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UNIVERSIDAD DE MURCIA FACULTAD DE VETERINARIA

Ingredientes Funcionales en Fórmulas Infantiles que afectan al Equilibrio de

la Microbiota Intestinal del Lactante y a la Absorción y Disponibilidad de

Minerales.

Patricia Peso Echarri

2012

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA DE

LOS ALIMENTOS, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA.

FACULTAD DE VETERINARIA

TESIS DOCTORAL

“INGREDIENTES FUNCIONALES EN FÓRMULAS INFANTILES QUE AFECTAN

AL EQUILIBRIO DE LA MICROBIOTA INTESTINAL DEL LACTANTE Y A LA ABSORCIÓN Y DISPONIBILIDAD DE

MINERALES”

Patricia Peso Echarri

Directores: Carmen Martínez Graciá Carmen Frontela Saseta

Murcia, 2012

I

ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN................................................................................................................ 1

II. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 5

III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 7

1. Nutrición del lactante ...................................................................................................... 7 1.1. Desarrollo y maduración gastrointestinal ........................................................................ 7 1.2. Digestión y absorción de proteínas .................................................................................. 9 1.3. Digestión y absorción de lípidos ..................................................................................... 10 1.4. Digestión y absorción de carbohidratos ......................................................................... 11 2. Lactancia artificial. Fórmulas infantiles ........................................................................ 12 2.1. Antecedentes históricos ................................................................................................. 12 2.2. Normativa actual ............................................................................................................ 14 2.3. Ingredientes funcionales y tendencias actuales en fórmulas infantiles ........................ 16 2.4. Componentes proteicos en fórmulas infantiles ............................................................. 18 3. α‐lactoalbúmina ............................................................................................................ 21 3.1. Funciones de la α‐lactoalbúmina .................................................................................. 22 3.2. Estructura la proteína α‐lactoalbúmina ......................................................................... 23 3.3. Bioactividad de la proteína α‐lactoalbúmina ................................................................. 25 4. Compuestos nitrogenados no proteicos: nucleótidos .................................................. 35 4.1. Bioactividad de los nucleótidos ...................................................................................... 37 5. Biodisponibilidad mineral ............................................................................................. 41 5.1. Métodos de estudio de la biodisponibilidad mineral ..................................................... 42 5.1.1. Métodos de estudios in vivo .......................................................................................... 43 5.1.2. Métodos de estudio in vitro ........................................................................................... 45 5.1.3. Métodos de estudio con líneas celulares ....................................................................... 45 5.2. Biodisponibilidad de calcio ............................................................................................. 47 5.2.1. Absorción y regulación del calcio ................................................................................... 47 5.2.2. Homeostasis de calcio en el recién nácido ..................................................................... 51 5.2.3. Deficiencia y exceso de calcio en la infancia .................................................................. 52 5.3. Biodisponibilidad de hierro ............................................................................................ 54 5.3.1. Absorción de hierro ........................................................................................................ 54 5.3.2. Homeostasis de hierro en el recién nácido .................................................................... 56 5.3.3. Patologías asociadas al desequilibrio del hierro en la infancia ...................................... 57 5.4. Biodisponibilidad de cinc ................................................................................................ 59 5.4.1. Absorción de cinc ........................................................................................................... 59 5.4.2. Homeostasis de cinc en el recién nácido ....................................................................... 63 5.4.3. Deficiencia de cinc en la infancia.................................................................................... 63 6. Evolución de la microbiota intestinal en lactantes....................................................... 65 6.1. Importancia de la microbiota intestinal en la salud del hospedador ............................. 67 6.2. Colonización de la microbiota intestinal en el neonato ................................................. 72 6.3. Factores que intervienen en la colonización .................................................................. 75

II

6.4. Perspectivas futuras en la modificación de la microbiota intestinal ............................. 79 IV. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 81

1. Diseño experimental ..................................................................................................... 81 2. Muestras: ingredientes, fórmulas infantiles y leche materna ..................................... 85 1.1. Ingredientes ................................................................................................................... 85 1.2. Fórmulas infantiles y leche materna .............................................................................. 85 3. ESTUDIO I: Biodisponibilidad mineral in vitro. Captación transporte y retención de calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2. ............................................................. 88 3.1. Material, reactivos y equipos de laboratorio ................................................................. 88 3.2. Cultivo celular de la línea Caco‐2 ................................................................................... 89 3.2.1. Mantenimiento celular y subcultivo .............................................................................. 90 3.2.2. Recuento y viabilidad celular ......................................................................................... 91 3.2.3. Congelación ................................................................................................................... 92 3.2.4. Crecimiento y diferenciación celular .............................................................................. 92 3.2.5. Permeabilidad y toxicidad celular .................................................................................. 93 3.3. Estudio de captación retención y transporte mineral mediante el empleo de la línea celular Caco‐2 .............................................................................................................................. 95 3.4. Ensayo 1: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de soluciones patrón de minerales con y sin los ingredientes de estudio .......................................................................................... 96 3.4.1. Procesado de los ingredientes de estudio ..................................................................... 96 3.4.2. Soluciones estándar de minerales y su preparación ...................................................... 97 3.4.3. Procedimiento ................................................................................................................ 97 3.5. Ensayo 2: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de una fórmula infantil suplementada con ingredientes funcionales ............................................................................. 98 3.5.1. Muestras ......................................................................................................................... 98 3.5.2. Digestión gastrointestinal in vitro .................................................................................. 98 3.5.3. Acondicionamiento de la fracción soluble y adición de dicha fracción a la monocapa celular .......................................................................................................................................... 99 3.6. Destrucción de la materia orgánica y obtención de la fracción mineral ...................... 100 3.7. Determinación de Fe, Ca y Zn (EAA) ............................................................................ 100 3.8. Evaluación de la morfología de las células Caco‐2 expuestas a dos concentraciones de nucleótidos ................................................................................................................................ 102 3.9. Análisis estadístico ....................................................................................................... 102 4. ESTUDIO II: Evaluación de la actividad funcional de la fórmula infantil suplementada con suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA y de sus ingredientes. ........ 103 4.1. Reactivos, material y equipos de laboratorio .............................................................. 105 4.2. Ensayo 1: Crecimiento de diferentes especies bacterianas intestinales sometidas a los ingredientes de estudio. Estudio preliminar ............................................................................. 107 4.1.1. Digestión gastrointestinal in vitro de los ingredientes ................................................ 107 4.1.2. Evaluación del crecimiento microbiano ..................................................................... 107 4.1.3. Procesado de los resultados y análisis estadístico ...................................................... 109 4.3. Ensayo 2: Evolución de la microbiota fecal expuesta a los diferentes ingredientes objeto de estudio ..................................................................................................................... 109 4.3.1. Procesado de los ingredientes .................................................................................... 110

III

4.3.2. Preparación del inóculo fecal ....................................................................................... 110 4.3.3. Medio de cultivo e inoculación del mismo. ................................................................. 110 4.3.4. Estudio de la microbiota fecal mediante PCR cuantitativa .......................................... 112 4.3.5. Medida de pH .............................................................................................................. 115 4.3.6. Análisis de ácidos grasos de cadena corta .................................................................. 115 4.3.7. Análisis estadístico. .................................................................................................... 117 5. ESTUDIOS III y IV. Estudios in vivo............................................................................... 118 5.1. Ensayo clínico .............................................................................................................. 118 5.2. Aspectos éticos y consentimiento informado .............................................................. 119 5.3. Reactivos, material y equipos de laboratorio PCR en tiempo real .............................. 122 5.4. Participantes ................................................................................................................ 123 5.5. Fórmulas infantiles ...................................................................................................... 123 5.6. Recogida de las muestras fecales ................................................................................. 124 5.7. PCR cuantitativa ........................................................................................................... 124 5.8. Análisis estadístico ...................................................................................................... 127 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 129

1. Estudio I: Biodisponibilidad mineral in vitro. Captación, transporte y retención de calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2. ........................................................... 129 1.1. Viabilidad y crecimiento de la línea celular Caco‐2 vitro ............................................. 129 1.2. Diferenciación celular ................................................................................................... 131 1.3. Evaluación de la permeabilidad aparente: prueba rojo fenol ...................................... 132 1.4. Ensayo de toxicidad de los ingredientes utilizados en este estudio ........................... 133 1.5. Ensayo 1: Evaluación de la disponibilidad mineral de soluciones patrón de minerales. Efecto de los ingredientes de estudio ....................................................................................... 134 1.5.1. Calcio ............................................................................................................................ 135 1.5.2. 2.4.2. Hierro .................................................................................................................. 136 1.5.3. 2.4.3. Cinc ..................................................................................................................... 138 1.6. Ensayo 2: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de una fórmula infantil suplementada con ingredientes funcionales ............................................................................ 141 1.6.1. Calcio ............................................................................................................................ 141 1.6.2. Hierro ............................................................................................................................ 145 1.6.3. Cinc ............................................................................................................................... 147 1.7. Evaluación de la morfología de las células Caco‐2 expuestas a dos concentraciones de nucleótidos ................................................................................................................................ 150 2. Estudio II: Evaluación de la actividad funcional de una fórmula infantil suplementada y de sus ingredientes ................................................................................................................ 152 2.1. Ensayo 1: Estudio preliminar. Crecimiento de diferentes especies bacterianas intestinales expuestas a los ingredientes en el estudio ............................................................ 152 2.1.1. Curvas de crecimiento de los diferentes microorganismos expuestos a los concentrados proteicos ............................................................................................................ 153 2.1.2. Curvas de crecimiento de los diferentes microorganismos expuestos a dos concentraciones diferentes de un preparado de nucleótidos sometido o no a una digestión gastrointestinal ........................................................................................................................ 163 2.2. Ensayo 2: Evolución de la microbiota fecal in vitro ..................................................... 171

IV

2.2.1. Evolución de la microbiota fecal expuesta a los ingredientes funcionales digeridos y sin digerir ....................................................................................................................................... 172 2.2.2. Evolución de la microbiota fecal expuesta a las fórmulas del estudio comparándolas con la leche materna ................................................................................................................ 188 3. Estudio III: Comparación de la microbiota intestinal de lactantes, alimentados con leche materna, procedentes de dos regiones espalas ........................................................... 200 4. Estudio IV: Evolución de la microbiota intestinal de lactantes alimentados con fórmula infantil suplementada con α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA. ........................... 207 VI. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 225

VII. RESUMEN ..................................................................................................................... 229

VIII. SUMMARY .................................................................................................................... 233

IX. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 237

V

ÍNDICE DE FIGURAS

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Pág.

Figura 1. Concentración de α‐lactoalbúmina en leche de vaca, fórmulas estándar, fórmulas ricas en lactoalbúmina y en leche materna

22

Figura 2. Función bioquímica y nutricional de la α‐lactoalbúmina 23Figura 3. Secuencia de aminoácidos de la α‐lactoalbúmina 24Figura 4. Estructura de la α‐lactoalbúmina humana. La hoja β (verde) y los dominios α (azul y rojo) (Rösne y Redfield, 2009)

25

Figura 5. Estructura de un nucleótido 35Figura 6. Diferentes métodos para evaluar la biodisponibilidad 43Figura 7 Absorción transcelular y paracelular del calcio 50Figura 8. Absorción intestinal de hierro no hemo 55Figura 9. Transporte de cinc a través del enterocito mediante la ruta transcelular….

61

Figura 10. Esquema del tejido linfoide asociado al intestino (Adlerberth y Wold, 2009)

68

MATERIAL Y MÉTODOS

Figura 11. Diseño experimental de los estudios in vitro I y II 83Figura 12. Diseño experimental de los estudios in vivo III y IV 84Figura 13. Visión al microscopio de los campos en los que se realiza el contaje celular

91

Figura 14. Reacción producida por las enzimas mitocondriales al reducir el MTT 94Figura 15. Pocillo bicameral, donde se pueden apreciar las dos cámaras y la monocapa

96

Figura 16. Diseño experimental del estudio II 104Figura 17. Procedimiento para el desarrollo del ensayo 1 del estudio II 108Figura 18. Condiciones de tiempo y temperatura para la amplificación de cada grupo microbiano.

114

Figura 19. Cromatograma del multipatrón a concentración 10mM 116Figura 20. Tríptico informativo y consentimiento informado del ensayo clínico que fue proporcionado a las madres antes del comienzo del estudio

121

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 21. Observación de la línea celular Caco‐2 en diferentes días de postsiembra mediante microscopio de contraste de fases y observación del testde micoplasmas. a) 2 días de cultivo, b) 5 días de cultivo, c) 7 días de cultivo, d)ausencia de micoplasmas

130

VI

Figura 22. Curva de crecimiento de la línea celular Caco‐2 131Figura 23. Imágenes de la monocapa en el microscopio electrónico de barrido (a: 5000X, b: 6000X)

131

Figura 24. a) Recta de calibrado de rojo fenol. b) Valores de la permeabilidad aparente a diferentes días de cultivo para evaluar la integridad de la monocapa

132

Figura 25. Porcentaje de viabilidad celular para cada grupo de estudio tras el ensayo de toxicidad

134

Figura 26. Imágenes de las células al microscopio electrónico de barrido a) sin exposición a nucleótidos, b) exposición 32 mg/L y c) 72 mg/L

150

Figura 27. Curvas de crecimiento de L. gasseri expuesto a los diferentes concentrados proteicos

153

Figura 28. Representación del incremento de densidad óptica para el crecimientoL. gasseri en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio

155

Figura 29. Variación de pH en el cultivo de L. gasseri sometido a diferentes sueros proteicos

156

Figura 30. Curvas de crecimiento de B. longum expuesto a los diferentes concentrados proteicos.

157

Figura 31. Representación del incremento de densidad óptica para el crecimientode B. longum en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio

158

Figura 32. Variación de pH en el cultivo de B. longum expuesto a los concentrados proteicos digeridos y sin digerir

159

Figura 33. Curvas de crecimiento de E. coli expuesto a los diferentesconcentrados proteicos.

160

Figura 34. Representación del incremento de densidad óptica en el crecimientode E. coli en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio.

162

Figura 35. Variación de pH en el cultivo de Escherichi coli sometido a dos concentrados proteicos digeridos y sin digerir.

163

Figura 36. Curvas de crecimiento de L. gasseri expuesto a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.

164

Figura 37. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de L. gasseri expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.

165

Figura 38. Variación de pH en el cultivo de L. gasseri sometido a dos concentraciones del preparado de nucleótidos digeridos y sin digerir.

165

Figura 39. Curvas de crecimiento de B. longum expuesto a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.

166

Figura 40. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de B. longum expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.

167

Figura 41. Variación de pH en el cultivo de B. longum sometido a dos concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.

168

Figura 42. Curvas de crecimiento de E. coli expuesta a los diferentes concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.

169

VII

Figura 43. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de E. coli expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.

170

Figura 44. Variación de pH en el cultivo de E. coli sometido a dos concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.

171

Figura 45. Evolución de la microbiota intestinal expuesta a los diferentes ingredientes sometidos o no a digestión.

179

Figura 46. Relación Bacteroides/Bifidobacterium para cada grupo de estudio en cada punto de muestreo.

180

Figura 47. Variación de pH en cada punto de muestreo para los diferentes grupos de estudio.

181

Figura 48. Concentraciones de los ácidos grasos minoritarios en cada punto de muestreo para los ingredientes estudiados.

186

Figura 49. Evolución de la microbiota intestinal expuesta a las fórmulas infantiles, control y suplementada, y a leche materna.

192

Figura 50. Relación Bacteroides/Bifidobacterium para cada grupo de estudio en cada punto de muestreo.

193

Figura 51. Variación de pH en cada punto de muestreo durante la evolución del inoculo fecal expuesto a las fórmulas infantiles y a la leche materna.

199

Figura 52. Evolución de las diferentes poblaciones bacterianas estudiadas en los dos grupos de lactantes.

202

Figura 53. Concentraciones de las diferentes poblaciones microbianas sin tener en cuenta la edad de los lactantes.

203

Figura 54. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 2 semanas de vida (primer muestreo).

216

Figura 55. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 4 semanas de vida (segundo muestreo).

217

Figura 56. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 7‐8 semanas de vida (tercer muestreo).

218

Figura 57. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 12 semanas de vida (cuarto muestreo).

219

VIII

ÍNDICE DE TABLAS REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Pág.

Tabla 1. Composición de los preparados para lactantes según legislación. 15Tabla 2. Estudios in vitro realizados con α‐lactoalbúmina o suero proteico ylos efectos evidenciados.

32

Tabla 3. Estudios in vivo realizados con fórmulas infantiles enriquecidas con α‐lactoalbúmina o suero proteico y los efectos producidos.

34

Tabla 4. Estudios in vivo realizados en lactantes sanos y nácidos a término, relacionados con la adición de nucleótidos a fórmulas infantiles.

40

Tabla 5. Bacterias anaerobias predominantes en el intestino grueso y sus productos de la fermentación.

65

MATERIAL Y MÉTODOS.

Tabla 6. Composición nutricional de la fórmula control por 100 g y por 100 mlde fórmula reconstituida

86

Tabla 7. Composición nutricional de fórmula suplementada por 100 g y por100 ml de fórmula reconstituida.

87

Tabla 8. Concentraciones de calcio, hierro y cinc evaluadas en los ensayos decaptación retención y transporte.

97

Tabla 9. Condiciones del espectrómetro de absorción atómica. 101Tabla 10. Preparación de las soluciones patrón de calcio, hierro y cinc pararealizar la recta de calibrado.

101

Tabla 11. Bacterias intestinales utilizadas en las curvas de crecimiento. 107Tabla 12. Especies bacterianas utilizadas para realizar las curvas estándar en la cuantificación de los diferentes grupos microbianos.

113

Tabla 13. Oligonucleótidos utilizados en la investigación de la evolución de diferentes grupos microbianos a partir de un inóculo fecal.

114

Tabla 14. Condiciones cromatográficas para el análisis de AGCC. 116Tabla 15. Patrones de ácidos grasos utilizados. 117Tabla 16. Criterios de inclusión y exclusión del ensayo in vivo. 122Tabla 17. Especies bacterianas utilizadas para preparar las curvas estándarpara la cuantificación de los diferentes grupos microbianos.

125

Tabla 18. Primers utilizados en PCR cuantitativa. 127 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 19. Valores medios y desviación estándar de los minerales analizados en los ingredientes de estudio.

135

Tabla 20. Retención, transporte y captación celular a partir de soluciones patrón de diferentes concentraciones de Calcio (10 y 30 mM) en los tres

139

IX

grupos de estudio Tabla 21. Retención, transporte y captación celular a partir de soluciones patrón de diferentes concentraciones de Hierro (50 y 150 µm) en los tres grupos de estudio

140

Tabla 22. Retención, transporte y captación celular de calcio en los tres grupos de estudio (LM, FC y FS).

144

Tabla 23. Retención, transporte y captación celular de hierro en los tres grupos de estudio (LM, FC y FS).

146

Tabla 24. Retención, transporte y captación de cinc en los tres grupos de estudio (LM, FC y FS).

148

Tabla 25. Limites de detección, eficiencias y coeficientes de correlación de las PCR cuantitativas de cada grupo microbiano.

172

Tabla 26. Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC).

184‐185

Tabla 27. Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC).

197‐198


206

Tabla 29. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el primer muestreo que corresponde con la edad de dos semanas (p es la significación obtenida al realizar el test de Fisher).

210

Tabla 30. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el segundo muestreo que corresponde con la edad de cuatro semanas (p es la significación obtenida al realizar el test de Fisher).

212

Tabla 31. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el tercer muestreo que corresponde con la edad de 7‐8 semanas (p es la significación obtenida al realizar el test de Fisher).

214

Tabla 32. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el cuarto muestreo que corresponde con la edad de 12 semanas.

215

Tabla 33. Resultados cuantitativos para cada grupo microbiano estudiado sin tener en cuenta la edad de los lactantes

222

XI

ABREVIATURAS µg: microgramo

µl: microlitro

µm: micrómetro

µM: micromolar

°C: Grados centígrados

AA: ácido araquidónico

AGCC: ácidos grasos de cadena corta

AGPICL: ácidos grasos poliinsaturados

de cadena larga

ANOVA: análisis de la varianza.

ARNr: ácido ribonucleic

BAMLET: bovine alfa‐lactalbumin with

monomeric oleic acid

BHI: “Brain Heart Infusion”.

BLAST: “Basic Local Alignment Search

Tool”.

CECT: Colección Española de Cultivos

Tipo.

cels: células

CLA: Ácido linoleico conjugado

cm: centímetro

DHA: Ácido docohexaenoico

dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato.

ESPGHAN: European Society for

Pediatric Gastroenterology Hepatology

and Nutrition

ET: eficiencia de transporte.

EC: eficiencia de captación

FC: Fórmula control

FS: Fórmula suplementada

FOS: Fructo‐oligossacárido

g: gramos

GABA: ácido γ-aminobutirico

GOS: galacto‐oligossacáridos

FS: Fórmula suplementada

HAMLET: human alfa‐lactalbumin with

monomeric oleic acid

Nuc: Nucleótidos

LM: Leche materna

mg: miligramos

ml: mililitro

mM: milimolar

MRSC: Medio de Man Rogosa y Sharpe

con 0,25% de L‐cisteína HCl.

NCIMB: “National Collections of

Industrial and Marine Bacteria” (UK).

nm: nanómetros

NUC: preparado de nucleótidos

NUC dig: preparado de nucleótidos

digerido.

NUC 32: preparado de nucleótidos 32

mg/L

NUC 72: preparado de nucleótidos 72

mg/L

PCR: “Polymerase Chain Reaction”

PBS: “Phosphate Buffered Saline”.

p/v: Peso/volumen.

RCA: “Reinforced Clostridial Agar”.

rpm: Revoluciones por minuto.

SCFAs: “Short chain fatty acids”.

XII

SLα: suero lácteo rico en α‐

lactoalbúmina

SLβ: suero lácteo rico en β‐

lactoglobulina

TGI; Tracto Gastrointestinal.

ufc: Unidades formadoras de colonia.

UI: Unidades Internaciones.

v/v: Volumen/ volume

I. Introducción

1

I. INTRODUCCIÓN

La leche humana es el alimento ideal para el crecimiento y desarrollo de los

recién nácidos ya que aporta todos los nutrientes requeridos en unas proporciones

adecuadas, y está adaptada a las condiciones fisiológicas del aparato digestivo del

niño. Además, incrementa la relación afectiva entre la madre y el niño y contiene

compuestos que ejercen un efecto protector regulando el desarrollo del sistema

inmunitario (Alles et al., 2004). De hecho, los niños alimentados con leche materna

sufren menos episodios de infecciones gastrointestinales o respiratorias que los

alimentados con fórmulas infantiles (Pathirage et al., 2009; Lamberti et al., 2011). Sin

embargo la alimentación con leche materna no siempre es posible o deseable y por

eso es necesario desarrollar fórmulas infantiles que sustituyan a la lactancia natural

aportando los nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo óptimo del

lactante.

La composición de los preparados para lactantes ha evolucionado junto con el

conocimiento de la composición de la leche materna. Hoy en día, las empresas y

centros de investigación dedicadas a la preparación de este tipo de alimentos centran

sus esfuerzos en la mejora de la calidad de las fórmulas infantiles, no solo en adecuar

la concentración de macronutrientes y micronutrientes sino también la composición

de compuestos bioactivos. Estos compuestos constituyen un grupo amplio de

moléculas de diferente naturaleza (proteínas, péptidos, hidratos de carbono…) que se

encuentran presentes en la leche materna de forma natural, y que se empiezan a

adicionar como ingredientes, con el objetivo de alcanzar los efectos funcionales que se

producen en los niños alimentados con lactancia natural (Dorca 2008).

El contenido proteico de las fórmulas infantiles ha evolucionado introduciendo

cambios en su cantidad y calidad hasta llegar a ser lo más parecido al contenido

proteico de la leche humana (Lönnerdal, 2003). Se ha visto que el contenido de α‐

lactoalbúmina es mayor en la leche materna que en la de vaca y además se le han

2

atribuido numerosos efectos beneficiosos a esa proteína y a los péptidos que se

originan tras su digestión (Chatterton et al., 2006).

Otros ingredientes bioactivos de la leche materna son los nucleótidos y están

presentes en mayor concentración (aproximadamente 72mg/L) que en la leche de vaca

(Leach et al., 1995). Se ha sugerido que los nucleótidos tienen un papel fundamental

en el desarrollo de la función inmunitaria. Además intervienen en la maduración,

proliferación y activación de linfocitos (células T). También se ha sugerido su papel en

el desarrollo de la microflora intestinal, teniendo un posible efecto en el metabolismo

de las lipoproteínas y reduciendo el número de episodios de diarrea (Yau y col., 2003).

Algunas fórmulas infantiles han incorporado a su composición los ácidos grasos

poliinsaturados de cadena larga araquidónico y docosahexanoico (DHA) en cantidades

similares a las encontradas en la leche materna. La razón por la que se incorporan

estos ingredientes está en que los niños alimentados con fórmulas infantiles, tienen

una cantidad significativamente menor de araquidónico y DHA en plasma y en los

fosfolípidos de la membrana de los eritrocitos, y menos DHA en la corteza cerebral que

los alimentados con leche materna (Martín‐Aragón, 2005).

A pesar de que el desarrollo de fórmulas destinada a la alimentación infantil en

las distintas etapas del primer año de vida ha mejorado considerablemente en las

últimas décadas, todavía no se ha podido obtener un producto similar en su totalidad a

la leche materna, puesto que aunque se aporten componentes en cantidades

semejantes, éstos son utilizados de una forma distinta por el niño.

Respecto a los minerales, se sabe que su biodisponibilidad en la leche materna

es mayor que la en las fórmulas infantiles, y para compensar esas diferencias las

fórmulas son enriquecidas con minerales hasta obtener una concentración superior

que la presente en leche humana (Drago y Valencia 2004). De esta forma se intentan

prevenir los riegos de la deficiencia mineral, ya que una ingesta inadecuada de

minerales puede tener consecuencias inmediatas para la salud del recién nácido pero

también a largo plazo (Frontela et al., 2009a).

I. Introducción

3

Por otro lado, la composición de la microbiota intestinal puede relacionarse

directamente con la salud y enfermedad humana, y los efectos beneficiosos que

produce en el hospedador son los siguientes: mejora la función de la barrera intestinal,

induce función defensiva contra patógenos., refuerza la función inmune, aumenta la

protección en la enfermedad inflamatoria intestinal, regula la autoinmunidad, produce

diferentes metabolitos, reduce la obesidad e influye en la diabetes, e incluso inhibe

ciertos tipos de cáncer (Ha, 2011).

II. Objetivos

5

II. OBJETIVOS

1. Objetivo general:

Determinar el efecto sobre la absorción mineral y la microbiota intestinal de

una fórmula infantil suplementada con α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA, en

comparación con una fórmula estándar (sin ingredientes adicionales añadidos), y

observar si dicho efecto es similar al producido por la leche materna.

2. Objetivos específicos:

2.1. Estudiar, utilizando la línea celular Caco‐2, el efecto de los diferentes ingredientes

(suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina y nucleótidos) sobre la biodisponibilidad

mineral (Fe, Ca y Zn) a partir de soluciones patrón de los minerales.

2.2. Evaluar la disponibilidad mineral (Fe, Ca y Zn), determinando la captación,

retención y transporte mineral, de una fórmula infantil suplementada (α‐

lactoalbúmina, nucleótidos y DHA) comparándola con otra fórmula estándar y

tomando como referencia la leche materna.

2.3. Estudiar la influencia de ingredientes los funcionales (suero lácteo rico en α‐

lactoalbúmina, suero lácteo rico en β‐lactoglobulina y nucleótidos) sobre el

crecimiento de cultivos puros de diferentes bacterias intestinales.

2.4. Determinar, in vitro, el efecto de la fórmula suplementada (respecto de la

estándar) y de sus ingredientes sobre la microbiota intestinal, estudiando la

evolución de diferentes poblaciones microbianas de un inóculo fecal.

2.5. Determinar la existencia de posibles diferencias en la composición microbiana de

dos poblaciones de lactantes, alimentados exclusivamente con leche materna, y

procedentes de dos regiones diferentes de España (Asturias y Murcia).

II.Objetivos

6

2.6. Estudiar, in vivo, la evolución de la microbiota intestinal durante 12 semanas, y las

posibles diferencias debidas al tipo de alimentación (fórmula estándar, fórmula

suplementada y leche materna).

III. Revisión Bibliografica

7

1. NUTRICIÓN EN EL LACTANTE

El niño, al nacer, sólo puede alimentarse con leche ya que no ha desarrollado

todavía la capacidad de digerir ciertas proteínas o de soportar cargas osmolares

excesivas a nivel renal (Casado de Frías et al., 1993). El estómago del neonato es

pequeño con una capacidad media de 25‐40 ml en los primeros días, para ir

aumentando progresivamente durante el primer mes de vida. El tránsito

gastrointestinal a esta edad, es rápido variando la evacuación gástrica total entre 2 y 3

horas después de la ingesta.

El intestino del recién nácido es un órgano de nutrición con función de absorción,

de secreción y de motilidad adaptado a la dieta basada en leche materna. Forma

también parte del sistema inmune, ya que contiene elementos humorales y celulares

asociados al tejido linfoide, así como del sistema endocrino secretando hormonas

intestinales y paracrinas que regulan la adaptación intestinal y metabólica a la vida

extrauterina. El intestino también participa en la conservación de la homeostasis,

siendo además hábitat de diversas poblaciones bacterianas (Weaver, 1992).

La primera alimentación con calostro en el recién nácido, estimula el desarrollo

anatómico del intestino y el desarrollo funcional para acomodar el cambio de

alimentación a través del cordón umbilical a alimentación oral. El calostro es rico en

inmunoglobulinas y factores de crecimiento que contribuyen a la defensa

inmunológica y promueve el rápido crecimiento intestinal (Carver y Barness, 1996;

Commare y Tappenden, 2007). La ausencia de calostro en la primera alimentación del

recién nácido dificulta el completo desarrollo del intestino (Commare y Tappenden,

2007).

1.1. Desarrollo y maduración gastrointestinal

El tracto gastrointestinal del recién nácido se desarrolla durante el crecimiento en

distintas fases. La primera es una fase embriológica en la que se forma el tubo

intestinal, posteriormente en una etapa de citodiferenciación se organizan los

III. Revisión Bibliográfica

8

diferentes tipos de células. A continuación se producirá una etapa de crecimiento y

diferenciación intestinal, y finalmente la fase de adaptación enteral que sucede a la de

destete, por la transición de la dieta a base de leche a la dieta sólida (Weaver, 1992).

El completo desarrollo de la función gastrointestinal incluye la maduración

anatómica y la maduración de las funciones secretora, digestiva y de absorción.

La diferenciación anatómica del tracto gastrointestinal ocurre a las 20 semanas de

gestación, sin embargo la función secretora y la de absorción se desarrollarán en fases

posteriores. En el esófago las ondas propulsivas coordinadas no aparecen hasta las 72

horas de vida. El estómago está anatómicamente diferenciado en el momento del

nacimiento aunque la capa muscular es más delgada que en el adulto, y no es hasta el

tercer día cuando la motilidad de las ondas del fundus comienzan a ser eficaces. El

vaciamiento gástrico es lento en las primeras 24 horas de vida, no alcanzándose el

ritmo normal hasta los 8 ó 9 meses de edad. La velocidad de propagación a través del

intestino es lenta en el periodo neonatal con un periodo de tránsito tres veces superior

al adulto siendo, sin embargo, la motilidad del colon similar a la del adulto. Respecto a

las glándulas y órganos hay que destacar que el páncreas y el hígado son

anatómicamente completos desde el momento del nacimiento, mientras que la

vesícula biliar alcanza su madurez posteriormente (Martínez, 2001).

La capacidad funcional de los procesos de digestión y absorción en el recién nácido,

va a depender del desarrollo anatómico del sistema digestivo, de la actividad de las

enzimas de transporte del borde en cepillo, de la actividad de las hormonas digestivas,

de la motricidad intestinal, de la flora bacteriana y del tipo de nutrientes ingeridos

(Chevalier, 1997). La maduración de la función digestiva y de absorción de

carbohidratos, proteínas, grasas, minerales y vitaminas en el recién nácido se

determina en relación a la actividad de las enzimas amilasa, glicosidasa, lactasa,

proteasa y lipasa. Durante el tercer trimestre de gestación, el feto absorbe

activamente nutrientes procedentes del líquido amniótico. Los cambios que se

producen en el desarrollo de la capacidad del transporte de nutrientes después del

nacimiento, están influidos por varios factores como: cambios en la masa intestinal,


9

propiedades fisicoquímicas de las membranas celulares y de los transportadores que

se expresan así como de sus características cinéticas (Berseth, 2006).

1.2. Digestión y absorción de proteínas

La secreción ácida del estómago está presente desde el nacimiento, pero los

valores de acidez son aproximadamente la mitad que los de un adulto (5,5‐7), mientras

que en niños a partir de seis meses y adultos es de 2‐3 (Hyman et al., 1985). Esta débil

respuesta secretora es paradójica, ya que en sangre se observan valores muy altos de

gastrina (hormona que estimula la secreción de ácido clorhídrico y pepsinógeno), lo

que puede indicar cierta resistencia a la gastrina durante el periodo neonatal. Por otro

lado, la secreción de pepsina es muy baja desde el nacimiento hasta los tres meses y

no alcanza los valores del adulto hasta los 18 meses de vida (Martínez, 2001).

La hidrólisis proteica debe comenzar en el ambiente ácido del estómago

continuando en el intestino debido a la acción de diferentes proteasas. Este ambiente

ácido favorece la ruptura de proteínas y además sirve como barrera para los

microorganismos (Hyman et al., 1985). El menor grado de acidez gástrica en el recién

nácido va a provocar que la pepsina no actúe correctamente produciéndose una

menor digestión proteica (Chevalier, 1997; Martínez, 2001). Esta insuficiente digestión

proteica hace que se favorezca el paso a la circulación de proteínas intactas. Del mismo

modo, la pepsina no actúan sobre la lactoalbúmina y lactoglobulina, por lo que la

menor producción de ácido y pepsinógeno puede ser la causa de que no se inactiven

las inmunoglobulinas y de que los antígenos sean reconocidos en el tubo digestivo del

recién nácido favoreciendo así el desarrollo del sistema inmune (Chevalier, 1997). Esto

sugiere que las proteínas hidrolizadas deberían ser mejor toleradas en los lactantes.

Así lo demuestran diversos estudios que comparan la tolerancia de fórmulas con

proteínas hidrolizadas y con proteínas sin hidrolizar (Mihatsch et al., 2002), sin

embargo, también se ha coprobado que las proteínas de la leche materna son bien

toleradas por los recién nácidos (Schanler, 2001).


10

Las proteasas del jugo pancreático tienen poca actividad durante las primeras

semanas, debido a la inmadurez del páncreas (Molina y Maldonado, 1993; Hernández

1999) y a la deficiente secreción de enteroquinasa que está reducida a un 25%

respecto a un adulto (Hernández 1999).

