Universidad de Málaga · ha sido realizada bajo mi dirección en condiciones que la hacen...

Rafael Bañón Arias

Málaga, 1999

Universidad de Málaga

FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA

HOSPITAL CLÍNICO UNIVERSITARIO

VIRGEN DE LA VICTORIA

SERVICIO DE MICROBIOLOGÍA

ASPECTOS FARMACOLÓGICOS DE LA ACCIÓN

ANTIMICROBIANA SOBRE STREPTOCOCCUSPNEUMONIAE

EL DOCTOR D. ALFONSO PINEDO SÁNCHEZ,

PROFESOR TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE

MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PÚBLICA DE LA

FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE

MÁLAGA, Y JEFE DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGÍA

DEL HOSPITAL CLÍNICO UNIVERSITARIO VIRGEN DE LA

VICTORIA,

CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral que presenta el

Licenciado, D. Rafael Bañón Arias,

ASPECTOS FARMACOLÓGICOS

DE LA ACCIÓN ANTIMICROBIANA SOBRE

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE,

ha sido realizada bajo mi dirección en condiciones

que la hacen acreedora del título de Doctor.

Málaga, a 20 de octubre de 1999

Firmado Dr. A. Pinedo Sánchez

Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todos los que han hecho

posible la realización de este trabajo:

Al Dr. D. Alfonso Pinedo Sánchez, Profesor Titular del Departamento de Medicina

Preventiva y Salud Pública de la Facultad de Medicina, y Jefe de Servicio de Microbiología

del Hospital Virgen de la Victoria de Málaga, por la confianza prestada al brindarme la

oportunidad y los medios necesarios para su realización, así como por su inapreciable ayuda

en la dirección y corrección de esta tesis.

A la Dra. D. María Victoria García López, Adjunta del Servicio de Microbiología del

Hospital Virgen de la Victoria de Málaga, por su apoyo incondicional y colaboración en el

desarrollo de esta tesis

Al Dr. D. Manuel de la Rosa Fraile, Jefe de Servicio de Microbiología del Hospital

Virgen de las Nieves de Granada, por iniciarme en la labor de investigación durante mis

años de formación como residente.

A mi familia, por lo que ha soportado

Rafael Bañón Arias. Aspectos farmacológicos de la acción antimicrobiana sobre Streptococcus pneumoniae

Indice 9

INDICE

INDICE ..........................................................................................................................9

INTRODUCCIÓN ......................................................................................................19

1. - INTRODUCCIÓN HISTÓRICA ........................................................................19

2. - CARACTERES GENERALES DEL STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ...20

2.1. - SITUACIÓN TAXONÓMICA ..................................................................................20

2.2. - CRITERIOS DE CLASIFICACIÓN ...........................................................................21

2.3. - CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS...................................................................21

2.4. - CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.......................................................................23

2.5. - CARACTERÍSTICAS NUTRICIONALES ..................................................................23

2.6. - COMPOSICIÓN DE LA PARED CELULAR ...............................................................24

2.7. - ESTRUCTURA ANTIGÉNICA ................................................................................25

2.7.1. - Antígeno capsular (SSS).............................................................................25

2.7.1.1. - Estructura...................................................................................................................................... 25

2.7.1.2. - Reacciones cruzadas ..................................................................................................................... 25

2.7.1.3. - Identificación serológica............................................................................................................... 26

2.7.1.4. - Factor de virulencia ...................................................................................................................... 26

2.7.2. - Antígenos somáticos...................................................................................26

2.8. - TOXINAS............................................................................................................27

2.8.1. - Neumolisina ...............................................................................................28

2.8.2. - Principio productor de púrpura.................................................................28

2.8.3. -. Otros factores de virulencia......................................................................28

2.9. - AUTOLISINAS ....................................................................................................28

2.10. - BACTERIÓFAGOS .............................................................................................29

2.11. - TRANSFORMACIÓN ..........................................................................................29

3. - EPIDEMIOLOGÍA ..............................................................................................29

3.1. - NEUMONÍA NEUMOCÓCICA. INCIDENCIA ...........................................................31

3.2. - TRANSMISIÓN....................................................................................................31

3.3. - DISTRIBUCIÓN DE SEROTIPOS ............................................................................32

4. - PATOGENIA Y MANIFESTACIONES CLÍNICAS .......................................33


Indice 10

4.1. - ASPECTOS CLÍNICOS ..........................................................................................33

4.2. - COMPLICACIONES..............................................................................................34

4.3. - INFECCIONES EXTRAPULMONARES ....................................................................35

4.3.1. - Otitis media ................................................................................................35

4.3.2. - Sinusitis aguda ...........................................................................................35

4.3.3. - Meningitis...................................................................................................36

4.3.4. - Endocarditis ...............................................................................................37

4.3.5. - Artritis ........................................................................................................37

4.3.6. - Peritonitis...................................................................................................38

5. - DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO .............................................................38

5.1. - AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO ..............................................................38

5.1.1. - Toma de la muestra....................................................................................38

5.1.2. - Examen directo ..........................................................................................38

5.1.3. - Cultivo........................................................................................................39

5.1.4. - Patogenicidad en animales ........................................................................40

5.2. - IDENTIFICACIÓN ................................................................................................41

5.2.1. - Identificación del antígeno capsular..........................................................42

5.2.1.1. - Coaglutinación.............................................................................................................................. 42

5.2.1.2. - Test de aglutinación en látex. ....................................................................................................... 42

5.2.1.3. - Contrainmunoelectroforesis.......................................................................................................... 42

5.2.2. - Identificación de otros componentes bacterianos......................................43

5.3. - ANTICUERPOS CIRCULANTES. ............................................................................43

6. - INMUNIDAD. .......................................................................................................43

6.1. - INMUNIDAD NATURAL. ......................................................................................43

6.2. - INMUNIDAD ADQUIRIDA. ...................................................................................43

6.2.1. - Vacunas......................................................................................................44

6.3. - INFECCIONES EN PACIENTES INMUNOCOMPROMETIDOS. ....................................45

6.3.1. - Esplenotomía..............................................................................................45

6.3.2. - Agammaglobulinemia. ...............................................................................45

6.3.3. - Enfermedades hematológicas. ...................................................................45

6.3.4. - Infecciones neumocócicas en pacientes infectados por el virus de la

inmunodeficiencia humana ................................................................................................45


Indice 11

7. - TRATAMIENTO..................................................................................................46

7.1. - INTRODUCCIÓN..................................................................................................46

7.1.1. - Situación actual del tratamiento de las infecciones neumocócicas ...........46

7.1.2. - Elección del agente antimicrobiano ..........................................................48

7.1.3. - Tabla 2: Niveles en suero y LCR ...............................................................50

7.2. - PENICILINA G ....................................................................................................51

7.2.1. - Farmacología.............................................................................................51

7.2.2. - Acción de los ß-lactámicos. .......................................................................52

7.2.2.1. - Pared celular ................................................................................................................................. 52

7.2.2.2. - Proteínas fijadoras de penicilina (PFPs o PBPs)........................................................................... 53

7.2.2.3. - Autolisinas.................................................................................................................................... 56

7.2.2.4. - Tolerancia. .................................................................................................................................... 58

7.2.2.5. - Cinética de la acción bactericida por ß-lactámicos ....................................................................... 59

7.2.2.6. - Criterio de resistencia. .................................................................................................................. 60

7.2.2.7. - Prevalencia y distribución de neumococos resistentes a penicilina. ............................................. 60

7.2.2.8. - Resistencia múltiple...................................................................................................................... 61

7.3. - CEFEMAS: CEFTRIAXONA..................................................................................64

7.3.1. - Farmacología.............................................................................................64

7.3.2. - Mecanismo de acción.................................................................................65

7.3.3. - Resistencia. ................................................................................................66

7.4. - CARBAPENEMAS: IMIPENEM..............................................................................66

7.4.1. - Farmacología.............................................................................................67


7.4.3. - Resistencia. ................................................................................................68

7.5. - GLUCOPÉPTIDOS: VANCOMICINA. .....................................................................68

7.5.1. - Farmacología.............................................................................................68


7.5.3. - Resistencia. ................................................................................................70

7.6. - FOSFOMICINA. ...................................................................................................70

7.6.1. - Farmacología.............................................................................................71


7.6.3. - Resistencia. ................................................................................................72

7.7. - QUINOLONAS. ESPARFLOXACINO. .....................................................................72

7.7.1. - Farmacología.............................................................................................74



Indice 12

7.7.3. - Resistencia. ................................................................................................77

8. - PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD .................................................................78

8.1. - PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD POR DIFUSIÓN EN AGAR CON DISCO.....................78

8.2. - PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD POR E-TEST.........................................................79

8.3. - PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD POR DILUCIÓN...................................................80

8.3.1. - Prueba de susceptibilidad por dilución en caldo.......................................80

8.3.2. - Tasas de letalidad in vitro..........................................................................80

8.3.2.1. - Cinética del crecimiento en medio líquido. Ciclo de crecimiento................................................. 80

8.3.2.2. - Curvas de muerte .......................................................................................................................... 82

8.3.2.3. - Factores que afectan los resultados de las curvas de muerte......................................................... 83

8.3.3. -. Estudio de la acción bactericida en animales ..........................................83

8.4. - OTROS ASPECTOS FARMACOLÓGICOS: EFECTO POST-ANTIBIÓTICO (EPA).........83

8.4.1. - ß-lactámicos ...............................................................................................84

8.4.2. - Glicopéptidos .............................................................................................85

8.4.3. - Quinolonas .................................................................................................85

8.4.4. - Estudio in vitro del EPA............................................................................85

8.4.4.1. - Métodos de eliminación del antimicrobiano................................................................................. 86

8.4.4.2. - Métodos de recuento bacteriano ................................................................................................... 88

8.4.4.3. - Factores que afectan al EPA. ........................................................................................................ 89

8.4.5. - Estudios del EPA mediante modelos animales ..........................................94

8.4.6. - Implicaciones sobre los regímenes de dosificación...................................95

8.5. - COMBINACIONES DE ANTIMICROBIANOS............................................................95

8.5.1. - Estudio in vitro de las combinaciones de antimicrobianos .......................96

8.5.2. - Definiciones de la interacción antimicrobiana in vitro .............................97

8.5.3. - Interacciones antagónicas .........................................................................98

8.5.3.1. - ß-lactámicos.................................................................................................................................. 98

8.5.3.2. - Fluorquinolonas............................................................................................................................ 99

8.5.4. - Interacciones sinérgicas ............................................................................99

8.5.4.1. - Fosfomicina más ß-lactámicos...................................................................................................... 99

8.5.4.2. - Vancomicina más ß-lactámicos .................................................................................................... 99

OBJETIVO GENERAL ...........................................................................................101

OBJETIVOS EXPERIMENTALES .......................................................................101

1. - ACCIÓN BACTERICIDA.................................................................................101


Indice 13

1.2. - OBJETIVOS METODOLÓGICOS ..........................................................................101

1.2.1. - Influencia de la variación en el tamaño del inóculo................................101

1.2.2. - Evaluación del medio de cultivo empleado..............................................102

1.3. - CURVAS DE LETALIDAD...................................................................................102

1.4. - EFECTO POST-ANTIBIÓTICO .............................................................................102

1.4.1. - Efecto de la concentración del antimicrobiano sobre el efecto post-

antibiótico ........................................................................................................................102

1.4.2. - Efecto del tiempo de exposición sobre el efecto post-antibiótico ............103

1.5. - COMBINACIÓN DE ANTIMICROBIANOS .............................................................103

MATERIAL Y MÉTODOS .....................................................................................105

1. - MATERIAL ........................................................................................................105

1.1. - CEPAS..............................................................................................................105

1.2. - SELECCIÓN DE CEPAS. .....................................................................................105

1.2.1. - Caracterización e identificación. .............................................................105

1.2.1.1. - Pruebas morfológicas.................................................................................................................. 106

1.2.1.1.1. - Morfología celular............................................................................................................... 106

1.2.1.1.2. - Morfología colonial............................................................................................................. 106

1.2.1.2. - Pruebas diagnósticas................................................................................................................... 106

1.2.1.2.1. - Pruebas clásicas................................................................................................................... 107

1.2.1.2.1.1. - Sensibilidad a la optoquina. ......................................................................................... 107

1.2.1.2.1.2. - Solubilidad en bilis. ..................................................................................................... 107

1.2.1.2.2. - Pruebas inmunoespecíficas.................................................................................................. 107

1.2.1.2.3. - Serotipado. .......................................................................................................................... 107

1.2.2. - Cepas controles........................................................................................108

1.3. - MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANO. .................................................................109

1.3.1. - Medios para la conservación de cepas. ...................................................109

1.3.2. - Medios de aislamiento. ............................................................................109

1.3.3. - Medios empleados en las técnicas. ..........................................................110

1.3.3.1. - Técnica de difusión en agar. ....................................................................................................... 110

1.3.3.2. - Técnica Etest®. ........................................................................................................................... 110

1.3.3.3. - Técnica por dilución en caldo..................................................................................................... 110

1.3.3.3.1. - Caldo Mueller-Hinton II...................................................................................................... 110

1.3.3.3.2. - Sangre de caballo lisada. ..................................................................................................... 111

1.4. - ANTIMICROBIANOS..........................................................................................111

1.4.1. - Selección de antimicrobianos. .................................................................111


Indice 14

1.4.2. - Selección del rango de concentraciones. .................................................111

1.4.3. - Preparación y almacenamiento. ..............................................................111

1.4.4. - Soluciones de antimicrobianos. ...............................................................112

1.4.4.1. - Penicilina G sódica. .................................................................................................................... 112

1.4.4.2. - Vancomicina............................................................................................................................... 112

1.4.4.3. - Ceftriaxona. ................................................................................................................................ 112

1.4.4.4. - Imipenem.................................................................................................................................... 112

1.4.4.5. - Fosfomicina. ............................................................................................................................... 113

1.4.4.6. - Esparfloxacino. ........................................................................................................................... 113

2. - MÉTODOS..........................................................................................................114

2.1. - PRUEBA DE SENSIBILIDAD POR EL MÉTODO DISCO-PLACA ...............................114

2.2. - CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA (CIM). ...............................................114

2.2.1. - Método de microdilución en caldo...........................................................114

2.2.1.1. - Preparación del inóculo. ............................................................................................................. 114

2.2.1.2. - Rango de concentraciones estudiadas. ........................................................................................ 115

2.2.1.3. - Desarrollo de la técnica. ............................................................................................................. 115

2.2.2. - Método Etest®. ........................................................................................116

2.2.2.1. - Estandarización del inóculo. ....................................................................................................... 116

2.2.2.2. - Desarrollo de la técnica Etest®.................................................................................................... 116

2.2.2.3. - Lectura de las CIMs Etest®......................................................................................................... 116

2.3. - ACCIÓN BACTERICIDA. CURVA LETAL.............................................................117

2.3.1. - Preparación del inóculo...........................................................................117

2.3.2. - Cepas estudiadas......................................................................................119

2.3.3. - Concentraciones probadas de antimicrobianos. .....................................119

2.3.4. - Técnica. ....................................................................................................120

2.3.4.1. - Material. ..................................................................................................................................... 120


2.3.4.3. - Lectura........................................................................................................................................ 121

2.3.4.4. - Representación gráfica................................................................................................................ 122

2.3.4.5. - Interpretación.............................................................................................................................. 123

2.4. - EFECTO POST-ANTIBIÓTICO (EPA). .................................................................124


2.4.2. - Cepas probadas........................................................................................124


2.4.4. - Técnica. ....................................................................................................125

2.4.4.1. - Material. ..................................................................................................................................... 125



Indice 15

2.4.4.2.1. - Preparación de los antimicrobianos.................................................................................... 125

2.4.4.2.2. - Curvas de muerte................................................................................................................. 125

2.4.4.2.3. - Efecto post-antibiótico tras 1 hora de exposición. ............................................................... 126

2.4.4.2.4. - Efecto post-antibiótico tras 2 horas de exposición. ............................................................. 126

2.4.4.3. - Lectura........................................................................................................................................ 126


2.4.4.5. - Interpretación.............................................................................................................................. 127

2.5. - COMBINACIÓN DE ANTIBIÓTICOS: ACCIÓN BACTERICIDA. ...............................127


2.5.2. - Cepas estudiadas......................................................................................128


2.5.4. - Técnica. ....................................................................................................129

2.5.4.1. - Material. ..................................................................................................................................... 129


2.5.4.3. - Lectura........................................................................................................................................ 129


2.5.4.5. - Interpretación.............................................................................................................................. 130

RESULTADOS..........................................................................................................131

1. - CEPAS BACTERIANAS. ..................................................................................131

2. - ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS....................132

2.1. - DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA......................132

2.2. - CONTROL DE CALIDAD ....................................................................................133

3. - ACCIÓN BACTERICIDA DE LOS ANTIMICROBIANOS SOLOS:.........133

3.1. - COMPARATIVA DEL MEDIO EMPLEADO. AUTÓLISIS .........................................133

3.2. - EFECTO DE LA VARIACIÓN DEL TAMAÑO DEL INÓCULO ...................................133

3.3. - ACCIÓN BACTERICIDA DE LOS ANTIMICROBIANOS SOLOS ................................137

3.3.1. - Cepas sensibles a penicilina. ...................................................................138

Efectos a las 2 horas .............................................................................................................................. 138




Efectos a las 10 horas ............................................................................................................................ 141

3.3.2. - Cepas con resistencia intermedia a penicilina ........................................144





Indice 16



3.3.3. - Cepas penicilina resistentes.....................................................................149






3.4. - EFECTO POST-ANTIBIÓTICO .............................................................................154

3.4.1. - Influencia de la concentración y el tiempo de exposición .......................164

4. - ACCIÓN BACTERICIDA DE LOS ANTIMICROBIANOS EN

ASOCIACIÓN ......................................................................................................................166

4.1. - EFECTIVIDAD DE LAS ASOCIACIONES...............................................................166

4.2. - EFECTIVIDAD DE LAS PROPORCIONES ..............................................................167

DISCUSIÓN ..............................................................................................................183

2.- CEPAS BACTERIANAS ....................................................................................184

3.- MÉTODO DE RECUENTO DE VIABLES......................................................185

3.1.- Limitaciones, precisión, reproducibilidad y umbral del método .................185

3.2.- COMPARATIVA DEL MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO. AUTÓLISIS ......................186

3.3.- EFECTO DE LA VARIACIÓN EN EL TAMAÑO DEL INÓCULO..................................188

4.- ACCIÓN BACTERICIDA..................................................................................189

4.1.- ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS .........................................................................189

4.1.1.- Cepas sensibles a penicilina .....................................................................189

4.1.1.1. - Cepas resistentes a penicilina ..................................................................................................... 190

4.1.1.1.- Cepas resistentes a penicilina ...................................................................................................... 190

4.1.1.2.- Cepas con resistencia intermedia a penicilina ......................................................................... 191

4.1.1.1.3.- Cepas con alta resistencia a penicilina. ................................................................................ 192

4.2.- VANCOMICINA..................................................................................................192

4.3.- ESPARFLOXACINO ............................................................................................193

5.- EFECTO POST-ANTIBIÓTICO.......................................................................195

5.2.- LIMITACIONES DE LA TÉCNICA .........................................................................195


Indice 17

5.3.- INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN Y EL TIEMPO DE EXPOSICIÓN SOBRE EL EPA

.............................................................................................................................................196

6.- ACCIÓN BACTERICIDA DE LOS ANTIMICROBIANOS EN

ASOCIACIÓN ......................................................................................................................199

6.1. - EFECTIVIDAD DE LAS ASOCIACIONES...............................................................200

6.1.1. - ß-lactámicos más vancomicina ................................................................200

6.1.2. - ß-lactámicos más fosfomicina..................................................................201

6.2. - Eficacia de las proporciones.......................................................................201

CONCLUSIONES.....................................................................................................203

BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................205

APÉNDICE I: CURVAS DE LETALIDAD..........................................................269

APÉNDICE II: EFECTO POST-ANTIBIÓTICO.................................................269

APÉNDICE III: COMBINACIÓN DE ANTIMICROBIANOS ..........................269


Indice 18


Introducción 19

INTRODUCCIÓN

1. - Introducción histórica

El establecimiento sistemático, a lo largo del

tiempo, de las características del Streptococcus

pneumoniae [(Klein) Chester, 1901] (neumococo, antes

Diplococcus pneumoniae), como un agente productor

de enfermedad, ha proporcionado algunos de los más

importantes descubrimientos de las ciencias

biomédicas. Fue aislado por primera vez de la saliva

humana en 1880 por Pasteur en Francia que lo

denominó Microbe septicemique du salive y por

Sternberg en los Estados Unidos que lo llamó

Micrococcus pasteuri siendo establecida su relación

con la neumonía lobular pocos años después en 1883 por Friedlander y Talamon

(Musher, 1995), A principios de la década de 1890 Félix y Georg Klemperer demostraron

que la inmunización con neumococos muertos protegía a los animales de

experimentación contra la inoculación ulterior de neumococos y, además, que esta

protección podía transferirse mediante la infusión de suero de ratones inmunizados a

receptores no expuestos. Neufeld y Rimpau demostraron que la inmunidad se debía

a la presencia de factores séricos que facilitaban la fagocitosis por parte de los

leucocitos, proceso que estos autores designaron como opsonización. Estas

observaciones brindaron los fundamentos de lo que hoy conocemos como

inmunidad humoral. Entre 1900 y 1902 Neufeld descubrió la lisis por bilis y la

reacción de qquueelllluunngg. Se debe a Neufeld y a Handel el reconocimiento de los

distintos tipos de neumococo que en 1910 condujo a la obtención de distintos

antisueros específicos, y con ello, al primer tratamiento eficaz de la neumonía

neumocócica. Siguieron después las observaciones fundamentales de Avery,

Heidelberger y Goebel sobre la estructura química del antígeno capsular y su papel

en la virulencia bacteriana. Posteriormente al estudio de Griffith, en 1928, sobre si

las células de neumococo de un tipo serológico podían transformarse en células

neumocócicas de otro tipo in vivo, Avery, MacLeod y McCarty en 1944 descubrieron

Fig. 1: Pasteur codescubridor del

neumococo


Introducción 20

que el componente químico de las células neumocócicas responsable de la

transformación es su DNA (McCarty, 1994). Antes de 1940 el conocimiento del fenómeno

genético provenía de las investigaciones sobre plantas y animales, pero no se sabía

si estos resultados se podían aplicar a los microorganismos. Encontraron que el

material de DNA de un tipo de neumococos puede transferir una característica

hereditaria a otro tipo de neumococos. Posteriormente, en 1953 Watson, Crick y

Wilkins descubrieron la estructura molecular del DNA. Estos descubrimientos, junto

con otros, establecieron que la información genética de todos los organismos está

codificada en el DNA. Esto hizo de los microorganismos un modelo muy atractivo

para la investigación genética, al abrir la puerta de la genética molecular (Davis B.D., 1996;

Austrian, 1996). Actualmente y utilizando la tecnología del DNA recombinante o ingeniería

genética se pueden transferir fragmentos de DNA de un organismo a otro.

2. - Caracteres generales del Streptococcus pneumoniae

2.1. - Situación taxonómica

La 8ª edición del Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, clasifica

el género Streptococcus - [Rosembach 1884] - como perteneciente a la familia

Streptococcaceae junto a otros géneros: Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus y

Gemella; sin embargo, el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Hardie 1986),

no lo incluye en ninguna familia, considerándolo un género independiente.

El género fue clasificado en cuatro divisiones principales (piogénico, viridans,

láctico y enterococo). Una clasificación más reciente, divide el género en siete

grupos denominados piogénico, neumococo, oral, fecal, láctico anaeróbico y otros

estreptococos. Sin embargo es marcadamente artificial y en la mayoría de los casos

sin estricta validez taxonómica. Una ordenación similar a la anterior es la que

presenta el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology con la diferencia de la

inclusión del Streptococcus pneumoniae en el grupo piogénico. La situación

taxonómica del S. pneumoniae está basada en un polisacárido específico de la

pared celular, y en distintas propiedades fisiológicas como son la actividad

hemolítica, solubilidad en bilis y la sensibilidad a los discos de 5 µg de Optoquina

(etilhidro-cupreína) en placa de agar sangre, entre otras pruebas.


Introducción 21

2.2. - Criterios de clasificación

El neumococo, antes conocido por el nombre de Diplococcus pneumoniae, ha

sido definitivamente clasificado dentro del género Streptococcus y debe

denominarse como Streptococcus pneumoniae (Deibel, 1974). La similitud entre el

neumococo y otros estreptococos comprende las siguientes características:

(a) Morfología: El S. pneumoniae es un coco Gram positivo capaz de crecer

en medios líquidos formando pequeñas cadenas.

(b) Metabolismo: Los estreptococos, incluyendo el neumococo, son bacterias

lácticas, esto es, capaces de fermentar la glucosa por la vía de los monofosfatos de

hexosa para rendir ácido láctico.

(c) Hemólisis: Se produce una fuerte alfahemólisis en agar sangre cuando los

cultivos son incubados en aerobiosis, mientras que en incubación anaerobia la

hemólisis puede faltar o puede producirse betahemólisis (Austrian, 1996) debido a la

neumolisina O idéntica a la estreptolisina O (Rotta, 1986).

(d) Estructura antigénica: Los neumococos y otros estreptococos contienen un

hidrato de carbono y una proteína M específicos de grupo, aunque esta última

carece de poder antifagocítico en el caso del neumococo (Rota, 1986; Musher, 1995).

(e) Mecanismos de transformación: Se ha logrado la transferencia de la

resistencia a antibióticos, especificidad antigénica de tipo y otros marcadores

genéticos entre especies de estreptococos (Rotta, 1986).

(f) Proporción molar Guanina + Citosina en ácidos nucleicos: La proporción

molar de las especies de Streptococcus incluyendo el S. pneumoniae es de un rango

similar entre 33 y 42 % (Hardei, 1986; Musher, 1995).

2.3. - Características morfológicas

S. pneumoniae se presenta como células cocoides de 0,5 a 1,25 µm de

diámetro, Gram positivas, inmóviles, no esporuladas, anaerobias facultativas, crecen

formando parejas típicas y sólo ocasionalmente en cadenas cortas (Hardie, 1986). Antes

de la división celular los cocos se alargan según un eje, escindiéndose

posteriormente para originar parejas. Cuando no se completa la separación se

forman las cadenas (Austrian, 1996). Las parejas presentan en sus terminaciones distales

una ligera deformación en punta que les da un aspecto lanceolado (Deibel 1974; Figura 2).


Introducción 22

En los aislamientos primarios generalmente se presentan en parejas

encapsuladas en material polisacarídico denominado sustancia específica soluble

(specific soluble sustance o SSS), mientras que el crecimiento prolongado en los

medios de laboratorio, especialmente en agar con bajo contenido en Mg++, o la

presencia de anticuerpos tipoespecíficos promueve la formación de cadenas cortas.

La tinción Gram positiva puede perderse en los cultivos viejos (Austrian, 1996).

Dado que las cadenas estreptocócicas son

difíciles de fragmentar manteniendo la viabilidad de los

microorganismos, algunos autores prefieren hablar de

unidades estreptocócicas al indicar el número de

colonias contadas, que es sólo un índice aproximado al

número de células influido por la longitud de las

cadenas (Austrian, 1996).

En medio líquido, la mayoría de las cepas

capsuladas originan un crecimiento difuso que

sedimenta cuando el medio se torna ácido, las cepas

no capsuladas, particularmente aquellas que tienden a formar cadenas, presentan

un crecimiento flocular que rápidamente sedimenta.

Si se prolonga la incubación en medio líquido, el recuento de formas viables

baja y el cultivo tiende a clarificarse. Estos cambios son debidos en parte a la acción

de los enzimas autolíticos que primeramente consiguen que las células pasen a

Gram negativas para acabar lisándolas. Esta autólisis es estimulada por agentes

tensioactivos como las sales biliares, propiedad que se utiliza en el diagnóstico del

S. pneumoniae.

En la superficie de los medios sólidos las células capsuladas forman colonias

mucosas que alcanzan un diámetro de 0.5 a 1.5 mm de diámetro después de 24 a

36 horas. Al envejecer las colonias suelen presentar el centro colapsado por la

autólisis. En los medios con sangre presentan una zona de hemólisis incompleta o

alfahemólisis si la incubación es aeróbica, mientras que en anaerobiosis pueden ser

betahemolíticos, debido a la neumolisina O sensible al oxígeno, o no mostrar

hemólisis (Musher, 1995). El tipo y extensión de la hemólisis, está influida por la

composición del medio base, el tipo y concentración de la sangre así como las

condiciones de cultivo (Deibel, 1974). El S. pneumoniae es capaz de presentar, en

Fig. 2: Diplococos grampositivos

(neumococos)


Introducción 23

variación de fase, diferencias en la transparencia de la colonia relacionadas con las

tasas de autolisis y otras propiedades fisiológicas y factores de virulencia (Weiser, 1996).

La cápsula neumocócica es demostrable al microscopio óptico suspendiendo

microorganismos en tinta china, también puede ser vista fácilmente mediante la

denominada reacción de quellung consistente en un tratamiento con anticuerpos

homólogos tipoespecíficos que hacen la cápsula más refringente cuando se unen al

polisacárido capsular.

2.4. - Características bioquímicas

Los neumococos son microorganismos exigentes que requieren de un medio

completo para su crecimiento. Sus requerimientos energéticos son satisfechos

principalmente por la fermentación láctica, siendo generalmente capaz de fermentar

la glucosa, galactosa, fructosa, sucrosa, lactosa, maltosa, rafinosa y glucógeno.

Mientras que su capacidad para metabolizar la inulina lo separa de la mayoría de los

otro estreptococos alfa hemolíticos (Deibel, 1974). Es capaz de realizar una lenta

producción de ácido a partir del glicerol (en incubación aeróbica), xilosa, arabinosa y

erithritol. Algunas cepas pueden fermentar el manitol. No producen ácidos a partir

del dulcitol o sorbitol.

El S. pneumoniae es anaerobio facultativo, oxidasa y catalasa negativo, con

tendencia a acumular ácidos acético y fórmico, lo que puede ocasionar, al disminuir

excesivamente el pH, una pérdida de viabilidad en los cultivos. En presencia de una

fuente de catalasa como los glóbulos rojos, el neumococo logra sobrevivir a 0-4 ° C

durante largo tiempo (Musher, 1995).

2.5. - Características nutricionales

El neumococo es un parásito obligado con requerimientos nutritivos

semejantes a los de sus hospedadores. El pH óptimo es de 7,8 dentro de un rango

de 6,4 - 8,3. El pH final que la actividad fermentativa del S. pneumoniae llega a

lograr en caldo glucosado es del orden de 5. La temperatura óptima de crecimiento

oscila entre 25 y 42 °C. De un 5 a un 10 % de los aislamientos requieren de una

atmósfera de CO2 para crecer en los medios de agar, por ello todos los cultivos

primarios deben incubarse en estufa de carbónico.


Introducción 24

Un medio satisfactorio es el caldo infusión de carne conteniendo un 10 % de

suero o sangre, y ajustado a un pH 7,4 - 7,8. El caldo infusión puede ser algo

inhibitorio cuando se expone al aire, por lo que debería añadirse algún agente

antioxidante como cisteína o tioglicolato para permitir el crecimiento, especialmente

cuando el inóculo es bajo.

A diferencia de otros estreptococos, el neumococo requiere de colina para

crecer en medios definidos (Rotta, 1986). La etanolamina puede sustituir a la colina en

los medios sintéticos pero aparece después como componente del ácido teicoico

originando ciertas alteraciones: las células no pueden dividirse y forman largas

cadenas, se hacen resistentes a la autólisis en presencia de penicilina, pierden la

capacidad de producir transformación y de adsorber sus fagos.

La mayoría de las cepas requieren de 4 vitaminas B además de guanina,

adenina, uracilo y de 7 a 10 aminoácidos esenciales. Se ha descrito un medio

sintético por Tomasz, y aunque no resulta adecuado para su uso rutinario, si lo es

para la recuperación de fracciones dializables (Austrian, 1996).

2.6. - Composición de la pared celular

Es la composición característica de las bacterias Gram positivas, constituida

principalmente por peptidoglicano al que se le unen una serie de carbohidratos,

ácidos teicoicos y antígenos proteicos de superficie.

Este peptidoglicano está formado por pequeñas cadenas de péptidos que

unen de forma cruzada a largas cadenas de polisacáridos.

Estos polisacáridos están formados por unidades alternas de N-

acetilglucosamina y ácido N- acetilmurámico.

La pared celular de los estreptococos contiene siempre el aminoazúcar

glucosamina y el ácido murámico, siendo la galactosamina un componente variable

dentro del género. Los azúcares reductores que se encuentran con mayor frecuencia

son glucosa, galactosa y ramnosa en diferentes combinaciones según la especie.

Algunos estreptococos contienen ácidos teicoicos además del ácido lipoteicoico

común en muchas bacterias Gram positivas.

A diferencia de otras especies estreptocócicas, en el neumococo la colina

forma parte de los ácidos teicoicos como en el ácido ribitol teicoico con fosfato de

colina (Rotta, 1986).


Introducción 25

Algunos componentes de la pared celular poseen propiedades inflamatorias

(Carlsen, 1992)

2.7. - Estructura antigénica

Se han diferenciado 90 serotipos según los

polisacáridos capsulares, lo que constituye la base

de su clasificación a diferencia de otros

estreptococos que se clasifican por los antígenos

somáticos.

Dos sistemas de nomeclatura se han

establecido: el americano y el danés siendo este

último más utilizado (Rotta, 1986).

Por otro lado se han descrito hasta tres clases de antígenos somáticos: el

antígeno proteico R, poco conocido, y la sustancia C glucídica, son específicos de

especie, mientras que el antígeno M es una proteína tipo-específica genética e

inmunológicamente independiente del polisacárido capsular (Rotta, 1986).

2.7.1. - Antígeno capsular (SSS)

2.7.1.1. - Estructura

La cápsula neumocócica está compuesta por grandes polímeros

polisacarídicos que constituyen un gel hidrofílico en la superficie de los organismos

Se ha dilucidado la estructura de algunos, así el tipo 3, por ejemplo, está compuesto

por unidades repetidas de ácido celobiourónico [ ácido D-glucurónico unido a D-

glucosa por enlaces beta 1-4 ] unidas por enlaces glucosídicos beta 1-3 (Austrian, 1996;

Morona, 1997).

2.7.1.2. - Reacciones cruzadas

Aunque los polisacáridos capsulares del neumococo muestran un alto grado

de especificidad de tipo, algunos pueden presentar reacciones cruzadas con

antígenos capsulares de otros tipos y hasta de otras especies bacterianas como

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp., Haemophilus influenzae

tipo B y con estreptococos del grupo viridans. El tipo 14 por ejemplo, muestra

reacciones cruzadas con Streptococcus agalactiae tipo III y con isoantígenos

humanos del grupo ABO (Musher, 1995).

Neuroaminidasa

Autolisina

Peumolisina

Polisacárido capsular

Pared celular

PspA dímero

PsaA

Acido teicoico

Membrana celular

Acido lipoteicoico

Fig. 3: Estructura antigénica delneumococo


Introducción 26

2.7.1.3. - Identificación serológica

La clasificación en serotipos se efectúa a partir de los polisacáridos

capsulares, que pueden demostrarse por aglutinación, por

contrainmunoelectroforesis o por una reacción de precipitación en su cápsula

denominada reacción de quellung (Musher, 1995). El procedimento consiste en dejar

secar al aire una suspensión del microorganismo en un portaobjetos y volver a

suspenderlo con una cantidad de suero antineumocócico al que se le añade azul de

metileno. Después de algunos minutos se observa al microscopio con objetivo de

inmersión, y se aprecia, si es positivo, al microorganismo rodeado de una cápsula

grande refringente.

Recientemente se han desarrollado otras técnicas de serotipado como la de

dot blot, con objeto de simplificar el estudio de grandes números de cepas (Fenoll, 1997).

Hasta el momento se han identificado 84 serotipos patógenos para el hombre.

Los serotipos 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 y 23 son los que se aíslan con

mayor frecuencia en la clínica. El serotipo 3 es el clásicamente más virulento y el 23

(23F) el que con mayor asiduidad se asocia a la resistencia a la penicilina en España

(Fenoll, 1998), habiéndose descrito en cepas con alta resistencia a cefalosporinas

(Figueiredo, 1992)

2.7.1.4. - Factor de virulencia

La patogenicidad del neumococo está directamente relacionada con el

polisacárido capsular (Kelly, 1994; Vidarson, 1994; Watson, 1995), principalmente debido a su

capacidad antifagocítica. Las cepas capsuladas (S o mucosas) son virulentas para

humanos y animales de experimentación, mientras que las cepas acapsuladas (R o

rugosas) no lo son. La inmunización con polisacárido capsular purificado protege

contra la infección por tipos homólogos (Musher, 1995; Giebink, 1993; Vi�arson, 1994; Ekdahl, 1997).

2.7.2. - Antígenos somáticos

En 1930 Tillet, Goebbel y Avery aislaron a partir de células neumocócicas un

carbohidrato, que a diferencia de los polisacáridos capsulares contenía restos

fosfato y era específico de especie (Tomasz, 1988).

El determinante antigénico de este polisacárido, denominado sustancia C o

polisacárido C neumocócico, es un ácido teicoico formado por restos fosfato N-

acetilgalactosamina (Yother, 1998), que llega a constituir mas del 30 % del carbohidrato


Introducción 27

de la pared celular, y que no se ha encontrado en otras células bacterianas, mientras

que el componente fosfato de colina es el responsable de la reactividad del

neumococo con la proteína C reactiva, una betaglobulina presente a bajas

concentraciones en el suero normal.

La liberación de componentes neumocócicos durante el tratamiento

antimicrobiano de la meningitis, suele ser causa de inflamación meníngea, siendo

los ácidos teicoico y lipoteicoico unos de los componentes con mayor capacidad

inflamatoria. Este proceso inflamatorio es responsable en parte, de la alta mortalidad

y secuelas de la meningitis neumocócica, por lo que se ha investigado el uso de anti-

inflamatorios (Tuomanem, 1987; 1990; Word, 1989; Bradley, 1994; Cabellos, 1995; Kanra, 1995; Lebel, 1988), así

como la selección de antimicrobianos que minimicen la liberación de antígenos (Stuertz

K., 1998; 1998b).

Antígeno proteico M. Los neumococos capsulados o no, poseen una proteína

somática antigénica específica de tipo, con propiedades fisicoquímicas semejantes a

las proteínas M de los estreptococos del grupo A (Austrian, 1996). Sin embargo no posee

propiedades antifagocíticas, ni los anticuerpos producidos contra ella son

protectores.

Antígeno proteico R. El antígeno de la proteína R fue aislado inicialmente de

cepas no capsuladas o rugosas. Se localiza en o cerca de la superficie celular, y no

se ha definido químicamente.

La neuroaminidasa, factor responsable de la unión del ácido N-

acetilneuramínico a la mucina, gangliósidos y glicoproteínas, puede afectar al mucus

protector respiratorio, favoreciendo la colonización (Cámara, 1994)

2.8. - Toxinas

La capacidad del neumococo para producir enfermedad es en gran parte

debida a su resistencia a la fagocitosis con la subsiguiente invasión y multiplicación

en los tejidos del huésped, y la génesis de las lesiones neumocócicas es un ejemplo

característico de la contribución de los componentes de la pared celular a los

síntomas y signos de la enfermedad (Tuomanem, 1995). Sin embargo algunas

observaciones clínicas indican la elaboración de sustancia tóxicas por el

microorganismo, como son el comienzo brusco de los síntomas, toxicidad sistémica

y curso fulminante con aparición de coagulación intravascular diseminada en

pacientes esplenotomizados.


Introducción 28

Los mecanismos patogénicos de algunas de las toxinas neumocócicas que

seguidamente se describen, no están totalmente dilucidados (Musher, 1995; Kim, 1995).

2.8.1. - Neumolisina

Esta proteína, factor de virulencia citoplasmático, es liberada durante la

autólisis, tiene un peso molecular de 63.000, es destruida por el calor e inactivada

por el oxígeno.

Está relacionada con la hemolisina O oxígeno- lábil de los estreptococos

hemolíticos, Clostridium tetani y C. welchii (Musher, 1995) siendo la responsable de la

betahemólisis que produce el neumococo en anaerobiosis.

Aunque no es necesaria para desencadenar la respuesta inflamatoria en el

SNC (Friedland, 1995b), ha demostrado propiedades dermatotóxicas y puede ser la causa

de la anemia hemolítica observada en conejos y ratones con bacteriemia

neumocócica (Musher, 1995; Benton, 1995; Cavin, 1995; Berry, 1995).

Se ha empleado como base para el desarrollo de técnicas diagnósticas (Kalin,

1987).

2.8.2. - Principio productor de púrpura

Está asociado al mucopéptido de la pared celular y es liberado durante la

autólisis (Musher, 1995). Produce púrpura y hemorragia dérmica en los animales de

experimentación.

2.8.3. -. Otros factores de virulencia

Algunos adenovirus son capaces de facilitar infecciones bacterianas del tracto

respiratorio por mecanismos no bien conocidos. En el caso del neumococo

favorecen in vitro la adherencia a las células (Hakansson, 1994).

El S. pneumoniae tienen una alta capacidad de adherencia a la fibronectina

no soluble, glicoproteína de los mamíferos presente en plasma, LCR y líquido

amniótico, que le proporciona un mecanismo para invadir los epitelios dañados (Flier,

1995).

2.9. - Autolisinas

Las células neumocócicas se lisan durante la incubación prolongada, esto

también sucede en presencia de agentes tensioactivos como las sales biliares y

antimicrobianos inhibidores de la síntesis de la pared celular. En las condiciones


Introducción 29

anteriores se libera la enzima N-acetil-muramil-l- alanina amidasa una autolisina

capaz de romper los puentes entre el ácido murámico y la alanina en el

peptidoglicano de la pared celular (Musher, 1995; Gillespie, 1997).

La actividad de las autolisinas no sólo transciende sobre la división celular e

infección por bacteriófagos (Díaz, 1992; Austrian, 1996), sino que también lo hace sobre la

acción de los antimicrobianos (Azoulay-Dupuis, 1996), y sobre la patogenia de la infección

(Rubins, 1994; Rayner, 1995; Canvin, 1995).

La acción autolítica de los neumococos, dificulta considerablemente su

estudio en medios líquidos a partir de las 10 - 12 horas. Para afrontar este problema,

y para simular comportamientos farmacocinéticos, se han diseñado diversas

tecnologías in vitro de cultivos controlados (Grasso, 1978; Cappelletty, 1996; Casetta, 1996)

2.10. - Bacteriófagos

Un diplofago - Dp1 - y numerosos fagos omega han sido aislados del S.

pneumoniae. Sustancias del diplofago pueden ser las responsables de la inducción

de autólisis necesaria para la liberación de la progenie fágica.

2.11. - Transformación

La recombinación genética por DNA exógeno fue descubierta por Avery y

colaboradores en 1944 en el neumococo. Estas transformaciones han sido

demostradas experimentalmente en ratones y pueden ocurrir en forma natural. Los

cultivos de neumococos liberan ADN transformante de forma más acusada durante

la fase de crecimiento, cuando son también más susceptibles al DNA añadido. Los

marcadores genéticos que se han transformado in vitro con éxito en neumococos

son: la especificidad de tipo del polisacárido capsular, la cantidad de polisacárido

capsular producida, la resistencia antimicrobiana (penicilina, estreptomicina y

sulfamidas) y a la optoquina, la especificidad de tipo de algunas proteínas M, la

formación de cadenas de mutantes lisas y rugosas, y la capacidad de producir

ciertas enzimas inducibles (Davis, 1996b; Austrian, 1996; Mufson, 1995).

3. - Epidemiología

Los neumococos colonizan con frecuencia las vías respiratorias superiores de

los individuos sanos, de forma que el 5-70% de ellos pueden ser portadores

asintomáticos (Musher, 1995). La tasa de portadores es más elevada en niños, en


Introducción 30

comunidades cerradas, en invierno y durante los brotes de infección respiratoria

aguda (Kurtii, 1997; Thornsberry, 1997). La infección neumocócica suele presentarse de forma

esporádica en un portador con algún factor predisponente (Tabla 1). En algunos

casos la adquisición es nosocomial, en especial en pacientes intubados

recientemente o inmunodeprimidos como pacientes infectados por el VIH. Al tratarse

de una infección endógena, los pacientes hospitalizados no requieren aislamiento.

El neumococo causa aproximadamente el 60% de las neumonías

extrahospitalarias en los adultos y el 25% en los niños, con amplias variaciones

según las series. Asimismo, es la segunda causa de meningitis tras el meningococo,

en adolescentes y adultos, aumentando su frecuencia y gravedad con la edad. En

España, el 30% de las meningitis bacterianas del adulto son de etiología

neumocócica; este porcentaje se eleva al 90% si se consideran sólo los casos de

meningitis recurrente.

