchichón
Pescado Atún Atún
Leguminosas Frijoles Negros y Frijoles Rojos Frijoles Negros y Frijoles Rojos.
Vegetales
Tomate, Cebolla, Culantro
castilla, Chile dulce o pimiento,
Chayote, Repollo verde o
morado, Zanahoria, Ajo
Tomate, Cebolla, Culantro
castilla, Chile dulce o
pimiento, Chayote, Repollo
verde o morado, Zanahoria, Ajo
Frutas Banano, Naranja dulce, Limón
ácido, Papaya, Manzana, Piña
Banano, Naranja dulce,
Manzana, Piña
Tubérculos y raíces Papa, Plátano maduro Papa, Plátano maduro
Pan y Galletas Pan salado, Pan dulce, Galleta
dulce, Galleta salada
Pan salado, Pan dulce, Galleta
dulce, Galleta salada
21
Cereales y otros
Arroz, Tortilla de maíz,
Espagueti, Cereales, Harina de
maíz (masa)
Arroz, Espagueti, Cereales,
Harina de maíz (masa)
Azúcar Azúcar Azúcar
Huevo Huevo Huevo
Grasas Aceite, Manteca vegetal,
Margarina, Natilla
Aceite, Manteca vegetal,
Margarina, Natilla
Otros alimentos Condimentos, Salsa, Sal Condimentos, Salsa, Sal
Bebidas no
alcohólicas Café, Bebidas naturales Café, Bebidas naturales
Los estudios realizados en Costa Rica para cuantificar la cantidad de sodio en los
alimentos de la canasta básica son pocos.
En el año 1994, María de los Ángeles Montero estudió el contenido de sodio en
diferentes tipos de galletas, pastas, avenas, tortillas y arroz. El estudio determinó que el
mayor contenido de sodio se encontraba en el pan (497 mg/100 g) y las galletas
integrales (354 mg/100 g). En cambio, las pastas, las tortillas, la avena y el arroz
poseen cantidades menores a los 8 mg/100 g, los cuales son muy bajos comparados
con las galletas y el pan. (35)
Más recientemente en el 2009, Ericka Valverde estudió el contenido de sodio en 46
alimentos prioritarios de la dieta del costarricense. Valverde estableció que la mayor
concentración de sodio la aportan los alimentos procesados como la leche en polvo
(452 mg/100 g), el pan blanco de trigo (430 mg/100 g), la tortilla (90 mg/100 g), el
queso crema (425 mg/100 g), el queso fresco (106 mg/100 g) y el queso mozzarella
(250 mg/100 g). (3)
22
Los alimentos con menor cantidad de sodio son las carnes (entre (44-70) mg/100 g), el
yogurt ((53-80) mg/100 g), la leche fluida descremada (46 mg/100 g), las verduras ((2-
24) mg/100 g) y las frutas (menos de 2 mg/100 g). (3)
Análisis de sodio en alimentos
Los métodos oficiales para la determinación de sodio en alimentos son: la fotometría de
llama, la espectrometría de emisión de llama, la espectrometría de emisión con plasma
acoplado inductivamente y la espectrometría de absorción atómica. (3)
Se puede determinar por medio de espectrometría de llama el contenido sodio total en
plantas (Método AOAC 956.01), en alimentos provenientes del mar (Método AOAC
969.23), sodio total en frutas y derivados (Método AOAC 966.16), en todos los
anteriores se utilizan distintos métodos para tratamiento de la muestra. (36)
Otras metodologías utilizan electrodos selectivos de iones para alimentos dietéticos
que presenten menos de 100 mg Na/100 g (Método AOAC 987.03). La espectrometría
de absorción atómica con llama se utiliza para determinar sodio total en cerveza
(Método AOAC 976.25), fórmula de infantes, productos de nutrición entera y alimentos
para mascotas (Método AOAC 985.35) (36)
Para el caso de la matriz de interés de esta tesis, la cual se basa en galletas dulces y
saladas, se utiliza como método de referencia el método AOAC 985.35. Este método
utiliza la técnica de calcinación por medio de mufla a 525 °C durante 8 h para la
destrucción de la materia orgánica. Luego las cenizas se disuelven en HNO3 1 mol/L.
La llama es una llama de aire-acetileno y se utiliza una disolución de CsCl al 0,5 %
como supresor de ionización. (36)
La espectrometría de absorción atómica con llama consiste en nebulizar la disolución
de la muestra mediante un flujo de gas oxidante, mezclado con el gas combustible,
para ser transportado a la llama donde se produce la atomización. Se producen varios
23
procesos en la llama los cuales incluyen desolvatación, la volatilización y la ionización
en cationes y electrones, los cuales son excitados por el calor de la llama, produciendo
espectros de emisión moleculares, atómicos e iónicos. (37)
Este método es muy específico ya que las líneas de absorción atómica son muy
estrechas y las energías de transición electrónica son únicas para cada elemento. La
fuente más común para las medidas de absorción atómica es la lámpara de cátodo
hueco, la cual provee de líneas de emisión muy estrechas, previniendo las
interferencias espectrales por superposición de las líneas. (37)
Las interferencias químicas son más comunes y se deben a procesos que suceden en
el seno de la llama y que están próximos al equilibrio. Estos equilibrios son la formación
de compuestos de baja volatilidad, las reacciones de disociación y las de ionización.
(37)
Para el caso específico de sodio, la interferencia química más importante que puede
suceder es la del equilibrio de ionización. Como consecuencia de las altas
temperaturas en la llama, hay una importante ionización reversible del átomo o
molécula neutra a su ion positivo y electrones libres. Esto puede provocar que se vea
afectada la intensidad de la línea de absorción atómica, ya que hay un aumento de los
átomos excitados y por lo tanto una disminución de la concentración de átomos como
resultado de la ionización. El equilibrio de ionización se representa de la siguiente
manera: (37)
Na Na+ + e-
Si este equilibrio está desplazado hacia la derecha se producirán resultados bajos
debidos a la baja absorción, ya que el espectro de absorción del Na+ es diferente del de
Na.
24
Para contrarrestar este efecto, se adiciona un supresor de ionización, el cual para este
caso particular es cloruro de cesio, con el objetivo de minimizar el efecto del
desplazamiento a la ionización. El cesio proporciona una concentración alta de
electrones en la llama y se suprime la ionización del analito, ya que el potencial de
ionización del cesio es menor que el del sodio y por lo tanto produce que el equilibrio se
desplace a la izquierda. (37)
Métodos de tratamiento de la muestra
Calcinación
La calcinación es la destrucción por oxidación de la materia orgánica y se utiliza para
eliminar los efectos de matriz que tienen las muestras de alimentos. La materia
orgánica se quema en un horno elevando gradualmente la temperatura hasta (500-600)
°C aproximadamente. Este residuo luego se prepara en una disolución de un ácido
mineral en caliente como el ácido nítrico para ser llevado al equipo de absorción
atómica. Este tipo de tratamientos de la muestra puede provocar pérdidas del analito
por volatilización o en forma de aerosoles en el humo. Algunas pérdidas se pueden dar
por el movimiento mecánico de materiales finamente divididos causados por las
corrientes de convección de aire caliente alrededor del crisol. (37, 38, 39)
Además, el tipo de reactivos para la digestión húmeda, pueden introducir tipos de
interferencias químicas y espectrales. Las interferencias por efectos de matriz tienen
influencia en el proceso de atomización. La composición global de la muestra puede
influir en el grado en que se disocian los átomos y la velocidad el proceso. (37, 38)
25
Digestión por horno de microondas
La técnica de digestión por horno de microondas es una técnica relativamente nueva,
desarrollada hace aproximadamente unos 20 años atrás. Las técnicas de
calentamiento incluyen la rotación dipolo y la conducción iónica. Al ser sometidas a un
campo eléctrico de microondas, las moléculas polares tienden a alinear sus momentos
dipolares con este campo, y como el campo está constantemente cambiando, las
moléculas rotan en ambos sentidos y causa que las moléculas choquen entre sí. Por
otro lado, los iones en disolución migran en presencia del campo eléctrico y esto causa
choque de moléculas. Estos movimientos provocan un aumento de temperatura en el
medio de reacción. (40)
En estos sistemas, la muestra se coloca en un contenedor cerrado que previene la
expansión libre y evaporación del contenido. El contenido puede ser calentado por
encima del punto de ebullición del líquido, ya que las elevadas presiones a las que se
trabaja previenen que hierva. Las altas temperaturas permiten que al mismo tiempo se
obtenga disolución, haciendo que la técnica de digestión por microondas tenga una
cinética de disolución-descomposición más acelerada que los métodos tradicionales.
(39)
Ventajas de un sistema cerrado de digestión:
Se minimiza la contaminación proveniente del medio y del vaso contenedor, ya
que es hecho de un fluoropolímero de Teflón.
Se previene la pérdida de volátiles.
A elevadas temperaturas, el ácido nítrico se convierte en un mejor agente
oxidante por lo que no se necesitan otros reactivos. La matriz resultante es
preferida para la técnica de Absorción Atómica.