1.3. Digestión y absorción de lípidos

Las lipasas que participan en la digestión de las grasas incluyen la lipasa presente

en la leche humana (ausente en la leche de vaca) que comienza su actividad en el

intestino delgado en presencia de los ácidos biliares, la lipasa lingual que es secretada

por las glándulas en la base de la lengua y está involucrada en la lipólisis gástrica, y

otras lipasas que se producen en el estómago o en el páncreas (Hamosh, 1996). En la

boca del lactante las lipasas salival y lingual inician la digestión de los triglicéridos

ingeridos, actividad que continuará en el estómago. Las demás enzimas lipolíticas

tienen actividad reducida en el recién nácido alcanzando valores iguales a los adultos a

la edad de seis meses (Hernández 1999). La lipólisis gástrica en el lactante representa

el 10‐30 % y puede compensar los bajos niveles de lipasa pancreática que se producen

en el recién nácido (Molina y Maldonado, 1993).

Los ácidos biliares sintetizados en el hígado son claves para la digestión y absorción

de las grasas (Hamosh, 1996). Estos ácidos intervienen en la digestión intraluminal

emulsionando las grasas, favoreciendo así la acción de la lipasa y la solubilización

lipídica. Esta secreción es insuficiente durante las tres primeras semanas de vida

(Martínez, 2001). En el recién nácido existe una inmadurez de esta circulación

enterohepática debido a diversos factores, que tienen como consecuencia que la

digestión de las grasas en el neonato sesa difícil. La absorción intestinal tiene lugar en

todo el intestino delgado (Molina y Maldonado, 1993) y dependerá de la lipólisis, de la

solubilización de los productos generados en la misma y del tipo de leche ingerida

(Chevalier, 1997).


11

1.4. Digestión y absorción de carbohidratos

La actividad de la enzima α‐amilasa salival, se detecta desde el momento del

nacimiento, sin embargo la actividad de la que es secretada por el páncreas es

prácticamente nula, siendo a los tres años de edad cuando alcanza los valores de un

individuo adulto (Martínez, 2001). Este hecho parece ser debido a que su secreción

está inducida por un sustrato que no aparece todavía en la dieta de los lactantes. Sin

embargo, esto no se convierte en un problema ya que la leche humana y

especialmente el calostro, son ricos en esta enzima y además en el intestino hay

glucoamilasas responsables de la hidrólisis de los polímeros de glucosa (Molina y

Maldonado, 1993; Ros 2009).

El desarrollo de los mecanismos de absorción de carbohidratos ocurre durante el

desarrollo embrionario. Las enzimas lactasa, sacarasa, maltasa, isomaltasa y

glucoamilasa son funcionales ya en el recién nácido, aunque la actividad lactasa está

bastante reducida lo cual permite la utilización de lactosa por las bacterias colónicas.

La microflora intestinal fermenta los hidratos de carbono no absorbidos produciendo

gas y ácidos grasos de cadena corta que son fácilmente absorbidos (Berseth, 2006;

Neu, 2007). La absorción de lactosa es dosis dependiente y si su ingesta es superior a

4,5 g/Kg/día será fermentada en el colon (Chevalier, 1997).


12

2. LACTANCIA ARTIFICIAL. FÓRMULAS INFANTILES

La leche humana proporciona al lactante todos los nutrientes necesarios en

proporciones equilibradas para su rápido y completo crecimiento y desarrollo.

Inicialmente, las fórmulas infantiles se desarrollaron para alimentar a los recién

nácidos cuyas madres no podían dar leche materna o elegían no darla, diseñándose

para asemejarse lo más posible a la leche humana y producir así respuestas fisiológicas

parecidas a las de los niños alimentados con lactancia materna (Lien, 2003).

El primer año de vida es una etapa caracterizada por un continuo crecimiento y

desarrollo del individuo por lo que los requerimientos nutricionales van a ser muy

elevados. Estos requerimientos se pueden determinar por el método observacional

tomando como referencia los niños alimentados con leche materna. El problema

principal es que la leche materna no es un alimento estático, sino que va cambiando

con el tiempo (Trabazo, 2005).

2.1. Antecedentes históricos

Ya en tiempos bíblicos la leche materna era considerada el mejor alimento para

el recién nácido. Sin embargo, las madres han necesitado en ocasiones buscar

alternativas para sus hijos ya que, en ocasiones, por cuestiones de salud u otras

circunstancias no es posible alimentar a los recién nácidos con leche materna (Barness,

1987).

Históricamente, se han considerado la leche de diferentes animales (cabra,

burra y vaca) como sustitutivas a la leche materna, pero fue la leche de vaca la que

prosperó como base de la actual lactancia artificial. Se analizó la composición de la

leche materna y se intentó adaptar la leche de vaca para que su composición fuera lo

más parecida posible a la materna. Las primeras adaptaciones fueron encaminadas a

diluir la leche de vaca para disminuir el contenido proteico y de electrolitos, aunque se

observó que el contenido graso se reducía demasiado (Paricio y Hernández, 2009).


13

En 1952 aparecen las primeras leches en polvo para lactantes y ya en 1961, se

fijó una composición determinada para éstas: 3 g de proteínas y 1,5 g de lípidos por

cada 100 ml de leche. A comienzos de los años setenta se observó que esta

composición contenía un exceso de proteínas y sodio, lo que suponía una carga renal

alta para el recién nácido cuyo riñón no ha madurado completamente (Chevalier,

1997).

Posteriormente, aparecieron en el mercado leches industriales siguiendo unas

reglas nutricionales, a las que se les llamó “leches maternizadas”. En 1976 se reguló la

composición de leches para lactantes y a partir de este año se crearon leches

especiales para determinadas circunstancias fisiológicas. En 1993 se comienzan a

enriquecer con vitamina D y al año siguiente se publica la Reglamentación europea en

relación a la composición de estos alimentos (Chevalier, 1997).

En los últimos cincuenta años se han realizado numerosos cambios en el diseño

de fórmulas infantiles, lo que ha conducido a la mejora de estos productos. A

mediados del siglo XX las fórmulas infantiles estaban basadas en leche de vaca

exclusivamente (Carver, 2003), y actualmente, aunque la composición de estas

fórmulas no ha cambiado mucho cuantitativamente, ciertos cambios cualitativos han

hecho posible que se asemejen cada vez más a la leche materna (Heird, 2007). Hoy en

día existen, además, diversas alternativas para las necesidades especiales de cada

lactante, como fórmulas de soja, sin lactosa, con compuestos funcionales añadidos,

etc. Las fórmulas infantiles continúan desarrollándose para que los efectos que

producen en el lactante sean lo más parecido posible a los conferidos por la leche

materna (Carver, 2003).

La Sociedad Europea de Gastroenterología y Nutrición Pediátrica en 2005

publicó los estándares para fórmulas infantiles, donde se refleja el nivel mínimo de

cada componente para que el desarrollo anatómico y funcional del niño sea el

correcto. Además, incluye también los niveles máximos permitidos con el fin de evitar

un exceso de nutrientes que puedan producir un efecto tóxico debido a la capacidad


14

limitada de los neonatos para digerir, absorber, procesar, regular y excretar ciertos

compuestos (Vásquez y Romero, 2008).

2.2. Normativa actual

El Real Decreto 867/2008 del 23 de mayo, define los preparados para lactantes

como los productos alimenticios destinados a la alimentación especial de los lactantes

durante los primeros meses de vida, que satisfagan por sí mismos las necesidades

nutritivas de estos lactantes hasta la introducción de una alimentación

complementaria apropiada. Además, en el artículo 10 del mismo, se expone la

información que debe aportarse a las mujeres embarazadas o madres lactantes sobre

la superioridad de la lactancia materna sobre las fórmulas infantiles. En la Tabla 1 se

resumen los requisitos que deben cumplir los preparados para lactantes según dicho

Real Decreto, y a continuación se especifican las cantidades a añadir de algunos

ingredientes cuya adición está permitida:

‐ Fructooligosacáridos y galacooligosacáridos: no deben superar los 0,8 g/100

ml de fórmula (90% oligogalactosil lactosa y 10% oligofructosil sacarosa).

‐ Respecto a los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPCL, 20‐22

átomos de carbono), su contenido no debe superar el 1% del contenido total graso

para AGPCL n‐3 ni el 2% del contenido total graso para AGPCL n‐6. El contenido en

ácido eicosapentaenoico (EPA) no debe ser superior al de docosahexaenoico (DHA) y el

contenido de este último no debe ser superior al de los AGPCL n‐6.

‐ Nucleótidos: su concentración total no será superior a 5 mg/100 Kcal y se

pueden añadir las siguientes cantidades como máximo (mg/100 Kcal): citidina 5’‐

monofosfato: 2,50; uridina 5’‐monofosfato: 1,75; adenosina 5’‐monofosfato: 1,50;

guanosina 5’‐monofosfato: 0,5; inosina 5’‐monofosfato: 1,00.


15

Tabla 1: Composición de los preparados para lactantes según legislación (R.D. 867/2008)

Componentes Unidades Mínimo MáximoEnergía Kcal /100 ml 60 70 Proteínas Leche de vaca g /100 Kcal 1,8 3 Hidrolizados proteínas g /100 Kcal 1,8 3 Aislados proteína de soja g /100 Kcal 2,25 3 Lípidos Grasa total g /100 Kcal 4,4 6 Ácido linoleico g /100 Kcal 0,3 1,2 Ácido α‐linolénico g /100 Kcal 50 ‐ Linolénico/ α‐linolénico 5 15 Ácidos Laúrico + Mirístico % mat. grasa NS 20 Fosfolípidos g/l 2 Carbohidratos ‐Carbohidratos totales g /100 Kcal 9 14 Lactosa g /100 Kcal 4,5 ‐ Sacarosa < % CHT ‐ 20 Almidón g /100 ml (< % CHT) ‐ 2 (30) Vitaminas Vitamina A μg RE/100 Kcal 60 180 Vitamina D3 μg /100 Kcal 1 2,5 Vitamina E mg α‐TE /100 Kcal 0,5 5 Vitamina K μg /100 Kcal 4 25 Tiamina μg /100 Kcal 60 300 Riboflavina μg /100 Kcal 80 400 Niacina μg /100 Kcal 300 1500 Vitamina B6 μg /100 Kcal 35 175 Vitamina B12 μg /100 Kcal 0,1 0,5 Ácido Pantoténico μg /100 Kcal 400 2000 Ácido fólico μg /100 Kcal 10 50 Biotina μg /100 Kcal 1,5 7,5 Minerales y Elementos traza Hierro (proteínas de vaca e hidrolizados) mg /100 Kcal 0,3 1,3 Hierro (aislados proteínas de soja) mg /100 Kcal 0,45 2 Calcio mg /100 Kcal 50 140 Fósforo (proteínas de vaca e hidrolizados) mg /100 Kcal 25 90 Fósforo (aislados proteínas de soja) mg /100 Kcal 30 100 Calcio/Fósforo 1:1 2:1 Magnesio mg /100 Kcal 5 15 Sodio mg /100 Kcal 20 60 Cloro mg /100 Kcal 50 160 Potasio mg /100 Kcal 60 160 Manganeso μg /100 Kcal 1 100 Fluor μg /100 Kcal NS 100 Yodo μg /100 Kcal 10 50 Selenio μg /100 Kcal 1 9 Cobre μg /100 Kcal 35 100 Cinc mg/100 Kcal 0,5 1,5 Otras sustancias Colina mg /100 Kcal 7 50 Inositol mg /100 Kcal 4 40 L‐Carnitina mg /100 Kcal 1,2 NS Taurina mg /100 Kcal ‐ 12


16

2.3. Ingredientes funcionales y tendencias actuales en la elaboración de fórmulas infantiles

La Sociedad Europea de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica y

la Federación Internacional de Sociedades en Pediatría, Gastroenterología,

Hepatología y Nutrición se unieron en el año 2005 con expertos altamente cualificados

en el área de nutrición infantil, para formar un grupo internacional de expertos y

definir las necesidades nutricionales en la infancia. Los datos de la composición de la

leche materna, de mujeres bien nutridas, proporcionan una guía para establecer la

composición de fórmulas infantiles. Sin embargo estos valores no deben ser tomados

en sentido estricto ya que la composición de la leche materna varía entre individuos y

con la etapa de lactación, habiendo además considerables diferencias en la

biodisponibilidad y efecto metabólico de nutrientes similares a la leche humana y

añadidos a las fórmulas infantiles. Por lo tanto una composición adecuada para una

fórmula infantil se conseguirá comparando los efectos fisiológicos (patrón de

crecimiento) bioquímicos (marcadores plasmáticos) y funcionales (respuesta inmune)

de la leche materna. Este grupo internacional de expertos concluye que la fórmula

infantil sólo debe contener ingredientes en las cantidades que sirvan para un propósito

nutricional o que aporten un beneficio (Koletzko et al., 2005).

Las últimas investigaciones en el diseño de fórmulas infantiles van encaminadas a

imitar en todo lo posible a la leche materna. No sólo han de aportar los nutrientes

necesarios para un óptimo crecimiento del lactante sino que deben ejercer, en la

medida de lo posible, los mismos efectos fisiológicos que la leche materna. Cada vez

que se identifican nuevos compuestos en la leche de mujer cambian las

recomendaciones para las fórmulas de inicio. Esto hace que las fórmulas infantiles

estén en una continua evolución, habiéndose realizado los siguientes avances:

reducción del contenido proteico y fósforo, adición de taurina, carnitina, nucleótidos,

ácidos grasos de cadena larga y oligosacáridos (Dorca 2008).

Los oligosacáridos están presentes en la leche humana en una concentración de 10

g/L y aparecen como moléculas libres o conjugadas (glicoproteínas, glicolípidos etc.).

Los monómeros de estas moléculas son D‐glucosa, D‐galactosa N‐acetilglucosamina, L‐


17

fucosa y ácido siálico (Boehm y Moro, 2008). Los oligosacáridos de la leche materna

producen efectos beneficiosos en los lactantes debido a que poseen actividad

prebiótica, propiedades antiadhesivas que confieren protección al epitelio intestinal

frente al ataque de patógenos y pueden tener además una interacción con el sistema

inmune (Espinosa Tamez y Prieto, 2007).

En relación al contenido en ácidos grasos, el DHA y el ácido araquidónico (AA)

se pueden obtener directamente de la dieta, o bien por conversión endógena a partir

de sus precursores: el ácido linolénico y el ácido linoleico, respectivamente. El feto y el

recién nácido son capaces de llevar a cabo estos procesos de conversión; no obstante

son insuficientes para cubrir la alta demanda de ácidos grasos poliinsaturados de

cadena larga (AGPICL) (Lauritzen et al., 2001). Esto quiere decir, que durante las

primeras etapas de desarrollo, estos ácidos grasos serán dependientes de la ingesta de

DHA y AA en la dieta (Hornstra, 2000). La leche materna contiene AGPICL pero su

cantidad varía con la dieta de la madre, sin embargo las fórmulas infantiles no han sido

enriquecidas con estos compuestos hasta los últimos años. Estos ácidos grasos van a

jugar un papel importante en el crecimiento y desarrollo del recién nácido. Se sabe que

la deficiencia de AGPICL conduce a un retraso del crecimiento, siendo abundante su

contenido en cerebro y retina. Así se piensa que pueden tener un efecto positivo en la

función cerebral y desarrollo visual (Lauritzen et al., 2001). La suplementación de

fórmulas infantiles con DHA surgió de la observación de que los niños alimentados con

leche materna obtenían mejores resultados en el desarrollo que los alimentados con

fórmula infantil, atribuyéndose este efecto a los AGPICL. Sin embargo, Hadders, (2005)

revisó 20 estudios en los que se administraba AGPICL, normalmente DHA y AA, a recién

nácidos y observó que solo tres de estos estudios obtenían efectos positivos, uno

sobre el desarrollo cerebral y dos sobre el desarrollo visual. Este autor concluyó que en

los demás estudios no se encontraron efectos positivos debido a la edad de los

lactantes a los que se les realizó el ensayo, ya que suele ser necesario un largo periodo

de observación para obtener resultados favorables.

Las poliaminas (putrescina, espermidina y espermina) son compuestos alifáticos

presentes en la leche materna y prácticamente ausentes en la leche de vaca y, como


18

consecuencia, en las fórmulas infantiles. Estos compuestos han sido relacionados con

la maduración y desarrollo intestinal y con la actividad del sistema inmune (Sabater‐

Molina et al., 2009). A pesar de este hecho, las poliaminas todavía no se añaden a los

preparados para lactantes siendo necesarios más estudios.

En la revisión de la presente tesis nos centramos en los componentes proteicos

concretamente en la α‐lactoalbúmina y en los nucleótidos como compuestos

nitrogenados no proteicos ya que han sido los ingredientes objeto de las

investigaciones en este trabajo.

2.4. Componentes proteicos en fórmulas infantiles.

Una de las principales diferencias entre la leche de vaca y la leche humana es el

contenido y composición proteica. La leche humana aporta 14‐16 g de proteínas /L

durante los primeros días de lactación, 8‐10 g /L a los 3‐4 meses, y de 7 a 8 g/L a partir

del sexto mes (Lönnerdal, 2003), mientras que la leche de vaca contiene 32 g/L de

proteínas (Haug, et al., 2007). Casi todas las proteínas de la leche, a excepción de la

albúmina, son sintetizadas en la glándula mamaria. La concentración de estos

nutrientes en la leche humana es menor que en otras especies, por lo que los primeros

intentos para adaptar la leche de vaca al consumo de los neonatos se centraron en

diluirla (Heine, Klein y Reeds 1991) para reducir la cantidad de proteínas y minerales y

así disminuir la carga renal de solutos, lo cual constituía un factor limitante en la

alimentación del niño debido a la inmadurez de estos órganos (Rees, 2005).

Posteriormente, los estudios se centraron en el predominio de proteínas del

lactosuero en la leche materna en relación a las fórmulas infantiles, realizándose

intentos importantes para la adecuación de las fórmulas infantiles mediante la adición

de proteínas del lactosuero de origen bovino. En la mujer, la concentración de

proteínas del lactosuero es muy elevada en los primeros días de la lactación mientras

que la concentración de caseína es casi inapreciable. Con el avance de la lactación,

aumenta la síntesis de caseína, aumenta el volumen de leche producido por la glándula

mamaria disminuyendo la concentración total de proteínas del lactosuero. Por lo tanto


19

se sabe que no existe una relación fija de proteínas del lactosuero con respecto a la

caseína en la leche humana sino que ésta varía a lo largo de la lactación adecuándose a

las necesidades del niño. El cociente proteínas del lactosuero:caseína más

frecuentemente citado en las referencias bibliográficas, es de 60:40, el cual es una

aproximación media, ya que hay que tener en cuenta que éste cambia desde 80:20 en

las primeras etapas de lactación hasta 50:50 al final de la misma (Lönnerdal, 2003). La

primera fórmula rica en proteínas del lactosuero se desarrolló en 1961 y se caracterizó

por su menor contenido proteico y mineral, por lo que también disminuían la carga

renal en el recién nácido. Aún así, la proporción de las proteínas del suero en estas

fórmulas seguía difiriendo de la que presenta la leche materna (Lien, 2003).

Otro factor a tener en cuenta en el diseño de fórmulas infantiles, es la diferente

composición de las proteínas del lactosuero de la leche bovina en relación a la

humana, incluso su composición aminoacídica. Este hecho parece ser crucial, ya que

supone un factor limitante en la nutrición de los neonatos debido a su rápido

crecimiento y a los procesos de maduración que se producen en esta etapa de la vida.

Algunas de las rutas de síntesis de aminoácidos no están desarrolladas completamente

en el recién nácido y además pueden tener una capacidad limitada temporalmente

para el catabolismo de los aminoácidos. Como consecuencia, los neonatos pueden

encontrarse en riesgo de deficiencia de algunos de estos aminoácidos esenciales, con

una sensibilidad particular a un exceso de aminoácidos.

Los aminoácidos que son esenciales para el lactante se establecieron teniendo

en cuenta el perfil aminoacídico de la leche materna. En este sentido, la concentración

de triptófano y cisteína es la mitad en la leche de vaca que en la humana cuando se

expresa como porcentaje de proteína total (Heine, Klein y Reeds 1991). El triptófano es

precursor de la serotonina y melatonina, neurotransmisores que regulan el apetito, el

humor, la percepción del dolor y el patrón de sueño (Yogman, 1982; Heine, Klein y

Reeds 1991). Para que el triptófano pueda ser captado por el cerebro, es necesario

que exista un equilibrio adecuado entre este aminoácido y otros aminoácidos neutros

como la leucina, isoleucina, valina, tirosina y fenilalanina, puesto que existe un solo

transportador que los conduzca desde la circulación periférica hasta el cerebro. Por


20

otro lado, la cisteína es un precursor del glutatión (sistema antioxidante) y de la

taurina, aminoácido que juega un papel importante en el desarrollo del cerebro (Lo,

1996).

En este sentido, la suplementación de las fórmulas con triptófano o cisteína

(como aminoácidos libres) no parece ser una manera efectiva de resolver estos

problemas, debido fundamentalmente a las dudas planteadas sobre la estabilidad de

estos aminoácidos añadidos a los alimentos como suplemento, y a que la absorción en

el organismo de aminoácidos libres o de di y tripéptidos como suplementos de la dieta,

puede ser demasiado rápida. Los aminoácidos libres requieren para su absorción un

sistema de transporte dependiente de sodio, mientras que los dipéptidos y tripéptidos

(principales productos de la digestión proteica intestinal) son absorbidos directamente

(Wenzel et al., 2001). Es importante tener en cuenta que, es posible que no sean

utilizados de forma eficiente para la síntesis de proteínas porque son absorbidos antes

que otros aminoácidos que constituyen la dieta. Además, la leche humana contiene

sólo un 5% de aminoácidos libres, principalmente ácido glutámico y taurina (Davies et

al., 2008).

Por otra parte, las concentraciones de metionina, lisina, fenilalanina y tirosina

son mayores en la leche de vaca que en la de mujer. La fracción del lactosuero de la

leche de vaca contiene mayores concentraciones de treonina, lisina, metionina e

isoleucina que la leche humana. Estos excesos también se reflejan en el patrón de

aminoácidos en plasma de los niños alimentados con fórmulas infantiles. Además, éste

patrón puede verse afectado por los cambios que se producen en la biodisponibilidad

de los aminoácidos debidos a los procesos tecnológicos utilizados en fabricación de las

fórmulas. Para compensar estas diferencias en la concentración de aminoácidos con la

leche materna, se aumentó el contenido proteico de las fórmulas con la intención de

cubrir los requerimientos de ingesta de aminoácidos (Rudolff, 1997). Sin embargo, en

varios estudios realizados con posteridad, se comprobó que el contenido de triptófano

en el plasma de niños alimentados con dichas fórmulas era menor que el de los

alimentados mediante lactancia natural (Hanning, et al., 1992; Fazzolari‐Nesci et al.,


21

1992). Estas diferencias podemos eliminarlas introduciendo compuestos ricos en

triptófano como la α‐lactoalbúmina.

Así, el aumento del aporte de proteína en las fórmulas elaboradas a base de

leche de vaca, resultó en una elevación de los niveles de valina, fenilalanina y

metionina en plasma del lactante. Además, se ha observado que si se suplementan las

fórmulas con lactosuero de vaca, se produce un aumento en plasma de las

concentraciones de treonina, lisina leucina e isoleucina, incrementándose también el

nitrógeno ureico en plasma, lo cual indica que algún aminoácido de la dieta está en

exceso y se está catabolizando. Por el contrario, si disminuimos la cantidad de proteína

en las fórmulas, descienden los niveles de triptófano y taurina o cisteína. Las

consecuencias derivadas de estos desequilibrios no son conocidas hasta el momento y

probablemente varíen de un niño a otro (Heine, Klein y Reeds 1991).

Por todo ello, es necesaria más investigación en la búsqueda de métodos

adecuados para que los aminoácidos aportados por las fórmulas infantiles

proporcionen un patrón de aminoácidos en el lactante lo más parecido posible al que

obtienen los lactantes alimentados con leche materna, este objetivo se torna difícil de

conseguir cuando se parte de las proteínas de la leche de vaca. Uno de los principales

inconvenientes se debe a que la principal proteína del lactosuero bovino es la β‐

lactoglobulina (una proteína ausente en el lactosuero de la leche de mujer); siendo la

α‐lactoalbúmina, la principal proteína del lactosuero de la leche humana. Una de las

propuestas tecnológicas para mantener la calidad biológica de la proteína, se basa en

asegurar un buen aporte de triptófano y reducir el contenido de proteínas mediante el

enriquecimiento de la fórmula con alguna proteína rica en dicho aminoácido, como la

α‐lactoalbúmina (Lönnerdal, 2003).

3. α‐LACTOALBÚMINA

La proteína α‐lactoalbúmina se encuentra en la leche de vaca en una

concentración de 1 a 1,5 g/L (Figura 1), siendo aproximadamente el 3,4% de las

proteínas totales y el 20% de las proteínas del lactosuero (Swaisgood, 1995; Chatterton


22

et al., 2006). La α‐lactoalbúmina es en la leche humana la principal proteína del

lactosuero, aumentando su proporción desde un 21% hasta un 34% del día 1 al 14 de

la lactación. En la leche madura después del día 30, alcanza una concentración de 2,44

g/L (Jackson et al., 2004; Chatterton et al., 2006)

Figura 1. Concentración de α‐lactoalbúmina en leche de vaca, fórmulas estándar, fórmulas ricas en lactoalbúmina y en leche materna (Jackson et al., 2002; Lien, 2003).

3.1. Funciones de la proteína α‐lactoalbúmina

La proteína α‐lactoalbúmina posee una función bioquímica por su participación

en reacciones enzimáticas, y una función nutricional ya que forma parte de la

composición de la leche materna (Figura 2).

La función bioquímica de esta proteína en las células de la glándula mamaria es

de vital importancia en la lactogénesis ya que, junto a la galactosil‐transferasa forma el

complejo enzimático lactosa‐sintasa, que cataliza la síntesis de lactosa a partir de

glucosa y galactosa (Brodbeck et al., 1967; Permyakov et al., 1991; Lien, 2003). En

concreto, la α‐lactoalbúmina confiere a la galactosiltransferasa un incremento en la

afinidad por la glucosa (Hill y Brew, 1975; Musci y Berliner, 1985), en contraposición a

la formación de otros disacáridos que pueden ser sintetizados también por esta

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Leche bovina Fórmulas estándar

Fórmulas enriquecidas

Leche humana

α‐lactoalbúm

ina (g/L)


23

enzima. La asociación de la proteína y la galactosiltransferasa en la superficie interna

del aparato de Golgi está catalizada por ciertos iones como el manganeso, cinc, cobalto

y calcio y la uridin difosfato galactosa.

Figura 2. Función bioquímica y nutricional de la α‐lactoalbúmina, (adaptada de Lien, 2003)

Por otro lado, una vez que se completa la síntesis de lactosa, la α‐lactoalbúmina

se disocia de la galactosiltransferasa (cuya unión es relativamente débil) y junto a otros

componentes de la leche es transportado a la superficie apical de las células de la

glándula mamaria, siendo descargada al lumen alveolar. La proteína es secretada a la

leche siendo una importante fuente de aminoácidos para el lactante, cumpliendo su

función nutricional (Lien, 2003). Su elevado contenido en aminoácidos esenciales (63%

del total), particularmente triptófano (5,9% del total de los aminoácidos), cisteína y

lisina, le confiere un importante valor nutricional para el lactante (Rees, 2005).

3.2. Estructura de la proteína α‐lactoalbúmina

La estructura completa de la α‐lactoalbúmina bovina y humana fueron

inicialmente definidas por Brew et al., (1970) y Findlay y Brew (1972),

respectivamente. Puesto que la función es semejante en ambas especies, sus

estructuras son muy similares. Ambas están formadas por una cadena de 123

aminoácidos con un 72% de homología en la secuencia. Esta estructura tan parecida

minimiza la posibilidad de que la α‐lactoalbúmina bovina tenga propiedades

Galactosiltransferasa

Función Bioquímica

Función Nutricional

α‐Lactoalbúmina

LactosaGalactosa+ Glucosa

Proteínas del lactosuero


24

antigénicas para el niño recién nácido, si la comparamos con otras proteínas lácteas

como la β‐lactoglobulina. En la Figura 3 se presenta la secuencia completa de la

proteína bovina.

Figura 3. Secuencia de aminoácidos de la α‐lactoalbúmina bovina.

Su estructura y su secuencia tienen cierta semejanza con la lisozima, enzima

presente en algunas secreciones corporales, aunque aparentemente no tienen relación

sus propiedades funcionales (Campbell, et al., 2006). La estructura nativa de la α‐

lactoalbúmina posee dos dominios; uno formado por una gran α hélice y otro por una

pequeña lámina β, estos se unen por un puente de cisteína entre los residuos 73 y 91

que forman el sitio de unión del calcio (Figura 4). Otro puente disulfuro conecta los dos

dominios en los residuos 61‐77 y toda la estructura es estabilizada por cuatro puentes

disulfuro (Permyakov y Berliner, 2000).

La α‐lactoalbúmina posee un sitio de fuerte unión al calcio, y esta unión va a

influir directamente en su estabilidad, aunque no es esencial para su actividad dentro

del complejo lactosa sintasa. Recientemente, se ha encontrado un sitio secundario de

unión al calcio en el que están implicados cuatro cationes Ca2+. La unión de calcio

produce cambios en la función y estructura terciaria de la proteína (Anderson, Brooks

y Berliner 1997). Además del calcio se pueden unir otros cationes como Mg2+, Mn2+, K+

Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-(Arg)-Glu-Leu-Lys-Asp-Leu-Lys-Gly-Tyr-Gly-Gly-(Val) Variante A

Val-Ser-Leu-Pro-Glu-Trp-Val-Cys-Thr-Thr-Phe-His-Thr-Ser-Gly-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ala-

Ile-Val-Glu-Asn-Asn-Gln-Ser -Thr –Asp-Tyr-Gly-Leu-Phe-Gln-Ile-Asn-Asn-lys-ile-Trp-

Cys-Lys-Asn-Asp-Gln-Asp-Pro-His-Ser-Ser-Asn-Ile-Cys-Asn-Ile-Ser-Cys-Asp-Lys-Phe-

Leu-Asn-Asn-Asp-Leu-Thr-Asn-Asn-Ile-Met-Cys-Val-Lys-Lys-Ile-Leu-Asp-Lys-Val-Gly-

Ile-Asn-Tyr-Trp-Leu-Ala His-Lys-Ala-Leu-Cys-Ser-Glu-Lys-Leu-Asp-Gln-Trp-Leu-Cys-

Glu-Lys Leu

10

30

50

70

90

110

21

1

41

61

121

111

81

H.

.OH


25

y Na+, que compiten por el sitio de unión con el calcio y cuando se unen a la proteína

producen cambios similares. La unión fuerte de calcio va a aumentar la estabilidad de

la proteína, y lo mismo ocurre con la unión de los otros cationes excepto el cinc que

posee varios sitios de unión en la proteína, y que disminuye la estabilidad térmica de la

α‐lactoalbúmina causando agregación y aumentando la susceptibilidad de digestión

por proteasas (Permyakov et al., 1991; Permyakov y Berliner, 2000). Esta proteína

también puede interaccionar con varios grupos orgánicos de bajo peso molecular.

Figura 4. Estructura de la α‐lactoalbúmina humana. La lámina β (verde) y los dominios α (azul y rojo) (Rösne y Redfield, 2009).

El enriquecimiento de las fórmulas infantiles con α‐lactoalbúmina permite

diseñar un producto con una composición proteica y aminoacídica más similar a la

leche humana, hecho que tiene una gran importancia en nutrición infantil, ya que la

amplia gama de proteínas que posee la leche materna la convierte en una fuente

idónea de aminoácidos y de actividad biológica beneficiosa para el recién nácido,

principalmente por su acción inmunoestimuladora y antimicrobiana (Chowanadisai et

al., 2005).

3.3. Bioactividad de la α‐lactoalbúmina

Los efectos sobre la salud que produce la α‐lactoalbúmina pueden dividirse en

tres grupos; aquellos relacionados con la proteína intacta, los producidos por los


26

péptidos obtenidos tras la hidrólisis parcial de la proteína, y por último los que

producen los aminoácidos libres que resultan de la digestión completa de dicha

proteína (Chatterton et al., 2006). La mayoría de las investigaciones se centran en este

último punto debido a que la α‐lactoalbúmina es particularmente rica en aminoácidos

esenciales; sin embargo, se debe destacar que existen otras funciones biológicas que

también derivan de la ingesta de α‐lactoalbúmina.

El hecho de que la proteína α‐lactoalbúmina de origen bovino sea realmente

digerida de forma efectiva por el neonato, ha sido cuestionado desde los años 80

(Janas et al., 1987) en los que se realizaron ensayos de digestibilidad in vitro con

proteínas puras; sin embargo, dichos estudios actualmente están poco valorados. En

este sentido, siguen faltando datos concluyentes procedentes de ensayos realizados

con mezclas proteicas, aunque de lo observado hasta ahora parece deducirse que la

digestibilidad de la α‐lactoalbúmina es tan alta como la de la caseína y superior a la de

la β‐lactoglobulina. Estas conclusiones son de gran importancia debido a la relación

que existe entre la antigenicidad de las proteínas y su tamaño tras la digestión.

Aunque, como ya se ha expuesto anteriormente, la estructura primaria de la α‐

lactoalbúmina bovina y humana es similar, actualmente se desconoce si se forman los

mismos péptidos antimicrobianos durante la digestión in vivo. Además, es importante

tener en cuenta que los procesos de purificación de esta proteína del lactosuero son

cruciales para mantener su estructura y su bioactividad. El tratamiento térmico altera

el patrón de uniones disulfuro entre proteínas y/o causa uniones cruzadas

intermoleculares. La α‐lactoalbúmina, sola o en presencia de otras proteínas del

lactosuero, induce la formación de uniones intermoleculares por puentes disulfuro

entre la proteína en sí, entre la α‐lactoalbúmina y la β‐lactoglobulina, o entre la α‐

lactoalbúmina y la albúmina sérica bovina, este hecho impediría la liberación de los

péptidos bioactivos con acción antimicrobiana.


27

3.3.1. Importancia nutricional

El triptófano, es un aminoácido precursor de la serotonina cerebral y de la

melatonina. Ambos compuestos regulan una gran cantidad de reacciones como el

apetito, y la saciedad, la percepción del dolor, la depresión y el ritmo del sueño. En un

estudio realizado en adultos, Markus et al., (2000) compararon el efecto de la ingesta

de α‐lactoalbúmina y a la caseína sobre la respuesta al estrés, comprobando que entre

los individuos susceptibles al estrés, aquellos que habían tomado α‐lactoalbúmina

mostraban menos episodios de depresión que los que ingerían caseína, asociando este

hecho a un aumento de la concentración de triptófano en plasma. En un estudio

posterior Markus et al., (2002) ratificaron el aumento de triptófano en plasma tras el

consumo de una dieta rica en α‐lactoalbúmina respecto a la dieta control,

observándose en pacientes vulnerables al estrés un incremento en el triptófano y la

actividad de serotonina cerebral y por lo tanto una mejor función cognitiva

Los efectos beneficiosos de las fórmulas infantiles con concentraciones

aumentadas en α‐lactoalbúmina fueron mostrados por Heine, Klein y Reeds (1991) en

un estudio en el que una fórmula estándar rica en proteína (18 g/L) y baja en α‐

lactoalbúmina era comparada con otras dos fórmulas bajas en proteínas (13 g/L), y con

una concentración intermedia y alta de α‐lactoalbúmina. Sólo los recién nácidos que

recibían la fórmula con alta concentración de α‐lactoalbúmina mostraron una

concentración de triptófano sérico tan alto como los alimentados con leche humana.