Tabla 1: Alteraciones de los mecanismos defensivos que

predisponen a la adquisición de neumonía neumocócica

Tipo de alteración Causa o enfermedad subyacente

Disminución de los reflejos epiglótico y tusígeno Inconsciencia, convulsiones,

alcohol, anestesia, sedación

Disminución de la actividad mucociliar Tabaco, inhalación de tóxicos,

Infección de las vías respiratorias altas,

Bronquitis crónica, intubación

Aumento de secreciones Infección vírica respiratoria, anestesia,

Bronquiectasias

Edema intralveolar Insuficiencia cardíaca, traumatismo,

Aspiración, hipoproteinemia

Alteración fagocitosis Neutropenia, asplenia funcional o

anatómica

Alteración de la inmunidad humoral Hipogammaglobulinemia, mieloma,

Hipocomplementemia

Alteración de la inmunidad Infección VIH


Introducción 31

3.1. - Neumonía neumocócica. Incidencia

S. pneumoniae es la causa más frecuente de neumonía adquirida en la

comunidad, observándose las mayores tasas en comunidades cerradas como

cuarteles y en ciertas poblaciones como mineros nativos en la Unión Sudafricana

(Hedlund, 1995; Musher, 1995; Porath, 1997). También es un patógeno a considerar en neumonías

nosocomiales.

Tiene mayor incidencia en hombres que en mujeres de todas las edades. En

personas mayores de 40 años la incidencia es tres a cuatro veces mayor que en la

década anterior. Por otro lado, los mayores picos en climas templados suceden en

los meses de invierno y principio de la primavera (Kim, 1996). La neumonía por

neumococos en la complicación secundaria más común tras la infección por virus

influenza (Musher, 1995), y el incremento de casos de neumonía suele ser paralelo a las

epidemias por este virus.

El número de infecciones neumocócicas también ha aumentado en años

recientes debido a la incidencia del VIH. En un estudio prospectivo realizado por

Bouza y col. (Bouza, 1998) un 18% de todos los ingresados con infecciones

neumocócicas eran VIH positivo. La mayoría de las veces los pacientes debutaron

con neumonía. Más de un 50% de las neumonías neumocócicas que ocurren en la

población menor de 50 años de edad tienen como situación de base la infección por

VIH, y el riesgo global de sufrir neumonía neumocócica en la población VIH positiva

es de 10 a 100 veces superior a la de la población VIH negativa.

3.2. - Transmisión

El neumococo se encuentra normalmente en el tracto respiratorio superior

humano, habiendo sido aislado en un 5 al 70 % de poblaciones adultas sanas. La

tasa de portadores asintomáticos varía con la edad, ambiente y presencia de

infecciones respiratorias (Musher, 1995). En población urbana la tasa desciende con la

edad, y es muy alta en colegios e instalaciones militares. La duración de la

colonización también varía resultando mayor en niños y en adultos con bajo nivel de

anticuerpos antes de la colonización. La relación entre la colonización y el desarrollo

de inmunidad natural no esta bien estudiado. Un aumento significativo de

anticuerpos tipo-específicos, ha sido observado después de la colonización en un 50

% de niños, pero rara vez en adultos.


Introducción 32

La mayoría de las cepas obtenidas de portadores son de los tipos altamente

capsulados que no suelen estar asociados a enfermedad. Por otro lado, los mismos

serotipos aislados en procesos neumocócicos tales como neumonía u otitis media,

se han recuperado del tracto respiratorio superior durante el proceso agudo. Como

la neumonía neumocócica suele ser una infección endógena, los pacientes

hospitalizados no requieren de aislamiento.

Las epidemias de neumonía neumocócica son infrecuentes, aún en

poblaciones cerradas, y se asocian a poblaciones susceptibles de distinto tipo.

Durante los períodos epidémicos, la transmisión entre personas es posible por gotas

de saliva (Hendley, 1975; Austrian, 1996).

La mortalidad varía con la edad, tipo capsular y condiciones subyacentes, y

especialmente aumenta cuando cursa con bacteriemia y otros focos

extrapulmonares.

Se han determinado algunos factores de riesgo, asociados a infecciones por

neumococos resistentes a penicilina como la edad menor de 15 años, el tratamiento

previo con ß-lactámicos o la infección por VIH (Bédos, 1995; Boken, 1995).

3.3. - Distribución de serotipos

Al menos 90 serotipos de S. pneumoniae han sido caracterizados (Henrichsen,

1995) aunque sólo un reducido número de ellos se ha mostrado patógeno para

humanos. En la era pre-antibiótica los tipos más abundantes eran el 1, 2 y 3 que

causaban del orden del 75 % de los procesos bacteriémicos (Musher, 1995).

Sin embargo, durante las últimas décadas, se da una distribución distinta

siendo los serotipos 8 - 10 responsables de los casos mas graves de enfermedad

con bacteriemia en adultos. Los serotipos más frecuentes son 1, 3, 4, 7, 8, 9, 12, 14

y algo menos frecuentes son los tipos 6, 18 y 19 (Parkinson, 1994; Musher, 1995; Casal, 1982; Jacobs,

1979; Latorre, 1985; Plouffe, 1994 Shapiro, 1994; Fenoll, 1991; 1998; Scott, 1995; Sessegolo, 1994; Simberkoff, 1986).

Los serotipos más frecuentemente asociados a resistencia a penicilina son el

9, 14 y 23 (Verhaegen, 1998).


Introducción 33

4. - Patogenia y manifestaciones clínicas

4.1. - Aspectos clínicos

La patogénesis en la neumonía

neumocócica es debida a la rápida

multiplicación del microorganismo en los

espacios alveolares, merced a su resistencia a

la fagocitosis. La presencia de exudado intra-

alveolar favorece la multiplicación. Sin

embargo, los mecanismos patogénicos

fundamentales no se conocen con exactitud (Bruyn, 1992; Boulnois, 1992; Cundell, 1995; 1995b). La

acción de diversas enzimas y toxinas parece poco importante; por el contrario, se

sabe que los polisacáridos capsulares protegen al organismo de la acción de los

fagocitos y son claros factores de virulencia. Asimismo, se ha demostrado que

distintos componentes de la pared celular son capaces de producir una intensa

reacción inflamatoria en el SNC de pacientes con meningitis (Musher, 1995). Los

mecanismos defensivos del hospedador incluyen a nivel del tracto respiratorio:

células secretorias de mucus, reflejo epiglótico, cilios, reflejo de tos, nódulos

linfáticos, leucocitos fagocíticos como leucocitos polimorfonucleares y macrófagos, y

opsoninas.

El periodo de incubación de la neumonía neumocócica es de 1 a 3 días. Antes

del uso de la antibioticoterapia, la recuperación natural sucedía en 5 a 7 días

coincidiendo con la aparición de anticuerpos circulantes. Clínicamente la

recuperación estaba caracterizada por una brusca caída de la temperatura que se

denominaba crisis.

El cuadro clínico se inicia abruptamente con escalofríos, fiebre, tos, dolor en

punta de costado, disnea y emisión de un esputo herrumbroso en el que se

observan hematíes, leucocitos polinucleares y, en tinción de Gram, diplococos Gram

positivos capsulados.

La neumonía normalmente se desarrolla, después de la aspiración a través

del tracto respiratorio superior, de secreciones conteniendo neumococos, en

Fig. 4: Neumonía lobular neumocócica


Introducción 34

pacientes con defensas debilitadas por alcoholismo, anestesia, o por la acumulación

de fluidos en alveolos frecuentemente asociada a fallo cardiocirculatorio.

Los hallazgos de laboratorio normalmente demuestran leucocitosis con

aumento de neutrófilos y formas en banda (desviación a la izquierda). Sin embargo,

en pacientes ancianos, puede haber leucopenia. La anemia un nivel aumentado de

bilirrubina indirecta puede sugerir cierto grado de hemólisis con o sin enfermedad

pulmonar. Los gases en sangre arterial a menudo demuestran hipoxia y

ocasionalmente un descenso del CO2. El esputo debe ser examinado en tinción de

Gram, y si es posible, observar la reacción de quellung.

La mejoría clínica en respuesta a un adecuado tratamiento puede observarse

en 12 - 36 horas hasta 96 horas. Sin embargo, la curación clínica no marcha paralela

con la curación anatómica, ya que se necesitan de 4 a 8 días mas para que los

macrófagos y fermentos celulares dejen los alveolos en su estado normal,

observándose una completa resolución radiológica en 2-3 semanas en pacientes sin

complicaciones.

4.2. - Complicaciones

El derrame de líquido pleural es la complicación más frecuente en la

neumonía neumocócica sucediendo en un 25 % de los pacientes. El líquido tiene

aspecto de exudado pero la tinción de Gram y los cultivos no suelen demostrar

microorganismos.

La aspiración diagnóstica del líquido pleural debe ser realizada cuando se

sospeche la presencia de empiema, esta complicación, hoy día mucho menos

frecuente, ocurre en un 1 % de los pacientes con

neumonía, y en un 10 % de aquellos con efusión

pleural. Otras complicaciones poco frecuentes en la

actualidad, serían la pericarditis neumocócica y los

abscesos pulmonares.

Bacteriemia. Se detecta bacteriemia en un 25

- 30 % de los pacientes con neumonía neumocócica,

incrementándose la tendencia (Baer, 1995), sin embargo,

la frecuencia relativa varía según el serotipo. La vía de penetración podría ser la

linfática a través de conducto torácico. La mortalidad de los pacientes con

Fig. 5: Absceso neumocócico enpaciente con SIDA


Introducción 35

bacteriemia es el doble que en el resto (Afessa, 1994; Gómez, 1995; Plouffe, 1996) Un curso

clínico fulminante puede darse en los pacientes con neumonía neumocócica y

asplenia con el desarrollo de coagulación intravascular diseminada (Kuikka, 1992; Carpenter,

1997). Los neumococos pueden ser vistos en la sangre periférica de estos pacientes,

siendo origen de infecciones secundarias (Ejlertsen, 1997; Kutas, 1994; Souweine, 1997)

Un elevado porcentaje de neumonías neumocócicas en el paciente VIH

positivo se acompaña de bacteriemia (Janoff, 1992; Bartlett, 1995; Bouza, 1998). Pese a ello, la

evolución de la neumonía en el grupo infectado por VIH sigue un curso más benigno

y con menor mortalidad que en la población VIH negativa.

4.3. - Infecciones extrapulmonares

4.3.1. - Otitis media

El Streptococcus pneumoniae es uno de los agentes más comunes

productores de otitis aguda media, bacteriemia y meningitis en niños. El 76 a 95 %

de los menores de 6 años presentan al menos un episodio de otitis media, siendo el

S. pneumoniae responsable de un 50 % de los casos (Block, 1995), aumentando la

frecuencia de cepas resistentes (Nelson, 1994).

4.3.2. - Sinusitis aguda

La sinusitis aguda, con afectación de uno o varios senos paranasales, suele

presentarse como complicación de una infección vírica de vías respiratorias

superiores. En ocasiones se observa en pacientes con rinitis alérgica o defectos

anatómicos nasales. Es más frecuente en adultos que en niños, puesto que los

senos maxilares, frontales y esfenoidales no se hallan totalmente desarrollados

hasta la adolescencia. La extensión intracraneal de la infección puede originar

osteomielitis, absceso cerebral, empiema subdural, flebitis supurada, meningitis o

cualquier combinación de ellas.

El neumococo es responsable de un tercio aproximadamente de los casos de

sinusitis aguda y, cuando produce una complicación, suele ser en forma de

meningitis aguda.


Introducción 36

4.3.3. - Meningitis

La meningitis neumocócica puede ser una de las complicaciones de la

neumonía bacteriémica, otitis media, mastoiditis y sinusitis, así como de fracturas

que comuniquen la nasofaringe con el espacio subaracnoideo. Una cuarta parte de

los pacientes con meningitis neumocócica tienen también neumonía. Aisa encontró

en una revisión que el 85% de los pacientes presentaban factores predisponentes o

enfermedad de base, destacando un 55,5% por defectos anatómicos congénitos o

traumáticos (Aisa, 1990).

La enfermedad afecta a todos los grupos de edad aunque la mayor mortalidad

la presentan los ancianos (Paredes, 1976; Kornelisse, 1995). En adultos S. pneumoniae es la

causa más frecuente de meningitis bacteriana (Greenlee, 1990), y dadas las campañas de

vacunación contra H. influenzae (tipo b), puede que suceda como en algún país

escandinavo, donde también es la causa de más frecuente de meningitis en niños

(pero no en neonatos).

Los síntomas clínicos y complicaciones neurológicas son similares a los de

cualquier meningitis bacteriana purulenta. Los datos clínicos y características del

LCR no difieren básicamente de los de otras meningitis purulentas. Los hemocultivos

y la tinción de Gram del LCR son positivos en alrededor del 80% de los casos.

Sin embargo, su presentación suele ser muy aguda, su progresión rápida y la

afectación neurológica es en general más grave que la observada en otras etiologías

(Ara, 1994; Chemlal, 1996). La mortalidad global de la meningitis neumocócica es de

alrededor del 10% en los niños y del 30% en los adultos y apenas ha variado en los

últimos 30 años (McGee, 1990). Su principal causa reside en la gran hipertensión

intracraneal y la afectación cerebral secundarias a la intensa reacción inflamatoria

del LCR ocasionada por el neumococo. Algunos pacientes mueren a pesar de

conseguir la esterilización del LCR y otros fluidos corporales, y en otros se ha

observado secuelas neurológicas persistentes (Tuomanem, 1987; Lebel, 1988). La proliferación

bacteriana junto con los productos tóxicos de la pared del neumococo,

especialmente cuando en el comienzo de la terapia antimicrobiana, produce una

lisis masiva que conlleva una explosión de los procesos inflamatorios en el SNC que

puede sobrepasar la capacidad adaptativa del espacio intracraneal (Tuomanen, 1992;

Greenlee, 1990; Tauber, 1991; 1992; Pfister, 1992).


Introducción 37

La mortalidad debida a cepas resistentes llega a ser del 90 %, mientras que a

cepas penicilina sensibles solo es del 30 % (Apelbaum, 1987). Se ha obtenido una

reducción de la mortalidad por meningitis neumocócica, así como en las secuelas

neurológicas de pacientes a los que se le ha administrado dexametasona como

modulador de la respuesta inflamatoria, a la misma vez que se instauraba la terapia

antimicrobiana (Grigis, 1989; Fernández-Viladrich, 1991). La mortalidad es superior en los casos

de meningitis “primaria” o secundaria a una neumonía y muy inferior en las

meningitis recurrentes por fístula pericraneal. Asimismo, la existencia de shock y/o

coma no reactivo al ingreso, así como el desarrollo de convulsiones, ensombrecen el

pronóstico (Kornelisse, 1995).

El punto mas crítico en la terapia es la administración temprana de las

cantidades adecuadas del antimicrobiano óptimo (Plotkin, 1988; Barquet, 1997). Este suele ser

penicilina G 70.000 UI/Kg cada 8 horas en neonatos y 50.000 UI/Kg cada 4 horas en

adultos. La pronta esterilización del LCR es un factor de pronóstico favorable

(McCraken, 1972).

La prevalencia en casos de meningitis de cepas moderadamente resistentes a

penicilina (CIM 0,12-1 mg/l), y que han sido asociadas a fallo del tratamiento

(Handwerger, 1986) puede ser de hasta el 60 % en algunas áreas (Aísa, 1991).

4.3.4. - Endocarditis

Antes del establecimiento de la terapia antimicrobiana, la endocarditis

neumocócica suponía un 10 % de los casos de endocarditis bacteriana. Hoy día sólo

supone un 1 % de los casos de infecciones neumocócicas bacteriémicas (Aronin, 1998).

Normalmente es una complicación de la neumonía neumocócica y sucede en

pacientes con válvulas nativas sanas o previamente dañadas. El curso clínico es en

general agudo y destructivo y en muchas ocasiones el tratamiento requiere un

recambio valvular durante la fase activa de la infección, en especial cuando se

afecta la válvula aórtica.

4.3.5. - Artritis

Es relativamente infrecuente, sucede principalmente en niños y ancianos y

suele presentarse en forma de monoartritis aguda, sin otras características

diferenciales. La artritis neumocócica es secundaria a la diseminación hematógena

desde las vías respiratorias.


Introducción 38

La aspiración del material purulento es un complemento necesario de la

antibioticoterapia. La instilación intra-articular de penicilina suele ser innecesaria

pues se consiguen niveles adecuados por administración parenteral.

4.3.6. - Peritonitis

De forma infrecuente, el neumococo causa peritonitis espontánea en

pacientes con cirrosis hepáticas y en niños con síndrome nefrótico. La patogenia de

estas infecciones no está clara, aunque es verosímil que se produzcan tras

episodios de bacteriemia originados a partir de las vías respiratorias. El diagnóstico

se realiza mediante tinción de Gram y cultivo del líquido peritoneal obtenido por

paracentesis. El tratamiento antibiótico por vía sistémica es suficiente para obtener

la curación.

5. - Diagnóstico de laboratorio

Se efectúa por el aislamiento e identificación del neumococo, o la

demostración del antígeno capsular en los productos del enfermo (Facklam 1987).

5.1. - Aislamiento del microorganismo

5.1.1. - Toma de la muestra

Las muestras adecuadas deben ser tomadas antes de la instauración de una

terapia antibiótica. El material debe ser recogido en recipientes estériles y procesado

inmediatamente o guardado a 4 ° C por el mínimo espacio de tiempo. Los esputos

deben proceder del aparato respiratorio inferior. La presencia de abundantes células

epiteliales demuestra la contaminación con saliva y, por tanto, por la flora oral

normal. Cuando no puede obtenerse una muestra de esputo, como en niños muy

pequeños, debe realizarse un cultivo faríngeo. En el frotis faríngeo, dada la labilidad

del neumococo a la solución salina y a la desecación, los hisopos deben colocarse

en tubos con medio de cultivo líquido o semisólido.

5.1.2. - Examen directo

En el frotis teñido por el método de Gram, cuando el neumococo presenta la

morfología típica (diplococo lanceolado, grampositivo, con las puntas hacia fuera y

rodeado de un halo claro), existe una fuerte presunción, que debe confirmarse


Introducción 39

mediante otras pruebas diagnósticas. Como muchos individuos sanos portan

neumococos en la faringe, sólo sería valorable su presencia en frotis de esputos si

se observara una elevada proporción de neumococos y leucocitos

polimorfonucleares. La cápsula se demuestra muy bien por tinción negativa con tinta

china (Austrian, 1994, 1996).

Sin embargo, en los enfermos tratados se observan menos leucocitos, y los

neumococos pueden presentar formas atípicas ovoides, en cadenas cortas, etc. y

ser gramnegativos. En estos casos es imposible diferenciar por el método de Gram

los neumococos de otros estreptococos (Musher, 1995)

5.1.3. - Cultivo

Se debe realizar siembras por agotamiento en placas recientes de agar

sangre de carnero con una atmósfera del 10 % de CO2. La adición de 5 µg/mL de

gentamicina al agar suprime el crecimiento de otros estreptococos pudiendo

aumentar la sensibilidad del cultivo. A las 12-18 horas se observan colonias muy

pequeñas (1 mm), planoconvexas y transparentes, rodeadas de una pequeña zona

de alfahemólisis, que a las 24 horas se aplanan y toman forma de disco. Con el

tiempo los fenómenos de autólisis son mas acentuados, aparece una depresión

central o colonias en anillo, y, en estos casos por lo general los neumococos se

hacen gramnegativos (Austrian, 1996). Los neumococos denominados tipo III forman

colonias mucosas.

Para la detección de neumococos en esputos, cuando son escasos y existe

abundante flora comensal, puede utilizarse medios selectivos como el de Nichol y

Freeman que contiene cristal violeta, ácido nalidíxico y gentamicina, siendo capaz de

inhibir el crecimiento de la mayoría de las cepas de enterobacterias, difteroides,

Staphylococcus aureus y Branhamella catarrhalis aunque permite el crecimiento de

otros estreptococos no hemolíticos y viridans abundantes en la boca. Igualmente

existe poca especificidad en los exámenes disponibles para la detección de

neumococos en esputos, ya que muestran hasta un 68 % de reacciones cruzadas

con estreptococos viridans. Algunos autores han propuesto el cultivo cuantitativo

para determinar la significación microbiológica. Si el número de neumococos es igual

o superior a 1x106 UFC/mL, entonces es muy probable que se trate de una infección


Introducción 40

del tracto respiratorio inferior; pero si el recuento es menor de 1x106 UFC/mL puede

que se trate de una contaminación.

En los casos de endocarditis, sepsis y de neumonía cuando la fiebre es alta,

se debe practicar un hemocultivo. La bacteriemia es indicadora de una infección

grave y posee significado pronóstico. Las muestras obtenidas por punción venosa y

LCR, así como los líquidos serosos obtenidos de la pleura, pericardio, peritoneo y

cavidades sinoviales, antes de la administración de antibióticos, deben sembrarse

inmediatamente en caldo de carne y un medio que contenga tioglicolato. El último se

halla indicado porque los pequeños inóculos de neumococo tienden a crecer mejor

en medios con bajo potencial de óxido - reducción (Austrian, 1996). En los enfermos

tratados con penicilina, no se mejora el aislamiento añadiendo penicilinasa al medio

del hemocultivo.

En la meningitis neumocócica, el LCR contiene frecuentemente gran número

de neumococos, pudiendo hacerse un diagnóstico presuntivo mediante la tinción de

Gram. Como los neumococos sufren autólisis con facilidad, debe examinarse

cuidadosamente la preparación antes de descartarla como negativa. Por la misma

razón anterior es especialmente recomendable en los LCR la investigación de

antígenos neumocócicos mediante técnicas serológicas.

5.1.4. - Patogenicidad en animales

El ratón resulta especialmente sensible a los neumococos virulentos, que

podrían investigarse directamente de la muestra emulsionándola con 1 mL de caldo

e inyectándola intraperitonealmente (Musher, 1995). Los neumococos se desarrollan

rápidamente y pueden aislarse a las pocas horas del líquido peritoneal y más tarde

de la sangre, muriendo el ratón dentro de cuatro días (Austrian, 1996).

El resto de la flora normal suele ser destruida por los fagocitos del ratón, que

así puede servir como medio selectivo de cultivo. Sin embargo, ciertos serotipos,

especialmente el 14, pueden no ser virulentos para el ratón (Musher, 1995).

En otros animales el neumococo puede ser agente ocasional de mastitis y

septicemia en ganado vacuno y ovino, y de infecciones del tracto respiratorio en

monos (Rotta, 1986).


Introducción 41

5.2. - Identificación

En los cultivos se observan colonias αhemolíticas,

compuestas por cocos grampositivos, catalasa negativa y que

en general no pueden diferenciarse de los estreptococos

viridans.

Las pruebas de identificación presuntiva del neumococo

se basan en su solubilidad en la bilis o soluciones de

desoxicolato sódico y en la sensibilidad a la optoquina. Esta

última es la más utilizada en el diagnóstico de rutina; se realiza

colocando un disco que contiene 5 µg de etilhidrocupreína

(optoquina) en una placa de agar-sangre recién sembrada, y a

las 24 horas de incubación se observa un área de inhibición de

15 mm o mayor alrededor del disco. Este método obtiene una

buena correlación con los resultados

obtenidos por cultivo de esputos, en el 95

% de adultos enfermos de neumonía neumocócica (Musher, 1995;

Gardam, 1998).

La prueba de solubilidad en bilis puede efectuarse mejor

en desoxicolato al 2 % p/v, y debe realizarse mejor con

suspensiones salinas de las células bacterianas porque las

proteínas extrañas del medio líquido inhiben la reacción,

posiblemente por fijar el desoxicolato (Musher, 1995). Igualmente no debe realizarse la

prueba en superficies de agar ya que se producen resultados falsos positivos.

Pruebas confirmatorias de identificación se basan en la reacción de hinchazón

de la cápsula (quellung) en presencia de un suero antineumocócico polivalente. La

unión del polisacárido capsular con el anticuerpo correspondiente forma un

precipitado intracapsular, que aumente su refringencia. La identificación del tipo

antigénico del neumococo causal debe realizarse mediante el empleo de sueros

monovalentes. Algunos serotipos, especialmente el 3 y 37 pueden dar falsos

negativos debido a un exceso de antígeno - fenómeno de zona (Musher, 1995).

Fig. 6: Prueba de laoptoquina

Fig. 7: Prueba en tubode lisis por bilis

Fig 8: Prueba deQuellung


Introducción 42

5.2.1. - Identificación del antígeno capsular

Para el establecimiento de un diagnóstico precoz, y especialmente cuando los

cultivos son negativos o nos encontramos ante un enfermo tratado con antibióticos;

se puede llegar algunas veces al diagnóstico por la demostración del antígeno

capsular en los líquidos tisulares (LCR, orina, liquido pleural y esputos) mediante

pruebas de precipitación, aglutinación en látex (LA), coaglutinación (COA), y menos

frecuentemente por contrainmunoelectroforesis (CIE) frente a sueros específicos

polivalentes. Estas técnicas para la detección de antígenos resultan rápidas,

sensibles y específicas especialmente en LCR donde resultan positivas en el 90 %

de los casos de meningitis neumocócica. La proporción de pacientes con antígeno

en esputo, sangre u orina varía considerablemente según los diferentes estudios

(Ajello 1987), así la antigenemia se presenta del 45 al 80 %, y la antigenuria lo hace en

un 50 al 65 % de los casos con neumonía neumocócica. En estudios comparativos

sobre LCR la COA dio mayor número de resultados positivos que los obtenidos por

tinción de Gram o cultivo (Musher, 1995).

5.2.1.1. - Coaglutinación.

El reactivo está formado por células muertas de Staphylococcus aureus

capaces mediante su proteína A superficial, de unirse a la fracción constante Fc de

inmunoglobulinas, en este caso de anticuerpos específicos contra neumococo. Así

cuando neumococos vivos o muertos, o antígeno neumocócico libre (SSS) se unen a

estas células se produce una aglutinación visible a simple vista.

5.2.1.2. - Test de aglutinación en látex.

También se dispone de ellos comercialmente, y constan de partículas de látex

o de otro tipo, recubiertas de anticuerpos antineumocócicos para la detección de

antígenos en LCR, suero y orina.

5.2.1.3. - Contrainmunoelectroforesis.

Este método es especialmente sensible, pudiendo dar resultados positivos

cuando la COA es negativa La técnica es relativamente rápida y permite la detección

del antígeno polisacarídico capsular en LCR, sangre, esputos, orina, liquido pleural y

peritoneal (Musher, 1995).


Introducción 43

5.2.2. - Identificación de otros componentes bacterianos

Se han utilizado técnicas de amplificación de ADN (PCR) para el diagnóstico

de S. pneumoniae en otitis (Virolainen, 1994; Friedland, 1994c), esputo (Gillespie, 1994), suero (Dagan,

1998) y meningitis (Hall, 1995; Cherian, 1998).

Otras técnicas han probado la determinación de neumolisina para el

diagnóstico de neumonía (Kalin, 1987), o de los ácidos teicoicos y lipoteicoicos en el

diagnóstico de meningitis (Stuertz, 1998, 1998b)

5.3. - Anticuerpos circulantes.

Los procedimientos serológicos actuales no proporcionan la necesaria rapidez

diagnóstica. Se ha utilizado extensamente el radioinmunoensayo (RIA) para evaluar

la respuesta a la vacuna antineumocócica, así como la persistencia de los niveles de

anticuerpos

Anticuerpos circulantes a la hemolisina neumocócica han sido medidos con

enzimoinmunoanálisis - ELISA - (Kalin 1987)

6. - Inmunidad.

6.1. - Inmunidad natural.

Las defensas celulares juegan un papel importante en la protección contra la

neumonía neumocócica. Los leucocitos alveolares macrófagos y polimorfonucleares

son las principales células fagocíticas actuantes en la neumonía (Johnston 1981). La

activación del complemento también juega un papel importante en el curso de las

infecciones neumocócicas, su activación por la vía alternativa promueve la

fagocitosis e induce la quimiotaxis de los neutrófilos.

6.2. - Inmunidad adquirida.

Los anticuerpos anticapsulares aparecen al quinto o sexto día de la

enfermedad (Austrian, 1996). Son tipo-específicos, protectores y duraderos, aunque el

efecto de un tratamiento precoz sobre la producción de anticuerpos es desconocido.

Su efecto protector se basa principalmente en promover la fagocitosis por los

neutrófilos. Las infecciones sistémicas recurrentes con el mismo serotipo son raras

excepto en pacientes con hipogammaglobulinemia o con focos persistentes. A pesar

de la presencia de anticuerpos circulantes protectores, pueden recobrarse


Introducción 44

neumococos del aparato respiratorio superior durante días o semanas. Los

anticuerpos pueden ser detectados por RIA y enzimoinmunoanálisis (Musher, 1995).

6.2.1. - Vacunas

La decisión de desarrollar una vacuna basada en el polisacárido capsular

partió de los numerosos trabajos de Avery y colaboradores, que indicaban como el

neumococo presentaba su superficie externa cubierta de dicho polímero. Los

anticuerpos generados eran altamente protectores contra la infección letal, pero

existía la complicación de encontrar más de ochenta serotipos capsulares. Cuando

se pudo asociar determinados serotipos a determinadas infecciones, se elaboraron

vacunas primeramente de 14 y actualmente se encuentra en el mercado, de los 23

serotipos que causan neumonía con mayor frecuencia. Esta vacuna es efectiva en

individuos adultos inmunocompetentes, pero sólo lo es un 60% en ancianos; e inútil

en niños menores de 2 años en los que la respuesta inmunológica contra los

polisacáridos es inmadura (Briles, 1998).

A pesar de que, desde el principio, se apreció el poder protector de la vacuna

con microorganismos muertos enteros, su evaluación sobre poblaciones de mayor

riesgo con cierto grado de inmunodeficiencia como ancianos, no llegó a demostrarlo;

tal vez debido al compromiso de la inmunidad que no permite la respuesta a la

vacuna. A pesar del la baja respuesta promedio, está indicada su aplicación en

pacientes inmunocompetentes con EPOC, enfermedad cardiovascular avanzada,

diabetes, alcoholismo, cirrosis, insuficiencia renal y toda persona mayor de 65 años.

Y, además, en pacientes inmunocomprometidos pero con alto riesgo de infección

neumocócica por disfunción esplénica, linfoma, VIH, trasplantados, etc.

Posiblemente si se mantiene el incremento de la prevalencia de neumococos

resistentes a penicilina, será razonable aumentar la población susceptible de

vacunación (Musher, 1995; Briles, 1998).

Actualmente se están investigando vacunas basadas en conjugados de

proteína con polisacárido para favorecer la respuesta, aunque persiste el problema

de la variedad de serotipos (Watson, 1996; Briles, 1998). Otras investigaciones trabajan sobre

proteínas como la neumolisina, autolisinas, neuroaminidasa; y en la denominada

adhesina A (pspA) proteína de la superficie del neumococo cuyos anticuerpos son

protectores contra diversos serotipos (Sampson, 1994; Briles, 1998).


Introducción 45

6.3. - Infecciones en pacientes inmunocomprometidos.

6.3.1. - Esplenotomía.

Las infecciones neumocócicas en pacientes esplenotomizados suelen cursar

de forma rápida y fatal. Suele aparecer coagulación intravascular diseminada y los

microorganismos pueden ser detectados en sangre periférica.

Especialmente las infecciones neumocócicas suelen ser comunes en niños

con anemia de células falciformes (drepanocitosis), donde el neumococo suele ser el

principal agente de bacteriemias y meningitis (Musher, 1995).

6.3.2. - Agammaglobulinemia.

Los niños y jóvenes con inmunodeficiencia hereditaria suelen ser

especialmente susceptibles a las infecciones piógenas incluyendo las neumocócicas

(Musher, 1995).

6.3.3. - Enfermedades hematológicas.

Las infecciones neumocócicas son frecuentes en pacientes con mieloma

múltiple y agudo así como en aquellos con leucemia linfocítica crónica.

6.3.4. - Infecciones neumocócicas en pacientes infectados por el virus

de la inmunodeficiencia humana

La colonización por S. pneumoniae es similar en el VIH positivo y en el grupo

de pacientes VIH negativos. La mayor incidencia de esta infección en el primero de

los grupos tiene su base en la deficiencia de respuesta humoral frente a antígenos

neumocócicos en la población VIH+ y quizá en la incapacidad de producir IgA

mucosa en cantidad y calidad adecuada (Bouza, 1998).

Las infecciones neumocócicas pueden ocurrir en cualquier momento de la

historia natural de la infección VIH, pero la mayoría de ellas se presentan cuando los

pacientes tienen cifras de células CD4+ menores de 200/mL. La infección

neumocócica puede ser la primera manifestación clínica de infección VIH, en un

porcentaje que supera el 40% de los episodios. La mayoría de las neumonías

neumocócicas en el paciente VIH positivo suelen adquirirse en la comunidad.

Clínicamente el cuadro es bastante semejante al de la neumonía en el resto de los

grupos de población.


Introducción 46

En nuestro medio, el tratamiento aplicado a la neumonía neumocócica en el

paciente VIH positivo no difiere del aplicado a otros grupos de población. Debe

recordarse que la incidencia de aislados con resistencia intermedia o alta a la

penicilina supera el 40% en muchos hospitales, y que la resistencia a macrólidos

(Shortrige, 1996), cloramfenicol y tetraciclina son mayores del 20% en muchos casos. El

cotrimoxazol, fármaco muy utilizado ante neumonías con prueba o sospecha de

estar causados por P. carinii tiene más de un 60% de resistencias frente a S.

pneumoniae, y, por tanto, no debe utilizarse en el tratamiento empírico de la

neumonía bacteriana.

La tendencia a la recurrencia en pacientes VIH positivos (Jordens, 1995) con

neumonía neumocócica es elevada, por lo que se han desarrollado diversas pautas

profilácticas (Peters, 1994)

7. - Tratamiento

7.1. - Introducción

7.1.1. - Situación actual del tratamiento de las infecciones neumocócicas

La penicilina G, por su excelente actividad contra el S. pneumoniae, ha sido

durante muchos años el tratamiento de elección de las infecciones neumocócicas

(Tarpay, 1978; Stratton, 1995). Sin embargo durante las dos pasadas décadas, se han descrito

cepas de neumococo con menor sensibilidad a penicilina por casi todo el mundo

(Appelbaum, 1987, 1992; Jorgensen, 1990, 1994, 1994b; Klugman, 1988, 1990, 1992; 1993; Schutze, 1994; Dowson, 1993;

Breiman, 1994; Doit, 1996), incluida España (Liñares, 1984, 1992; 1992b; Latorre, 1985; 1988; Fenoll, 1989, 1998; de

Cueto, 1990; Baquero, 1991; Gómez, 1994; Pallarés, 1995; Fridmodt-Moller, 1997). Pero la resistencia a

penicilina es sólo un aspecto del problema, ya que la tasa de cepas resistentes a

múltiples antibióticos es mayor en las cepas resistentes a penicilina, que, además,

presentan una menor sensibilidad frente a otros ß-lactámicos (Jacobs, 1978; Zighelboim, 1980;

Liu, 1985; Applebaum, 1987; Liñares, 1992; McDouglas, 1992; Reichler, 1992; Cantón, 1993; Lister, 1994, 1995; Barnes, 1995;

Klugman, 1996; Mason, 1996).

Infecciones extrameníngeas. Los criterios de sensibilidad de la NCCLS para

penicilina y cefalosporinas de tercera son restrictivos al asumir el punto de vista de

las infecciones meníngeas. Sin embargo, la penicilina G persiste como el antibiótico

de primera elección en las infecciones extrameníngeas por neumococo (Pallarés, 1987;

Musher, 1995; Mason, 1998). La mayoría de los pacientes hospitalizados reciben medicación


Introducción 47

parenteral, y en esos casos es suficiente la administración de 500.000 - 1.000.000 UI

de penicilina G cada 4 horas. La amoxicilina por su completa absorción en

administración oral, y su mayor vida media resulta una opción adecuada para el

tratamiento de la neumonía neumocócica en dosis de 500 mg cada 8 horas (Andes,

1998; Balcabao, 1996; Pérez-Trallero, 1998). El índice de resistencia a eritromicina, en las cepas

resistentes a penicilina, hace desaconsejable su elección (Moreno, 1995; Ednie, 1996; Visalli,

1997).

Infecciones meníngeas. Aquellos pacientes con aislamientos resistentes a la

penicilina y compuestos relacionados, pueden administrárseles una cefalosporina de

tercera generación como cefotaxima o ceftriaxona (Scholz, 1998), o cloramfenicol (Pécoul,

1991), aunque se han documentado fracasos terapéuticos con cefalosporinas de

tercera (Bradley, 1991; 1994; Sloas, 1992; Chandy, 1993; Raymond, 1995; Flórez, 1996), y aislado cepas

resistentes al cloramfenicol (Friedland, 1992). En cualquier aislamiento de S. pneumoniae

procedente de líquidos estériles debe estudiarse, la sensibilidad a cefalosporinas de

tercera (Daum, 1994).

Aunque algunos autores americanos, en pacientes con meningitis,

endocarditis y artritis siguen indicando dosis de 12 a 24 millones de UI de penicilina

(Musher, 1995), existe, ante el incremento de cepas altamente resistentes a penicilina, los

niveles alcanzables en el SNC y la publicación de fallos terapéuticos, el general

consenso (Tweardy, 1983; Klugman, 1990; Viladrich, 1991; Paris, 1995; Jacobs, 1996) en desaconsejar el uso

de penicilina, y en recomendar (Tan, 1992; Lister, 1995; Mensa, 1998) para el tratamiento de

meningitis por S. pneumoniae, agentes como las cefalosporinas de tercera

generación (p.ej. cefotaxima o ceftriaxona) que atraviesan bien la barrera

hematoencefálica (Pallares, 1995).

Con neumococos de CIM a cefotaxima ≤ 1 µg/mL, el tratamiento es con altas

dosis de la misma (300 mg/kg/día) (Tan, 1994); sin embargo la infección con cepas de

CIM a cefotaxima ≥ 2 µg/mL debe tratarse con altas dosis de vancomicina (1 g /8-12

hr en perfusión lenta) asociada a rifampicina o a una cefalosporina de tercera

generación, o imipenem (Doit, 1997; Paris, 1995; Bhatacharya; Friedland 1993, 1995).

Vancomicina se asocia con una capacidad variable de atravesar la barrera

hematoencefálica y no es confiable en monoterapia de primera elección para el

tratamiento de la meningitis en adultos (Viladrich, 1991). Imipenem y esparfloxacino, a

pesar de la excelente actividad contra S. pneumoniae (Asensi, 1989; Spangler, 1994; 1997; Visalli,


Introducción 48

1996; 1996b; Pikis, 1997; Baquero, 1996; Barakett, 1996b; Barret, 1996; Goa, 1997; Liñares, 1998) por la producción

de efectos adversos, tampoco son aconsejables como tratamiento de elección en

meningitis. Sin embargo vancomicina, imipenem y las fluorquinolonas mantienen su

utilidad en otros tipos de infecciones neumocócicas (Aísa, 1990; Barr, 1990; Craig, 1994; Liu, 1995;

Siami, 1995; Lacka, 1996; Balfour, 1996; Aubier, 1996, 1998; Allegra, 1996; Crokaert, 1996; Basoli, 1997; Kaplan, 1998),

Actualmente se investiga en el tratamiento de meningitis neumocócica, el uso

de otras cefalosporinas como cefepime o cefpiroma (Gialdroni, 1993; Giamarellou, 1993; Hoepelman,

1993; Kieft, 1993; Leophonte, 1993; Fitoussi, 1995; Fremaux, 1998; Jones, 1998), penemas como meropenem

(Dagan, 1994; Barakett, 1996; Bradley, 1997), clindamicina (Paris, 1996) y fluorquinolonas como el

trovafloxacino (Thomson, 1997; Kaplan, 1998), o el moxifloxacin (Ostergaard, 1998). La posible

ventaja de algunos de estos antimicrobianos, sobre ceftriaxona, imipenem y

esparfloxacino, de una actividad superior contra S. pneumoniae, no refleja

necesariamente una mayor eficacia terapéutica ya que en todos los casos es factible

superar los niveles bactericidas.

7.1.2. - Elección del agente antimicrobiano

Una vez presumido o conocido el S. pneumoniae como responsable de la

infección, y contando con la información más exacta posible a cerca de su

susceptibilidad antimicrobiana, o de su prevalencia, hay que considerar los

denominados factores del huésped, siendo el más importante el lugar de la

infección, que determina no sólo la elección del antimicrobiano, sino también su

dosis y la vía de administración (Jernigans, 1996) en función de sus características

farmacodinámicas y farmacocinéticas.

Si la penetración es aceptable, en aquellos fármacos como ß-lactámicos,

vancomicina o fosfomicina, cuya acción bactericida depende más del tiempo de

exposición que de la concentración del fármaco, y que suelen producir un mínimo o

moderado efecto post-antibiótico, debe seleccionarse una dosificación y vía de

administración que mantenga niveles constantes por encima de la CIM. En los

antimicrobianos cuya acción bactericida depende altamente de la concentración y

suelen producir efectos post-antibióticos prolongados como las fluorquinolonas se

considera que la concentración local debe ser mayor de 8 veces la CIM para un

efecto antimicrobiano óptimo y un mínimo desarrollo de resistencias, aunque se ha

visto que concentraciones subinhibitorias pueden ejercer efectos antimicrobianos,

que ayudan a las defensas naturales, alterando propiedades como la adherencia


Introducción 49

celular y los requerimientos opsónicos, aumentando la fagocitosis e, incluso, pueden

ayudar a la destrucción intracelular por lo leucocitos polimorfonucleares (Moellering, 1995).

En procesos graves como meningitis, donde es crítico conseguir un efecto

bactericida rápido, los estudios en animales indican que se necesita obtener una

concentración ≥10 CIM (Scheld, 1985).


Introducción 50

7.1.3. - Tabla 2: Niveles en suero y LCR

Ref

eren

cia

Ant

ibió

tico

Vía

de

adm

.

Dos

is

T½

(hr

)

Pic

o m

edio

y (

rang

o)en

sue

ro (

µg/

mL

)

Tie

mpo

del

pic

o en

suer

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r)

Pic

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edio

y (

rang

o)en

LC

R µ

g/m

L*(

con

men

ingi

tis)

Tie

mpo

del

pic

o en

LC

R (

hr)

% L

CR

/sue

ro*(

con

men

ingi

tis)

Amsdem, 1995 PEN IV 2.000.000 U.I. 0,4-0,5 20 0-10 *

Mensa, 1998 PEN IV 1.000.000 U.I. 0,5 20 5-10**

Gerding, 1996 PEN IV 1.200.000 U.I. 0,5 74 (12-91) 1 0,17 (0,09-0,37) 1 0,2

Dámaso, 1990 PEN IV 1.000.000 U.I. 0,5-1 0,3-200,5-33 UI

0,5

Gerding, 1996 VAN IV 500 mg/kg 6 6,3 (4,3-10) 1-2,5 0 sin infecc 0 sin infecc

Mensa, 1998 VAN IV 1g 6 25-40 5-20*†

Amsdem, 1995 VAN IV 1 g 4-6 25 7,21*

Fekety, 1995 VAN IV 1 g 6-8 7-35 (2) 1 <1 - 7 *

Dámaso, 1990 VAN IV 0.5 g1g2 g

4-6 102550

222

10-20*

Mensa, 1998 CTR IV 1 g/dia 8 150 5-10*‡+§

Gerding, 1996 CTR IV 100 mg/kg/dia 4 128,2 2 11 2 8,6

Amsdem, 1995 CTR IV 1 g2 g3 g

5,4-10,9 123-150223-276216-281

16-32

Karchmer, 1995 CTR IV 2 g 8 250 1,2 - 39

Balfour, 1996 IMP IV 1 g 30-4260-72

0,6-0,91,1-2,3

1-81-6

20-30

Gerding, 1996 IMP IV 1 g 20 (12-41) 1-2 1,7 (0,65-3,0) 2-6 8,5

Mensa, 1998 IMP IVIVIM

1,0 g0,5 g0,5 g

704010

10***

Dámaso, 1990 IMP IV 1 g1 g

1 g/6 hr

0,6-0,91,1-2,3*0,5-11*

1-81-61-2

Dámaso, 1990 IMP IV 0,25 g0,50 g1,00 g

12-2021-5841-83

Chambers, 1995 IMP IV 0,250,501,00

111

133252

Amsdem, 1995 IMP IV 0,250,501,00

0,8-1 14-221-5841-83

1-10*

Goa, 1997 ESP PO 100 mg200 mg400 mg

15,8- 16,815,8-20,816-20,2

0,39-0,440,62-0,710,56-1,60

2,3-2,63,5-4

2,05-5,6

Entenza, 1994 ESP IV 400 mg 18-20 4-61,5-2,5

124

Davey, 1994 ESP PO 400 mg 2,541,582,24

3-6 0,420,570,84

3-6

Trautmann, 1986 ESP PO 400 mg 24 1,5 2

Zix, 1997 ESP PO 400 mg 20 1,3 4

Mensa, 1998 FOS IV 2 g 3-5 90 25*

Dámaso, 1990 FOS IV 0,25 g0,50 g1,00 g2,00 g

1,2-2 12.6-1831,5

44,4-5878,4-93,2

15 min

PEN: Penicilina G sódica; VAN: Vancomicina; CTR: Ceftriaxona sódica; IMP: Imipenem;ESP: Esparfloxacino; FOS: Fosfomicina

* Si la concentración en LCR es superior a 5 µg/mL, existe el riesgo de encefalopatía y convulsiones† La concentración en LCR es a menudo subterapéutica. Puede administrarse intratecalmente, debiéndose controlar los niveles entre 10 - 20 �g/ml‡ En términos absolutos corresponde a una concentración de 5 - 15 µg/mL eficaz frente a la mayoría de los microorganismos sensibles§ La elevada fijación proteica de la ceftriaxona (90%) limita su difusión al LCR. Sin embargo hay datos sobre la existencia en el plexo coroideo, de un mecanismo de transporte activo para este antimicrobiano** Disminuye el umbral de aparición de convulsiones


Introducción 51

7.2. - Penicilina G

La penicilina fue descubierta por Fleming en 1928 en el Penicillinum notatum.