Al utilizar menos cantidad de reactivos, se minimiza la contaminación y la matriz
es más simple. (39, 40)
Con respecto a la utilización del horno de microondas para digestión de muestras de
alimentos para determinación de sodio, Sapp y Davidson (1991), utilizaron esta técnica
26
para medir el contenido de sodio en cenas congeladas bajas en sodio, probando
además la repetibilidad y reproducibilidad del método. Los investigadores concluyeron
que es una metodología rápida, de baja variabilidad y sin interferencias por efectos de
matriz. (41)
Más recientemente, Valverde (2009) utilizó esta técnica para digerir diferentes tipos de
alimentos y medir el contenido de varios minerales incluido el sodio, así como una
validación exitosa de la metodología y de la digestión. (1)
Fuentes de sodio en galletas dulces y saladas
Las galletas son productos horneados que están compuestos principalmente por
harina, azúcar y grasa. Dependiendo del tipo de galleta, al finalizar el horneo, algunas
pueden ser cubiertas con chocolate, galletas tipo emparedado con algún relleno graso
o galletas saborizadas. (42)
La masa con la cual se prepara las galletas se divide en dos tipos: suave y dura, en
donde la diferencia radica en la cantidad de agua necesaria para manejar la masa. La
masa dura se utiliza para hacer galletas saladas o semi dulces y la masa suave para
hacer galletas dulces. (42)
En la preparación de galletas se utilizan otros ingredientes como la sal, enzimas, polvo
de hornear, bicarbonato de sodio, bicarbonato de amonio y algunos ácidos. Estos
ingredientes, aparte de la harina, son potenciales fuentes de sodio en las galletas. (42)
La sal se utiliza para proporcionar sabor y como potenciador de sabor de otros
ingredientes; el bicarbonato de sodio o el polvo de hornear se usa para dar textura y
crecimiento en la galleta así como ajustar la acidez de la masa. (42)
Para el caso de las galletas dulces a base de cocoa, la cocoa también es una potencial
fuente de sodio. Los granos de cacao son sometidos a un proceso de tostado y se
27
sumergen en una disolución alcalina caliente para luego molerse y obtener como
resultado la cocoa en polvo. (42)
Las galletas que se utilizaron para este estudio incluyen ambos tipos: galletas saladas y
galletas dulces con rellenos grasos, además de galletas integrales. Estas galletas son
ingeridas por los niños y jóvenes como aperitivos y por ende nace la importancia de
cuantificar la cantidad de sodio en las mismas y contar con una metodología validada
para estas cuantificaciones.
Validación de un método analítico
Según la Eurachem, la validación de un método consiste en el proceso práctico de
determinar la idoneidad de un método para proveer datos analíticos que se ajusten al
fin previsto. Para alcanzar esto, algunos parámetros de desempeño deben ser
corroborados antes de aplicar el método a las muestras de interés. (43,44)
La validación es específica para una combinación particular de la matriz de la muestra
y el analito, así como el equipo utilizado en el proceso de validación, por lo que se
definen parámetros de desempeño aceptables dentro de esas limitaciones analíticas.
Además la validación culmina con la evaluación de la incertidumbre asociada al
resultado obtenido al aplicar el método. (43)
Parámetros de desempeño
Hay muchos parámetros que pueden ser investigados para la validación de un método
los cuales dependen del alcance del mismo. Estos parámetros son: precisión,
expresada como repetibilidad o reproducibilidad, veracidad (precisión + exactitud), que
se puede calcular a partir del sesgo analizando un material certificado o por
28
recuperaciones de una cantidad exactamente conocida de una disolución patrón,
robustez, especificidad, límite de detección y de cuantificación, linealidad y ámbito de
trabajo. (43)
Precisión
La precisión se define como el grado de concordancia entre los resultados de
mediciones independientes obtenidos bajo condiciones establecidas. Es importante
notar que mediciones independientes se refiere a que las réplicas se deben realizar
siguiendo el método completo, desde el muestreo hasta la preparación de la muestra y
el procedimiento de medición. Por otro lado, la precisión se mide bajo condiciones
definidas de repetibilidad y reproducibilidad. (43)
La herramienta estadística para la medición de la precisión es la desviación estándar
(sr) o la desviación estándar relativa (se define como la desviación estándar dividida por
el promedio de los resultados) y se puede definir también como el coeficiente de
variación (CV). Entre mayor es la desviación estándar o el CV, mayor es el error
aleatorio presente en el sistema y menos preciso es el método. (43)
La repetibilidad es la precisión obtenida por mediciones realizadas utilizando un método
específico, en una muestra particular y bajo condiciones similares tales como analista,
equipo, laboratorio y en un intervalo de tiempo corto entre análisis. La repetibilidad
indica la variación que se puede esperar cuando un analista realiza réplicas de una
muestra y discernir si la variación es debida al error aleatorio o las muestras en sí. (43)
La reproducibilidad es la precisión obtenida por mediciones realizadas utilizando el
mismo método en la misma muestra pero variando algunas condiciones como el
analista, el equipo, laboratorio y en intervalos más grandes de tiempo entre análisis. La
reproducibilidad refleja la variación en el método proveniente de muchas fuentes
posibles. (43)
29
A partir de la desviación estándar de repetibilidad, se calculan los límites de
repetibilidad (“r”), los cuales permiten al analista decidir si la diferencia entre los
resultados de análisis duplicados, bajo condiciones de repetibilidad, son significativos.
La fórmula para calcular este límite es: (44)
[1]
Donde al 95 % de confianza equivale a 1,96. (44)
Veracidad
La exactitud o veracidad se define como la diferencia entre el valor esperado o medido
y el valor real. En la práctica, el valor real se sustituye por un valor de referencia
aceptado y la veracidad se expresa experimentalmente en términos de sesgo. Además
es posible evaluarla por medio de estudios de recuperación. (43)
Recuperación
La recuperación es una medida de la eficiencia de un método analítico para recuperar y
determinar el analito que se encuentra enriquecido en la matriz de interés,
especialmente en el muestreo y tratamiento de la muestra. (43)
Para determinar el porcentaje recuperado, se adiciona una fracción de analito a la
muestra de prueba antes del análisis, previamente al análisis de una muestra fortificada
y sin fortificar. (44)
30
Robustez
Medida de la capacidad de un procedimiento analítico de permanecer inafectado por
pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee una
indicación de su confiabilidad en condiciones de uso normales. (44)
Para evaluar la robustez, se introduce un diseño de experimentos cambiando los
parámetros y evaluando el efecto en el resultado. (43)
Selectividad/Especificidad
La selectividad de un método analítico evalúa la fiabilidad de la medición en presencia
de interferencias, estas interferencias incluyen impurezas, componentes degradados,
posibles inhibidores o catalíticos de la reacción, y parámetros físicos como
temperatura, fuerza iónica o pH. (43, 44)
Linealidad e intervalo de trabajo
El intervalo de trabajo es el rango en el cual los resultados tienen una incertidumbre
aceptable y es determinado por la concentración inferior y superior de un analito para el
cual el método es adecuado. También es conocido como el rango dinámico. (43)
La linealidad generalmente se vincula con el intervalo de trabajo del método y se refiere
a la habilidad del método para proporcionar una respuesta que sea directamente
proporcional a la concentración del analito. (43, 44)
El ámbito lineal de trabajo recomendado en la metodología oficial de la AOAC 985.35
es de 0,003 mg/L a 0,5 mg/L.
31
Límites de detección y de cuantificación
La definición del límite de detección (LD) según Miller&Miller, es aquella concentración
que proporciona una señal del instrumento significativamente diferente a la señal del
blanco o del ruido de fondo. (45)
El límite de cuantificación se define como la concentración más baja que puede ser
determinada con nivel aceptable de precisión y veracidad. (44, 45)
Sensibilidad
La sensibilidad se define como el cambio en la respuesta del instrumento debido al
cambio en la concentración del analito. Específicamente, la sensibilidad de calibración
(S.C) se refiere a la pendiente de la curva de calibración. (44).