Este estudio demostró que el desarrollo de fórmulas infantiles bajas en proteínas pero

enriquecidas con α‐lactoalbúmina, supone un importante avance en la creación de

fórmulas infantiles más parecidas en composición a la leche humana.

Sandström et al., (2008) realizaron un estudio en recién nácidos sanos

comparando un grupo alimentado con lactancia natural con otro alimentado con una

fórmula estándar a base de proteínas del lactosuero, y otras dos fórmulas ricas en α‐

lactoalbúmina (25%) con diferentes concentraciones de glicomacropéptidos (15% y

10% respectivamente). En dicho estudio, todas las fórmulas tenían la misma cantidad


28

de proteína; sin embargo, la fórmula con 25% de α‐lactoalbúmina contenían un 20%

más de triptófano que la leche materna o la fórmula estándar. Dicha fórmula dió lugar

a una concentración plasmática del aminoácido similar al obtenido en los niños

alimentados con leche materna. El nitrógeno ureico en sangre fue significativamente

mayor en todos los niños alimentados con fórmula en relación a los niños alimentados

con leche materna, y puesto que el crecimiento fue óptimo, estos autores propusieron

disminuir la cantidad total de proteína, siempre que ésta sea de alta calidad, ya que

elevados niveles de proteína pueden suponer una elevada carga renal. En este sentido

Lien, Davis y Euler (2004), llevaron a cabo un estudio en el que evaluaron una fórmula

con menor contenido proteico y enriquecida con α‐lactoalbúmina, observado un

patrón de crecimiento similar en los niños alimentados con la fórmula experimental y

con la fórmula control.

Son varios los estudios que profundizan en el efecto de las fórmulas infantiles

enriquecidas con α‐lactoalbúmina sobre el crecimiento de los lactantes y en todos los

casos los resultados obtenidos demuestran un patrón de crecimiento más parecido al

de los lactantes alimentados con leche materna que aquellos niños que son

alimentados con fórmulas estándar (Rochat et al., 2007; Sandström et al., 2008;

Trabulsi et al., 2011).

3.3.2. Absorción de minerales

La unión de minerales a péptidos procedentes de las proteínas del lactosuero es

menor y menos específica que la unión a péptidos originarios de la caseína, ya que

tienen cargas negativas que unen eficientemente cationes divalentes (Fe, Mg, Mn, Cu y

Se). Sin embargo los péptidos que se producen mediante hidrólisis in vitro o in vivo de

la proteína α‐lactoalbúmina, atrapan los minerales que se unen a sitios específicos y no

específicos. Por lo tanto esos péptidos pueden actuar de transportadores de varios

minerales aumentando o disminuyendo su biodisponibilidad (Kamau et al., 2010).


29

En un estudio realizado en monos Rhesus, Kelleher et al., (2003) observaron

que las fórmulas adicionadas con α‐lactoalbúmina producen un aumento en la

absorción de cinc con respecto a los animales alimentados con leche materna. Estas

diferencias podrían estar relacionadas con cierta actividad temporal de esta proteína

que provocaría un aumento del cinc plasmático, lo cual debe ser estudiado en

profundidad, ya que no es recomendable un aumento excesivo del mineral en plasma

debido a que parece interferir con la función inmune. Por lo tanto, es posible que la α‐

lactoalbúmina mejore la absorción mineral, ya que cuando se produce la digestión

parcial de esta proteína, los péptidos generados pueden favorecer la absorción de

cationes divalentes. Estos autores observaron también un aumento de la absorción de

hierro pero sin diferencias estadísticamente significativas respecto del grupo control

que posiblemente se debieron a la alta variabilidad encontrada por los autores.

Sändstrom et al., (2008) también observaron un incremento en la absorción de

hierro en niños alimentados con fórmulas ricas en α‐lactoalbúmina (25%). Este

aumento se reflejó en los niveles de hierro sérico, sin aparecer modificaciones en la

ferritina sérica ni en el hematocrito. La concentración de minerales en las fórmulas es

superior a la de la leche materna, pero la adición de α‐lactoalbúmina podría, por lo

tanto, conseguir una mayor biodisponibilidad de cationes divalentes, siendo necesario

añadir una menor proporción del mineral a las fórmulas infantiles.

3.3.3. Actividad anticarcinogénica

La actividad de la proteína α‐lactoalbúmina fue estudiada durante al menos

tres décadas, hasta que en 1995 se observó una nueva actividad de esta proteína que

despertó cierto interés. Hakansson et al., (1995) encontraron una forma multimérica de

la α‐lactoalbúmina con actividad antitumoral selectiva. Posteriormente, fue

demostrado que esta proteína unida al ácido graso C18:1:9 cis (ácido oleico) (a lo que

se le llamó complejo HAMLET/BAMLET: Human or Bovine Alpha‐lactalbumin Made

LEtal to Tumor cells), también poseía actividad frente a los tumores celulares

(Knyazeva et al., 2008). Las formas proteicas humanas y bovinas inducen, in vitro,

apoptosis en una gran variedad de tumores. Además, recientemente se ha demostrado


30

in vivo el efecto terapéutico específico del complejo HAMLET sobre varios tumores

como glioblastomas humanos, tumores en glándulas mamarias de ratón y también

sobre el papiloma humano en el que se observó una reducción de las lesiones

causadas por dicho virus en un 100% de los pacientes tratados con el complejo

HAMLET (Gustafsson, et al., 2005). Sin embargo, hasta ahora los beneficios sobre la

salud de los neonatos de los productos derivados de la digestión de la leche, y la

posible formación los complejos HAMLET en alguna etapa determinada de la digestión,

permanece sin esclarecer (Chatterton et al., 2006).

3.3.4. Actividad sobre el sistema inmune

En dos recientes estudios in vitro, las proteínas del lactosuero mostraron tener

actividad sobre el sistema inmune, estimulando la respuesta del mismo (Saint‐Sauveur

et al., 2008; Jacquot et al., 2010). Además estudios realizados en cultivos celulares y en

estudios in vivo han demostrado que estas proteínas son capaces de aumentar la

respuesta inmune no específica y específica (Gómez et al., 2002; Saint‐Sauveur et al.,

2009). La alta concentración de aminoácidos precursores de glutatión parece ser la

causa de los efectos inmunológicos producidos (Madureira et al., 2007).

3.3.5. Actividad prebiótica

Según diversos autores, la α‐lactoalbúmina estimula el crecimiento de

Bifidobacterias. Este hecho fue observado por Kee et al., (1998) en un estudio in vitro

realizado con Bifidobacterium longum ATCC 15707 y los péptidos que se generaron de

la digestión de la α‐lactoalbúmina. Además, estos péptidos poseen un efecto

inhibitorio sobre Bacteroides, Clostridios y E. coli, llegando a ser la reducción de estas

bacterias potencialmente patógenas, semejante a la que se observa en recién nácidos

alimentados mediante lactancia natural (Brück, Graverholt y Gibson 2002). En un

estudio in vivo realizado por Brück et al., (2006a), se observó un ligero efecto

bifidogénico en la población de niños alimentados con fórmulas enriquecidas con α‐

lactoalbúmina sólo en aquellos casos en los que la población de bacterias beneficiosas

era en inicio muy baja (niños no alimentados con leche materna)


31

3.3.6. Actividad antimicrobiana

Son diversos los estudios in vitro que demuestran la actividad antimicrobiana de los

péptidos que se producen tras la digestión de esta proteína. Pihlanto‐Leppälä et al.,

(1999) indicaron que tanto la pepsina como la tripsina liberan péptidos a partir de la α‐

lactoalbúmina que soncapaces de inhibir el crecimiento de Escherichia coli JM103,

mientras que la misma proteína sin ser sometida a hidrólisis carece completamente de

efecto. Se demostró el efecto antimicrobiano que ejerce la α‐lactoalbúmina, cuando es

añadida a fórmulas infantiles, frente a bacterias patógenas inoculadas en monos

rhesus (Escherichia coli enteropatógeno y Salmonella thypimurium) (Brück et al.,

2003a). Por otro lado, tres de los polipéptidos liberados tras la digestión (mediante la

acción de la tripsina y la quimotripsina) parecen tener efecto antimicrobiano frente a

Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,

Streptococci y Candida albicans (Pelligrini et al., 1999).

Las células Caco‐2 tratadas con péptidos procedentes de la digestión tanto de la

proteína α‐lactoalbúmina como de glicomacropeptidos mostraron menor adhesión de

los pátógenos Eschechia coli enteopatógeno, Shigela flexneri y Salmonella

thiphymorium respecto de las células control (no tratadas) (Brück et al., 2006b).

3.3.7. Otras funciones

Entre otras funciones atribuidas a los péptidos procedentes de la digestión de esta

proteína se encuentra la actividad reductora de la presión sanguínea. Diversos estudios

demuestran que diferentes péptidos procedentes de la proteína α‐lactoalbumina

sometida a distintas enzimas, poseen actividad antihipertensiva (Pihlanto‐Leppälä et

al., 2000; Otte et al., 2007). Se ha demostrado también la capacidad antioxidante de

los péptidos obtenidos a partir de la digestión de la α‐lactoalbúmina (Hernandez‐

Ledesma, et al., 2005), así como las propiedades antiulcerativas y su actividad opioide

(Antila et al., 1991; Pihlanto‐Leppälä et al., 2001).


32

En las Tablas 2 y 3 se resumen algunos de los estudios que avalan los efectos

beneficiosos de la proteína α‐lactoalbúmina y de los péptidos procedentes de su

digestión, así como los relacionados directamente con la actividad funcional que puede

aportar la proteína cuando se adiciona a alimentos infantiles. La Tabla 2 hace

referencia a los estudios in vitro que demuestran actividades que posteriormente se

evalúan in vivo.

Tabla 2. Estudios in vitro realizados con α‐lactoalbúmina o proteínas del lactosuero y efectos evidenciados.

F (fórmula infantil) α‐LA (α‐lactoalbúmina), GMP (Glicomacropeptidos). * Reemplaza ese porcentaje sobre el contenido proteico. **Indican porcentaje de pureza

Estos estudios ponen de manifiesto la capacidad antimicrobiana de los péptidos

producidos tras la digestión de la proteína α‐lactoalbúmina, aunque un estudio

Grupos de estudio Efectos Referencia

α‐LA + tripsina α‐LA + quimiotripsina

α‐LA+ pepsina

2 péptidos mostraron actividad antimicrobiana 1 péptido mostró actividad antimicrobiana

Ningún péptido mostró actividad antimicrobiana

Pellegrini et al., 1999

α‐ LA + ácido oleico Actividad antimicrobiana contra Streptococcus pneumoniae Hakansson et al., 2000

α‐LA Peptidos inhiben crecimiento de Escherichia coli JM103 La proteína intacta no tuvo actividad antimicrobiana

Pihlanto‐Leppälä et al.,

2000

1% lactosa Leche materna F. 68% α‐LA* F. 68% GMP*

Disminuyen los recuentos de Escherichia coli después de 6 horas de incubación con α‐LA y GMP pero luego los niveles se igualan

con el control

Bruck et al., 2002

1% lactosa Leche materna F. 68% α‐LA* F. 68% GMP*

α‐LA y GMP inhiben el crecimiento de S. choleraesuis y E. coli α‐LA y GMP pueden tener efectos beneficiosos sobre la

microbiota intestinal

Brück Graverholt y Gibson 2003b

α‐LA humana 90%** α‐LA bovina 68%** α‐LA bovina 25%**

GMP 80%**

Las células Caco‐2 tratadas con las proteínas ensayadas intactas y digeridas (pepsina o pepsina + pancreatina) mostraron menor adhesión de los patógenos estudiados (EPEC, S. thyphimorium y

S. flexneri) respecto del control

Brück et al., 2006b

Proteínas lactosuero Aumenta actividad del sistema inmune Saint‐Sauveur et al., 2008

α‐LA camello + digestión α‐LA bovina + digestión

Mayor antioxidante de α‐LA de camello con respecto a la α‐LA bovina

Salami et al., 2009

α‐LA + digestión β‐LG+ digestión

Aumenta respuesta del sistema inmune Jacquot et al.,

2010


33

realizado por Hakansson et al., (2000) obtiene el mismo resultado para una variante de

la proteína nativa. Otras de las actividades funcionales que se demuestran in vitro para

la α‐lactoalbúmina son los efectos positivos sobre el sistema inmune y la microbiota

intestinal son. A partir de las conclusiones obtenidas en estos estudios realizados in

vitro se cuenta con una base para seguir investigando los efectos beneficiosos in vivo,

ya que no debemos olvidar que en la metodología in vitro no se pueden reproducir las

condiciones fisiológicas exactas del organismo y que por lo tanto los efectos

demostrados in vitro deben tomarse con cautela al extrapolarlos a condiciones in vivo.

En la Tabla 3 se presentan exclusivamente los estudios realizados in vivo en

los que se evalúan fórmulas infantiles y concentrados proteicos. En las

investigaciones llevadas a cabo en animales de experimentación se observaron los

siguientes efectos beneficiosos: estimulación de la respuesta del sistema inmune,

composición de la microbiota intestinal parecida a la de los individuos alimentados

con leche materna y aumento de la absorción de cinc.

En los estudios realizados en humanos, se ha observado en lactantes un perfil

aminoácidico, crecimiento, desarrollo y composición de la microbiota intestinal

similar a los niños alimentados con leche materna, un aumento de la respuesta del

sistema inmune y una mayor absorción mineral (Tabla 3).


34

Tabla 3. Estudios in vivo realizados con fórmulas infantiles enriquecidas con α‐lactoalbúmina o suero proteico y los efectos producidos.

Grupos de estudio Efectos Referencia

F. estándar F. ↓Prot. 1/2[α‐LA] F. ↓Prot. ↑[α‐LA]

Perfil aminocídico parecido al de niños alimentados a pecho. Heine et al.,

1996

F. estándar F α‐LA F. GMP

Leche materna

Monos Rhesus alimentados con la F.+ α‐LA, mostraron una composición de la microbiota intestinal parecida a los

alimentados con leche materna.

Brück et al., 2003a

F. estándar F. caseína hidrolizada‐1 F caseína hidrolizada‐2 F. suero hidrolizado

Todas las fórmulas con proteínas hidrolizadas elevaron la concentración excesiva de aminoácidos en plasma.

El estatus de hierro fue menor en el grupo que recibió alguna de las fórmulas con caseína hidrolizada.

Hernell y Lönnerdal,

2003

F. estándar F. ↓Prot. ↑[α‐LA]

Patrón de crecimiento similar en los dos grupos de niños Mejor aceptación y tolerancia de la fórmula experimental

Lien, Davis y Euler ,2004

F. 11% α‐LA 14%GMP F. 25% α‐LA 15% GMP F. 25% α‐LA 10% GMP

Leche materna

No encontraron grandes diferencias en la microbiota intestinal debido a la alta variabilidad interindividual.

↓recuentos de clostridios.

Brück et al., 2006a

F. estándar F. GMP F. α‐LA

Leche materna

Monos alimentados con F. α‐LA presentaron un perfil aminoácido similar al de los alimentados con leche materna

↑absorción de cinc y en los grupos de alimentación enriquecida con GMP o α‐LA

Kelleher et al., 2003

F. 70% suero proteico Leche materna

Crecimiento, tolerancia y recuentos en la microbiota intestinal similares a los de los niños alimentados con LM

Rochat et al., 2007

F. estándar F. ↑[α‐LA]

Leche materna

↑Niveles de aminoácidos esenciales Tolerancia gastrointestinal parecida a niños alimentados con

LM

Davis et al., 2008

F. 11% α‐LA 14% GMP F. 25% α‐LA 15% GMP F. 25% α‐LA 10% GMP

Leche materna

Patrón de crecimiento parecido a niños alimentados con LM. Concentración de triptófano ↑ (F. Estandar vs. F ↑[α‐LA])

Sandström et al., 2008

Proteínas suero Aumenta repuesta sistema inmune de ratones infectados

con E.coli 0157:H7 Saint‐Sauveur et al., 2009

F. estándar F. ↑[α‐LA]+probiótico

F. experimental produce menores efectos gastrointestinales en bebes con cólico, además su crecimiento fue el esperado.

Dupont et al., 2010

F. 11% α‐LA 14% GMP F. 25% α‐LA 15% GMP F. 25% α‐LA 10% GMP

Leche materna

α‐LA y GMP no afectaron a la absorción de hierro Szymlek‐Gay et al., 2010

F. estándar F. ↓Prot. ↑[suero] Leche materna

El peso ganado en el grupo alimentado con la fórmula experimental se situó entre F. estándar y LM

Crecimiento similar al grupo de LM

Trabulsi et al., 2011

F: fórmula; Prot: proteína; GMP: glicomacropeptidos; α‐LA: α‐lactoalbúmina; LM: leche materna


35

4. COMPUESTOS NITROGENADOS NO PROTEICOS: NUCLEÓTIDOS

Los nucleótidos son compuestos químicos de bajo peso molecular (300‐350

Da) que están formados por la unión de una pentosa, una base nitrogenada púrica

o pirimidínica y de 1 a 3 moléculas de fosfato (Figura 5).

Figura 5. Estructura de un nucleótido

El ser humano obtiene los nucleótidos mediante absorción intestinal o síntesis

de novo. En la luz intestinal, las nucleoproteínas (nucleótidos unidos a proteínas) y los

ácidos nucleicos de la dieta son degradados por las nucleasas y proteasas intestinales

que producen nucleótidos libres. Éstos son metabolizados por otras enzimas, como

fosfatasa alcalina y nucleotidasas que separan los grupos fosfato originando

nucleósidos. Los nucleósidos son absorbidos por la mucosa intestinal y/o son

degradados hasta formar ácido úrico, o bien son convertidos de nuevo en nucleótidos

(Millan, 2005).

Aproximadamente un 25% del nitrógeno de la leche humana es nitrógeno no

proteico e incluye sustancias como aminoácidos libres, ácidos nucleicos, poliaminas,

carnitina y nucleótidos. Los nucleótidos representan aproximadamente 2‐5% del

nitrógeno no proteico de la leche materna que consiste entre 30 y más de 70 mg/L

(Carver, 2003). Por otro lado, es importante destacar que la leche de vaca posee un

contenido muy bajo en nucleótidos y además, su perfil difiere bastante del que

Fosfato

Base púrica o pirimidínica

Pentosa


36

presenta la leche materna. Este hecho ha impulsado a suplementar las fórmulas

infantiles con nucleótidos.

Hasta hace pocos años, la cuantificación de los nucleótidos se refería a la

medida de nucleótidos libres, pero hoy en día es sabido que la digestión de la leche

materna por el lactante genera más nucleótidos o nucleósidos disponibles. Por esta

razón se desarrolló un método (Leach et al., 1995) para determinar nucleótidos totales

potencialmente disponibles que determinó el rango en la leche materna 82–402

μmol/L (Lerner y Shamir, 2001).

Los nucleótidos se han relacionado con algunos de los efectos positivos de la

leche materna, como acciones sobre el sistema inmune y sobre la reparación

crecimiento y diferenciación de las células del tracto gastrointestinal. Además, los

nucleótidos están relacionados con una menor incidencia de diarrea (Brunser et al.,

1994; Yau et al., 2003), por lo que se cree que tienen influencia sobre la microbiota

intestinal. Así, diversos estudios in vitro demuestran una estimulación del crecimiento

de Bifidobacterias por parte de los nucleótidos (Uauy, 1989) y de manera indirecta

pueden inhibir el crecimiento de microorganismos potencialmente patógenos, debido

al descenso del pH (Gil, 2002).

Se ha visto que varios sistemas enzimáticos involucrados en la digestión de

nutrientes no están completamente desarrollados en los niños recién nácidos, por lo

que tienen una eficiencia de utilización limitada. En este sentido, Thorell et al., (1996)

demostraron que existía actividad enzimática para la digestión de ácidos nucleicos,

nucleótidos o nucleósidos en el contenido intestinal de fetos de 22 semanas de

gestación. Por esta razón las fórmulas infantiles se pueden suplementar con

cualquiera de estos compuestos. La absorción de los nucleótidos aportados en la dieta

es complicada debido a la carga negativa de los grupos fosfato, pero después de la

actuación de las enzimas digestivas se van a producir nucleósidos que sí son de fácil

absorción (Sanderson, 1994, Yu, 1998). Aunque más del 90% de los nucleótidos

ingeridos son absorbidos como nucleósidos en el intestino delgado (Carver y Walker


37

1995; Cosgrove, 1998) probablemente algunos pasan al colon donde pueden actuar

como promotores del crecimiento de Bifidobacterias (Singhal et al., 2008).

En individuos sanos sólo se utiliza el 5% de los nucleótidos de la dieta, ya que sus

necesidades son cubiertas endógenamente; pero, en ciertas condiciones, el cuerpo

requiere un suplemento adicional, por lo que será necesario el aporte exógeno de

nucleótidos. Estas condiciones especiales ocurren cuando existe un crecimiento rápido

del organismo como sucede en la infancia (Jyonouchi, 1994).

Los nucleótidos participan en diversos procesos biológicos esenciales (Cosgrove,

1998; Lawrence et al., 2007):

• Producción de ácidos nucleicos, ADN, ARN

• Metabolismo energético (ATP)

• Mediadores fisiológicos (AMPc, GMPc, ADP)

• Coenzimas en procesos metabólicos (NAD, CoA)

• Moléculas transportadoras en reacciones de síntesis (UDP, GDP,CMP)

No obstante, estos compuestos no se consideran nutrientes esenciales porque son

sintetizados y reciclados durante los procesos metabólicos.

4.1 Bioactividad de los nucleótidos

A continuación se describen los efectos beneficiosos que pueden producir los

nucleótidos y en la Tabla 4 se resumen los principales estudios realizados en este

sentido.

Parece ser que las fórmulas infantiles suplementadas con nucleótidos podrían

producir un aumento de la absorción de hierro en los lactantes. Esta idea surge

principalmente por un estudio llevado a cabo en ratas (Faelli y Esposito 1970). Debido

a que la leche materna posee concentraciones de nucleótidos mayores que las

fórmulas infantiles, se ha postulado que los nucleótidos intervienen en la mejora de la

absorción de hierro de la leche materna. Sin embargo Hernell y Lönnerdal (2002) en


38

un estudio realizado en lactantes alimentados con leche materna, fórmula estándar y

fórmula suplementada con nucleótidos no observaron ninguna mejora en el estatus

del hierro.

Varios estudios han demostrado que la suplementación de fórmulas infantiles

con nucleótidos, incrementa el crecimiento de Bifidobacterias y disminuye el de

Enterobacterias (Gil y Rueda, 2000). Las Bifidobacterias disminuyen el pH intestinal y

de esta manera impiden el crecimiento de bacterias potencialmente patógenas como

las pertenecientes al género Bacteroides y Clostridium (Carver y Walker, 1995;

Cosgrove, 1998; Gil, 2002), reduciendo de este modo la incidencia de diarrea debido a

la inhibición de los grupos bacterianos citados anteriormente (Yau, 2003; Schaller,

Buck y Rueda, 2007). Sin embargo, son pocos los estudios realizados in vivo que

investigan el efecto de los nucleótidos sobre la microbiota intestinal. Además, los

resultados obtenidos hasta el momento son contradictorios, ya que algunos concluyen

que los nucleótidos promocionan el crecimiento de Bifidobacterias (Gil et al., 1986;

Uauy, 1989) mientras que en otros estudios se indica que lo restringe (Balmer, Hanvey

y Wharton, 1994). Esta contradicción puede ser debida a que el análisis de la

microbiota intestinal se realizó en ambos estudios mediante cultivos en placa y es

sabido que la variabilidad suele ser bastante alta para esta metodología, existiendo

además determinadas bacterias no cultivables.

Un estudio más reciente, realizado por Singhal (2008) en el que se analizó la

microbiota mediante técnicas moleculares, concluyó con un efecto positivo sobre el

balance de la microbiota intestinal, aunque no encontró un incremento del

crecimiento de Bifidobacterias. Además, no pudo relacionar el aporte de nucleótidos

con una menor incidencia de diarrea. En este sentido los resultados de los diferentes

estudios son contradictorios como podemos observar en la Tabla 4, ya que hay

ensayos que demuestran menor incidencia de diarrea incluso con concentraciones

bajas de nucleótidos (32 mg/L) mientras que en otros no se observan estos efectos

positivos suplementando la fórmula infantil con una mayor concentración de

nucleótidos (72 mg/L). Esta gran variabilidad puede ser debida a la diferente

metodología empleada en el análisis microbiano.


39

La suplementación de fórmulas infantiles con nucleótidos podría mejorar el

crecimiento del individuo y su desarrollo, aunque no hay estudios concluyentes en

este sentido (Uauy 1989). Lo que si se ha observado es una mejora evidente en el

crecimiento en niños nácidos con bajo peso (Cosgrove et al., 1996). Sin embargo, un

estudio reciente realizado por Singhal et al., 2010 demostró la mejora del crecimiento

de lactantes nácidos con un peso normal alimentados con fórmulas infantiles

suplementadas con estos compuestos.

Numerosos trabajos han demostrado la capacidad de los nucleótidos para

estimular la respuesta del sistema inmune modulando la respuesta celular y humoral

(Gil y Rueda, 2002; Yau et al., 2003; Vasquez‐Garibay, 2004; Buck et al., 2004; Schaller

et al., 2004; Hawkes et al., 2006). Estos efectos también han sido observados en

lactantes alimentados con fórmulas infantiles a base de soja y suplementadas con

nucleótidos, en ellos se observa una respuesta inmunitaria e incidencia de diarrea

similares a los lactantes alimentados con leche materna durante 2 meses y

posteriormente con fórmula estándar (Ostrom et al., 2002; Cordle et al., 2002).

Además, un estudio reciente ha realizado un meta‐análisis corroborando el efecto

beneficioso de los nucleótidos sobre el sistema inmune (Gutierrez et al., 2007).

Estos compuestos poseen un papel importante en el crecimiento y

diferenciación del tracto gastrointestinal. El tejido intestinal de los animales a los que

se les suplementa la dieta con nucleótidos, tiene más proteína y ADN en la mucosa,

además de tener vellosidades más grandes, mayor actividad disacaridasa y mejor

capacidad para la reparación de la mucosa intestinal. LeLeiko et al., (1995)

demostraron que la dieta suplementada con nucleótidos afectaba a la expresión

génica de la enzimas gastrointestinales. Por otro lado, dietas suplementadas con

nucleótidos fueron relacionadas con un incremento en la actividad disacaridasa y en la

altura de las vellosidades (Uauy et al., 1990) y un aumento en el porcentaje del peso

del intestino delgado respecto del peso corporal (Carver, 1994). Los resultados

obtenidos en los estudios realizados hasta ahora, sugieren que los nucleótidos de la

dieta pueden ser importantes para el crecimiento y desarrollo intestinal en la vida

postnatal temprana (López‐Navarro et al., 1996).


40

Tabla 4. Estudios in vivo realizados en lactantes sanos y nácidos a término, relacionados con la adición de nucleótidos a fórmulas infantiles.

Bacteroides‐Porphyromonas‐Prevotella group (BPP). a fórmulas de soja con nucleósidos totales potencialmente disponibles 300mg/L. F: fórmula; LM: leche materna; NT: Nucleótidos.

Grupos de estudio

Dosis/duración Efectos Referencia

F. estándar F. NT

4 semanas ↑ Bifidobacterias Gil et al., 1986

F. estándar F. NT LM

33 mg /L 4 meses

mayor respuesta inmune en lactantes alimentados con F. NT

Carver et al., 1991


34 mg /L 7 semanas

Los nucleótidos no mostraron efectos beneficiosos sobre la microbiota intestinal ↓ Bifidobacterias, ↑Bacteroides y E. coli

Balmer, Hanvey,

Wharton, 1994

F. estándar F. NT

29,5‐37,7 mg/L Mejora del crecimiento Cosgrove et al.,

1996.


72 mg/L 12 meses

Menor incidencia de diarrea y mayor respuesta inmune en lactantes alimentados

con F. NT

Pickering et al., 1998


72 mg/L 6 meses (1‐3m)

↓ Incidencia de diarrea (F. NT). Merolla, 2000


40 mg /L 6 meses

No afectó a los depósitos de hierro Hernell y

Lönnerdal, 2002

F. soja F. soja NT

LM/F. estándar

72 mg/L 12 meses

La suplementación con nucleotidos mostró beneficios contra Haemophilus influenza b y

menores episodios de diarrea

aOstrom et al., 2002

F. soja F. soja NT

LM/F. estándar

72 mg/L 12 meses

respuesta del sistema inmune similar en F. soja NT y LM/F. estándar

aCordle et al., 2002

F. estándar F. NT

72 mg/L 12 meses

↑ respuesta del sistema inmune (F. NT.) ↓ incidencia de diarrea en el grupo (F. NT).

Yau et al., 2003


72 mg/L 12 meses

↑ la respuesta del sistema inmune (F. NT.) Schaller et al.,

2004


72 mg/L 12 meses

↑ la respuesta de anticuerpos y la inmunidad celular (F. NT.).

Buck et al., 2004


33,5 mg/L 7 meses

Se observaron pequeñas mejoras en la respuesta de anticuerpos.

Hawkes et al., 2006


31 mg /L 20 semanas

La fórmula infantil suplementada mejoró la composición de la microbiota intestinal ↓proporcion BPP/Bifidobacterium

Singhal et al., 2008

F. estándar F. NT

72 mg /L 1 año

No hubo efectos positivos en la incidencia de diarrea

Neri‐Almeida et al., 2009


31 mg /L 20 semanas

Los nucleótidos mejoraron el crecimiento de los lactantes.

Singhal et al., 2010


41

5. BIODISPONIBILIDAD MINERAL

La ingesta inadecuada de minerales puede ser responsable de enfermedades en el

recién nácido que pueden tener consecuencias inmediatas, e incluso manifestarse en

la edad adulta (Frontela et al., 2009a). En este sentido, la deficiencia en hierro puede

ocasionar entre otras alteraciones un inadecuado desarrollo motor, la deficiencia en

calcio puede ser la causa de raquitismo y/o osteoporosis y la deficiencia en cinc puede

provocar retraso en el crecimiento y comprometer el sistema inmune del recién nácido

(Domellöf et al., 2004).

No todo el mineral que es ingerido a partir de un alimento estará disponible para

que el organismo lo utilice en los diferentes procesos bioquímicos y metabólicos.

Solamente una parte será absorbida a nivel intestinal y participará en dichos procesos

orgánicos. Por esta razón, antes de profundizar en la biodisponibilidad mineral, es

importante realizar una diferenciación entre los conceptos de biodisponibilidad y

bioaccesibilidad mineral.

‐ Biodisponibilidad mineral corresponde a la proporción de mineral ingerido que

puede ser utilizado en los procesos metabólicos del organismo (Greffeuille et al.,

2011).

‐ Bioaccesibilidad mineral se define como la proporción mineral de una matriz

alimentaria que se encuentra solubilizado en el lumen del tracto gastrointestinal y

que por lo tanto podría ser absorbida (Greffeuille et al., 2011).

En la biodisponibilidad mineral están involucradas tres fases: la disponibilidad del

nutriente en el lumen intestinal para su absorción (bioaccesibilidad), la absorción y/o

retención del nutriente en el organismo, y la capacidad del organismo para utilizarlo en

las funciones metabólicas (Farré, 201o). La primera fase depende de factores

relacionados con el alimento (factores extrínsecos como la fibra alimentaria,

determinadas vitaminas, presencia de antinutrientes como el ácido fítico y ácido

oxálico, etc.) mientras que las otras dos fases dependen de los mecanismos de

regulación homeostática y de las necesidades fisiológicas del individuo (factores


42

intrínsecos como el sexo, la edad, el tránsito intestinal, niveles de los depósitos del

mineral en el organismo, etc.) (Watzke, 1998).

La biodisponibilidad mineral de las fórmulas infantiles elaboradas a base de leche

de vaca es menor que la de la leche materna. La composición y concentración de la

caseína y de las proteínas del lactosuero de la leche vaca, las propiedades estructurales

de los fosfopéptidos formados durante la digestión y la concentración de algunos

minerales, han sido descritas entre otros factores como responsables de esta baja

biodisponibilidad (Bouhallab et al., 2002). Ésto ha hecho que la concentración de

algunos minerales añadidos a las fórmulas infantiles sea mayor que la concentración

de los mismos minerales en la leche materna. Para una adecuada fórmulación mineral

de las leches de inicio se debe conseguir que la cantidad de mineral absorbido sea

parecida a la cantidad absorbida de la leche materna (Drago y Valencia 2004).

La suplementación mineral de las fórmulas infantiles puede afectar a la

biodisponibilidad del resto de minerales, en este sentido se ha comprobado en

estudios in vitro que la adición de calcio puede afectar a la biodisponibilidad del hierro

(Perez‐Llamas et al., 2001). Además en un ensayo realizado en cereales reconstituidos

con fórmulas infantiles se observó que el calcio, presente en dicha fórmula, disminuía

la disponibilidad in vitro del hierro y cinc de los cereales (Frontela, Ros y Martínez

2009b).

5.1 Métodos de estudio de la biodisponibilidad mineral

La medida de la biodisponibilidad mineral se ve dificultada por el complejo proceso

de la digestión gastrointestinal, aunque se han desarrollado varios métodos que

intentan evaluarla reproduciendo las condiciones gastrointestinales del modo más fiel

posible. A continuación se enumeran y explican brevemente cada uno de estos

métodos. El método que utiliza cultivos celulares se expondrá con más profundidad e

el apartado 5.2.3., ya que es el que se desarrolla en esta tesis. En la Figura 6 se

muestra la clasificación de los métodos utilizados actualmente para evaluar la

biodisponibilidad.


43

Figura 6: Diferentes métodos para evaluar la biodisponibilidad mineral.

5.1.1 Métodos de estudios in vivo

‐ Balances químicos:

En los métodos que utilizan balances químicos para medir la biodisponibilidad

mineral, se evalúa la cantidad ingerida del mineral y se relaciona con la cantidad

excretada del mismo durante un largo periodo de tiempo. Sus principales limitaciones

son el tiempo necesario para su desarrollo, posibles errores significativos en la

estimación de absorción debido a errores en la cantidad de ingesta y excreción, y por

último poder diferenciar si el mineral excretado proviene de la dieta o del

metabolismo endógeno (Van Campen y Glahn, 1999).

‐ Isótopos:

Actualmente, en los estudios in vivo realizados en humanos, los métodos más

utilizados son los que emplean isótopos para marcar la fuente dietética del mineral a

MÉTODOS PARA EVALUAR LA BIODISPONIBILIDAD MINERAL

IN VIVO

HUMANOS

BALANCES QUÍMICOS

ISÓTOPOS

ESTABLES RADIACTIVOS

ANIMALES

IN VITRO

SOLUBILIDAD DIALIZABILIDAD

LÍNEAS CELULARES


44

estudiar y realizan posteriormente la medida del mineral marcado en los distintos

órganos. Los isótopos utilizados en estos estudios pueden ser radioactivos o estables.

El análisis de las muestras se lleva a cabo mediante espectrometría de masas. En los

isótopos radiactivos se plantea un problema ético, ya que los individuos deben aceptar

la exposición a pequeñas dosis de radioactividad, mientras que en los métodos con

isótopos estables el problema planteado es económico, debido a su elevado coste

(Martínez et al., 1999).

Los isótopos estables de calcio, magnesio, cinc y hierro se han utilizado en

numerosos estudios clínicos con grupos de diferente edad y no se ha observado

ninguna complicación relacionada con su uso. Estos isótopos estables no causan

ningún cambio fisiológico ni riesgo cardiovascular en las dosis empleadas hasta ahora

en los estudios de cinética de absorción (Abrams, 2008).