A partir del trabajo de Florey, Chain y colaboradores en 1941 se pudo obtener

comercialmente. La estructura de la penicilina G, como la mayor parte de penicilinas

del mercado, posee el anillo ß-lactámico, un anillo tiazolidinico, y una cadena lateral.

Generalmente existen como sales de sodio o potasio. El anillo ß-lactámico es

esencial para la actividad antimicrobiana, mientras que la cadena lateral determina,

en gran parte, el espectro antibacteriano y las propiedades farmacológicas.

7.2.1. - Farmacología

La penicilina G no es estable a los ácidos, lo que limita su administración a la

vía parenteral. Se une a las proteínas plasmáticas un 55%, principalmente a la

albúmina. La unión a proteínas séricas puede afectar tanto la distribución tisular (la

fracción unida no atraviesa membranas) como la actividad de los agentes

antimicrobianos (la fracción unida no se une a los receptores). Aunque se han

llevado a cabo cuidadosas investigaciones sobre la unión a proteínas (Merrikin, 1983; Wise,

1986), todavía se debe determinar la significación clínica de este fenómeno. Se ha

demostrado que sólo la forma libre de un antimicrobiano es activa in vitro (y

presumiblemente también in vivo); no obstante como la unión a proteínas es

rápidamente reversible incluso la actividad de agentes altamente unidos a proteínas,

puede no estar limitada por ello (Craig, 1977; Cars, 1991).

Se excreta con rapidez por la orina, por lo que tiene una vida media corta de

menos de 30 minutos. Las células de los túbulos renales, en virtud de mecanismos

activos, pueden eliminar hasta 4 g/hr de penicilina G. Esta excrección puede ser

bloqueada por el probenecid que aumenta la vida media de todas las penicilinas.

Además el probenecid también compite por los lugares de unión a la albúmina

aumentando la fracción libre activa.

Fig. 9: Estructura de la Penicilina G


Introducción 52

Distribuye bien por la mayor parte de las áreas corporales, como el pulmón, el

hígado, el riñón, el músculo, el hueso y la placenta. Los niveles de penicilina en los

abscesos, el oído medio y los líquidos peritoneal, pleural, o sinovial, son en

presencia de inflamación, suficientes para inhibir a la mayoría de los

microorganismos susceptibles. La mayoría de las penicilinas son relativamente

insolubles en lípidos y atraviesan mal las membranas, por lo que su distribución en

ojos, SNC o próstata es prácticamente nula en ausencia de inflamación. La

inflamación altera las barreras normales, permitiendo el ingreso de las penicilinas,

pero lo más importante es que interfiere la bomba de aniones que elimina penicilina

del líquido cefalorraquídeo (Musher, 1995).

7.2.2. - Acción de los ß-lactámicos.

No se sabe con precisión de qué manera las penicilinas destruyen las

bacterias. El estudio de su acción ha contribuido en muchos aspectos al

conocimiento de la fisiología bacteriana, pero avances recientes sugieren que el

concepto de que la penicilina destruye bloqueando simplemente el último paso de la

síntesis de la pared celular es simplista. La síntesis del peptidoglucano es un

proceso complejo, en el que intervienen no menos de 30 enzimas, que empieza en

el citoplasma, continúa a través de la membrana citoplasmática y da lugar a nuevas

unidades en la pared.

7.2.2.1. - Pared celular

La pared celular de las bacterias

grampositivas es una gran capa de 50 a

100 moléculas cuyo componente principal

es el peptidoglucano. Este consta de largas

cadenas de polisacáridos en las que la N-

acetil glucosamina (NAG) y el ácido N-

acetil murámico (NAM) se alternan linealmente. Las cadenas individuales son fijadas

por péptidos cortos unidos en el enlace amida al penúltimo grupo D-alanil del ácido

N-acetil murámico.

La síntesis del peptidoglucano ha sido estudiada en tres fases. La primera

corresponde a la síntesis de precursores UDP-NAM-pentapéptido y UDP-NAG.

Estos dos compuestos son transportados a través de la membrana citoplasmática

Cápsula

Péptidoglicano

Membrana

Fig. 10: Esquema de la pared celular del neumococo


Introducción 53

por un transportador liposoluble; y en esta

etapa se produce la transglicosilación del

monómero del disacárido en polímero del

peptidoglucano. La reacción final, que inhibe

la penicilina, es la fijación del nuevo

peptidoglucano al existente en la pared. Un

grupo amino libre del tercer aminoácido del

NAM-pentapéptido de una cadena, desplaza la D-alanina terminal de un

pentapéptido de una segunda cadena en una reacción de transpeptidación. Parece

haber transpeptidasas definidas que permiten la fijación del nuevo peptidoglucano al

antiguo, que fijan estructuras especiales y conforman el tabique de la pared celular.

Además la penicilina es capaz de inhibir otras enzimas carboxipeptidasas, de

importancia no dilucidada. En cualquier caso el efecto letal parece ser dependiente

del ciclo celular y la inhibición induce la alteración del evento crítico de la división

celular.

7.2.2.2. - Proteínas fijadoras de penicilina (PFPs o PBPs)

Los neumococos con resistencia aumentada a los antibióticos ß-lactámicos no

son productores de beta-lactamasas (Robins-Browne, 1979) sino que la resistencia

intrínseca observada se ha demostrado asociada a alteraciones secuenciales y

acumuladas de los enzimas sensibles a penicilina denominados proteínas fijadoras

de penicilina [PFPs] (Jacobs, 1978; Hakenbeck, 1980; 1991; 1991b; Williamson, 1980; Jabes, 1989; Smith, 1995;

Greebe, 1995; 1997; Severin, 1996; 1997; Guilmi, 1998), que modifican su número (Tumanem, 1986), y su

afinidad y especificidad por los ß-lactámicos (Handwerger, 1986b). Se entiende también que

una prolongada presión antibiótica, haya seleccionado cepas portadoras de

modificaciones múltiples que las hacen capaces de sobrevivir ante altas

concentraciones de penicilina (Bryan, 1991). Las alteraciones en la secuencia de DNA,

unidas a los cambios observados en las PFPs, sugieren que la resistencia a la

penicilina, y otros antimicrobianos en el neumococo es posiblemente el resultado de

una transformación natural por recombinación genética de los genes codificadores

de las PFPs, con genes de otras especies resistentes como el Streptococcus mitis

(Dowson, 1993; Tomasz, 1995; Adrian, 1997; Reichman, 1997; Asahi, 1998; Hakenbeck, 1998). El proceso de

recombinación puede suceder cuando la diferencia entre el segmento entrante y el

Fig. 11: Estructura del péptidoglicano en elmeumococo


Introducción 54

reemplazado es menor del 25 - 30%. Estos genes segmentados o en mosaico,

determinan la resistencia a ß-lactámicos. Es por ello que las cepas de neumococo

resistentes a los ß-lactámicos ofrecen PFPs alteradas (Hakenbeck, 1980; Markiewicz y Tomasz,

1989; Jabes, 1989).

Las bacterias suelen producir varias clases de PFPs semejantes

estructuralmente. Las PFPs de alto peso molecular (>50 kiloDalton [kDa]) y las de

bajo peso molecular (<50 kDa) catalizan las reacciones de transpeptidación y

carboxipeptidación en la ensambladura de la pared celular. Los antibióticos ß-

lactámicos se unen a ambas en forma covalente por acilación del sitio activo del

residuo serina. Las funciones críticas para la supervivencia celular suelen residir en

las PFPs de alto peso molecular (Musher, 1995).

En los estudios de un determinado microorganismo, las PFPs se enumeran

de acuerdo con el peso molecular, designándose PFP1 a la de mayor peso. Si

posteriormente resulta que alguna de ellas, en realidad, son varias de peso

molecular parecido, se las distingue con una letra o signo prima (p.ej PFP1b).

Las PFPs más importantes en los Gram positivos son PFP1, PFP2 y PFP4.

Las PFPs suponen un 1% de las proteínas de membrana, variando tanto en número

como en funciones durante la formación de la pared celular. También difieren en su

afinidad con los antibióticos ß-lactámicos, lo que contribuye a explicar las diferencias

de actividad antibacteriana de estos antimicrobianos (Hakenbeck, 1988). Por otro lado la

especificidad de la interacción de los ß-lactámicos con las PFPs neumocócicas

depende parcialmente del resto R1 unido al anillo betalactámico, de tal manera que

ß-lactámicos con diferentes estructuras, pero con la misma cadena R1, se unen a

las mismas PFPs. La especificidad de un ß-lactámico por las distintas PFPs

trasciende del puro interés académico, pues aquellos que se unen preferentemente

a la PFP3 como la mayoría de las penicilinas y las cefalosporinas aminotiazólicas,

permiten un considerable desarrollo de la biomasa antes de que los procesos

bacteriolíticos sean predominantes. Cuando los filamentos lisan, al menos in vitro se

produce una liberación masiva de productos bacterianos, con el consiguiente riesgo

de shock séptico in vivo. La acción de los antimicrobianos que se unen

proporcionalmente más a las PFPs 1a, 1b y 2 como imipenem, minoriza dicho riesgo

ya que sólo permiten un pequeño incremento de la biomasa antes de la lisis celular.


Introducción 55

Seis PFPs se encuentran en la mayoría de las cepas susceptibles (Ellerbrok y

Hakenbeck, 1988).

Tabla 3: PFPs de Streptococcus pneumoniae

PFP Masa molecular (kDa)* Esencial Comentarios

1a 92 - 100 Sí

1b 89 - 95 Sí

2a 81 Sí

2b 77 - 79 Sí

2x 85 Sí

3 43 - 52 No

PFP1c es una

forma de la PFP1a

con baja afinidad

Los pesos moleculares varían en distintos aislamientos, debido a que las PFPs están

codificadas por genes segmentados.

Tomado de Livermore y Williams, 1996, modificado.

Ninguna PFP es el blanco único de un ß-lactámico, antibióticos que provocan

su efecto letal por inhibición simultánea de diversas PFP. Algunos estudios sobre

aislados clínicos resistentes a penicilina, sugieren que son las PFP-1 y PFP-2 las

dianas preferentes a través de las cuales los ß-lactámicos ejercen su acción

bactericida.

Una cepa sudafricana con una CIM 1000 veces mayor que la correspondiente

a una cepa sensible, mostró numerosos cambios en sus PFPs siendo los principales

la pérdida de las PFPs- 1a, -1b y -2b (Handwerger y Tomasz, 1986) y la adquisición de una

nueva PFP-1c (Zighelboim y Tomasz, 1980), así como la reducción de la afinidad por la

bencilpenicilina de la PFP-2a.

Análisis de los perfiles de PFPs muestran una serie de cambios asociados

con un incremento de la resistencia como es el descenso de la afinidad de la PFP-

2a, pérdida de la PFP-2b, descenso de la afinidad seguido de pérdida de la PFP-1a

y PFP-1b, asociado con la aparición de la PFP-1c en las cepas con alta resistencia

(Tomasz, 1988). En todos estos microorganismos no se observaron cambios en la PFP-3.

Aquellos antibióticos que no se unen a la PFP-2b no producen lisis celular, lo

que podría indicar que la unión a dicha enzima es esencial para la actividad lítica de

los ß-lactámicos sobre el neumococo (Hakenbeck, 1986; 1988). Además esta proteína puede

realizar un papel crítico en la síntesis del peptidoglicano, ya que en presencia de


Introducción 56

penicilina, la cantidad de PFP-2b no saturado por penicilina está correlacionada con

la cantidad de peptidoglicano sintetizado.

Estos resultados sugieren que la mayoría de las PFPs en el neumococo

desarrollan funciones esenciales y son diana de los antibióticos ß-lactámicos.

El tratamiento de Streptococcus pneumoniae con concentraciones

subinhibitorias de numerosos ß-lactámicos producen la hinchazón de la bacteria,

aunque ello no ha podido relacionarse con la unión a determinada PFP (Williamson, 1981).

La acción no contrarrestada de la autolisinas cuando las PFPs son inhibidas

por los ß-lactámicos, también contribuyen a su efecto antibacteriano en el

neumococo.

7.2.2.3. - Autolisinas.

Los antibióticos ß-lactámicos traspasan la pared celular e interactúan con las

PFPs a las que se unen covalentemente. Queda la cuestión de qué manera la

inactivación de PFPs esenciales produce efectos irreversibles con muerte y lisis.

Una de las primeras observaciones sobre la acción antibacteriana de la

penicilina fue que sólo resultaba letal sobre

gérmenes en crecimiento. Con el

descubrimiento de que los antibióticos ß-

lactámicos inhibían la biosíntesis del

peptidoglicano, se pensó que los efectos

bactericidas de estos antibióticos eran

consecuencia del crecimiento

desbalanceado que sufrían al impedirse el

desarrollo de la pared celular. A las

autolisinas, enzimas capaces de hidrolizar

los puentes entre los glúcidos

(glicosidasas), o los péptidos (amidasas y

peptidasas) del peptidoglicano, se les consideraba con un importante papel en la

incorporación de nuevas unidades al polímero de la pared. Bajo la acción inhibidora

de los ß-lactámicos, que impide los enlaces cruzados, la autolisinas continuaban su

acción autolítica debilitando la pared, que se hacía incapaz de sostener la

Fig. 12: Lugares de acción de autolisinas. �-N-acetilglucosaminidasa, Transglicosilasa y �-N-acetilmuraminidasa, DD-endopeptidasa N-acetilmuramil-L-alanina amidasa, D,Dcarboxipeptidasa. (De Livermore, 1996)


Introducción 57

membrana celular ante la gran presión osmótica interna, la pared terminaba

dañándose y se producía la muerte del microorganismo.

La primera evidencia directa de la implicación de las autolisinas en la lisis

inducida por penicilina en las bacterias, se constató en una investigación realizada

en un S. pneumoniae mutante defectivo de la actividad N-acetilmuramil- L-alanina

amidasa. La cepa original no defectiva lisaba en el tratamiento con ß-lactámicos y

otros antibióticos inhibidores de la síntesis de la pared celular, mientras que la cepa

mutante amidasa-deficiente si bien su crecimiento era inhibido, no lisaba,

permaneciendo las células viables durante largo tiempo (son cepas de CIM normal y

CMB muy alta).

Iguales resultados se obtuvieron de cepas con producción de amidasa

disminuida; y de cepas con la pared celular modificada al reemplazar la colina por

etanolamina en el medio, que resultan insensibles a la acción de las autolisinas.

Ninguna de estas cepas tolerantes muestra disfunción en el crecimiento, por lo que

se creyó que estas enzimas no eran esenciales para la supervivencia o síntesis de la

pared celular, sin embargo se ha visto que en estas mutantes persiste una pequeña

cantidad crítica de dicha actividad.

A partir de estos y otros hallazgos se ha postulado por Tomasz y

colaboradores que las autolisinas están inhibidas por los ácidos lipoteicoicos y otras

sustancias anfipáticas de la membrana (Tomasz, 1988; Moreillon, 1988; 1990). Estos mismos

autores han postulado un modelo para explicar los mecanismos por los cuales los ß-

lactámicos producen lisis y muerte en las bacterias. En este modelo, las autolisinas

están naturalmente inhibidas por las sustancias antes mencionadas, por acción de

los ß-lactámicos se inhibe la síntesis de peptidoglicano lo que de alguna manera

hace que se liberen los inhibidores y la actividad enzimática autolítica se dispare. De

esta manera la acción bactericida de los ß-lactámicos se debe a factores

secundarios como es la hidrólisis del peptidoglicano por enzimas específicas que

directamente no tienen relación con los antibióticos.

Esto también explicaría las recientes observaciones de cepas mutantes

penicilina- tolerantes que contienen cantidades normales de autolisinas, el

crecimiento de estas cepas se inhibe por acción de la penicilina aunque las células

permanecen viables (Bryan, 1991). Por otro lado presentan un perfil de PFPs normal, por


Introducción 58

lo que se concluye que en estas cepas falla el paso que conecta la inhibición de las

PFPs con la liberación de la acción autolítica (Liu y Tomasz, 1985).

Por otro lado, se ha apreciado recientemente, cierta asociación entre la

resistencia a la penicilina y la deficiencia autolítica (Tomasz, 1988; Appelbaum, 1987). Estos

autores lo explican considerando que en el curso de un tratamiento antibiótico, las

bacterias se ven sometidas a picos de muy alta concentración, por encima de la

CIM, seguido de un período de aclaramiento del antibiótico a niveles por debajo de

la CIM durante el cual las células sobrevivientes pueden volver a crecer. Este

proceso repetido favorece la supervivencia de mutantes deficientes en autólisis, por

lo que existe una mayor probabilidad de que los mutantes penicilina-resistentes se

originen de dicha población.

7.2.2.4. - Tolerancia.

Algunas bacterias pueden sobrevivir en presencia de un antibiótico aunque se

encuentren inhibidas, y se les denomina tolerantes al antibiótico (Horne, 1981). Estas

bacterias, que en condiciones normales presentan crecimiento óptimo se definen

como genotípicamente tolerantes cuando la CMB (establecida como la

concentración mínima que mata el 99,9 % del inóculo) resulta 32 veces mayor que la

CIM (Allen, 1978; Brennan y Durack, 1983; Sherris, 1986; Betriu, 1994). Algunos trabajos sugieren la

alteración de las proteínas fijadoras de penicilina PFP, con relación a la tolerancia a

penicilina por los estreptococos (Asselt, 1995)

La tolerancia fenotípica es reconocida desde el principio de la era antibiótica

como una pérdida o reducción de la capacidad bactericida de un agente, bajo ciertas

condiciones restringidas de crecimiento bacteriano; siendo una muestra de ello la

pérdida de susceptibilidad a los ß-lactámicos por parte de las bacterias en

crecimiento estacionario sin que por ello cambie la CIM de la cepa. Sin embargo

existen algunos ß-lactámicos capaces de producir una reducción significativa de

viables en crecimiento estacionario, son los penems como imipenem, MT141 y CGP

14233.

A diferencia de la tolerancia de origen genotípico, la tolerancia fenotípica es

una propiedad virtual de todas las bacterias, y por ello, de mucha mayor incidencia

en la clínica (Brennan, 1982; Tuomanem, 1986; Cozens, 1987). Se acepta hoy día que en la mayoría

de las infecciones, la tasa de crecimiento bacteriano es mucho menor que las


Introducción 59

conseguidas en los cultivos de laboratorio, siendo común una tasa de crecimiento

reducida en las infecciones crónicas o en los últimos estadíos de los episodios

agudos.

Un ejemplo de ello se da en el curso del establecimiento de una infección

meníngea, la bacteria debe hacer una transición desde un medio rico como el suero

a otro relativamente pobre como el LCR. La concentración en los numerosos

aminoácidos y oligoelementos requeridos por el neumococo es relativamente baja

en el LCR. Tales deficiencias llevan a una fase de adaptación nutricional, que

presumiblemente conlleva al establecimiento de un período lag antes de la fase de

crecimiento exponencial. Se establece así una etapa en la que los microorganismos

muestran tolerancia fenotípica a los ß-lactámicos.

Análogamente, en las valoraciones in vitro, tiene gran influencia la tolerancia

fenotípica que puede conseguirse por factores variables del medio empleado como

son el pH (Horne, 1981), nutrientes (Mayhall y Apollo, 1980; Kim, 1979), oligoelementos, presión

osmótica y potencial redox en microorganismos exigentes como Streptococcus

pneumoniae.

7.2.2.5. - Cinética de la acción bactericida por ß-lactámicos

El número de microorganismos destruídos, después de la exposición al

antimicrobiano, se relaciona con la manera en que este destruye (dependiente de la

concentración vs independiente de la concentración). En el caso de antibióticos

bactericidas relativamente independientes de la concentración como los ß-

lactámicos, la tasa de destrucción que se genera a altas concentraciones es la

misma que a concentraciones a mitad de la curva o incluso por debajo, cerca de la

CIM. En consecuencia, el número total de microorganismos muertos por una dosis

del antimicrobiano, es la tasa de destrucción (casi constante) por el tiempo que las

concentraciones superan la CIM (o la CBM sí es muy diferente) (Soriano, 1992). Cuando

el éxito terapéutico guarda relación con la capacidad para erradicar el agente

infeccioso, entonces se obtiene un éxito creciente, hasta un valor máximo,

aumentando el tiempo en que la concentración del fármaco supera la CIM. Otros

autores (Tauber, 1984) encuentran más significativo el obtener picos ≥ 10 CIM.

En contados casos, la penicilina muestra contra estreptococos el denominado

efecto paradójico o efecto Eagle,, donde la tasa de muerte disminuye cuando la


Introducción 60

concentración supera ciertos límites. Aunque es conocido desde el principio del

estudio de los antibióticos, no se conoce su causa, siendo posibles explicaciones

que el balance de la inhibición de las distintas PFPs, sea menos favorable a la lisis

que a menores concentraciones; o que la liberación de autolisinas se favorezca a

bajas concentraciones del antibiótico, y se inhiba a concentraciones altas.

Los antimicrobianos cuya tasa de destrucción es muy dependiente de la

concentración, como las fluorquinolonas, la tasa de destrucción cambia con la

concentración (tiempo en el paciente), y el número total de microorganismos

muertos es una integral de la tasa de destrucción con respecto al tiempo. Los

fármacos de este tipo tiene un resultado terapéutico vinculado al área bajo la curva

(ABC), que es en sí misma, una integral de la concentración - tiempo.

7.2.2.6. - Criterio de resistencia.

La relevancia clínica de la resistencia intermedia en el tratamiento de

meningitis neumocócicas y la potencial importancia de la distinción entre resistencia

intermedia y la de alto nivel en el tratamiento de todas las infecciones neumocócicas,

hace que sea conveniente la subdivisión de las cepas resistentes a penicilina. Se

aplica el término de resistencia intermedia a aquellos neumococos con una CIM de

0,1 a 1.0 µg/mL ambos extremos inclusive, y el término de altamente resistentes a

aquellos con una CIM > 1 (≥ 2) µg/mL. Por contra se denomina cepas sensibles

aquellas con CIM < 0,1 (≤ 0,06) µg/mL (Klugman 1990; Jacobs, 1992; NCCLS, 1997).

7.2.2.7. - Prevalencia y distribución de neumococos resistentes a penicilina.

En 1943, la penicilina G a la concentración de 0,008 µg/mL era capaz de

matar los neumococos (Neu, 1994). La primera descripción de un neumococo resistente

a penicilina se hizo en 1967 refiriéndose una CIM del orden de 0.25 µg/mL, y por lo

general el término resistente se aplicaba en la literatura a aquellas cepas con CIM

mayor o igual a 0,1 µg/mL.

Desde entonces la distribución, de cepas moderada y altamente resistentes,

(CIM > 0,1 µg/mL) ha llegado a ser mundial (Appelbaum, 1987, 1991; Klugman, 1990, 1992; Koornhof,

1992; Geslin, 1991; Ridgway, 1992; Schutze, 1994; Goldstein, 1994; Hortal, 1994; Privitera, 1994; Reinert, 1995; Marchese,

1995; McCraken, 1995; Nissinen, 1995; Pradier, 1997). Zonas con mas del 10% de aislados resistentes

a penicilina han sido comunicados en Nueva Guinea, Israel, España, Polonia,


Introducción 61

Sudáfrica y Estados Unidos de América (Istre, 1987; Simberkoff, 1986), y continúan

comunicándose desde todas las partes del mundo.

Según una revisión del CDC en 1989, hasta un 20 % de los neumococos

aislados en los Estados Unidos son relativamente resistentes a penicilina con una

CIM > 0,1 µg/mL, y un 5 % son altamente resistentes con CIM superiores a 2 µg/mL

(Neu, 1994).

La prevalencia de cepas resistentes en aislados clínicos varía del 1 % al 60

%, habiéndose comunicado las tasas mas altas en Africa de Sur y en Cataluña

(Applebaum, 1987; Latorre, 1985). El uso de antibióticos orales pudiera estar correlacionado con

la colonización por cepas resistentes de neumococo (Pallarés, 1987; Chadwick, 1993; Gómez, 1994;

Nava, 1994; Negri, 1994; Frimodt-Moller, 1997; Castillo, 1998).

En el brote de Africa de Sur en 1977 se demostraron cepas no solo

resistentes a penicilina (CIM 0,12 - 4 µg/mL), sino también a tetraciclinas (CIM 16 -

64 µg/mL), cloramfenicol (CIM 16 - 32 µg/mL), eritromicina (CIM 32 - 64 µg/mL) y

clindamicina (CIM 64 - 128 µg/mL). Muchas de estas cepas resultaron resistentes a

la rifampicina después del uso profiláctico de esta. Todos los aislados de neumococo

fueron sensibles a la vancomicina que se usó pues, para la erradicación de

portadores de cepas multirresistentes (Appelbaum, 1987).

En Europa, España constituyó un posible foco de cepas resistentes dado el

número de aislamientos tanto en portadores como en enfermos. Sin embargo en

1989 se ha comunicado desde Hungría un porcentaje de aislados resistentes mayor

al 50 %. Esta alta prevalencia de la resistencia a penicilina se atribuye al bajo coste

y fácil accesibilidad a los antibióticos en estos países. La resistencia a penicilina

parece mantenerse a bajo nivel en el resto de Europa.

Según los datos del Laboratorio de Referencia de Neumococos del Centro

Nacional de Microbiología de Majadahonda, Madrid, los porcentajes de resistencia a

los antimicrobianos de 9.243 cepas de Streptococcus pneumoniae aisladas en el

período 1990 - 96 fueron los siguientes: penicilina 49%, cefotaxima 21,7%,

eritromicina 22,5%, tetraciclina 43,4% (Fenoll, 1998).

7.2.2.8. - Resistencia múltiple.

La resistencia contra al menos tres clases distintas de antibióticos es

denominada resistencia múltiple. El seguimiento de los primeros casos en Sudáfrica

de cepas multirresistentes sugirió su origen en España (cepa serotipo 23F) (Lefévre,


Introducción 62

1995 Marchese, 1998), en ambos casos la epidemiología fue inicialmente similar, por la

asociación encontrada en niños hospitalizados con tratamiento antibiótico. Pero

posteriores estudios bioquímicos, genéticos y epidemiológicos indican que las cepas

resistentes a penicilina tiene múltiples orígenes (Jabes, 1989; Muñoz, 1992; 1992b; Sibold, 1992;

Swiatlo, 1996; Maskell, 1997), y su difusión es mundial (Jacobs, 1979; Zighelboim, 1980; Landesman, 1981b; Liu,

1985; Klugman, 1990; McDouglas, 1992; Reichler, 1992; Leggiadro, 1993; 1994; Reichler, 1992; Lister 1995; Mason, 1992;

1993; 1995; 1995b; Welby, 1994; Doern, 1996).

Los procesos debidos a neumococos resistentes son especialmente un

problema en España (Casal, 1982; García Leoni y Bouza, 1988; 1992; Asensi, 1989; Ramos, 1998), donde el

73% de las cepas penicilina resistente lo son también a tres o más antibióticos no ß-

lactámicos, mientras que la tasa es del 11% en las cepas sensibles a penicilina

(Liñares, 1992).

Se ha empleado la rifampicina para profilaxis de portadores nasofaríngeos de

cepas resistentes a penicilina, con los inconvenientes de reaparición de la misma

cepa después de semanas, y la presentación de cepas resistentes a rifampicina

(Ekdahl. 1997; García-Arenzana, 1994).

No han sido descritas cepas de neumococos resistentes a vancomicina o

teicoplanina (Klugman, 1990).

La resistencia a penicilina conlleva una disminución de la sensibilidad a ß-

lactámicos de otras clases como cefemas o penemas (Ward, 1981; Spangler, 1994-1997; Pikis,

1997). (Tabla 4)

Tabla 4: Susceptibilidad in vitro a ß-lactámicos

de cepas sensibles y resistentes a penicilina

MIC90 (µg/mL) para los grupos de sensibilidad a penicilinaAntimicrobiano

Sensible Intermedia Resistente

Penicilina 0,015 - 0,06 0,5 - 1,0 4 - 16

Ceftriaxona 0,01 - 0,06 0,5 1 -2

Cefotaxima 0,01 - 0,12 0,25 - 1,0 1 -4

Imipenem ≤0,015 0,06 - 1,0 0,125 - 2,0

Meropenem 0,01 - 0,03 0,125 - 0,5 0,5 - 1,0

Tomado de Lister, 1995 modificado


Introducción 63

Tabla 5: Resistencia de neumococos a antimicrobianos no ß-lactámicos en

España.

Antimicrobiano Punto

de corte(µg/mL)

Período

Estudiado

Resistencia

(%)

Origen Referencia

Eritromicina >0,5 1991-95 35,3 Andalucía García-Martos, 1997

>0,25 1979-96 21,7 Nacional Fenoll, 1998

>0,5 1980-91 9,1 Guipúzcoa García-Arenzana, 1991

>0,5 1996-97 28,4 Cataluña Liñares, 1998

>0,25 1997 22,6 Levante García de Lomas, 1997

Cloramfenicol >4,0 1979-96 22,5 Nacional Fenoll, 1998


Cotrimoxazol >2/38 1991-95 65,5 Andalucía García-Martos, 1997

>2/38 1996-97 49,6 Cataluña Liñares, 1998

>2/38 1997 83,0 Levante García de Lomas, 1997

Tetraciclinas >2,0 1979-96 30,9 Nacional Fenoll, 1998

>2,0 1991-95 33,7 Andalucía García-Martos, 1997


Ciprofloxacino >1,0 1994 18,0 Madrid Baquero, 1994


Esparfloxacino >1,0 1996 1,2 Madrid Baquero, 1996


Ofloxacino >4,0 1996-97 2,1 Cataluña Liñares, 1998

Trovafloxacino >2,0 1996-97 0,6 Cataluña Liñares, 1998

Vancomicina >1,0 1979-96 0 Nacional Fenoll, 1998

>1,0 1991-95 0 Andalucía García-Martos, 1997

>1,0 1996-97 0 Cataluña Liñares, 1998

Cepas sensibles y resistentes a penicilina. Criterio de resistencia


Introducción 64

Fig. 13: Estructura de la Ceftriaxona sódica

7.3. - Cefemas: Ceftriaxona

Las cefemas (cefalosporinas y cefamicinas) son antibióticos semisintéticos de

estructura ß-lactámica, con actividad primariamente bactericida, de amplio espectro

(Neu, 1984), que actúan sobre las bacterias

sensibles inhibiendo la síntesis de la pared

celular.

El descubrimiento de actividad

antibiótica en los caldos de cultivo del hongo

Cephalosporium (actualmente Acremonium

crysogenum) aislado por Brotzu en aguas residuales de Cagliari (Cerdeña), y los

posteriores trabajos de Florey, Burton y Abraham produjeron el aislamiento de una

serie de moléculas entra las que se encuentra la cefalosporina C que poseía un

amplio espectro de actividad antibacteriana y resistía la acción de la penicilinasa

estafilocócica. De esta cefalosporia C derivan las penicilinas semisintéticas.

La molécula de la cefalosporina C se compone de un núcleo ß-lactámico

denominado ácido 7-aminocefalosporánico o cefem, una cadena lateral acetilo, y la

otra, un residuo aminoacetilo. Para la actividad antibacteriana se requiere de la

integridad estructural del núcleo y de la sustitución en determinados sitios de la

molécula (Cleeland, 1984)

7.3.1. - Farmacología.

La difusión tisular y humoral de las cefemas es buena, pudiendo lograrse

niveles terapéuticos en tejidos y líquidos orgánicos como pulmón, riñón e hígado,

líquido pleural, sinovial, pericárdico y ascítico (Finch, 1987; Patel, 1991). Si bien, en general

difunden mal al SNC (Nau, 1993), pueden conseguirse niveles terapéuticos en LCR de

sujetos con meninges inflamadas (Schaad, 1981; del Río, 1982; Jones, 1987; 1992; Holt, 1990; Ellmen, 1991;

Sakata, 1994; Cabellos, 1995b; Doit, 1997; Friedland, 1997; Lutsar, 1997)

Las cefalosporinas, como las penicilinas y en contraste con las quinolonas, no

muestran una destrucción de células dependiente de la concentración. Su efecto

bactericida alcanza un máximo con 4-5 veces la CIM (Karchmer, 1995) y existe un EPA

relativamente corto para los estreptococos. Estas consideraciones sugieren que es

el período de tiempo que los niveles de una cefalosporina permanecen por encima

de la CIM del patógeno, el parámetro farmacológico más importante. Un breve


Introducción 65

período de pico alto, seguido de un tiempo considerable por debajo de la CIM, no es

conveniente (Craig, 1977). Los estudios en modelos animales, así como los que

correlacionan observaciones farmacocinéticas, microbiológicas y clínicas en seres

humanos avalan este concepto (Frimodt, 1986; Schentag, 1991; Vogelman, 1985b; Holt, 1992; Caballero,

1996). El tratamiento por infusión continua, los intervalos más cortos entre las dosis y

las estrategias para retrasar la excrección, contribuyen a la adecuada administración

de las cefalosporinas de vida media corta. Con pocas excepciones las

cefalosporinas alcanzan una excelente penetración en los tejidos y en los

compartimentos líquidos como el pulmón (Adu, 1995)

Ceftriaxona en dosis de 2 g/12 hr presenta un pico sérico de 250 µg/mL, una

vida media de 8 horas, una fijación a proteínas plasmáticas del orden de 83-96%,

una excrección renal del 50% y biliar del 40%, alcanzando en LCR niveles de 1,2 -

39 µg/mL (Karchmer, 1995). En consecuencia la mayoría de las infecciones serias pueden

tratarse con menos dosis diarias, por ejemplo meningitis en adultos con 1-2 g/12 hr o

en niños 50-100 mg/kg/día (del Río, 1982; Schaad, 1990), siempre que la prevalencia de

neumococos resistentes (CIM ≥ 2 µg/mL) en el área no sea alta (Cabellos, 1995; Mensa, 1998).

Sin embargo la ceftriaxona a pesar de la comodidad de su administración cada 24

horas, tiene un límite de dosis total diaria de 4 g y no estaría recomendada su

utilización en solitario contra cepas altamente resistentes a cefalosporinas (Viladrich,

1994).

7.3.2. - Mecanismo de acción.

El mecanismo de acción de las cefemas es similar a la de las penicilinas:

inhiben la síntesis de la pared bacteriana de células sensibles en crecimiento, por

inhibición de las enzimas transpeptidasas y carbopeptidasas encargadas de la

formación de los puentes que unen las cadenas lineales del peptidoglicano. Las

enzimas inhibidas, que reconocen como substratos competitivos a penicilinas,

cefalosporinas y cefamicinas, son las denominadas proteínas fijadoras de penicilina

o PFPs (ver sección 7.2.2.2. - Proteínas fijadoras de penicilina (PFPs o PBPs).

En última instancia, la actividad antineumocócica de las cefemas depende de

la accesibilidad a las PFPs, y a la afinidad y especificidad por las distintas PFPs (Ikeda,

1995). La actividad in vitro contra S. pneumoniae de cefotaxima y ceftriaxona (Pankuch,

1994; 1995), es esencialmente idéntica contra cepas sensibles o con resistencia

intermedia a penicilina (Barry, 1995; 1995b; 1996).


Introducción 66

7.3.3. - Resistencia.

La menor afinidad de las PFPs por los antibióticos ß-lactámicos, es el

mecanismo por el que algunas cepas de Streptococcus pneumoniae han disminuído

su sensibilidad a cefalosporinas como la ceftriaxona (Figueiredo, 1992; Karchmer, 1995; McDouglas,

1995). Concretamente se debe en algunos casos a la producción de PFPs alteradas:

PFP2x (Sifaoui, 1996; Zhao, 1997) y PFP1a (Smith, 1998); y estas pueden ser transferidas a

cepas sensibles en un solo paso de transformación (Muñoz, 1992).

Las cefemas y carbapenemas a menudo permanecen activas contra cepas de

neumococos y otros patógenos con PFPs alteradas, aunque presentan CIM más

altas que las cepas sensibles. Sin embargo es preocupante el hecho de que basta la

alteración de dos PFPs (1a y 2x) para obtener cepas resistentes a cefotaxima y

ceftriaxona (CIM ≥ 2 µg/mL); mientras que la resistencia de nivel alto a penicilina

requiere de al menos 4 PFPs modificadas (1a, 2a, 2b y 2x). Este hecho implica que

la futura evolución de la resistencia a cefalosporinas puede ser rápida. Existen

publicaciones de que la resistencia a cefotaxima y ceftriaxona puede ser superior

(CIM > 16 µg/mL), que la resistencia a penicilina (Coffey, 1995).

7.4. - Carbapenemas: Imipenem.

El imipenem o imipenema, N-formimidoiltienamicina es un antibiótico

semisintético, de estructura β-lactámica carbapenémica, con actividad primariamente

bactericida, de amplio espectro, que actúa inhibiendo la síntesis de la pared celular.

Ha sido el primero de los carbapenem en ser introducido en terapéutica. Deriva de la

tienamicina, metabolito elaborado por el Streptomyces cattleya, que presenta una

gran inestabilidad físico-química, incoveniente resuelto con la obtención de

derivados semisintéticos como el N-formimidoiltienamicina.

Los carbapenémicos se diferencian de otros ß-lactámicos por el reemplazo

del átomo de azufre, que contienen en su anillo principal α las penicilinas y

Fig. 14: Estructura del Imipenem


Introducción 67

cefalosporinas, por un grupo metileno. Esta sustitución le confiere al imipenem una

mayor reactividad con las proteínas de la pared celular, y por tanto, un efecto

bactericida más potente. Además difiere de los ß-lactámicos convencionales en el

carácter y configuración de su cadena lateral: éstos poseen una cadena lateral

acilamino en configuración cis, mientras que imipenem posee una cadena lateral

hidroxietil en configuración trans. Esta configuración trans es la responsable de la

estabilidad del imipenem ante las ß-lactamasas.


El imipenem no es estable en medio ácido y no se puede administrar

oralmente. Se excreta por filtración glomerular y secreción (Kesado, 1980; Buckley, 1992). A

diferencia del meropenem (Dreetz, 1996), es hidrolizado en gran parte por la peptidasa

renal dihidropeptidasa-1, localizada en los cepillos de los túbulos renales proximales.

Para impedir esta metabolización se sintetizaron inhibidores específicos que

presentaran mayor afinidad por el enzima que el imipenem, seleccionándose la

cilastatina. Esta se admistra en igual dosis que imipenem (Tegeder, 1997), no presenta

actividad antimicrobiana ni interfiere la del imipenem. En ausencia de cilastatina el

imipenem es nefrotóxico.

Después de 20-25 minutos de infusión de 250 mg de imipenem (más

cilastatina), se observan picos séricos de 13 µg/mL, con 500 mg el pico es de 33

µg/mL, y con 1.000 mg el pico es de 52 µg/mL.

El imipenem se distribuye ampliamente por los diversos compartimientos

corporales. Su secreción biliar es mínima, y también lo es el cambio de la flora

intestinal. Se han registrado en LCR niveles de 1-5 µg/mL en presencia de

inflamación meníngea.

Las convulsiones, que constituyen el efecto tóxico más serio, son poco

comunes (0,4-1,5 %) y afecta en la mayoría de los casos a pacientes con patología

subyacente del SNC e individuos con función renal disminuída a los que no se ha

ajustado la dosis (Chamber, 1995; Garau, 1997).


El mecanismo de acción es semejante al de otros ß-lactámicos interfiriendo la

síntesis de la pared celular El imipenem se combina con alta afinidad con las PFPs


Introducción 68

de alto peso molecular, especialmente la PFP2 y algo menos con la PFP1a; lo que

rápidamente provoca muerte y lisis celular (Chamber, 1995).

Además provoca un efecto post-antibiótico significativo.


Al igual que en cefalosporinas, se ha observado un descenso de sensibilidad

a imipenem en cepas de neumococos resistentes a penicilina (Tabla 4:

Susceptibilidad in vitro a ß-lactámicos de cepas sensibles y resistentes a penicilina)

Se ha descrito resistencia a imipenem en Pseudomonas aeruginosa, por alteración

de su principal diana, la PFP2, y ello es probablemente la causa de la resistencia en

Enterococcus faecium (Dámaso, 1990; Livingstone, 1995).

7.5. - Glucopéptidos: Vancomicina.

Los glucopéptidos son un grupo de antibióticos de espectro reducido, formado

por dos únicos componentes: vancomicina y teicoplanina. La vancomicina se obtuvo

en 1956 a partir de cultivos de Streptomyces orientalis (actualmente Amycolatopsis

orientalis). Posee una estructura química compleja, no relacionada con ningún otro

grupo de antimicrobianos. La estructura central es un heptapéptido con siete

residuos de aminoácido de los que cinco son aromáticos y comunes de los

glucopéptidos. La teicoplanina difiere en las posiciones 1 y 3, y en algunos

sustituyentes de los anillos aromáticos. En vancomicina, el heptapéptido se

encuentra unido a un disacárido, formado por la unión de una molécula de glucosa

con el aminoazúcar vancosamina. En teicoplanina, la presencia de cadenas

laterales, portadoras de ácidos grasos, confieren a esta molécula un carácter

lipofílico entre 50 - 100 veces mayor que vancomicina,

lo que determina en gran medida su farmacología

(Chambers, 1990; Greemberg, 1990; Kaatz, 1990; Wood, 1996; Sábada, 1998).


Ningún glucopéptido se absorbe oralmente, por

que su administración es parenteral. Los valores de

concentración máxima y área bajo la curva (ABC)

después de la administración IV, indican que estos

fármacos siguen una cinética lineal, es decir que estos parámetros aumentan con la

Fig. 15: Estructura de la

Vancomicina


Introducción 69

dosis. La cinética de vancomicina se ha descrito como un modelo tricompartimental

en el que se da una primera fase de distribución rápida, seguida de otra más lenta y

una tercera de eliminación.

Los glucopéptidos penetran mal en LCR, salvo que exista inflamación

meníngea, y en estos casos tampoco puede que se consigan concentraciones

elevadas, siendo en ocasiones necesaria su administración intratecal (Pfausler, 1997).

Aunque la administración simultánea de antiinflamatorios como la dexametasona

puede reducir la penetración de vancomicina al SNC (Paris, 1994; 1995b), existen datos de

que se mantienen concentraciones efectivas.

La vancomicina se une poco a proteínas plasmáticas (30 - 60%), mientras que

teicoplanina lo hace en un 90%. El grado de unión es independiente de la dosis, es

decir, la fracción no unida permanece constante, no se produce saturación. La

eliminación es fundamentalmente renal, por filtración glomerular pasiva,

recogiéndose en orina un 80 - 90% de la dosis en las primeras 24 horas. Sufre algún

metabolismo hepático (<10%) siendo su vida media de 3 - 9 horas. Desde un inicio

se ha relacionado la eficacia y la toxicidad de vancomicina con las concentraciones

plasmáticas (Cobo, 1996). Así, la eficacia depende de mantener la concentración por

encima de la CIM90 durante el intervalo de administración, con valores de 8 veces la

CIM90 en el pico máximo, y al menos, dos veces en la concentración mínima (Ackerman,

1992; James, 1996).


La vancomicina es un fármaco bactericida frente a cocos y ciertos bacilos

grampositivos, al inhibir la síntesis de la pared celular bacteriana. Los glucopéptidos

se unen a las dos D-alaninas terminales del pentapéptido, formando un complejo

intermediario de carácter lipídico que inhibe la acción de la transglicolasa, enzima

que facilita la unión del disacárido-pentapéptido a la cadena de peptidoglicano

preexistente. También inhiben las transpeptidasas, enzimas encargadas de unir

entre sí o entrecruzar las diferentes cadenas de polisacáridos para formar la pared

celular, también bloquean la liberación del fosfolípido encargado de transportar las

unidades básicas a través de la ‘membrana de la bacteria, de forma que se

acumulan en el citoplasma y no acceden al exterior que es donde se realiza la

transpeptidación o polimerización de la pared. Como consecuencia de estos efectos

se impide el ensamblaje del nuevo péptidoglicano a la pared preexistente, se inhibe


Introducción 70

la formación de la pared celular y además, el efecto continuo de las autolisinas

bacterianas consigue la muerte celular. En cualquier caso, esta muerte es más lenta

que la que producen los antibióticos ß-lactámicos.