La sensibilidad analítica ( ) es la comparación entre la pendiente (m) de la curva de
calibración con respecto a la desviación estándar de la señal analítica (Ss) a una
concentración específica del analito. (37)
[2]
Incertidumbre
La incertidumbre se define como un "parámetro asociado con el resultado de una
medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser atribuidos
razonablemente al mensurando". (44)
32
Control de Calidad en el Laboratorio Analítico
El control de calidad se define como todas las técnicas y actividades operacionales que
son utilizadas para satisfacer los requerimientos de calidad. El control de calidad
interno se refiere al conjunto de procedimientos adaptados por el personal de un
laboratorio para el monitoreo continuo de las operaciones y los resultados de las
mediciones con el objetivo de decidir si los resultados son confiables para ser
liberados. (44)
El monitoreo continuo del desempeño analítico de una metodología implementada en el
laboratorio de una industria alimenticia es crítico para asegurar que se está
produciendo alimentos con la calidad adecuada y requerida tanto internamente como
para el cliente. (49)
Luego de haber validado la metodología es necesario asegurar que los datos que se
está produciendo de forma rutinaria se encuentren bajo control. Esto se puede realizar
mediante del análisis de muestras control bajo las mismas condiciones. Si no se
encuentran diferencias significativas de acuerdo a las pruebas de veracidad y precisión,
el método analítico se encuentra aún bajo control estadístico, lo que significa que la
variación de los resultados pertenece a la misma distribución. (49)
Los datos obtenidos a partir de éstas muestras control se evalúan mediante gráficos de
control. Hay muchos tipos pero todos muestran los cambios de un parámetro a través
del tiempo. (49)
Los gráficos de control más utilizados son los cuadros de Shewart. Estos cuadros se
construyen con los datos obtenidos en un periodo previo. Se crea una línea central que
representa el valor promedio y los datos se distribuyen de forma aleatoria alrededor de
esa línea. Luego de forma estadística se crean los límites de control y los límites de
acción para controlar los nuevos datos. (49)
33
Justificación
La gran variabilidad de contenido de sodio entre alimentos similares y el no
cumplimiento del etiquetado nutricional con respecto al contenido del mismo, han
creado la necesidad de evaluar con precisión la ingesta de sodio de los individuos para
poder actualizar la cantidad diaria recomendada y establecer un nivel máximo de sodio.
Además, permite a las industrias alimenticias diseñar programas donde se reformulen
los alimentos para poder disminuir el contenido de sodio. Es por esto, que la empresa
Kraft Foods Costa Rica, está implementando un programa donde se pretende disminuir
el contenido de sodio en sus galletas, y es la razón por la cual se desarrolló este
trabajo final de graduación, en donde inicialmente se validó la metodología para la
cuantificación de este mineral por medio de la técnica de espectroscopia de absorción
atómica de llama y seguidamente se determinó el contenido real de sodio de cinco
tipos de galletas.
34
Objetivo
Implementar la metodología oficial de análisis de sodio por espectroscopia de
Absorción Atómica de llama en galletas de la empresa Kraft Foods Costa Rica, con el
fin de determinar la cantidad real de sodio que ellas contienen.
Objetivos específicos
Obtener los parámetros de validación de comprobación de la metodología oficial
AOAC 985.35 para la determinación de sodio.
Establecer los parámetros de control de calidad para la aplicación rutinaria del
método en el proceso productivo de la empresa Kraft Foods Costa Rica.
Cuantificar la cantidad total de sodio en cinco tipos de galletas.
Generar la información del contenido real de sodio al departamento de
Investigación y Desarrollo de la empresa en las cinco galletas analizadas.
35
Capítulo II
SECCIÓN EXPERIMENTAL
36
Validación de comprobación de parámetros de la metodología
Se realizó una validación de comprobación de los parámetros de la metodología oficial
de la AOAC 985.35 Minerales en Fórmula de Infantes, Productos Enteros y Alimentos
para Mascotas. (51)
Linealidad de la curva de calibración
Se comprobó el ámbito de linealidad de la curva de calibración entre 0,1000 mg/L hasta
1,0000 mg/L en sodio, establecido en el equipo Perkin Elmer AA400.
Para esto se preparó la curva con 8 patrones con su respectivo blanco y se realizaron
7 lecturas al azar para cada patrón. Se graficó la absorbancia en función de la
concentración para cada uno de los patrones y se comprobó la línea. La curva de
calibración se determinó mediante una hoja de cálculo de excel a través del método de
mínimos cuadrados no ponderados.
Además se utilizaron pruebas estadísticas para comprobar la relación lineal entre la
concentración y la absorbancia así como la prueba de homogeneidad de varianzas.
Límites de detección y límites de cuantificación
Los límites de detección y cuantificación se determinaron utilizando la metodología
propuesta por Meier y Zünd. Este método gráfico toma en cuenta los límites de
confianza al 95 % y la recta de regresión de la curva de calibración utilizando el método
de los mínimos cuadrados no ponderados. (45)
37
Los límites de detección y cuantificación se calcularon utilizando el promedio de las 7
lecturas al azar que se realizó a cada patrón de la curva de calibración mencionada en
la sección de linealidad.
Sensibilidad
Para obtener la sensibilidad de calibración, se promediaron las pendientes de 18
curvas de calibración.
Para el caso de la sensibilidad analítica, se calculó dividiendo la sensibilidad de
calibración entre la desviación estándar promedio de la absorbancia al nivel de
concentración intermedia de la curva de calibración.
Precisión
La repetibilidad se estableció al analizar 10 réplicas del material certificado de
referencia 1846 de fórmula de infantes del NIST (National Institute of Standards and
Technology) al nivel de concentración dentro del ámbito lineal de trabajo.
Se calculó la desviación estándar y el límite de repetibilidad al 95 % de confianza y se
comparó con el valor de la literatura (AOAC 985.35).
Además se tomó una muestra homogénea de galleta, y se realizaron 7 réplicas de la
misma, las cuales se midieron en dos días distintos y se comprobó que no hubiera
diferencia entre los resultados de las réplicas y los resultados de ambos días.
38
Veracidad
La veracidad del método se comprobó al analizar el material certificado de referencia
1846 de fórmula de infantes de la NIST (National Institute of Standards and
Technology) al nivel de concentración dentro del ámbito lineal de trabajo y comparando
los valores obtenidos con el valor de referencia certificado utilizando la prueba de
sesgo y una prueba de hipótesis.
Además se realizó una prueba de recuperación en donde se utilizó una muestra de
galleta a la cual se le añadió una cantidad conocida de estándar de sodio de forma que
la muestra final estuviera dentro del intervalo lineal de trabajo. Se realizaron 10
réplicas.
Cálculo de Incertidumbre
El cálculo de incertidumbre para reportar la cantidad total de sodio en las galletas
escogidas se realizó siguiendo los pasos recomendados en la Guía para la
Cuantificación de la Incertidumbre en las Mediciones Analíticas de la Eurachem/CITAC.
Se construyó un gráfico para mostrar cual fuente de variación contribuyó con mayor
fuerza en el valor final de incertidumbre así como la incertidumbre expandida asociada
al contenido de sodio en las galletas.
39
Control de calidad y desempeño del equipo
Se construyeron cuadros de control utilizando la disolución de la curva de calibración
que representa el patrón de sensibilidad (0,3 mg/L) fijando el valor central mediante el
promedio de una serie de mediciones y estableciendo los límites de control y de acción
para control y corrección de las mediciones de las muestras. La disolución control se
analizó después de la calibración y cada 10 lecturas de muestras.
Tratamiento estadístico de los datos
El tratamiento estadístico y la construcción de las gráficas para la representación de los
datos obtenidos en este trabajo final de graduación se realizó utilizando la herramienta
de excel y a su vez se validó la información con el programa estadístico Minitab ®
16.1.0. bajo la licencia de Kraft Foods.
Galletas escogidas
Se escogieron 5 tipos diferentes de galletas producidas por Kraft Foods con el fin de
determinar la cantidad de sodio presente en las mismas, ya que anteriormente no se
conocía el valor analítico de sodio, sino solamente el valor teórico derivado de la
cantidad de sodio reportado según formulación.
40
Los tipos de galletas fueron los siguientes:
1. Un tipo de galleta salada sin relleno graso.
2. Un tipo de galleta semidulce sin relleno graso.
3. Un tipo de galleta salada con relleno graso salado.
4. Un tipo de galleta dulce con relleno graso dulce.
5. Un tipo de galleta salada integral sin relleno graso.
Para mayor facilidad las galletas serán codificadas de ahora en delante de la siguiente
forma respectivamente:
1. SSRG
2. SDSRG
3. SCRG
4. DCRG
5. SISRG
Muestreo
Con el fin de determinar el contenido de sodio en cada tipo de galleta, se tomaron
muestras empacadas de la línea de producción de la planta. Como el contenido de
sodio es variable por las condiciones propias del proceso de producción, tales como
diferentes materias primas, turno de producción, personal, condiciones ambientales y
desempeño de la planta; se decidió muestrear 30 lotes diferentes de cada tipo de
galleta recolectados de forma aleatoria.
La muestra primaria de cada lote de galleta correspondía a 12 paquetes individuales de
30 g cada uno, que generaba un aproximado de 360 g de galleta. De estos 12
paquetes se tomaron 4 de forma aleatoria para la determinación por duplicado tanto de
humedad como de sodio.
41
Preparación de las muestras
Para cada lote de galleta, se tomaron los 4 paquetes y se molieron utilizando un
procesador de alimentos. Las galletas que contenían relleno graso se molieron
incluyendo el relleno. La muestra molida se almacenó en bolsas hechas de laminado
de triple capa con barrera a la humedad y selladas herméticamente.