‐ Modelos animales:

El uso de modelos animales para evaluar la biodisponibilidad mineral y realizar

una posterior extrapolación a seres humanos está limitado por las diferencias entre

especies utilizadas, tanto en la velocidad de crecimiento como en la actividad de

enzimas intestinales y microbianas, y en la fisiología y anatomía intestinal que difieren

en mayor o menor medida del organismo humano (Binaghi et al., 2008).

Por ejemplo es sabido que las ratas no son un buen modelo animal en el

estudio del hierro ya que sintetizan vitamina C que favorece la absorción de este

mineral (Reddy y Cook 1994). Patterson et al., (2008) señalaron al cerdo como un buen

modelo animal en el estudio de la disponibilidad de hierro, debido a que los niveles de

este mineral en cerdo son más fácilmente manipulables en el nacimiento. Por otro

lado, Zinn et al., (1999) pudieron observar que los niveles de hierro de los lechones

eran similares a los presentados por niños de 6 a 9 meses de edad.


45

5.1.2 Métodos de estudio in vitro Se han desarrollado diversos métodos in vitro para evaluar la disponibilidad

mineral de un alimento como alternativa a los estudios in vivo, ya que estos últimos

requieren de más tiempo para su desarrollo y presentan elevados costes, además de

ser complicados de llevar a cabo y en ocasiones no son aprobados por los Comités

éticos. Con los métodos in vitro, en los que se simulan condiciones fisiológicas, se

puede estimar la biodisponibilidad de un nutriente y anticiparnos así a lo que ocurriría

en un modelo in vivo (Farré, 2010). Sin embargo, estos métodos sólo permiten realizar

estimaciones relativas de la biodisponibilidad ya que existen factores fisiológicos que

afectan a la absorción mineral (estado nutricional, secreción gastrointestinal,

interacciones con la mucosa, microbiota intestinal…) que no pueden ser reproducidos

(Martínez et al., 1999). Se consideran, por lo tanto, útiles para desarrollar hipótesis

pero no para tomar decisiones sobre fortificación de alimentos, para lo que son

necesarios estudios en humanos (Farré, 2010).

Los métodos in vitro más sencillosse basan en la evaluación del mineral soluble

y dializable a través de una membrana, previa simulación in vitro de la digestión

gastrointestinal. Esta fracción mineral soluble nos da una medida del mineral

bioaccesible, mientras que cuando evaluamos el mineral dializado a través de un

membrana semipermeable obtenemos valores extrapolables al mineral absorbido a

nivel intestinal y que pasa por lo tanto, al torrente sanguíneo (Frontela, Ros y

Martínez, 2009b).

5.1.3 Métodos de estudio con líneas celulares

El uso de líneas celulares humana para estudiar los procesos de absorción a

nivel intestinal requiere, en primer lugar, de la elección de la línea celular adecuada y

también el conocimiento de las condiciones fisiológicas idóneas de ese tipo celular al

simular las condiciones intestinales. Uno de los factores críticos a controlar es el pH ya

que juega un papel fundamental en la absorción de minerales (Frontela et al., 2011).


46

Una de las líneas celulares más utilizadas es la línea Caco‐2, procedente de

adenocarcinoma de colon humano que posee las características bioquímicas y

morfológicas de los enterocitos del intestino delgado y que han sido utilizadas en

numerosos estudios para estimar la biodisponibilidad mineral. En cultivo, estas células

son capaces de diferenciarse de forma espontánea para dar lugar a una monocapa

celular polarizada que posee muchas de las características funcionales y morfológicas

de los enterocitos humanos maduros (Álvarez‐Hernández et al., 1994). Estas células se

cultivan habitualmente sobre un soporte microporoso inserto en un sistema bicameral

de modo que pueden diferenciarse dos compartimentos: apical y basal, lo que permite

realizar la medida del mineral que es transportado a través de la monocapa de células.

Este mineral transportado a la cámara basal se estima como medida del mineral que

pasa al torrente circulatorio una vez que se ha absorbido (Frontela et al., 2009a). La

línea celular Caco‐2 ha sido ampliamente considerada como un sistema in vitro

adecuado para el estudio de absorción de nutrientes a nivel intestinal. Sin embargo,

presenta alguna limitación en la medida de ciertos minerales, debido a la baja

permeabilidad paracelular comparada con la que presenta el intestino delgado

humano (Atursson y Karlsson, 1991).

Los ensayos de biodisponibilidad mineral mediante la línea celular Caco‐2 han

sido correctamente correlacionados con estudios in vivo. No obstante, para el caso de

algunos minerales como el hierro, hay ensayos que han obtenido resultados variables

empleando esta línea celular atribuyéndolo a la ausencia de moco en la superficie

apical de las mismas (Laparra et al., 2009). En este sentido se ha propuesto la

utilización de líneas celulares alternativas como la HT29 (procedente de intestino) que

expuesta a metotrexano (HT29 MTX) producen mucus, con el fin de aproximar más los

ensayos a las condiciones fisiológicas (Frazer y Anderson, 2005; Laparra et al., 2009;

Mahler et al., 2009).

También debemos señalar las limitaciones que encontramos al realizar ensayos

con líneas celulares respecto a los ensayos in vivo. Por ejemplo, el área de transporte

es sólo una pequeña fracción de la correspondiente al intestino delgado y resulta


47

imposible reproducir in vitro los movimientos peristálticos y la regulación

neuroendocrina (Frontela et al., 2011)

5.2 Biodisponibilidad de calcio

El calcio es un nutriente esencial para numerosos procesos bioquímicos como la

coagulación sanguínea, la contracción muscular, la transmisión de impulsos nerviosos,

la mitosis o la integridad de las membranas celulares, estando además involucrado en

muchas reacciones enzimáticas y forma parte del esqueleto (Pereira et al., 2009). El

calcio corporal se encuentra en dos compartimentos: en el esqueleto (99%) y en

fluidos extracorporales (1%). En éste último, se puede encontrar de tres formas, unido

a la albúmina, unido a aniones o en forma ionizada libre (Jain et al., 2010). El calcio de

los huesos forma parte de dos tipos de depósitos: un pequeño depósito de calcio

intercambiable de rápida y fácil movilización, y una reserva más estable y poco

intercambiable, que representa el 99% del calcio óseo (Pérez‐Llamas et al., 2010).

Es importante destacar que los requerimientos de calcio varían según la etapa

de la vida en la que se encuentre el individuo, existiendo grandes necesidades en los

periodos de rápido crecimiento, infancia y adolescencia, ya que en dichos periodos el

hueso crece e incrementa el depósito mineral (Pereira et al., 2009).

5.2.1 Absorción y regulación del calcio

En el intestino delgado se absorbe aproximadamente el 90% de calcio. La

permanencia del quimo en cada segmento del intestino delgado determina la cantidad

de calcio absorbida. Cuando la ingesta de calcio es normal o alta, la cantidad relativa

de calcio absorbido en el duodeno es pequeña comparada con la cantidad absorbida

en el íleon. Una mínima cantidad de calcio es absorbido en el intestino grueso,

cantidad que no excede de 10% (Bronner, 2008).

La cantidad de calcio ingerido con la dieta afecta a la eficiencia de la absorción del

mismo a nivel intestinal. Así, dietas bajas en calcio incrementan la absorción de este


48

mineral viéndose influenciada, al menos en parte, mediante la regulación de la

vitamina D y la composición lipídica y fluidez de las membranas celulares. También, las

necesidades fisiológicas influyen en la absorción de calcio intestinal de tal manera que

cuando los requerimientos aumentan y la ingesta es baja, la absorción mejora (Pérez et

al., 2008).

El calcio presente en los fluidos extracelulares e intracelulares debe estar

estrechamente regulado para poder ejercer su papel en las funciones citadas

anteriormente. El balance de calcio debe ser mantenido para asegurar la integridad

esquelética y este balance se lleva a cabo mediante el transporte coordinado entre

intestino, riñón y hueso en el que dos hormonas son las principales responsables de la

regulación del flujo de calcio, la hormona paratiroidea (PTH) y la 1,25‐dihidroxivitamina

D (1,25 (OH)2 D) (McKay, 2010).

La absorción del calcio a través del tejido epitelial, se realiza mediante dos

procesos, un movimiento transcelular que tiene lugar en el duodeno y un movimiento

paracelular que ocurre en el resto del intestino delgado.

‐ Transporte transcelular: La proporción de calcio absorbido mediante este

proceso es elevada cuando la ingesta de calcio es baja y en estados de crecimiento

rápido, decreciendo con la edad. Hay tres mecanismos involucrados en este tipo de

transporte (McKay, 2010):

a. Canales de calcio: las moléculas involucradas en la entrada apical de calcio son

dos canales llamados TRPV5 y TRPV6. En humanos las dos proteínas se

coexpresan en riñón e intestino y también en otros órganos o glándulas. Ambos

canales son permeables al calcio pero también lo son a otros cationes divalentes

e incluso a monovalentes en ausencia de divalentes. Estos canales se localizan

en el borde en cepillo del enterocito y es posible que sean los que limitan el

paso de entrada de la absorción activa del calcio (Pérez et al., 2008).

b. Calbindinas: son proteínas responsables del transporte del calcio de la cara

apical del enterocito a la basolateral (Tolosa de Talamoni, Perez y Alisio, 1998).


49

Estas proteínas no solo transportan calcio sino que también proporcionan

protección frente a los niveles tóxicos de calcio durante el alto flujo del mismo,

ya que actúan sobre su regulación (Venyaminov et al., 2004).

c. La salida del calcio del enterocito está mediada por una bomba de calcio (PMCA)

localizada en las caveolas de la membrana celular que pueden encontrase

abiertas o cerradas. Otra molécula que interviene en la salida de calcio es un

intercambiador sodio calcio (NCX1) que es responsable aproximadamente del

20% de la extrusión de calcio y su actividad depende del gradiente creado por

Na+/K+‐ATPasa.

‐ Transporte paracelular: El epitelio está constituido por una capa continua de

células individuales y por estrechos espacios intercelulares, que permiten el paso de

pequeñas moléculas e iones a través de ellos. Esta ruta es regulada por el epitelio para

mantener su permeabilidad selectiva. Así, dependiendo de los requerimientos

funcionales, pasarán pequeñas o grandes cantidades de moléculas e iones a través de

las estrechas uniones celulares. Este proceso ha sido menos estudiado que el

transcelular; sin embargo, estudios recientes relacionan componentes moleculares del

transporte paracelular con determinadas enfermedades hereditarias (Hoenderop,

Nilius y Bindels, 2005). Cuando la ingesta de calcio es normal o alta, esta ruta comienza

a ser importante en la absorción del calcio. El movimiento de calcio a través de las

estrechas uniones es un proceso pasivo que depende en mayor parte del gradiente de

concentración del ion y del gradiente eléctrico a través del epitelio. Este no es un

transporte saturable y ocurre principalmente en el yeyuno e íleon (Pérez et al., 2008).

En la Figura 7 se presenta un esquema de las dos rutas de absorción del calcio;

El transporte paracelular se produce en las uniones estrechas (TJ) de las células

mediante gradiente electroquímico. En el transporte transcelular están involucrados

tres procesos, en primer lugar, la entrada apical de calcio a través de los canales TRPV5

y TRPV6. Posteriormente, una difusión en el citosol unido a calbindinas y por último

extrusión a través de la membrana basolateral mediante Ca2+‐ATPasa (PMCA1b) y el

intercambiador Na+/Ca2+ (NCX1). La 1,25‐dihidroxivitamina D se une a sus receptores


50

nucleares y el complejo interactúa con secuencias específicas de ADN induciendo la

transcripción y aumentando la expresión de los canales TRPV5 y TRPV6, las calbindinas

y los sistemas de extrusión.

Figura 7. Absorción transcelular y paracelular del calcio (adaptada de Hoenderop,

Nilius y Bindels, 2005)

El principal regulador de la absorción del calcio es la 1,25‐dihidroxivitamina D

(calcitriol, que es la forma activa de la vitamina D) aunque también algunas hormonas

y nutrientes participan en esta regulación. Por ejemplo, la hormona tiroidea posee un

papel importante en el mantenimiento de la concentración de calcio extracelular

(Mckay, 2010). Por otro lado, el papel de la calcitonina en la absorción intestinal es

poco conocido, aunque Yoshida et al., (1999) llegaron a la conclusión de que la

calcitonina producía un incremento de 1,25 dihidroxivitamina D. Otras hormonas que

intervienen en la regulación de este proceso son los estrógenos y los glucocorticoides.

Los hidratos de carbono incrementan su absorción, mientras que las proteínas no la

altera y los datos relacionados con los lípidos no son concluyentes. Se ha propuesto

igualmente que los probióticos influyen positivamente en la absorción del catión

debido a la producción de ácidos grasos de cadena corta que favorecen su absorción

(Pérez et al., 2008).

1,25(OH)2D3

Ca2+

Ca2+

NCX 1

PMCA 1bCalbindina

Ca2+Ca2+ Ca2+

Ca2+Ca2+

ATPCa2+

Ca2+

3Na+ Ca2+

mRNA

Lumen SangreEspacio intersticial

TRPV5/6

Síntesis proteínas

Ca2+

TJ


51

Hay otros componentes en la dieta que pueden disminuir la absorción del calcio

formando complejos insolubles con él. Entre estos antinutrientes son de especial

relevancia los fitatos, taninos y oxalatos (Guéguen y Pointillart, 2000).

Se sabe también que no existe una regulación directa de la absorción paracelular.

Las uniones celulares juegan el mayor papel en la regulación de la permeabilidad

epitelial, por lo que los factores que afecten dicha permeabilidad afectarán al

movimiento paracelular de calcio (Bronner 2008).

La excreción del calcio ocurre a nivel renal y gastrointestinal. El calcio fecal puede

tener dos orígenes: exógeno (fracción no absorbida de la dieta) y endógeno (restos

celulares de la mucosa, jugos digestivos y bilis). Diversos estudios han recomendado

que las concentraciones de fosfato y calcio en sangre se mantengan en una proporción

1:1, ya que el exceso de alguno de los dos provocará un aumento de su excreción en

heces. La excreción urinaria de calcio se encuentra bajo regulación endocrina (Perez‐

Llamas et al., 2010).

5.2.2 Homeostasis de calcio en el recién nácido

Durante el último trimestre del embarazo el calcio es transferido de la madre al

feto a través de la placenta, acumulando 120‐150 mg por kilo de peso en el feto. En el

momento del nacimiento, los recién nácidos a término presentan aproximadamente

30 g de calcio en el organismo (Mckay, 2010). Tras el nacimiento se rompe el vínculo

materno que aportaba el calcio por lo que los niveles de calcio sérico en el recién

nácido comienzan a decrecer. Este descenso está relacionado con la aparición de

hipoparatiroidismo (ausencia de respuesta en la produción de PTH) desórdenes en el

metabolismo de la vitamina D y con un exceso de fósforo, magnesio y/o calcitonina.

Los niveles de la paratohormona van aumentando gradualmente durante 48 horas

tras el nacimiento volviéndose a encontrar niveles normales de calcio al tercer día (Jain

et al., 2010).


52

Los riñones del recién nácido juegan un papel importante en la homeostasis del

calcio y fósforo y en la regulación de las pérdidas de mineral por medio de la orina. En

circunstancias normales casi todo el calcio filtrado es reabsorbido en el túbulo renal,

aunque la excreción renal de calcio puede modificarse por factores locales y sistémicos

como la actividad de la hormona paratiroidea. Hasta el momento, se conoce poco la

capacidad de los lactantes para responder a dicha hormona (Hsu y Levine, 2004).

El calcio soluble o unido a diferentes moléculas orgánicas como fosfopéptidos

puede ser absorbido en el intestino. Además de la forma química en la que se

encuentre el calcio, otros factores van a influir también en su absorción, por ejemplo la

relación calcio: fósforo, citada anteriormente (Bronner & Pansu, 1999). En la absorción

de calcio intestinal aparecen tanto el transporte pasivo como los mecanismos de

transporte activo dependientes de la vitamina D. Es importante tener en cuenta que el

estatus de dicha vitamina en el recién nácido está directamente relacionado con el de

la vitamina D de la madre. Así, neonatos con madres deficientes en vitamina D,

tendrán comprometido el estatus de dicha vitamina. Los niveles séricos de 25‐

hidroxivitamina D en recién nácidos alimentados con leche materna no se

correlacionan con la concentración de vitamina D y sus metabolitos en la leche

humana, por lo que el aporte en estos lactantes se produce mediante síntesis

endógena después de la exposición a la luz solar o mediante suplementación. La

maduración de los mecanismos de absorción dependientes de vitamina D determina

en gran medida la capacidad del neonato para transportar de forma activa el calcio en

el tracto gastrointestinal para ser absorbido (Hsu y Levine, 2004).

5.2.3 Deficiencia y exceso de calcio en la infancia.

La hipocalcemia o bajos niveles de calcio, es un desorden común en el recién

nácido y ocurre cuando el calcio sérico total es menor de 1,75 mmol/L o la forma

ionizada menor que 1 mmol/L en recién nácidos prematuros, y 2 mmol/L o 1,2 mmol/L

respectivamente en recién nácidos a término (Jain et al., 2010). Los síntomas clínicos

de la hipocalcemia se relacionan principalmente con afecciones en el sistema cardiaco


53

y neuromuscular (Mckay, 2010). Dependiendo del momento de aparición de la

hipocalcemia tras el nacimiento se pueden distinguir dos tipos:

a). Una hipocalcemia temprana en el recién nácido que puede ser debida a diversos

factores como prematuridad, diabetes materna, asfixia perinatal e hiperparatiroidismo

materno (Jain et al., 2010).

b) La aparición de hipocalcemia tardía en el neonato es menos común que la

temprana y ocurre normalmente al final de la primera semana de nacimiento (Jain et

al., 2010). Una hiperfosfatemia y como consecuencia una hipocalcemia, están

asociadas a altas ingestas de fósforo, que suele ocurrir en lactantes alimentados con

fórmulas infantiles que contienen más fosforo que la leche materna. Las convulsiones

en el recién nácido son a menudo consecuencia de una hipocalcemia, sin embargo

semanas después se produce, en general, una espontánea recuperación de la

homeostasis mineral. También puede revertir la hipocalcemia suplementando con

calcio la alimentación del recién nácido en suficiente cantidad para lograr una

adecuada relación de calcio/fosforo (Hsu y Levine, 2004).

La deficiencia en vitamina D en recién nácidos también puede manifestarse como

hipocalcemia después de unos pocos días del nacimiento cuando la absorción

intestinal de calcio se produce por transporte activo dependiente de esta vitamina

(Hsu y Levine, 2004).

La hipercalcemia o exceso de calcio neonatal no es muy común pero, cuando

ocurre, la causa más frecuente suele ser un incremento en la movilización del calcio

esquelético. También se han descrito casos de hipercalcemia por una administración

excesiva del mismo a través de la dieta o suplementos. La hipercalcemia no es

fácilmente reconocible ya que los primeros síntomas son inespecíficos y pueden ser

confundidos con otros procesos comunes como anorexia, vómitos, estreñimiento, etc.,

lo que supone un gran problema cuando se produce ya que su dificultad en

reconocerla puede ocasionar daños mayores al recién nácido (Hsu y Levine, 2004).


54

5.3 Biodisponibilidad de hierro

La principal función del hierro es fijar de forma reversible el oxígeno para su

transporte o almacenamiento, así como aceptar y liberar electrones para generar

fuentes inmediatas de energía (Monteagudo y Ferrer, 2010). Además, este elemento

participa en múltiples procesos metabólicos, ya que se encuentra como componente

de enzimas y otros complejos moleculares. Dentro de sus funciones principales se

pueden mencionar: transporte de oxígeno a los tejidos a través de la hemoglobina,

síntesis de ADN al formar parte de la enzima ribonucleotido reductasa, y transporte de

electrones, por tener la capacidad de aceptarlos y donarlos (West y Oates, 2008). En el

sistema nervioso, el papel del hierro es muy importante ya que parece intervenir en la

síntesis, degradación y almacenamiento de neurotransmisores, serotonina, dopamina

y ácido gammaaminobutírico (GABA). La distribución del GABA y la dopamina en el

organismo coinciden aproximadamente con la de este metal, por lo que se ha sugerido

que debe existir alguna participación del hierro en las funciones dopaminérgicas y

gabaminérgicas (Suárez, Cimino y Bonilla 1985).

5.3.1 Absorción de hierro

La mayoría de los alimentos contienen dos formas diferentes de hierro: hierro

no hemo (o inorgánico) presente fundamentalmente en vegetales y hierro hemo que

forma parte de la hemoglobina y mioglobina de la carne (Zhang y Enns, 2009). Estas

dos formas de hierro se absorben mediante rutas diferentes y por lo tanto tienen una

eficiencia de absorción distinta. El hierro hemo es más soluble que el hierro no hemo y

además, la absorción de este último se ve afectada por otros factores,

fundamentalmente dietéticos como la presencia de proteínas, por lo que nuestro

organismo utiliza de manera más eficiente el hierro hemo (Haro et al., 2005). La única

fuente de alimento para los recién nácidos es la leche materna o la fórmula infantil, en

este sentido es importante destacar que la leche humana no contiene hierro hemo,

por lo que el hierro no hemo unido a las proteínas de la leche o a otras sustancias de

bajo peso molecular será la principal fuente de hierro para los lactantes (Collard,


55

2010). El hierro puede absorberse a lo largo del todo el intestino pero

fundamentalmente lo hace en el duodeno, cuya absorción se ve aumentada de 3 a 4

veces en caso de existir una deficiencia en el organismo.

Respecto a la absorción de hierro no hemo; la mayoría del hierro dietético se

encuentra en la forma férrica (Fe3+), pero antes de ser transportado debe ser reducido

en el lumen, concretamente en la parte apical del enterocito. La enzima responsable es

una hemoproteína asociada con los enterocitos de la membrana apical, denominada

Dcytb (Duodenal cytochrome b), la cual tiene actividad ferrireductasa parecida a la del

citocromo b (McKie et al., 2001). Ya en la forma ferrosa (Fe2+), será transportado al

enterocito por el transportador DMT‐1, que también puede transportar otros cationes

divalentes como el Cu2+ y Zn2+ (Collard, 2010). El hierro en el citosol del enterocito

puede ser almacenado como ferritina o exportado al plasma mediante la ferroportina,

y la hefastina que son proteínas transportadoras. Así el hierro pasará a formar parte de

la transferrina (Zhang y Enns, 2009). Este proceso de absorción de hierro descrito se

puede observar detalladamente en la Figura 8.

Figura 8. Absorción intestinal de hierro no hemo (adaptada de Collard, 2009)

Los factores que incrementan la absorción de hierro no hemo a nivel intestinal

son la vitamina C que cambia el estado de oxidación del hierro a una forma más

soluble, el pH ácido, un aumento en la eritropoyesis, la presencia de carne y de

pescado por su contenido proteico, los azúcares y los aminoácidos. Mientras que los

Fe3+

Fe2+

Fe3+

Fe2+

H+

H+

Na+

e‐

Ferritina

Fe2+

Ferroxidasa

Dcytb

Fe3+

TransferrinaLUMEN ENTEROCITO

PLASMA

DMT‐1

FPN


56

factores que disminuyen la absorción de hierro son los siguientes: hipoclorhidria, los

oxalatos, la fibra, el calcio, los fosfatos, los fitatos y los polifenoles (Zimmermann y

Hurrel, 2007).

La hipótesis de la captación de hierro hemo mediante un receptor mediado por

endocitosis fue propuesta en 1979 con el descubrimiento de una proteína que se unía

a esta forma de hierro en las microvellosidades del enterocito en el intestino delgado

de cerdos y humanos (Grasbeck et al., 1979). Una vez dentro, el hierro es

metabolizado y liberado en las vesículas como hierro no hemo, siendo entonces

transportado por el DMT‐1 al citoplasma. El hierro hemo, también puede ser

catabolizado a no hemo en el retículo endoplasmático. Otra vía de entrada del hierro

hemo al citoplasma del enterocito es mediante el transportador HCP1 (heme carrier

protein 1) y desde la membrana basolateral a la sangre lo llevará el transportador

FLVCR (West y Oates, 2008).

La hormona hepcidina es la principal reguladora de la absorción de hierro y de

su distribución a los tejidos. Esta hormona es sintetizada principalmente en los

hepatocitos aunque también se expresa en niveles bajos en otras células y órganos

como macrófagos, adipocitos y cerebro. La producción de hepcidina es regulada por

los niveles de hierro; de este modo cuando el hierro es abundante, la producción de

esta hormona es estimulada, limitando la absorción de hierro y la liberación de las

moléculas de almacén. El mecanismo de acción de esta molécula se basa en su unión a

la ferroportina, proteína situada en la membrana basal del enterocito y que regula la

salida de hierro desde el enterocito dependiendo del estatus de este mineral en el

organismo (Ganz y Nemeth, 2011).

5.3.2 Homeostasis de hierro en el recién nácido

El feto muestra avidez por el hierro y lo va acumulando progresivamente, sobre

todo en el tercer trimestre de embarazo, almacenando aproximadamente 250 mg de

hierro que será utilizado durante la lactancia ya que ésta sólo proporciona 0,15 mg/día

del hierro absorbido, siendo los requerimientos de 0,55 mg/día (Zimmermann y Hurrel,


57

2007). Por lo tanto, la leche materna no podrá satisfacer los requerimientos de hierro

del lactante, sin embargo las reservas del mineral que posee el recién nácido

proporcionan el hierro necesario durante los primeros meses de vida. Entre los 6 y 12

meses de vida, en lactantes alimentados con leche materna, más del 90% de los

requerimientos de hierro son satisfechos mediante la alimentación complementaria,

disminuyendo así el riesgo de desarrollar una deficiencia en hierro o incluso una

anemia ferropénica, que está asociada con efectos adversos en el desarrollo

neurológico (Domellöf, 2007). Los factores determinantes de las reservas de hierro en

el recién nácido son: madurez gestacional y estado nutricional, estado nutricional del

hierro de la madre, perdidas prenatales y pérdidas perinatales (Monteagudo y Ferrer,

2010).

Dube et al., (2010) realizaron un estudio retrospectivo, en el que se demostró la

hipótesis de que un niño alimentado con leche materna está protegido contra la

aparición de anemia deficiente en hierro durante los primeros meses de vida. Sin

embargo, también se observó que entre los niños que habían sido alimentados

exclusivamente con leche materna durante los 4 primeros meses de vida, un 21%

presentaron deficiencia en hierro y un 6% anemia deficiente hierro en la segunda

mitad de su infancia. Estos porcentajes fueron mayores a los encontrados en los

alimentados con fórmula infantil, por lo que estos autores remarcaron la necesidad de

incorporar la alimentación complementaria con fuentes de hierro de elevada

biodisponibilidad en edades tempranas (4‐6 meses).

5.3.3 Patologías asociadas al desequilibrio del hierro en la infancia

El hierro juega un papel importante en numerosos procesos bioquímicos y sus

requerimientos van a ser mayores en los periodos de rápido crecimiento y

diferenciación celular como son la última etapa de embarazo y el periodo neonatal.

Por esta razón, deficiencias durante estos periodos pueden provocar importantes

desórdenes en el desarrollo del niño (Collard, 2010).


58

Niveles inadecuados de hierro en los tejidos reducen la eritropoyesis y el

transporte de oxígeno. Además, el sistema nervioso parece ser susceptible a la

deficiencia y al exceso de hierro sobre todo, en etapas de rápido desarrollo como

puede ser en el recién nácido (Fredriksson, 2000). El mecanismo por el cual la

deficiencia en hierro tiene efectos negativos en el cerebro no ha sido completamente

dilucidado. Sin embargo, se cree que el exceso del mismo puede producir efectos

negativos al generar radicales libres mediante las reacciones Fenton y Heber‐Weiss. Se

ha comprobado también que el exceso de hierro también puede favorecer la

colonización bacteriana (Collard, 2010).

Según datos de la OMS se estima que un 24,8% de la población padece anemia,

y en su mayoría es de tipo ferropénico (De Benoist et al., 2008), siendo la prevalencia

de este tipo de anemia en lactantes de entre 2‐4,3%.

La deficiencia nutricional de hierro surge cuando los requerimientos fisiológicos

no pueden ser cubiertos mediante la absorción del hierro de la dieta, siendo el riesgo

de deficiencia mayor cuando los requerimientos de hierro son superiores al ingreso de

hierro al organismo. Esta situación ocurre en lactantes, niños, adolescentes y en

mujeres en edad reproductiva y embarazadas (Zimmermann y Hurrel, 2007).

El flujo cerebral del hierro es muy lento, por lo tanto, las deficiencias

producidas en etapas tempranas de la vida son muy difíciles de corregir y tienden a

persistir (Suárez, Cimino y Bonilla, 1985). Además, el hierro es imprescindible para la

mielinización de las neuronas (Guyton y Hall, 2006). También se ha relacionado la

presencia de este mineral con la actividad del hipocampo y ciertas áreas de la

memoria. De hecho muchas enfermedades degenerativas cerebrales como Parkinson o

la demencia, parecen tener su origen en alteraciones del metabolismo del hierro

(Friedman et al., 2006, Oakley et al., 2007).

Así mismo, se ha correlacionado la falta de hierro con la “pica”, trastorno de la

conducta alimentaria en el que se produce un consumo constante e inadecuado de

sustancias no nutritivas durante un período de al menos un mes. Aunque la causa de la


59

pica aún es desconocida, algunos estudios epidemiológicos y clínicos la relacionan con

una deficiencia en hierro y cinc. Se ha descrito pica y déficit de hierro en mujeres

embarazadas, niños y en personas con pérdidas sanguíneas digestivas entre otros. La

administración de hierro parece resolver este transtorno en muchos casos, incluso

antes de verse corregida la anemia (Viguria y Miján de la Torre, 2006).

5.4 Biodisponibilidad de cinc

El cinc es un elemento que forma parte de varias enzimas y metaloproteinas, y que

posee funciones de vital importancia como la participación en la reparación del ADN,

en el crecimiento celular y replicación, en la expresión génica, en el metabolismo

proteico y lipídico, en el sistema inmune y en la actividad hormonal (Haug, Høstmark y

Harstad, 2007). De hecho, este elemento es requerido por más de 300 enzimas que

participan en numerosos funciones metabólicas. Además más de 2000 factores de

transcripción que regulan la expresión génica necesitan cinc para mantener su

integridad estructural y unirse al ADN (Murakami y Hirano, 2008).

El contenido en cinc en el cuerpo de un humano adulto oscila entre 1,5 y 2,5 g. La

mayor proporción de cinc corporal se encuentra en el músculo esquelético (60%),

también hay una importante cantidad en el hueso (25‐30%), aunque en el recién

nácido a término puede llegar a un 40% (Olivares et al., 2010). La cantidad total de cinc

en el cuerpo que se reduce durante la depleción, no es la misma en todos los tejidos.

Por ejemplo, en el músculo esquelético, piel y corazón, se mantiene mientras que los

niveles de cinc disminuyen en hueso, hígado, testículos y plasma. Por el momento, no

se conocen bien las señales que permiten que se mantenga los niveles de cinc en unos

tejidos y que en otros se libere (IZINCG, 2004).

5.4.1 Absorción de cinc

La eficiencia de absorción de cinc en adultos oscila normalmente entre un 15 y

un 35% y depende de la cantidad ingerida de cinc y de la presencia de otros factores

dietéticos que puedan inhibir su absorción como el ácido fítico, ácido oxálico u otros


60

minerales (Hess et al., 2009). La homeostasis del cinc se mantiene mediante la

regulación de la absorción y la excreción. La absorción media de cinc en recién nácidos

a término se encuentra entre un 20 y un 60%, pero es mayor en los niños alimentados

de modo natural (50‐60%) que en los alimentados con fórmulas infantiles (Domellöf et

al., 2009).

La captación de cinc intestinal ocurre mediante dos mecanismos, uno saturable

en el que participa un transportador específico y otro no saturable que se realiza por

difusión (Wang y Zhou, 2010). El transporte activo es mayor que el pasivo cuando la

ingesta de cinc es baja o normal, mientras que el pasivo ocurrirá cuando la ingesta es

elevada (Hess et al., 2009).

El Transporte transcelular es un proceso saturable y muy eficiente tras un consumo

bajo de cinc y depende de receptores y proteínas intracelulares que lo transportan.

Recientemente, se han descubierto dos familias de transportadores de cinc, las

proteínas ZIP y las proteínas ZnT. La primera familia de proteínas (ZIP) transporta el

cinc desde el espacio extracelular al interior de la célula o de las organelas al

citoplasma celular, llamándose proteínas importadoras de cinc. Hasta ahora se sabe

que el genoma humano codifica 14 proteínas diferentes de la familia ZIP, siendo las

más importantes la ZIP‐4, que tiene un papel clave en el transporte de cinc al interior

de la célula, y la ZIP‐5 que se expresa en la membrana basolateral del enterocito,

donde, en determinadas situaciones (bajo condiciones de repleción), puede ser el

responsable del transporte de cinc desde la circulación al enterocito (Hess, et al.,

2009). ZIP‐4 y ZIP‐5 sufren endocitosis por la membrana plasmática en situaciones de

repleción y depleción de cinc respectivamente (Wang y Zhou, 2010)

La segunda familia (ZnT) consta de 9 transportadores que están involucrados

principalmente en la captación de cinc por las organelas de la célula, disminuyendo así

la concentración citoplasmática (Hess et al., 2009). Las metalotioneínas son proteínas

pequeñas ricas en cisteína que se unen al cinc y a otros iones metálicos, siendo

responsables de la regulación intracelular de la concentración de cinc y de la

detoxificación de metales pesados no esenciales. Cuando la concentración de cinc


61

alcanza un determinado umbral, se induce la activación de estas proteínas que

secuestran a los iones de cinc (Murakami y Hirano, 2008).

En la Figura 9 se muestran las tres fases del proceso de la absorción del cinc en el

enterocito mediante transporte activo. La primera consiste en la captación de cinc y su

introducción en la célula. La siguiente fase es el transporte en el interior de la célula.

La última etapa muestra la incorporación de cinc a la circulación sanguínea. La

asignación de los transportadores a cada organela está basada en estudios de co‐

localización en cultivos celulares. No obstante, todavía hay muchos aspectos que

definir en la absorción del cinc, la dirección del transporte y la exocitosis.

Figura 9. Transporte de cinc a través del enterocito mediante la ruta transcelular (adaptada de Wang y Zhou, 2010).

Aparato de Golgi

ZIP7ZnT5

ZnT6

ZnT7 ZnT2

Vesículas

ZnT5ZIP4

ZnT1

ZIP5

ZnT6

ZnT4

? Exocitosis

? Exocitosis


62

Se han descrito diversos factores que pueden afectar a la absorción de cinc y se

enumeran a continuación:

‐ Cantidad de cinc en la dieta: si el contenido en cinc es demasiado alto su

absorción se verá disminuida en relación a la cantidad ingerida. Este hecho, fue

demostrado por Sandström y Cederblad (1980) en un estudio in vivo, y se debe a la

absorción mayoritaria del cinc mediante un mecanismo saturable.

‐ La matriz en la que vaya disuelto el mineral también es importante. Se sabe que

se absorbe menor cantidad de cinc en la ingesta de un alimento sólido que en la

ingesta de un alimento con alto contenido en agua y en el que el cinc está solubilizado

(Lönerdal, 2000).