No se ha descrito ningún Streptococcus pneumoniae resistente a

vancomicina. Las resistencias bacterianas a los glucopéptidos se producen como

consecuencia de la síntesis de proteínas de membrana incapaces de unirse a estos

antibióticos, impidiendo la acción inhibitoria de la síntesis de la pared celular.

Se han descrito tres tipos de resistencia: La resistencia de tipo A (Van A)

es de alto grado, es decir, las bacterias resistentes presentan CIM90 superiores a

256 µg/mL. Es una resistencia autoinducible, plasmídica y transferible, y codifica tres

nuevas enzimas que sintetizan precursores del peptidoglicano diferentes, impidiendo

su unión a los glucopéptidos. Aparece fundamentalmente en Enterococcus faecium

y, en menor medida, en E. faecalis, E. durans y E. avium (Patel, 1998) Produce

resistencia cruzada entre ambos glucopéptidos. La resistencia de tipo B (Van B),

de bajo grado (CIM90 = 16-32 µg/mL), es cromosómica y no transferible, y codifica

dos proteínas. Es inducible, y suele afectar únicamente a vancomicina, por lo que las

bacterias permanecen sensibles a teicoplanina (CIM90 = 0,51 µg/mL). Se ha

observado sobre todo en E. faecium. La resistencia de tipo C (Van C), de bajo

grado es cromosómica, no transferible y con poca repercusión clínica. Se ha

observado E. gallinarum y E. casseliflavus. También en este caso los

microorganismos permanecen sensibles a teicoplanina.

7.6. - Fosfomicina.

La fosfomicina es un antibiótico natural de

estructura epoxídica, con actividad

predominantemente bactericida al inhibir la síntesis

de la pared celular. Fue aislada en 1966 de una

cepa de Streptomyces fradiae procedente de un

suelo de Alicante, y posteriormente, de otras cepas

de Streptomyces. Actualmente se produce por síntesis química obteniéndose un

producto puro. La sal sódica se emplea parenteralmente, y la sal cálcica por vía oral.

PO3H2

C C

H3C

O

H H

Fig. 16: Estructura de la Fosfomicina


Introducción 71


La fosfomicina en las formas de administración oral, como sal cálcica o

trometamol, resulta ácido lábil y su biodisponibilidad es incompleta (Patel, 1997). Por vía

intramuscular (fosfomicina disódica), tiene una absorción completa y rápida,

obteniéndose niveles séricos de 3 a 5 veces superiores a la vía oral. Por vía

intravenosa los niveles sanguíneos son casi el doble que los obtenidos por inyección

intramuscular, alcanzándose la concentración máxima a los 15 minutos. Infusiones

intravenosas continuas de 500 y 650 mg/hr producen unos niveles constantes de 60

y 80 µg/mL, infusiones de 4 g/ 6 horas proporcionan concentraciones de 195 µg/mL

después de la primera dosis, y 253 µg/mL tras la segunda, dosificaciones repetidas

producen efectos acumulativos (Patel, 1997).

Debido al pequeño tamaño (peso molecular 138,1 g/mol), la fosfomicina

difunde bién tisular y humoralmente, penetrando bién en el SNC (Sicilia, 1981; Dámaso. 1990).

La hemivida de la fosfomicina es de 1,5 - 2 horas, no se conjuga con las proteínas

plasmáticas y no metaboliza.

La fosfomicina por vía parenteral, se elimina preferentemente (89 - 90% de la

dosis) mediante filtración glomerular, en forma activa sin metabolizar. Presenta una

recirculación enterohepática. Por vía oral una fracción se elimina en las heces.


La fosfomicina actúa de forma bactericida mediante un efecto neto inhibidor

de la síntesis de la pared celular. Su acción se ejerce en la primera etapa de la

biosínteis del péptidoglicano, al competir estructuralmente con el fosfoenolpiruvato,

por la enzima N-acetilglucosamina-3-O-enolpiruviltransferasa. Esta enzima es

responsable de la incorporación del fosfoenolpiruvato a la uridindifosfo-N-

acetilglucosamina para originar el ácido uridindifosfo-N-acetilmurámico.

Penetra en la célula bacteriana transportada por las mismas permeasas que

normalmente permiten el paso del L-alfa-glicerofosfato y la D-glucosa-6-fosfato.

La fosfomicina es un antibiótico bactericida, con una buena actividad in vitro

contra cocos gram positivos, incluídas cepas resistentes a penicilina de

Streptococcus pneumoniae. Además, por su bajo peso molecular y escasa unión a

proteínas plasmáticas, consigue una penetración adecuada en los tejidos infectados,

incluído el líquido cefalorraquídeo de pacientes con meningitis.


Introducción 72

Numerosos investigadores han publicado una sinergia in vitro e in vivo entre

antibióticos ß-lactámicos y fosfomicina (Eliopoulos, 1986), contra dichos neumococos (Nau,

1995; Barakett, 1993; Chavanet, 1995; 1996)

Su uso como único antibiótico contra S. pneumoniae, conlleva un riesgo

significativo de seleccionar mutantes resistentes.

La combinación de fosfomicina con una cefalosporina de tercera generación,

se ha mostrado más eficaz contra neumococos resistentes a penicilina que la

combinación con rifampicina.


En casi todas las poblaciones bacterianas existen mutantes espontáneos

resistentes a fosfomicina en un solo escalón con una frecuencia alta (104 - 105), que

se ponen de manifiesto en forma de colonias más o menos numerosas, según el

tamaño del inóculo, en los halos de inhibición. Esta resistencia es debida a la

incapacidad de penetración del antibiótico dentro de la célula, al carecer de los

sistemas de transporte del L-alfa-glicerolfosfato y la D-glucosa fosfato. Estas cepas,

mutantes defectivos, presentan una disminución o pérdida de virulencia en

infecciones experimentales.

Además existe una resistencia adquirida, posiblemente localizada en el

cromosoma, en virtud de la cual cepas sensibles a fosfomicina, adquieren en uno o

varios pasos, niveles de resistencia 16 a 256 veces mayores. Estas cepas, aisladas

de recaídas o fracasos terapéuticos, no se trata de mutantes defectivas y mantienen

su virulencia (Dámaso D., 1974).

7.7. - Quinolonas. Esparfloxacino.

Las quinolonas están relacionadas con el

ácido nalidíxico, fármaco sintetizado a partir de la

cloroquina en 1962. Desde entonces se ha

desarrollado ampliamente este grupo terapéutico.

Dos acontecimientos consistentes en la

incorporación en la estructura química básica de

un átomo de flúor en posición 6- (flumequino), y

un anillo piperacinico en posición 7- (ácido pipemídico), logró mejorar la actividad

antimicrobiana y los parámetros farmacocinéticos (Gerding, 1989). Esto dio origen a una

Fig. 17: Estructura del Esparfloxacino


Introducción 73

búsqueda de la relación entre estructura y actividad, con la que se avanzó en el

diseño de las nuevas moléculas. El éxito fue notable hasta lograr patentar miles de

substancias diferentes en poco espacio de tiempo (Paton, 1988; Tanaka, 1993; Clement, 1994).

Las quinolonas tienen como núcleo común la estructura 4-oxo-1,4-

dihidroquinoleína. El nitrógeno en posición 1 y el grupo carboxílado en posición 3

son indispensables para la actividad antibacteriana. Las fluoroquinolonas poseen un

átomo de flúor en posición 6 y un anillo piperacina (norfloxacino, ciprofloxacino,

enoxacino y esparfloxacino) o metilpiperacina (ofloxacino, pefloxacino, amifloxacino)

en posicion 7. Se diferencian entre sí por el radical en la posición N-1 del núcleo

principal y por el radical unido al grupo piperacina.

Se han propuesto varias clasificaciones de las quinolonas: generaciones en

función de su aparición en el mercado, o de forma más práctica en grupos según la

indicación clínica.

Tabla 6: Clasificación de las fluorquinolonas

Clasificación de la quinolonas fluoradas

Grupo I: Fluorquinolonas orales con indicación esencial limitada a infecciones del tracto urinario.

Presentan una hemivida prolongada (10 - 12 horas) y concentraciones urinarias altas

Norfloxacino

Pefloxacino

Grupo II: Fluorquinolonas de utilización sistémica con amplias indicaciones.

Con buena actividad contra bacilos gramnegativos, pero limitada contra cocos grampositivos

incluyendo neumococos.

Fleroxacino

Ofloxacino

Ciprofloxacino

Grupo III: Fluorquinolonas con actividad mejorada frente a grampositivos y patógenos atípicos.

La hemivida es superior a la del grupo anterior salvo fleroxacino. Especialmente indicadas en

neumonía neumocócicas y atípicas.

Levofloxacino

Esparfloxacino

Grepafloxacino

Grupo IV: Fluorquinolonas con actividad mejorada frente a grampositivos, patógenos atípicos y

anaerobios. Mejoran la actividad, espectro y farmacocinética de los anteriores grupos de indicación

sistémica.

Gatifloxacino

Trovafloxacino

Moxifloxacino

Clinafloxacino

Tomado de Gomis et al. 1998, modificado

Las CMI de ciprofloxacino y ofloxacino frente a los aislamientos de S.

pneumoniae, están muy próximas a los niveles máximos alcanzados en suero por


Introducción 74

dichos antimicrobianos (límite terapéutico), siendo inadecuados para el tratamiento

antineumocócico, especialmente de infecciones graves que precisen una rápida

eliminación del patógeno.

El esparfloxacino presenta un amplio espectro (Brueggemann, 1997; Wakabayashi, 1994)

que incluye al S. pneumoniae (Neu, 1992; Fuchs, 1993; 1996; Pankuch, 1994; 1996; 1998; Hoogkamp, 1997;

Richard, 1998), microorganismo que resulta mucho menos sensible a las primeras

quinolonas. El sustituyente amina en la posición 5 del núcleo quinolónico, diferencia

al esparfloxacino de las otras quinolonas, y contribuye a su actividad contra cocos

grampositivos. El grupo carboxilo en posición 3 y la cetona en la 4 son los lugares de

unión al ADN y a la girasa ADN. El flúor en posicion 6 aumenta la capacidad de

penetración al interior de la bacteria y mejora la afinidad por la girasa. Tambíen se

ha relacionado alguno de estos radicales con diferencias farmacocíneticas; así, las

quinolonas con un grupo metilpiperacina en posicion 7 o las que poseen un núcleo

naftiridona poseen vidas medias de eliminacion mas prolongadas. El anillo

piperacina en posicion 7 es el principal lugar de metabolismo del fármaco.

La neurotoxicidad se ha relacionado con el anillo piperacina sin ningún

sustituyente en posicion 7 del núcleo principal (ciprofloxacino, enoxacino,

norfloxacino) (Davey, 1994) y la fototoxicidad, fundamentalmente con el halógeno situado

en posición 8 (esparfloxacino) (Sábada, 1998)


Esparfloxacino penetra bien en los tejidos, presentando un volumen aparente

de distribución alto (3,6 L/Kg) (Goa, 1997; Zix, 1997). Como otras quinolonas (Sorgel, 1989),

alcanza concentraciones elevadas en tejidos, y a nivel intracelular, atraviesa bien las

barreras, sobre todo si están inflamadas (meninges, placenta, próstata). Los picos

de concentración conseguidos en tejido broncopulmonar, macrófagos alveolares y

esputo, suelen superar la CIM de los patógenos más usuales (Entenza, 1994), incluido el

S. pneumoniae (Trautmann, 1996). Las concentraciones observadas en el líquido

cefalorraquídeo, en la grasa o en el ojo son la mitad que las obtenidas en plasma,

aunque en el caso de esparfloxacino pueden resultar activas. En cambio en piel,

músculo, saliva, mucosas, pulmón, corazón, riñón o liquido sinovial las

concentraciones generalmente exceden a la plasmática (Douidar, 1989; Schaad, 1994). Por


Introducción 75

esto se define la farmacocinética de las quinolonas con un modelo tricompartimental

(Borner, 1986), donde se considera la presencia de un compartimento profundo.

Se une un 40% a proteínas plasmáticas, posee una larga vida media de 15 a

20 horas y en parte se excreta por mecanismos no renales pero su eliminación se

consigue principalmente por metabolización hepática en derivados inactivos.

La cinética de este fármaco es lineal, de forma que tanto la concentración

máxima como el área bajo la curva de niveles plasmáticos en el tiempo aumentan

proporcionalmente con la dosis.

La incidencia de efectos adversos durante la realización de ensayos clínicos

es similar para el grupo de las fluorquinolonas (Frías Iniesta, 1999), siendo la tasa de

abandonos por eventos adversos del 6,6% de 1585 pacientes que recibieron

esparfloxacino y del 5% de 6000 pacientes que recibieron trovafloxacino. La

reacción de fototoxicidad con quinolonas era predecible, pues ya se había descrito

con el ácido nalidíxico. Es un fenómeno relacionado con la dosis, mejora e un mes y

se previene o reduce evitando los rayos UVA. En Francia y Japón detectaron una

alta toxicidad con esparfloxacino, requiriendo hospitalización el 10 al 15% de los

casos (Ball, 1995).


Penetra en el interior de la bacteria por las porinas, canales acuosos de la

membrana externa, probablemente mediante un transportador de membrana.

Parece que las quinolonas afectan los enlaces entre los lipopolisacandos de

membrana, aumentando la permeabilidad de la pared celular bacteriana.

La actividad de las fluorquinolonas se debe principalmente a que interfieren la

actividad de dos enzimas necesarias para la replicación del ADN bacteriano: ADN-

girasa y topoisomerasa IV. Ambas son tetrámeros, la primera consta de dos

subunidades A y dos B, la segunda de dos subunidades C y dos E. La girasa

humana consta de un monómero A y otro B, y por tanto, no es substrato de la acción

de estos antimicrobianos.

La topoisomerasa IV, responsable de la separación de las cadenas de ADN

durante la división celular, es la diana principal en estreptococos, mientras que en

microorganismos gramnegativos sólo sería un objetivo secundario.


Introducción 76

La ADN girasa, es la enzima encargada de producir tanto el

superenrollamiento de las dos hélices del ADN como su separación y la ruptura de

enlaces, para permitir diferentes funciones (replicación del ADN, transcripción a

ARN). La quinolona se une al sitio especifico del ADN donde debía unirse la

subunidad A y a la propia girasa, formando un complejo ternario que interfiere de

forma directa su acción reparadora final del proceso de superenrollamíento.

Además, parece que la existencia de este complejo bloquea la transcripción

del ARN por las polimerasas. Al impedir la reparación del ADN, y por tanto el

superenrollamiento, el ADN pierde su estructura, y no tiene espacio suficiente en el

interior de la bacteria. Ésta pierde su aspecto inicial, adquiriendo una forma

filamentosa. Posteriormente sufre la acción de las autolisinas propias,

produciéndose el efecto bactericida.

Este mecanismo de acción no explica, por sí solo, el efecto bactericida de las

quinolonas y, por tanto, hay que pensar en otros posibles efectos. De hecho, se han

observado indicios de como la liberación de polisacáridos de membrana conduce a

un aumento de la permeabilidad y a una mayor sensibilidad frente a otros factores

antiinfecciosos, alteraciones en la síntesis de ARN y de proteínas, producción de

exonucleasas, que provocarían la degradación del ADN cromosómico y cambios en

la superficie celular bacteriana tras la exposición a las quinolonas. Incluso a

concentraciones elevadas, mucho más altas que la concentración inhibitoria mínima

(CIM), hay evidencia de alteraciones significativas del péptidoglicano.

En principio, todas las quinolonas presentan el mismo mecanismo de acción,

con efecto bactericida sobre microorganismos en reproducción, es decir, con síntesis

de ARN y de proteínas y división celular (mecanismo A). Algunas quinolonas

pueden, además, continuar siendo bactericidas frente a algunos microorganismos

que no se encuentran en fase de multiplicación, ni sintetizando ARN o proteínas

(mecanismo B). Parece que existe un tercer mecanismo C, que puede darse cuando

la bacteria mantiene sus procesos de síntesis, aunque no haya división celular. Si

únicamente presentan el mecanismo A, se produce un efecto paradójico, y es que

por encima de cierta concentración, el efecto bactericida disminuye, puesto que la

síntesis de proteínas bacterianas se encuentra muy comprometida.


Introducción 77


Existen al menos tres mecanismos fundamentales mediante los que las

bacterias desarrollan resistencias a la acción de las quinolonas (Janoir, 1996; Pan, 1996;

1997): Alteraciones de la permeabilidad de la membrana restringiendo el acceso del

antimicrobiano a los lugares de acción; Alteraciones en la subunidad C de la

topoisomerasa IV; y Alteraciones estructurales de la subunidad A de la girasa,

impidiendo la unión de esta enzima a las quinolonas.

La presencia de mutaciones en el gen parC da como resultado sustituciones

de aminoácidos en la subunidad C de la topoisomerasa IV, y confiere resistencia de

bajo nivel a ciprofloxacino que ve aumentada de 4 a 8 veces la CIM, mientras que no

afecta significativamente a esparfloxacino o trovafloxacino. Si en estas cepas con

mutaciones del gen parC aparecen mutaciones secundarias en el gen gyrA, se

originan alteraciones de la subunidad A de la girasa en posiciones próximas a la

zona de unión con la quinolona. Diferentes mutaciones a este nivel dan lugar a

enzimas que no pueden unirse a las quinolonas y, dependiendo del número de

mutaciones en esta subunidad, la resistencia será de mayor o menor grado, dando

lugar a resistencia de alto nivel a ciprofloxacino, ofloxacino y esparfloxacino, y

resistencia moderada a trovafloxacino (Taba, 1998).

Se han descrito otros mecanismos como el desarrollo de sistemas

bacterianos que expulsan de forma activa a las quinolonas del interior de la bacteria,

en microorganismos gramnegativos y en grampositivos como el neumococo (Brenwald,

1998; Zeller, 1998).

De esta forma, la concentración de antibiótico en el interior de la bacteria es

menor, y, por tanto, también la susceptibilidad. Parece que este mecanismo

depende de las características fisicoquímicas de la quinolona, de manera que afecta

mas a las de carácter hidrofilico. Alguna de estas mutaciones se ha relacionado con

el desarrollo de resistencias a diferentes antibióticos, como tetraciclinas,

cloramfenicol y ß-lactámicos.

La mayor parte de estas resistencias se producen por mutación cromosómica,

ya que, al ser estos antibióticos inhibidores de la síntesis del ADN, es difícil la

aparición de plásmidos transmisores de estas resistencias.


Introducción 78

La resistencia es cruzada entre las diferentes fluorquinolonas, pero no con el

resto de los antibióticos de este grupo. Igualmente, la resistencia a antibióticos no

fluorados es cruzada entre sí, pero no lo es con las fluoroquinolonas (Cormican, 1995).

La aparición de resistencias a las fluoroquinolonas es relativamente frecuente

en Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S epidermidis y otros

Staphylococcus coagulasa negativos o Streptococcus pneumoniae. Liñares et al.

(Liñares, 1998) constata la buena actividad y baja frecuencia de resistencias frente a S.

pneumoniae de esparfloxacino y trovafloxacino.

Esparfloxacino fue pues la primera fluorquinolona con una buena actividad in

vitro e in vivo contra S. pneumoniae, demostrando a su vez eficacia clínica (Allegra,

1996). Y aunque actualmente ha sido superado en espectro de acción, propiedades

farmacológicas y menor toxicidad por otras quinolonas, su excelente actividad y baja

tasa de resistencias frente a Streptococcus pneumoniae ( Aubier, 1996; Barry, 1996d; Goa, 1997;

Richard, 1998), lo promocionaban, en el momento de la realización de esta tesis, como

una excelente opción terapeútica.

8. - Pruebas de susceptibilidad

8.1. - Prueba de susceptibilidad por difusión en agar con disco.

Este método, aceptado ampliamente como estándar, es esencialmente un

método cualitativo que ubica los microorganismos en las categorías de sensibles,

intermedios o resistentes.

Los antimicrobianos se aplican normalmente a las placas de prueba en forma

de discos secos de papel filtro. El resultado final es un gradiente de concentración

del antimicrobiano en el agar que rodea cada disco. No aparece ningún crecimiento

en el área donde la droga está a concentraciones superiores a la mínima inhibitoria.

El tamaño de la zona de inhibición depende de numerosos factores

experimentales, sin embargo para la prueba estandarizada se obtiene una buena

correlación entre el tamaño del halo y la categoría de susceptibilidad para el

microorganismo (Barry 1995b).

Los neumococos son normalmente inhibidos por ≤ 0.02 µg de penicilina G por

mL. Se han descrito cepas moderadamente resistentes (MIC entre 0,1 y 1 µg/mL) y

cepas resistentes a penicilina (MIC ≥ 2 µg/mL) (Flacklam, 1987; Jorgensen, 1994).


Introducción 79

El uso del método de sensibilidad con discos de oxacilina como un screening

para la detección de cepas penicilina-resistentes de Streptococcus pneumoniae ha

sido ampliamente recomendado (National Committee for Clinical Laboratory Standards [NCCLS], 1984). Sin

embargo no es recomendable para distinguir entre cepas moderadamente

resistentes y altamente resistentes (Swenson, 1986).

8.2. - Prueba de susceptibilidad por E-test

La técnica E-test (E-test, AB Biodisk; Solna, Sweden) es un método bién

contrastado (Skulnick, 1995; Tenover, 1996; Scheel, 1997) y actualmente muy utilizado (Jorgensen, 1991;

Jacobs, 1992b), recomendado por el Grupo de Trabajo de la NCCLS como una alternativa

aceptable al método de referencia por dilución en agar para el neumococo (Krisher, 1994;

Kiska, 1995). A diferencia del disco de oxacilina, permite la rápida diferenciación entre

cepas intermedias y altamente resistentes a penicilina, y otros antimicrobianos (Macias,

1994)

Consiste en tiras plásticas inertes y no porosas, de 5 cm de largo por 5 mm de

ancho, en una cara se ha desarrollado y afianzado un gradiente de antimicrobiano,

equivalente a 15 doblediluciones seriadas, que difunde inmediatamente al aplicar las

tiras sobre la superficie del agar. De forma similar a otras técnicas de difusión en

agar, se crea un gradiente exponencial proporcional a la concentración presente en

los puntos teóricos de la tira. Tras la incubación se puede observar una zona de

inhibición elipsoidal y simétrica. El punto en que el extremo de la zona de inhibición

intersecciona con la tira, es el valor de la CIM (Mirelis, 1995).

Además de por las limitaciones comunes a las técnicas de difusión en agar

como son la composición y grosor del agar, temperatura, pH, electrolitos, carga del

inóculo, etc., pueden producirse errores o discrepancias por la aplicación

inadecuada de las tiras o mala interpretación de los resultados (Acar, 1996).

Especialmente con el neumococo hay que tener en cuenta la posible existencia de

microcolonias o colonias aisladas dentro del área de inhibición; o la presentación del

denominado dip-effect, debiendo entonces realizarse la lectura sobre la curva virtual

final de la elipse.

Se ha investigado la aplicación del método Etest en la valoración de

parámetros farmacológicos como el efecto post-antibiótico y sinergia antimicrobiana

(Hollander, 1998).


Introducción 80

8.3. - Pruebas de susceptibilidad por dilución.

Resultan métodos más cuantitativos, dando resultados directos que no están

tan influenciados por factores experimentales complejos de las técnicas de difusión.

Como en todas las pruebas de susceptibilidad se debe cuidar especialmente el

tamaño del inóculo y el tiempo de lectura (Thornsberry, 1987; Laverdiere, 1978; Tarpay, 1978).

8.3.1. - Prueba de susceptibilidad por dilución en caldo.

Concentración inhibitoria mínima (CIM)

En la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM), diluciones

seriadas de los antimicrobianos se inoculan con el microorganismo, se incuban, y se

lee la CIM como la correspondiente al pocillo de menor concentración sin

crecimiento visible a simple vista (Washington, 1985). Se usa para determinar de forma

aproximada la concentración mínima de un antimicrobiano necesaria para inhibir o

matar a un microorganismo. Ello permite cuantificar la acción de los antimicrobianos

y comparar las concentraciones inhibitorias con las tisulares. Un microorganismo se

considera resistente cuando los niveles alcanzados en el lugar de la infección por el

antimicrobiano, no son suficientes para inhibirlo.

8.3.2. - Tasas de letalidad in vitro

Aunque el parámetro que cuantifica la sensibilidad de un microorganismo a un

antimicrobiano es la CIM, existen situaciones clínicas como la meningitis o las

infecciones en pacientes inmunodeprimidos, que precisan de una actividad

bactericida rápida.

Sobre la base del estudio de curvas de muerte, se han descrito numerosos

métodos in vitro de diferente complejidad para la determinación del efecto

bactericida, simulando diversos patrones o condiciones farmacocinéticas (Thorburn, 1998).

8.3.2.1. - Cinética del crecimiento en medio líquido. Ciclo de crecimiento

Cuando se inoculan bacterias en un medio fresco, la curva de crecimiento

suele mostrar tres fases: la de latencia (también denominada lag), la exponencial

(denominada logarítmica o log) y la estacionaria (Fig. 18).


Introducción 81

Al principio la turbidez aumenta muy lentamente, mientras se van sintetizando

ribosomas y otros componentes necesarios, hasta que el crecimiento se hace

exponencial. Si se inoculan células procedentes de un estado estacionario el periodo

lag es mayor, ya que las células han de crecer antes de poder empezar a dividirse.

Si se inoculan células procedentes de un cultivo en fase exponencial, en el mismo

medio a temperatura idónea, el período

de latencia puede resultar inapreciable.

Avanzado el tiempo empiezan a

escasear los nutrientes y las células se

hacen más pequeñas, produciéndose

cambios en su composición como la

reducción de ribosomas que se utiliza

para sintetizar otras moléculas necesarias

para continuar la división celular sin

aumento de la masa total.

Transcurrido cierto tiempo en fase estacionaria, las células del neumococo

empiezan a lisarse, situación denominada a veces fase de muerte. Parece que

durante esta fase, el proceso adaptativo de degradación ribosómica se convierte en

una estrategia suicida, ya que se elimina hasta el último ribosoma y no es posible la

síntesis proteica necesaria para formar nuevos ribosomas.

Representación gráfica.

Durante la fase exponencial de crecimiento, la tasa de incremento de la masa

bacteriana en un tiempo determinado es proporcional a la masa presente:

dB/dt = αB

Donde B es la masa bacteriana, t el tiempo y α la tasa constante de crecimiento

bacteriano para cada cultivo concreto. Por tanto:

dB / B = α dt (o ln B = α dt)

Bt = Boeαt ; e integrando:

ln Bt /Bo = αt, o ln Bt = ln Bo + αt

Por tanto, durante la fase exponencial la representación gráfica del logaritmo

de la masa bacteriana (o de lo que es equivalente, de las unidades formadoras de

colonias), frente a tiempo da lugar a una línea recta. Esta gráfica semilogarítmica

suele ser la que se emplea para representar curvas de crecimiento bacteriano.

Streptococcus pneumoniae

Cepa nº 2461

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 H24

tiempo (horas)

log

It

(UF

C/m

L)

fase

exponencial

temprana

fase

exponencial

fase de

latencia

fase

lítica

fase

exponencial

tardía

Fig.18: Cinética de crecimiento del neumococo


Introducción 82

8.3.2.2. - Curvas de muerte

Las pruebas de susceptibilidad de rutina, incluyendo las determinaciones de

CIM, estiman la acción bacterioestática o inhibidora de los antimicrobianos. En la

práctica esto es suficiente como guía de la quimioterapia en la mayoría de los casos,

dado que el éxito de la acción antimicrobiana in vivo depende mucho de los propios

mecanismos de defensa del huésped que son los que en última instancia matan y

eliminan los microorganismos que han sido reducidos por los agentes

antimicrobianos bactericidas o bacteriostáticos. (Schoenknecht, 1987).

Las curvas de muerte o tasas de letalidad son la representación gráfica de los

puntos correspondientes a los supervivientes de un teórico tratamiento

antimicrobiano. Esta técnica ha sido usada para comparar nuevos antimicrobianos y

para el estudio en los cambios de susceptibilidad de patógenos importantes como el

neumococo. Aunque rara vez se emplean como guía en alguna quimioterapia

concreta, si lo han sido en casos de endocarditis bacteriana, bacteriemia en

pacientes con cáncer, osteomielitis o artritis séptica y especialmente en meningitis.

Algunos antibióticos como los ß-lactámicos, aunque resultan altamente

bactericidas para células en rápido crecimiento in vitro, pueden ser menos efectivos

contra bacterias en lento o nulo crecimiento (Allen, 1978), tal como sucede en algunos

compartimentos anatómicos debido a algunas deficiencias nutricionales,

especialmente para algunos microorganismos exigentes como el neumococo, y

cuando se alcanzan altas concentraciones bacterianas (Baker, 1973). Una comparación

directa entre la composición de un medio mínimo definido, frente a la del LCR (Diem,

1981) nos muestra que este último resulta 100 veces más pobre en algunos

aminoácidos y manganeso. Por otro lado, se ha demostrado que los estreptococos

(McGeary, 1983), y dentro de ellos el neumococo (Feldman, 1976), pueden alcanzar en LCR

altas concentraciones del orden de 1x108 UFC/mL

Esto puede suponer un importante problema terapéutico especialmente

cuando o donde las defensas del huésped están disminuidas, tal como sucede en el

espacio subaracnoideo (Tuomanem, 1986). Y por ello las curvas de muerte, que pueden

aportar datos sobre la dinámica de crecimiento o muerte respecto al tiempo, son

útiles para comprender la influencia de dicho aspecto en procesos infecciosos de

curso rápido y grave como la meningitis bacteriana.


Introducción 83

La limitada experiencia, experimental y clínica en el tratamiento de las

meningitis y otros procesos graves, por neumococos resistentes a penicilina, hace

especialmente interesante el estudio de la cinética de muerte de dichas cepas ante

algunos de los antibióticos preconizados para su tratamiento. (McCraken y Sakata, 1985;

Appelbaum, 1987; Piérard, 1994; Musher, 1995).

8.3.2.3. - Factores que afectan los resultados de las curvas de muerte

Como en las técnicas anteriores para la determinación de la CIM, existen

numerosos factores que influyen en los resultados de las curvas de muerte para el

estudio de las tasas de letalidad en función de las concentraciones del

antimicrobiano (Magnusson, 1995), del efecto post-antibiótico y del efecto de las

combinaciones antimicrobianas, y según el control que se haga de ellos, numerosas

variantes de los procedimientos de laboratorio. Alguna de ellas se describen más

adelante.

8.3.3. -. Estudio de la acción bactericida en animales

Los modelos de infección en animales, proporcionan una aproximación

necesaria, al resultado de las numerosas interacciones entre el antimicrobiano, el

microorganismo y el huésped (Dalhoff, 1990).

Se han empleado modelos diferentes intentando oviar o aislar determinados

factores, como la respuesta inmune celular empleando animales neutropénicos (Martín-

Caminero, 1997); o reproducir procesos patológicos como la neumonía (Gavaldá, 1997).

8.4. - Otros aspectos farmacológicos: efecto post-antibiótico (EPA)

Inicialmente, los intervalos entre las dosis estaban determinados por las

distintas farmacocinéticas. Posteriormente se han tenido en cuenta otros

parámetros, tales como el modo de acción de los antibióticos (bacteriostático,

bactericida, lugar de acción sobre las bacterias), su paso a distintos lugares (líquido

intersticial, concentración intracelular, unión a los lisosomas, vía de eliminación), etc.

La presencia del efecto post-antibiótico (EPA) o persistencia en la supresión

del crecimiento que sigue tras una corta exposición de las bacterias a los agentes

antimicrobianos, puede ser una curiosidad microbiológica de valor cuestionable al

menos se demuestre su valor en situaciones clínicas, interrelacionando una serie de


Introducción 84

datos y conocimientos como son la dosis, farmacodinamia, CIM de la bacteria, EPA

y su relación con la ABC (área bajo la curva), y las enfermedades de base del

enfermo junto con sus factores de riesgo a la adquisición de las mismas.

El EPA puede tener su mayor influencia en el régimen de dosis (Kunin, 1981). Por

ejemplo se consigue una mayor persistencia de la supresión del crecimiento mediante

concentraciones sub-CIM (efecto post-antibiótico sub-CIM) (Odenholt, 1992; 1997; Gudmundsson,

1994; Kikuchi, 1994), si el microorganismo ha sido previamente tratado a concentraciones

por encima de la CIM. Estas concentraciones sub-CIM, las encontramos entre dosis

en administración intermitente (Cars, 1993). Por otro lado la exposición in vitro de S.

pneumoniae a concentraciones sub-CIM favorece el desarrollo de resistencias (Carsenti-

Etesse, 1995). Luego la elección de una administración intermitente, debe tener en

cuenta la incidencia de resistencias (Fung-Tomc, 1990).

La situación microorganismo-antibiótico que no haya demostrado EPA, o este

sea muy corto, puede requerir de una dosificación mas frecuente que aquella en la

que si se haya demostrado (Hollander, 1998). Este es el caso de la mayoría de los

antibióticos ß-lactámicos, cuyos datos indican seguir con dosis repetidas que

consigan niveles por encima de las CIM. Por el contrario, antimicrobianos como los

aminoglucósidos, macrólidos, glicopéptidos y rifamicinas, su farmacocinética, niveles

hísticos específicos y EPA prolongado, son datos a favor de espaciar la dosis.

8.4.1. - ß-lactámicos

Los antibióticos ß-lactámicos producen un EPA corto o intermedio sobre la

mayoría de bacterias grampositivas con la excepción de los carbapenenes, como

imipenem y meropenem que inducen EPA largo de varías horas, frente a las mismas

(Gudmundsson, 1986; Rennenberg, 1989; Munckhof, 1997; Odenholt, 1998).

Entre las cefalosporinas, la cefalotina produce EPA más largo sobre S.aureus

(Bundtzen, 1981). Las cefalosporinas de segunda y tercera generación consiguen EPA de

aproximadamente 5 horas frente a esta bacteria, mientras que el resto de

cefalosporinas inducen un EPA corto o nulo.

La penicilina G 10xCIM es capaz de producir un EPA de 1,2 horas en

Streptococcus pyogenes, al parecer por unión irreversible a las PFPs 1 - 3,

representando el tiempo requerido para la síntesis de nuevas PFPs necesarias para

la síntesis celular (Yan, 1994).


Introducción 85

La dosificación continua de ß-lactámicos ha demostrado sostenidamente más

eficacia que dosificaciones intermitentes en modelos animales. La duración del tiempo

en el que los niveles séricos exceden la CIM es un parámetro farmacocinético

importante para la eficacia de esos antimicrobianos.

Con muy altas dosis de penicilina, se observó una eficacia equivalente cuando

en ambos modelos los niveles séricos superaban la CIM. Otros trabajos en ratas con

capacidad fagocitaria alterada por veneno de cobra, el régimen de dosificación

continuo fue bastante más efectivo. Esto sugiere que las defensas del hospedador

intactas contribuyen de forma significativa a la eficacia del régimen intermitente de

penicilina G contra S. pneumoniae.

8.4.2. - Glicopéptidos

Teicoplanina y vancomicina producen EPAs intermedios con E. faecalis y

cortos con cepas de S.aureus resistentes a la meticilina (Cooper, 1990). Vancomicina

frente a S. pneumoniae consigue un EPA de 1,8 a 4,5 horas, y frente a S. pyogenes

de 2,9 - 3,8 horas (Odenholt-Tornqvist, 1992).

8.4.3. - Quinolonas

Los inhibidores de la DNA girasa producen EPA intermedio o de varias horas

de duración sobre bacterias grampositivas (Gudmundsson, 1991; Minguez, 1991). Esparfloxacino

frente a E. faecalis obtiene EPAs de 0 a 112 minutos (Pastor, 1994) y de 1,7 a 2,3 horas

(Odenholt, 1997), y frente a S. pneumoniae de 1,8 - 2,6 horas (Odenholt-Tornqvist, 1992).

En general se puede decir que los antimicrobianos que inhiben la síntesis de

RNA o de proteínas, como cloranfenicol, macrólidos, rifampicina, tetraciclina y

vancomicina, con la excepción de los aminoglucósidos, tienden a producir un EPA

más largo sobre las bacterias grampositivas que los antibióticos ß-lactámicos.

8.4.4. - Estudio in vitro del EPA

Se han descrito numerosos métodos in vitro de diferente laboriosidad (Craig,

1996; Gottfredsson, 1991; Odenholt, 1993; Jason, 1994) para la determinación del EPA. Básicamente

se trata de medir el crecimiento bacteriano después de la eliminación del

antimicrobiano. La diferencia entre unos métodos y otros consiste en la forma de

medir el crecimiento, y en la forma de eliminar el antimicrobiano.


Introducción 86

Tabla 7: Métodos de estudio del EPA

Estudio del EPA

Métodos de eliminación del antimicrobiano

• Dilución

• Filtración en membrana

• Centrifugación y lavado

• Inactivación enzimática

Métodos de recuento bacteriano

Directos

• Recuento de células viables

• Cambio de la morfología celular

Indirectos

• Espectrofotometría

• Conductancia eléctrica

• Medición de productos bacterianos

• Incorporación de isótopos radiactivos

• Bioluminiscencia

8.4.4.1. - Métodos de eliminación del antimicrobiano

En la mayor parte de los estudios recogidos, se usa el método de dilución

para la eliminación del antimicrobiano. Un

pequeño volumen del cultivo con antibiótico es

añadido a un gran volumen de medio sin

antibiótico. Se pretende que la dilución sea tan

grande que la concentración del antibiótico no

afecte el crecimiento del cultivo control. Para

concentraciones cercanas a la CIM, una

dilución de 10-2 es suficiente; para

concentraciones mayores suele necesitarse

diluciones del orden de 10-3 a 10-4. También

es preciso partir de inóculos iniciales del microorganismo del al menos 105 a 106

UFC/mL, ya que también es diluido en la misma extensión que la droga. Al igual que

el lavado repetido, la técnica de dilución es aplicable a todos los antimicrobianos. Sin

embargo, con drogas de rápida acción bactericida, la dilución puede reducir el número

de recuentos viables por debajo del umbral detectable mas fácilmente que en el

sistema de lavado.

EPA 1 HORA Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 + Penicilina G 1 mcg/mL

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24

Tiempo (horas)

log

(UF

C/m

L)

DiluciónControl

T

C

EPA = T(5)-C (2) = 3 hr

Fig. 19: Eliminación del antimicrobiano por elmétodo de dilución


Introducción 87

Algunos investigadores han usado un sistema de centrifugación por

membrana para la eliminación de la droga. Filtros de membrana también han sido

utilizados para exponer los microorganismos a la droga que difunde desde una

superficie de agar. Esta es eliminada por repetida trasferencia de los filtros a placas de

agar sin droga. La ventaja potencial de este método es que los microorganismos son

menos afectados por la presión osmótica y otros efectos mecánicos. La eliminación de

los microorganismos de los filtros consume mas tiempo que el muestreo de los caldos.

El sistema de lavado repetido de los microorganismos es un método común

usado para la rápida remoción del fármaco. Se logra por centrifugación de los cultivos

en caldo a 1200 x g o más durante 5 a 10 minutos, decantando el supernadante, y

resuspendiendo el sedimento en medio nuevo. Todos los investigadores han utilizado

al menos dos lavados para asegurar una completa eliminación de la droga. Con la

eliminación del 90% del sobrenadante, dos lavados consiguen reducir la

concentración de la droga unas 100 veces. Con la decantación completa del

sobrenadante puede reducirse la concentración hasta 10.000 veces. El lavado

ocasiona per se una reducción temporal de la tasa de crecimiento bacteriano, esto

puede ser debido a un descenso de la temperatura durante la centrifugación, a efectos

mecánicos, o a la reducción del aporte de nutrientes a las bacterias agrupadas en el

sedimento. En cualquier caso, es importante cuando se utiliza este método, procesar

controles sin tratar. Aunque este método es aplicable a cualquier antimicrobiano, su

elaboración requiere de al menos 30 minutos.

Un método más rápido para la eliminación del antimicrobiano es la

inactivación del fármaco, aunque está muy limitado a los ß-lactámicos. La simple

adición de •-lactamasa comercial al cultivo con antibiótico, rápidamente inactiva a

penicilinas y cefalosporinas, otras clases de antimicrobianos no son tan fácilmente

inactivadas. El fosfato de celulosa es capaz de unirse e inactivar las moléculas de

aminoglucósidos, pero requiere un paso de centrifugación para separar el complejo

celulosa-aminoglucósido. La eliminación del fármaco por resinas de intercambio iónico

podría tener aplicación en numerosas drogas, pero sólo ha sido estudiado bien en un

antibiótico.


Introducción 88

8.4.4.2. - Métodos de recuento bacteriano

Recuento de viables. Se emplea ampliamente el recuento de viables

(unidades formadoras de colonias o UFC/mL) para seguir la cinética de crecimiento

bacteriano después de la eliminación de la droga. Las curvas de viabilidad de un

neumococo estandard, después de una hora de exposición a penicilina G y su

eliminación por lavado se ilustran en la Figura 19.

Después de la eliminación de la droga, se da un retraso del crecimiento que

persiste durante 0 a 3 horas. Los primeros investigadores cuantificaron el EPA

estimando el período de tiempo en fase estacionaria de crecimiento. Sin embargo

las curvas de crecimiento EPA no siempre reflejan una fase estacionaria seguida de

otra fase logarítmica, a menudo se reanuda diréctamente el incremento logarítmico

de viables.

Cuantificación mecánica. Medidas ópticas y eléctricas han sido usadas por

numerosos investigadores para cuantificar el EPA. MacKenzie y Gould (MacKenzie, 1994,

1994b) han comparado simultáneamente estos resultados con los obtenidos en

Enterobacteriaceae por recuento de viables.

Limitaciones de estas técnicas son que la densidad óptica infravalora la

intensidad de la acción bactericida de los antibióticos ß-lactámicos y

aminoglucósidos sobre bacilos gram-negativos, resultando EPAs mucho mayores que

los calculados con recuento de viables.

El contaje electrónico de partículas ha mostrado un EPA comparable al

obtenido por recuento de viables de S. aureus contra dicloxacilina (Li, 1996). Sin

embargo, la validez de este método para bacilos gram-negativos y otros antibióticos

es desconocida.

Concentraciones por debajo de 106 UFC/mL no son bien detectadas por

densidad óptica (Odenholt-Tornqvist, 1993) o medidas de la impedancia, el crecimiento

logarítmico determinado por estos métodos puede mostrar un aparente periodo lag,

donde las bacterias exceden el umbral de detección. Entonces si la densidad óptica o

la impedancia son usadas para la determinación de EPA, es preciso realizar curvas

control por recuento de viables para los diferentes inóculos.

Determinaciones bioquímicas. El contenido de ATP intracelular medido por

bioluminiscencia también ha sido usado para la determinación de EPA (MacKenzie, 1994,

1994b; Handberger, 1990). En algunos casos la intensidad de la acción bactericida fue


Introducción 89

marcadamente infravalorada por el método del ATP, tal vez debido al número de

células muertas pero intactas y conservando su ATP intracelular.

Gottfredsson y col. (Gottfredsson, 1991) han comparado la producción de C02

derivada del metabolismo bacteriano con el recuento de viables, utilizando un sistema

comercial de hemocultivos BACTEC NR 740 (Becton-Dickinson S.A.), capaz de

detectar por espectroscopía de infrarrojos la producción de CO2, obteniendo una

excelente correlación (r = 0,93).

Método radiométrico. La tasa de incorporación de timidina marcada con tritio

por las bacterias después de la exposición al antimicrobiano, también ha sido utilizada

en la cuantificación del EPA. El EPA cuantificado por este método, es prácticamente el

mismo que el medido por el procedimiento estándar y no parece rentable su uso.

Morfología. Se puede usar técnicas como la microscopía de contraste de

fases, microscopía electrónica o citometría (Craig, 1996) para hacer un seguimiento de la

morfología celular o de cambios estructurales relacionados con la acción del

antimicrobiano. La persistencia de esas alteraciones se correlacionan bien con la

duración del EPA determinado por recuento de viables.

8.4.4.3. - Factores que afectan al EPA.

Tabla 8: Factores in vitro que afectan al EPA

Microorganismo• Tipo• Cepa• Tiempo de generación• Fase de crecimiento• Sensibilidad antibiótica• Tamaño del inóculo• Asociación bacterianaAntimicrobiano• Tipo• Modo de acción• Concentración• Combinación• Coeficiente de particiónCondiciones experimentales• Método experimental• Duración de la exposición• Eliminación antibiótica• Agitación• Medio de cultivo• pH del medio• Temperatura• Presencia de iones, orina, suero, LCR


Introducción 90

Numerosos factores pertenecientes a los microorganismos, al antimicrobiano y

a las condiciones experimentales, pueden afectar la duración e incluso la existencia

de EPA. En general, los factores que pueden afectar el EPA son los mismos que

afectan otros parámetros farmacológicos como CIM o CBM, con pocas excepciones.