Tratamiento de las muestras
Cada muestra se pesó de forma exacta utilizando una balanza analítica y se digirió
utilizando la técnica de digestión de microondas. El equipo usado fue un
speedwave®two de Berghof, utilizando como agente oxidante HNO3 al 65 % en masa,
de calidad A.C.S. Se utilizó un programa de digestión en etapas con tiempo,
temperatura y potencia establecidas, el cual se explica en el cuadro IV. Además, según
la capacidad de los vasos de digestión, la presión máxima de trabajo fue de 40 bar (580
psi).
42
Cuadro IV. Parámetros de operación del digestor por microondas para la
determinación de sodio en galletas. (63)
Paso 1 2 3 4 5
Rampa min 2 5 2 1 1
Tiempo min 5 10 15 10 1
Temp °C 145 170 190 75 75
Máx poder
90 % Tiempo
Total 52 min
Determinación de humedad
La determinación de humedad se realizó utilizando una balanza de humedad de
calentamiento halógeno Mettler Toledo HB-43S. El método que se utilizó había sido
anteriormente validado en Kraft Foods, por medio de una validación de equivalencia de
metodologías contra el método oficial de la AOAC 935.36.
Determinación del contenido de sodio
El contenido de sodio en las galletas se determinó por medio de la técnica de
espectrometría de absorción atómica de llama (EAA) utilizando un espectrómetro de
absorción atómica Perkin Elmer AAnalyst 400, equipado con una lámpara de cátodo
hueco de sodio y una llama de aire-acetileno.
43
El método de referencia fue el método oficial de la AOAC 985.35 de acuerdo con los
siguientes parámetros:
Como supresor de ionización se utilizó una disolución de CsCl al 0,5 % m/v en
donde el reactivo CsCl utilizado fue de la casa J.T Baker grado ultrapuro.
La curva de calibración se preparó a partir de un estándar se sodio de 1 000
mg/L de la casa Merck trazable al S.I por el NIST.
El analito se determinó a una longitud de onda de 589,0 nm.
44
Capítulo III
Resultados y Discusión
45
Validación de comprobación de parámetros de la metodología
analítica
A continuación se presentarán los resultados de la comprobación de parámetros para
la validación de la metodología de análisis de sodio así como los resultados de sodio
en los tipos de galletas escogidas.
Linealidad y ámbito de trabajo de la curva de calibración de sodio
El ámbito de trabajo se validó según lo recomendado por el equipo de Absorción
Atómica Perkin Elmer AAnalyst 400 el cual fue de 0,100 mg/L a 1,000 mg/L. Para esto
se llevó a cabo el estudio de correlación y el análisis de la regresión lineal de la curva
de calibración. (46)
Coeficientes de correlación de Pearson
La correlación mide el grado de asociación lineal entre las variables X y Y y si su
relación es directa o inversa. Cuando la relación es perfectamente lineal dicho
coeficiente vale 1 (ó -1). Cuando el coeficiente tiene un valor próximo a cero, o bien no
existe relación entre las variables analizadas o bien dicha relación no es lineal. Sin
embargo, incluso si hay un alto grado de correlación, esta herramienta no implica causa
y efecto en las variables. Este coeficiente es adimensional. El coeficiente de correlación
de Pearson ( se calcula según la siguiente ecuación: (47)
46
[5]
Donde indica el valor de la variable 1 para el individuo i, indica el valor de la
variable 2 para el individuo i, y son los promedios respectivos. son las
desviaciones estándar de las muestras. (47)
El coeficiente de correlación de Pearson para la curva de calibración de sodio fue de
0,9962 y fue calculado promediando las 7 réplicas realizadas al azar de cada punto de
la curva. Este valor indica que hay una alta relación lineal y que además es positiva,
entre las variables de concentración y absorbancia.
Significancia estadística del Coeficiente de Pearson
Para comprobar la significancia estadística de este coeficiente debemos determinar si
es estadísticamente diferente de cero, con lo cual se comprueba que en efecto existe
una relación significativa entre ambas variables. Esto se realiza mediante una prueba
de t-student de dos colas con n–2 grados de libertad y a un nivel de confianza del 95 %.
Se plantea la hipótesis nula (H0) de que no hay correlación entre las variables X y Y.
(46)
Hipótesis nula y alternativa para el coeficiente de correlación ( ):
Las variables no están asociadas (sin significancia estadística).
Las variables están asociadas (con significancia estadística).
El valor de t experimental se calcula según la siguiente ecuación:
47
[6]
Se obtuvo un valor de 28,05 el cual es mayor que el valor de t crítico. El t crítico para
dos colas y a un nivel de significancia del 95 % es 2,45, de esta forma se rechaza la
hipótesis nula y se concluye que la correlación obtenida es diferente de cero y por tanto
las variables de absorbancia y concentración están relacionadas significativamente.
Análisis de la Regresión Lineal Simple
La regresión mide la fuerza de asociación entre una variable independiente y la variable
dependiente (también llamada la variable de respuesta). En la siguiente figura se
observa la curva de calibración y la ecuación de la recta de mejor ajuste calculada con
el método de mínimos cuadrados no ponderados. (48)
48
Figura 2. Curva de calibración para sodio mediante el método de mínimos cuadrados
no ponderados e intervalos de confianza (IC) al 95 %.
Se observa que en el centro de gravedad de la curva de calibración a una
concentración de 0,500 mg/L los intervalos de confianza se hacen más angostos por lo
tanto el corredor de errores es mínimo y se minimiza el error asociado con el valor de
interpolación de las muestras cercanas a esa concentración. (48)
Por otro lado, el R2 mide la proporción de la variación que es explicada por el modelo.
Idealmente este valor debería ser cercano al 100 % indicando un error igual a cero. El
R2 en la curva de calibración de sodio fue de 99,62 %. (48)
Para comprobar que el modelo de la regresión lineal simple es correcto se utiliza el
análisis de Varianzas conocido como ANOVA por sus siglas en inglés. ANOVA es una
técnica estadística valiosa utilizada para estimar y separar las fuentes de variación.
Para este caso particular de la curva de calibración de sodio, se descomponen las
49
fuentes de variación sobre la señal analítica en la suma de cuadrados de la
contribución debida a la regresión (SCreg) y la suma de cuadrados debida al error
residual de la respuesta analítica (SCres). (3, 49)
La hipótesis nula que se plantea en éste caso es la siguiente:
Donde, la corresponde a la varianza asociada a la regresión y es la varianza
asociada al error residual.
Antes de obtener el modelo de predicción es importante analizar los residuales para
validar los supuestos de la regresión, los cuales son: (49)
Los residuos deben ser normales con un promedio de cero.
Los residuos deben ser aleatorios
Las varianzas deben ser homogéneas (homocedasticidad)
Los residuos deben ser independientes unos de otros.
Análisis de residuales y homogeneidad de varianzas
En el anexo 1 se muestra un gráfico donde se representa el comportamiento de los
residuales. Se observa que los residuos son aleatorios, no forman grupos, mezclas ni
tienen alguna tendencia. Minitab ® 16.0 permite comprobar el comportamiento de los
residuos de forma estadística a través de un valor de P.
El valor de P se utiliza en pruebas de hipótesis con el objetivo de rechazar o no
rechazar la hipótesis nula y tiene un valor entre 0 y 1. Este valor representa la
probabilidad de tener un error Tipo I (representado con un valor de alfa α), en otras
palabras la probabilidad de rechazar la hipótesis nula cuando es cierta. El valor de α
comúnmente utilizado es de 0,05 y si el valor P de la prueba estadística calculado a
50
partir de las muestras observadas es menor que el valor de α, se rechaza la hipótesis
nula. (54)
Las hipótesis nulas planteadas para comprobar el comportamiento de los residuales
fueron:
Los residuales no forman grupos o clúster.
Los residuales no forman mezclas.
Los residuales no siguen tendencias.
Los residuales no oscilan.
Para los cuatro casos los valores de P obtenidos fueron mayores al valor α de 0,05; por
lo tanto no existe evidencia significativa para rechazar la hipótesis nula y se concluye
que los residuales no forman grupos, mezclas, no siguen una tendencia ni oscilan.
Prueba de Homogeneidad de varianzas
La prueba de homogeneidad de varianzas u homocedasticidad del sistema analítico
comprueba que a pesar de tener diferentes muestras que provienen de diferentes
poblaciones con diferentes promedios, los mismos tienen la misma varianza. Existen
muchas pruebas para verificar si el supuesto de homogeneidad de varianzas es posible
o no, entre ellas la Prueba de Barlett, la prueba de Levene, la prueba de Cochran, la
prueba de Fligner & Killeen, entre otras. En esta investigación se utilizaron solamente
las pruebas de Barlett y Levene. (48)
La prueba de Bartlett es la que se utiliza con más frecuencia y se usa cuando los datos
provienen de distribuciones normales.
51
Se define estadísticamente de la siguiente forma:
[7]
Donde
[8]
La notación representa lo siguiente:
k: número de muestras.
ni: tamaño de la i-ésima muestra.
: Varianza estimada para la i-ésima población a partir de una muestra de tamaño ni.
N: ni + n2 +…+ nk
s2: varianza total estimada.