‐ Algunos antinutrientes presentes en la dieta como el ácido fítico pueden inhibir

de forma significativa la absorción de cinc. Este compuesto puede formar complejos

insolubles con diferentes minerales impidiendo su absorción (Hurrell et al., 1992). Este

factor no es importante para los lactantes menores de 4 meses ya que su alimentación

se basa únicamente en leche.

‐ Otro factor que puede inhibir la absorción de cinc es la cantidad de calcio

ingerida ya que diversos estudios in vitro han demostrado una correlación negativa en

la absorción de estos dos minerales (Frontela et al., 2009a).

‐ Cantidad y calidad proteica: la absorción se ve incrementada con el aumento de

la cantidad de proteína en la dieta (Sandström, 1992), aunque también hay que

destacar que los alimentos ricos en proteína son también una fuente de cinc por lo que

también se incrementa la ingesta de este mineral. Por otro lado, se ha observado que

la proteína animal contrarresta el efecto inhibidor del ácido fítico en la absorción de

este micronutriente, ya que favorece la solubilidad del cinc (Sandström y Cederblad,

1980). Lönerdal, (1984) en un estudio in vivo realizado en adultos, comparó dos

fórmulas infantiles que diferían en la relación caseína:lactosuero, concluyéndose que


63

se producía un aumento significativo en la absorción de cinc en la fórmula rica en

proteínas del lactosuero.

5.4.2 Homeostasis de cinc en el recién nácido

Los recién nácidos a término poseen importantes almacenes hepáticos de cinc,

no ocurre lo mismo en prematuros en los que esas reservas son bajas. Por esta razón,

la alimentación de los lactantes prematuros debe ser reforzada con cinc, incluso

cuando reciben leche materna. Sin embargo todavía se desconocen las consecuencias

fisiológicas y la duración óptima de la suplementación con cinc, lo que es motivo de

preocupación no solo por la deficiencia en cinc sino que también por los posibles

efectos tóxicos que podría producir un exceso de este mineral (Klein, 2002).

En adultos, la homeostasis de cinc se consigue principalmente a través de un

equilibrio entre la absorción intestinal y la excreción endógena. La absorción intestinal

de cinc en adultos esta inversamente relacionada con la cantidad ingerida de cinc. Por

el contrario, en recién nácidos se encontró una correlación positiva entre la absorción

de cinc y sus niveles en la dieta (Krebs et al., 2003). Todo esto sugiere que la regulación

de cinc en los lactantes no está tan estrechamente regulada como en adultos y la alta

capacidad de absorción de este mineral puede inducir toxicidad potencial, por lo que

los mecanismos que regulan la homeostasis de cinc dependen de la maduración

intestinal (Jou et al., 2010).

5.4.3 Deficiencia de cinc en la infancia

Los mecanismos para mantener el equilibrio corporal de cinc son muy eficientes,

pero se sabe que ingestas bajas, determinados estímulos fisiológicos o patológicos, o

defectos genéticos pueden alterar ese equilibrio y causar desórdenes en los tejidos

comprometiendo el sistema inmune y la función neuronal (Wang y Zhou, 2010).


64

La deficiencia de cinc después del parto puede deberse a diferentes factores que

incluyen, un aumento de las necesidades nutricionales de cinc, una ingesta

inadecuada, una absorción reducida, o un aumento de pérdidas de cinc endógeno

(Krebs et al., 2006).

La deficiencia en cinc es común en recién nácidos y niños de países en desarrollo, y

va a producir un retardo en el crecimiento, un incremento en el riesgo de infección y

un neurodesarrollo deficiente (Domellöf et al., 2009). En humanos, la acrodermatititis

enteropática es un desorden congénito debido a la mala absorción de cinc. Los

pacientes que sufren este desorden tienen los síntomas clásicos de deficiencia en cinc

incluyendo, dermatitis, diarrea, retardo en el crecimiento, disfunción inmune, y

ocasionalmente alteraciones neuronales. El gen que codifica el transportador ZIP4 ha

sido identificado como el responsable de esta enfermedad (Wang y Zhou, 2010).


65

6 EVOLUCIÓN DE LA MICROBIOTA INTESTINAL EN LACTANTES

Existen aproximadamente 1000 especies diferentes de bacterias autóctonas

presentes en el intestino grueso de un individuo adulto, lo que supone 1014 ufc/g heces

(Dethlefsen et al., 2006). En la Tabla 5 se presenta un resumen de algunos de los

grupos principales que habitan el intestino de adultos, así como sus productos de

fermentación.

Tabla 5: Bacterias anaerobias predominantes en el intestino grueso y sus productos de la fermentación (Salminen et al., 1998).

En general, las bacterias intestinales se pueden clasificar según ejerzan efecto

beneficioso o perjudicial sobre la salud del hospedador (Gibson y Roberfroid, 1995).

Así decimos entonces que E. coli y algunas especies de Clostridios son patógenos

potenciales pudiendo provocar diarrea y desórdenes gastrointestinales en el

hospedador. La mayoría de bacterias del colon son anaerobias obligadas y la energía la

obtienen de los procesos de fermentación. Los principales sustratos utilizados en estos

procesos de fermentación, son los carbohidratos y las proteínas que no se digieren en

Log10ufc/g Productos de fermentación

Bacteroides 11,3 (9,2‐13,5) Acetato, Propionato, Succinato

Eubacteria 10,7 (5‐13,3) Acetato, Butirato, Lactato

Bifidobacteria 10,2 (4,9‐13,4) Acetato, Lactato, Formato, Etanol

Clostridia 9,8 (3,3‐13,1) Acetato, Propionato, Butirato, Lactato, Etanol

Lactobacillus 9,6 (3,6‐12,5) Lactato

Fusobacteria 8,4 (5,1‐11,0) Butirato, Acetato, Lactato

Ruminococci 10,2 (4,6‐12,8) Acetato

Peptostreptococci 10,1 (3,8‐12,6) Acetato, Lactato

Peptococci 10,0 (5,1‐12,9) Acetato, Butirato, Lactato

Propionibacteria 9,4 (4,3‐12,00) Acetato, Propionato

Actinomyces 9,2 (5,7‐11,1) Acetato, Lactato, Succinato

Streptococci 8,9 (3,9‐12,9) Lactato, Acetato

Escherichia 8,6 (3,9‐12,3) Mezcla ácidos orgánicos

Desulfovibrios 8,4 (5,2‐10,9) Acetato

Methanobrevibacter 8,8 (7,0‐10,5) Metano


66

el intestino delgado y llegan intactos al colon. En el colon proximal encontramos un

ambiente sacarolítico y es ahí donde los carbohidratos son fermentados, el digerido se

va trasladando en dirección al colon distal donde disminuye la disponibilidad de

hidratos de carbono mientras que predomina la de proteínas y aminoácidos que sirven

como fuente de energía para las bacterias de esta región (Macfarlane, Gibson y

Cummings, 1992).

Aunque el principal sustrato para el crecimiento bacteriano son los carbohidratos,

algunos de ellos son preferiblemente fermentados por Bifidobacterias (FOS: fructo‐

oligosacáridos, GOS: galacto‐oligosacáridos y lactulosa) y otros por toda la flora

colónica (almidones resistentes). Los principales productos de la fermentación de estos

sustratos son los ácidos grasos de cadena corta (acetato, propionato y butirato) y otros

metabolitos como lactato, piruvato, etanol, succinato y gases (H2, CO2, CH4 y H2S)

(Levitt et al., 1995). Las proteínas y aminoácidos son también fermentables por la flora

del colon, siendo las principales especies proteolíticas Bacteroides y Clostridios

(Macfarlane y Macfarlane, 1997). La fermentación de proteínas va a producir ácidos

grasos de cadena corta pero diferentes a los producidos en la fermentación de

hidratos de carbono, predominando isobutirato, isovalerato y otros compuestos

nitrogenados, algunos de los cuales pueden ser tóxicos (amonio, aminas y compuestos

fenólicos) (Macfarlane y Macfarlane, 1995). Una excesiva fermentación proteica en el

colon distal se ha relacionado con determinados tipos de cáncer como el de colon.

Actualmente se sabe que la actividad bacteriana en el colon está directamente

relacionada con la aparición de determinadas enfermedades.

El estudio de la composición de la microbiota intestinal en heces, tanto cuantitativa

como cualitativamente, ha sido frecuentemente llevado a cabo mediante técnicas

dependientes de cultivo (Gueimonde y de los Reyes‐Gavilán, 2009). Sin embargo,

muchas bacterias son difíciles de cultivar e incluso algunas pueden no ser cultivables,

además, los medios de cultivo a menudo no son verdaderamente específicos o

selectivos para determinadas bacterias, y es imposible estudiar y comparar

ecosistemas completos mediante técnicas dependientes de cultivo. Actualmente ya

existen herramientas moleculares para el estudio de la microbiota intestinal


67

(Bezirtzoglou et al., 2011). Entre estas técnicas destacamos la PCR en tiempo real

cuantitativa ya que es un método exacto, sensible y especifico que cada vez se utiliza

más para el estudio de las diferentes poblaciones bacterianas que habitan en el

intestino (Chen, Cai y Feng, 2007)

6.1 Importancia de la microbiota intestinal en la salud del hospedador.

La composición de la microbiota normal juega un papel importante en la salud del

hospedador ya que está involucrada en la nutrición, patogénesis e inmunología del

mismo (Bezirtzoglou et al., 2011). La presencia de bacterias en el intestino, tiene una

gran influencia en la expresión génica en las células de la mucosa. Así, se ha visto que

la colonización de ratones libres de gérmenes por Bacteroides thetaiotamicron, que es

un microorganismo común en la microbiota intestinal, induce la expresión de genes

implicados tanto en la defensa del organismo y la regulación de la función intestinal de

barrera como en la vascularización del epitelio y la digestión/absorción de nutrientes

(Hooper y Macpherson, 2010).

Los estudios de colonización intestinal controlada han identificado tres funciones

principales de la microbiota intestinal (Guarner, 2011):

‐ Función de nutrición y metabolismo: es el resultado de la actividad bioquímica

de la microbiota e incluye entre otros procesos recuperación de energía en

forma de ácidos grasos de cadena corta (AGCC), producción de vitaminas y

efectos favorables sobre la absorción del calcio y el hierro.

‐ Función de protección: previene la invasión de agentes infecciosos o el

sobrecrecimiento de especies bacterias potencialmente patógenas.

‐ Funciones tróficas: la microbiota intestinal está involucrada en la proliferación y

diferenciación del epitelio intestinal y sobre el desarrollo y modulación del

sistema inmune.

La causa de diversos desórdenes no intestinales que incluyen, alergias, asma,

diabetes, obesidad, cáncer y alguna neuropatía, han sido asociados con cambios en la

composición de la microbiota intestinal (Gill y Finlay, 2011).


68

6.1.1 Sistema inmune

El tracto gastro‐intestinal es el primer lugar de interacción entre el sistema

inmune del hospedador y microorganismos tanto simbióticos como patógenos. En

todos los mamíferos, inmediatamente después del nacimiento comienza el proceso de

colonización por microorganismos del medio ambiente circundante (Round y

Mazmanian, 2009). La asociación de tejido linfoide al intestino nos protege de las

bacterias intestinales, lo que comprende nódulos linfoides mesentéricos, placas de

Peyer, folículos linfoides aislados en el intestino delgado, células inmunes en la lámina

propia de la mucosa y linfocitos intraepiteliales (Figura 10).

Figura 10: Esquema del tejido linfoide asociado al intestino

(Adlerberth y Wold, 2009).

El tracto gastro‐intestinal de un humano adulto comprende un complejo

ecosistema bacteriano, en el que las bacterias simbióticas aportan diversos beneficios

al hospedador. Sin embargo, la microbiota normal de un individuo también incluye

Lumen intestinal

Placas de Peyer

linfocito Tlinfocito B

Nódulo linfoide mesentérico

célula de Paneth

célula de plasmamacrófago

célula dendrítica

vellosidad

mucusbacteria

células MLamina propialinfocito

Linfocitointraepitelial

Cripta

Centro germinal


69

microorganismos que producen inflamación bajo determinadas condiciones. Por lo

tanto, la microbiota posee la capacidad de producir respuesta anti‐inflamatoria pero

también inflamatoria estando la composición de las poblaciones bacterianas

intestinales íntimamente relacionada con el funcionamiento del sistema inmune

(Round y Mazmanian, 2009).

Varios estudios de colonización selectiva, realizados en laboratorio con

animales libres de gérmenes, observaron que la microbiota intestinal podía ejercer

diferentes efectos sobre el sistema inmune del hospedador. Estos animales mostraron

defectos en el tejido linfoide asociado al intestino y en la producción de anticuerpos,

además, sus placas de Peyer y nódulos linfoides mesentéricos fueron menores en

número y más pequeños comparando con animales colonizados (Round y Mazmanian,

2009).

Los antibióticos y la dieta están asociados con el desarrollo de alergias y asma,

pero también son factores que influyen en la composición de la microbiota intestinal.

Hasta ahora la evidencia de que la microbiota intestinal influía en las alergias, se

basaba en estudios epidemiológicos. Numerosos estudios indican que la microbiota

intestinal es diferente en individuos atópicos en relación a los no atópicos (Bjorksten et

al., 2001). Se ha observado también que niños alérgicos procedentes de dos países

diferentes, uno con baja incidencia de alergias (Estonia) y otro con alta incidencia

(Suecia) poseen composiciones similares de microbiota intestinal (Bjorksten et al.,

1999). Los niños alérgicos tienen mayores niveles de microrganismos aerobios y

menores de anaerobios y anaerobios facultativos, especialmente del genero

Lactobacillus.

6.1.2 Protección contra patógenos

Los microorganismos del tracto gastrointestinal constituyen una barrera

ocupando un espacio o nicho ecológico, de forma que no lo pueda ocupar un

microorganismo extraño. Además un equilibrio en la composición de la microbiota

intestinal asegura que bacterias oportunistas, presentes en el intestino, no proliferaren


70

causando enfermedad. Además, la función de barrera se debe también a la capacidad

de algunas bacterias para producir sustancias antimicrobianas que inhiben la

proliferación de otras y por la competición por los nutrientes (Lievin et al., 2000).

6.1.3 Obesidad

La actividad metabólica de la microbiota intestinal facilita la extracción de

calorías de los alimentos ingeridos, ayudando a almacenar dicha energía en el tejido

adiposo del hospedador para su posterior utilización, y proporcionando, al mismo

tiempo, combustible y nutrientes necesarios para el crecimiento y proliferación

microbiano. Además, parece ser que la microbiota de una persona posee una

eficiencia metabólica específica y que ciertas características de su composición podrían

predisponer a la obesidad (Backhed et al., 2005).

Estudios recientes como el llevado a cabo por Ley, (2006) sugieren que existen

diferencias en la composición de la microbiota intestinal entre ratones obesos y con

normopeso. En este sentido un estudio realizado en niños, reveló que los niveles de

Bifidobacterias eran superiores en los niños con peso normal respecto a los niños con

sobrepeso u obesidad (Kalliomäki et al., 2008).

6.1.4 Producción de metabolitos

Las interacciones mutualistas entre la microbiota entérica y el hospedador son

esenciales para el mantenimiento de la salud. Los microorganismos presentes en el

intestino pueden secretar moléculas que inhiben a patógenos y pueden producir

sustancias bioactivas como el ácido linoleico conjugado (CLA), ácidos grasos de cadena

corta (AGCC) y ácido γ‐aminobutírico (GABA) que pueden jugar un papel de protección

contra enfermedades causadas por el estilo de vida (cáncer, obesidad, y enfermedad

cardiovascular). La microbiota intestinal también interviene en rutas bioquímicas que

el ser humano no es capaz de llevar a cabo como son, la fermentación de polisacáridos

no digeribles, el metabolismo de proteínas complejas y la síntesis de determinadas

vitaminas. Además, la colonización bacteriana del intestino y la interacción entre las


71

diferentes poblaciones de microorganismos, juegan un importante papel en la

maduración del sistema inmune en los primeros días de vida del niño (Marques et al.,

2010).

El CLA es una mezcla de isómeros conjugados del ácido graso esencial ”linoleico”, y

es producido por los siguientes grupos bacterianos: Lactobacillus, Propionibacterium,

Bifidobacterium, Pediococcus, Enterococcus y Lactococcus (Ross et al., 2010). Este

compuesto ha demostrado tener propiedades anticarcinogénicas, anti‐inflamatorias e

inmunomoduladoras (Bhattaacharya et al., 2006)

Los AGCC (ácidos grasos de cadena corta) son los productos finales de la

fermentación bacteriana de diferentes sustratos en el intestino, principalmente

hidratos de carbono pero también proteínas. Éstos son rápidamente absorbidos en el

colon, rescatando una energía que podía haber sido perdida en la excreción a través de

las heces. Los AGCC poseen un papel importante en la estimulación de la absorción de

agua y sodio, previenen la diarrea disminuyendo el pH luminal que evita el crecimiento

y proliferación de bacterias potencialmente patógenas y protege contra la

carcinogénesis en el colon disminuyendo la biodisponibilidad de aminas toxicas (Knol

et al., 2005; Puccio et al., 2007). Este descenso de pH también ha sido relacionado con

una mayor absorción mineral (Weaver et al., 2011). Un estudio reciente ha

demostrado que estos ácidos se pueden unir a un receptor (GPR43) y su interacción

influye en el sistema inmune y la respuesta inflamatoria (Maslowski et al., 2009).

Además, el ácido butírico es la principal fuente de energía de los colonocitos (Marques

et al., 2010). Por otro lado el patrón de AGCC refleja una determinada actividad

metabólica en el colon, por lo que cambios en dicho patrón a menudo indican cambios

en la composición de la microbiota intestinal (Knol et al., 2005).

El ácido γ‐aminobutírico es un aminoácido no proteico que actua como neuro

transmisor en el sistema nervioso central y ejerce varias funciones como inducción de

hipotensión y diuresis (Komatsuzaki et al., 2008). Es producido principalmente por

Lactobacillus (Forsythe et al., 2010) y ha sido utilizado en el desarrollo de productos


72

funcionales como carne fermentada, queso (Komatsuzaki et al., 2008) y yogurt (Park y

Oh, 2007).

Además la microbiota intestinal ha sido reconocida como fuente de vitaminas que

no pueden ser sintetizadas por mamíferos y deben ser obtenidas mediante la

absorción intestinal. Entre las vitaminas producidas por las bacterias comensales que

componen la microbiota intestinal se encuentran la vitamina K y la mayoría de

vitaminas hidrosolubles del grupo B, incluyendo la biotina, el ácido nicotínico, los

folatos, la riboflavina, la tiamina, la piridoxina, el ácido pantoteico y la cobalamina

(Rossi, Amaretti y Raimondi, 2011). La vitamina K2 (menaquinona), es importante para

el hueso y la salud vascular (Greer, 2010). La vitamina B12 (cobalamina), es importante

en la vida fetal y la infancia durante el rápido crecimiento que se produce y en el

desarrollo del sistema nervioso (Hay et al., 2008). La vitamina B9 (ácido fólico) que

interviene en numerosas rutas metabólicas, su deficiencia se ha relacionado con

determinados tipos de cáncer y es esencial en el desarrollo fetal (Rossi, Amaretti y

Raimondi, 2011).

6.2 Colonización de la microbiota intestinal en el neonato

La composición y cantidad de grupos microbianos a lo largo del tracto

gastrointestinal es diferente en cada región del intestino debido a las características

fisicoquímicas de cada una de ellas (Macfarlane et al., 1997). La colonización está

influenciada en primer lugar por el pH luminal y por el lento tránsito del alimento hacia

el colon. El movimiento del digerido a través del estómago y el intestino delgado en el

niño es rápido (4‐6 h) cuando lo comparamos con el tránsito colónico en adultos (48‐

70 h) (Macfarlane y Gibson, 1994). En la boca, donde el pH es alcalino, encontramos

que el número de células es de aproximadamente 108 cels/ml, este valor va ir

disminuyendo en el estómago y duodeno debido al pH ácido y comienza a aumentar

de nuevo en el íleon para llegar a 1012 células/ml en el colon (Macfarlane y McBain,

1999).


73

Hasta hace poco, se creía que el feto se desarrollaba en un ambiente estéril en el

útero, y con la rotura de membranas en la iniciación del nacimiento comenzaba la

exposición a un ambiente nuevo colonizado por microorganismos (Tiihonen et al.,

2010). Sin embargo la colonización bacteriana del intestino humano es un complejo

proceso que parece comenzar a pequeña escala durante el periodo fetal (Jiménez et

al., 2008b, Martín, et al., 2012). En el momento del nacimiento ocurre la colonización

más importante microbiana del tracto gastrointestinal. Las superficies mucosas

estériles (digestivas, urogenitales, naso‐bucal y respiratorias) constituyen una serie de

nichos ecológicos que favorecen el establecimiento de las diferentes poblaciones

microbianas. La microbiota materna es normalmente la que comienza a colonizar, pero

recientemente, se han detectado microorganismos en el líquido amniótico, placenta y

cordón umbilical (Pettker et al., 2007), lo que sugiere que estas bacterias también

pueden formar parte de la primera colonización del tracto gastro‐intestinal del recién

nácido (Wall et al., 2009). En ausencia de los sofisticados mecanismos del adulto, el

tracto digestivo del recién nácido es un ambiente especialmente permisivo para la

colonización microbiana, alcanzando niveles de 1011 ufc/g de heces de un modo rápido

(Dore y Corthier, 2010).

Las bacterias anaerobias facultativas van a ser las primeras en habitar el tracto

gastrointestinal, mientras que las bacterias anaerobias estrictas no colonizan de un

modo inmediato el intestino debido a la presencia de oxígeno. Más concretamente

podemos decir que especies pertenecientes a las familias Enterobacteriaceae

(Escherichia coli) y Enterococcaceae (Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium) son

las primeras bacterias en colonizar el intestino de neonatos (Adlerberth y Wold, 2009).

Los niveles poblacionales de estas bacterias en niños recién nácidos podrían ser de

1010 ufc/g de heces, sin embargo en adultos se encuentran en menor concentración,

106‐108 ufc/g de heces. Mientras que otras bacterias pertenecientes a los géneros

Klebsiella y Enterobacter (familia Enterobacteriaceae) son comunes en la microbiota

intestinal de los lactantes pero no en la de adultos. Otras bacterias facultativas que

frecuentemente colonizan el intestino durante la primera etapa de la vida, son los

Estafilococos coagulasa negativos, mientras que la colonización por Staphylococcus

aureus es rara (Adlerberth y Wold, 2009).+


74

La colonización por levaduras en recién nácidos ha sido poco estudiada. Adlerberth

y Wold, (2009) observaron en un estudio, que durante la primera semana de vida

ningún niño era colonizado por levaduras, mientras que menos de un 15% lo era el

primer mes, llegando a un porcentaje de colonización del 50% a los cuatro meses. Los

niveles de levaduras en los niños de esta edad oscilan entre 103 y 105 ufc/ g de heces.

Los microorganismos anaerobios facultativos consumen el oxígeno, reduciendo el

ambiente, que en poco tiempo será colonizable por anaerobios estrictos. Es en este

momento cuando los géneros Bifidobacterium, Bacteroides y Clostridium spp.

comienzan a colonizar el intestino de los lactantes durante la primera semana de vida.

Estudios basados en técnicas moleculares, corroboran la dominancia de estos tres

géneros y la gran variabilidad que existe entre individuos durante los primeros meses

de vida lo que puede explicarse por la continua exposición y recolonización de

bacterias ambientales (Reinhardt et al., 2009).

La colonización intestinal de Lactobacilos en recién nácidos ha sido un aspecto

controvertido ya que los resultados obtenidos en diversas investigaciones conducen a

conclusiones diferentes. La mayoría de estudios han mostrado bajos porcentajes de

colonización de Lactobacilos en lactantes de países occidentales, mientras que otros

estudios observaron altos niveles (107‐9 ufc/g heces) de este género microbiano. Lo

que ha sido demostrado en numerosos estudios es que el nivel de Bifidobacterias es

superior al de Lactobacilos (Chen, Cai y Feng, 2007).

Con el tiempo un gran número de especies anaerobias se establecen en el intestino

del neonato, y comienzan a expandirse y a competir con las bacterias anaerobias

facultativas que disminuyen su población respecto a los anaerobios estrictos hasta la

proporción 100‐1000:1 en el individuo adulto (Adlerberth y Wold, 2009).

En el nacimiento, como hemos dicho anteriormente, comienza la colonización del

intestino del niño cuya microbiota no es estable, sin embargo es aproximadamente a

los dos años cuando su microbiota será compleja y más estable, lo que impidedirá la


75

colonización por ciertas bacterias. A esta edad se introducen los alimentos sólidos y la

microbiota es más parecida a la de un adulto (Marqués et al., 2010).

6.3 Factores que intervienen en la colonización

Son muchos los factores que influyen en la colonización microbiana del tracto

gastrointestinal de los recién nácidos. A continuación se describen algunos de ellos:

6.3.1 Tipo de parto (vaginal o cesárea)

La primera y principal fuente de bacterias que comienzan a colonizar el tracto

gastrointestinal de los niños nácidos mediante parto vaginal es la de la madre, la

microbiota de su tracto gastrointestinal, de la vagina y de la piel. Otra fuente

importante es el ambiente que rodea al parto. Los niños nácidos por cesárea no son

inmediatamente expuestos a la microbiota de madre y sí lo son al ambiente

hospitalario (Buddington y Sangild, 2011). Un parto por cesárea está asociado a un

prolongado retraso de la colonización de Bifidobacterium, Escherichia coli y

Bacteroides y a una colonización oportunista de las bacterias potencialmente

patógenas (Clostridium difficile) (Adlerberth y Wold, 2009; Marques et al., 2010).

Por lo tanto se considera demostrada la influencia del tipo de parto en el patrón

de la colonización microbiana intestinal. La relación entre microorganismos anaerobios

y anaerobios facultativos resulta ser menor en niños nácidos por cesárea que por parto

vaginal en un estudio realizado por Adlerberth et al., (2007). Además, Huurre et al.,

(2008) demostraron que el tipo de parto influía no sólo en la colonización intestinal

sino que ejercía un gran efecto sobre la función inmune del recién nácido.

6.3.2 Administración de antibióticos

Los recién nácidos que por diversos motivos (enfermedades, bajo peso,

prematuridad…) deben permanecer en el hospital, presentan cambios notables en la

colonización bacteriana intestinal y en parte es debido a la administración de


76

sustancias antimicrobianas. Éstos compuesos también pueden ser administrados a los

niños que se encuentran ya en sus casas pero afectados por diversas infecciones.

El uso de antibióticos en el recién nácido o en la madre, altera el equilibrio de la

flora intestinal de forma negativa, induciendo un descenso en las poblaciones de

anaerobios estrictos. Su microbiota intestinal estará entonces dominada por

Estafilococos coagulasa negativa, Enterococos y Enterobacterias, además de levaduras

debido a que esas bacterias pueden ser seleccionadas por su resistencia a compuestos

microbianos de amplio espectro (Adlerberth y Wold 2009). Sin embargo, el efecto

observado difiere entre antibióticos y normalmente la mayoría de familias y géneros

microbianos intestinales volverán a sus niveles tras unas semanas de exposición a los

agentes antimicrobianos (Marques et al., 2010).

En un estudio reciente, llevado a cabo por Savino et al., (2010) en el que

compararon la microbiota intestinal de lactantes alimentados exclusivamente con

leche materna antes y después de ser sometidos a tratamientos antibióticos durante

cinco días, observaron que la composición de la microbiota se modificaba

significativamente. La antibioterapia produjo un descenso en Enterobacteriaceae,

Enterococci, Lactobacilli y bacterias totales.

6.3.3 Tiempo de gestación

La flora de niños nácidos de forma prematura es diferente a la de los que llegan al

término del embarazo. Esto es debido a la inmadurez del intestino del recién nácido, al

largo tiempo en la unidad de cuidados intensivos del hospital y al uso de antibióticos

de amplio espectro (Marques et al., 2010). Arboleya et al., (2012) en un estudio

comparativo entre recién nación prematuros y a término, observaron un incremento

en los microorganismos anaerobios facultativos (Enterobacteriaceae, Enterococcaceae

y en el grupo Lactobacillus) y un descenso en anaerobios.


77

6.3.4 Condiciones sanitarias que rodean el momento del parto y la estancia en el

hospital.

Los niños que nacen bajo condiciones sanitarias deficientes y/o de hacinamiento

en países en desarrollo son colonizados antes por E. coli y otras Enterobacterias,

Enterococos y Lactobacilos que los niños nácidos en la sociedad occidental (Adlerberth

y Wold 2009). Actualmente, las condiciones de higiene durante el parto son más

estrictas, se ha reducido la exposición bacteriana que ha provocado cambios en el

patrón de colonización siendo el género Staphylococccus el primero en colonizar, en

lugar de la familia Enterobacteriaceae (Marques et al., 2010).

6.3.5 Estructura y ambiente familiar

Son varios los estudios que relacionan el ambiente familiar en el que nace el niño

con la composición de la microbiota. En un estudio llevado a cabo por Penders et al.,

(2006) demostraron que los niños con hermanos mayores tuvieron menores recuentos

de bacterias totales, y además, estos niños presentaron mayores proporciones de

Bifidobacterias. En este estudio, no pudieron confirmar un efecto en la microbiota

intestinal por la presencia de mascotas en casa.

Adlerberth et al., (2007) también evaluaron la influencia de tener hermanos

mayores en la composición de la microbiota intestinal, y observaron que los niños que

no tenían hermanos presentaban mayores recuentos de Enterobacterias diferentes de

E. coli y Clostridios y una menor relación de anaerobios/bacterias facultativas. Este

hecho sugiere que los niños sin hermanos tenían un patrón de colonización menos

maduro, mostrando una cierta semejanza con los niños nácidos por cesárea. Estos

autores tampoco encontraron relación entre la posesión de mascotas en casa y

diferencias en la microbiota intestinal.


78

6.3.6 Diferencias geográficas

Recientemente en un estudio comparó la microbiota intestinal de niños nácidos en

diferentes países europeos pero con características similares, encontrándose

diferencias en la composición de la microbiota. Los niños nácidos en países del norte

de Europa presentaron mayores niveles de Bifidobacterias (Fallani, et al., 2010).

6.3.7 Alimentación

Tradicionalmente se ha considerado que la microbiota intestinal de los lactantes

alimentados con leche humana estaba dominada por Bifidobacterias y en menor

cantidad por Lactobacilos, Estreptococos, Estafilococos, Enterococos y Enterobacterias.

No ocurría lo mismo con la microbiota intestinal de niños alimentados con fórmulas

infantiles, su microbiota era más diversa e incluía bacterias de los grupos Bacteroides,

Clostridium y Enterobacteriaceae (Penders et al., 2006). Sin embargo, actualmente,

que los lactantes alimentados con leche materna tengan niveles más altos de

Bifidobacterias es objeto de controversia, ya que algunos estudios no han encontrado

diferencias entre los dos tipos de alimentación (Palmer et al., 2007; Adlerberth y Wold

2009).

En el estudio llevado a cabo por Penders et al., (2006) en el que se evaluaron

posibles factores que influyen en la composición de la microbiota intestinal, la

alimentación del niño resultó ser el más importante. La leche humana es una fuente

importante de bacterias comensales, mutualistas o probióticas para el intestino del

niño. La leche de cada madre tiene una composición bacteriana única como ocurre con

la flora intestinal de niños y adultos. Entre las bacterias predominantes destacan

diversas especies de los géneros estafilococcos, estreptococos y bacterias lácticas.

Estas bacterias pueden desempeñar un papel importante en la prevención de algunas

enfermedades y en la maduración del sistema inmune (Rodríguez et al., 2008). Se

estima que el lactante ingiere 800 ml de leche al día y con ella 105 y 10 7 bacterias

(Hekkilä y Saris, 2003; Martín et al., 2003)


79

6.4 Perspectivas futuras en la modificación de la microbiota intestinal

En apartados anteriores de la presente tesis doctoral se han descrito las funciones

de la microbiota intestinal, comprendiendo su importancia en la defensa contra

microorganismos, en el sistema inmune, en la obesidad y en procesos alérgicos e

incluso en la prevención de algunos tipos de cáncer. Mantener un balance adecuado

de las poblaciones presentes en la microbiota intestinal confiere numerosos beneficios

al hospedador, por lo que varios estudios han centrado sus objetivos en la

investigación de estrategias para modificar la microbiota intestinal hasta conseguir un

equilibrio entre poblaciones. Probióticos y prebióticos son utilizados en diferentes

estudios como suplemento en fórmulas infantiles habiendo comprobado su eficacia

sobre la composición de la microbiota al estimular el crecimiento de Bifidobacterias.

(Marques et al., 2010).

Los prebióticos son ingredientes no digeribles y fermentables por las bacterias

colónicas que pueden afectar al hospedador por estimulación selectiva del crecimiento

de determinadas bacterias mejorando así la salud del hospedador (Gibson y

Roberfroid, 1995). Por otra parte, los probióticos son microorganismos vivos que,

ingeridos en cantidad adecuada, ejercen efectos beneficiosos para la salud más allá de

sus propiedades puramente nutricionales (WHO, 2002).

Son numerosos los estudios que demuestran los efectos beneficiosos de los

prebióticos y probióticos, sin embargo una publicación reciente de la sociedad Europea

de Pediatría, Gastroenterología, Hepatología y Nutrición (ESPGHAN) (2011) concluye

con que los datos científicos disponibles sugieren que la suplementación de fórmulas

infantiles con probióticos y/o probióticos evaluados en lactantes sanos no alcanzan los

parámetros exigidos en seguridad respecto al crecimiento y efectos adversos. La

seguridad y los efectos clínicos de un producto no deben ser extrapolados a otro

producto. En este momento se disponen de pocos datos para recomendar el uso

rutinario de probióticos y/o prebióticos en fórmulas infantiles, por lo que el Comité de

dicha asociación consideró que este es todavía un amplio campo de investigación. Es

necesario plantear nuevos ensayos cuidadosamente diseñados, con adecuados


80

criterios de inclusión y exclusión y suficiente tamaño de muestra. En estos estudios se

deberá definir la dosis óptima del producto, el tiempo de administración y deberán

proporcionar también información sobre los efectos a largo plazo sobre el organismo

(ESPGHAN, 2011).

IV. Matrial y Métodos

81

V. MATERIAL Y MÉTODOS

1. Diseño experimental

Para alcanzar los objetivos planteados en la presente tesis, el trabajo experimental se

desarrolló en cuatro estudios, que se presentan en las Figuras 11 y 12.

En el estudio I se evaluó la disponibilidad mineral in vitro de las fórmulas infantiles

mediante el empleo de la línea celular Caco‐2. En primer lugar, se realizó un ensayo con

distintas concentraciones de soluciones patrón de hierro calcio y cinc y los diferentes

ingredientes de estudio (suero lácteo rico en lactoalbúmina y un preparado de nucleótidos) a

fin de evaluar su efecto sobre la absorción mineral. En un segundo ensayo, se evaluó la

absorción mineral de una fórmula infantil estándar (FC) y otra enriquecida con ingredientes

funcionales (FS), previa simulación de una digestión gastrointestinal adaptada para niños

menores de 6 meses.