La variable más importante y una de las mejor estudiadas es el tipo de

microorganismo y la clase de antimicrobiano. Los efectos de la concentración de la

droga y de la duración de la exposición al antimicrobiano también han sido estudiados.

Parámetros sobre los que existe un número limitado de experiencias son el tamaño

del inóculo, la fase de crecimiento en el momento de la exposición, agitación

mecánica del cultivo, tipo de medio, pH del medio y efecto de la combinación de

fármacos (Craig y Gudmunsson, 1996).

Tipo de microorganismo y antimicrobiano

Aunque el efecto post-antibiótico ha sido observado en una amplia variedad de

bacterias y levaduras; y este fenómeno también parece ser una característica de

todos los antimicrobianos. Sin embargo la duración del EPA puede variar

significativamente según la combinación antimicrobiano - microorganismo. Así se ha

observado que los antimicrobianos que interfieren la síntesis de la pared celular

inducen EPAs más largos sobre bacterias grampositivas que sobre gramnegativas.

Por el contrario antimicrobianos como las fluorquinolonas producen EPAs más largos

en gramnegativos que en grampositivos (Martín Caminero, 1993).

MacKenzie y col. investigaron por cinco métodos distintos, el efecto de una

exposición a meropenem en diferentes especies de la familia Enterobacteriaceae,

encontrando distintos EPAs en cada microorganismo (McKenzie, 1991; 1994).

Excepto gentamicina, los inhibidores de la síntesis proteica o de ácidos

nucleicos, tienden a producir mayores EPAs que los antimicrobianos ß-lactámicos

(Craig, 1996).

Concentración del antimicrobiano

Las concentraciones a las que se ha ensayado el EPA suelen ser, en la

mayoría de los casos, las que se alcanzan en suero o líquidos orgánicos después de

una dosis habitual de antimicrobiano, o bien a concentraciones superiores a la CIM

del microorganismo. Por otra parte, hay que tener en cuenta que cuando se produce

mucha letalidad el EPA es difícil de medir, como ocurre con los antimicrobianos

rápidamente bactericidas como imipenem. Zhanel y colaboradores (Zhanel, 1991), han


Introducción 91

sugerido que los estudios sobre el EPA incluyan concentraciones inferiores a la CIM

del microorganismo ya que los antibióticos que son bactericidas a concentraciones

iguales o un poco por encima de la CIM (ß-lactámicos y quinolonas), eliminarán una

gran parte de las bacterias expuestas a la acción del antimicrobiano y en estos

casos el EPA podría representar la recuperación de los miembros más resistentes

de la población bacteriana. Si los estudios se realizasen a concentraciones inferiores

a la CIM, representarían la recuperación de casi toda la población bacteriana

durante el ensayo y no la de los miembros más resistentes.

Los estudios de la cinética de la actividad bactericida con respecto a la

concentración han puesto de manifiesto que existen diversas categorías de

antimicrobianos: Antimicrobianos con un marcado efecto bactericida, dependiente

de la concentración, como los aminoglucósidos. Antimicrobianos con poco efecto

de la concentración en la actividad bactericida, como los ß-lactámicos.

Antimicrobianos que tienen sólo acción bacterioestática, como el cloramfenicol.

Antimicrobianos cuya acción bactericida aumenta con la concentración hasta

alcanzar un máximo a partir del cual la acción bactericida disminuye; esto es lo que

se llama efecto paradójico, como las quinolonas (Pastor, 1992; 1992b; Dudley, 1991). Estas

categorías también quedan reflejadas en el EPA.

En los ß-lactámicos, al actuar sobre los microorganismos grampositivos, un

incremento en la concentración produce un incremento en la actividad bactericida y

el EPA consiguiendo el efecto máximo cuando la concentración es de 5 a 10 veces

la CIM del microorganismo. Por encima de esta concentración no se da un aumento

del EPA aunque se incremente la misma. Con gramnegativos, la mayoría de los

datos de los ß-lactámicos indican que se producen EPAs pequeños o nulos pero

indiferentes de la concentración del antimicrobiano.

Un efecto paradójico del EPA aparece cuando se incrementa la concentración

de penicilina ya que se produce un decrecimiento de la duración del mismo a partir

de un punto máximo (Eagle, 1950[Craig, 1996]). Con los antibióticos bacteriostáticos como

eritromicina, tetraciclina o cloramfenicol, el EPA sólo se produce cuando las

concentraciones empleadas son de 5 a 10 veces la CIM del microorganismo, tanto si

son grampositivos como si son gramnegativos (Vogelman, 1985). El EPA producido por las

fluoroquinolonas se muestra dependiente de la concentración de antimicrobiano, un


Introducción 92

aumento en la misma lleva consigue un incremento en la duración del EPA (Pastor,

1992).

La concentración que alcance el antimicrobiano en un lugar determinado,

también puede afectar el EPA (Bergeron, 1981).

Duración de la exposición.

Aumentando el tiempo de exposición al antimicrobiano, también se logra una

prolongación del EPA (Bundtzen, 1981; Gerber, 1993; Vogelman, 1985). De esta forma, como ocurre

con la concentración, el EPA aumenta con el tiempo de exposición al antimicrobiano

hasta un punto de máxima respuesta a partir del cual ya no se produce aumento del

EPA.

La ampicilina frente a Streptococcus pneumoniae, con mayores períodos de

exposición produce mayores EPAs. En algunos antimicrobianos, como en el caso de

las carbapenemas, la máxima duración del EPA es difícil de determinar debido a la

rápida acción bactericida que producen cuando se ensayan a concentraciones

elevadas o con exposiciones largas.

Eagle y colaboradores (Eagle, 1949 [Craig, 1996]) observaron que el máximo EPA

producido por la penicilina sobre bacterias grampositivas se obtenía después de 2-4

horas de exposición; sin embargo, algunas cepas muestran incrementos del EPA

después de 24 horas. La eritromicina, por su parte, produce el máximo EPA sobre S.

aureus después de 8 horas de exposición. Así mismo, se ha observado que la

duplicación de la duración de la exposición tiene el mismo efecto que el de duplicar

la concentración del antimicrobiano (Craig, 1996).

Por tanto el área bajo la curva (ABC o AUC), esto es concentraciones frente a

tiempo de exposición, aparece como el principal factor determinante de la duración

del EPA para una determinada combinación bacteria-antimicrobiano. Se ha

demostrado una excelente correlación entre la ABC y la duración del EPA de

imipenem y varios bacilos gramnegativos (Munckhof, 1997), penicilina G y S. aureus, y

roxitromicina y S. pneumoniae.

Método de determinación.

Se pueden apreciar diferencias en la duración del EPA dependiendo del

método utilizado para su determinación. Las diferencias entre unos métodos y otros

radican en la forma de medir el crecimiento bacteriano, una vez ha sido eliminado el

antimicrobiano (McKenzie, 1991).


Introducción 93

Tamaño del inóculo

Los incrementos del inóculo se asocian a ligeros descensos en la duración del

EPA. De forma similar, el incremento del inóculo en bacilos gram-negativos da lugar

a EPA más cortos en imipenem, tobramicina y ciprofloxacino.

Fase de crecimiento del microorganismo

Muchos estudios del EPA se han desarrollado con microorganismos en fase

logarítmica de crecimiento. Con penicilina G y S. aureus (Craig, 1996) se han revelado

duraciones similares del EPA con microorganismos en fase lag o en fase log. Por

otro lado, Tuomanem (Tuomanem, 1986) ha demostrado un inmediato recrecimiento de S.

pneumoniae en lento desarrollo, después de la eliminación de la penicilina G,

mientras que otros investigadores han observado mayores EPAs durante la fase log

de crecimiento (Bundtzen, 1981; Kim, 1981).

Agitación mecánica

Algunos autores no han observado diferencias significativas en la duración del

EPA con S. aureus y penicilina G en condiciones estacionarias o en agitación en

baño-María (Fuursted, 1997). Sin embargo otros encontraron mayores EPAs en E. coli y

ampicilina en condiciones estacionarias que en agitación continua (Craig, 1996).

La agitación conlleva un aumento de la tensión de oxígeno, lo que puede

alterar la acción de antimicrobianos como vancomicina, aminoglucósidos y

quinolonas, si bién su importancia no está dilucidada (Fuursted, 1997).

Aunque no está clara la influencia de la condición experimental de agitación,

todos los estudios realizados en este trabajo, se han desarrollado en agitación

mecánica continúa.

Tipo de medio

El empleo de diferentes medios produce efectos variables en el EPA, los más

pronunciados se han observado con trimetoprim, seguramente debidos a distintos

contenidos en timidina que pueden inhibir la acción del trimetoprim.

Wilson y Rolinson (Wilson, 1979) no observan diferencias en la duración del EPA

en S. aureus y penicilina G en caldo nutritivo o en caldo infusión cerebro corazón.

Influencia del pH

A pesar de que la influencia del pH es notoria sobre la acción de los

antimicrobianos, existe un reducido número de trabajos que la estudien.

Gudmundsson y col. (Gudmundsson, 1991) demostraron que la actividad de imipenem,


Introducción 94

ciprofloxacino y otros antimicrobianos se ve disminuída por la acidificación del

medio.

La duración del EPA se puede afectar significativamente modificando el pH

del medio post-exposición, donde S. aureus crece más despacio a pH 6,0 o a pH

9,0, que a pH 7,4 (Fuursted, 1997).

Temperatura

Al igual que con el pH, suele existir un rango de temperatura óptimo para el

crecimiento de determinadas bacterias, por lo que la temperatura, también suele

afectar a parámetros como la CIM o CBM y naturalmente al EPA (Fuursted, 1997;

Magnunsson, 1995).

Presencia de suero

La presencia de suero humano incrementa el EPA de algunas fluorquinolonas

frente a cocos grampositivos (Davidson, 1991), y la actividad de cefalosporinas frente otros

patógenos (Leggett, 1989; 1989b)

8.4.5. - Estudios del EPA mediante modelos animales

El número de experiencias in vivo (animales o humanas) sobre el EPA es

mucho menor que el número de estudios in vitro publicados. La mayoría de los

autores emplean los modelos de infección en ratón neutropénico, de músculo

(Gudmunsson, 1982; Martín-Caminero, 1997), o de neumonía (Moine, 1994; Sauve, 1996; Candiani, 1997) y el de

meningitis en conejo (Sande, 1981; McCraken, 1983; Paris, 1994, 1995, 1996; Nau, 1995) para el estudio

del EPA en S. pneumoniae y otros patógenos. Menos frecuentes son los modelos

de ratón normal en infección subcutánea (Renneberg, 1989), peritonitis (Sullivan, 1993; Tsuji, 1994;

Knudsen, 1997, 1998) y otros (Tateda, 1996; Ponte, 1996; Destache, 1996; Saladino, 1997).

Al parecer todos los antimicrobianos son capaces de producir in vivo EPAs de

acuerdo con los encontrados in vitro en cocos grampositivos (Zhanel, 1991). La excepción

puede ser precisamente la penicilina que produce en S. pneumoniae EPAs de

varias horas in vitro, pero no en ratón neutropénico (Craig, 1996), sin embargo otros

autores si han encontrado EPA in vivo con penicilina o ampicilina, discrepancia que

puede deberse a factores experimentales no controlados como variación en las

cepas, o en el método animal empleado.


Introducción 95

8.4.6. - Implicaciones sobre los regímenes de dosificación

Experiencias tempranas con penicilina G sugirieron que muchas infecciones

podrían ser tratadas adecuadamente con una terapia antimicrobiana intermitente,

aunque los niveles en suero y tejidos estén por debajo de la CIM durante horas. Por

ejemplo, la neumonía neumocócica, la escarlatina, y las infecciones estafilocócicas de

piel y tejidos blandos han sido tratadas con 80.000 a 300.000 unidades de penicilina G

administradas 1 o 2 veces al día.

El estudio de la eficacia del tratamiento continuo o del intermitente también se

ha abordado en una serie de modelos de infección animal para determinar la

dosificación óptima de penicilina G (Bergeron, 1981; Bakker, 1984), los resultados de tales

trabajos se atribuyen en parte al EPA (Sande, 1981; Craig, 1992; 1993).

Los datos más recientes de EPA sobre una amplia variedad de antimicrobianos

y microorganismos proveen de una teoría racional sobre la dosificación continua o

intermitente de antimicrobianos (Turnidge, 1991), dependiendo del microorganismo

infectante y el antimicrobiano utilizado. Una dosificación intermitente puede ser

aplicada en primera instancia a aquellas parejas microorganismo-antimicrobiano que

presentan un EPA prolongado. Por contra es necesaria una dosificación continua en

aquellas que carecen de EPA.

Existen muy pocos ensayos clínicos humanos que hayan estudiado la

diferencia de eficacia entre dosificación continua o intermitente de antimicrobianos

parenterales (Craig, 1992). Sin embargo si se han realizado ensayos con antibioterapia

oral en bronquitis e infecciones del tracto respiratorio superior, que han demostrado

que una dosificación dos veces al día es tan efectiva como una dosificación 3 o 4

veces diaria.

Existe una documentada eficacia de la dosificación espaciada de

aminoglucósidos en modelos animales, esta también a resultado con menor oto- y

nefrotoxicidad (Renneberg, 1989). Estas observaciones han llevado a la evaluación de una

dosificación una vez al día de los aminoglucósidos en humanos.

8.5. - Combinaciones de antimicrobianos

Las combinaciones antimicrobianas se han utilizado ampliamente para

proveer empíricamente una cobertura de amplio espectro en el tratamiento de

pacientes con procesos graves. Con menor frecuencia se emplean cuando se ha


Introducción 96

identificado un patógeno resistente a las dosis convencionales de un antibiótico pero

que en combinación puede conseguirse el efecto antimicrobiano. En ambos casos,

el resultado clínico puede depender de los efectos de las combinaciones

antimicrobianas contra los microorganismos individuales.

La aplicación de las combinaciones antimicrobianas para conseguir una

actividad in vitro y una eficacia clínica frente a microorganismos resistentes a la

inhibición o muerte, mediante dosis poco tóxicas, sigue siendo objetivo de

investigación intensiva por su gran importancia clínica.

Por todo lo anteriormente mencionado, es conveniente la verificación del

efecto sinérgico de una determinada combinación antimicrobiana contra un

patógeno. Igualmente importante sería utilizar los ensayos in vitro para descartar

interacciones antagónicas.

8.5.1. - Estudio in vitro de las combinaciones de antimicrobianos

La técnica de concentraciones cruzadas en tablero de ajedrez, ha sido utilizada

con frecuencia para el estudio de las combinaciones antimicrobianas. Sin embargo, la

limitación a la observación de crecimiento bacteriano (turbidez), ofrece solamente

datos de inhibición del crecimiento, de poca utilidad en cuanto las combinaciones

antimicrobianas se utilizan precisamente para obtener efectos bactericidas rápidos.

En segundo lugar, tanto el cálculo de los índices como la interpretación del

isobolograma, asumen incorrectamente que todos los antimicrobianos tienen una

relación lineal dosis-respuesta. Aunque los resultados del tablero cruzado a menudo se

utilizan para determinar la relación dosis-respuesta entre un antimicrobiano y un

microorganismo, el test origina normalmente respuestas del tipo todo o nada

(crecimiento o no), y es por tanto incapaz de medir una respuesta gradual necesaria

para elaborar una curva dosis-respuesta.

Finalmente, debido a que los resultados se obtienen al final de un período, los

resultados del tablero cruzado son principalmente estáticos, no aportan ningún dato

dinámico de la interacción antimicrobiana, y presentan disparidades con las técnicas de

cinéticas (Barr, 1990)

Curvas de muerte.

En contraste con la técnica de tablero cruzado, que sólo proporciona datos de

inhibición del crecimiento, la técnica de curva de muerte mide la actividad bactericida


Introducción 97

de la combinación. Por esta razón puede ser mas apropiada para estudiar procesos

correspondientes a situaciones clínicas en las que es deseable una acción bactericida.

Sin embargo, el recuento colonial repetido significa un tedioso y serio límite al

número de concentraciones y combinaciones testadas. Por ello es esencial que las

concentraciones ensayadas del antimicrobiano sean elegidas cuidadosamente a fin de

que sean representativas de las realmente pueden conseguirse in vivo en el lugar de la

infección.

La mayoría de los ensayos se realizan con inóculos de 105 a 107 UFC/mL,

obtenidos mediante la dilución de un cultivo nocturno ajustado a 0,5 de McFarland,

teniendo en cuenta la segunda dilución que se produce al añadir el antimicrobiano.

8.5.2. - Definiciones de la interacción antimicrobiana in vitro

A pesar de las diferencias en los métodos experimentales y de los criterios

para definir cuantitativamente los resultados de las combinaciones antimicrobianas,

existe una general aceptación en las definiciones cualitativas de sinergismo y

antagonismo.

Cuando no existe una interacción significativa entre las drogas, el resultado se

describe como aditividad o como autonomía. La aditividad viene dada cuando los

efectos observados por una combinación, equivalen a la suma de los efectos

separados. Autonomía (o indiferencia) se basa en el concepto de que, en un

momento dado, sólo una vía metabólica puede ser limitante de la tasa de

crecimiento. Según esto la autonomía supondría que el efecto de dos drogas que no

interactúan es simplemente el de la droga más activa.

Sinergismo- interacción positiva consistente en un resultado mayor que el

esperado cuando se usan independientemente los antibióticos, por efecto de su

acción combinada. Cuando ambos antimicrobianos matan, la definición de sinergia

exige que el efecto coordinado sea mayor que la suma de los efectos

independientes (aditividad).

Antagonismo- interacción negativa cuando el uso combinado de las drogas da

un resultado menor que el obtenible con los fármacos solos.

Las definiciones cuantitativas de interacción antimicrobiana con la técnica de

curva de muerte, se basan en los estudios realizados con enterococos,

aminoglucósidos y penicilina. Los resultados de la combinación son interpretados en


Introducción 98

función de la droga mas activa. Sinergismo se define como un incremento ≥100 veces

(≥2 log10) de la muerte en 24 horas con la combinación sobre la droga mas activa. El

antagonismo se define como un descenso ≥100 veces de la tasa de muerte en 24

horas de la combinación sobre la droga más activa. Aditividad o indiferencia se define

como cambios de ≤10 (≤1 log10) veces en la tasa de muerte en 24 horas con la

combinación, sobre la droga más activa. Las definiciones anteriores asumen que al

menos uno de los fármacos no produce inhibición significativa o muerte por si solo

(p.ej. aminoglucósidos frente a enterococos). Al presente no se han establecido

criterios para evaluar los resultados sobre sinergismo obtenidos, con la técnica de

curva de muerte, usando dos o más drogas con actividad antibacteriana por si solas.

Numerosos autores (Landesman, 1981; Schoenknecht, 1987; Barr, 1990; Friedland, 1994; Cormican,

1995b; Lhopital, 1996; Ferrara, 1997) aceptan como sinergia, una caída del recuento de

supervivientes igual o mayor a 2 log10 (UFC/mL) producida por la combinación

respecto a la producida por el más activo de los antimicrobianos.

8.5.3. - Interacciones antagónicas

8.5.3.1. - ß-lactámicos

Un ejemplo clásico de antagonismo entre antibacterianos fue publicado en un

estudio sobre meningitis neumocócica, donde los pacientes tratados con penicilina

más tetraciclina presentaban una tasa de muerte muy superior que los tratados solos

con penicilina (Eliopoulos, 1991 [Lepper, 1951]). Estos resultados clínicos posiblemente reflejan

la capacidad de las tetraciclinas de inhibir la acción bactericida de la penicilina in

vitro. Aunque el mecanismo exacto de este proceso no es conocido enteramente, si

se sabe que antimicrobianos bactericidas como la penicilina requieren que el

microorganismo sensible esté en crecimiento, y que la tetraciclina posee una acción

neta bacterioestática. Otros antimicrobianos bacteriostáticos como el cloramfenicol,

también antagonizan la acción bactericida de la penicilina o la cefotaxima. Un

mecanismo adicional para el Streptococcus pneumoniae en la acción de

antimicrobianos baceriostáticos que inhiben la síntesis proteica, es la inhibición de la

síntesis de autolisinas.


Introducción 99

8.5.3.2. - Fluorquinolonas

A pesar de los numerosos trabajos sobre interacciones de fluorquinolonas, las

combinaciones que han demostrado ser antagónicas son relativamente infrecuentes.

In vitro el cloramfenicol, la vancomicina y la rifampicina antagonizan la acción del

ciprofloxacino sobre cepas de S. aureus (Eliopoulos, 1991).

8.5.4. - Interacciones sinérgicas

Existen al menos cuatro mecanismos que producen sinergismo

antibacteriano: inhibición secuencial de la misma ruta metabólica (p.ej TMP/SMZ);

inhibición de enzimas protectoras bacterianas (p.ej. AMP/Ác. Clavulánico);

agentes que colaboran en modificar la pared celular (mecilinama + otros ß-

lactámicos); agentes que modifican la pared celular permitiendo la acción de otros

antimicrobianos (p.ej. penicilina + estreptomicina).

8.5.4.1. - Fosfomicina más ß-lactámicos

Las combinaciones de fosfomicina más ß-lactámicos han demostrado acción

sinérgica contra numerosos microorganismos. Sin embargo, debido a la fácil

aparición de mutantes resistentes a fosfomicina, no está claro si la interacción

positiva se debe a la eliminación de aquellos más que a una verdadera sinergia.

Los derivados del ácido fosfónico como la fosfomicina actúan en los primeros

pasos de la síntesis de la pared celular, inhibiendo las enzimas alanina-racemasa,

uridin-5´-difosfato N-acetil-muramil-L-alanina sintetasa y fosfoenolpiruvato sintetasa.

La interacción observada entre fosfomicina y ß-lactámicos, seguramente se debe a

la incidencia sobre dos puntos de la cadena de síntesis de la pared. La fosfomicina

además también afecta la síntesis de PFPs, lo que proporciona otro posible

mecanismo de interacción con los ß-lactámicos.

Frente a S. pneumoniae las combinaciones de fosfomicina más cefotaxima

(Barakett, 1993) y más ceftriaxona (Chavanet, 1995) han demostrado ser sinérgicas.

8.5.4.2. - Vancomicina más ß-lactámicos

La vancomicina actúa en un paso anterior a los ß-lactámicos, y ha

demostrado acción sinérgica en distintas combinaciones con ß-lactámicos (Barr, 1990;

Lacka, 1996). Al igual que fosfomicina, la interacción entre vancomicina y penicilina o


Introducción 100

ceftriaxona puede clasificarse como una inhibición secuencial sobre dos puntos

distintos de la síntesis de la pared.


Objetivos 101

Objetivo general

En las últimas décadas Streptococcus pneumoniae ha presentado una

disminución de sensibilidad a los antimicrobianos clásicos, además, existe un

aumento de su implicación en infecciones, especialmente graves en pacientes

inmunodeprimidos. Por ello, compete una revisión de la actitud terapéutica de las

infecciones neumocócicas, principalmente de aquellas graves como meningitis, o las

que afectan a pacientes inmunodeprimidos, que requieren de un tratamiento

rápidamente bactericida.

Es objetivo general de esta tesis, el estudio de factores farmacológicos que

pueden suministrar una base teórica para la obtención de la acción bactericida,

como la tasa de muerte bacteriana con relación al tiempo y a la concentración del

antimicrobiano, del efecto post-antibiótico a distintos tiempos de exposición y a

distintas concentraciones del antimicrobiano, y especialmente un enfoque en los

resultados bactericidas de algunas combinaciones de antibióticos frente a S.

pneumoniae.

Objetivos experimentales

1. - Acción bactericida

1.2. - Objetivos metodológicos

Dada la limitada estandarización de las técnicas para la determinación del

poder bactericida, nos hemos propuesto evaluar la influencia de algunos factores

experimentales en los resultados, mediante el estudio de los siguietes objetivos.

1.2.1. - Influencia de la variación en el tamaño del inóculo

Valorar la modificación de la acción antimicrobiana que puede originar la

variación del tamaño del inóculo realizado, comparando los resultados obtenidos con

los antimicrobianos enfrentados a distintas concentraciones del inóculo ajustadas a

las mismas condiciones experimentales.


Objetivos 102

1.2.2. - Evaluación del medio de cultivo empleado

Una importante dificultad técnica, en la realización y reproducibilidad de las

pruebas in vitro del neumococo, es su notoria tendencia a la autolísis. Queremos

evaluar el medio recomendado internacionalmente, caldo Mueller-Hinton Broth

catión ajustado y suplementado con sangre de caballo lisada (MH2+5%SCL), en su

capacidad para mantener viables los cultivos, y para ello comparamos los resultados

obtenidos con un medio caldo sin sangre Brain Heart Infusion (BHI Oxoid CM 225)

empleado en anteriores experiencias, y los obtenidos en la experiencia actual con el

medio recomendado.

1.3. - Curvas de letalidad

Estudiar mediante el método de recuento de viables, para un rango de

concentraciones de antimicrobianos diferentes, la acción bactericida respecto al

tiempo en cepas penicilina sensibles, intermedias y resistentes. Los estudios in vitro

de la cinética de muerte, mediante curvas de letalidad, constituyen una primera fase

en el estudio y comparación de la actividad bactericida y sinérgica de los

antimicrobianos en combinación. Este conocimiento es esencial en los casos que,

como meningitis o inmunodeprimidos, la capacidad y rapidez bactericida de un

antimicrobiano son cruciales para la vida del paciente (Drusano, 1988; Chesney, 1995).

1.4. - Efecto post-antibiótico

Comprobar el efecto post-antibiótico que puede producir la penicilina, sobre S.

pneumoniae resistente a penicilina. Además interesa comparar con el EPA que

pueden producir antimicrobianos alternativos, especialmente desde el punto de vista

del tratamiento de las meningitis donde por diversas causas, no siempre se consigue

mantener concentraciones por encima de la CIM.

1.4.1. - Efecto de la concentración del antimicrobiano sobre el efecto

post-antibiótico

Comprobar el efecto post-antibiótico respecto al tiempo, que se puede

conseguir con las diferentes concentraciones de cada antimicrobiano, por el método

de dilución y recuento de viables en cepas intermedias y resistentes a penicilina


Objetivos 103

1.4.2. - Efecto del tiempo de exposición sobre el efecto post-antibiótico

Comparar, en cepas penicilina intermedias y resistentes, el efecto post-

antibiótico respecto al tiempo, conseguido con diferentes tiempos de exposición a

cada antimicrobiano.

1.5. - Combinación de antimicrobianos

Examinar, en cepas penicilina intermedias y resistentes, la acción bactericida

respecto al tiempo, conseguida con diferentes concentraciones y proporciones en

diversas combinaciones de antimicrobianos. El uso de las combinaciones

antimicrobianas tiene generalmente una base empírica, sin embargo el resultado

clínico puede depender de la acción de la combinación contra cierta clase de cepas,

por lo que conviene la verificación del efecto sinérgico.


Material y métodos 105

MATERIAL Y MÉTODOS

1. - Material

1.1. - Cepas

Las cepas fueron seleccionadas procedentes de un trabajo previo (García López,

1996), sobre sensibilidad en neumococos aislados durante el período de Enero 1994

a Febrero 1996, en la rutina normal de laboratorio de diversas muestras clínicas

enviadas al Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen de la Victoria

de Málaga, y a la Unidad de Microbiología del Hospital Infanta Margarita de Cabra,

Córdoba

1.2. - Selección de cepas.

Clasificamos para los diversos estudios con los diferentes antimicrobianos, las

cepas de Streptococcus pneumoniae de acuerdo con su sensibilidad al antibiótico de

referencia la penicilina.

Tabla 9: Selección de cepas.

Penicilina

(categorías)Técnica Nº de cepas

S I R

Acción bactericida 9 3 3 3

Efecto post-antibiótico 4 - 2 2

Combinaciones 10 - 5 5

1.2.1. - Caracterización e identificación.

Las cepas fueron identificadas como pertenecientes a la familia

Streptococcaceae, siguiendo los criterios habituales en el laboratorio de

microbiología clínica (Fackland, 1987). El origen de la cepa infectante, su morfología

colonial y la actividad hemolítica en placas de agar sangre, son las características

usadas para determinar las pruebas a realizar. El género Streptococcaceae y la



especie S. pneumoniae pueden identificarse presuntivamente con un mínimo de

pruebas simples y de forma más exacta y completa por medio de procedimientos

serológicos.

1.2.1.1. - Pruebas morfológicas.

1.2.1.1.1. - Morfología celular.

Tinción de Gram: células esféricas Gram positivas de 0.6 a 1.2 �m de

diámetro, formando parejas que presentan los extremos distales en punta, o

cadenas de longitud corta (Deibel, 1974).

1.2.1.1.2. - Morfología colonial.

Las colonias neumocócicas después de 18-24 horas de incubación en agar

sangre en atmósfera de anhídrido carbónico, son típicamente lisas con bordes

enteros, rodeadas por una zona pequeña de lisis incompleta (alfa- hemólisis) aunque

en algunas cepas la lisis de eritrocitos puede faltar por completo (no hemólisis)

(Musher, 1995). En el medio selectivo agar sangre -nalidíxico, las características

coloniales son las mismas que en agar sangre. Con el tiempo presentan un aspecto

de ficha de damas debido al colapsamiento del centro de la colonia por la lisis

celular, llegando a aparecer una depresión central anular con un botón central que le

da a la colonia un aspecto de pulsador. Los neumococos del grupo III producen

colonias mucosas (Austrian, 1996).

1.2.1.2. - Pruebas diagnósticas.

A los microorganismos seleccionados como presuntos neumococos por las

características mencionadas anteriormente, los sometimos a una serie de pruebas

para su identificación.

En el laboratorio microbiológico de rutina a los neumococos los identificamos

por tres reacciones: (1) la llamada alfahemólisis en agar sangre, (2) la negatividad

con la prueba de la catalasa y (3) la solubilidad en sales biliares o la susceptibilidad

a la etilhidrocupreína (optoquina) (Musher, 1995).



1.2.1.2.1. - Pruebas clásicas.

1.2.1.2.1.1. - Sensibilidad a la optoquina.

Usamos específicamente el disco de optoquina para diferenciar el

Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de Streptococcus

(resistentes) (Mac Faddin, 1980). Discos de 5 µg de clorhidrato de etilhidrocupreína

(optoquina) en placa de agar-sangre recién sembrada y observando a las 24 horas

el halo de inhibición de 15 mm o mayor alrededor del disco.

En los últimos años se han aislado varias cepas resistentes a la optoquina,

por lo que esta prueba puede no bastar para la identificación definitiva (Muñoz R., 1990;

Borek, 1997). En nuestro caso no encontramos cepas resistentes a la optoquina.

1.2.1.2.1.2. - Solubilidad en bilis.

Se basa en la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en

presencia de sales biliares, en un tiempo y temperatura específicos. Empleamos

generalmente dexoxicolato de sodio o taurocolato de sodio ya que son los

componentes líticos más activos. El proceso es complejo y no bien dilucidado.

Técnica directa: depositamos unas gotas de solución de desoxicolato sódico

al 2 % p/v sobre algunas colonias aisladas y observamos su lisis en 5-10 minutos

(Mac Faddin, 1980).

1.2.1.2.2. - Pruebas inmunoespecíficas.

De las diversas pruebas basadas en el uso de anticuerpos específicos contra

Streptococcus pneumoniae, hemos utilizado en su identificación definitiva, y como

control interno, una de las basadas en la determinación polivalente de antígeno

capsular (Slide pneumo-kit bioMerieux 58 821).

1.2.1.2.3. - Serotipado.

Las colonias identificadas como Streptococcus pneumoniae pueden

identificarse serológicamente por la reacción de quellung.. Las células de una sola

colonia, suspendidas en una gota de solución salina fisiológica, o las procedentes de

un cultivo en caldo pueden examinarse directamente. Mezclando con los antisueros

específicos en un porta, añadimos azul de metileno para favorecer el contraste y

observamos al microscopio con iluminación oblicua (Facklam, 1985). La reacción positiva

de quellung se debe a la unión del polisacárido capsular con el antisuero tipo



específico. El consiguiente cambio del índice de refracción hace que la cápsula

parezca hinchada, aunque sólo se hace más visible. La célula neumocócica se tiñe

de azul oscuro y está rodeada de un halo netamente marcado que corresponde al

borde externo de la cápsula. La agrupación serológica se realiza, en la mayoría de

los casos, con los antisueros del Instituto Nacional de Sueros de Copenhague,

Dinamarca (Casal J., 1982; Fenoll, 1989; Bogaerts, 1993; Barnes 1995, Scott, 1996). Todas las cepas las

remitimos para su serotipado, al Laboratorio de referencia de neumococos del

Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid

(Tabla 10).

Tabla 10: Serotipos de las cepas estudiadas

Cepa nº Serotipo

9679C 35

3923M 23F

2150M 23F

52190M 23F

40532M 19

9457M 14

9036M 14

4699C 9V

2461M 9V

4477C 7

16109M 6B

12087M 6B

19633M Nt

Nt: no tipada

1.2.2. - Cepas controles.

Empleamos como cepas controles en algunas de las técnicas, los

Streptococcus pneumoniae de la American Type Culture Collection (Rockville, Md):

ATCC® 6303 (Thorburn, 1998) y la recomendada internacionalmente ATCC® 49619.



Tabla 11: Control de calidad.

Rangos de concentración mínima inhibitoria (CMI) (µg/mL)

para Streptococcus pneumoniae ATCC ® 49619.

Antimicrobianos CIMs (µg/mL)

Penicilina 0,25 - 1,00

Ceftriaxona 0,03 - 0,12

Imipenem 0,03 - 0,12

Esparfloxacino 0,12 - 0,50

Vancomicina 0,12 - 0,50

(NCCLS, 1997: M7-A4, tabla 3C modificada; Fuchs, 1997).

1.3. - Medios de cultivo bacteriano.

1.3.1. - Medios para la conservación de cepas.

Las cepas seleccionadas las conservamos preparando una suspensión alta

en medio MHB-II (ver sección 1.3.3.3.1) partiendo de un cultivo puro de 18 horas,

mezclado a partes iguales con leche desnatada (Bacto skim millk Difco ref. 0032-01-

1) previamente esterilizada en alícuotas Eppendorf. Las congelamos a -40ºC hasta

su uso. Repetimos este proceso cada 2 meses, para garantizar la viabilidad de las

cepas al no disponer de un sistema de congelación más efectivo.

1.3.2. - Medios de aislamiento.

Para los aislamientos utilizamos placas comerciales de agar sangre con una

proporción de sangre de carnero del 5 % y pH final de 7,3.

Los cultivos primarios y los aislamientos los incubamos en atmósfera de CO2

a 37° C.



1.3.3. - Medios empleados en las técnicas.

1.3.3.1. - Técnica de difusión en agar.

Para esta técnica hemos empleado placas del medio Mueller-Hinton II Agar

con 5% de sangre de cordero, elaboradas comercialmente (bioMérieux c/ Manuel

Tovar, 36 28034 Madrid, referencia 43 321).

1.3.3.2. - Técnica Etest®.

Usamos el medio Mueller-Hinton II Agar (bioMérieux ref. 51075). Preparado

según las instrucciones del fabricante, con suplemento de 5% de sangre de caballo

lisada (ver apartado 1.3.3.3.2), y dispuesto en placas de 150 mm.

1.3.3.3. - Técnica por dilución en caldo.

Empleamos el medio recomendado (NCCLS, 1997: M7-A4). MHB-II o MHBCA.

Ajustado con las sales necesarias para proporcionar de 20 a 25 mg por litro de calcio

(Ca++), y 10 a 12,5 mg por litro de magnesio (Mg++). Bajo contenido en timina y

timidina,.suplementado con 5% de sangre de caballo lisada y pH final de 7,3 (+/-

0,1).

1.3.3.3.1. - Caldo Mueller-Hinton II

Ajustado en cationes (MHBCA o MHB-II). (BBL lote 1000A8DFKF). El medio

lo preparamos según las instrucciones del fabricante, suspendiendo 22 g de polvo

en un litro de agua purificada y calentando a baño María hasta su disolución

completa. Lo envasamos en tubos de cristal de 15 mL con tapón a rosca, que

esterilizamos entre 116 y 121 ºC durante 10 minutos procurando evitar

calentamientos excesivos. Le elaboramos periódicamente, conservándolo en

frigorífico a 4 ºC. Controlamos la esterilidad de cada tubo observando su

transparencia, y la del lote mediante siembras en agar sangre en atmósferas CO2 y

anaerobia.



Con 5% de sangre de caballo lisada. (MHB-II+5%LHB). Al medio anterior

añadimos asépticamente la cantidad necesaria de LHB 50% para obtener una

concentración del 5%. Realizamos un control de esterilidad mediante siembras en

agar sangre en atmósferas CO2 y anaerobia.

1.3.3.3.2. - Sangre de caballo lisada.

Elaboración de la sangre de caballo lisada (LHB) (NCCLS, 1997: M7-A4). Sangre

desfibrinada de caballo (bioMérieux ref. 55833). Lisamos los hematíes mediante un

número suficiente de ciclos de congelación y descongelación consecutivas,

añadimos asépticamente agua destilada estéril a partes iguales (LHB 50%) y

centrifugamos a 12.000 x g durante 20 minutos. Decantamos el sobrenadante que

debe resultar diáfano, centrifugando otra vez si es necesario.

1.4. - Antimicrobianos.

1.4.1. - Selección de antimicrobianos.

Hemos utilizado para este estudio antimicrobianos ampliamente

recomendados en la literatura para las infecciones por Streptococcus pneumoniae.

Seleccionamos los más apropiados de acuerdo con la bibliografía existente y la

práctica en el tratamiento de las enfermedades infecciosas (Klugman, 1994; Friedland, 1994b;

Cassinat, 1994; Musher, 1995; Bradley, 1995; Lister, 1995; Paris, 1995; Sanford, 1998).

1.4.2. - Selección del rango de concentraciones.

El rango y las concentraciones específicas ensayadas de cada antimicrobiano

los escogimos en acuerdo con los niveles que podemos conseguir en humanos

(Gerding, 1996; Amsdem, 1995; Morrissey, 1997) y con los puntos de corte interpretativos publicados

(NCCLS, 1997: M7-A4; Amsterdam, 1996).

1.4.3. - Preparación y almacenamiento.

Todas las sustancias fueron suministradas con potencia valorada por los

fabricantes o por otras fuentes comerciales. Los polvos valorados fueron

almacenados según instrucciones del fabricante o a - 40ºC y utilizados dentro de su

período de caducidad. De los antimicrobianos pesamos la suficiente cantidad con

una balanza analítica para obtener soluciones madre, según las recomendaciones

del fabricante y las publicadas (NCCLS, 1997: Vol.17 nº2 Tabla 4). Esta dilución la empleamos



una sola vez o la congelamos a -40 ° C según los casos. De la solución anterior,

obtuvimos por dilución la solución de trabajo. Estas las desechamos siempre

después de su uso.

1.4.4. - Soluciones de antimicrobianos.

1.4.4.1. - Penicilina G sódica.

Penicilina G sódica (Bencilpenicilina). Vial de sustancia valorada

proporcionado por CEPA, S.L. Paseo de la Castellana, 141. 28046 Madrid.

Preparamos con agua destilada estéril, soluciones madre de 5120 µg/mL que

congelamos asépticamente en alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 1 mes.

1.4.4.2. - Vancomicina.

Vancomicina clorhidrato. Viales de polvo valorado con 101,4 mg/vial (USP).

Laboratorio Eli Lilly & C. lote RS0171, proporcionados por Lilly S.A. Avda. de la

Industria, 30. 28100 Madrid. Preparamos con agua destilada estéril, soluciones madre

de 5120 µg/mL que congelamos asépticamente en alícuotas a -40ºC. Conservación

a -40ºC 3 meses.

1.4.4.3. - Ceftriaxona.

Ceftriaxona sal disódica (RO-13-9904/001). Procedencia Laboratorio Roche

(F. Hoffmann - La Roche LTD, CH-4002 Basel, Switzerland), proporcionado por

Roche, S.A. Carretera de Carabanchel a Andalucía s/n. Apdo. de Correos 1157.

28080 Madrid. Vial de 1000 mg lote B0453 potencia declarada 845 µg/mg.

Elaboramos con agua destilada estéril, soluciones madre de 5120 µg/mL que

congelamos asépticamente en alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 3 meses.

1.4.4.4. - Imipenem.

Imipenem (N-Formimidoyl thienamicin monohidrate). Procedencia Laboratorio

Merck, Sharp & Dohme. West Point, PA 19486 USA. Vial de 100 mg lote 7019A

potencia declarada 924 µg/mg (92,4 mg). Proporcionado por MS&D de España, S.A.

c/ Josefa Varcálcer, 38. 28027 Madrid. Elaboramos asépticamente soluciones

extemporáneas, disolviendo el polvo valorado y diluyendo hasta la solución de

trabajo, con solución fosfato pH 7.2 - 0,01 M esterilizada por filtración.



Solución tampón fosfatos de Sörensen.

Solución A: PO4Na2H (M/15) 9,45 g de reactivo anhidro en un litro de agua

destilada estéril.

Solución B: PO4KH2 (M/15) 9,08 g de reactivo anhidro en un litro de agua

destilada estéril.

Solución pH 7.2 - 0,01 M: 71,5 mL (A) + 28,5 mL (B) y dilución a 1/10 de la

mezcla. Esterilización por filtración. Controlamos el pH.

1.4.4.5. - Fosfomicina.

Fosfomicina (Phosphomycin disodium salt C3H5Na2O4P: solubilidad 50 µg/mL

agua). Vial del Lote: E-668 de potencia declarada 748 mg/g proporcionado por

CEPA, S.L. Paseo de la Castellana, 141. 28046 Madrid. Preparamos con agua

destilada estéril, soluciones madre de 12800 µg/mL que congelamos asépticamente

en alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 1 mes.

D-Glucosa 6 fosfato monosódico Sigma (G7879).

Elaboramos con agua destilada estéril, soluciones madre de 400 µg/mL que

congelamos asépticamente en alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 1 mes.

1.4.4.6. - Esparfloxacino.

Esparfloxacino. RP 64206 Rhone-Poulenc-Rorer 13 Quai J Guesde BP 14

94403 Vitry sur Seine CEDEX, proporcionado por RPR, S.A. Avda. de Leganés, 62.

28925 Madrid. Vial de 1 gramo de sustancia valorada lote MIJ500 con potencia

declarada del 99,9%. Solubilidad del polvo 20 mg en 1 mL de 0,1N NaOH.

Disolvimos el polvo con agua destilada y estéril añadiendo gotas de NaOH 0,1N en

cantidad suficiente, completando luego con agua hasta la concentración deseada.

Elaboramos soluciones madre de 5120 µg/mL que congelamos asépticamente en

alícuotas a -40ºC. Conservación a -40ºC 1 mes.



2. - Métodos

2.1. - Prueba de sensibilidad por el método disco-placa

Usamos el método de sensibilidad con discos de oxacilina (1 µg) como un

screening para la detección de cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes a

penicilina (NCCLS, 1997: M2-A6).

Preparamos el inóculo mediante la suspensión de las suficientes colonias en

BHI para obtener una turbidez aproximada al 0.5 de McFarland, y sembramos en

placas de Mueller-Hinton suplementado con 5 % de sangre de carnero, que

incubamos en estufa de CO2 a 37 ° C durante 24 horas. El punto de ruptura se

estableció para un halo con diámetro de 20 mm (Jacobs, 1979), determinando como

sensibles a penicilina aquellas cepas con un halo de inhibición de ≥ 20 mm de

diámetro y resistentes (intermedias o altas) la que presentan un halo de diámetro

menor de 20 mm La incubación en atmósfera de CO2, aunque no es necesaria para

las técnicas de microdilución, se recomienda (NCCLS, 1997: M2-A6, pág. 20) para obtener un

crecimiento fiable en la superficie del agar.

2.2. - Concentración inhibitoria mínima (CIM).

2.2.1. - Método de microdilución en caldo.

Las CIMs fueron determinadas por el método de microdilución recomendado

por el National Committee For Clinical Laboratory Standards 1997(NCCLS, 1997: M7-A4),

Esta técnica permitió confirmar la selección previa de las cepas a estudiar, y

clasificarlas según la CMI a penicilina.

2.2.1.1. - Preparación del inóculo.

Para la preparación del inóculo partimos de un cultivo puro en agar de 18-20

horas, tomamos varias colonias que inoculamos en un caldo Mueller-Hinton II sin

sangre hasta conseguir una turbidez de un estándar 0,5 de McFarland lo que

equivale aproximadamente a 108 UFC/mL. Pipeteamos 125 µL de esta suspensión

estandarizada en un tubo de tapón roscado que contenga 12,5 mL de Mueller-Hinton

II con 5% de sangre lisada de caballo. Mezclando bien, la suspensión bacteriana

obtenida es aproximadamente de 106 UFC/mL.



2.2.1.2. - Rango de concentraciones estudiadas.

Tabla 12: Rango de estudio de las CMIs

Antimicrobiano Rango (µg/mL)

(11 diluciones)

Penicilina 16 - 0,016

Vancomicina 16 - 0,016

Ceftriaxona 16 - 0,016

Imipenem 16 - 0,016

Fosfomicina 512 - 0,50

Esparfloxacino 16 - 0,016

2.2.1.3. - Desarrollo de la técnica.