La hipótesis nula planteaba que todas las varianzas son iguales a lo largo de todos los
puntos de la curva de calibración.
Cuando la hipótesis nula es cierta, el estadístico tiene una distribución
aproximadamente con k-1 grados de libertad. (55)
La prueba de Levene se utiliza cuando los datos provienen de datos continuos, pero no
necesariamente de datos normales. Este método toma en cuenta la distancia de las
observaciones hacia la mediana en vez del promedio de la muestra, lo que hace la
52
prueba más robusta para muestras pequeñas. Esta prueba es usual el estadístico F.
(55)
El estadístico de esta prueba se define como:
[9]
Donde puede tener una de las siguientes tres definiciones:
donde es la media del i-ésimo subgrupo.
donde es la mediana del i-ésimo subgrupo
donde es la media recortada al 10 % del i-ésimo subgrupo
es la media global de y es la media del i-ésimo subgrupo de los
La prueba de Levene rechaza la hipótesis nula de que las varianzas son iguales con un
nivel de significancia de α si donde es el valor crítico
superior de la distribución con grados de libertad en el numerador y
grados de libertad en el denominador a un nivel de significancia α. (55)
De igual forma que para el análisis de los residuales, Minitab 16.0 comprueba la
igualdad de varianzas a través del valor de P para las pruebas de Barlett y Levene con
un nivel de confianza del 95 % y bajo el supuesto que los datos siguen una distribución
normal.
Como se observa en el anexo 2, los valores de P corresponden a 0,441 para la prueba
de Barlett y 0,737 para la prueba de Levene. Ambos valres de P son mayores al valor α
de 0,05 por lo que no existe evidencia significativa para rechazar la hipótesis nula y se
53
concluye la homogeneidad de varianzas de los puntos de la curva de calibración y por
tanto la variabilidad se mantiene constante a lo largo del ámbito de concentraciones.
Una curva de calibración normal de mínimos cuadrados asume la homogeneidad de
las varianzas al o largo de la curva de calibración, por lo que es importante medir por
lo menos siete patrones con concentración baja media y alta para comprobarlo.
Además en el anexo 3 se encuentra el gráfico de residuales de la curva de calibración
de sodio asociado a cada patrón.
Análisis del ANOVA de la regresión de la curva de calibración
Al haber comprobado los supuestos de la prueba estadística, se procederá con el
análisis del ANOVA. Los resultados se resumen en el cuadro V.
Cuadro V. Resultados de las fuentes de variación del ANOVA.
Fuente de
Variación
Grados de
Libertad
Suma de
cuadrados Varianza F P
Regresión 1 (n-1) SCreg
= 1,2977 = 1,2977 14124,87 0,000
Residual 54 (n-2) SCres
= 0,0050 = 0,0001
Total 55 SCtot
= 1,3026
Se utilizan los estadísticos de F y valor de P para demostrar la significancia de la
prueba. El estadístico F compara las varianzas debidas a la regresión y a los residuales
con la condición de que . La hipótesis nula de que las varianzas difieren
54
significativamente ( ) se comprueba por medio de la comparación del valor
experimental de F con el valor de F crítico.
[10]
Al ser el valor de F mayor al valor de F crítico se rechaza la hipótesis nula y se
concluye que existe una relación lineal entre la absorbancia y la concentración. Entre
mayor es el valor de F mayor es esta relación. Por otro lado, también se utiliza el valor
de P, que al ser menor que el valor alfa ( de 0,05 se rechaza la hipótesis nula y el
modelo tiene significancia estadística.
Límite de Detección y Límite de Cuantificación
Para obtener los límites de detección y cuantificación según Meier and Zünd se traza
una línea horizontal a través del límite de confianza superior de la curva de calibración
para el intercepto estimado cuando X es igual a cero. El intercepto de la línea horizontal
con la curva de calibración define el límite de detección (LD).
El límite de cuantificación (LC) se obtiene del intercepto de la línea horizontal con el
límite de confianza inferior tal como se muestra en la figura 3.
55
Figura 3. Límite de detección y límite de cuantificación según Meier and Zünd para el
sodio.
De esta forma el límite de detección para la curva de calibración de sodio es de 0,036
mg/L y el límite de cuantificación de 0,069 mg/L.
Sensibilidad
En el cuadro VI se presentan los valores de sensibilidad de calibración y sensibilidad
analítica para el método de determinación de sodio en el intervalo de concentración de
trabajo.
56
Cuadro VI. Sensibilidad de calibración y sensibilidad analítica.
Sensibilidad de calibración (A*L/mg) Sensibilidad Analítica (L/mg)
0,536 709
La sensibilidad de calibración es la capacidad de la metodología de discriminar las
diferencias en las concentraciones de sodio; entre más cercano sea este valor a 1, la
metodología posee mayor sensibilidad de calibración. Además este valor se mantiene
constante en todo el ámbito lineal de la curva de calibración. El valor obtenido de 0,536
A*L/mg indica el máximo cambio de mg/L de sodio que produce un incremento en una
unidad de absorbancia.
La sensibilidad analítica se utiliza en la mayoría de los casos para comparar
metodologías que determinan un mismo analito. La sensibilidad analítica obtenida fue
de 709 L/mg, que comparado con el valor conseguido en el Trabajo Final de
Graduación de Ericka Valverde para la metodología de sodio (45 L/mg) es mayor, lo
cual significa que la metodología validada en este Trabajo Final de Graduación
presenta una menor dispersión en el nivel intermedio de la curva de calibración (0,500
mg/L). (3)
A diferencia de la sensibilidad de calibración, la sensibilidad analítica no se mantiene
constante en todo el ámbito lineal de la curva de calibración, sin embargo, al haber
comprobado anteriormente el comportamiento homocedástico de la metodología, es
válido hacer el cálculo de sensibilidad analítica en el punto medio de la curva de
calibración ya que la desviación estándar no cambia significativamente con la
concentración. (3)
57
Además es importante resaltar que en la metodología oficial de la AOAC 985.35 no se
hace referencia a un valor de sensibilidad analítica ni de calibración por lo tanto no se
cuentan con valores de referencia para comparar.
Precisión bajo condiciones de repetibilidad
En el cuadro VII se presentan el estudio de repetibilidad utilizando el Material
Certificado de Referencia 1846 Fórmula de Infantes de la NIST. Se calculó el promedio,
el sesgo, la desviación estándar de repetibilidad (sr), el límite de repetibilidad (r) al 95 %
de significancia y el coeficiente de variación (CV) en el nivel intermedio de la curva de
calibración.
58
Cuadro VII. Datos para el estudio de repetibilidad y veracidad para la metodología de
determinación de sodio en el MCR 1846 en el nivel intermedio de la curva de
calibración.
Réplicas Concentración (mg/kg)
1 2304
2 2292
3 2200
4 2299
5 2295
6 2311
7 2329
8 2400
9 2304
10 2305
Valor teórico 2310
Promedio 2304
Desviación estándar (sr) 48
CV (%) 2
Límite de repetibilidad (r) 135
Sesgo (mg/kg) -6
La primera prueba realizada al conjunto de datos obtenidos experimentalmente
consistió en determinar si los datos se ajustaban a una distribución normal. Para esto
se utilizó una prueba de hipótesis con un nivel de confianza del 95 % y un valor de α de
0,05. La hipótesis nula planteada fue que los datos siguen una distribución normal
59
El valor de P para la prueba de normalidad fue de 0,380; mayor al valor alfa (α) de 0,05;
por lo tanto se concluye que los datos presentan una distribución normal. En el anexo 4
se observan los resultados de ésta prueba.
Una vez comprobada la normalidad de los datos, se procedió a comparar los resultados
estadísticos obtenidos con respecto a lo reportado en la metodología oficial. La
metodología oficial de la AOAC 985.35 reporta que la desviación estándar de
repetibilidad máxima debe ser de 73 mg/kg y el de coeficiente de variación máximo
debe ser 5,8 % al medirse el MCR 1846 bajo condiciones de repetibilidad. En el cuadro
VII se observa que la desviación estándar obtenida fue de 48 mg/kg y el CV de 2 % a
un nivel de confianza del 95 %. Estos valores cumplen con lo requerido por la
metodología oficial y por lo tanto indica que la metodología presenta una repetibilidad
adecuada, con una dispersión de datos mínima y errores aleatorios presentes en
cantidad aceptable. (51)
Con respecto al límite de repetibilidad, la metodología oficial AOAC 985.35 reporta un
valor máximo de 204,4 mg/kg. El valor obtenido experimentalmente fue de 135 mg/kg
que de igual forma cumple con lo establecido por la AOAC. Este valor significa que la
diferencia absoluta encontrada entre dos resultados obtenidos bajo condiciones de
repetibilidad con una probabilidad de 95 % fue de 135 mg/kg. (44, 51)
Se realizó una prueba adicional de repetibilidad con el objetivo de estudiar la diferencia
de los resultados obtenidos al medir una muestra homogénea de galleta en dos días
distintos. Se realizaron 14 réplicas en total, de forma que 7 réplicas se prepararon y
analizaron el día 1 y las otras 7 réplicas se prepararon y analizaron el día 2. Cada una
de las 14 réplicas pasó por el proceso completo de preparación de la muestra.