En el estudio II se evaluó la capacidad prebiótica de los diferentes ingredientes

objeto de estudio. En un primer ensayo, se realizaron las curvas de crecimiento de diferentes

bacterias a las que se les suplementó el medio de cultivo con los ingredientes a estudiar. En

el segundo ensayo, se estudió la evolución de la microbiota de un inóculo fecal expuesto a

los ingredientes digeridos y sin digerir y a las fórmulas infantiles o leche materna igualmente

sometidas o no a una digestión previa. Se realizó el análisis de la microbiota fecal mediante

PCR a tiempo real así como el análisis de los ácidos grasos de cadena corta producidos.

El objetivo del estudio III fue evaluar posibles diferencias en la composición de la

microbiota intestinal debidas al lugar de nacimiento de los individuos del estudio. Éste

consistió en un ensayo comparativo de la microbiota intestinal de lactantes procedentes de

dos regiones diferentes de España, Asturias y Murcia. Los individuos de los dos grupos

comparados cumplieron los mismos criterios de inclusión (leche materna, parto vaginal, no

administración de antibióticos). Se realizaron tres muestreos para el análisis de la

composición microbiota de la fecal mediante PCR a tiempo real.

IV. Material y Métodos

82

Por último en el estudio IV se investigó, in vivo la evolución de 9 grupos microbianos

en heces de lactantes alimentados con leche materna (LM), fórmula estándar (FC) y fórmula

enriquecida con los ingredientes funcionales (FS). Se realizaron 4 muestreos; a las 2, 4, 7‐8 y

12 semanas de edad de los lactantes. El análisis de la microbiota se realizó mediante PCR a

tiempo real en una estancia realizada en el Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA‐

CSIC).

Figura 11. Diseño experimental de los estudios in vitro I y II.

Biodisponibilidadmineral in vitro. Captación, transporte y retención de calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2.

Línea celular Caco‐2

Análisis mineral (espectrofotometría de

absorción atómica, EAA)

FeCaZn

Actividad funcional de las fórmulas infantiles y de sus ingredientes

Estudio I

Estudio II

Ensayo 2: Evolución microbiota fecal

Ensayo 1: Curvas de crecimiento

Medio de cultivo base+

Ingredientes Fórmulas inicio

0, 6, 12, 24 ,36, 48 y 72 h

Estándar (FC)Suplementada (FS)Leche materna (LM)

Suero lácteo (SLα)Nucleótidos

Muestreo cada 2 horas durante 14 h

Inóculo cultivo puro

pH

ufc/ml

DO600

MRS/ BHI+

Sueros lácteos (SLα y SLβ)/nucleótidos

pH

Poblaciones microbianas

Ácidos grasos de cadena corta

Inóculo fecal

Ensayo 1: Ingredientes

Muestreos p

p

Ensayo 2:Fórmulas inicio/Leche materna

IV. Material y M

étodos

83

Figura 12. Diseño experimental de los estudios in vivo III y IV.

Evolución de la microbiota intestinal de lactantes alimentados con una fórmula suplementada con α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA.Estudio IV

Fórmula estándar(n= 14)

Fórmula funcional(n= 14)

Leche materna(n=33)

Grupos microbianos

AtopobiumBacteroides

Bifidobacterium

Clostridium coccoides

Enterobacteriaceae

Staphylococcus

Lactobacillus

Clostridium leptumEnterococaceae

Estudio III Comparación de la microbiota intestinal de lactantes, alimentados con leche materna, procedentes de dos regiones españolas

20 lactantesHospital Universitario Virgen

de la ArrixacaMurcia

20 lactantesHospital de Cabueñes

Asturias

40 lactantes sanos

días de vida

Muestras fecales

8, 30, 90

Extracción ADN

AtopobiumBacteroides

Bifidobacterium


Enterobacteriaceae

Staphylococcus

Lactobacillus

Clostridium leptumEnterococaceae

CUANTIFICACIÓN DE POBLACIONES MICROBIANAS

Muestras fecales

2, 4, 7-8, 12Semanas de vida

Extracción ADN

CUANTIFICACIÓN DE POBLACIONES MICROBIANAS

IV. Material y M

étodos

84


85

2. Muestras: ingredientes, fórmulas infantiles y leche materna

2.1. Ingredientes

‐ Suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα): proteínas de suero con alto

contenido en α‐lactoalbúmina (45% del contenido total de proteínas), Arla Food

(Denmark).

‐ Suero lácteo rico en β‐lactoglobulina (SLβ): proteínas de suero con alto contenido

en β‐lactoglobulina (32% del contenido total de proteínas), Arla Food (Denmark).

‐ Nucleótidos (Nuc):

• GMP: guanosina 5’‐monofosfato disodio (Ajinomoto, Hamburg,

Alemania).

• CMP: Citidina 5’‐monofosfato acid (Pharma Waldhof GMBH, Dusseldorf,

Alemania).

• AMP: adenosine 5’‐monofosfato acid (Pharma Waldhof GMBH,

Dusseldorf, Alemania).

• UMP: Uridina 5’‐monofosfato disodio (Pharma Waldhof GMBH,

Dusseldorf, Alemania).

2.2. Fórmulas infantiles y leche materna

Se evaluaron dos fórmulas infantiles de inicio de la marca comercial Hero España S.A:

una fórmula estándar (sin suplementar) a la que llamamos fórmula control (FC) y una

fórmula suplementada con suero proteico rico en α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA a la

que llamamos fórmula suplementada (FS). La fórmula suplementada contiene 5,1 g de suero

lácteo, de los cuales un 28% aproximadamente son de suero enriquecido con α‐

lactoalbúmina. El contenido total de α‐lactoalbúmina en la fórmula suplementada fue

aproximadamente de 2 g/L y el de nucleótidos de 32 mg/L. La composición detallada de

dichas fórmulas se muestra en las Tablas 6 y 7.


86

Tabla 6. Composición nutricional de la fórmula control por 100 g y por 100 ml de fórmula reconstituida. Por 100 g de

fórmula en polvo Por 100 ml de fórmula

reconstituida VALOR ENERGÉTICO KJ/Kcal 2184/ 522 285/ 68 NUTRIENTES

Proteínas g 10,2 1,3 Caseína g 5,1 0,7 Suero lácteo g 5,1 0,7

Hidratos de Carbono g 55,2 7,2 Grasas g 29,0 3,8

Ácido linoleico mg 4510,0 586,3 Ácido α‐linolénico mg 430,0 55,9 Relación 10,5 10,5

MINERALES Sodio mg 130,0 16,9 Potasio mg 497,0 64,6 Cloro mg 366,0 47,6 Calcio mg 392,0 51,0 Fósforo mg 220,0 28,6 Relación Ca/P 1,8 1,8 Magnesio mg 42,0 5,5 Hierro mg 6,3 0,8 Cinc mg 4,2 0,5 Cobre µg 314,0 40,8 Yodo µg 78,0 10,1 Selenio µg 7,0 0,9

VITAMINAS Vitamina A µg 523,0 68,0 Vitamina D µg 7,8 1,0 Vitamina E mg 7,8 1,0 Vitamin K µg 52,0 6,8 Vitamina C mg 52,0 6,8 Vitamina B1 µg 523,0 68 Vitamina B2 µg 785,0 102,0 Niacina mg 5,2 0,7 Vitamina B6 µg 523,0 68,0 Ac. Fólico µg 78,0 10,1 Biotina µg 2,1 0,3 Ac. Pantoténico µg 16,0 2,1

OTROS 2353,0 305,9 L‐Carnitina mg Taurina mg 7,8 1,0 Inositol mg 42,0 5,5 Colina mg 26,1 3,4


87

Tabla 7. Composición nutricional de fórmula suplementada por 100 g y por 100 ml de fórmula reconstituida Por 100 g de

fórmula en polvo Por 100 ml de fórmula

reconstituida VALOR ENERGÉTICO KJ/Kcal 2159/516 281/ 67 NUTRIENTES

Proteínas g 10,2 1,3 Caseína g 5,1 0,7 Suero lácteo g 5,1 0,7 α‐lactoalbúmina g 1,4 0,2

Hidratos de Carbono g 56,9 7,4 Grasas g 27,5 3,8

Ácido linoleico mg 4067,2 528,7 Ácido α‐linolénico mg 335,5 43,6 Relación 12,1

MINERALES 12,1 Sodio mg 154 21 Potasio mg 495 67 Cloro mg 326 44 Calcio mg 387 52 Fósforo mg 246 33 Relación Ca/P 1,6 1,6 Magnesio mg 47 6,4 Hierro mg 6,6 0,9 Cinc mg 4,2 0,5 Cobre µg 314 40,8 Yodo µg 78 11 Selenio µg 7,0 0,9

VITAMINAS Vitamina A µg 523,0 68,0 Vitamina D µg 7,8 1,0 Vitamina E mg 7,8 1,0 Vitamin K µg 52,0 6,8 Vitamina C mg 52,0 6,8 Vitamina B1 µg 523,0 68 Vitamina B2 µg 785,0 102,1 Niacina mg 5,2 0,7 Vitamina B6 µg 523,0 68,3 Ac. Fólico µg 78,0 10,1 Biotina µg 16,0 2,1 Ac. Pantoténico µg 2353,0 305,1

OTROS L‐Carnitina mg 8,1 1,1 Taurina mg 44,1 6,0 Inositol mg 29,3 4,0 Colina mg 60,2 8,2 Adenosin 5’‐monofosfato mg 3,6 0,5 Citidina 5’‐monofosfato mg 12,4 1,6 Uridina 5’ monofosfato mg 6,5 0,8 Guanosina 5’‐monofosfato mg 2,1 0,3


88

Como referencia se utilizó leche materna (LM), en el estudio de disponibilidad

mineral en fórmulas infantiles y en el de evaluación de la funcionalidad de las fórmulas

infantiles, ya que se considera el alimento ideal para el recién nácido. Ésta fue donada por

cuatro madres diferentes, que se encontraban entre el segundo y cuarto mes de lactación.

Las muestras de leche se obtuvieron de forma estéril y fueron congeladas hasta su

utilización. Esta leche se utilizó como máximo a las tres semanas de su recogida. El día del

experimento se mezclaron las diferentes muestras de leche de forma estéril.

3. ESTUDIO I: Biodisponibilidad mineral in vitro. Captación transporte y retención de

calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2

3.1 Material, reactivos y equipos de laboratorio

‐E‐MEM (Eagle minimum essential medium; Gibco BRL Life Technologies, Rockville,

MD, USA).

‐Suero bovino fetal (Sigma St Louis, MO, USA)

‐Penicilina‐Estreptomicina (Sigma St Louis, MO, USA)

‐Glutamina (Sigma St Louis, MO, USA)

‐Aminoácidos no esenciales (Sigma St Louis, MO, USA)

‐Solución de tripsina‐EDTA (0,25 mg/mL)

‐Azul tripán, CI 23850 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania)

‐Bromuro de 3‐(4,5‐dimetiltiazol‐2‐il)‐2,5 difeniltetrazolio (MTT) (Sigma, St Louis, MO,

USA)

‐Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA).

‐Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) CA 0192 (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, España)

‐Cloruro férrico hexahidratado (FeCl3.6H2O) HI0336 (Scharlau Chemie S.A., Barcelona,

España)

‐Ácido clorhídrico (HCl) 30% (Suprapur Merck KGaA, Darmstadt, Alemania)

‐Ácido nitrilotriacético extrapuro AC 1606 (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, España)

‐Sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O) ACS, C10207 (Scharlau Chemie S.A.,

Barcelona, España)

‐Citrato sódico (C6H5O7Na3.2H2O) (GMBH&Co Riedel‐de Häen, Seelze, Alemania)


89

‐Cloruro sódico (NaCl) (Merck KGA Darmstadt, Alemania)

‐Cloruro potásico (KCl) (Merck KGA Darmstadt, Alemania)

‐Cloruro de lantano hidrato (LaCl3) (Fluka Chemie GmbH, Austria)

‐Sulfato de magnesio anhidro (MgSO4), MA0080 (Scharlau Chemie S.A., Barcelona,

España)

‐1‐ácido piperazinetanosulfónico 4‐(2‐hidroxietil) sal monosódica (HEPES), H7006

(100 g) (Sigma‐Aldrich, St. Louis, MA, USA)

‐D(+)‐Glucosa monohidrato (Merck KGA Darmstadt, Alemania)

‐PBS (solución tampón fosfato salino) (Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA)

‐Cabina de flujo laminar vertical (Teslar, serie V‐30170)

‐Baño termostático (Selecta, Barcelona, España)

‐Estufa de incubación (Binder, Tuttlingen, Alemania)

‐Microscopio invertido de contrate de fases (Motic)

‐Cámara de recuento Neubauer, Boeco (Neubauer, Hamburgo, Alemania)

‐Lector de placas Labsystem multiskan MCC/340 microplate reader (Termo Electrón

Corporation, Barcelona, España)

‐Placas de 6 y 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca)

‐ Filtros de policarbonato 0,4µm, 24mm de diámetro (Nunc, Roskilde, Dinamarca)

‐Rascador de células, 25 cm (Sarstedt, Inc., NC, USA)

‐Frascos 75 cm2 de poliestireno, 83.1811.002 (Sarstedt, Inc., NC, USA)

‐Crisoles de porcelana C‐4 (KPM, Berlín, Alemania)

‐Espectrofotómetro de absorción atómica mod. 3100 (Perkin‐Elmer, Norwalk, U.S.A)

‐Horno mufla, mod. S27 (Naberthem Bremen, Alemania)

‐Micro‐Osmómetro Automatic Type 13/13DR‐Autocal (Roebling, Berlin, Alemania).

3.2. Cultivo celular de la línea Caco‐2

El trabajo realizado con cultivos celulares se desarrolló en los laboratorios del Servicio

de apoyo a la investigación (SAI) de la Universidad de Murcia. Las instalaciones de estos

laboratorios están certificadas como Laboratorios de Nivel de Bioseguridad 2. y están

equipados con cabinas de flujo laminar vertical de tipo II, donde obtuvimos condiciones de

esterilidad para la manipulación de la línea celular. Antes de comenzar a trabajar, se conectó


90

la lámpara ultra violeta durante 15 minutos y después se encendieron los ventiladores

durante otros 15 minutos a fin de obtener un flujo laminar de aire estable. La superficie de la

cabina se limpió con alcohol al 70%.

La línea celular Caco‐2 fue obtenida por primera vez en 1977 a partir de un

adenocarcinoma colorrectal procedente de un hombre de 72 años de edad (Pinto et al.,

1983). Son células adherentes con morfología epitelial, con la característica de que cuando

alcanzan el estado de confluencia dejan de proliferar, se diferencian espontáneamente

desarrollando una monocapa de células polarizadas en las que destaca el borde en cepillo

apical propio de la mucosa intestinal. Las células Caco‐2 utilizadas en este estudio procedían

de la European Collection of Cell Cultures (ECACC; número 86010202, Salisbury, UK). Se

recibieron congeladas en nitrógeno líquido y en el pase número 16. Todos los ensayos con

células Caco‐2 se realizaron entre los pases 18 y 35.

3.2.1. Mantenimiento celular y subcultivo

El medio de cultivo utilizado fue EMEM (Eagle Minimum Essential Medium) con rojo

fenol al que suplementamos con 10% de suero bovino fetal, 1% de aminoácidos no

esenciales, 1% de glutamina y 1% de antibióticos (estreptomicina y penicilina). El medio de

cultivo ya reconstituido se mantuvo a 4º C, no más de siete días, hasta su uso.

El mantenimiento de la línea celular se realizó en frascos de 75 cm2 y el crecimiento

de la misma se observó por microscopía invertida de contraste de fases. El medio de cultivo

se cambió en días alternos. Las células se incubaron a 37ºC, a una presión parcial de CO2 del

5% y con una humedad relativa del 95%. El cultivo se mantuvo hasta un 80% de confluencia,

momento en el que se realizó el subcultivo.

Para subcultivar las células utilizamos tripsina‐EDTA (0,25%), que actúa digiriendo las

proteínas de adherencia, que son dependientes de calcio y magnesio. A este nivel interviene

el EDTA secuestrando los cationes divalentes libres que intervienen en las uniones.


91

Transcurridos 3 minutos, se inactivó la tripsina mediante la adición de de EMEM

completo, la suspensión se centrifugó a 1200 rpm durante 10 minutos, descartando el

sobrenadante. El sedimento de células se resuspendió en caldo nuevo.

3.2.2. Recuento y viabilidad celular

A partir de la suspensión celular obtenida, se realizó el contaje del número de células

presentes utilizando una cámara de Neubauer. Para ello se realizó una dilución 1:1 de la

suspensión celular y el colorante azul tripán. Esta tinción permite diferenciar las células

viables de las muertas, ya que en las células muertas el colorante penetra al estar la

membrana está alterada (Figura 13).

Figura 13. Visión al microscopio de los campos en los que se realiza el contaje celular utilizando una cámara Neubauer.

La relación entre el número de células muertas y el número de células vivas nos

indica la viabilidad celular:

%Número de células vivasNúmero total de células 100

La densidad celular de siembra para el mantenimiento del cultivo celular fue de

30.000 cels/cm2 en el presente trabajo.


92

3.2.3. Congelación

Las células se mantuvieron congeladas hasta la realización de los experimentos, en

nitrógeno liquido (‐196ºC) en criotubos de 1,5 mL conteniendo 1 mL de medio de cultivo y un

10% de dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector, para prevenir el daño físico, que pueda

causar la formación de cristales y el daño osmótico debido a un descenso de la solubilidad de

solutos.

Para realizar la congelación, se procedió del mismo modo que se describe para

realizar un subcultivo, Ajustando posteriormente la concentración de células (con viabilidad

mayor del 85%) a 2‐ 4∙106 cels/ml.

3.2.4. Crecimiento y diferenciación celular

a. Curva de crecimiento

Para la realización de una curva de crecimiento celular, las células Caco‐2 se

sembraron en una placa de 12 pocillos (4 cm2 de superficie), con una densidad de 30.000

células/cm2. El medio se cambió cada 2 días hasta llegar al 90% confluencia, momento a

partir del cual se cambió todos los días.

Los días 2, 4, 7, 11, 14 y 18 postsiembra, las células se separaron de la superficie con

tripsina‐EDTA 0,25% y se evaluó su recuento en cámara de Neubauer y su viabilidad del

modo descrito en el apartado 2.5.

b. Diferenciación celular

Según la bibliografía consultada, las células Caco‐2 alcanzan el estado diferenciado a los

19‐21 días de postsiembra (Frontela et al., 2009a), el cual se caracteriza por el desarrollo de

microvellosidades en la superficie apical de las células.


93

A fin de confirmar la presencia de microvellosidades en las células, éstas fueron

sembradas sobre un cubreobjetos de vidrio y transcurridos 21 días, se analizaron con

microscopio de barrido en el servicio de microscopia del SAI (servicio de Apoyo a la

Investigación de la Universidad de Murcia).

3.2.5. Permeabilidad y toxicidad celular

a. Evaluación de la permeabilidad aparente: prueba rojo fenol

La integridad de la monocapa se puede evaluar mediante la medida del paso de ciertos

compuestos como es el rojo fenol (Pm; 354 Da) a través de los espacios intercelulares de la

misma. Para ello, se preparó una disolución de concentración 1 mM de rojo fenol en EMEM

sin rojo fenol. Se lavó la monocapa celular al menos 3 veces con EMEM sin rojo fenol a 37ºC

con el fin de de eliminar cualquier residuo del colorante procedente del medio de cultivo en

el que se han mantenido las células hasta el momento del experimento.

Se realizó una curva de calibración con diferentes concentraciones de rojo fenol: 40, 20,

10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 y 0,3125 µM a partir de la disolución madre. Medimos la absorbancia a

560 nm en un espectrofotómetro de absorción molecular de 900 µl de cada una de las

concentraciones.

Para el desarrollo de los experimentos, las células fueron sembradas en filtros de

policarbonato insertos en pocillos bicamerales, a una densidad de 30.000 células/cm2

realizándose el experimento a los 5, 8, 12, 15, 18 y 21 días postsiembra. Se añadieron 500 µl

de la disolución rojo fenol 1 mM en la cámara apical y el mismo volumen de EMEM sin rojo

fenol en la cámara basolateral. Incubamos las células durante una hora a 37º C y 5% de CO2.

Transcurrido el periodo de incubación se recogió el contenido de la cámara basolateral y se

le añadieron 100 µl de NaOH 0,1 N.

A partir de los valores obtenidos se calculó la permeabilidad aparente que es indicativo

del desarrollo de las uniones intercelulares estrechas.


94

0CdtdC

AV

×=

Donde:

V (cm3): volumen cámara basolateral.

A (cm2): área del filtro.

t (s): tiempo.

C0: concentración de rojo fenol en la

cámara apical a tiempo 0.

C: concentración de rojo fenol en la

cámara basolateral a tiempo t.

b. Ensayo de toxicidad celular: ensayo MTT

Para evaluar la toxicidad de los diferentes ingredientes y disoluciones patrón de

calcio, hierro y cinc utilizadas en este estudio sobre las células Caco‐2 se realizó un ensayo

cuantitativo colorimétrico que mide la actividad metabólica de las células en fase de

proliferación activa. Las sales de tetrazolio se utilizan para evaluar la actividad celular,

porque su reducción está principalmente catalizada por las oxidoreductasas presentes en la

cadena de transporte mitocondrial. Una de las más utilizadas es el MTT (bromuro de 3‐(4,5‐

dimetiltiazol‐2‐il)‐2,5‐ difeniltetrazolium) que se basa en la formación de cristales de

formazán de un color azul intenso que son insolubles en agua después de la rotura de la sal

de tetrazolium (Figura 14).

Figura 14. Reacción producida por las enzimas mitocondriales al reducir el MTT.

Amarillo MTT Azul MTT

ReductasaMitocondrial


95

La formación de los cristales sólo se puede producir en células viables mediante la

enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa. Los cristales se solubilizan con un solvente

orgánico (DMSO) y la densidad óptica de los cristales disueltos se puede medir

espectrofotométricamente. El valor de absorbancia obtenido correlaciona de forma directa

con el número de células metabólicamente activas presentes en el cultivo celular.

Se siguió el protocolo descrito por Mosmann (1983). Para ello se preparó una

disolución de MTT a una concentración de 5 mg/ml en medio de cultivo sin rojo fenol,

teniendo en cuenta que el MTT es fotosensible. Las células fueron sembradas a una

densidad de 5000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (superficie: 2 cm2/pocillo). Las

células se mantuvieron en la placa durante 19‐21 días, transcurrido este tiempo se incubó

cada pocillo con cada ingrediente de estudio o la solución patrón de calcio, hierro o cinc

durante una hora a 37ºC. Posteriormente se retiró la muestra y se añadieron 200 μL de

EMEM libre de suero y 50 μl de solución de MTT (5 mg/ml). Se incubó durante 4 horas,

observándose un precipitado violáceo que se encuentra en el interior de las células. Se retiró

el medio y se añadieron 100 µl de dimetilsulfóxido (DMSO) en cada pocillo a fin de solubilizar

el formazano. Se leyó la absorbancia empleando un lector de placas a una longitud de onda

de 570 nm. Dos de las columnas de la placa de 24 pocillos no fueron tratadas con ningún

ingrediente, dándoles un valor de 100% de viabilidad.

3.3. Estudio de captación retención y transporte mineral mediante el empleo de la línea

celular Caco‐2

Se realizaron ensayos de captación, retención y transporte mineral a partir de

soluciones patrón de calcio, hierro y cinc a diferentes concentraciones, con cada uno de los

ingredientes objeto de estudio. Se evaluó el efecto de la adición de suero proteico rico en α‐

lactoalbúmina o nucleótidos (descrito anteriormente) sobre la absorción de dichos

minerales. Se realizaron también ensayos con las dos fórmulas infantiles objeto de estudio

de la presente tesis doctoral y con leche materna, previamente digeridas, para evaluar la

absorción mineral de cada una de ellas tomando como referencia la biodisponibilidad

mineral de la leche materna (Figura 11).


96

Para realizar estos ensayos, las células se sembraron sobre pocillos bicamerales de

policarbonato con 0,4 µm de diámetro de poro y 3,8 cm2 de superficie (Figura 15). La

densidad de siembra fue de 30.000 cels/cm2, manteniéndose hasta alcanzar la diferenciación

celular (19‐21 días), y cambiando el medio de cultivo en días alternos.

Figura 15. Pocillo bicameral, donde se pueden apreciar las dos cámaras y la monocapa celular

3.4. Ensayo 1: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de soluciones patrón de

minerales con y sin los ingredientes de estudio

3.4.1. Procesado de los ingredientes de estudio

En este ensayo se evaluaron el suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα) y los

nucleótidos (Nuc). El suero lácteo se disolvió en el tampón de captación cuya composición

fue: 0,75% de NaCl, 0,074% de cloruro potásico, 0,012% de sulfato de magnesio, 0,09% de

glucosa y 1,3% de HEPES en agua milli‐Q, ajustando el pH a 7 con ácido clorhídrico 30%. Se

calentó a 60ºC para su completa disolución y se añadió en cantidad suficiente para obtener

la misma concentración que la presente en la fórmula infantil.

Se prepararon las soluciones de nucleótidos a ensayar tomando el volumen adecuado de

una disolución madre para alcanzar una concentración final igual a la de la fórmula de

estudio. Como disolvente en las disoluciones estudiadas se empleó el tampón de captación,

descrito anteriormente, con el objetivo de que el pH y la osmolaridad fueran fisiológicos

evitando así la lisis celular (pH: 7 y osmolaridad: 310‐330 mOsm/Kg). El contenido total de


97

nucleótidos fue de 32mg/L, suponiendo un 44% del aporte de nucleótidos de la leche

materna.

3.4.2. Soluciones estándar de minerales y su preparación.

Se realizaron disoluciones madre de los tres minerales en las concentraciones que se

especifican a continuación; 10 mM de CaCl2 para el calcio, de 10 mM de FeCl3⋅6H2O (con

ácido nitriloacético 20 mM de y ácido clorhídrico 1 mM) para el hierro y 1 mM de

ZnSO4⋅7H2O para el cinc. A partir de estas soluciones se prepararon las distintas

concentraciones de minerales a utilizar en los ensayos para cada uno de los minerales en

una solución tampón de captación empleada como blanco. Las diferentes concentraciones

estudiadas para cada mineral se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8: Concentraciones de calcio, hierro y cinc evaluadas en los ensayos de captación retención y transporte.

Calcio (CaCl2) Hierro (FeCl3.6H2O) Zinc (ZnSO4.7H2O)

10 mM 50 µM 5 µM

30 mM 150 µM 10 µM

Los ensayos fueron realizados con cada una de las soluciones estándar de minerales y

con los ingredientes a evaluar, nucleótidos y suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina. Estos

ingredientes se añadieron en la misma concentración presente en la fórmula infantil de

inicio. Todas las disoluciones fueron preparadas inmediatamente antes de realizar cada

ensayo.

3.4.3. Procedimiento.

En cada ensayo se sembraron las células Caco‐2 en los filtros de policarbonato a una

densidad de 30.000 células/cm2, insertos en pocillos formando un sistema bicameral en

placas de 6 pocillos. Cinco pocillos fueron empleados para el estudio con los patrones de

hierro, calcio o cinc sólo o junto con los ingredientes objeto de estudio. El sexto pocillo fue

utilizado como blanco (tampón de captación).


98

Tras retirar el medio de cultivo, se lavó la monocapa 3 veces con PBS a 37ºC para

eliminar restos del medio de cultivo y del metabolismo de las células. A continuación, se

añadió 1 ml de cada una de las disoluciones de los patrones de minerales (Tabla 8) con o sin

el ingrediente de estudio a la cámara apical del inserto en el que se encontraban las células

ya diferenciadas. En la cámara basolateral se añadió 1 ml del tampón de captación,

incubándose las células durante una hora a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de humedad relativa.

Transcurrida la incubación se recogió el contenido de las cámaras basolateral y apical,

se lavó la monocapa con el tampón de captación a 4ºC para evitar modificaciones y

desprendimientos en las células, se añadió 0,5 ml de agua milli‐Q, con el objetivo de producir

la lisis celular y con la ayuda de unos rascadores se recogieron las células que estaban

adheridas a los filtros. El contenido de la cámara apical, basolateral y las células recogidas se

congelaron a ‐80ºC hasta su análisis.

3.5. Ensayo 2: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de las fórmulas infantiles que

difieren en su contenido en ingredientes funcionales y de leche materna

3.5.1. Muestras

Para llevar a cabo este ensayo de la presente tesis doctoral, se utilizaron las fórmulas

infantiles elaboradas a base de leche vaca: una fórmula control (FC) sin suplementar y otra

fórmula suplementada (FS) con α‐lactoalbúmina y nucleótidos como ingredientes

funcionales (Tabla 6 y 7). Como referencia utilizamos leche materna madura, descrita en el

apartado 2.2. Fórmulas infantiles y leche materna donada por tres madres diferentes en la

misma fase de lactancia, (entre 2 y 3 meses). Se mezclaron las tres muestras, de forma

estéril, con el objetivo de minimizar las diferencias entre individuos.

3.5.2. Digestión gastrointestinal in vitro

Se siguió el procedimiento descrito por Frontela et al., (2009a) para ello 13,5 gramos de

la fórmula se disolvieron con 100 ml agua milli‐Q templada según instrucciones del

fabricante. Para la digestión gástrica se ajustó el pH a 4 con HCl 6 N, y tras 15 minutos se


99

volvió a ajustar en caso de ser necesario. Se añadieron 0,02 g de la solución de pepsina por

gramo de muestra (1,6 g de pepsina en 10 ml de HCl 0,1 N) incubando a 37ºC en agitación

durante 2 horas. Posteriormente, se detuvo la actividad enzimática sumergiendo las

muestras en hielo durante 10 minutos.

A continuación, se inició la digestión intestinal ajustando el pH del digerido gástrico a 5

empleando NaHCO3 1 M. Tras 15 minutos se reajustó cuando fue necesario. Preparamos una

disolución de pancreatina (0,2 g) y sales biliares (1,25 g) en NaHCO3 0,1 N (50 ml). Se añadió

suficiente cantidad de dicha disolución para proporcionar 0,005 gramos de pancreatina y

0,03 g de sales biliares por gramo de muestra. Incubamos a 37ºC en agitación durante 2

horas. Detuvimos la actividad enzimática sumergiendo las muestras en hielo durante 10

minutos. El pH de la muestra se ajustó a 7 añadiendo NaOH 5 M, reajustando cuando fue

necesario. Para asegurar la inactividad enzimática, la muestra se mantuvo a 100ºC durante 4

minutos.

Para la obtención de la fracción soluble, alícuotas del digerido intestinal se centrifugaron

a 3500 g durante 1 hora a 4ºC. Se recogió el sobrenadante (fracción soluble) y se congeló a

‐20ºC para su posterior determinación del contenido mineral.

3.5.3. Acondicionamiento de la fracción soluble y adición de dicha fracción a la monocapa

celular.

La fracción soluble se añadió sobre la monocapa celular previo acondicionamiento de la

misma ajustando los valores de pH y de osmolaridad de la siguiente manera:

‐ Se añadió glucosa y HEPES hasta una concentración final de 5 mM y 50 mM

respectivamente.

‐El pH se ajustó a 7,2‐7,4 con HCl 30%.

‐ La osmolaridad se corrigió añadiendo agua milli‐Q hasta un valor de 310 ± 10 mOsm/kg

a fin de alcanzar valores fisiológicos que no dañen la monocapa.

Se retiró el medio de de cultivo, se lavó la monocapa 3 veces con PBS a 37°C para

eliminar restos del medio de cultivo, del mismo modo como se procedió en el trabajo con

soluciones patrón. Se añadió 1 ml de la fracción soluble acondicionada sobre la monocapa


100

celular tras 21 días de cultivo y 1 ml del tampón de captación en la cámara basaly se

mantuvo durante 1 hora a 37°C, 5% de CO2 y con un 95% de humedad relativa.

Transcurrida la incubación se recogió el contenido de la cámara basolateral y apical,

siguiendo la metodología descrita en el apartado 2.9 y posteriormente se procedió a su

análisis mineral o a su congelación.

3.6. Destrucción de la materia orgánica y obtención de la fracción mineral

El contenido de las cámaras apical, basal y las células obtenidas en los ensayos se

incineraron durante 24 horas en horno‐mufla a 450°C, empleando una rampa de subida de

temperatura de 30 minutos hasta alcanzar la temperatura final. Sobre las cenizas obtenidas

se adicionó 1 ml de ácido nítrico 65% que fue evaporado en placa calefactora, y se incineró

de nuevo a 450°C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se adicionaron 2 ml de HCl

fumante 37%, a cada crisol conteniendo la muestra y se cubrieron con vidrios de reloj

manteniéndolos durante 4 horas en la placa calefactora. Se añadieron a continuación, de

nuevo 2 ml del mismo ácido manteniéndolos en placa calefactora hasta reducción del

volumen a 1 ml. Este volumen fue entonces completado hasta 7 ml con agua bidestilada

desionizada, conteniendo cloruro de lantano (0,2%) para evitar posibles interferencias entre

calcio y fósforo.

3.7. Determinación de Fe, Ca y Zn por Espectrofotometría de absorción atómica (EAA)

El contenido mineral de las muestras se midió por espectrofotometría de absorción

atómica. La diferencia entre el contenido del mineral obtenido de la monocapa incubada con

la solución patrón de cada mineral y el contenido de la monocapa no expuesta (blanco) nos

da una estimación de la retención mineral. El transporte es estimado como la diferencia

entre la cantidad de mineral presente en la cámara basal y la solución tampón empleada

como blanco. La captación mineral se determinó a partir de es la suma del mineral retenido

y transportado. Se calculó el porcentaje de mineral retenido y transportado así como la

eficiencia de transporte y captación mineral (Perales et al., 2005). A continuación se

muestran las ecuaciones utilizadas en los cálculos de disponibilidad.


101

ó 100 ñ

100

ñ

ó 100

ñ

100

ó ó

100

En la Tabla 9 se muestran las condiciones aplicadas al espectrofotómetro de absorción

atómica y que fueron aplicadas a lo largo del estudio.

Tabla 9. Condiciones del espectrómetro de absorción atómica

Longitud de onda(nm)

Apertura rendija(mm)

Sensibilidad de verificación (mg/L)

Calcio 422,7 0,5 5Hierro 248,3 0,2 4Zinc 213,9 0,2 1

Para la realización de los diferentes concentraciones patrones utilizados en la rectas de

calibrado, se partió de un patrón comercial de 100 ppm de cada uno de los tres minerales

(Tabla 10).

Tabla 10. Preparación de las soluciones patrón de calcio, hierro y cinc para realizar la recta de calibrado.

[Calcio] [Hierro] [Zinc] Patrón 1 0,5 0,25 0,125

Patrón 2 1 0,5 0,25

Patrón 3 2 1 0,5

Patrón 4 5 2 1

Patrón 5 10 5 2

RECTA y=0,0168x‐0,0030 Y=0,0426x+0,0013 y=0,1886x+0,0062

R2 0,9994 0,9998 0,9993


102

3.8. Evaluación de la morfología de las células Caco‐2 expuestas a dos concentraciones de

nucleótidos

Las células fueron sembradas sobre cubres previamente esterilizados con etanol a

una densidad de 30.000 cels/ml. Se mantuvieron en cultivo durante 19‐21 días. A partir del

día 8 comenzamos a estimular a las células todos los días con dos concentraciones distintas

de nucleótidos (32 mg/L y 72 mg/L). Al grupo control se le cambió el medio de cultivo de

modo paralelo. El experimento se realizó por duplicado.