En placa microtiter de 8x12 pocillos, estéril, para un antibiótico y ocho cepas.

Cada paso lo realizamos con puntas nuevas estériles desechables.

1. - Añadimos a todos los pocillos 50 µL de MHBCA+5%LHB

(aproximadamente 5 mL por placa)

2. - Añadimos en la primera columna 50 µL de la solución antibiótica a la

concentración cuádruple de la máxima deseada. Queda el antibiótico a

concentración doble.

3. - A partir de la primera columna, doblediluímos 10 veces dejando la última

columna sin antibiótico como control.

4. - Añadimos a todos los pocillos 50 µL del inóculo 106 UFC/mL, queda por

pocillo 5x105 UFC y las concentraciones deseadas.

5. - Del pocillo control sembramos 1 µL para recuento del inóculo.

6. - Incubamos a 35ºC con tapa, 20-24 horas antes de la lectura.

7. - Lectura: consideramos crecimiento significativo una turbidez definida o un

botón mayor o igual a 2 mm. El punto final correspondiente a la CMI es el de mínima

concentración del antimicrobiano que inhibe el crecimiento detectable a simple vista

(comparando con el pocillo control sin antibiótico). (Landesman, 1981; Mazulli 1990; NCCLS, M7-A4:

1997).



2.2.2. - Método Etest®.

El método comercial PDM Epsilómetro o Etest® (AB

Biodisk, Solna, Sweden) es una técnica incorporada al

laboratorio de microbiología en esta última década, ha sido

empleada por numerosos autores para el estudio de la CMI

en neumocos y otros patógenos (Baker, 1991; Kriser, 1994; Macias, 1994;

Bolmstrom, 1994; Skulnick, 1995). Se trata de un transportador inerte,

una tira de plástico poroso de 5 mm de ancho por 5 cm de

largo (Fig. 20), con un gradiente continuo del agente

antimicrobiano, equivalente a 15 diluciones dobles

progresivas, aplicado en una cara de la tira. El proceso es

semejante al de difusión en agar con disco. La técnica

consiste en sembrar sobre toda la superficie de una placa de

agar MH un inóculo estandarizado, luego depositamos la tira y tras la incubación,

leemos la CMI donde la curva de la elipse de inhibición cruza con la tira graduada

(Acard y Goldstein, 1996).

2.2.2.1. - Estandarización del inóculo.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante y de algunos autores (Jorgensen,

1994; Tenover, 1996). El inóculo lo preparamos, por el método directo de suspensión

colonial en caldo Mueller-Hinton II ajustando a una turbidez de 0,5 de McFarland; 1

de McFarland para cepas mucosas, y utilizando la suspensión antes de 15 minutos.

2.2.2.2. - Desarrollo de la técnica Etest®.

1. - El inóculo estandarizado, lo sembramos sobre la superficie de una placa

de Mueller-Hinton II con 5% de sangre de caballo lisada, con un escobillón en tres

direcciones y dejamos secar.

2. - Aplicamos las tiras e incubamos a 37ºC en

atmósfera de CO2, por un período completo de 24 horas.

2.2.2.3. - Lectura de las CIMs Etest®.

Siguiendo las instrucciones del fabricante, leímos

la CMI usando una luz oblicua y observando la inhibición

completa de cualquier tipo de crecimiento incluyendo

Fig. 20: Tira de Etest

Fig. 21: Disposición y lectura

en placa de 150 mm



microcolonias o colonias aisladas dentro de la elipse de inhibición. En los casos de

valores intermedios de CIM, redondeamos a la dilución superior más próxima. Se ha

publicado discrepancias entre microdilución y Etest, en el ensayo de vancomicina

frente a S. pneumoniae (Hashemi, 1996).

2.3. - Acción bactericida. Curva letal.

La determinación de la velocidad microbicida o el establecimiento de una

curva letal ha sido ampliamente aplicado a la evaluación y comparación de nuevas

drogas y al estudio de diferencias y cambios en la susceptibilidad antimicrobiana

(Decazes, 1983; Schoentnecht, 1987; Potel, 1991; Hohl, 1990; Carret, 1991; Ackerman, 1992; Friedland, 1994; Keil, 1995;

Visalli, 1996-97; Spangler, 1996-97; Klugman, 1996 Corvasier, 1998), especialmente cuando se pretende

valorar la rapidez de la acción bactericida.

2.3.1. - Preparación del inóculo.

Previamente para cada cepa realizamos un estudio de la densidad celular del

inóculo, suspendiendo de 4 a 5 colonias procedentes de un cultivo en AS de 18-20

horas, en caldo Mueller-Hinton II sin sangre, e incubando hasta conseguir o superar

una turbidez (absorbancia) comparable al 0,5 de la escala de McFarland* con el

espectrofotómetro† ajustado en 625 nm. Este enturbiamiento corresponde

aproximadamente a 2-3 x108 UFC/mL y normalmente lo conseguimos mediante un

cultivo nocturno de 12 -18 horas (NCCLS, 1997: M2-A6; pág. 23).

Este proceso lo repetimos reajustado, para elaborar el inóculo 2-3 x108

UFC/mL y a partir de éste realizamos la dilución de trabajo en Mueller-Hinton II +

5%LHB mediante dilución 1/100, obteniéndose una concentración aproximada de

5x105 UFC/mL, que constituye el inóculo utilizado. El inóculo de trabajo lo

elaboramos una hora antes de la exposición a antibióticos y usamos Mueller-Hinton

II + 5%LHB precalentado a 37ºC a fin de reducir la fase de retardo y favorecer la

rápida instauración del período de crecimiento logarítmico (Peterson, 1978; Friedland, 1994; Doit,

1997).

* Patrón 0,5 McFarland BaSO4. P.ej. 250 �L [0,048M/L BaCl2] o [1,1175 % p/v BaCl2x2H2O] + 4750 �L [0,18 M/L

(0,36N) SO4H2 (1%v/v). Debe presentar una absorbancia de 0,08 - 0,1 a 625 nm en cubeta de 1 cm.† Spectronic, Bausch and Lomb Inc., Rochester,NY



Tabla 13: Factores técnicos que afectan las curvas de muerte y condicionesasumidas en este trabajo.

Factores Efectos Condiciones experimentales

Concentración del antimicrobiano Existen antimicrobianos conefectos muy dependientes dela dosis como quinolonas,mientras que otros como ß-lactámicos la dependencia esmucho menor

Se emplea rangos deconcentracionesrecomendados, reproduciblesen humanos.

Fase del crecimiento En la fase estacionariaaumenta los supervivientes; elefecto paradógico (Eagle)aumenta en la faselogarítmica tardía

Tamaño del inóculo Con altos inóculos seobtienen menores tasas demuerte.

La fase de crecimiento y eltamaño del inóculo secontroló de igual forma entodas las técnicas. Ajustandoun inóculo de 8 - 10 horas al0,5 McF, y preincubando 1 - 2horas antes de la exposicióna los antibióticos.

Temperatura de incubación La tasa de crecimiento tieneun rango óptimo detemperatura

Las placas se incubaron alaire en estufa a 37ºC. Y sereincubaron inmediatamentetras cada período demuestreo (máximo 5 minutos)

Medio de cultivo y contenido encationes.

Sobre el desarrollo óptimo yla reproducibilidad del test

Se usó el mediorecomendado Muller-Hinton 2con 5% LHB y ajustado encationes

Tipos de tubos o pocillos La adhesión a las superficiescargadas electrostáticamentevaría según el materialpudiendo dar falsosresultados.

Modo de inoculación La adhesión por encima delmenisco, puede ser eliminadainoculando en pequeñosvolúmenes por debajo delmenisco, y agitando

Agitación Un sistema de agitación esnecesario para resuspenderlas células, favoreciendo eldesarrollo en medio líquido ypermitiendo tomar muestrasrepresentativas.

Las placas de incubación demantuvieron en agitación(175-180 rpm) durante todo elproceso. Las inoculacionesde antimicrobiano serealizaron con pipetasautomáticas con puntasdesechables que sirvieronagitar la mezcla. Losmuestreos se realizaron conasas calibradas o puntas depipeta desechables, agitandopara tomar una muestrahomogénea

Arrastre de antibiótico o de inóculobacteriano

Se pueden obtener falsosresultados negativos cuandoarrastramos antibióticos aaltas concentraciones, ofalsos resultados positivos siarrastramos altos inóculosbacterianos

Aunque no se utilizaron altasconcentraciones deantimicrobiano (máximo 4CIM), el sistema de dilucionesdecimales para recuento,manifiesta si existe inhibiciónpor arrastre de antibióticocuando alcanza la diluciónsuficiente. En cada paso demuestreo o dilución secambiaron las puntas depipeta desechables.

Reincubación del medio libre deantibióticos

Puede ser necesaria unaincubación de 48 horas, paraapreciar los resultados

La lectura se realizó en 24 o48 horas según lascaracterísticas de la cepa.

Adaptado de Schoenknecht y col. 1985



2.3.2. - Cepas estudiadas.

Tabla 14: Cepas estudiadas en curvas de letalidad.

Cepa nº CMIpenicilina (µg/mL) Categoría (penicilina)

4477 0,063 S

9679 0,012 S

ATCC 6303 0,063 S

19633 0,500 I

2461 1,000 I

9036 1,000 I

3923 2,000 R

9457 2,000 R

12087 2,000 R

2.3.3. - Concentraciones probadas de antimicrobianos.

Tabla 15: Concentraciones probadas de antimicrobianos (µg/mL).

Penicilina Vancomicina Ceftriaxona Imipenem Esparfloxacino

4,00 2,00 4,00 1,00 4,00

2,00 1,00 2,00 0,50 2,00

1.00 0,50 1,00 0,25 1,00

0,125 0,25 0,50 0,125 0,50

0,062 0,125 0,125 0,015 0,25



2.3.4. - Técnica.

2.3.4.1. - Material.

Empleamos, para cada inóculo bacteriano y cuatro

antimicrobianos, una placa de propileno rígido, estéril,

desechable y con tapa, de 4 x 6 pocillos, cada pocillo con

una capacidad máxima de dos mililitros (Pearson, 1980; Barry y

Lasner, 1979). Incubamos en estufa a 37ºC y en agitación*.

Para evitar el arrastre de antibiótico o cultivo bacteriano, en

cada transferencia utilizamos puntas estériles nuevas y

desechables (Barry, 1979)

Uso de placas. Se requiere una cantidad

considerable de antimicrobianos y medio para realizar la técnica

mediante filas de tubos. Por ello preferimos por su mejor

practicabilidad y menor requerimiento de material el uso de

placas de pocillos. Aunque los volúmenes empleados son

menores (2 mL), la información producida es básicamente

similar. Sin embargo existen al menos dos problemas

potenciales en la adaptación a placas, que no encontramos en

el test de tubos.

Evaporación. Debido a que el volumen de cada pocillo

es de 2000 •L, una pequeña evaporación puede originar un incremento significativo

de las concentraciones de los antimicrobianos que produzca una reducción de las CIM

o CBM. Esto puede prevenirse utilizando película plástica o etiquetas adhesivas, o

como en nuestro caso, utilizando placas con tapa que posee para cada pocillo un

reborde que ajusta evitando la evaporación y el paso de material de un pocillo a otro.

Electricidad superficial. La electricidad estática puede acumularse en las placas,

interfiriendo la disolución del antimicrobiano, o la floculación de las células bacterianas

en cuyo caso podría dar resultados falsos. Dado que los antimicrobianos añadimos los

antimicrobianos disueltos, y el medio estaba en agitación contínua, no creemos que

este problema influya significativamente.

* Agitador orbital regulable bioMerieux a 175 rpm dentro de la estufa a 37ºC.

Fig.22 Placa de cultivo 6x4 en

agitación e incubación aerobia a

37ºC.

Fig. 23 : Placa de cutivo

6x4 pocillos




1. - Preparación de los antimicrobianos.

(A). - Realizamos la predilución de la solución madre antibiótica 5120 µg/mL a

800 µg/mL.

(B). - A partir del 800 µg/mL en placa microtiter doblediluyendo con MHB-II,

obtenemos las prediluciones necesarias: 400; 200; 100; 50; 25; 12,5; etc. µg/mL

2. - Preparación del inóculo. En todos los pocillos pusimos 2000 µL del

inóculo [105 - 106 UFC/mL]:

3. - Añadimos 20 µL de las soluciones correspondientes a cada pocillo con

200 µL de medio (tiempo 0), lo que supone una dilución 1/100.

4. - Incubación de la placa: a 37ºC, en agitación y tapada.

2.3.4.3. - Lectura.

La lectura la realizamos mediante recuentos de las siembras. El volumen de

caldo subcultivado debe ser lo suficientemente grande para detectar poblaciones del

orden de 1x102 UFC/mL (0,01% del inóculo inicial 105 - 106), pero no tan grande que el

antibiótico transportado produzca resultados falsos negativos (Barry, 1979).

Periodicidad de la siembra: Hora 0: Recuento del inóculo inicial del pocillo

control. Horas 2, 4, 6, 8, 10 y 24: Recuento de cada pocillo con antibiótico y pocillo

control.

Técnica de la siembra:

(A). - Directamente de cada pocillo tomamos

con pipeta 10 µL que sembramos en gota sobre

una placa de agar-sangre (equivale a la

dilución 1/100), y sin cambiar la punta

ponemos otros 10µL en el primer pocillo de

la placa de diluciones decimales (placa

microtiter con 100µL de solución salina

estéril en cada pocillo). Incubamos

inmediatamente la placa con el cultivo en la estufa.

(B). - Diluciones 1/10. Con la pipeta multicanal, 8 veces: diluir 10µL en 100µL.

Sembramos gotas de 10µL de cada dilución, empezando por la más diluida (1x10-10),

en la mitad de una placa según el orden establecido (Figura 24).

10-3

10-4

10-5

10-6 10-8

10-9

10-7

10-10

Fig. 24: Disposición de siembra de lasgotas de 10 µL para recuento,

equivalencias de dilución



Dilución salina. Como normalmente la desarrollamos, en este método y en los

siguientes, usamos una placa de pocillos microtiter con 100µL de solución salina estéril

para realizar diluciones seriadas del inóculo, que después sembramos.

Lectura: Procedimos al recuento de viables, leyendo el inóculo

correspondiente a la mayor dilución que presentaba algún crecimiento, expresándolo

como UFC/mL, tras 24-48 horas de incubación a 37 ° C de las placas de agar

sangre.

Limitaciones y precauciones en el desarrollo de la técnica. Aunque las

diferencias significativas entre antimicrobianos o combinaciones de antimicrobianos

normalmente se definen como variaciones del orden de 10 a 100 veces el número

de UFC/mL (1-2 log) después de 4 a 24 horas de incubación (Craig y Gudmunsson, 1996). Si

esperamos que el recuento colonial sea muy bajo, conviene sembrar una alícuota de

la muestra sin diluir. Oviamente no podemos emplear la misma punta empleada para

tomar la muestra directa para las diluciones, debido al potencial arrastre de

microorganismos. Y en algunos casos, debemos comprobar que el arrastre del

antimicrobiano no es lo suficientemente grande para dar falsos resultados. Esto no

suele ser un problema cuando el recuento lo realizamos mediante diluciones

decimales de una pequeña muestra (10µL), donde a partir de las primeras

diluciones la cantidad de antimicrobiano resulta inapreciable. Es importante tener en

cuenta, que para aquellos antibióticos que han demostrado un efecto inóculo, las

concentraciones del antibiótico muy debajo de la CIM y con un inóculo normalizado,

pueden inhibir el crecimiento de las pocas colonias de las diluciones.

2.3.4.4. - Representación gráfica.

Representamos los resultados sirviéndonos del programa informático Excel

(Microsoft®) disponiendo en el eje de ordenadas la diferencia entre el logaritmo del

inóculo inicial y el logaritmo del recuento a tiempo t, y en el eje de abscisas el tiempo

en horas de incubación del cultivo en presencia del antimicrobiano.

Dada la general autólisis de las cepas a partir de las diez horas de incubación,

y por tanto la dificultad de valorar las curvas a partir de dicha hora, éstas solo hemos

representado los datos hasta las diez horas, para simplificar las gráficas.(Apéndice I)



2.3.4.5. - Interpretación.

En la representación gráfica utilizada consideramos efecto bactericida la

muerte del 99,9% o más del inóculo inicial, lo que supone una caída de 3 o más

puntos del logaritmo para inóculos del orden de 106 UFC/mL (Barry, 1979; Pearson, 1980).

Tabla 16: Prediluciones y concentraciones del estudio

para los distintos antimicrobianos.

(A) Pre-Diluciones

(µg/mL)

Dilución 1/100: 20µLde (A) en 2000µL demedio.(µg/mL)

Penicilina Vancomicina Impenem Ceftriaxona Esparfloxacin

400 4,000 X X X

200 2,000 X X X X

100 1,000 X X X X X

50 0,500 X X X X

25 0,250 X X X

12.5 0,125 X X X X

6,25 0,062 X

3,12 0,031

1,56 0,015 X



2.4. - Efecto post-antibiótico (EPA).

La mayor parte de los estudios publicados (Neu, 1987; Cooper, 1990; Gudmundsson, 1991;

Davidson, 1991; Martín-Caminero, 1993; Fuursted, 1997), usan el método de dilución para la

eliminación del antimicrobiano. Un pequeño volumen del cultivo con antibiótico es

añadido a un gran volumen de medio sin antibiótico. Se pretende que la dilución sea

tan grande que la concentración del antibiótico no afecte el crecimiento del cultivo

control. Para concentraciones cercanas a la CIM, una dilución de 10-2 sería

suficiente; para concentraciones mayores suele necesitarse diluciones del orden de

10-3 a 10-4,. En nuestro estudio empleamos la dilución 10-3, mediante transferencias

con asas calibradas de 1 µL.

También es preciso partir de inóculos iniciales del microorganismo del al

menos 105 a 106 UFC/mL, ya que también es diluido en la misma extensión que la

droga. Sin embargo, con antimicrobianos de rápida acción bactericida, la dilución

puede reducir el número de recuentos viables por debajo del umbral detectable (Craig y

Gudmundsson, 1996).


Este proceso es semejante al descrito en el apartado 2.3.1. Lo repetimos

ajustado para elaborar el inóculo 2-3 x108 UFC/mL y a partir de éste realizamos los

inóculos de trabajo en Mueller-Hinton II + 5%LHB mediante dilución 1/10 (inóculo

alto) y dilución 1/100 (inóculo bajo), obteniéndose una concentración aproximada

de 5x107 y 5x105 UFC/mL respectivamente, que constituyeron los inóculos alto y

bajo utilizados.

2.4.2. - Cepas probadas.

Tabla 17: Cepas estudiadas de EPA.

Cepa nº CMIpenicilina (µg/mL) Categoría

(penicilina)

ATCC 49619 0,25 I

40532 0,25 I

4699 2,00 R

16109 2,00 R




Los antimicrobianos y concentraciones probados fueron los mismos, que en

las curvas de muerte descritas en el apartado 2.3.3.

2.4.4. - Técnica.


El estudio del EPA lo realizamos como parte de una técnica múltiple en placa

de 6x4 para una cepa y un antibiótico por experiencia, de la que obtenemos: una

curva letal a inóculo alto en la primera columna, una curva letal a inóculo bajo en la

segunda columna, efecto post-antibiótico a tiempo de exposición de 1 hora en la

tercera columna y efecto post-antibiótico a tiempo de exposición de 2 horas en la

cuarta columna.

El preinóculo lo preparamos a partir de un cultivo nocturno, incubando 1 hora

para obtener la fase logarítmica temprana.

Usamos, para cada cepa y antimicrobiano, una placa de propileno rígido,

estéril, desechable, de 4 x 6 pocillos y con tapa, cada pocillo con una capacidad

máxima de dos mililitros. Incubamos en estufa a 37ºC y en agitación a 175 rpm.


2.4.4.2.1. - Preparación de los antimicrobianos.

(a). - Realizamos la predilución de la solución madre antibiótica 5120 µg/mL a

800 µg/mL.

(b). - A partir del 800 µg/mL en placa microtiter, doblediluyendo con MHB-II,

obtuvimos las prediluciones necesarias: 400; 200; 100; 50; 25; 12,5; etc. µg/mL

2.4.4.2.2. - Curvas de muerte.

1. - Preparación del inóculo para las curvas de letalidad.

(a). - En todos los pocillos de la primera columna pusimos 2000µL del inoculo

alto (106 - 107 UFC/mL). A partir de estos pocillos estudiamos el EPA.

(b). - En todos los pocillos de la segunda columna pusimos 2000µL del inoculo

bajo (105 - 106 UFC/mL).



2. - Añadimos 20µL de las prediluciones del antibiótico para obtener las

concentraciones a estudiar, según el esquema del apartado 2.3.4.2.

3. - Incubación de la placa: a 37ºC, en agitación y tapada

2.4.4.2.3. - Efecto post-antibiótico tras 1 hora de exposición.

1. - Añadimos en los pocillos de la columna 3, 2000µL de MHB+5%LHB

2. -Transferimos con asa calibrada de 1µL, 2µL de cada pocillo de la columna

1, al pocillo con medio correspondiente de la columna 3.

2.4.4.2.4. - Efecto post-antibiótico tras 2 horas de exposición.

1. - Añadimos en los pocillos de la columna 4, 2000µL de MHB+5%LHB

2. -Transferimos con asa calibrada de 1µL, 2µL de cada pocillo de la columna

1, al pocillo con medio correspondiente de la columna 4.

2.4.4.3. - Lectura

Procedimos a la lectura mediante recuento de las siembras (UFC/mL),

realizadas con puntas estériles desechables.

Periodicidad de la siembra:

Curvas de muerte a las 0 (controles), 1, 2, 4, 6, 8, 10 y 24 horas

EPA cada hora:

EPA de 1 hora: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 24

EPA de 2 horas: _, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 24

Técnica de la siembra:

Es la misma descrita en el apartado de acción bactericida

Lectura: Procedimos a recuento de viables, expresándose como UFC/mL,

tras 24-48 horas de incubación a 37 ° C de las placas de agar sangre.



(Microsoft®) disponiendo en el eje de ordenadas el logaritmo del recuento a tiempo t,

y en el eje de abscisas el tiempo en horas de incubación del cultivo en presencia del

antimicrobiano.



2.4.4.5. - Interpretación.

Después de la eliminación de la droga, se da un retraso del crecimiento que

persiste durante 1,4 a 1,6 horas. Ocasionalmente pueden apreciarse ligeras

disminuciones del recuento tras la fase estacionaria, y ello puede ser debido a un

error del recuento.

El gráfico de crecimiento del cultivo (Fig 19) representa la media de los

retrasos experimentados por las células individuales. Se ha demostrado una

variabilidad intercelular, encontrando que el EPA en células individuales puede variar

de 20 minutos hasta 3 horas (Craig y Gudmundsson, 1996)

A fin de soslayar los problemas mencionados, y suministrar un método

estándar para comparar diferentes metodologías y similares experimentos de

distintos días, se ha propuesto la siguiente ecuación para la cuantificación del EPA:

EPA = T + C

Donde T es el tiempo requerido para que el cultivo tratado aumente 1 log10

(10 veces) después de la eliminación de la droga, y C es el tiempo requerido para

que el cultivo control aumente 1 log10 después de la aplicación del mismo

procedimiento que al cultivo tratado. La razón para escoger un incremento de 1 log10

de las UFC/mL es que más allá de esta tasa, es igual el crecimiento para los

microorganismos tratados o no. Entonces lo realmente medido, sería el tiempo

necesario para reanudar la fase logarítmica de crecimiento.

2.5. - Combinación de antibióticos: acción bactericida.

En contraste con la técnica de tablero cruzado, que sólo proporciona datos de

inhibición del crecimiento, la técnica de curva de muerte mide la actividad bactericida

de la combinación. Por esta razón puede ser más apropiada para estudiar procesos

correspondientes a situaciones clínicas en las que es deseable una acción bactericida

(Barriere, 1984; Eliopoulos y Moellering, 1996).

Sin embargo, el recuento colonial repetido significa un tedioso y serio límite al

número de concentraciones y combinaciones testadas. Por ello es esencial que las

concentraciones ensayadas del antimicrobiano sean elegidas cuidadosamente a fin de

que sean representativas de las que realmente podemos conseguir in vivo en el lugar

de la infección. Las concentraciones ensayadas de cada antimicrobiano, normalmente

cubren el rango de 4 a 5 diluciones por debajo de la CMI, y dos veces por encima de la



CMI (o más sí esperamos un antagonismo), empleando doble diluciones de cada

antimicrobiano.

Este estudio de la acción bactericida para evaluar combinaciones de

antimicrobianos lo desarrollamos en placa 6x4, aunque utilizamos solamente 16

pocillos, testando las combinaciones posibles entre las concentraciones 4CMI, 1CMI

y ¼CMI de dos antimicrobianos frente a una cepa.


Este proceso es semejante al descrito en el apartado 2.3.1. Lo repetimos

reajustado para elaborar el inóculo 2-3 x108 UFC/mL, y a partir de éste realizamos la

dilución de trabajo en Mueller-Hinton II + 5%LHB mediante dilución 1/100,

obteniéndose una concentración aproximada de 5x105 UFC/mL, que constituyó el

inóculo utilizado.

2.5.2. - Cepas estudiadas.

Tabla 18: Cepas estudiadas en combinaciones de antimicrobianos.

Cepa nº CMIpenicilina

(µg/mL)

Categoría

(penicilina)

40532 0,25 I

19633 0,50 I

9036 1,00 I

ATCC® 49619 0,25 I

2461 1,00 I

52190 2,00 R

2150 2,00 R

4699 2,00 R

3923 2,00 R

9457 2,00 R




Probamos las combinaciones penicilina + vancomicina, penicilina +

fosfomicina, ceftriaxona + vancomicina y ceftriaxona + fosfomicina. En todas las

combinaciones cruzadas de las concentraciones 4 CMI, 1 CMI y ¼ CMI.

Tabla 19: Disposición en la placa de cultivo

de las combinaciones antimicrobianas (A+B).

4 CIM(a) 4 CIM(a) + ¼ CIM(b) 4 CIM(a) + 1 CIM(b) 4 CIM(a)+ 4 CIM(b)

1 CIM(a) 1 CIM(a) + ¼ CIM(b) 1 CIM(a) + 1 CIM(b) 1 CIM(a) + 4 CIM(b)

¼ CIM(a) ¼ CIM(a) + ¼ CIM(b) ¼ CIM(a) + 1 CIM(b) ¼ CIM(a) + 4 CIM(b)

Control sin antibiótico ¼ CIM(b) 1 CIM(b) 4 CIM(b)

Realizamos a partir de la solución madre, las prediluciones correspondientes

a las concentraciones necesarias.

2.5.4. - Técnica.


Utilizamos como en las técnicas anteriores, para cada inóculo bacteriano y

una combinación, una placa de propileno rígido, estéril, desechable, de 4 x 6 pocillos

y con tapa, cada pocillo con una capacidad máxima de dos mililitros. Empleamos 4 x

4 pocillos, e incubamos en estufa a 37ºC y en agitación.


1. - Inoculación. En todos los pocillos ponemos 2000 µL del inóculo.

2. - Antibióticos. Añadimos el volumen necesario de las soluciones

correspondientes a cada pocillo con 2000 µL de medio inoculado (hora 0).

3. - Incubación de la placa: a 37ºC, en agitación (175 rpm) y tapada

2.5.4.3. - Lectura.

Realizada mediante recuentos de las siembras.

Periodicidad de las siembras.

Hora 0: Recuento del inóculo inicial del pocillo control sin antibiótico.

Recuentos de cada pocillo y pocillo control a las 2, 4, 6, 8 y 24 horas.



Técnica de la siembra.

Es la misma descrita para las otras técnicas en el apartado 2.3.2.3.

Lectura.

Procedimos a recuento de viables, expresándose como UFC/mL, tras 24-48

horas de incubación a 37 ° C de las placas de agar sangre.



(Microsoft®) disponiendo en el eje de ordenadas el logaritmo del recuento a tiempo t,

y en el eje de abscisas el tiempo en horas de incubación del cultivo en presencia del

antimicrobiano.

2.5.4.5. - Interpretación

En la representación gráfica utilizada, consideramos efecto sinérgico de la

combinación, una caída de 2 o más puntos del logaritmo para inóculos del orden de

5x105 UFC/mL


Resultados 131

RESULTADOS

1. - Cepas bacterianas.

Las cepas seleccionadas fueron identificadas siguiendo pruebas clásicas para

neumococos, obteniéndose los siguientes porcentajes:

Tabla 20: Características microbiológicas de las cepas aisladas

Hemólisis en AS/CO2/37ºC 100 %

Sensibilidad a la optoquina 100 %

Lisis por bilis 100 %

Látex positivo 100 %

Las cepas las remitimos para su serotipado, al Laboratorio de referencia de

neumococos del Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III,

Majadahonda, Madrid, recogiéndose los resultados en la Tabla 21.

Tabla 21 : Serotipos de las cepas estudiadas

Cepa nº Serotipo

9679 35

3923 23F

2150 23F

52190 23F

40532 19

9457 14

9036 14

4699 9V

2461 9V

4477 7

16109 6B

12087 6B

19633 -


Resultados 132

2. - Estudio de susceptibilidad a antimicrobianos

2.1. - Determinación de la concentración mínima inhibitoria

Las CIMs fueron determinadas por el método de microdilución descrito en el

apartado de material y métodos, recomendado por el National Committee For

Clinical Laboratory Standards 1997(NCCLS, 1997: M7-A4). Los datos se confrontaron, como

control de calidad-reproducibilidad, con las CIMs obtenidas por el método comercial

Etest®. Los resultados se expresan en la Tabla 22

Tabla 22: CIMs (µg/mL) de S. pneumoniae a penicilina, vancomicina, imipenem,

ceftriaxona, esparfloxacino y fosfomicina

Penicilina Vancomicina Imipenem Ceftriaxona Esparfloxacino Fosfom+G6P

cepa diluc. etest diluc. etest diluc. etest diluc. etest diluc. etest diluc. etest

ATCC 6303 0,063 0,016 0,125 0,125 0,016 0,002 0,016 0,008 0,031 0,125 16 16

ATCC 49619 0,250 0,190 0,250 0,190 0,063 0,064 0,032 0,032 0,125 0,500 16 16

19633 0,500 0,500 0,250 0,380 0,125 0,125 0,250 0,250 0,063 0,125 16 16

16109 2,000 1,500 0,500 0,750 0,500 0,250 1,000 0,750 0,031 0,125 32 48

40532 0,250 0,250 0,125 0,320 0,016 0,094 0,250 0,190 0,250 0,500 16 24

4699 2,000 3,000 0,500 0,750 0,250 0,500 1,000 1,500 0,125 0,250 32 64

4477 0,063 0,063 0,125 0,250 0,016 0,064 0,016 0,064 0,016 0,125 128 256

9679 0,016 0,063 0,125 0,063 0,016 0,006 0,016 0,006 0,125 0,250 64 48

3923 2,000 2,000 0,500 0,500 0,250 0,500 1,000 0,750 0,250 0,190 128 24

9457 2,000 2,000 0,250 0,750 0,250 0,500 1,000 0,750 0,031 0,125 64 32

12087 2,000 1,500 0,500 0,500 0,500 0,500 1,000 0,500 0,250 0,500 32 32

9036 1,000 0,750 0,500 0,750 0,125 0,500 0,500 0,500 0,125 0,250 64 32

2461 1,000 1,000 0,500 0,750 0,125 0,380 0,500 0,500 0,031 0,125 32 32

2150 2,000 3,000 0,500 0,750 0,500 0,750 2,000 1,500 0,016 0,125 32 16

52190 2,000 2,000 0,500 0,750 0,250 0,500 1,000 1,000 0,125 0,250 8 16

Notas: diluc. = microdilución en caldo. G6P = glucosa 6-fosfato


Resultados 133

2.2. - Control de calidad

Las concentraciones de los antimicrobianos fueron verificadas con las cepas

control ATCC® 6303 y con la actualmente recomendada internacionalmente ATCC®

49619.

3. - Acción bactericida de los antimicrobianos solos:

3.1. - Comparativa del medio empleado. Autólisis

Valoramos el efecto del medio empleado en el desarrollo de las técnicas, y

puesto que se trata de técnicas que miden la variación de la población o cinética del

crecimiento, comparamos los resultados obtenidos sobre la cinética de crecimiento

de los cultivos control, con el medio brain heart infusion (BHI) sin sangre de

anteriores experiencias, y los obtenidos en la experiencia actual con MHB2+5%LHB.

Tabla 23: Variación media de los cultivos controles según el

medio de cultivo empleado

0 horas 10 horas 24 horas 10-24horas

Nº de Pruebas

Inóculo Medio

RecuentoMedio

Recuentomedio

�recuentomedio

%

(UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL)

BHI 53 2,4x105

1,5x108

4,2x107

-1,1x108 -28,0

MHB+LHB5% 40 9,0x105

1,0x1011

1,5x1010

-8,5x1010 -15,0

.- Recuento a las 24 horas menos el recuento a las 10 horas

.- Variación relativa (%) del recuento de 24 horas respecto al recuento de 10 horas

Los datos se presentan según intervalos clásicos de la curva de crecimiento

del neumococo correspondiendo el tramo de 0 a 10 horas a la fase de crecimiento

logarítmico, el tramo de 10 a 24 horas a la fase estacionaria y comienzo de los

procesos líticos,y el tramo de 0 a 24 horas al conjunto del proceso (Tabla 23).

En todas las cepas estudiadas, y especialmente unido a la concentración

bacteriana y al tiempo de incubación, se observa un marcado efecto de autólisis.

3.2. - Efecto de la variación del tamaño del inóculo

Estudiamos en cuatro cepas (Tabla 17) el efecto de la variación del tamaño

del inóculo empleado, en el desarrollo de las técnicas. Comparando los resultados


Resultados 134

obtenidos con los antibióticos enfrentados a distintas concentraciones del inóculo.

Los resultados se muestran en las tablas 24 a 29, seleccionándose las 6 horas como

segmento representativo de la influencia que sobre la acción bactericida puede tener

la variación del inóculo en tamaño.

Tabla 24: Efecto bactericida de penicilina en inóculo alto (A) y bajo (B)

4 µg/mL 2 µg/mL 1 µg/mL 0,125 µg/mL 0,062 µg/mL

hr Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B

1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4 2 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

6 4 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

8 4 2 0 2 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

10 4 3 0 3 3 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0

24 4 4 0 4 4 0 3 3 0 2 2 0 2 2 0

Tabla 25: Efecto bactericida de ceftriaxona en inóculo alto (A) y bajo (B)



1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4 2 1 1 2 0 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0

6 4 3 1 2 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

8 4 3 1 3 3 0 1 2 -1 0 0 0 0 0 0

10 4 4 0 4 3 1 3 2 1 1 1 0 1 0 1

24 4 4 0 4 3 1 4 2 2 1 1 0 1 1 0

A = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo alto (107-108 UFC/mL )

B = nº de cepas muertas (99,9%) en inóculo bajo (105-106 UFC/mL)

A-B Diferencia: Nº cepas muertas en inóculo alto menos nº de cepas muertas en inóculo bajo.

Efecto inóculo: A-B < 0 (negativo)


Resultados 135

Tabla 26: Efecto bactericida de imipenem en inóculo alto (A) y bajo (B)

1 µg/mL 0,5 µg/mL 0,25 µg/mL 0,125 µg/mL 0,015 µg/mL


1 1 0 1 0 1 -1 1 0 1 0 0 0 0 0 0

2 3 3 0 2 3 -1 1 2 -1 1 1 0 1 0 1

4 3 3 0 2 3 -1 2 2 0 2 2 0 1 1 0

6 3 3 0 2 4 -2 3 3 0 3 2 1 1 1 0

8 3 4 -1 3 4 -1 3 3 0 3 2 1 1 1 0

10 4 4 0 3 4 -1 3 3 0 3 2 1 1 1 0

24 4 4 0 3 4 -1 3 3 0 3 2 1 1 1 0

Tabla 27: Efecto bactericida de vancomicina en inóculo alto (A) y bajo (B)

2 µg/mL 1 µg/mL 0,5 µg/mL 0,25 µg/mL 0,125 µg/mL

Hr Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B Alto Bajo A-B

1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0

2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 1 0 1 0 0 0

4 2 2 0 2 2 0 3 2 1 3 1 2 0 0 0

6 3 3 0 3 2 1 3 2 1 3 1 2 1 0 1

8 4 3 1 4 3 1 3 3 0 3 1 2 1 1 0

10 4 3 1 4 3 1 3 3 0 3 1 2 1 1 0

24 4 4 0 4 4 0 3 4 -1 4 2 2 2 1 1






Resultados 136

Tabla 28: Efecto bactericida de esparfloxacino en inóculo alto (A) y bajo (B)



1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4 2 1 1 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 4 4 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

8 4 4 0 4 4 0 2 2 0 1 1 0 0 0 0

10 4 4 0 4 4 0 2 2 0 2 2 0 0 0 0

24 4 4 0 4 4 0 3 3 0 2 2 0 0 0 0





Tabla 29: Efecto del tamaño del inóculo

sobre la acción bactericida a las 6 horas

Penicilina µg/mL 4 2 1 0,125 0,062

A-B 1 0 0 0 0

Ceftriaxona µg/mL 4 2 1 0,5 0,125

A-B 1 0 0 0 0

Imipenem µg/mL 1 0,5 0,25 0,125 0,015

A-B 0 -2 0 1 0

Vancomicina µg/mL 2 1 0,5 0,25 0,125

A-B 0 1 1 2 0

Esparfloxacino µg/mL 4 2 1 0,5 0,25

A-B 0 0 0 0 0




Resultados 137

3.3. - Acción bactericida de los antimicrobianos solos

Comparamos en cepas penicilina sensibles, intermedias y resistentes (Tabla

14), las tasas de muerte conseguidas, respecto al tiempo, con las diferentes

concentraciones de cada antimicrobiano. Para ello, a partir de los recuentos de

microorganismos viables (UFC/mL.), se elaboran las curvas de letalidad respectivas,

de las que se obtiene la tasa de muerte para un determinado tiempo y concentración

del antimicrobiano.

Representamos los resultados disponiendo en el eje de ordenadas la

diferencia entre el logaritmo del inóculo inicial y el logaritmo del recuento a tiempo t,

a fin de normalizar las pequeñas variaciones del inóculo inicial; y en el eje de

abscisas el tiempo en horas de incubación del cultivo en presencia del

antimicrobiano (Apéndice I: Curvas de letalidad).

Las tablas siguientes (Tablas 31 a 33) resumen de forma gráfica las distintas

tasas de muerte conseguidas a lo largo del tiempo con las diferentes

concentraciones de los antimicrobianos, descritas en los apartados 3.3.1. a 3.3.3.

Según la definición, establecida anteriormente en el apartado de Métodos,

para el efecto bactericida o simplemente muerte, consideramos efecto bactericida la

muerte del 99,9% o más del inóculo inicial, lo que supone una caída de 3 o más

puntos del logaritmo para inóculos del orden de 106 UFC/mL.

Los estudios mediante curvas de muerte, han permitido clasificar a los

antimicrobianos según la relación entre concentración y actividad bactericida, en dos

grandes grupos:

Antimicrobianos que muestran una actividad bactericida dependiente de la

conncentración y un efecto post-antibiótico prolongado. El objetivo farmacológico

con estos antimicrobianos es alcanzar la máxima concentración, estando su eficacia

correlacionada con el área bajo la curva (AUC o ABC) y los picos máximos en suero

(Cmax).

Antimicrobianos que muestran una actividad bactericida más dependiente

del tiempo de exposición que de la concentración, ya que tras alcanzar un máximo

efecto bactericida a 5-10 veces la CIM, presentan un patrón de saturación donde un

incremento de la concentración no supone mayor efecto bactericida (Bundtzen, 1981;

Gerber, 1993). Por encima de estas concentraciones, puede darse incluso en el caso de


Resultados 138

la penicilina un efecto paradójico de descenso de la actividad (efecto Eagle). El

objetivo farmacológico con estos antimicrobianos es obtener y mantener

concentraciones por encima de la CIM90 el mayor tiempo posible

En nuestros trabajos, estudiamos la acción bactericida de varios

antimicrobianos del grupo de los ß-lactámicos, además de vancomicina y

fosfomicina, descritos como de baja dependencia de la concentración, y una

fluorquinolona, grupo descrito como concentración-dependiente: el esparfloxacino.

Las concentraciones ensayadas están dentro de las recomendadas

internacionalmente para pruebas de sensibilidad (NCCLS, 1997), y salvo esparfloxacino

(Tabla 30, pág 130), las medias de las concentraciones no superan 4 CIM. Por lo tanto en

todos los casos trabajamos con rangos donde el efecto bactericida es concentración-

dependiente (Tauber, 1984), lo que hay que tener en cuenta a la hora de comparar

resultados in vitro, mientras el carácter bactericida dependiente o no de la

concentración es el parámetro más importante para comparar resultados in vivo.

Tabla 30: Relación CIM/concentraciones ensayadas

Concentraciones probadas µg/mL CIM µg/mL

Rango Media (n=5) Rango Media (n=9)

Relación

CIM/conc.

Penicilina 4 - 0,062 1,44 2 - 0,016 0,96 1,55

Vancomicina 2 - 0,125 0,78 0,5 - 0,125 0,33 2,36

Ceftriaxona 4 - 0,125 1,53 1 - 0,016 0,48 3,20

Imipenem 1 - 0,015 0,38 0,5 - 0,016 0,16 2,40

Esparfloxacino 4 - 0,125 1,55 0,25 - 0,016 0,10 15,50

3.3.1. - Cepas sensibles a penicilina.

(CMI ≤ 0,06 µg/mL )

Efectos a las 2 horas

• Penicilina

• concentraciones supra CMI (≥≥≥≥ 0,12 µg/mL)

• Penicilina 4 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de 3 cepas

estudiadas.


Resultados 139

• Penicilina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,12 µg/mL: alcanza la acción bactericida en

1 de 3 cepas estudiadas.

• concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 0,06 µg/mL)

• Penicilina 0,06 µg/mL: no alcanza la acción bactericida en ninguna cepa.

• Otros quimioterápicos

• Vancomicina 2 y 0,5 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1 de 3 cepas

estudiadas.

• Ceftriaxona 4 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de 3 cepas

estudiadas.

• Ceftriaxona 2 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 cepa.

• Imipenem 1 µg/mL: logra la acción bactericida en 2 de 3 cepas estudiadas.

• Imipenem 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 cepa.

• Esparfloxacino: no se alcanza la acción bactericida en ninguna de las

cepas estudiadas.


• Penicilina


• Penicilina 4 µg/mL, 2 µg/mL y 1 µg/mL: alcanza la acción

bactericida en todas las cepas estudiadas.

• Penicilina 0,12 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3 cepas


• Penicilina 0,06 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1 cepa.


• Vancomicina a todas las concentraciones: obtiene la acción

bactericida en 1 de 3 cepas estudiadas.

• Ceftriaxona a 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: alcanza la acción


• Imipenem a 1; 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: logra la acción bactericida

en 3 de 3 cepas estudiadas.

• Imipenem a 0,015 µg/mL: logra la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.


Resultados 140

• Esparfloxacino a 4;2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2

de 3 cepas estudiadas.

• Esparfloxacino a 0,5 y 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en

1 de 3 cepas estudiadas.


• Penicilina

• concentraciones supra CMI (≥ 0,12 µg/mL)

• Penicilina 4 µg/mL, 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,12 µg/mL: consigue la

acción bactericida en todas las cepas.


• Penicilina 0,06 µg/mL: consigue la acción bactericida en dos de las

cepas.


• Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción

bactericida en 2 de 3 cepas.

• Vancomicina 0,25 y 0,125 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1


• Ceftriaxona 4;2; 1;0,5 y 0,125 µg/mL: alcanza la acción bactericida


• Imipenem 1; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,015 µg/mL: logra la acción


• Esparfloxacino 4 µg/mL y 2 µg/mL: consigue la acción bactericida

en 3 de 3 cepas.

• Esparfloxacino 1 y 0,5 µg/mL: alcanzan acción bactericida en 2 de

3 cepas estudiadas.

• Esparfloxacino 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1 de 3

cepas estudiadas.


• Penicilina



Resultados 141





cepas.


• Vancomicina 2 µg/mL y 1 µg/mL: consigue la acción bactericida en

3 de 3 cepas.

• Vancomicina 0,5 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.

• Vancomicina 0,25 y 0,125 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1


• Ceftriaxona 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: alcanza la acción bactericida




• Esparfloxacino 4 µg/mL, 2 µg/mL y 1 µg/mL: alcanza la acción

bactericida en 3 de 3 cepas estudiadas

• Esparfloxacino 0,5 y 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2



• Penicilina





cepas.


• Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL : consigue la acción bactericida en

3 de 3 cepas.