En el cuadro VIII se presentan los resultados obtenidos.
60
Cuadro VIII. Resultados de sodio para una muestra de galleta homogénea media en
dos días distintos.
Réplicas
Día 1 Día 2
Concentración (mg/100g)
Concentración (mg/100g)
1 686 693
2 656 663
3 659 667
4 683 708
5 647 662
6 659 672
7 661 663
Promedio 664 675
Desviación estándar (sr) 14 18
CV (%) 2,2 2,6
Según los resultados anteriores se puede observar que la desviación estándar y el
coeficiente de variación cumplen con lo establecido por la metodología oficial de la
AOAC 985.35; la repetibilidad de los resultados en ambos días de medición cumple con
lo establecido.
Para validar que no exista diferencia entre el promedio de los resultados de ambos días
se realizó una prueba de hipótesis nula a un nivel de confianza del 95 %. La hipótesis
nula que se planteó fue la no existencia de una diferencia significativa entre los
promedios de los resultados de sodio obtenidos en el día 1 y día 2 .
Para poder utilizar esta prueba de hipótesis es necesario comprobar que los siguientes
supuestos se cumplan:
Los datos deben ser independientes y tener una distribución normal.
Las varianzas deben ser homogéneas (homocedasticidad).
61
La prueba de normalidad de los datos de ambos días se observa en anexo 5. Se utilizó
una prueba de hipótesis con un nivel de confianza del 95 % y un valor de α de 0,05. La
hipótesis nula planteada fue que los datos siguen una distribución normal.
El valor de P para la prueba de normalidad de los datos del día 1 es 0,077 y para el día
2 es de 0,169; ambos casos mayores al valor alfa (α) de 0,05. Se concluye que los
datos presentan una distribución normal.
Con respecto a la homocedasticidad de los datos, en el anexo 6 se observan los
resultados de la prueba realizada para verificar la igualdad de varianzas del grupo
completo de datos. Se utilizó una prueba de hipótesis con un nivel de confianza del 95
% y se obtiene un valor de P mayor a 0,05; por lo tanto se concluye la
homocedasticidad del sistema y se puede proceder a realizar la prueba de t de student.
Una vez que se comprobó los supuestos de que los datos siguen una distribución
normal y la homocedasticidad de los mismos, se procedió a realizar la prueba de
hipótesis para determinar la no existencia de una diferencia significativa entre los
promedios de los resultados de sodio obtenidos en el día 1 y día 2 .
Los resultados de la prueba de hipótesis se muestran en el anexo 7.
Para un nivel de confianza del 95 % se obtuvo un valor de P de 0,232 por lo tanto no
existe evidencia suficiente para rechazar la hipótesis nula y se concluye que no hay
diferencia significativa entre los promedios de los resultados de sodio de ambos días.
62
Veracidad
Sesgo
La veracidad se verificó mediante el uso del sesgo. Según la Guía Eurachem, el sesgo
se define como “la diferencia entre el resultado de una prueba esperado y el valor de
referencia aceptado" (44)
[11]
En donde corresponde al promedio de los resultados obtenidos experimentalmente
del MCR 1846 de la NIST y equivale al valor de referencia certificado.
Como se observa en el cuadro VII el valor de sesgo obtenido fue de -6 mg/kg, el cual
además fue menor a la desviación estándar de ese mismo conjunto de datos. Es
importante evaluar si esta diferencia es consecuencia de un error aleatorio en el
análisis del material de referencia certificado o de un sesgo en la metodología de
análisis de sodio. Para comprobar estadísticamente este cuestionamiento, se compara
la diferencia experimental ( con la diferencia que podría existir si no existiera
sesgo en un nivel de probabilidad del 95 %. Esta prueba utiliza el parámetro estadístico
t y se calcula de la siguiente forma: (37)
[12]
63
En donde N es el número de réplicas que se utilizaron en la prueba, s la desviación
estándar y el valor de t de student con n-1 grados de libertad con un nivel de confianza
del 95%. Se comprueba la presencia del sesgo cuando el valor experimental es
mayor que el valor calculado. Por el contrario, cuando el valor calculado es
mayor, no queda demostrada la presencia de sesgo. (37)
El valor calculado fue de ± 8; el cual fue mayor que el valor experimental de - 6.
Con esto se puede concluir que no se demostró la existencia del sesgo.
Prueba de t de student para una muestra
Se utilizó una prueba de hipótesis para comparar como el promedio de los resultados
de sodio del MCR difería del valor certificado de referencia. La prueba estadística
utilizada fue la prueba t de student para una muestra. La hipótesis nula planteada fue
que el promedio de los datos es igual al valor certificado de referencia
para un nivel de confianza del 95 %.
Los resultados se observan en el anexo 8.
Para un nivel de confianza del 95 % se obtuvo un valor de P de 0,127. Este valor de
probabilidad es mayor al valor de α de 0,05 por lo que no existe suficiente evidencia
para rechazar la hipótesis nula y se concluye que no hay diferencia significativa entre el
promedio de los resultados experimentales del MCR con respecto al valor de referencia
certificado.
64
Pruebas de recuperación
El porcentaje de recuperación se define con la fracción de analito agregado a una
muestra fortificada o enriquecida previo al análisis de la muestra fortificada y no
fortificada. El porcentaje de recuperación se calcula de la siguiente manera:
[12]
En donde C1 equivale a la concentración del analito medido en la muestra fortificada,
C2 es la concentración del analito medido de la muestra no fortificada y C3 equivale a
la concentración de analito teórico agregado en la muestra fortificada. (44)
La prueba de recuperación permite determinar la eficiencia de la metodología para
detectar todo el analito presente en la muestra y que tan exitoso ha sido en extraerlo de
la matriz de la misma. (44)
El porcentaje de recuperación se calculó agregando una cantidad conocida de estándar
de sodio a una muestra de galleta homogénea, de forma que la concentración final
estuviera en el medio de la curva de calibración. Se obtuvieron los resultados que se
observan el cuadro IX.
65
Cuadro IX. Porcentajes de recuperación de sodio obtenidos en una muestra
homogénea de galleta.
Réplica Porcentaje de recuperación (%)
1 101,6
2 100,7
3 99,4
4 100,5
5 101,8
6 101,6
7 99,7
8 100,1
9 103,0
10 101,1
Promedio 100,9
CV 1,1
Intervalo de confianza
al 95 % ± 0,8
Al ser los porcentajes de recuperación cercanos al 100 % se puede concluir que no hay
presencia de errores sistemáticos en la metodología de determinación de sodio en
galletas y que el método es capaz de detectar todo el analito presente y de extraerlo de
la galleta.
Como se mencionó en la introducción, el uso de la técnica de microondas para la
digestión de las muestras tiene muchas ventajas en comparación a los métodos
convencionales. Al utilizar sistemas cerrados se desarrollan temperaturas altas como
resultado del aumento de la presión. Además, debido a que se evitan las pérdidas por
evaporación, se utilizan cantidades de reactivos menores, lo que reduce la interferencia
por contaminantes en los reactivos y la pérdida de componentes volátiles de las
66
muestras se elimina casi por completo. Todos éstas ventajas contribuyen a obtener
porcentajes de recuperación cercanos al 100 %.
Cálculo de Incertidumbre para el contenido de sodio en las galletas.
El cálculo de incertidumbre de la metodología de determinación de sodio depende de
una serie de valores de entrada los cuales se encuentran en función del proceso de
medición en sí. (56, 57, 58)
La incertidumbre estándar puede ser de tipo A cuando se determina como la desviación
estándar de la media obtenida a través de métodos experimentales y se calcula
mediante el siguiente modelo matemático: (56, 57, 58)
[13]
En donde a la desviación estándar de la medición y el número de experimentos
realizados. (56, 57, 58)
La incertidumbre estándar puede ser además de tipo B para métodos no
experimentales y se evalúa a partir del juicio científico basado en la información
disponible sobre la posible variabilidad de los datos. (56, 57, 58)
La contribución a la incertidumbre estándar de la medición es estimada por la
incertidumbre estándar de cada magnitud de entrada multiplicada por un coeficiente de
sensibilidad, el cual se calcula a partir de la derivada parcial del modelo matemático
mencionado anteriormente. La incertidumbre estándar combinada se obtiene al
67
combinar todas las contribuciones obtenidas de cada uno de los parámetros
involucrados. (56, 57, 58)
La incertidumbre expandida se denota con una U y se obtiene multiplicando la
incertidumbre estándar combinada por un factor de cobertura k. Este valor de k
corresponde a un valor de 2 para un nivel de confianza del 95 %. (56, 57, 58)
Definición del mensurando
Para poder calcular la incertidumbre se debe definir el mesurando a determinar, en este
caso la concentración de sodio expresado como mg/100 g. El cálculo se realiza
mediante la siguiente ecuación: (56, 57, 58)
[14]
En donde corresponde la concentración de sodio en la disolución y
obtenido a partir de la curva de calibración, es el volumen de la muestra leída en el
equipo, es el factor de dilución y corresponde al peso de la muestra y al
valor de recuperación del proceso global de análisis. (56, 57, 58)
68
Análisis de las variables involucradas
Las variables involucradas en el proceso de medición se representan a través de un
diagrama de causa y efecto (figura 4). Las ramas principales surgen de los parámetros
de la ecuación 15 y a cada una de ellas se les agregan los factores que contribuyen a
su incertidumbre combinada. (56, 57, 58)
Figura 4. Diagrama completo de causa y efecto de las variables involucradas.