Transcurrido el periodo de diferenciación las células se enviaron al departamento de

microscopia del servicio de Apoyo a la investigación (SAI) para su procesado y su posterior

observación al microscopio electrónico de barrido. El objetivo fue evaluar el efecto de los

nucleótidos sobre la morfología y características externas de la línea celular Caco‐2.

3.9. Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como el valor medio y la desviación estándar como

medida de dispersión. Se realizó una comparación de los valores medios de los diferentes

parámetros de biodisponibilidad de calcio, hierro y cinc de los tres grupos de estudio

mediante un análisis de la varianza (ANOVA) con el fin de comprobar si existían diferencias

debidas a la adición los ingredientes objeto de estudio o de la fórmula infantil suplementada.

Contrastamos la normalidad y la homogeneidad de varianzas, y aquellas variables que no

siguieron una distribución normal fueron transformadas mediante logaritmo en base 10. El

análisis estadístico se realizó usando el paquete estadístico SPSS para Windows (SPSS versión

15.0 Inc., Chicago, IL).


103

4. ESTUDIO II: Evaluación de la actividad funcional de la fórmula infantil

suplementada con suero lácteo rico en α-lactoalbúmina, nucleótidos y DHA y de sus

ingredientes.

Antes del comienzo del estudio sobre la evolución de la microbiota fecal expuesta a

diferentes ingredientes, se realizó una valoración preliminar de los mismos exponiendo

diferentes cultivos puros de bacterias intestinales a los ingredientes objeto de estudio. De

esta forma, obtuvimos una idea general del efecto de los ingredientes funcionales

ensayados sobre el crecimiento de determinadas bacterias. Una vez finalizado el estudio

preliminar, se llevó a cabo el estudio de la evolución de los diferentes grupos microbianos

de un inoculo fecal expuesto a los diferentes ingredientes y a las fórmulas de inicio. En la

Figura 16 se presenta el diseño experimental del estudio II.

Figura 16. Diseño experimental del estudio II

Estudio II: Evaluación de la actividad funcional de fórmulas infantiles y sus ingredientes

Muestreo cada hora durante 14h

Ensayo 1: Evaluación del crecimiento de diferentes especies bacterianas expuestas a los ingredientes de estudio

2 ó 3 colonias en caldo de cultivo e incubación

6‐18 horas

Siembra en medio sólido

Ensayo 2: Evolución de la microbiota intestinal expuesta a los diferentes ingredientes de estudio

Inoculamos 2% (v/v)Medio de cultivo + ingrediente

Inoculo fecal 2% v/v

Muestreo 0, 6, 12, 24, 36, 48 y 72 horas

p

Ácidos grasos de cadena corta

Evolución microbiota fecal

Medio de cultivo base

ControlNucleótidosNucleótidos digeridosSuero lácteo αSuero lácteo α digeridoSuero lácteo βSuero lácteo β digerido

Leche maternaLeche materna digeridaFórmula controlFórmula control digeridaFórmula suplementadaFórmula suplementada digerida

+Cisteína

+

ppHpH

Ufc/mlDO600

IV. Material y M

étodos

104


105

4.1. Reactivos, material y equipos de laboratorio

a. Cultivos puros y crecimiento microbiano

‐ Man Rogosa Sharpe. (Oxoid, Hampshire, England)

‐ Agar cerebro corazón (Oxoid, Hampshire, England)

‐ Cisteína‐HCl (Fluka, Steinhein, Alemania)

‐ Agar‐agar (Merck, Darmstadt, Alemania)

‐ Solución tampon fosfato (PBS) (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ Generadores de anaerobiosis (Oxoid, Hampshire, England)

‐ Tubos de 1,5 y 10 ml (Daslab, Barcelona, España)

‐ Pipetas de 1 y 10 ml (BD Falcom, Le Pont De Claix, Francia)

‐ Asas de siembra en triple estría y de digralski (Merck, Darmstadt, Alemania)

‐ Puntas de 100 y 1000 µl (Daslab, Barcelona, España)

‐ Cubetas para espectrofotometría (Daslab, Barcelona, España).

‐ Jarras de anaerobiosis (Biomereux, Marcy lEtoile, Francia)

‐ Vortex (Merck, Darmstadt, Alemania)

‐ pH metro (Crison, Barcelona, España)

‐ Espectrofotómetro Evolution 600 UV‐Vis (Thermo Scientific, Cambridge, Reino

unido)

‐ Cabina de flujo laminar (Telstar, Barcelona, España)

‐ Autoclave (Selecta, Barcelona, España).

b. Cultivos fecales

Procesado del inóculo y cultivos

‐PBS (solución tampón fosfato salino) (Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA)

‐Homogenizador (IUL intruments, Barcelona, España)

‐Bolsas para el homogenizador (Seward, Sussex, Inglaterra)

‐Jarras de anaerobiosis (Biomereux, Marcy lEtoile, Francia )

‐Pipetas de 1 y 10 ml (BD Falcom, Le Pont De Claix, Francia)

‐Cabina de flujo laminar (Telstar, Barcelona, España)

‐Generadores de anaerobiosis (Oxoid, Hampshire, England)

‐Autoclave (Selecta, Barcelona, España).

‐Tubos de 1,5 y 2 ml (Daslab, Barcelona, España)


106

PCR (polymerase chain reaction) cuantitativa

‐ QIAmp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania)

‐ Etanol para Biología Molecular (Merck, Darmstadt, Alemania)

‐ SensiMix SYBR No‐ROX kit (Bioline, London, Reino Unido)

‐ Agua para biología molecular (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ Primers (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ Puntas de 1000, 200, 20 y 10 µl estériles y libres de DNAasa yRNAasa (QSP)

‐ Placas de 96 pocillos (Biorad, Marnes la Coquette, Francia)

‐ Film para las placas (Biorad, Marnes la Coquette, Francia)

‐ Termociclador CFX96 (Biorad, Marnes la Coquette, Francia)

Análisis de los ácidos grasos de cadena corta

‐ ‐Metanol (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ ‐Hexano (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ Ácido fórmico (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ Patrón comercial de ácidos grasos de cadena corta (Supelco, Estados Unidos).

‐ Ácido acético (Fluka, Steinhein, Alemania)

‐ Ácido Láctico (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ Viales eppendorff (Daslab, Barcelona, España).

‐ Micropipetas 100‐1000 µL (Thermo Scientific, Cambridge, Reino Unido)

‐ Viales de 0,2 mL (Agilent Technologies, Santa Clara, Estados Unidos)

‐ Microjeringas de 50‐2500 µL (Agilent Technologies, Santa Clara, Estados Unidos)

‐ Matraces aforados de vidrio (Daslab, Barcelona, España)

‐ Centrífuga (Eppendorff, Hamburg, Alemania)

‐ Cromatógrafo de gases 7890A GC System de Agilent Technologies, equipado con

un inyector automático 7683B Series Inyector (Agilent Technologies, Santa Clara,

Estados Unidos)

‐ Columna NukolTM (referencia 24107, Sigma‐Aldrich, St. Luis, Estados Unidos).

‐ Filtros de policarbonato 0,2 µm de diámetro de poro (Merck, Darmstadt,

Alemania)

‐ Jeringas desechables de 1ml (BD Plastipak, Madrid, España)


107

4.2. Ensayo 1: Crecimiento de diferentes especies bacterianas intestinales

sometidas a los ingredientes de estudio. Estudio preliminar

4.2.1. Digestión gastrointestinal in vitro de los ingredientes.

Se realizó una solución madre al 10% de los dos concentrados proteicos; suero

lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα) y suero lácteo rico el β‐lactoglobunina (SLβ) y por

otro lado de los nucleótidos en la misma proporción que en la fórmula pero diez veces

concentrada utilizando como disolvente agua milli Q. Para conseguir una completa

disolución de los ingredientes se calentó a 60ºC.

La digestión de los ingredientes se llevó a cabo sobre dicha solución madre

siguiendo el mismo protocolo que en el estudio I , realizando los cálculos para la

adición de enzimas según el peso de muestra seca. La solución madre de las enzimas

se realizó 10 veces más concentrada con el objetivo de minimizar la dilución de estos

compuestos.

4.2.2. Evaluación del crecimiento microbiano

Se seleccionaron tres especies bacterianas características de la flora intestinal

que fueron expuestas a los ingredientes de las fórmulas infantiles. Dos de las especies

seleccionadas pertenecen al grupo de bacterias lácticas y una a la familia

Enterobacteriaceae, a fin de poder determinar si el comportamiento de dichas

bacterias era diferente debido a los ingredientes. Se decidió estudiar la evolución de

Bifidobacterium longum, Lactobacillus gasseri y Escherichia coli. Esta última fue aislada

en nuestro laboratorio a partir de heces humanas y fue codificada con el nombre del

grupo de investigación (Tabla 11).

Tabla 11. Bacterias intestinales utilizadas en las curvas de crecimiento

Especie bacteriana Origen

Bifidobacterium longum CCTELactobacillum gasseri DSMZ 20077

Escherichia coli Colección NUTBRO


108

Para la realización de las curvas de crecimiento de B. longum y L. gasseri el

medio de cultivo utilizado fue caldo MRS (Man Rogosa Sharpe) con cisteína (0,05%).

Para el estudio del crecimiento de E. coli se empleó caldo BHI (infusión de cerebro

corazón). En primer lugar, se sembró la bacteria en medio de cultivo sólido (15 g/L

agar), y posteriormente se inocularon 2 ó 3 colonias en caldo y se incubó durante la

noche a 37°C y en condiciones de anaerobiosis. Transcurrido el tiempo de incubación,

a partir de la suspensión bacteriana crecida durante la noche, se inocularon al 2% (v/v)

diferentes tubos con y sin ingrediente a estudiar. Los concentrados proteicos se

prepararon a una concentración final de 1% v/v. Los nucleótidos se añadieron en

volumen suficiente para que en el medio de cultivo obtuviéramos la concentración de

la fórmula de estudio (32 mg/L fórmula). Además, se ensayó otra concentración

superior citada en la bibliografía para enriquecer fórmulas infantiles (72 mg/L fórmula)

(Schaller et al., 2004; Buck et al., 2004; Neri‐Almeida et al., 2009). Se llevó a cabo por

separado el estudio de las bacterias expuestas a los sueros proteicos y expuestas a los

nucleótidos. Cada se ingrediente evaluó por triplicado (Figura 17).

Figura 17. Procedimiento para el desarrollo del ensayo 1 del estudio II

1 2 3 4 5Control SLα SLα

digeridoSLβ SLβ

digerido

1 2 3 4 5Control Nucleótidos

32mg/LNucleótidos 32mg/L digerido

Nucleótidos72mg/L

Nucleótidos72mg/L digerido

Inoculo al 2% v/v

Incubación 6‐18 horas a 37C en anaerobiosis

Tomamos 2ó 3 colonias del medio sólido e inoculamos

en medio líquido


109

En cada punto de muestreo (0‐14 h cada dos horas y a las 24 h) se tomó 1 ml

para la medida espectrofotométrica de su densidad óptica a 600 nm. Cuando la

densidad óptica obtenida fue mayor de 1 se realizó una dilución 1:10 y se repitió la

medida. Igualmente se tomó una alícuota para realizar el recuento de viables y la

medida de pH.

4.2.3. Procesado de los resultados y análisis estadístico

Una vez obtenidos los resultados de los recuentos de viables para cada

microorganismo y según el ingrediente utilizado, se ajustaron las curvas de

crecimiento a partir de las que se calculó, el tiempo de adaptación al medio de cultivo

(λ), la tasa de crecimiento en la fase exponencial (µ) y los recuentos máximos. Para

ajustar los modelos de crecimiento se utilizó la macro de Excel ® DMfit. Para evaluar

las posibles diferencias estadísticas (P<0,05) debidas al ingrediente añadido al medio

de cultivo, se llevó a cabo un Análisis de Varianza (ANOVA) y la comparación por

parejas se realizó mediante el test de Tukey. El tratamiento estadístico se realizo con

SPSS 15.0.

4.3. Ensayo 2: Evolución de la microbiota fecal expuesta a los diferentes

ingredientes objeto de estudio

Existen diferentes métodos para evaluar la actividad prebiótica de un

compuesto. Se pueden realizar ensayos en fermentadores estáticos donde el sustrato

es añadido a concentración conocida. Los tubos de fermentación que contienen un

medio de cultivo basal inoculado con una suspensión fecal se incuban a 37ºC en

anaerobiosis durante un corto periodo de tiempo (24‐48h) y se toman muestras

regularmente. En las fermentaciones cerradas en las que el sustrato es limitado, el

cultivo sigue una curva típica de crecimiento. Para simular las condiciones intestinales,

se llevan a cabo estudios en fermentadores que trabajan en continuo. En ellos se

controlan diversos parámetros y se alimenta el sistema con medio de cultivo nuevo

(Gibson y Fuller, 2000). Los modelos in vitro del tracto grastrointestinal han sido

utilizados en numerosos estudios para investigar el efecto de la fermentación de


110

distintos sustratos (carbohidratos y proteínas) sobre la flora intestinal (Wang y Gibson,

1993; Sghir, Chow y Mackie; 1998, Brück, Graverholt y Gibson, 2002 y 2003b; Al‐

Tamimi,. 2006).

4.3.1. Procesado de los ingredientes

Los ingredientes utilizados para este experimento se describen en el apartado

2.1. de la presente tesis. La simulación de la digestión gastrointestinal de los mismos

se realizó sobre la solución madre al 10% y siguiendo el protocolo descrito en el

ensayo anterior de este mismo estudio (apartado 3.11). Por otro lado, la digestión de

las fórmulas infantiles y la leche materna se llevó a cabo según el procedimiento

explicado en el primer estudio (apartado 3.12 b). Terminada las digestiones de las

fórmulas y los ingredientes, las alícuotas se mantuvieron a 100° C durante 4 minutos

para la desnaturalización de las enzimas utilizadas.

4.3.2. Preparación del inóculo fecal

Las heces se obtuvieron de 3 lactantes sanos de entre 2 y 4 meses de edad que

no habían tomado antibióticos y con alimentación mixta (los niños recibían leche

materna y fórmula infantil). Para la preparación del inóculo fecal, se pesó 1 gramo de

heces en condiciones de esterilidad y se le añadieron 9 ml de PBS (10% w/v)

homogeneizándose en un Stomacher. La composición de PBS fue 8 g/L de NaCl, 0,2 g/L

de KCl, 1,15 g/L de Na2HPO4 y 0,2 g/L de KH2PO4 (pH 7,3). Posteriormente, 10 ml de

esta suspensión se añadieron a 90 ml del medio de cultivo basal (su composición se

indica en el siguiente apartado). Se incubó durante toda la noche en anaerobiosis a 37°

C para estabilizar la suspensión fecal antes de proceder a la inoculación.

4.3.3. Medio de cultivo e inoculación del mismo.

El medio de cultivo basal utilizado estaba compuesto por: agua de peptona (2

g/L), extracto de levadura (2 g/L), cloruro sódico (0,1 g/L) fosfato dipotásico (0.04 g/L),

sulfato de magnesio (0,01 g/L), cloruro cálcico hexahidratado (0,01 g/L), carbonato


111

sódico (2 g/L) L‐cisteína (2,5 g/L), sales biliares (0,5 g/L), tween 80 (2 ml), hemina (50

mg/ml) Se esterilizó en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos y posteriormente se

añadió vitamina K (10 µl) (Salazar et al., 2008).

El volumen final para llevar a cabo esta experiencia fue de 20 ml, y el inóculo

fecal se realizó al 10% (v/v). En primer, lugar se les añadió a todos los tubos un 1% de

lactosa (w/v) ya que es el azúcar mayoritario de la leche. Los concentrados de

proteínas de lactosuero se añadieron también en un 1% (v/v), por otra parte los

nucleótidos se añadieron en suficiente cantidad para que la concentración final fuera

la misma que en la fórmula infantil (32 mg/L) tal y como se ha descrito anteriormente.

De esta forma obtuvimos para cada hora de muestreo (0, 6, 12, 24, 36, 48, 72

horas) dos tubos con los siguientes ingredientes:

• 1% lactosa (Control).

• nucleótidos (32 mg/L).

• nucleótidos digeridos (32 mg/L).

• 1% suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα).

• 1% suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina digerido (SLα dig).

• 1% suero lácteo rico en β‐lactoglobulina (SLβ).

• 1% suero lácteo rico en β‐lactoglobulina digerido (SLβ dig).

Por otro lado, se prepararon distintos tubos conteniendo 18 ml de las fórmulas

infantiles o la leche materna, a las que previamente se les añadió 0,5 g/L cisteína como

agente reductor del medio (Bruck et al., 2003b), quedando para cada hora de

muestreo (0, 6, 12, 24, 36, 48, 72 horas) dos tubos de las siguientes muestras:

• Fórmula de inicio control (FC).

• Fórmula de inicio control digerida (FC dig).

• Fórmula de inicio suplementada (FS).

• Fórmula de inicio suplementada digerida (FS dig).

• Leche materna (LM).

• Leche materna digerida (LM dig).


112

Los tubos con el medio de cultivo y los ingredientes (nucleótidos y proteínas de

lactosuero) o con las fórmulas infantiles y leche materna, se incubaron durante toda la

noche a 37° C en anaerobiosis. Al día siguiente, se inocularon todos los tubos con 2 ml

de la suspensión fecal y se incubaron a 37° C en anaerobiosis. Se tomó muestra a las 0,

6, 12, 24, 36, 48 y 72 horas y se midió el pH. Recogimos 1 ml de suspensión en cada

muestreo y se centrifugó a 14000 rpm durante 15 minutos. El precipitado se congeló

inmediatamente a ‐80º C para la posterior extracción de ADN, y el sobrenadante se

filtró a través de 0,2 µm de diámetro de poro, congelándose a ‐80º C para el análisis de

los ácidos grasos de cadena corta.

4.3.4. Estudio de la microbiota fecal mediante PCR cuantitativa

Se investigaron los siguientes grupos microbianos: Atopobium (Atopobium‐

Collinsella), Bacteroides (Bacteroides‐Prevotella‐Porphiromonas), Enterobacteriaceae,

Enterococcaceae, Clostridia IX (Clostridium leptum‐ Faecalibacterium praustnitzii),

Clostridia IVa (Clostridium cocoides‐Eubacterium rectale) Bifidobacterium,

Lactobacillus y bacterias totales en los cultivos fecales incubados en anaerobiosis a

37ºC para cada uno de los puntos de muestreo (0, 6, 12, 24, 36, 48, 72 horas).

a. Cepas, condiciones de crecimiento y curvas estándar

Se realizaron distintas curvas estándar con las diferentes especies que se

indican en la Tabla 12 para cada grupo microbiano. Se cultivaron los microorganismos

entre 6 horas y toda una noche (dependiendo de su velocidad de crecimiento). Cuando

se obtuvo suficiente crecimiento (controlamos la densidad óptica) del microorganismo,

realizamos diluciones decimales y sembramos en medio sólido para hacer recuentos

que se expresaron como logaritmos decimales de las unidades formadoras de colonia

por mililitro (ufc/ml). Por otro lado, 1 ml de la suspensión bacteriana se centrifugó

para extraer el ADN del precipitado. Se realizaron 4 diluciones decimales del ADN

extraído para realizar las curvas de calibrado. La eficiencia de cada ensayo de PCR

viene determinada por la pendiente obtenida en la recta de calibrado.


113

Tabla 12. Especies bacterianas utilizadas para realizar las curvas estándar en la cuantificación de los diferentes grupos microbianos

Línea Origen Lactobacillus gasseri DSMZ 20077

Bifidobacterium longum CECT 4503 Clostridium coccoides DSMZ 7935 Clostridium leptum DSMZ 753

Bacteroides tetaiotaomicron DMSZ 2079 Collinsella intestinalis DSMZ 13280

Escherichia coli Colección NUTBRO Enterococcus faecalis DSMZ2478

b. Extracción del ADN

El ADN se extrajo a partir del precipitado bacteriano obtenido de la

centrifugación de 1 ml del cultivo fecal, mediante el kit para heces QIAmp de Qiagen

siguiendo las instrucciones del fabricante. El procedimiento de extracción del ADN

comprendió 2 etapas:

1‐ lisado de las células para la extracción del ADN

2‐ purificado del mismo mediante la adsorción de impurezas y diferentes

lavados una vez quedaba retenido en las columnas QIAamp.

c. Oligonucleótidos

Los primers fueron elegidos a partir de la bibliografía consultada (Tabla 14). Para

comprobar la especificidad, las secuencias fueron comparadas con las secuencias

disponibles en la base de datos BLAST (Gueimonde et al., 2004).

d. Amplificación

Los primers utilizados para la amplificación de cada grupo microbiano así como sus

condiciones de anillamiento y la referencia bibliográfica se presentan en la Tabla 13. La

amplificación se llevó a cabo empleando las condiciones experimentales que se

muestran en la Figura 18 para las siguientes etapas: desnaturalización, 40 ciclos de


114

desnaturalización y anillamiento y por último se realizó una curva de disociación para

comprobar que solamente obteníamos un único producto de amplificación.

Tabla 13. Oligonucleótidos utilizados en la investigación de la evolución de diferentes grupos microbianos a partir de un inóculo fecal.

Grupo bacteriano Primer Secuencia Tª

anillamiento Referencia

Atopobium cluster AtopgroupF GGGTTGAGAGACCGACC

55ºC Matsuki et al.,

2004 AtopgroupR CGGRGCTTCTTCTGCAGG

Lactobacillus LbF AGCAGTAGGGAATCTTCCA

60ºC Rinttila et al.,

2004

LGralR CATGGAGTTCCACTGTCCTC *

Enterococcus EnterocoF CCCATCAGAAGGGGATAACACTT

60ºC Matsuda et al., 2007 EnterocoR ACCGCGGGTCCATCCATC

Enterobacteriaceae EnterobacF TGCCGTAACTTCGGGAGAAGGCA

60ºC Matsuda et al., 2007 EnterobacR TCAAGGACCAGTGTTCAGTGTC

Bacteriodes‐Prevotella

BacteroF GAGAGGAAGGTCCCCCAC

60ºC

Layton et al., 2006

BacteroR CGCKACTTGGCTGGTTCAG Ramírez‐

Farias et al., 2009

Clostridia XIVa CloscoF CGGTACCTGACTAAGAAGC


2004 CloscoR AGTTTYATTCTTGCGAACG

Clostridia IV CloslepF TTAACACAATAAGTWATCCACCTGG

60ºC Ramírez‐

Farias et al., 2009 CloslepR ACCTTCCTCCGTTTTGTCAAC

Bifidobacterium Bif GATTCTGGCTCAGGATGAACGC

60ºC Gueimonde et

al., 2004 Bif CTGATAGGACGCGACCCCAT

Bacterias totales UniF GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA

60ºC Fuller et al.,

2007 UniR ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC

* diseñado en el IPLA

Figura 18. Condiciones de tiempo y temperatura para la amplificación de cada grupo microbiano.

95º C 95º C 55‐60º C

10 min 15 seg

60 seg

40 ciclos

AnillamientoDesnaturalizaciónDesnaturalización Disociación

95º C

60º C


115

4.3.5. Medida de pH

El pH se midió inmediatamente después de tomar las alícuotas para los análisis

de PCR y AGCC. Esta medida se realizo por triplicado realizando una medida directa

con el pH‐metro, en el tubo donde se produjo el crecimiento microbiano.

4.3.6. Análisis de ácidos grasos de cadena corta

Se realizó a partir de 1 ml de la suspensión bacteriana obtenida en cada punto

de muestreo (0, 6, 12, 24, 36 y 72 horas) que fue centrifugado a 14.000 rpm durante

15 minutos. Al sobrenadante se le adicionó 2 mg/L 2‐ etilbutírico (estándar interno) a

razón de 1:6,5 y posteriormente se filtró (0,22 µm) y se analizó por cromatografía de

gases (adaptado de Salazar et al., 2008).

El equipo utilizado fue en un cromatógrafo de gases (Agilent 7890A) con una

columna NukolTM (30 m x 0,25 x 0,25 µm), un detector de ionización de llama y un

inyector automático (7683B). Los diferentes ácidos orgánicos fueron identificados

según los tiempos de retención y las concentraciones fueron calculadas a partir de una

recta de calibrado para cada ácido graso. En Tabla 14 se recogen las condiciones

cromatográficas del método analítico empleado.

Los datos cromatográficos se procesaron con el software ALS Controller Utility de

Agilent Technologies. En la Figura 19 se muestra el cromatograma de los ácidos grasos

de cadena corta analizados a partir de la solución patrón de concentración 10 mM


116

Tabla 14. Condiciones cromatográficas para el análisis de AGCC

Parámetros instrumentales Condiciones

Método de elución Presión inyector constante

Flujos

Helio 25 ml/min. (gas portador)

Aire 400 ml/min.

Hidrógeno 30 ml/min.

Modo inyección Splitless

Volumen de inyección 2 µL

Columna NukolTM 30 m x 0,25 x 0,25 µm

Temperatura horno 80 °C

Rampa de temperatura 80 °C durante 5 min.

5 ºC/min. hasta 185 ºC

Temperatura inyector 220 °C

Temperatura detector 220 °C

Presión inyector 58.99 kPa

Figura 19. Cromatograma del multipatrón a concentración 10mM.

La recta de calibrado se preparó a partir de un multipatrón comercial Supelco de

AGCC (descrito en la Tabla 15) de concentración 10 mM. Por otro lado se prepararon

patrones individuales de ácido acético con mayor concentración, ya que las muestras

min12 14 16 18 20 22 24

pA

0

50

100

150

200

250

300

Acético (12.60)

Propionico

(13.96)

Isobutírico(14.80)

Butírico (16.46)

Isovalérico(17.34)

Valérico

(18.85)

Isocaproico(20.22)

Caprocico(21.10)

Heptanoico(23.56)

PI (19,27)


117

presentaron valores superiores a 10 mM. Las soluciones estándar de ácidos grasos

fueron procesadas igual que las muestras.

Tabla 15. Patrones de ácidos grasos utilizados para la elaboración de las rectas de calibrado Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 Patrón 6

Multipatrón 10 mM 5 mM 2 mM 1 mM 0,5 mM 0,25mM

Acético 200 mM 100 mM 50 mM 10 mM 5 mM 2 mM

4.3.7. Análisis estadístico.

Los resultados de la cuantificación de las poblaciones microbianas, de los ácidos

grasos de cadena corta y de la evolución del pH, se mostraron como media ±

desviación estándar y mediana. Para determinar la existencia de diferencias

estadísticamente significativas debidas a los diferentes ingredientes añadidos al medio

de cultivo o a la exposición del inóculo fecal a las fórmulas y leche materna, se realizó

el test de Kruskal Wallis, tras contrastar la normalidad (test de Shapiro Wilk) y la

homogeneidad de varianzas (Test de Levene). Por otro lado para comprobar posibles

correlaciones entre las diferentes variables estudiadas (grupos microbianos, ácidos

grasos y pH) se realizó el test de Sperman. El análisis estadístico se realizó utilizando el

paquete estadístico SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)


118

5. ESTUDIOS III y IV. ESTUDIOS IN VIVO

Con el objetivo de facilitar el diseño del estudio in vivo de la presente tesis, éste

se dividió en: comparación de la microbiota intestinal de lactantes procedentes de

diferentes regiones españolas alimentados con leche materna (estudio III), y

caracterización de la flora de lactantes mediante PCR cuantitativa (estudio IV) (Figura

8).

Para el estudio III se eligieron 20 participantes alimentados con leche materna

que también formaron parte del estudio IV. Se realizó la comparación de la microbiota

intestinal de lactantes alimentados con leche materna procedentes de dos regiones

españolas diferentes, Asturias y Murcia. En total se incluyeron 40 lactantes nácidos a

término (20 de cada región) mediante parto vaginal, que no hubieran recibido

tratamiento antibiótico (lactantes y madres) y cuya alimentación fuera exclusivamente

leche materna. El diseño del ensayo y la metodología llevada a cabo en ambas regiones

fue similar y se detalla en los siguientes apartados.

En el estudio IV se estudia la influencia de la alimentación (suero lácteo rico en

lactoalbúmina y nucleótidos) sobre la microbiota intestinal de lactantes tomando

como referencia la microbiota de los lactantes alimentados con leche materna. A

continuación detallamos el ensayo clínico correspondiente a este estudio, en el que

están incluidos los 20 participantes del ensayo III procedentes de la región de Murcia.

5.1. Ensayo clínico

Se realizó un ensayo clínico prospectivo, comparativo, doble ciego y aleatorizado

para las fórmulas objeto de estudio, realizado en paralelo en 3 grupos de individuos.

Se incluyeron en el estudio 61 recién nácidos a término y sanos, que cumplían los

criterios de inclusión (Tabla 16). Grupo FC: alimentados con fórmula de inicio

estándar, sin suplementar (n=14), Grupo FS, alimentados con fórmula rica en

ingredientes funcionales, (n=14) y Grupo LM, alimentados con leche materna (n=33).


119

El periodo de tratamiento fue de 12 semanas, iniciándose entre los días 8 y 14 de vida

del niño.

Para limitar la posibilidad de la aparición de desequilibrios en la asignación de

tratamientos, la aleatorización se realizó en bloques equilibrados de 4 individuos. Una

vez generada la secuencia de aleatorización, se prepararon sobres cerrados que

contenían una tarjeta con el código que indicaba el tipo de fórmula y que serviría para

identificar al participante. A los niños alimentados con leche materna se les asignó un

número para ser identificados junto a sus iniciales.

Tanto el participante como el pediatra desconocían la fórmula asignada a cada

individuo estando sólo en conocimiento del coordinador del proyecto la

correspondencia entre el número de aleatorización y el tipo de fórmula. Para asegurar

que las madres voluntarias no pudieran identificar los productos estudiados, las

fórmulas se envasaron en envases idénticos.

El análisis se realizó “por protocolo” teniendo en cuenta sólo a los participantes

que fueron alimentados, durante el periodo de estudio, exclusivamente con la fórmula

asignada en el proceso de aleatorización y acudieron al total de las visitas programadas

entregando muestras en cada una de dichas visitas.

5.2. Aspectos éticos y consentimiento informado

Este estudio se realizó de acuerdo con las Normas de Helsinki y las ICH Guidelines

establecidas en cuanto a la realización de estudios clínicos en seres humanos. Además,

siguió las directrices publicadas por la EFSA para la preparación y presentación de

aplicaciones, alimentos o ingredientes para autorización de propiedades saludables. El

estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital

Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia) y por el Comité Ético de la Universidad de

Murcia.


120

Los voluntarios que aceptaron participar en el estudio recibieron, para su lectura

y estudio y posterior firma, el “consentimiento informado” (Figura 20). Igualmente se

solicitó su autorización para incluir sus datos en un fichero sometido a las garantías de

Conforme al Proyecto de Ley de Servicios de la Sociedad de la Información y de

Comercio Electrónico (la LSSI‐CE) recientemente aprobado por el parlamento español

(LSSI 34/2002 11 julio artículo 21) y de la vigente Ley Orgánica 15 13/12/1999 de

Protección de Datos española.

Esta documentación fue aportada por el Servicio de Pediatría del Hospital

Universitario Virgen de la Arrixaca. Se programaron controles médicos coincidentes

con la toma de muestras de heces y sangre, así como con la recogida de información.

Durante el estudio se requirió que los lactantes no participaran en otro estudio, y

recibieron las fórmulas infantiles y la atención médica de forma gratuita. Todas las

madres participantes gozaban de buena salud y no tomaron medicación con agentes

antimicrobianos ni antifúngicos, ni con bismuto, laxantes u otros medicamentos que

pudieran suprimir la secreción ácido‐gástrica. No obstante, se les informó que podían

retirarse voluntariamente en cualquier momento del estudio o bien por cualquiera de

las siguientes causas:

‐ Cumplimiento insuficiente de los protocolos definido como: “No acude a las

visitas del estudio, no facilita los datos que se registran en diarios sobre la

alimentación/tolerancia, se permite que el bebé ingiera alimentos o

fórmulaciones distintas de las del estudio”.

‐ Vómitos, diarreas y/o constipación debido a una enfermedad diagnosticada.

‐ Aparición de alguna dolencia orgánica, sistémica o de otro tipo que pueda

dificultar la valoración de la respuesta del recién nácido a la formulación del

estudio.

‐ Cualquier enfermedad que exija un cambio en la dieta durante más de 24 horas.

‐ Administración de medicamentos.


121

Figura 20. Triptico informativo y consentimiento informado del ensayo clínico que fue proporcionado a las madres antes del comienzo del estudio.

En la Tabla 17 se muestran los criterios de inclusión y exclusión que se tuvieron

en cuenta para la participación en el estudio in vivo.


122

Tabla 16. Criterios de inclusión y exclusión del ensayo in vivo

Criterios de inclusión Criterios de exclusión

Consentimiento firmado por los padres y compromiso de completar los formularios, realizar la recogida de muestras y acudir a las visitas previstas en el estudio.

Niños alérgicos a la proteína de leche de vaca o con historia familiar de alergia a la proteína de leche de vaca.

No tener antecedentes familiares de intolerancia a la proteína de leche de vaca.

Parto mediante cesárea.

Recién nácidos a término. Edad gestacional 37‐42 semanas. Percentil al nacer en peso y altura entre 10 y 90. Test Apgar ≥ 8 a los cinco minutos del nacimiento.

Recién nácidos con episodios de diarrea desde el nacimiento.

Las madres lactantes tendrán buena salud, y no tomarán ninguna medicación con agentes antimicrobianos ni antifúngicos, laxantes o medicamentos que supriman la secreción ácido‐gástrica.

Recién nácidos con infecciones sistémicas o congénitas, desórdenes cardiacos, respiratorios, hematológicos y gastrointestinales.

Los padres están de acuerdo en no administrar al recién nácido ninguna mediación, suplementos minerales o vitamínicos (excepto vitamina D) y en alimentar al niño sólo con las fórmulas en estudio durante la duración del mismo.

Niños que han recibido suplementos de hierro, agentes antimicrobianos, medicación antifúngica, supositorios, medicamentos con bismuto o cualquier otra medicación que pudiera neutralizar o suspender la secreción ácido gástrica.

5.3. Reactivos, material y equipos de laboratorio PCR en tiempo real (cuantitativa).

‐ Master mix SYBR Green Ref. 4334368577G (Applied Biosystems, Madrid,

España)

‐ Agua para biología molecular Ref. W4502 (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ Cisteína (Sigma, Steinhein, Alemania)

‐ MRS broth CM 0359 Oxoid (Oxoid, Hamshire, England)

‐ Agar‐agar (Merck, Darmstadt, Germany)

‐ QIAmp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania)

‐ Etanol para Biología Molecular (Merck, Darmstadt, Alemania)

‐ Tubos Eppendorf de 1 ml y 2 ml (Daslab, Barcelona, España)

‐ Tubos 5 ml fondo cónico estériles (Deltalab, Barcelona,España).

‐ Puntas de pipetas QSP, 100,200 y 1000 (Bioline, London, UK)

‐ Placas de 96 twin.tec para PCR pocillos incoloros Ref. 0030128.575.

(Eppendorf Hamburgo, Alemania)

‐ Jarras de anaerobiosis 2,5 L (Biomereux, Marcy lEtoile, France).