• Vancomicina 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: obtiene la acción bactericida



Resultados 142

• Ceftriaxona 4;2; 1;0,5 y 0,125 µg/mL: alcanza la acción bactericida




• Esparfloxacino a todas las concentraciones: consigue la acción



Resultados 143

Tabla 31: Tasas de muerte (% del inóculo). Cepas sensibles a penicilina

Tiempo 2 horas 4 horas 6 horas 8 horas 10 horas 24 horas

Tasa de muerte (% del inóculo) / número de cepasAntimicrobianos

µg/mL90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9%

Penicilina (CIM pen = 0,046 µg/mL)

4 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

2 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

1 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,1 1 0 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,062 0 0 0 0 1 1 0 0 2 0 0 2 0 0 2 0 0 2

Vancomicina (CIM van = 0,167 µg/mL)

2 1 0 1 1 0 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3

1 1 1 0 1 1 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,5 0 0 1 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2

0,25 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 2 0 0 2

0,125 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 2 0 0 2

Ceftriaxona (CIM ctr = 0,021 µg/mL)

4 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

2 2 0 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

1 1 1 0 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,5 1 1 0 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,125 0 2 0 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

Imipenem (CIM imp = 0,032 µg/mL)

1 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,5 1 1 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,25 1 1 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,125 2 0 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,015 1 1 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

Esparfloxacino (CIM esp = 0,052 µg/mL)

4 2 0 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

2 2 0 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

1 3 0 0 0 1 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,5 1 0 0 1 1 1 0 1 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3

0,25 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3

Nota: los sombreados representan la tasa de muerte bactericida (99,9%) correspondiente a tiempo marcado

en la columna. Tasas de muerte: -1 log10 = muerte del 90% del inóculo; -2 log10 = muerte del 99% del inóculo; -3 log10 =

muerte del 99,9% del inóculo.

CIM x = Concentración inhibitoria mínima media (µg/mL) del antimicrobiano x


Resultados 144

3.3.2. - Cepas con resistencia intermedia a penicilina

(CIM 0,12 - 1 µg/mL)


♦ Penicilina

♦ concentraciones supra CMI (≥≥≥≥ 2 µg/mL )

♦ Penicilina 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1 de 3

cepas estudiadas.

♦ concentraciones CMI y sub CMI (CMI ≤≤≤≤ 1 µg/mL)

♦ Penicilina 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción bactericida

en ninguna cepa.

♦ Otros quimioterápicos

♦ Vancomicina 2 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de 3 cepas

estudiadas.

♦ Ceftriaxona 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: no logra alcanzar la acción

bactericida en ninguna de las cepas estudiadas.

♦ Imipenem 1; 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3

cepas estudiadas.

♦ Imipenem 0,015 µg/mL: logra la acción bactericida en 2 de 3 cepas

estudiadas.

♦ Esparfloxacino no alcanza la acción bactericida en ninguna de las

cepas estudiadas.


♦ Penicilina

♦ concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 2 µg/mL )


cepas estudiadas.



en ninguna cepa.


Resultados 145

♦ Otros antimicrobianos

♦ Vancomicina 2 µg/mL y 1 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 1


♦ Vancomicina 0,25 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.

♦ Ceftriaxona 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.

♦ Ceftriaxona 1y 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida 1 de 3 cepas

estudiadas.

♦ Imipenem 1 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3 cepas

estudiadas.

♦ Imipenem 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 2 de 3

cepas.

♦ Esparfloxacino 4 µg/mL: a alcanza la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.


♦ Penicilina



cepas estudiadas.



en ninguna cepa.


♦ Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción



cepas estudiadas.

♦ Ceftriaxona 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.

♦ Ceftriaxona 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida 1 de 3 cepas

estudiadas.


Resultados 146


cepas estudiadas.


estudiadas.

♦ Esparfloxacino 4 µg/mL: consigue la acción bactericida en 3 de 3

cepas.

♦ Esparfloxacino 2 y 1 µg/mL: alcanzan acción bactericida en 1 de 3

cepas estudiadas.


♦ Penicilina



cepas estudiadas.



en ninguna cepa.





cepas estudiadas.


cepas estudiadas.


estudiadas.


cepas estudiadas.


estudiadas.

♦ Esparfloxacino 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de

3 cepas estudiadas


Resultados 147

♦ Esparfloxacino 0,5 y 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2



♦ Penicilina



cepas estudiadas.


♦ Penicilina 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en dos cepas.





cepas estudiadas.


cepas estudiadas.


estudiadas.


cepas estudiadas.


estudiadas.

♦ Esparfloxacino 4; 2; 1 y 0,5 µg/mL: alcanza la acción bactericida en

3 de 3 cepas estudiadas

♦ Esparfloxacino 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.


Resultados 148

Tabla 32: Tasas de muerte (% del inóculo). Cepas con resistencia intermedia a penicilina



µg/mL90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9%


4 0 1 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 0 3

2 0 1 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 0 3

1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 2 0 1 0

0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,062 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


2 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 0 3

1 0 2 0 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 0 3

0,5 1 2 0 0 2 0 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 0 2

0,25 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1

0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


4 0 2 0 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 0 0 3

2 0 2 0 0 0 2 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 0 3

1 0 2 0 0 1 1 1 0 2 1 0 2 1 1 1 0 1 2

0,5 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1

0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


1 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,5 0 2 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,25 0 2 1 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,125 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1

0,015 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


4 2 0 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

2 1 0 0 0 3 0 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3

1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,5 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 2 0 0 3 0 0 3

0,25 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 2 1 0 2 1 0 2






Resultados 149

3.3.3. - Cepas penicilina resistentes

(CIM � 2 µg/mL)


Penicilina

concentraciones supra CMI ( ≥≥≥≥ 4 µg/mL )

Penicilina 4 µg/mL: no logra alcanzar la acción bactericida en

ninguna cepa.

concentraciones CMI y sub CMI (≤≤≤≤ 2 µg/mL)

Penicilina 2; 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción

bactericida en ninguna cepa.

Otros antimicrobianos

Vancomicina 2; 1; 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: no obtiene la acción


Ceftriaxona 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: no logra alcanzar la acción


Imipenem 1; 0,5; 0,25; 0,125 y 0,015 µg/mL: no logra la acción


Esparfloxacino: No se alcanza la acción bactericida en ninguna de

las cepas estudiadas.


Penicilina


Penicilina 4 µg/mL: no logra alcanzar la acción bactericida en

ninguna cepa.


Penicilina 2; 1; 0,125 y 0,062 µg/mL: no alcanza la acción

bactericida en ninguna cepa.


Vancomicina 2; 1; 0,5; 0,25 y 0,125 µg/mL: no obtiene la acción



Resultados 150

Ceftriaxona 4; 2; 1; 0,5 y 0,125 µg/mL: no logra alcanzar la acción


Imipenem 1; 0,5 y 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3

cepas estudiadas.

Esparfloxacino 4 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.


Penicilina


Penicilina 4 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3 cepas

estudiadas.



estudiadas.


Vancomicina 2; 1 y 0,5 µg/mL: obtiene la acción bactericida en 2 de

3 cepas estudiadas.

Ceftriaxona 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.

Imipenem 1y 0,5 µg/mL: logra la acción bactericida en 3 de 3 cepas

estudiadas.

Imipenem 0,25 µg/mL: logra la acción bactericida en 1 de 3 cepas

estudiadas.

Esparfloxacino 4; 2 y 1 µg/mL: consigue la acción bactericida en 2

de 3 cepas.

Esparfloxacino 0,5 µg/mL: alcanzan acción bactericida en 1 de 3

cepas estudiadas.


Penicilina



Resultados 151


estudiadas.



estudiadas.


Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción


Ceftriaxona 4 y 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.


estudiadas.


estudiadas.

Esparfloxacino 4; 2; 1 y 0,5 µg/mL: alcanza la acción bactericida en

2 de 3 cepas estudiadas

Esparfloxacino 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1de

3 cepas estudiadas.


Penicilina



estudiadas.


Penicilina 2 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3 cepas.


Vancomicina 2 µg/mL, 1 µg/mL y 0,5 µg/mL: consigue la acción


Ceftriaxona 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de 3

cepas estudiadas.


estudiadas.


Resultados 152


estudiadas.

Esparfloxacino 4; 2 y 1 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 3 de

3 cepas estudiadas

Esparfloxacino 0,5 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 2 de 3

cepas estudiadas.

Esparfloxacino 0,25 µg/mL: alcanza la acción bactericida en 1de 3

cepas estudiadas


Resultados 153

Tabla 33: Tasas de muerte (% del inóculo). Cepas con alta resistencia a

penicilina



µg/mL90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9% 90% 99% 99,9%


4 1 0 0 1 2 0 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3

2 0 0 0 2 0 0 2 0 1 1 1 1 0 1 2 0 0 3

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,062 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


2 0 0 0 1 2 0 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3

1 0 0 0 1 2 0 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,5 1 0 0 1 2 0 1 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


4 0 0 0 1 1 0 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3

2 0 0 0 1 1 0 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 2

0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


1 2 1 0 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,5 1 1 0 0 2 1 0 0 3 0 0 3 0 0 3 0 0 3

0,25 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 2

0,125 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,015 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


4 2 1 0 1 0 2 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3

2 3 0 0 1 2 0 1 0 2 1 0 2 0 0 3 0 0 3

1 0 0 0 0 2 0 1 0 2 0 1 2 0 0 3 0 0 3

0,5 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 2 0 1 2 0 0 3

0,25 0 0 0 2 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1






Resultados 154

3.4. - Efecto post-antibiótico

La obtención de resultados mediante gráficos se ilustra con algunos ejemplos

en el Apéndice II.

Presentamos en las tablas 34 a 43 los resultados de la influencia de la

concentración, y del tiempo de exposición al antimicrobiano sobre el efecto post-

antibiótico, con penicilina, ceftriaxona, imipenem, vancomicina y esparfloxacino a

cinco concentraciones diferentes en cuatro cepas de S. pneumoniae con resistencia

intermedia y alta a penicilina.

Tabla 34: Penicilina. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora

Concentración de

Penicilina (µg/mL)

CIM Pen

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,062 0,25 0,0 1,0 0,1

0,062 0,25 0,0 1,0 0,1

0,125 0,25 0,0 1,0 0,1

0,125 0,25 0,7 1,0 0,1

1 0,25 0,0 1,0 1,0

1 0,25 2,9 1,0 1,0

2 0,25 1,0 1,0 2,0

2 0,25 2,4 1,0 2,0

4 0,25 3,0 1,0 4,0

4 0,25 4,0 1,0 4,0

0,062 2,00 0,0 1,0 0,1

0,062 2,00 0,0 1,0 0,1

0,125 2,00 0,0 1,0 0,1

0,125 2,00 0,0 1,0 0,1

1 2,00 0,0 1,0 1,0

1 2,00 0,0 1,0 1,0

2 2,00 0,0 1,0 2,0

2 2,00 0,0 1,0 2,0

4 2,00 0,2 1,0 4,0

4 2,00 0,7 1,0 4,0


Resultados 155

Tabla 35: Penicilina. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 2 horas

Concentración de

Penicilina (µg/mL)

CIM Pen

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,062 0,25 0,0 2,0 0,1

0,062 0,25 0,0 2,0 0,1

0,125 0,25 0,0 2,0 0,3

0,125 0,25 1,4 2,0 0,3

1 0,25 5,5 2,0 2,0

2 0,25 5,7 2,0 4,0

4 0,25 6,1 2,0 8,0

0,062 2,00 0,0 2,0 0,1

0,062 2,00 0,0 2,0 0,1

0,125 2,00 0,0 2,0 0,3

0,125 2,00 0,0 2,0 0,3

1 2,00 0,0 2,0 2,0

1 2,00 0,0 2,0 2,0

2 2,00 0,0 2,0 4,0

2 2,00 0,0 2,0 4,0

4 2,00 1,7 2,0 8,0

4 2,00 3,5 2,0 8,0


Resultados 156

Tabla 36: Ceftriaxona. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora

Concentración de

Ceftriaxona (µg/mL)

CIM Ctr

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,125 0,032-0,25 0,0 1,0 0,1

0,125 0,032-0,25 0,2 1,0 0,1

0,5 0,032-0,25 0,3 1,0 0,5

0,5 0,032-0,25 0,7 1,0 0,5

1 0,032-0,25 0,7 1,0 1,0

1 0,032-0,25 0,7 1,0 1,0

2 0,032-0,25 1,2 1,0 2,0

2 0,032-0,25 1,7 1,0 2,0

4 0,032-0,25 0,5 1,0 4,0

4 0,032-0,25 1,7 1,0 4,0

0,125 1,00 0,0 1,0 0,1

0,125 1,00 0,0 1,0 0,1

0,5 1,00 0,0 1,0 0,5

0,5 1,00 0,0 1,0 0,5

1 1,00 0,8 1,0 1,0

1 1,00 0,9 1,0 1,0

2 1,00 1,0 1,0 2,0

2 1,00 1,5 1,0 2,0

4 1,00 1,5 1,0 4,0

4 1,00 1,6 1,0 4,0


Resultados 157

Tabla 37: Ceftriaxona. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora

Concentración de

Ceftriaxona (µg/mL)

CIM Ctr

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,125 0,032-0,25 0,0 2,0 0,3

0,125 0,032-0,25 0,5 2,0 0,3

0,5 0,032-0,25 0,0 2,0 1,0

0,5 0,032-0,25 0,8 2,0 1,0

1 0,032-0,25 0,8 2,0 2,0

1 0,032-0,25 0,9 2,0 2,0

2 0,032-0,25 1,0 2,0 4,0

2 0,032-0,25 1,9 2,0 4,0

4 0,032-0,25 3,0 2,0 8,0

4 0,032-0,25 4,1 2,0 8,0

0,125 1,00 0,0 2,0 0,3

0,125 1,00 0,0 2,0 0,3

0,5 1,00 0,0 2,0 1,0

0,5 1,00 0,3 2,0 1,0

1 1,00 0,1 2,0 2,0

1 1,00 0,3 2,0 2,0

2 1,00 0,3 2,0 4,0

2 1,00 1,7 2,0 4,0

4 1,00 2,0 2,0 8,0


Resultados 158

Tabla 38: Imipenem. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora

Concentración de

Imipenem (µg/mL)

CIM Imp

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr

ABC

(µg hr/mL)

0,015 0,016 - 0,5 0,0 1 0

0,015 0,016 - 0,5 0,0 1 0

0,015 0,016 - 0,5 0,0 1 0

0,125 0,016 - 0,5 0,0 1 0

0,125 0,016 - 0,5 0,0 1 0

0,125 0,016 - 0,5 0,9 1 0,1125

0,25 0,016 - 0,5 0,0 1 0

0,25 0,016 - 0,5 0,0 1 0

0,25 0,016 - 0,5 1,1 1 0,275

0,5 0,016 - 0,5 0,0 1 0

0,5 0,016 - 0,5 1,7 1 0,85

0,5 0,016 - 0,5 2,0 1 1

1 0,016 - 0,5 0,9 1 0,9

1 0,016 - 0,5 1,7 1 1,7

1 0,016 - 0,5 2,4 1 2,4


Resultados 159

Tabla 39: Imipenem. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 2 horas

Concentración de

Imipenem (µg/mL)

CIM Imp

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,015 0,016 - 0,5 0,0 2 0

0,015 0,016 - 0,5 0,0 2 0

0,015 0,016 - 0,5 0,0 2 0

0,125 0,016 - 0,5 0,0 2 0

0,125 0,016 - 0,5 0,9 2 0,1125

0,125 0,016 - 0,5 1,5 2 0,1875

0,25 0,016 - 0,5 0,0 2 0

0,25 0,016 - 0,5 2,2 2 0,55

0,5 0,016 - 0,5 0,0 2 0

0,5 0,016 - 0,5 2,5 2 1,25

1 0,016 - 0,5 2,5 2 2,5


Resultados 160

Tabla 40: Vancomicina. Efecto post-antibiótico. Tiempo de exposición 1 hora

Concentración de

Vancomicina (µg/mL)

CIM Van

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,125 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,125

0,125 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,125

0,125 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,125

0,125 0,125 - 0,5 0,6 1,0 0,125

0,25 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,25

0,25 0,125 - 0,5 0,0 1,0 0,25

0,25 0,125 - 0,5 1,3 1,0 0,25

0,5 0,125 - 0,5 0,2 1,0 0,5

0,5 0,125 - 0,5 0,3 1,0 0,5

0,5 0,125 - 0,5 1,6 1,0 0,5

1 0,125 - 0,5 0,4 1,0 1

1 0,125 - 0,5 1,6 1,0 1

1 0,125 - 0,5 2,0 1,0 1

2 0,125 - 0,5 0,7 1,0 2

2 0,125 - 0,5 1,8 1,0 2

2 0,125 - 0,5 2,0 1,0 2


Resultados 161

Tabla 41: Vancomicina. Efecto post-antibiótico.

Tiempo de exposición 2 horas.

Concentración de

Vancomicina (µg/mL)

CIM Van

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,125 0,125 - 0,5 0,0 2 0,25

0,125 0,125 - 0,5 0,0 2 0,25

0,125 0,125 - 0,5 0,5 2 0,25

0,125 0,125 - 0,5 1,5 2 0,25

0,25 0,125 - 0,5 0,2 2 0,5

0,25 0,125 - 0,5 1,6 2 0,5

0,5 0,125 - 0,5 2,0 2 1

1 0,125 - 0,5 2,2 2 2

2 0,125 - 0,5 2,8 2 4


Resultados 162

Tabla 42: Esparfloxacino. Efecto post-antibiótico.

Tiempo de exposición 1 hora.

Concentración de

Esparfloxacino (µg/mL)

CIM esp

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,25 0,031 - 0,25 0,0 1,0 0,25

0,25 0,031 - 0,25 0,0 1,0 0,25

0,25 0,031 - 0,25 0,1 1,0 0,25

0,25 0,031 - 0,25 0,3 1,0 0,25

0,5 0,031 - 0,25 0,1 1,0 0,5

0,5 0,031 - 0,25 0,4 1,0 0,5

0,5 0,031 - 0,25 0,9 1,0 0,5

0,5 0,031 - 0,25 1,0 1,0 0,5

1 0,031 - 0,25 0,4 1,0 1

1 0,031 - 0,25 0,4 1,0 1

1 0,031 - 0,25 0,9 1,0 1

1 0,031 - 0,25 1,1 1,0 1

2 0,031 - 0,25 1,0 1,0 2

2 0,031 - 0,25 1,3 1,0 2

2 0,031 - 0,25 1,3 1,0 2

2 0,031 - 0,25 1,3 1,0 2

4 0,031 - 0,25 0,8 1,0 4

4 0,031 - 0,25 1,0 1,0 4

4 0,031 - 0,25 1,2 1,0 4

4 0,031 - 0,25 2,0 1,0 4


Resultados 163

Tabla 43: Esparfloxacino. Efecto post-antibiótico.

Tiempo de exposición 2 horas.

Concentración de

Esparfloxacino (µg/mL)

CIM esp

(µg/mL)

EPA

(hr)

Tiempo de

Exposición (hr)

ABC

(µg hr/mL)

0,25 0,031 - 0,25 0,4 2,0 0,5

0,25 0,031 - 0,25 0,6 2,0 0,5

0,25 0,031 - 0,25 1,1 2,0 0,5

0,5 0,031 - 0,25 0,4 2,0 1

0,5 0,031 - 0,25 0,9 2,0 1

0,5 0,031 - 0,25 1,0 2,0 1

0,5 0,031 - 0,25 1,0 2,0 1

1 0,031 - 0,25 0,9 2,0 2

1 0,031 - 0,25 1,1 2,0 2

1 0,031 - 0,25 1,2 2,0 2

1 0,031 - 0,25 2,4 2,0 2

2 0,031 - 0,25 1,4 2,0 4

2 0,031 - 0,25 1,8 2,0 4

2 0,031 - 0,25 2,5 2,0 4

2 0,031 - 0,25 3,0 2,0 4

4 0,031 - 0,25 1,4 2,0 8

4 0,031 - 0,25 2,3 2,0 8

4 0,031 - 0,25 2,5 2,0 8

4 0,031 - 0,25 3,0 2,0 8


Resultados 164

Las concentraciones a las que se ha ensayado el EPA, son las mismas que

las recomendadas para las pruebas bactericidas (NCCLS, 1997), en un rango próximo a la

CIM del microorganismo, y suelen ser, en la mayoría de los casos, las que se

alcanzan en suero o líquidos orgánicos después de una dosis habitual del

antimicrobiano.

Hay que tener en cuenta que, si la concentración ensayada es muy alta, se

produce mucha letalidad y el EPA es difícil de medir, especialmente en los

antimicrobianos rápidamente bactericidas como imipenem o vancomicina a las

concentraciones empleadas.

Por el contrario si las concentraciones ensayadas son excesivamente bajas,

por debajo de la CIM, tampoco se consigue demostrar EPA con la técnica de

recuento de viables.

Por ambas razones sólo se ha podido determinar EPAs tras 1 hora en

imipenem y vancomicina, en 15/25 y 16/25 casos, y EPAs tras 2 horas en 11/25 y

9/25 casos respectivamente.

3.4.1. - Influencia de la concentración y el tiempo de exposición

Los EPAs medios conseguidos, tras un tiempo de exposición de 1 hora (Tabla

44), con los distintos antimicrobianos, son muy semejantes: 0,75; 0,75; 0,72; 0,78 y

0,78 horas.

Tabla 44: Efecto post-antibiótico: Resultados medios tras

exposición de 1 hora

Antimicrobianos(casos)

CIMs

(µg/mL)

Concentración

(µg/mL)

Conc/ CIM

EPA

(1hr)

ABC

(µg*hr/mL)

Penicilina (20) 1,13 1,44 1,27 0,75 1,44

Ceftriaxona (20) 0,57 1,53 2,68 0,75 0,32

Imipenem (15) 0,29 0,38 1,31 0,72 0,38

Vancomicina (16) 0,40 0,73 1,82 0,78 0,30

Esparfloxacino(20) 0,13 1,55 11,92 0,78 1,55

Los EPAs medios conseguidos tras 2 horas de exposición (Tabla 45): 1,40;

0,93; 0,87; 1,20 y 1,46 son superiores y también presentan mayores diferencias

entre ellos.


Resultados 165

Tabla 45: Resultados medios tras exposición de 2 horas:

Antimicrobianos

(casos)

CIMs

(µg/mL)

Concentración

(µg/mL)

Conc

/ CIM

EPA

(2hr)

ABC

(µg*hr/mL)

Penicilina (17) 1,28 1,28 1,00 1,40 2,56

Ceftriaxona (19) 0,54 1,39 2,57 0,93 2,79

Imipenem (11) 0,24 0,27 1,13 0,87 0,53

Vancomicina (9) 0,43 0,50 1,16 1,20 0,24

Esparfloxacino (20) 0,13 1,55 11,92 1,46 3,1

El incremento del EPA en el rango de tiempo estudiado es mínimo para

imipenem, y máximo para penicilina y esparfloxacino (Tabla 46)

Tabla 46: Influencia del tiempo: comparación de los EPAs medios

Antimicrobianos EPA (1hr) EPA (2hr) ∆EPA (%)

Penicilina 0,75 1,40 0,65 (87%)

Ceftriaxona 0,75 0,93 0,18 (24%)

Imipenem 0,72 0,87 0,15 (21%)

Vancomicina 0,78 1,20 0,42 (54%)

Esparfloxacino 0,78 1,46 0,68 (87%)

El producto de la concentración por el tiempo de exposición equivale al la

cantidad de antimicrobiano disponible en un período, posee las mismas dimensiones

(Masa*Tiempo/Volumen = µg*hr/mL) que las curvas farmacocinéticas ABC (área

bajo la curva) con las que puede ser comparado.

Los resultados medios del producto de la concentración por el tiempo de

exposición (Tablas 44 y 45) o ABCs conseguidas in vitro, tras un tiempo de

exposición de 1 hora, con los distintos antimicrobianos, son 1,44; 0,32; 0,38; 0,30 y

1,55 horas, mientras que los obtenidos tras 2 horas de exposición suelen ser

mayores: 2,56; 2,79; 0,53; 0,24 y 3,1 horas


Resultados 166

4. - Acción bactericida de los antimicrobianos en asociación

Los resultados medios obtenidos se exponen en las tablas 47 a 50 y se

representan en los gráficos del Apéndice III.

Al presente no se han establecido criterios para evaluar los resultados sobre

sinergismo obtenidos, con la técnica de curva de muerte, usando dos o mas drogas

con actividad antibacteriana por si solas. La eficiencia de la combinación suele ser

definida en función del antimicrobiano mas eficaz, esto es la diferencia entre el efecto

de la combinación menos el efecto del antimicrobiano más activo (Chavanet, 1998).

Además de los elementos que influyen generalmente sobre la acción

antimicrobiana, en las combinaciones son factores importantes los tipos de

antimicrobianos asociados, especialmente en cuanto a similitudes o diferencias,

cualitativas y cuantitativas, de sus mecanismos de acción, en el mismo punto o en

puntos distintos de la misma o distintas vías metabólicas, resultando una acción

predominantemente bactericida o bacterioestática, así como la concentración y las

proporciones.

4.1. - Efectividad de las asociaciones

Para inóculos del orden de 106 UFC/mL diferenciamos:

Sinergia, la definimos como un aumento en la tasa de muerte igual o mayor de

100 veces (≥2 log10), producida por la combinación respecto a la producida por el

más activo de los antimicrobianos.

Aditividad o sinergismo parcial lo definimos como un aumento en el rango de

100 a 10 (2 - 1 log10) veces en la tasa de muerte de la combinación, sobre la droga

más activa.

Indiferencia se define como cambios de ± 10 veces (± 1 log10) en la tasa de

muerte con la combinación, sobre la droga más activa.

Disminución o antagonismo parcial lo definimos como una disminución en el

rango de 100 a 10 (2 - 1 log10) veces de la tasa de muerte con la combinación, sobre la

droga más activa.

Antagonismo se define como un descenso ≥100 veces (≥2 log10), de la tasa de

muerte de la combinación sobre la droga más activa.

La fórmula empleada es: ∆∆∆∆neto = C - A


Resultados 167

Eficacia de la combinación (-∆∆∆∆ Log10 (UFC/mL) o C

Eficacia del antimicrobiano más activo (-∆∆∆∆ log10 (UFC/mL) o A

4.2. - Efectividad de las proporciones

Para poder comparar la eficacia intrínseca de las distintas proporciones,

dentro de una combinación de antimicrobianos, es necesario considerar los

resultados en términos relativos, a fin de oviar la influencia de la concentración.

Si consideramos la eficacia del antimicrobiano más activo como el 100% (A = -

∆∆∆∆ log10 (UFC/mL) = 100%); la eficacia de la combinación C en términos relativos

sería:

C% =(C/A)x100

Y el incremento de la eficacia de la combinación respecto al antimicrobiano

más activo sería:

∆∆∆∆% = C% - A% = [(Cx100/A)-100] = [100x(C-A)/A]

Fig. 26: Definición gráfica de la interacción antimicrobiana


Resultados 168

Tabla 47: Penicilina + Vancomicina. (CIM).

Resultados medios (log10(UFC/mL)). (n = 10)

Tiempo (hr) 0 2 4 6 8

4Pen+4Van 5,41 4,65 3,53 3,12 2,26

4Pen 5,41 5,02 4,21 3,21 3,01

4Van 5,41 4,89 4,15 3,53 2,97

∆% 0,0% 4,9% 14,9% 3,0% 23,8%

∆ neto 0,0 0,2 0,6 0,1 0,7

4Pen+Van 5,41 4,97 4,20 3,24 2,15

4Pen 5,41 5,02 4,21 3,21 3,01

Van 5,41 5,19 4,79 4,36 3,88

∆% 0,0% 0,9% 0,3% -0,9% 28,7%

∆ neto 0,0 0,0 0,0 0,0 0,9

4Pen+Van/4 5,41 4,91 4,35 3,49 2,69

4Pen 5,41 5,02 4,21 3,21 3,01

Van/4 5,41 5,72 6,20 6,99 7,97

∆% 0,0% 2,1% -3,2% -8,8% 10,5%

∆ neto 0,0 0,1 -0,1 -0,3 0,3

Pen+4Van 5,41 4,71 4,09 3,09 2,42

Pen 5,41 5,52 5,05 4,62 4,69

4Van 5,41 4,89 4,15 3,53 2,97

∆% 0,0% 3,7% 1,3% 12,5% 18,5%

∆ neto 0,0 0,2 0,1 0,4 0,5


Resultados 169

Tabla 47: Penicilina + Vancomicina. (Continuación)

Pen+Van 5,41 4,74 4,45 3,26 2,42

Pen 5,41 5,52 5,05 4,62 4,69

Van 5,41 5,19 4,79 4,36 3,88

∆% 0,0% 8,6% 7,1% 25,2% 37,6%

∆ neto 0,0 0,4 0,3 1,1 1,5

Pen+Van/4 5,41 5,37 4,71 3,94 3,81

Pen 5,41 5,52 5,05 4,62 4,69

Van/4 5,41 5,72 6,20 6,99 7,97

∆% 0,0% 2,7% 6,8% 14,9% 18,6%

∆ neto 0,0 0,1 0,3 0,7 0,9

Pen/4+4Van 5,41 5,01 4,13 3,28 2,63

Pen/4 5,41 5,93 6,56 7,75 9,11

4Van 5,41 4,89 4,15 3,53 2,97

∆% 0,0% -2,3% 0,5% 7,2% 11,6%

∆ neto 0,0 -0,1 0,0 0,3 0,3

Pen/4+Van 5,41 4,96 4,30 3,59 3,27

Pen/4 5,41 5,93 6,56 7,75 9,11

Van 5,41 5,19 4,79 4,36 3,88

∆% 0,0% 4,3% 10,2% 17,6% 15,7%

∆ neto 0,0 0,2 0,5 0,8 0,6

Pen/4+Van/4 5,41 5,51 5,32 5,77 6,25

Pen/4 5,41 5,93 6,56 7,75 9,11

Van/4 5,41 5,72 6,20 6,99 7,97

∆% 0,0% 3,6% 14,2% 17,4% 21,6%

∆ neto 0,0 0,2 0,9 1,2 1,7


Resultados 170

Fig. 27: Penicilina + Vancomicina. Incremento medio (log) de la combinación sobre el

antimicrobiano más activo

Fig. 28: Penicilina + Vancomicina. Incremento medio (%) de la combinación sobre el



Resultados 171

Tabla 48:.Resultados medios (log10(UFC/mL)). (n = 10)

de la combinación (CIM) Penicilina + Fosfomicina.

Tiempo (hr) 0 2 4 6 8

4Pen+4Fos 5,41 4,42 3,17 2,53 1,23

4Pen 5,41 4,66 3,72 2,81 1,40

4Fos 5,41 4,83 3,91 3,17 2,38

∆% 0,0% 5,3% 14,8% 9,8% 12,7%

∆ neto 0,0 0,2 0,6 0,3 0,2

4Pen+Fos 5,41 4,43 3,57 2,67 1,26

4Pen 5,41 4,66 3,72 2,81 1,40

Fos 5,41 5,07 4,64 4,66 4,96

∆% 0,0% 5,0% 4,0% 5,0% 10,2%

∆ neto 0,0 0,2 0,2 0,1 0,1

4Pen+Fos/4 5,41 4,64 3,90 2,58 1,05

4Pen 5,41 4,66 3,72 2,81 1,40

Fos/4 5,41 5,46 6,38 7,14 8,20

∆% 0,0% 0,5% -4,7% 8,0% 25,3%

∆ neto 0,0 0,0 -0,2 0,2 0,4

Pen+4Fos 5,41 4,64 3,59 2,56 1,27

Pen 5,41 4,89 4,47 3,87 3,77

4Fos 5,41 4,83 3,91 3,17 2,38

∆% 0,0% 4,0% 8,3% 19,1% 46,8%

∆ neto 0,0 0,2 0,3 0,6 1,1


Resultados 172

Tabla 48: Penicilina + Fosfomicina (Continuación)

Pen+Fos 5,41 4,68 3,97 2,63 1,67

Pen 5,41 4,89 4,47 3,87 3,77

Fos 5,41 5,07 4,64 4,66 4,96

∆% 0,0% 4,3% 11,2% 32,2% 55,7%

∆ neto 0,0 0,2 0,5 1,2 2,1

Pen+Fos/4 5,41 4,97 4,32 3,06 2,22

Pen 5,41 4,89 4,47 3,87 3,77

Fos/4 5,41 5,46 6,38 7,14 8,20

∆% 0,0% -1,7% 3,4% 21,0% 41,2%

∆ neto 0,0 -0,1 0,2 0,8 1,6

Pen/4+4Fos 5,41 4,51 3,95 2,42 1,52

Pen/4 5,41 5,53 5,61 6,28 7,75

4Fos 5,41 4,83 3,91 3,17 2,38

∆% 0,0% 6,7% -1,1% 23,8% 36,3%

∆ neto 0,0 0,3 0,0 0,8 0,9

Pen/4+Fos 5,41 5,03 4,28 3,46 2,36

Pen/4 5,41 5,53 5,61 6,28 7,75

Fos 5,41 5,07 4,64 4,66 4,96

∆% 0,0% 0,7% 7,7% 25,6% 52,4%

∆ neto 0,0 0,0 0,4 1,2 2,6

Pen/4+Fos/4 5,41 5,24 5,09 5,18 5,22

Pen/4 5,41 5,53 5,61 6,28 7,75

Fos/4 5,41 5,46 6,38 7,14 8,20

∆% 0,0% 4,1% 9,3% 17,5% 32,7%

∆ neto 0,0 0,2 0,5 1,1 2,5


Resultados 173

Fig. 29: Penicilina + Fosfomicina. Incremento medio (log) de la combinación sobre el


Fig. 30: Penicilina + Fosfomicina: Incremento (%) de la combinación sobre el



Resultados 174

Tabla 49: Resultados (log10(UFC/mL). medios (n = 10)

de la combinación (CIM) Ceftriaxona + Vancomicina.

Tiempo (hr) 0 2 4 6 8

4Ctr+4Van 5,40 4,90 3,85 3,01 2,06

4Ctr 5,40 5,20 4,61 3,66 3,22

4Van 5,40 5,23 3,98 3,48 2,62

∆% 0,0% 5,8% 3,4% 13,4% 21,5%

∆ neto 0,0 0,3 0,1 0,5 0,6

4Ctr+Van 5,40 4,81 3,88 3,30 2,68

4Ctr 5,40 5,20 4,61 3,66 3,22

Van 5,40 5,20 4,72 4,34 4,03

∆% 0,0% 7,4% 15,8% 9,7% 16,8%

∆ neto 0,0 0,4 0,7 0,4 0,5

4Ctr+Van/4 5,40 5,17 4,60 3,75 2,89

4Ctr 5,40 5,20 4,61 3,66 3,22

Van/4 5,40 5,86 6,45 7,18 8,15

∆% 0,0% 0,5% 0,1% -2,5% 10,1%

∆ neto 0,0 0,0 0,0 -0,1 0,3

Ctr+4Van 5,40 5,03 3,89 3,13 2,62

Ctr 5,40 5,62 5,72 6,09 6,14

4Van 5,40 5,23 3,98 3,48 2,62

∆% 0,0% 3,8% 2,4% 10,1% 0,0%

∆ neto 0,0 0,2 0,1 0,4 0,0


Resultados 175

Tabla 49: Ceftriaxona + Vancomicina. (Continuación)

Ctr+Van 5,40 4,97 4,27 3,53 3,28

Ctr 5,40 5,62 5,72 6,09 6,14

Van 5,40 5,20 4,72 4,34 4,03

∆% 0,0% 4,5% 9,6% 18,5% 18,7%

∆ neto 0,0 0,2 0,5 0,8 0,8

Ctr+Van/4 5,40 5,32 4,85 4,62 4,41

Ctr 5,40 5,62 5,72 6,09 6,14

Van/4 5,40 5,86 6,45 7,18 8,15

∆% 0,0% 5,4% 15,2% 24,0% 28,1%

∆ neto 0,0 0,3 0,9 1,5 1,7

Ctr/4+4Van 5,40 5,30 4,11 3,47 2,85

Ctr/4 5,40 6,02 7,17 8,48 9,49

4Van 5,40 5,23 3,98 3,48 2,62

∆% 0,0% -1,3% -3,1% 0,2% -8,7%

∆ neto 0,0 -0,1 -0,1 0,0 -0,2

Ctr/4+Van 5,40 5,03 4,52 3,63 3,31

Ctr/4 5,40 6,02 7,17 8,48 9,49

Van 5,40 5,20 4,72 4,34 4,03

∆% 0,0% 3,3% 4,3% 16,3% 18,0%

∆ neto 0,0 0,2 0,2 0,7 0,7

Ctr/4+Van/4 5,40 5,39 5,85 6,47 6,76

Ctr/4 5,40 6,02 7,17 8,48 9,49

Van/4 5,40 5,86 6,45 7,18 8,15

∆% 0,0% 8,0% 9,3% 10,0% 17,0%

∆ neto 0,0 0,5 0,6 0,7 1,4


Resultados 176

Fig. 31: Ceftriaxona + Vancomicina. Incremento medio (log) de la combinación sobe el


Fig. 32: Ceftriaxona + Vancomicina. Incremento medio (%) de la combinación sobre el

antimicrobianos más activo


Resultados 177

Tabla 50: Resultados (log10(UFC/mL). medios (n = 10) de

la combinación (CIM) Ceftriaxona + Fosfomicina

Tiempo (hr) 0 2 4 6 8

4Ctr+4Fos 5,40 4,64 3,97 2,66 1,26

4Ctr 5,40 4,67 4,08 3,16 1,89

4Fos 5,40 5,03 3,89 3,17 2,21

∆% 0,0% 0,5% -2,2% 15,8% 33,7%

∆ neto 0,0 0,0 -0,1 0,5 0,6

4Ctr+Fos 5,40 4,56 4,12 2,56 1,43

4Ctr 5,40 4,67 4,08 3,16 1,89

Fos 5,40 4,97 4,68 4,83 5,00

∆% 0,0% 2,2% -1,1% 19,2% 24,5%

∆ neto 0,0 0,1 0,0 0,6 0,5

4Ctr+Fos/4 5,40 4,78 4,21 3,03 1,31

4Ctr 5,40 4,67 4,08 3,16 1,89

Fos/4 5,40 5,71 6,44 7,44 8,58

∆% 0,0% -2,3% -3,3% 4,3% 30,9%

∆ neto 0,0 -0,1 -0,1 0,1 0,6

Ctr+4Fos 5,40 4,68 3,84 2,58 1,34

Ctr 5,40 4,85 4,83 4,43 3,52

4Fos 5,40 5,03 3,89 3,17 2,21

∆% 0,0% 3,5% 1,4% 18,4% 39,6%

∆ neto 0,0 0,2 0,1 0,6 0,9


Resultados 178

Tabla 50: Ceftriaxona + Fosfomicina (Continuación)

Ctr+Fos 5,40 4,84 4,16 2,90 1,43

Ctr 5,40 4,85 4,83 4,43 3,52

Fos 5,40 4,97 4,68 4,83 5,00

∆% 0,0% 0,1% 11,1% 34,5% 59,3%

∆ neto 0,0 0,0 0,5 1,5 2,1

Ctr+Fos/4 5,40 4,95 4,52 3,98 2,47

Ctr 5,40 4,85 4,83 4,43 3,52

Fos/4 5,40 5,71 6,44 7,44 8,58

∆% 0,0% -2,0% 6,4% 10,3% 29,8%

∆ neto 0,0 -0,1 0,3 0,5 1,0

Ctr/4+4Fos 5,40 4,77 3,84 2,72 1,38

Ctr/4 5,40 5,67 6,28 7,46 8,84

4Fos 5,40 5,03 3,89 3,17 2,21

∆% 0,0% 5,3% 1,3% 14,1% 37,8%

∆ neto 0,0 0,3 0,1 0,4 0,8

Ctr/4+Fos 5,40 4,97 4,38 3,66 3,05

Ctr/4 5,40 5,67 6,28 7,46 8,84

Fos 5,40 4,97 4,68 4,83 5,00

∆% 0,0% 0,0% 6,3% 24,1% 39,0%

∆ neto 0,0 0,0 0,3 1,2 2,0

Ctr/4+Fos/4 5,40 5,40 5,31 5,77 6,31

Ctr/4 5,40 5,67 6,28 7,46 8,84

Fos/4 5,40 5,71 6,44 7,44 8,58

∆% 0,0% 4,8% 15,5% 22,5% 26,4%

∆ neto 0,0 0,3 1,0 1,7 2,3


Resultados 179

Fig. 33: Ceftriaxona + Fosfomicina: Incremento medio (log) de la combinación sobre el


Fig. 34: Ceftriaxona + Fosfomicina: Incremento medio (%) de la combinación sobre el



Resultados 180

Tabla 51: Resultados (log (UFC/mL) medios (n = 10) delas distintas combinaciones

Tiempo (hr) 2 4 6 8

(Ctr+Fos) vs Ctr 4,80 4,20 2,90 1,40

Ctr 4,80 4,80 4,40 3,50

Fos 5,00 4,70 4,80 5,00

∆% 0,1% 11,1% 34,5% 59,3%

∆ neto 0 0,5 1,5 2,1

(Ctr+Van) vs Van 5,00 4,30 3,50 3,30

Ctr 5,60 5,70 6,10 6,10

Van 5,20 4,70 4,30 4,00

∆% 4,5% 9,6% 18,5% 18,7%

∆ neto 0,2 0,5 0,8 0,8

(Pen+Fos) vs Pen 4,70 4,00 2,60 1,70

Pen 4,90 4,50 3,90 3,80

Fos 5,10 4,60 4,70 5,00

∆% 4,3% 11,2% 32,2% 55,7%

∆ neto 0,2 0,5 1,2 2,1

(Pen+Van) vs Van 4,70 4,40 3,30 2,40

Pen 5,50 5,10 4,60 4,70

Van 5,20 4,80 4,40 3,90

∆% 8,6% 7,1% 25,2% 37,6%

∆ neto 0,4 0,3 1,1 1,5


Resultados 181

Fig. 35: Combinaciones [CIM+CIM] vs CIM. Incremento medio (log) del efecto de la

combinación sobre el antimicrobiano más activo

Fig. 36: Combinaciones [CIM + CIM] vs CIM. Incremento (%) el efecto de la combinación

sobre el antimicrobiano más activo (100%)


Resultados 182


Discusión 183

DISCUSIÓN

El rápido y generalizado desarrollo de la resistencia del Streptococcus

pneumoniae a penicilina y otros antimicrobianos, ha hecho que el tratamiento

antimicrobiano de las infecciones neumocócicas antes relativamente sencillo, esté

sujeto a revisiones conforme varía el perfil de sensibilidad del patógeno. Numerosas

publicaciones en los años setenta relataban aislamientos con CIMs de 0,1 a 1 µg/mL

asociados a fallos clínicos en pacientes con meningitis tratados con penicilina, lo que

llevó a la conclusión de que con la penicilina a dosis normales no se obtenían

niveles suficientes contra dichas cepas, y al consenso en los años ochenta, sobre el

uso de cefalosporinas de tercera generación como alternativa terapeútica de

elección.

Diversos autores han publicado en los últimos años, un aumento significativo

de la prevalencia de cepas resistentes a cefalosporinas de tercera generación,

aunque se han descrito relativamente pocos fracasos terapéuticos, generalmente en

casos de meningitis, tal vez por que en parte se pudieron resolver con altas

concentraciones de cefalosporina en aislamientos con CIMs ≥ 1 µg/mL o la

utilización de fármacos como la vancomicina, el imipenem o diversas asociaciones

en los infrecuentes casos de CIMs ≥ 2 µg/mL (Bradley, 1991).

Las categorías de sensibilidad del S. pneumoniae dadas por el NCCLS en

1997 para los ß-lactámicos, están basadas en el tratamiento de las meningitis

neumocócicas, sin embargo para infecciones con otra localización, podrían utilizarse

mayores puntos de corte basados en consideraciones farmacocinéticas y

farmacodinámicas del lugar de infección. Una cepa de S. pneumoniae con CIM =

0,5 µg/mL puede ser resistente a penicilina si el microorganismo produce meningitis,

pero sensible si causa neumonía.

A la disminución de la sensibilidad a antimicrobianos, y a la alta mortalidad de

las meningitis neumocócicas, hay que añadir el aumento de las infecciones que S.

pneumoniae produce en inmunodeprimidos, grupo de población en aumento por

diversas causas, y motivo de la orientación de este trabajo hacia los ß-lactámicos

parenterales y sus posibles alternativas.

Las principales consideraciones para una dosificación óptima de los

antimicrobianos, en procesos graves como la meningitis son la penetración del


Discusión 184

antimicrobiano en el sitio de la infección (Schentag, 1989), la necesidad crítica de

conseguir efectos bactericidas, el modo de administración (intermitente o continuo)

con la posible obtención de efecto post-antibiótico, y la duración de la terapia, por lo

que hemos aplicado algunas de las técnicas microbiológicas que pueden aportar

datos sobres estas cuestiones.