69
Evaluación de la incertidumbre de las variables involucradas.
La cuantificación de la incertidumbre de las diferentes variables involucradas se basa
en un estudio de recuperación de sodio realizado al material certificado de referencia
de las NIST 1846 y con los datos generados en el experimento. Se toma en cuenta lo
siguiente: (56, 57, 58)
El estimado de repetibilidad del proceso analítico (Frep).
El estimado de la recuperación del análisis y su incertidumbre asociada (Rec).
El factor de temperatura que afecta en mayor parte la dilución del sodio en la
muestra de galleta (fT). La temperatura en todas las diluciones se mantiene
constante, por lo que sus efectos se cancelarán en cada etapa de dilución, sin
embargo la concentración final de sodio si se verá afectada por la temperatura,
por lo que se tomará en cuenta dentro del factor de temperatura.
Cuantificación de cualquier otra incertidumbre asociada a efectos diferentes a
los anteriores. (56, 57, 58)
Al considerar los datos del estudio del MCR 1846, el diagrama de causa y efecto se
reordena de la siguiente forma:
70
Figura 5. Diagrama completo de causa y efecto reordenado de las variables
involucradas.
Definición del modelo.
Al tomar en cuenta que la repetibilidad y las variaciones de temperatura se manejan
como factores multiplicativos con un valor único e incertidumbre asociada, el modelo
matemático se establece de la siguiente forma:
[15]
71
Cálculo de la incertidumbre.
Para estimar la incertidumbre de la repetibilidad global del proceso analítico
y la incertidumbre asociada a la recuperación se utilizaron los datos
obtenidos en el estudio de recuperación del material certificado de referencia de la
NIST 1846, el cual fue sometido al mismo procedimiento de análisis de las muestras de
galletas. (56, 57, 58)
De acuerdo con los datos presentados en el cuadro VII, la repetibilidad obtenida fue de
un 2 %, por lo que la incertidumbre correspondería a .
Para calcular la incertidumbre de la recuperación del MCR se utiliza la siguiente
ecuación: (56, 57, 58)
[16]
El resultado obtenido luego de resolver la ecuación anterior es de 0,0288. Con este
valor quedan cubiertas las fuentes de incertidumbre debidas a los procesos de dilución
de la muestra en un volumen final, peso de la muestra y calibración de los procesos de
dilución en balones y medición en pipetas, ya que se toma en cuenta la calibración del
equipo volumétrico así como la calibración de las balanzas. Además en el estudio de
recuperación, se toma en cuenta la incertidumbre de la curva de calibración. (56, 57,
58)
Por lo anterior, solamente la incertidumbre debida a la pureza de la disolución estándar
de sodio y a la temperatura se calculó de forma independiente.
72
Para el caso de la incertidumbre debida a la pureza del estándar de sodio, el certificado
de análisis del mismo reporta un valor de sodio de 1000 mg/L ± 3 mg/L, por lo que la
incertidumbre correspondería a .
Para el caso del factor de temperatura, se supone una variación máxima de 5 °C en la
temperatura del agua (coeficiente de expansión térmica de y con un 95 %
de confianza la incertidumbre corresponde a .
En forma de resumen se presentan los datos en el cuadro X.
Cuadro X. Valores e incertidumbres en la determinación de sodio.
Variable
Valor medido
experimentalmente
(xi)
Incertidumbre
estándar (u(xi))
Incertidumbre
estándar relativa
(u(xi))/ xi
Incertidumbre
estándar relativa al
cuadrado
Frep 1,00 0,0063 0,0063 2,89x10-5
Rec 0,9974 0,029 0,029 8,40x10-4
PNa 1000 1,73 0,0017 2,89x10-6
FT - - 0,00060 3,60x10-7
Al realizar la combinación de cada uno de las variables se obtiene una incertidumbre
combinada relativa de 0,0295. En el cuadro XI se observan los resultados de sodio en
las galletas con su respectiva incertidumbre expandida al usar un factor de cobertura
de 2 a un nivel de confianza del 95 %. (56, 57, 58)
73
A continuación se muestra una figura en donde se comparan las contribuciones a la
incertidumbre de cada una de las variables. Se observa en el factor de temperatura
contribuye de forma casi nula ya que el mismo se mantiene estable en todo el proceso
de medición. La pureza del patrón de sodio tiene una contribución también baja, sin
embargo el factor de repetibilidad el proceso de recuperación son las que tienen un
mayor aporte en la incertidumbre. Esto se debe a que en éstos procesos es donde hay
más operaciones involucradas ya que influye la medición como tal hasta la preparación
de los patrones y su ajuste lineal. Con esta información se concluye que lo más
importante es prestarle atención a éste proceso para lograr mantener una
incertidumbre baja a lo largo de toda la medición.
Figura 6. Contribución a la incertidumbre de las variables involucradas en la
determinación de análisis de sodio.
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03
Frep
Rec
PNa
FT
Incertidumbre estándar relativa
74
Planteamiento del sistema de control de calidad para la generación de
datos.
El cuadro de control se construyó en la etapa de validación de los parámetros de
desempeño mediante la medición de 28 disoluciones estándar del 0,3000 mg/L. Los
límites de control y de acción establecidos se utilizaron para posterior control y
corrección de la lectura arrojada por el equipo.
Figura 7. Cuadro de control para el desempeño del equipo de Absorción Atómica AA
400 para el análisis de sodio.
28252219161310741
0,3700
0,3600
0,3500
0,3400
0,3300
0,3200
0,3100
0,3000
0,2900
Observacion
Co
nce
ntr
acio
n (
mg
/L)
_X=0,3274
+3s=0,3615
-3s=0.2933
+2s=0,3501
-2s=0,3047
75
El cuadro de control se utiliza para monitorear el desempeño total del analista, del
equipo y del procedimiento utilizado. La línea central del cuadro de control mostrado en
la figura 6 corresponde a un valor promedio de 0,3274 mg/L; en el cual los valores
obtenidos experimentalmente varían de forma aleatoria alrededor de él. (49)
Al utilizar la desviación estándar (s) obtenida a partir del grupo de datos con el que se
construye el cuadro de control, es posible obtener los límites de control y los límites de
acción. Los límites de control equivalen al promedio de los datos ± 2 veces la
desviación estándar y los límites de acción equivalen al promedio de los datos ± 3
veces la desviación estándar. Al asumir que los datos siguen una distribución normal,
los límites de acción incluyen el 99,7 % del área bajo la curva normal y los límites de
control incluyen el 95,5 % de los valores. Si todos los datos se encuentran dentro de
estos límites, se puede concluir que la variabilidad de los resultados se debe solamente
a errores aleatorios. (49)
Al haber establecido los límites de acción y de control, la disolución control se
analizaba después de la calibración y de cada 10 lecturas de muestras y se observaba
si la variación del proceso era consistente (en control) o fuera de control. Si se
detectaba una situación fuera de control, el proceso de medición se detenía se
identificaba la causa de la variación (calibración del equipo o contaminación de la
muestra) y se corregía o se eliminaba.
Replicados de muestras
Se realizaron dos réplicas por muestra y se utilizó el criterio de que la diferencia entre
ambos resultados no sobrepasara el límite de repetibilidad obtenido en la etapa de
validación. Si se obtenía una diferencia mayor, se procedía a repetir el análisis.
76
Determinación de humedad en galletas
La húmedad de las muestras de galletas se determinó utilizando una balanza de
humedad halógena Mettler Toledo HB-43 S. El método se encontraba implementado en
Kraft Foods y fue validado contra el método oficial de la AOAC 935.36.
El procedimiento de validación de la balanza por equivalencia de metodologías se
realizó años atrás con una muestra patrón de galleta creada por el Centro Técnico de
Galletas de East Hannover en Nueva Jersey de Kraft Foods y siguiendo el protocolo de
validación establecido por la compañía en su Manual de Calidad para Laboratorios
Analíticos, Anexo 4 Lineamiento para verificación de equivalencia de metodologías.
(52).
Para la balanza halógena se utilizaron las siguientes condiciones:
Cantidad de muestra: 5,0000 g debidamente pulverizada y distribuida en el plato
de la muestra.
Temperatura de calentamiento: 105 °C.
Tiempo de calentamiento: 3 minutos.