Los estudios microbiológicos in vitro (Blaser, 1985, 1987), y los modelos animales in

vivo (Bergeron, 1981; Scheld, 1985; Schentag, 1991) son actualmente las técnicas que nos

proporcionan la valoración tanto de los nuevos como de los antimicrobianos clásicos,

de la actividad bactericida única o en diferentes asociaciones, frente a la población

cambiante de un patógeno como S. pneumoniae .

A pesar de que son numerosos los factores metodológicos que pueden influir

en los resultados obtenidos, lo que sin duda dificulta su estandarización, las curvas

de letalidad han sido utilizadas por numerosos autores como buenos predictores de

la actividad bactericida única o sinérgica in vitro. Su valoración debe realizarse en

función de otros parámetros como la CIM y los niveles terapéuticos conseguibles.

2.- Cepas bacterianas

Dada la laboriosidad de las técnicas de curvas de muerte y especialmente del

estudio del efecto post-antibiótico, el número de cepas seleccionadas ha sido

necesariamente limitado.

En la técnica de estudio simple de la acción bactericida mediante curvas de

letalidad, se seleccionaron cepas sensibles y con resistencia intermedia y alta a

penicilina, para valorar el efecto bactericida de los antimicrobianos elegidos, sobre

todo el espectro de susceptibilidad del S. pneumoniae.

Sin embargo, en los estudios del efecto post-antibiótico y de sinergia

antimicrobiana, seleccionamos cepas con resistencia intermedia y alta a penicilina,

ya que tratamos de observar aspectos farmacológicos que nos permitan valorar

opciones terapéuticas, como lo son la variación de las pautas medicamentosas o el

empleo de combinaciones antimicrobianas, ante respuestas clínicas insuficientes

asociadas a cepas resistentes a penicilina o cefalosporinas.

Por el método de sensibilidad con discos de oxacilina (1 µg) realizamos una

primera clasificación de las cepas estudiadas (datos no presentados), como un


Discusión 185

screening para la detección de cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes a

penicilina (NCCLS, 1997: M2-A6).

Este método no permite diferenciar entre cepas intermedia y altamente

resistentes a penicilina, y debe ajustarse a las condiciones del laboratorio para

minimizar los errores (Manninen, 1998)

Dowson et al. (Dowson, 1994) en un estudio de resistencia a oxacilina en cepas del

Reino Unido y España, encontraron que la adquisición de una PFP2x de baja

afinidad, confiere a las mutantes resistencia a oxacilina, cloxacilina y meticilina, así

como un nivel intermedio de resistencia a cefotaxima, permaneciendo por el

contrario sensibles a penicilina. En nuestro estudio las cepas clasificadas como

resistentes en función del halo de inhibición a oxacilina, se confirmaron con la

técnica de microdilución en caldo.

Las CIMs fueron determinadas por el método de microdilución descrito en el

apartado de material y métodos; recomendado por el National Committee For

Clinical Laboratory Standards 1997 (NCCLS, 1997: M7-A4).

3.- Método de recuento de viables.

3.1.- Limitaciones, precisión, reproducibilidad y umbral del método

Según la descripción establecida anteriormente, consideramos efecto

bactericida la muerte del 99,9% o más del inóculo inicial, lo que supone una caída de

3 o más puntos del logaritmo para inóculos del orden de 106 UFC/mL.

Para la determinación de la acción bactericida o el efecto post-antibiótico se

requiere del suficiente volumen de cultivo que permita el subcultivo periódico a lo

largo de la técnica. Oviamente el volumen subcultivado para recuento debe ser a su

vez lo suficientemente grande para detectar pequeñas poblaciones, especialmente si

tratamos de valorar el EPA por el método de dilución. Por el contrario el manejo de

grandes volúmenes en tubos limita, por excesivamente laborioso, el número de

ensayos (Pelletier, 1984).

El empleo de placas desechables de 16 pocillos de 2 mL y con tapa,

proporciona un volumen adecuado para el recuento repetido. Permite algunas de las

ventajas de los micrométodos como la facilidad de manipulación, sin que influyan

problemas característicos como la evaporación, lo que facilita enormemente este


Discusión 186

tipo de estudios (Barry, 1978; Prober, 1979). El subcultivo de 14 a 24 alícuotas como máximo

para el EPA, de 10µL (140 -240µL ) supone solamente un 7-14% del volumen total

de 2 mL.

El método de siembra directa de una pequeña alícuota de 10µL y de sus

diluciones decimales, reduce considerablemente otra potencial fuente de error,

particularmente importante si la siembra se realiza como en nuestro caso por goteo

sin extensión. Aunque no hemos utilizado concentraciones muy altas de

antimicrobianos, es posible que en la siembra directa (10-2) y aún en las primeras

diluciones los recuentos fueran menores debidos al arrastre de antimicrobiano, pero

ello es fácilmente detectable por un aumento de los recuentos en las diluciones

superiores.

Barry et al. (Barry, 1979) estudió la precisión de los recuentos de Streptococcus

faecalis obtenidos mediante pequeños muestreos de 1µL a 25µL realizados con

micropipetas o asas calibradas desde microplacas o tubos, y sembrados por goteo

en secciones de 1/8 de placas de 15 cm MH. Encontrando que la alícuota de 10µL

con micropipeta presentaba el menor coeficiente de variación (17,7%) y desviación

estándar (6,2) en el muestreo de volúmenes de 1 mL, por lo que lo recomendaba, al

igual que Pearson et al. (Pearson, 1980) para inóculos del orden de 1x106 UFC/mL.

Eliopoulos (Eliopoulos, 1991) también describe este método en la realización de

curvas de letalidad, declarando una variabilidad general del ± 10% para el recuento,

lo que supone una variación del logaritmo del recuento de ± 0,04 log10.

La siembra de xUFC contenidas en 10µL equivale a una dilución 1/100 en

UFC/mL

mL

xUFC

mL

L

L

xUFC ×=× 1001

1000

10

µµµµµµµµ

por lo que el umbral de detección se sitúa por encima de 1x102 UFC/mL,

suficiente para detectar el efecto bactericida sobre inóculos de 1x106 UFC/mL.

3.2.- Comparativa del medio de cultivo empleado. Autólisis

Para valorar la influencia del medio de cultivo empleado en el desarrollo de

las técnicas, y puesto que se trata de medir la variación de la población o cinética del

crecimiento, comparamos los resultados obtenidos sobre la cinética de crecimiento


Discusión 187

de los cultivos control, con el medio brain heart infusion (BHI) sin sangre, empleado

en anteriores pruebas, y los obtenidos en la experiencia actual con MHB2+5%LHB.

El uso de un medio con sangre lo avalan trabajos como el de Musher, donde

en presencia de una fuente de catalasa como los glóbulos rojos, el neumococo logra

sobrevivir de 0 a 4 ° C durante largo tiempo (Musher, 1995).

Otros medios con sangre o suplementados proporcionan buenos resultados

(D´Amato, 1987; Jorgensen, 1992; Marshall, 1993; Gratten, 1994), mientras que medios como el MHA

chocolatizado antagoniza la acción de teicoplanina y vancomicina, o los medios

Haemophilus test y Wilkins-Chalgren que no son capaces de desarrollar algunas

cepas de neumococos (Traub, 1996).

La concentración de Ca++ y Mg++ tienen una influencia importante sobre la

fisiología del neumococo (Trombe, 1992), y sobre la acción de los antimicrobianos

modificando parámetros como la CIM o el EPA (Amsterdam, 1996). Algunas quinolonas

pueden quelar iones metálicos, modificándose su acción. El Mg++ es el catión más

importante en la reducción del EPA y de la actividad bactericida de las quinolonas

(Marshall, 1994). La adición de Mg++ al medio hace descender en un 50% el EPA de

ofloxacino sobre S. aureus (Pastor, 1992b). El hecho de que se emplee para este estudio

el medio MHB2 con una cantidad ajustada cationes incluyendo Mg++ y Ca++, sin duda

contribuirá a su reproducibilidad, ya que la osmolaridad del medio afecta la unión de

los ß-lactámicos a las PBPs (Amsterdam, 1996).

Con el medio MHB2+LHB5%, en comparación con el medio sin sangre BHI,

se consiguen mejores rendimientos netos (UFC/mL) en los períodos de 0 a 10 horas

y de 0 a 24 horas, pero además aporta mayor estabilidad al cultivo si se considera el

tramo de 10 a 24 horas, correspondiente a la fase estacionaria y comienzo de los

procesos líticos, donde con MHB2+LHB5% la tasa relativa de muerte del control es

menor.

Para inóculos altos del orden de 1x108 UFC/mL el efecto es mucho más

pronunciado resultando generalmente en la muerte total del control sin antibiótico a

las 24 horas de incubación en la mayoría de los casos. En numerosos casos, la

autólisis impide valorar el efecto de los antibióticos mas allá de las diez horas de

incubación, por lo que decidimos descartar los resultados obtenidos a las 24 horas

en diversas pruebas.


Discusión 188

3.3.- Efecto de la variación en el tamaño del inóculo

La elaboración del inóculo no supone un hecho simple sobre el resultado

obtenible, que cambia según la especie y aún la cepa, pues no disponemos de una

población homogénea, y existen contingencias de carácter cualitativo y cuantitativo.

En un inóculo alto hay un mayor número de mutantes resistentes resultando una

tasa de supervivencia mayor. Tampoco todas las células se encuentran en la misma

fase de crecimiento. A concentraciones altas ≥ 108 UFC/mL en medios de cultivo

estancados se alcanza pronto la fase estacionaria.

Estudiamos la influencia que la variación en el tamaño del inóculo empleado,

tiene sobre el desarrollo de las técnicas (Anónimo, 1989; Greewood, 1997; Kennedy, 1996),

comparando los resultados obtenidos en el tiempo, con los antibióticos en el rango

de concentraciones estudiados, enfrentados a tamaños de 1x107 - 1x108 UFC/mL

(inóculo alto) y 1x105 - 1x106 UFC/mL (inóculo bajo).

En algunos trabajos que presentan una evaluación de la influencia del tamaño

del inóculo (Laverdiere, 1978; Mayhall, 1980; Kennedy, 1996) obtienen los inóculos altos mediante

incubación nocturna y en fase estacionaria, por lo que la influencia del tamaño del

inóculo que publican, puede ser debida en parte a la fase de crecimiento, estatus

metabólico de primera importancia según el mecanismo de acción del

antimicrobiano, y no solo al número de UFC/mL presentes.

En experiencia* anterior con S. pneumoniae utilizando concentraciones

bacterianas semejantes: 1x108 - 1x109 UFC/mL (inóculo alto) y 1x105 - 1x106

UFC/mL (inóculo bajo), donde empleamos directamente un cultivo nocturno,

inmediatamente después de ajustar la concentración con el espectrofotómetro, esto

es en fase estacionaria de crecimiento, constatamos importantes diferencias según

el inóculo empleado. Friedland et al. (Friedland, 1994) en un estudio de curvas de letalidad

con cepas de S. pneumoniae, sobre el efecto del tamaño y fase del inóculo, preparó

inóculos en fase estacionaria (cultivo nocturno directo), fase logarítmica temprana

(preincubación de 2 horas) y fase logarítmica media (preincubación de 4 horas);

encontrando variaciones significativas en los resultados hasta las 6-8 horas de

incubación, siendo después mínimas las diferencias de concentración.

* Bañón R. Memoria de licenciatura Acción de diversos antimicrobianos en la dinámica de

crecimiento del Streptococcus pneumoniae. 1991. Universidad de Granada.


Discusión 189

En el presente estudio realizamos una preincubación de al menos dos horas

después del ajuste de concentración a McF 0,5 SO4Ba, sin variar sustancialmente el

tamaño del inóculo como se demuestra por los recuentos control, conseguimos que

una parte importante del cultivo esté en fase inicial de crecimiento logarítmico, lo que

se demuestra a su vez por el incremento de la curva de crecimiento del control.

Si consideramos los datos a partir de obtenerse resultados bactericidas, esto

es desde las 6-8 horas, penicilina, ceftriaxona y esparfloxacino presentan, a

concentraciones iguales o menores a la CIM, las mismas tasas bactericidas frente a

inóculos altos y bajos. Vancomicina reúne generalmente mayores tasas de muerte a

inóculos altos (Tabla 27).

Imipenem, si bien presenta variación en sus tasas, esta es de signo contrario

en concentraciones consecutivas, y por tanto no relacionada con la concentración,

por lo que puede deberse a variaciones experimentales.

Por tanto, en los rangos de concentración del antimicrobiano y tamaño del

inóculo estudiados, ningún antibiótico presenta el denominado efecto del tamaño del

inóculo, esto es constantes y menores tasas de muerte frente a inóculos altos

(Tablas 24 a 28).

4.- Acción bactericida

4.1.- Antibióticos ββββ-lactámicos

4.1.1.- Cepas sensibles a penicilina

Frente a cepas sensibles a penicilina, los antibióticos ß-lactámicos siguen

presentando excelentes resultados (Tabla 31), obteniendo penicilina (CIM pen =

0,046 µg/mL), a la concentración de 4 µg/mL la muerte de todas las cepas a las 2

horas; y prácticamente a casi todas las concentraciones desde las 4 horas,

penicilina, imipenem (CIM imp = 0,032 µg/mL) y ceftriaxona (CIM ctr = 0,021 µg/mL)

Teniendo en cuenta que los puntos de corte recomendados se refieren

principalmente a procesos meníngeos, se admite que a pesar de la alta tasa de

resistencia a penicilina, esta se mantenga como antibiótico de elección en pacientes

inmunocompetentes con procesos no graves (Pallarés, 1987; Musher, 1995; Mensa, 1998).


Discusión 190

En cualquier caso, la elección del tratamiento debe fundarse en datos de

prevalencia de la resistencia a ß-lactámicos y en parámetros farmacocinéticos (Bradley,

1995; Azanza, 1989), hasta disponer de los datos microbiológicos de sensibilidad.

4.1.1.1. - Cepas resistentes a penicilina

El tratamiento de las infecciones producidas por S. pneumoniae resistente a

los antimicrobianos está cambiando, conforme cambia su perfil de sensibilidad. El

uso de diferentes pautas de dosificación o combinaciones de los antimicrobianos

conocidos, o el empleo de antimicrobianos nuevos con distintos mecanismos de

acción, son los principales enfoques frente a este problema (Kaplan, 1998).

Contra cepas resistentes a penicilina, la eficacia de los antimicrobianos en el

nuestro estudio y en otros publicados, es en general menor, especialmente como es

lógico, la de los ß-lactámicos que actúan sobre algunas dianas comunes (Pankuch, 1994).

Vancomicina y esparfloxacino en series más amplias (Visalli, 1996) no han mostrado

influenciarse por la resistencia a penicilina, sin embargo en nuestro trabajo, las

cepas resistentes a penicilina seleccionadas si presentan menor sensibilidad a

dichos antimicrobianos.

4.1.1.1.- Cepas resistentes a penicilina

El tratamiento de las infecciones producidas por S. pneumoniae resistente a

los antimicrobianos está cambiando, conforme cambia su perfil de sensibilidad. El

uso de diferentes pautas de dosificación o combinaciones de los antimicrobianos

conocidos, o el empleo de antimicrobianos nuevos con distintos mecanismos de

acción, son los principales enfoques frente a este problema (Kaplan, 1998).

Contra cepas resistentes a penicilina, la eficacia de los antimicrobianos en el

nuestro estudio y en otros publicados, es en general menor, especialmente como es

lógico, la de los ß-lactámicos que actúan sobre algunas dianas comunes (Pankuch, 1994).

Vancomicina y esparfloxacino en series más amplias (Visalli, 1996) no han mostrado

influenciarse por la resistencia a penicilina, sin embargo en nuestro trabajo, las

cepas resistentes a penicilina seleccionadas si presentan menor sensibilidad a

dichos antimicrobianos.


Discusión 191

4.1.1.2.- Cepas con resistencia intermedia a penicilina

Pallarés et al., (Pallarés, 1987) publican buenos resultados (0/3 muertes/casos

tratados) en neumonías por S. pneumoniae con CIMs de ≥ 0,1 a ≤ 1 µg/mL tratadas

con altas dosis de penicilina IV. Sin embargo, estos mismos autores, siete años

después (Pallarés, 1995) reconocen menores resultados (4/14) para el mismo tipo de

cepas y tratamiento.

Weingarten et al. (Weingarten, 1990) notifican un caso de fracaso terapéutico en el

tratamiento con penicilina de meningitis por una cepa con resistencia intermedia a

penicilina (CIM = 1 µg/mL), superado con cefotaxima (CIM = 0,125 µg/mL).

Tan et al. publican (Tan, 1992) 19 casos de infección sistémica por S.

pneumoniae con sensibilidad intermedia a penicilina, recomendando el tratamiento

empírico en casos de meningitis o sepsis con cefalosporinas de tercera.

Dagan et al. (Dagan, 1996) informan de mala respuesta clínica por el uso de

cefalosporinas orales frente a cepas de resistencia intermedia a penicilina.

La experiencia clínica a la fecha, nos demuestra que la respuesta a la terapia

con cefalosporinas de tercera, en casos de meningitis por neumococos con

resistencia intermedia a penicilina ha cambiado, informándose de fallos terapéuticos

en casos de meningitis (Bradley, 1991; Sloas, 1992; Chandy, 1994; Lonks, 1995; Raymond, 1995).

Los autores arriba mencionados (Tan, 1994) publican cinco casos de meningitis

neumocócica en niños originados por cepas con CIM a cefotaxima de 0,5 a 1 µg/mL

en los que se obtuvo la curación con cefotaxima a dosis de 200-225 mg/kg/día.

Actualmente algunos autores, considerando la baja prevalencia de resistencia

a cefalosporinas de tercera generación, mantienen la recomendación de utilizar altas

dosis en los casos de meningitis causadas por cepas con CIMpen de hasta 2 µg/mL

(Cabellos, 1995b, Viladrich, 1988; 1996).

En nuestro estudio penicilina � 1 µg/mL (CIM pen = 0,833 µg/mL) y

ceftriaxona ≥≥≥≥ 1 µg/mL (CIM ctr = 0,417 µg/mL), si bién lo logran la acción bactericida

en 2 de los 3 casos desde las cuatro horas, en el caso restante y con el rango de

concentraciones estudiadas no logran la muerte en 10 primeras horas de incubación.

Imipenem ≥≥≥≥ 1 µg/mL (CIM imp = 0,125 µg/mL) si alcanza mejores resultados con la

acción bactericida de las 3 cepas a las 4 horas (Tabla 32).

Aunque podría optarse por aumentar la dosis de penicilina, la dificultad para

obtener altos niveles en LCR, y considerando que superar la concentración de 5


Discusión 192

µg/mL en LCR conlleva el riesgo de encefalopatías y convulsiones (Mensa, 1998), nos

parece más razonable a la luz de nuestros resultados, que si el aislamiento se

confirma de resistencia intermedia a penicilina, el usar una cefalosporina de tercera

generación, pero teniendo en cuenta la posibilidad del fracaso, y debiendo pues

realizar al menos un control microbiológico del resultado (Kleiman, 1993). Otras opciones

serían el uso de imipenem o la asociación con vancomicina. En localizaciones

extrameníngeas la penicilina a altas dosis mantiene su utilidad.

4.1.1.1.3.- Cepas con alta resistencia a penicilina.

Sauve et al. (Sauve, 1996) de un estudio mediante modelo de neumonía en ratón

neutropénico, llegan a la conclusión de que ceftriaxona, a pesar de tener la misma

CIM que cefotaxima, es más eficaz a igual dosis, contra cepas de neumococo

altamente resistentes a penicilina y resistentes a cefalosporinas, por mantener

concentraciones por encima de la CIM durante más tiempo.

En nuestro estudio, frente a cepas altamente resistentes a penicilina, y

considerando que todas las cepas tenían una CIMpen de 2 µg/mL, en el límite de la

definición de alta resistencia, los efectos con ß-lactámicos son semejantes a los

obtenidos con cepas de resistencia intermedia, aunque para conseguir los mismos

resultados se requieran concentraciones superiores. Imipenem ≥≥≥≥ 2 µg/mL (CIM imp

= 0,334 µg/mL) es el primero en conseguir tasas bactericidas a las 6 horas, mientras

que penicilina 4 µg/mL (CIM pen = 2 µg/mL) y ceftriaxona ≥≥≥≥ 2 µg/mL (CIM ctr = 1

µg/mL) no lo consiguen hasta las 10 horas (Tabla 33).

Ceftriaxona presenta mejores resultados, pero la limitación de su dosis a 4

gramos diarios, puede también hacer desaconsejable su uso en solitario (Viladrich, 1994);

y en el caso de que la CIM a cefotaxima fuera ≥ 2 µg/mL estamos de acuerdo con

otros autores en el empleo de antimicrobianos alternativos como imipenem (Asensi,

1989; Balfour, 1996), a pesar de su menos actividad contra cepas resistentes a penicilina

(Pikis, 1997); o como vancomicina a dosis de al menos 1g/8-12 horas en perfusión lenta,

sola o asociada a una cefalosporina de tercera generación.

4.2.- Vancomicina

La eficacia de vancomicina contra cepas resistentes de Streptococcus

pneumoniae, ha sido demostrada en numerosos ensayos in vitro (Liñares, 1992; Spangler,


Discusión 193

1994; Pankuch, 1994b; Doit, 1994; Klugman: 1996b; Visalli, 1996; Knudsen, 1997) y en modelos animales (Beam,

1981; Cabellos, 1995). Beam comprueba mediante ensayos en conejos la efectividad de

vancomicina IV frente a cepas sensibles y resistentes de neumococos, obteniendo

efectos bactericidas con niveles en LCR semejantes a la CIM, no siendo necesario

alcanzar la CBM para ello.

Sin embargo Viladrich et al. (Viladrich, 1991) publican 4 casos de fracasos

terapéuticos de un total de 11 adultos tratados con vancomicina (7,5 mg/kg/ 6 horas)

y dexametasona. La penetración de la vancomicina depende en gran manera del

grado de inflamación, y se reduce significativamente por la acción de la

dexametasona (Paris, 1994; Cabellos, 1995), antiinflamatorio que no influye en la acción de

otros antimicrobianos (Lebel, 1988; Paris, 1994; Bradley, 1994; Kanra, 1995) Chesney et al. (Chesney,

1995) también presenta un caso de meningitis en paciente inmunocomprometido

tratado de septicemia neumocócica con cefotaxima y vancomicina, donde empleó

dosis de 40 mg/kg/día de vancomicina. Ambos casos ilustran la fina línea que existe

entre dosis efectivas o no en el tratamiento de meningitis por S. pneumoniae

resistentes, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Chesney

recomienda una dosificación inicial de vancomicina de 40-60 mg/kg/día esto es 10-

15 mg/kg/6horas. Otros autores con el fin de conseguir niveles suficientes en LCR,

han recomendado la administración intratecal.

En nuestro estudio (Tablas 31-33), vancomicina, aunque no es más eficaz

que los ß-lactámicos frente a cepas sensibles a penicilina, si demuestra una

capacidad bactericida suficiente para sustituir a penicilina o ceftriaxona en los casos

de cepas altamente resistentes a penicilina (CIM van = 0,417 µg/mL), donde logra la

muerte de todas las cepas en 8 primeras horas de incubación, si bién lo logran en 2

de los 3 casos a las 6 horas.

4.3.- Esparfloxacino

El impresionante desarrollo de las quinolonas en estos últimos años, ha dado

lugar a que moléculas como el esparfloxacino cuyos primeros ensayos in vitro (Fuch,

1993; Pankuch, 1994, 1997; Visalli, 1997) indicaban como un agente antineumocócico excelente,

se hayan visto rápidamente superadas en actividad, aspectos farmacocinéticos y

menor toxicidad, por otras nuevas sustancias como el trovafloxacino o el


Discusión 194

levofloxacino. Por ello recientemente, durante el desarrollo de esta tesis, el

esparfloxacino se ha dejado de comercializar.

En modelos animales la tasa de supervivencia de ratones infectados con

neumococos sensibles a penicilina fue superior con esparfloxacino frente a

ciprofloxacino (Azoulay-Dupuis, 1992). Entenza et al. (Entenza, 1994) usa un modelo animal de

endocarditis estreptocócica para comparar la eficacia de esparfloxacino versus

ceftriaxona, intentando mimetizar las cinéticas humanas de ambos fármacos.

Aunque ambos fueron capaces de eliminar las vegetaciones, el esparfloxacino lo

hizo más lentamente.

También ha demostrado su eficacia clínica en la neumonía comunitaria (Richard,

1998) así como en la exacerbaciones agudas de los procesos respiratorios

obstructivos (Allegra, 1996).

Esparfloxacino, como otras fluorquinolonas, presenta una actividad semejante

contra neumococos sensibles y resistentes a penicilina (Liñares, 1992; Spangler, 1992; Gootz,

1996; Fuchs, 1997b), y en nuestro estudio las CIM esp para los tres grupos de sensibilidad a

penicilina seleccionados, han sido muy semejantes con una amplitud de rango de

dos diluciones.

Encontramos que los mejores resultados los obtiene frente a cepas sensibles

a penicilina (CIM esp= 0,052 µg/mL) consiguiendo la acción bactericida de todas las

cepas entre las 6 y 10 horas (Tabla 32), estos son inferiores a los obtenidos por los

ß-lactámicos, aunque mejores que vancomicina. Contra cepas resistentes

intermedias (Tabla 32), a penicilina, esparfloxacino (CIM esp = 0,073 µg/mL) presenta

casi los mismos resultados que frente a cepas sensibles a penicilina, sólo

ligeramente inferiores en la concentración más baja.

Frente a cepas altamente resistentes (Tabla 33), a penicilina, esparfloxacino

(CIM esp = 0,177 µg/mL) obtiene menores y más tardíos resultados que los

conseguidos frente a cepas sensibles o con resistencia intermedia.

Aunque el esparfloxacino ha sido retirado del mercado, los resultados

obtenidos en este trabajo podrían trasladarse en parte a otros fármacos de

características similares en cuanto actividad antineumocócica y buena penetración

como el trovafloxacino (Tabla 52), con el que se han realizado estudios de meningitis

experimental en conejos (Paris, 1995b). Los resultados publicados y los obtenidos por

nosotros, abonan la posibilidad de las fluorquinolonas para el tratamiento de la


Discusión 195

infeciones graves neumocócicas. En cualquier caso son necesarios más estudios

experimentales y clínicos para asegurar la eficacia de las fluorquinolonas como

alternativa terapéutica en meningitis.

Tabla 52: Farmacocinética y actividad antineumocócica de esparfloxacino y trovafloxacino

Esparfloxacino Trovafloxacino

Concentración sérica (400 mg/PO) 2,54 µg/mL1 5,9 µg/mL2

Concentración en LCR3 0,42 µg/mL1 0,25 µg/mL4

Volumen de distribución 3,6 L/Kg 1,4 L/Kg

CIM90 S. pneumoniae 5 0,25 µg/mL 0,12 µg/mL

: Davey, 1994. : Vincent J., 1997. : Individuos sanosvoluntarios. : Cutler N.R. 1997. : Liñares, 1998

5.- Efecto post-antibiótico

Estudiamos el efecto post-antibiótico y su afectación por la concentración, y

tiempo de exposición al antimicrobiano, obtenido sobre cuatro cepas de S.

pneumoniae con resistencia intermedia y alta a penicilina, con penicilina, ceftriaxona,

imipenem, vancomicina y esparfloxacino a cinco concentraciones diferentes. El

objeto de dicho estudio es valorar la importancia del EPA como factor farmacológico.

5.2.- Limitaciones de la técnica

Para el efecto post-antibiótico se producen cambios, posiblemente

interrelacionados, en la síntesis proteica (Yan, 1994), modificación del tiempo de

generación y morfología celular (Lorian, 1991), susceptibilidad a los leucocitos

polimorfonucleares (Craig, 1991b), susceptibilidad a los antibióticos (Gudmundsson, 1994),

adherencia bacteriana (Shibl, 1995), etc.. Imipenem y otros ß-lactámicos con alta

afinidad por las PFP2 originan esferoplastos (Gudmundsson, 1986; Hanberger, 1990) que pueden

permanecer viables.

Los ensayos in vitro por cinética de muerte, presentan una limitación de su

sensibilidad, en cuanto a la detección del EPA debido a daños subletales, que no

afectan significativamente a las curvas de muerte, pero que trascienden en una

menor virulencia o capacidad del microorganismo para enfrentarse a los sistemas de

protección del hospedador (Davidson, 1991; Fuursted, 1997b), o como en el caso de las


Discusión 196

fluorquinolonas que incrementan su acción con la incorporación de suero (Davidson,

1991).

Esta restricción supone en primer lugar una base para la discrepancia de

resultados con los modelos animales (Zhanel, 1991; Craig, 1996), y lo que es más importante,

que los ensayos in vitro como el realizado por nosotros, pueden ser sólo una

aproximación al valor e importancia real del EPA.

Las concentraciones a las que ensayamos el EPA, son las mismas que las

recomendadas para las pruebas bactericidas (NCCLS, 1997), en un rango próximo a la

CIM del microorganismo, y suelen ser, en la mayoría de los casos, próximas a las

que se alcanzan en suero o líquidos orgánicos después de una dosis habitual del

antimicrobiano.

Hay que tener en cuenta que, si la concentración estudiada es alta, se

produce mucha letalidad y el EPA es difícil de medir, especialmente en los

antimicrobianos rápidamente bactericidas como imipenem y con la técnica de

dilución.

Por el contrario si las concentraciones ensayadas son excesivamente bajas,

por debajo de la CIM, tampoco se consigue demostrar EPA con la técnica de

recuento de viables.

Por ambas razones, en nuestro estudio no se ha podido determinar el EPA

en todos los casos, por ejemplo imipenem y vancomicina tras 1 hora en 15/25 y

16/25 casos, y tras 2 horas en 11/25 y 9/25 casos respectivamente (Tablas 38 a

41).

5.3.- Influencia de la concentración y el tiempo de exposición sobre el

EPA

Dado que el EPA es un aspecto de la acción bactericida, las categorías de

esta pueden trasladarse al EPA y por ejemplo, cuando utilizamos antimicrobianos

poco dependientes de la concentración como los ß-lactámicos contra cocos

grampositivos, tanto la actividad bactericida como el EPA aumentan con el

incremento de la concentración, hasta alcanzar un máximo generalmente alrededor

de 5 a 10 veces la CIM (Bundtzen, 1981; Gerber, 1993).

En nuestro estudio, la relación entre concentración media empleada de cada

antimicrobiano, y la CIM media de la cepa estudiada son semejantes, salvo en el


Discusión 197

caso de esparfloxacino, por lo que, como en el estudio de la acción bactericida, nos

mantenemos dentro de rangos donde el efecto es concentración-dependiente. Pero

aún incluyendo el caso del esparfloxacino, los EPAs medios conseguidos, tras un

tiempo de exposición de 1 hora, con los distintos antimicrobianos, son muy

semejantes: 0,75; 0,75; 0,72; 0,78 y 0,78 horas.(Tabla 44)

La tendencia de los resultados se representan mediante curvas de que

muestran unos coeficientes de determinación intermedios: imipenem (r2=0,53);

vancomicina (r2=0,47); penicilina (r2=0,31); ceftriaxona (r2=0,77) y esparfloxacino

(r2=0,63) (Fig. 36)

Los EPAs medios conseguidos tras 2 horas de exposición son: 1,40; 0,93;

0,87; 1,20 y 1,46 horas, no sólo son superiores, sino que presentan mayores

diferencias entre ellos, posiblemente debido a que la influencia del tiempo de

exposición es distinta para cada antimicrobiano (Tabla 45).

Estos resultados están de acuerdo con otros publicados para ß-lactámicos

Fig 36 EPA después de 1 hora de exposiciónEfecto de la concentración

Fig. 37: EPA después de 2 horas de exposición.Efecto de la concentración

Fig. 38Efecto de la concentración sobre el EPA encepas con resistencia intermedia a penicilina

Fig. 39: Efecto de la concentración sobre el EPAen cepas con resistencia alta a penicilina


Discusión 198

(Bundtzen, 1981), que producen a concentraciones de 5 CIMs, EPAS de 1-3 horas. Con

vancomicina frente a S. aureus, Cooper (Cooper, 1990). obtiene con 2-10 CIM EPAs de

0,2 - 2 horas, y Hanberger (Hanberger, 1991) EPAs de 0,5 a 1 hora y de forma semejante

a los ß-lactámicos, una baja dependencia de la dosis.

Los resultados se representan, mediante curvas con tendencia a un máximo,

con unos coeficientes de determinación generalmente más altos: imipenem

(r2=0,40); vancomicina (r2=0,69); penicilina (r2=0,34); ceftriaxona (r2=0,79) y

esparfloxacino (r2=0,66) (Fig. 37)

Comparando la relación entre EPA y concentración para cepas con

resistencia intermedia y alta a penicilina, podemos observar pautas diferentes según

el tiempo de exposición; y así en cepas con resistencia intermedia a penicilina se

aprecia EPA desde las primeras concentraciones y si bien en la primera hora la

relación parece lineal (r2=0,7), en la segunda hora el EPA conseguido es mucho

mayor y con tendencia a un máximo (r2=0,9) (Fig. 38).

Por el contrario las cepas altamente resistentes a penicilina (CIM ≥ 2 µg/mL)

en ningún caso empiezan a manifestar EPA hasta superar una concentración mayor

o igual a 2 µg*hr/mL; con un coeficiente de correlación de (r2 1 horas=0,71 y r2

2

horas=0,86) (Fig. 39).

Dado que los ß-lactámicos no presentan una actividad bactericida tan

dependiente de la concentración como aminoglucósidos o quinolonas, sino que su

actividad se relaciona mejor con la duración de la exposición, el hecho de que las

cepas altamente resistentes a penicilina estudiadas, necesiten concentraciones

superiores para manifestar EPAs, induce a pensar que ante este tipo de aislamiento

se debe vigilar especialmente que los niveles se mantengan por encima de la CIM

Fig. 40: Efecto del ABC sobre el EPA de distintosantimicrobianos, en cepas con resistencia

intermedia y alta a penicilina

Fig. 41: Efecto del ABC sobre el EPA de penicilina,en cepas con resistencia intermedia y alta a

penicilina


Discusión 199

durante todo el intervalo de dosificación. Existen numerosos datos clínicos que

documentan que la dosificación continua de ß-lactámicos es más eficaz que la

intermitente (Vogelman, 1986).

El todos los casos, el producto de la concentración por el tiempo de exposición (ABC

in vitro) se relaciona mejor con el EPA producido (Munckof, 1997). La media del producto

de la concentración por el tiempo de exposición, equivalente al ABC, tras un tiempo

de exposición de 1 hora, con los distintos antimicrobianos, son 1,44; 0,32; 0,38; 0,30

y 1,55 horas, mientras que los obtenidos tras 2 horas de exposición suelen ser

mayores: 2,56; 2,79; 0,53; 0,24 y 3,1 horas (Tablas 44 y 45).

La tendencia de los resultados se representan en el mediante curvas de que

presentan unos coeficientes de determinación excelentes: imipenem (r2=0,82);

vancomicina (r2=0,53); ceftriaxona (r2=0,71) y esparfloxacino (r2=0,63), salvo

penicilina (r2=0,35) (Fig.40)

Apreciamos un comportamiento similar del EPA/ABC respecto al de la

EPA/concentración, y así en cepas altamente resistentes a penicilina (CIM ≥ 2

µg/mL) no empiezan a manifestar EPA hasta superar una ABC ≥ 2 µg*hr/mL y un

coeficiente de correlación de (r2=0,85). Por

el contrario las cepas con resistencia

intermedia empiezan a mostrar EPA desde

el principio, también con un buen coeficiente

de correlación (r2=0,74) (Fig. 41)

De igual forma, ceftriaxona consigue

en cepas intermedias a ceftriaxona efecto

post-antibiótico a partir de concentraciones

por debajo de la CIM (r2=0,65), lo que

contribuiría a explicar la eficacia de altas

dosis de cefalosporinas frente a cepas con CIMctr ≤ 1 µg/mL (Fig. 42)

6.- Acción bactericida de los antimicrobianos en asociación

Se han descrito los resultados positivos in vitro e in vivo de numerosas

asociaciones antimicrobianas, alguna de las cuales: ß-lactámicos más vancomicina y

ß-lactámicos más fosfomicina, consideramos en este trabajo. Otras asociaciones

posibles frente a cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina, podrían ser ß-

Fig 42 Efecto del ABC sobre el EPA deceftriaxona, en cepas sensibles e intermedias a

ceftriaxona


Discusión 200

lactámicos más fluorquinolonas (Jenkins, 1993; Giron, 1995; Gimeno, 1998; Nicolau, 1998) , ß-

lactámicos más aminoglucósidos (Gross, 1995; Scaglione, 1995; Schegel, 1995), o ß-lactámicos más

otro betalactámico (Jones, 1998; Klugman, 1995; Schmutzhard, 1995) que actúen de forma diferente

sobre las PFPs, ß-lactámicos más rifampicina (Tubau, 1996), fluorquinolonas más

glicopéptidos o rifampicina (Klugman, 1996b), y glicopéptidos más aminoglucósidos (Martínez,

1993)

6.1. - Efectividad de las asociaciones

6.1.1. - ß-lactámicos más vancomicina

La eficacia de distintas combinaciones de ß-lactámicos con glicopéptidos ha

sido publicada en numerosos artículos (Barr, 1990; Cassinat, 1994; Cabellos, 1995, Klugman, 1995;

Lhopital, 1996)

Friedland et al., (Friedland, 1993b, 1994c) encontraron sinérgica la asociación de

ceftriaxona con vancomicina frente a S. pneumoniae resistentes a penicilina y

cefalosporinas, tanto in vivo en modelo experimental de meningitis, como in vitro

mediante curvas de muerte. Klugman et al., (Klugman, 1995) en un estudio de meningitis

tratadas con diferentes pautas antibióticas, demuestran que los LCR de los

pacientes tratados con ceftriaxona más vancomicina presentaron mayor actividad

bactericida frente a S. pneumoniae con sensibilidad disminuída a ceftriaxona, que

los tratados con ceftriaxona sola, por lo que recomienda dicha asociación para el

tratamiento de las meningitis por cepas resistentes a cefalosporinas de tercera

generación.

Sin embargo otros trabajos no consiguen demostrar sinergia, Doit et al. (Doit,

1997) en un estudio multicéntrico sobre meningitis neumocócicas en niños tratados

con altas dosis de cefotaxima y vancomicina, mediante ensayos bactericidas en LCR

halla una interacción aditiva. Tubau et al. , (Tubau, 1996b) encuentra la asociación

ceftriaxona más vancomicina indiferente aunque con cierta actividad bactericida.

Chesney et al. (Chesney, 1995) publica un fracaso terapéutico inicial de un tratamiento

con ceftriaxona más vancomicina en paciente inmunocomprometido.

Las asociaciones de penicilina o ceftriaxona con vancomicina en nuestro

estudio (Figs. 27, 28, 31 y 32) no han demostrado sinergismo neto ( ≥ 2 log10) sobre

la acción del antimicrobiano más activo, sin embargo ambas combinaciones fueron

bactericidas, llegando a mostrar un sinergismo parcial (>1log10) a partir de las 6


Discusión 201

horas incluso a concentraciones por debajo de la CIM, normalmente obtenibles en

LCR en casos de meningitis (Klugman, 1995b).

6.1.2. - ß-lactámicos más fosfomicina

Las asociaciones de ß-lactámicos más fosfomicina se han mostrado eficaces

frente a cocos grampositivos (Ferrara, 1997). Frente a S. pneumoniae Cassinat et al.

(Cassinat, 1994) mediante técnicas de concentraciones cruzadas, y Chavanet et al.

(Chavanet, 1995) mediante curvas de muerte e in vivo mediante coágulos infectados,

comprueba la eficacia de la asociación de fosfomicina a ceftriaxona o cefotaxima,

proponiendo su uso en el tratamiento de la infecciones neumocócicas. Nau et al. (Nau,

1995) con un modelo de meningitis neumocócica en conejo, a pesar de su buena

farmacocinética en el SNC, descarta por ineficaz el uso de fosfomicina en solitario,

pero por su efecto aditivo sobre la acción de la ceftriaxona, lo propone en

combinación cuando falla la monoterapia con cefalosporinas. Tubau, (Tubau, 1996c)

observa una sinergia total (FIC ≤ 0,5) en la combinación de ceftriaxona con

fosfomicina frente a una cepa de neumococo resistente a penicilina y cefotaxima; y

si bién encuentra un incremento de la actividad bactericida en la asociación de

penicilina más fosfomicina a las 6 horas, a las 24 horas la cepa estudiada desarrolló

resistencia a fosfomicina cuando se estudió en solitario o asociada a penicilina.

Nuestros resultados están de acuerdo con la eficacia de la combinación de

fosfomicina con ß-lactámicos, mostrando las combinaciones de penicilina o

ceftriaxona más fosfomicina efectos sinérgicos parciales desde las 6 horas,

alcanzando efectos sinérgicos netos (≥2log10) a las 8 horas (Figs. 29, 30, 33 y 34).

Si presumiblemente por su bajo peso molecular, la penetración en el SNC de

la fosfomicina no es afectada por la acción de la dexametasona, sería una ventaja

añadida que apoya el que se realicen los necesarios ensayos clínicos para asegurar

su eficacia.

6.2. - Eficacia de las proporciones

Para poder comparar la eficacia intrínseca de una determinada proporción,

dentro de una combinación de antimicrobianos, es necesario considerar los

resultados en términos relativos, a fin de reducir la influencia de la concentración. En

todos los casos la proporción más efectiva en términos relativos fue 1CIM + 1CIM,


Discusión 202

salvo ceftriaxona más vancomicina que fue 1CIM ceftriaxona + 1/4CIM de

vancomicina. Y en general, la eficacia relativa de las asociaciones fue mayor,

cuando el antimicrobiano primario se encuentra a concentraciones CIM o 1/4CIM

(Figs. 35 y 36).


Conclusiones 203

Conclusiones

1.- Dentro del rango estudiado de concentración del inóculo, y en las

condiciones bajo las que desarrollamos las técnicas, no apreciamos que un aumento

en la densidad del inóculo produzca un descenso de la acción bactericida.

2.- Encontramos que el medio de cultivo actualmente recomendado, caldo

Muller-Hinton ajustado en cationes y suplementado con sangre, proporciona un

incremento en la capacidad de desarrollo y mantenimiento de la viabilidad de las

cepas estudiadas.

3.- Frente a cepas de neumococos sensibles a penicilina, encontramos que ß-

lactámicos de primera linea como penicilina o ceftriaxona, mantienen una eficacia

bactericida excelente, sin que otros antimicrobianos estudiados en este trabajo

aporten ventajas significativas, salvo casos de hipersensibilidad medicamentosa.

4.- Frente a cepas con resistencia intermedia a penicilina, la ceftriaxona ofrece

buenos resultados, siendo otras posibles opciones el imipenem, o la asociación de

vancomicina a ceftriaxona o cefotaxima.

5.- Frente a cepas con alta resistencia a penicilina consideramos más

recomendable el uso de antimicrobianos alternativos como el imipenem, siendo la

asociación de ceftriaxona con vancomicina otra opción.

6.- La actividad bactericida in vitro del esparfloxacino se muestra adecuada

frente a cepas sensibles y resistentes a penicilina, por lo que consideramos que las

fluorquinolonas deben estudiarse como alternativa terapéutica en los procesos

graves por neumococos resistentes a ß-lactámicos.


Conclusiones 204

7.- En los rangos de concentración y tiempo de exposición estudiados, los

EPAs producidos por todos los antimicrobianos, no son de suficiente magnitud para

apoyar una administración que no mantenga niveles constantes por encima de las

CIMs.

8.- El hecho de que las cepas altamente resistentes a penicilina no manifiesten

EPAs a concentraciones por debajo de las CIMs, lo consideramos como un aspecto

más de la resistencia a penicilina.

9.- Por el contrario, el hecho de que se produzca algún grado de EPA con

ceftriaxona a concentraciones por debajo de la CIM, frente a cepas con sensibilidad

intermedia a ceftriaxona, está de acuerdo con el hecho de su eficacia en dichos

casos.

10.- La combinación ß-lactámicos más vancomicina, resulta normalmente

superior al antimicrobiano más activo. Aunque no hemos podido demostrar efecto

sinérgico, este hecho puede justificar su empleo clínico.

11.- La asociación de ß-lactámicos más fosfomicina resulta de una eficacia

mayor, llegando a conseguir efectos sinérgicos. Sin embargo son necesarias más

pruebas experimentales y clínicas para poder asegurar su eficacia en procesos

graves.


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Apéndices 269

Apéndice I: Curvas de letalidad

Apéndice II: Efecto post-antibiótico

Apéndice III: Combinación de antimicrobianos

Apendice I: Curvas de letalidad 249

Apéndice I: Curvas de letalidad

Apendice II: Efecto post-antibiótico 305

Apéndice II: Efecto post-antibiótico

Apendice II: Combinaicón de antimicrobianos 327

Apéndice III: Combinaicón de antimicrobianos

Universidad de Málaga · ha sido realizada bajo mi dirección en condiciones que la hacen...

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