Resultados del contenido de sodio en las muestras de galletas
A continuación se muestran los resultados del contenido de sodio en los 5 tipos de
galletas analizados. Los resultados se presentan en base húmeda y se expresan en mg
de sodio por 100 g de galleta.
En las figuras 7 a la 11 se muestran las dos réplicas por muestra y las 30 muestras
analizadas, las cuales equivalen a los 30 distintos lotes de producción.
77
Figura 8. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta SSRG
según lote de producción.
.
302520151050
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
Lote
Co
nce
ntr
ació
n (
mg
Na
/100 g
)
78
Figura 9. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta SDSRG
según lote de producción.
302520151050
1100
1000
900
800
700
Lote
Co
nce
ntr
ació
n (
mg
Na
/100 g
)
79
Figura 10. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta
SISRG según lote de producción.
302520151050
1000
950
900
850
800
750
Lote
Co
nce
ntr
ació
n (
mg
Na
/100g
)
80
Figura 11. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta
SDSRG según lote de producción.
302520151050
850
800
750
700
650
600
Lote
Co
nce
ntr
ació
n (
mg
Na
/100g
)
81
Figura 12. Variación de la concentración de sodio en base húmeda de la galleta DCRG
según lote de producción.
302520151050
540
520
500
480
460
440
420
400
Lote
Co
nc
en
tra
ció
n (
mg
Na
/10
0 g
)
82
Los resultados se resumen en el cuadro XI.
Cuadro XI. Resumen de los resultados de sodio en los diferentes tipos de galletas.
Muestra Promedio (mg/100 g) Desviación Estándar (mg/100 g)
SSRG 907 ± 53 132
SCRG 919 ± 53 93
SISRG 885 ± 51 58
SDSRG 703 ± 41 52
DCRG 460 ± 27 27
De los cinco tipos de galletas estudiadas, la galleta que tiene un mayor contenido de
sodio es la galleta tipo SCRG que es la galleta salada con relleno graso salado.
Además es una galleta son sal espolvoreada lo que hace que aumente su contenido de
sodio así como su variabilidad.
La galleta salada sin relleno graso (SSRG) es la segunda en el contenido de sodio ya
que es una galleta con sal espolvoreada y la masa como tal contiene sal. La tercera
galleta con mayor contenido de sodio en la galleta salada integral sin relleno graso
(SISRG).
La galleta dulce con relleno graso (DCRG) es la galleta que posee el menor contenido
de sodio, ya que este tipo de galleta no posee sal espolvoreada y al ser dulce, la
cantidad de sal agradada a la masa es poca.
83
Con respecto a la variación del proceso en la Planta de Kraft Foods, se observa que la
mayor variación se encuentra en las galletas saladas sin relleno graso ya que es la
mayor desviación estándar obtenida entre los datos de los 30 lotes. La galleta salada
con relleno graso también tiene una desviación estándar más alta que el resto de
galletas.
Las galletas que poseen menos variabilidad en el contenido de sal es la galleta integral
y las galletas semidulces y dulces.
84
Capítulo IV
Conclusiones
85
Conclusiones
El objetivo de este trabajo final de graduación se cumplió al validar e implementar la
metodología de espectrometría de absorción atómica de llama basado en la
metodología oficial de la AOAC 985.35. La metodología se implementa en la empresa
Kraft Foods de Costa Rica para determinar el contenido de sodio en cinco tipos
diferentes de galletas. Además se valida con una modificación en el proceso de
digestión de las muestras al utilizar el horno de microondas.
Esta metodología se valida a través del estudio de los parámetros de desempeño. Se
comprueba la linealidad y el ámbito de trabajo de la cruva de calibración utilizada,
además se obtienen los límites de detección y de cuantificación así como la
sensibilidad de calibración y sensibilidad analítica. Los valores obtenidos para cada uno
de éstos parámetros son satisfactorios y por ende la metodología puede ser utilizada
para la determinación de sodio.
Se comprueba la precisión de la metodología a través de un estudio de repetibilidad
utilizando el Material Certificado de Referencia 1846 Fórmula de Infantes de la NIST,
del cual se obtuvo una desviación estándar y un coeficiente de variación menores a los
valores máximos permitidos reportados en la metodología oficial de la AOAC 985.35
para el sodio. Además, se realizó un estudio para comprobar la repetibilidad el medir
una misma muestra en distintos días y se obtuvo que las desviaciones estándar y los
coeficientes de variación de ambos días cumplen con lo establecido por la metodología
oficial de la AOAC 985.35. Por otro lado, para validar que no existía diferencia entre el
promedio de los resultados de ambos días se utilizó una prueba de hipótesis; para el
cual se obtuvo que no existía diferencia significativa entre los resultados de los dos
días.
Para validar la veracidad de la metodología se utilizó el valor del sesgo obtenido a partir
de la medición en condiciones de repetibilidad del Material Certificado de Referencia
86
1846 Fórmula de Infantes de la NIST. El sesgo obtenido fue menor a la desviación
estándar de ese mismo conjunto de datos. Además se realizó un estudio de
recuperación utilizando la matriz de la galleta obteniéndose valores cercanos al 100 %,
con lo cual se puede concluir que no hay presencia de errores sistemáticos y que el
método es capaz de detectar todo el analito presente y de extraerlo de la galleta.
Para el control de calidad del equipo de Absorción Atómica Perkin Elmer AA400 se
construyó un cuadro de control, el cual ayudaba a verificar que el equipo y la
metodología se encontraran siempre cumpliendo los parámetros establecidos en la
validación de la metodología.
Las muestras se midieron por duplicado, para lo que se calculó un límite de
repetibilidad que las réplicas debían cumplir.
Una vez validada la metodología, se procedió a determinar el contenido de sodio en los
cinco tipos de galletas escogidos. La galleta con un mayor contenido de sodio fue la
galleta tipo SCRG que corresponde a la galleta salada con relleno graso salado. La
galleta salada sin relleno graso (SSRG), la tercera galleta con mayor contenido de
sodio en la galleta salada integral sin relleno graso (SISRG). La galleta dulce con
relleno graso (DCRG) es la galleta que posee el menor contenido de sodio.
Estos valores encontrados han ayudado a la empresa Kraft Foods de Costa Rica a
tener un valor analítico real del contenido de sodio en cada una de las galletas que
produce, y no un valor teórico proveniente de la cantidad de sodio de cada materia
prima. Además ha permitido entender cuál es la variación del proceso, en términos de
contenido de sal, en la Planta de Kraft Foods, el cual a pesar de no ser parte de los
objetivos de esta investigación, provee información importante para entenderlo.
87
Bibliografía
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97
Anexos
98
Anexo 1
Figura 13. Comportamiento de los residuales de la regresión lineal de la curva de
calibración de sodio.
99
Anexo 2
1,000
0,900
0,800
0,600
0,500
0,300
0,200
0,100
0,000
0,0040,0030,0020,0010,000
Co
nce
ntr
ació
n (
mg
/L)
Intervalos de Confianza al 95 % para las desviaciones estándar
Valor de P 0,441
Valor de P 0,737
Prueba de Barlett
Prueba de Levene
Figura 14. Prueba de homogeneidad de varianzas a través de los intervalos de
confianza al 95 % de las desviaciones estándar de la curva de calibración de sodio.
100
Anexo 3
Figura 15. Gráfico de Residuales de la Curva de Calibración de Sodio.
101
Anexo 4
Figura 16. Prueba de normalidad de los datos obtenidos experimentalmente para el
MCR 1846 bajo condiciones de repetibilidad.
2350234023302320231023002290228022702260
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
mg Sodio / kg
Po
rce
nta
je
Anderson-Darling 0.357
Valor de P 0,380
102
Anexo 5
Figura 17. Prueba de normalidad de los datos para la prueba de hipótesis de
repetibilidad en el día 1.
720700680660640620600
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
mg Sodio/100g del Día 1
Po
rce
nta
je
Anderson-Darling 0.588
Valor de P 0,077
103
Figura 18. Prueba de normalidad de los datos para la prueba de hipótesis de
repetibilidad en el día 2.
740720700680660640620600
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
mg Sodio/100 g del Día 2
Po
rce
nta
jeAnderson-Darling 0.466
Valor de P 0,169
104
Anexo 6
Figura 19. Prueba de homogeneidad de varianzas para la prueba de hipótesis de
comparación de los resultados de sodio en la muestra de galleta homogénea medida
en el día 2.
mg Sodio/100g Día 1
mg Sodio/100g Día 2
5040302010
Intervalos de Confianza al 95% de las desviaciones estándar
mg Sodio/100g Día 1
mg Sodio/100 g Día 2
710700690680670660650640
mg Na/ 100 g
Valor de P 0.611
Valor de P 0.741
Prueba F
Prueba de Levene
105
Anexo 7
Figura 20. Prueba de hipótesis para la comparación de los resultados de sodio de una
muestra homogénea de galleta medida en días distintos.
106
Anexo 8
Figura 21. Prueba de hipótesis de una muestra para la comparación del promedio de
los resultados de sodio en el MCR contra del valor certificado.