123

‐ Láminas para el termosellado de placas (Applied Biosystem, Foster city,

USA)

‐ Termociclador Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster city, USA)

‐ Centrífuga 5415R (Eppendorf, Hamburg, Alemania)

‐ Autoclave (Selecta, Barcelona, España)

‐ Micropipetas (Thermo, Cambridge, Reino Unido)

‐ TissueRuptor y sondas(QIAGEN, Hilden, Alemania)

5.4. Participantes

Los participantes fueron reclutados en la unidad Materno‐Infantil del Hospital

Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia) durante la estancia de las madres tras el

parto. Los pediatras fueron los encargados de informar a los padres de los objetivos y

desarrollo del ensayo, entregándoles el tríptico informativo (Figura 20). Debido a que

en mayoría de los casos, la decisión de participar la tomaron una vez obtenida el alta

hospitalaria, previamente se les asignó y entregó, una de las fórmulas objeto de

estudio. Una vez tomada la decisión se les indicaba la fecha de la primera visita

durante la cual firmarían el consentimiento informado.

Para el desarrollo del ensayo clínico se programaron 4 visitas al pediatra durante

las cuales se realizaron las diferentes evaluaciones y se recogieron las muestras

fecales. En cada visita se les entregó el material de toma de muestras de heces para

que pudieran recogerlas en casa y entregarlas a los pediatras en la siguiente visita

programada. Igualmente, eran las pediatras las encargadas de entregarles la fórmula

asignada en cantidad suficiente para alimentar a sus bebés durante el periodo de

tiempo transcurrido entre visitas.

5.5. Fórmulas infantiles

Evaluamos dos fórmulas infantiles de inicio de la marca comercial Hero España S.A

ya descritas en las Tablas 6 y 7, una fórmula estándar sin suplementar con ingredientes


124

funcionales a la que llamamos Fórmula control (FC) y una fórmula suplementada con

alfa‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA a la que llamamos Fórmula suplementada (FS).

Como referencia se analizaron también las heces de recién nácidos cuya alimentación

fue exclusivamente leche materna (LM).

5.6. Recogida de las muestras fecales.

Las muestras de heces fueron recogidas el mismo día de la visita, aunque cuando

esto no fue posible, el niño fue estimulado por los pediatras durante la cita. La muestra

se almacenó a 4°C y se mantuvo en condiciones de esterilidad y anaerobiosis con el

material proporcionado por el pediatra hasta su recepción en el laboratorio (antes de 4

horas después de la recogida).

El transporte de las muestras al hospital se realizó en neveras portátiles y una vez

entregadas al pediatra, fueron codificadas con la identificación del sujeto

manteniéndose en las mismas condiciones de temperatura (4 °C). Se realizó el

transporte inmediato al laboratorio del Departamento de Nutrición y Bromatología de

la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia, lugar donde se congelaron a ‐

80 °C hasta la posterior realización de los análisis.

5.7. PCR cuantitativa

Se analizaron los siguientes grupos microbianos de 164 muestras fecales

pertenecientes a 61 lactantes pertenecientes a los tres grupos del estudio (FC, FS, LM):

Atopobium, Bifidobacterium, Bacteroides, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae,

Clostridia XIVa (C. coccoides), Clostridia IV (C. leptum), Lactobacillus y Staphylococcus.

El ADN extraído, se transportó al Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA‐CSIC)

para su posterior análisis.


125

5.7.1. Extracción de ADN

Las muestras fecales fueron congeladas a ‐80 ºC inmediatamente después de su

llegada al laboratorio y se conservaron así hasta su procesado para la posterior

extracción de ADN mediante el kit para heces QIAmp de Qiagen®. El procedimiento de

extracción del ADN se detalla en el apartado 4.3.4.2 del ensayo 2, en el que se estudia

la evolución de la microbiota fecal in vitro. Para el procesado de las muestras de heces,

0,2 g de muestra congelada, se mezclaron con 1,4 ml del tampón ASL del kit de

extracción, y se homogenizó con un Tissuerruptor durante un minuto. Una vez extraído

el ADN, se congeló a ‐80 ºC hasta la realización de la PCR cuantitativa.

5.7.2. Cepas, condiciones de crecimiento y curvas estándar

Las cepas utilizadas para el desarrollo de esta técnica se muestran en la Tabla

17. El crecimiento de las bacterias se realizó primero en un medio de cultivo sólido y a

partir de las colonias obtenidas, se inoculó un medio líquido para preparar la curva de

calibración. L. casei y B. longum fueron cultivadas en caldo MRS, E.coli en caldo BHI

(caldo cerebro‐corazón) y las demás bacterias en el medio de cultivo GAM (Gifu

Anaerobic Médium).

Tabla 17. Especies bacterianas utilizadas para preparar las curvas estándar para la cuantificación de los diferentes grupos microbianos

Línea Origen Lactobacilus casei Colección IPLA

Bifidobacterium longum NCC 2705Clostridium coccoides DSMZ 7935Clostridium leptum DSMZ 753

Bacteroides Tetaiotaomicron DMSZ 2079Collinsella intestinalis DSMZ 13280

Escherichia coli LH6 2072Enterococcus faecalis Colección IPLA

Staphylococcus epidermis Colección IPLA

Para la realización de las curvas de calibrado, se inoculó el microorganismo en

cuestión en el caldo de cultivo especificado anteriormente para cada microorganismo,


126

incubándose toda la noche. Al día siguiente se sembró en medio solido para realizar

recuentos, por otro lado se centrifugó 1ml de la suspensión bacteriana para extraer el

ADN. Se realizaron diluciones decimales a partir del ADN extraído de los cultivos puros

de los que previamente hicimos recuentos en placa. La extracción del ADN de los

cultivos puros, se realizó con el mismo kit de extracción de ADN utilizado para heces.

5.7.3. Oligonucleótidos y PCR cuantitativa

Para comprobar la especificidad de los primers se consultó la bibliografía y las

secuencias fueron comparadas con las secuencias disponibles en la base de datos

BLAST (Gueimonde et al., 2004). Los primers utilizados se muestran en la Tabla 18.

5.7.4. Condiciones de amplificación

Las muestras se analizaron en un volumen final de 25 μl, que contenía Power

SYBR® Green PCR Master Mix 1X, primers 0,2 μM y 1 μl de la muestra. Las reacciones

se llevaron a cabo en placas ópticas de 96 pocillos. Las condiciones de PCR fueron 10

minutos 95º C, 40 ciclos 15 s 95°C, 1 minuto Tª de anillamiento (correspondiente para

cada primer), curva de disociación, 15 segundos 95°C, T anillamiento 1 minuto, 15

segundos 95ºC. Todos los análisis se realizaron por duplicado y cuando el coeficiente

de variación era cercano a 10 se realizó un tercer análisis.

Calculamos la eficiencia de los ensayos de PCR cuantitativa mediante la siguiente

fórmula (Rinttila et al., 2004):

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡−=

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −

1101

slopeE


127

Tabla 18. Primers utilizados en PCR cuantitativa

Grupo bacteriano Primer Secuencia Tª

anillamiento Referencia

Atopobium cluster AtopgroupF GGGTTGAGAGACCGACC

55ºC Matsuki et al.,

2004 AtopgroupR CGGRGCTTCTTCTGCAGG

Lactobacillus LbF AGCAGTAGGGAATCTTCCA

60ºC

Rinttila et al., 2004

LGralR CATGGAGTTCCACTGTCCTC *

Enterococcus EnterocoF CCCATCAGAAGGGGATAACACTT

60ºC Matsuda et al.,

2007 EnterocoR ACCGCGGGTCCATCCATC

Enterobacteriaceae EnterobacF TGCCGTAACTTCGGGAGAAGGCA


2007 EnterobacR TCAAGGACCAGTGTTCAGTGTC

Bacteriodes BacteroF GAGAGGAAGGTCCCCCAC 60ºC Layton et al., 2006

BacteroR CGCKACTTGGCTGGTTCAG

Ramírez‐Farias et al., 2009

Clostridia XIVa CloscoF CGGTACCTGACTAAGAAGC


2004 CloscoR AGTTTYATTCTTGCGAACG

Clostridia IV CloslepF TTAACACAATAAGTWATCCACCTGG

60ºC Ramírez et al.,

2008 CloslepR ACCTTCCTCCGTTTTGTCAAC

Bifidobacterium Bif GATTCTGGCTCAGGATGAACGC

60ºC Gueimonde et al.,

2004 Bif CTGATAGGACGCGACCCCAT

Staphylococcus StaphyF ACGGTCTTGCTGTCACTTATA


2007 StaphyR TACACATATGTTCTTCCCTAATAA

* diseñado en el IPLA

5.8. Análisis estadístico.

Debido a que los grupos de estudio no siguieron una distribución normal (test

de Shapiro Wilk) y no cumplieron la condición de homogeneidad de varianzas (test de

Levene), se aplicaron pruebas no paramétricas para evaluar la influencia de la

alimentación en la composición de la microbiota fecal .Los resultados de la

cuantificación de las poblaciones microbianas en heces de lactantes se representaron

en diagramas de cajas. Se realizó el test de Kruskal Wallis sobre las medianas de los

tres grupos de estudio y múltiples test de Mann Witney por pares corrigiendo la

significación por el método de Bonferroni (α/n). Se repitieron las mismas pruebas para

analizar posibles diferencias en general sobre la microbiota debidas a la alimentación

recibida sin tener en cuenta los muestreos. Para contrastar los porcentajes de

muestras positivas para cada grupo microbiano en los tres grupos de estudio, se llevó a

cabo un test de Fisher. Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el

paquete estadístico SPSS para Windows (SPSS versión 15.0 Inc., Chicago, IL).

V. Resultados y Discusión

129

V. RESULTADOS Y DISCUSION

1. ESTUDIO I: Biodisponibilidad mineral in vitro. Captación, transporte y retención de

calcio, hierro y cinc mediante la línea celular Caco‐2.

1.1. Viabilidad y crecimiento de la línea celular Caco‐2

La viabilidad celular evaluada mediante la tinción con azul tripán puso de

manifiesto aquellas células con las membranas rotas y por lo tanto estaban muertas.

Esta prueba se realizó cada vez que se llevó a cabo un subcultivo, antes de congelar y

después de descongelar a fin de determinar la viabilidad que presentaban las células.

En todos los casos la viabilidad celular fue superior al 90 %.

La línea celular Caco‐2 fue mantenida en frascos de 75 cm2 hasta alcanzar el 70‐

80% de confluencia momento en que se realizó su subcultivo. Para poner de

manifiesto las modificaciones del crecimiento celular, se observó el cultivo al 2º, 5º y

7º día de postsiembra empleando un microscopio de contraste de fases (Figura 21a, b

y c).

La línea celular utilizada en este estudio mostró estar libre de micoplasmas en

los ensayos realizados (Figura 21d). La contaminación en cultivos celulares por

micoplasmas puede inducir efectos citogenéticos, disminución en las concentraciones

de nutrientes, alteración de la morfología celular, modulación de la respuesta inmune

e incluso interrupción del metabolismo celular (Rivera, Castillo y Sánchez, 2011).


130

Figura 21. Imagen de la línea celular Caco‐2 en diferentes días de postsiembra mediante microscopio de contraste de fases y observación del test de micoplasmas. a) 2 días de cultivo, b) 5 días de cultivo, c) 7 días de cultivo, d) ausencia de micoplasmas.

En una curva de crecimiento celular teórica se pueden observar tres fases, una

primera fase de latencia o adaptación al medio en la que las células no se dividen y

comienzan a adherirse al sustrato. En la segunda fase, llamada logarítmica, las células

se dividen con una alta tasa de crecimiento hasta llegar a una fase estacionaria en la

que ya no existe división celular y comienza la diferenciación.

Para realizar la curva de crecimiento se sembró una placa de 12 pocillos que se

mantuvo en cultivo durante 21 días. En la Figura 22 se muestra la curva de crecimiento

de la línea celular de este estudio, en ella se pueden diferenciar las dos últimas fases

de crecimiento, la exponencial del día 2 al 14 y la estacionaria del día 14 al 21,

resultados que coinciden con los obtenidos por Jovani et al., (2001) excepto que en

nuestro caso no se observó fase de latencia, debido a que nuestro primer punto de

muestreo fue el 2º día de postsiembra y las células ya se habían adaptado al medio.


131

Figura 22. Curva de crecimiento de la línea celular Caco‐2.

1.2. Diferenciación celular

El estado de diferenciación celular de la línea Caco‐2, se caracteriza por el

desarrollo de una monocapa de células polarizadas con un fenotipo absortivo en el que

destaca el borde en cepillo, con altos niveles de expresión de enzimas hidrolasas como

la fosfatasa alcalina y sacarasa‐isomaltasa (Pinto et al., 1983).

Figura 23. Imágenes de la monocapa en el microscopio electrónico de barrido (a: 5000X, b: 6000X)

Según Frontela et al., (2009ab), las células se encuentran diferenciadas tras 19‐

21 días de cultivo, por lo que decidimos realizar los ensayos en esta fase. Para

comprobar que, efectivamente las células se habían diferenciado en este tiempo, éstas

fueron sembradas en un cubre y se mantuvieron en cultivo hasta que se realizó la

a b


132

fijación de las mismas (19‐21 días) para su posterior observación al microscopio

electrónico de barrido. En la Figura 23 se muestran las imágenes tomadas y en ellas se

puede observar el desarrollo de las microvellosidades apicales.

1.3. Evaluación de la permeabilidad aparente: prueba rojo fenol.

La evaluación de la integridad de la monocapa se evaluó mediante la

determinación del paso transepitelial de rojo fenol, ya que esta molécula, sólo utiliza

como vía de transporte la ruta paracelular. Esta medida es importante, porque el

transporte mineral no sólo ocurre a través de la célula (vía transcelular), sino que

también sucede a través de los espacios intercelulares. Si la monocapa no se forma

correctamente y quedan espacios entre las células, el mineral atravesará el epitelio de

un modo que no permite el correcto estudio siendo incorrectos los datos que se

obtengan del ensayo.

Figura 24. a) Recta de calibrado de rojo fenol. b) Valores de la permeabilidad aparente en diferentes días de cultivo para evaluar la integridad de la monocapa.

Para realizar esta prueba, en primer lugar se construyó una recta de calibrado

con diferentes concentraciones de rojo fenol relacionándolas con un valor de

absorbancia a 560 nm (Figura 24a). A partir de esta recta se calculó la concentración de

rojo fenol de la cámara basolateral y la permeabilidad aparente, cuyos resultados se

muestran en la Figura 24b.

En los resultados de permeabilidad aparente se pudo observar como ésta va

disminuyendo conforme incrementan los días en cultivo, siendo el valor más bajo a los

Días en cultivo

Absorbancia (560nm)

Rojo Fenol (µM)

Permeabilidad Aparente (cm/s)

8 0,1749 3,56 2,02∙10‐4

12 0,1574 3,18 1,80∙10‐4

15 0,1222 2,42 1,37∙10‐4

18 0,1061 2,07 1,17∙10‐4

21 0,0663 1,20 6,82∙10‐5


133

21 días de postsiembra. Este descenso del paso del rojo fenol, indica una correcta

formación de las uniones intercelulares y por lo tanto una adecuada integridad de la

monocapa para poder realizar los experimentos de absorción mineral. Los resultados

obtenidos en el presente estudio, indican que la monocapa está correctamente

formada desde los 8 días hasta 21 días a los que la permeabilidad aparente es mínima

(6,82∙105 cm/s) y el porcentaje de rojo fenol que atraviesa la monocapa es del 0,12%.

En relación a estos resultados, hay autores que describen un descenso del paso de rojo

fenol desde el día siguiente a la siembra (24 ± 1%) hasta que se produce la confluencia

celular (6%) (Halleux & Schneider, 1991) y otros que determinan que en condiciones

óptimas de formación de la monocapa celular, el porcentaje del paso de ese

compuesto durante una hora de incubación con la solución de rojo fenol, debe ser: 0,6

% (Reeves et al., 1996) y 0,24 % (Ekmekcioglu et al., 1999).

Esta técnica para evaluar la integridad de la monocapa se relacionó con la

resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en diversos estudios y actualmente es este

método el más utilizado.

1.4. Ensayo de toxicidad de los ingredientes utilizados en este estudio. Ensayo MTT

Con el objetivo de comprobar que los ingredientes del presente estudio y las

soluciones patrón de los minerales empleados no eran tóxicos para las células se

evaluó la funcionalidad mitocondrial de la línea celular Caco‐2, mediante un test de

toxicidad (ensayo MTT) cuyos resultados se muestran en la Figura 25. El test se llevó a

cabo después de 21 días de cultivo y la exposición de la monocapa a cada una de las

muestras se realizó durante 1 hora, para simular las mismas condiciones a las que se

realizarán los experimentos con soluciones patrón de los tres minerales ensayados.

En todos los casos se obtuvieron valores de porcentajes de viabilidad celular

mayores del 90% a excepción de la solución de calcio con concentración 30 mM, que

mostró unos valores ligeramente inferiores. Estos resultados nos indican que los

ingredientes y las diferentes concentraciones de los minerales no son tóxicas para las

células Caco‐2 y por lo tanto pueden ser utilizadas en los ensayos.


134

Figura 25. Porcentaje de viabilidad celular para cada grupo de estudio tras el ensayo de toxicidad.

1.5. Ensayo 1: Evaluación de la disponibilidad mineral de soluciones patrón de

minerales. Efecto de los ingredientes de estudio.

El objetivo de este ensayo fue, evaluar el efecto de los diferentes ingredientes

de estudio (suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina y nucleótidos) en la disponibilidad

mineral. Para ello las células fueron sembradas sobre membranas semipermeables

insertas en pocillos bicamerales y finalizado el tiempo de exposición, el contenido

mineral de las células y de la cámara basolateral fue analizado para calcular el

porcentaje de retención, transporte y captación celular.

Fueron ensayadas dos concentraciones de una solución patrón de cada mineral

sobre los tres grupos de estudio: i) grupo control al que sólo se le añadió la solución

patrón del mineral, ii) grupo al que se le añadió la solución patrón y el preparado de

nucleótidos (Nuc) y por último iii) grupo al que se le añadió la solución patrón y el

suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina (SLα).

Los resultados obtenidos de la medida del contenido mineral de los

ingredientes ensayados en el presente trabajo (suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina y

0

20

40

60

80

100

120

Control Nuc SLα Fe 50 µM Fe 150µM Ca 10mM Ca 30 mM Zn 5 µM Zn 10µM

% Viabilidad


135

nucleótidos) se muestran en la Tabla 19. En ella podemos observar que la cantidad de

mineral aportada por los ingredientes era muy baja, por lo que no se tuvo en cuenta al

hacer los cálculos de los parámetros de disponibilidad mineral de las disoluciones

patrón de calcio, hierro y cinc ensayados.

Tabla 19. Valores medios y desviación estándar de los minerales analizados en los ingredientes de estudio

Nucleótidos Suero lácteo

Calcio µg/g ingrediente 31,79±0,71 388,85 ± 24,71

µg/ ml solución final 1∙10‐3±0,00 8,1∙10‐1± 5,2∙10‐2

Hierro µg/g ingrediente 24,27±5,01 24,56±5,10

µg/ ml solución final 8∙10‐4±2∙10‐5 5,2∙10‐2±1∙10‐2

Cinc µg/g ingrediente 25,11±0,77 2,69±0,09

µg/ ml solución final 8∙10‐4±0,00 5,6∙10‐3± 2∙10‐3

Los resultados de retención, transporte y captación del calcio y hierro se

muestran en la Tabla 20 y la Tabla 21 respectivamente, como valores medios y

desviación estándar de cada uno de los parámetros analizados o calculados.

1.5.1. Calcio

En la tabla 20 se puede observar que la cantidad de calcio retenido cuando se

utilizó una solución patrón a concentración 10 mM, fue mayor en las células a las que

se les añadió el preparado de nucleótidos (Nuc) que en las que fueron expuestas al

lactosuero rico en α‐lactoalbumina (SLα) o al grupo control (C) (21,31 µg/pocillo vs

7,69 y 7,25 µg/pocillo respectivamente). Como consecuencia, el porcentaje de

retención de calcio también fue mayor en las células a las que se les adicionó

nucleótidos, mostrando tanto la cantidad de calcio retenida como el porcentaje de

retención, diferencias significativas con respecto a los otros grupos. Sin embargo el

transporte de calcio fue menor en las células con mayor retención, mostrando el grupo

control un incremento significativo de calcio transportado y por lo tanto mayor

porcentaje de transporte comparado con los otros dos grupos de estudio. A partir de

los datos de calcio retenido y transportado se calculó el captado por las células,

obteniéndose los valores más altos para el grupo al que se le añadieron nucleótidos


136

respecto de los otros dos. Los resultados del porcentaje de captación observados en

este estudio cuando se añadieron a la monocapa 0,4 mg de calcio/pocillo, fueron

superiores a los obtenidos por Jovaní et al., (2001) que añadió 0,56 mg. La causa de la

gran diferencia entre estos valores podría ser atribuido a la metodología, ya que

nosotros utilizamos insertos bicamerales para estudiar retención, transporte y

captación y estos autores realizaron el ensayo en frascos por lo que sólo cuantificaron

el mineral retenido por las células expresado como mineral captado.

De los resultados del ensayo realizado con la concentración 30mM de calcio se

debe destacar que el porcentaje de calcio retenido, transportado y captado por las

células no aumentó con la cantidad añadida, sino que fue menor. Este hecho pudo ser

debido probablemente a una saturación del mecanismo de transporte transcelular del

calcio que también ocurrió en un ensayo de captación llevado a cabo por Frontela et al

(2009a) en el que añadió 2 mg de calcio a las células. La cantidad de mineral retenido y

el porcentaje de retención fueron similares para los tres grupos de estudio (control,

nucleótidos y α‐lactoalbúmina), sin embargo el porcentaje de calcio transportado fue

significativamente menor en el grupo al que se le añadió α‐lactoalbúmina.

Según los resultados obtenidos, parece ser que 10 mM es la concentración de

calcio óptima a la cual la disponibilidad del mineral, ensayada con soluciones patrón,

es más alta. Además, al estudiar la disponibilidad mineral de esta concentración, el

grupo de estudio al que se le añadió nucleótidos presentó un aumento significativo de

la captación del calcio. Actualmente, no hay estudios que corroboren estos resultados,

por lo que se plantea la necesidad de llevar a cabo más investigaciones a este respecto.

1.5.2. Hierro

Los resultados de la evaluación de retención, transporte y captación celular de

hierro a partir de soluciones patrón de este mineral, utilizando la línea Caco‐2 expuesta

a los ingredientes de estudio se muestra en la Tabla 21.


137

Los resultados obtenidos con la solución patrón 50µM, muestran diferencias

significativas en la cantidad de hierro retenido y el porcentaje de hierro retenido, entre

los tres grupos de estudio, siendo superiores los valores obtenidos por los grupos a los

que se les adicionó los ingredientes funcionales (SLα y Nuc). Los valores de hierro

transportado y su porcentaje fueron mayores en el grupo al que se le añadió α‐

lactoalbúmina aunque sin diferencias estadísticas respecto a los otros dos grupos. Este

hecho se pudo deber a la alta variabilidad encontrada entre las muestras. Los

parámetros de captación mineral, mostraron una tendencia similar a los parámetros

de transporte. Por lo tanto podemos afirmar que los ingredientes evaluados en las

concentraciones del estudio mejoran la disponibilidad del hierro.

Para la concentración 150 µM no encontramos ninguna diferencia significativa

en los parámetros estudiados aunque de nuevo, se observaron valores mayores para la

retención, transporte y captación en el grupo expuesto al concentrado proteico. Los

valores encontrados en los otros dos grupos (control y nucleótidos) fueron similares.

En este sentido, Sändstrom et al., (2008) observaron un incremento en la absorción de

hierro en niños alimentados con fórmulas ricas en α‐lactoalbúmina (25%) respecto de

los alimentados con fórmulas estándar. Por otro lado, Kamau et al., (2010)

describieron que los péptidos resultantes de la hidrólisis in vitro o in vivo de la proteína

α‐lactoalbúmina eran capaces de unir minerales y por lo tanto de actuar de

transportadores.

La cantidad y el porcentaje de hierro retenido, transportado y captado fue

mayor cuando añadimos la solución patrón con concentración más alta, excepto para

el porcentaje de captación en el grupo al que se le añadió nucleótidos, cuyos valores

resultaron similares para las dos concentraciones ensayadas. Frontela et al., (2009a),

en un ensayo de captación en frascos de cultivo, evaluaron una cantidad de hierro

intermedia a las ensayadas en el presente trabajo observando una porcentaje

captación mineral de (16,9%) inferior al obtenido en nuestro estudio con cualquiera de

las dos concentraciones ensayadas (22,01‐27,03%).


138

En un estudio realizado en lactantes en los que se evaluó una fórmula infantil

suplementada con nucleótidos, no observaron una mejora del estatus de hierro

(Hernell y Lönnerdal 2002)

1.5.3. Cinc

Los resultados obtenidos con las soluciones patrón de cinc no se pueden reflejar

numéricamente en este estudio debido a que los valores observados en las monocapas

empleadas como blanco presentaron unos elevados niveles de cinc, similares a las

células expuestas a las diferentes soluciones patrón. Nosotros atribuimos la causa, de

detectar niveles tan bajos, a la pequeña cantidad de cinc añadida a las células. Esta

situación ha sido igualmente descrita en un ensayo llevado a cabo por Jovaní et al.,

(2001) con soluciones patrón y en los que evalúan la captación. Sin embargo cuando

realizan estos ensayos con fórmulas infantiles si logran cuantificar la cantidad de cinc

por lo que concluyen que son diversos los factores dietéticos que deben intervenir en

la disponibilidad este mineral, entre ellos la matriz del alimento

Tabla 20. Retención, transporte y captación celular a partir de soluciones patrón de diferentes concentraciones de Calcio (10 y 30 mM) en los tres grupos de estudio.

Solución patrón (mM)

Mineral añadido

(mg/pocillo)

Mineral retenido

(µg/pocillo)

Retención (%)

Mineral transportado(µg/pocillo)

Transporte (%)

Mineral captado

(µg/pocillo)

Captación (%)

Control 10 0,4 7,25±1,53b 1,81±0,38b 16,16±0,56a 4,04±0,14a 23,41±2,07ab 5,85±0,52ab

30 1,2 17,99±4,14 1,50±0,34 22,36±4,47a 1,86±0,37a 40,35±7,89 3,36±0,66

Nucleotidos 10 0,4 21,31±4,79a 5,33±1,20a 8,72±1,33b 2,18±0,32b 30,04±5,48a 7,51±1,37a

30 1,2 23,29±1,83 1,94±0,16 17,25±1,83b 1,43±0,15a 40,54±3,40 3,37±0,28

α‐

lactoalbúmina

10 0,4 7,69±0,70b 1,92±0,17b 9,52±3,24b 2,38±0,81b 17,21±3,18b 4,31±0,80b

30 1,2 19,33±3,92 1,61±0,33 10,54±1,53b 0,88±0,09b 29,87±5,00 2,49±0,59

a,b,c Diferentes letras en la misma columna para cada concentración mineral, indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).


139

Tabla 21. Retención, transporte y captación celular a partir de soluciones patrón de diferentes concentraciones de Hierro (50 y 150 µm) en los tres grupos de estudio

Solución

patrón (µM)

Mineral añadido

(µg/pocillo)

Mineral retenido

(µg/pocillo)

Retención (%)

Mineral transportado(µg/pocillo)

Transporte (%)

Mineral captado

(µg/pocillo)

Captación (%)

Control 50 2,8 0,19±0,03c 6,73±1,09c 0,43±0,12 15,27±4,26 0,62±0,13 22,01±4,82

150 8,4 0,56±0,03 6,69±0,39 1,71±0,37 20,33±4,36 2,27±0,38 27,03±4,49

Nucleótidos 50 2,8 0,37±0,01a 13,27±0,47a 0,40±0,05 14,16±1,87 0,77±0,06 27,43±2,17

150 8,4 0,55±0,11 6,54±1,26 1,79±0,36 21,37±4,24 2,34±0,26 27,91±3,13

α‐

lactoalbúmina

50 2,8 0,28±0,01b 10,05±0,02b 0,52±0,10 18,43±3,74 0,80±0,10 28,62±3,63

150 8,4 0,67±0,14 7,96±1,71 2,42±0,33 28,87±3,95 3,09±0,47 36,83±5,65

a,b,c Diferentes letras en la misma columna para cada concentración mineral, indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).


140


141

1.6. Ensayo 2: Evaluación de la biodisponibilidad mineral de una fórmula infantil

suplementada con ingredientes funcionales

La disponibilidad mineral se evaluó tras simular una digestión gastrointestinal y

añadiendo la fracción soluble acondicionada a la línea celular Caco‐2, sembrada en un

sistema bicameral. De esta forma se calculó el mineral retenido, transportado y

captado para estimar la eficiencia de transporte y captación.

1.6.1. Calcio

En la Tabla 22 se presentan los resultados obtenidos sobre la disponibilidad del

calcio de las tres muestras estudiadas (Leche materna: LM, Fórmula control: FC,

Fórmula suplementada: FS)

En dicha Tabla, se puede observar que la cantidad de calcio de la leche materna fue

significativamente inferior (p<0,05) a la de las fórmulas de inicio. Aunque, los valores

de la concentración de calcio en la leche materna, obtenidos en el presente trabajo

(28,00 ± 3,00 mg/100ml) fueron similares a los obtenidos en los estudios realizado por

Roig et al., (1999) (29,0 ± 1,4 mg/100ml)) y Bosscher (2001a) (27,0 ± 0,6 mg/100ml)).

Sin embargo, la solubilidad de calcio obtenida en este estudio (25,28 ± 0,99) resultó ser

más baja que la publicada en un trabajo llevado a cabo por Roig et al., (1999) (69,4 ±

2,0%). Esta diferencia es probablemente debida a la metodología utilizada, ya

que la incubación de la fase gástrica en nuestro estudio fue a pH 4 (para niños

menores de seis meses) y esos autores utilizaron la pH 2 (para adulto), provocando

este pH más ácido un aumento en la solubilidad mineral (Bosscher et al., 2001b).

Como consecuencia de la menor cantidad de calcio de la leche materna respecto de

las fórmulas, también se obtuvo una baja cantidad de calcio en su fracción soluble

(p<0,05). Sin embargo cuando calculamos el porcentaje de solubilidad resultó ser

similar en las tres muestras (LM: 25.28%, FC: 27.15%, FS: 23.41%). Los valores

obtenidos para el porcentaje de solubilidad fueron menores que los observados por

otros autores (Roig et al., 1999; Perales et al., 2005). Este hecho pudo deberse al


142

método empleado, ya que en nuestro caso la metodología de digestión in vitro incluye

algunas modificaciones adaptadas a las condiciones intestinales de niños menores de 6

meses. En este sentido Bosscher et al., (2001b) realizaron un estudio en condiciones

similares a las nuestras y concluyeron que la disponibilidad mineral varía con el pH

utilizado en la digestión gástrica e intestinal y con el tiempo de incubación. Además,

Perales et al., (2007) remarcaron la dificultad de comparar sus resultados con otros

debido a diferencias en la metodología, cantidad de enzimas, valores de pH y tiempos

de incubación en la digestión gástrica e intestinal e incluso variaciones en la velocidad

de centrifugación en el caso de la solubilidad.

Partiendo de los datos anteriores la cantidad de calcio añadida a la monocapa de

células, a partir de la leche materna fue inferior que en el caso de la fórmulas

infantiles. La cantidad de calcio retenido a nivel de la monocapa mostró diferencias

estadísticamente significativas entre la leche materna y las fórmulas infantiles,

presentando la leche materna los valores más altos (LM: 4,94±1,13, FC: 1,80±0,80 y FS:

2,69±0,61 µg). Estos resultados también se reflejaron en los porcentajes de retención,

presentando la leche materna unos valores nueve veces superiores a los mostrados

por las fórmulas infantiles. Por otro lado, comparando las dos fórmulas infantiles,

pudimos observar que, aunque sin diferencias estadísticamente significativas, la

fórmula infantil suplementada (FS) presentó unos valores mayores en la retención

celular del mineral.

La cantidad de calcio transportado fue similar en las tres muestras, pero cuando

calculamos el porcentaje de calcio transportado, observamos diferencias

estadísticamente significativas entre los tres grupos, mostrando la leche materna los

valores más altos (20,36%), seguidamente la fórmula suplementada (11,47%) y por

último la fórmula control (7,08%). Los valores de calcio retenido y el porcentaje de

transporte de calcio para las fórmulas fueron superiores a los encontrados por Perales

et al., (2005). Sin embargo la cantidad de mineral transportado y la eficiencia de

transporte para la fórmula control (FC) resultaron ser similares.


143

Los valores del porcentaje de captación celular de calcio fueron

significativamente (p<0,05) más altos en la leche materna (32,79%) respecto a las

fórmulas infantiles. Además, encontramos diferencias estadísticas entre las dos

fórmulas, siendo inferiores en la fórmula control (FC: 8,97%, FS: 15,33%). Los valores

de captación de este estudio fueron superiores a los obtenidos por en un estudio

similar llevado a cabo por Perales et al., 2005 en fórmulas infantiles utilizando la línea

celular Caco‐2.

En otro estudio llevado a cabo por los mismos autores, se observó que en leche

enriquecida con calcio, se obtienen porcentajes de captación celulares similares a los

encontrados en nuestro estudio para la fórmula control (Perales et al., 2006b).

Nuestros resultados relacionados con el porcentaje de transporte de calcio en

la leche materna siguen la misma tendencia que los observados por Roig et al., en

1999 en estudios de dializabilidad. No obstante es necesario tener en cuenta que

aunque ambas metodologías son una medida de disponibilidad mineral, los resultados

no son directamente comparables.

En último lugar se calcularon la eficiencia del transporte y de la captación

celular de calcio teniendo en cuenta la solubilidad. En este sentido, pudimos observar

una mayor eficiencia de transporte de calcio en la leche materna respecto a ambas

fórmulas de inicio. Sin embargo las dos fórmulas no mostraron diferencias

significativas entre ellas.

Según estos resultados, en relación a la disponibilidad del calcio se debe

destacar la superioridad de la leche materna respecto a las fórmulas infantiles aunque

los valores obtenidos en los parámetros de disponibilidad de la fórmula suplementada

fueron superiores y por lo tanto más parecidos a los de la leche materna.

Tabla 22. Retención, transporte y captación celular de calcio en los tres grupos de estudio.

a,b,c Diferentes letras en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05)

Leche Materna (LM) Fórmula Control (FC) Fórmula Suplementada (FS)

Concentración calcio: (mg/ ml)

0,28±0,03 0,50± 0,06 0,44± 0,01

Fracción soluble (mg/ ml) 0,07±0,004 0,14±0,003 0,10±0,004

Solubilidad % 25,28 ±0,99 27,15 ± 1,5 23,41 ± 2,2

Mineral añadido (mg) 0,04 0,09 0,07

Mineral retenido (µg) 4,94±1,13a 1,80±0,82b 2,69±0,61b

Retención % 12,44±2,84a 1,89±0,86b 3,86±0,88b

Mineral transportado (µg) 8,09±1,16 6,75±1,75 7,99±0,91

Transporte % 20,36±2,92a 7,08±1,84c 11,47±1,31b

Mineral captado(µg) 13,03±1,33a 8,55±1,45c 10,68±1,22b

Captación % 32,79±3,35a 8,97±1,52c 15,33±1,74b

Eficiencia de transporte % (ET) 5,15±0,74a 1,92±0,50b 2,68±0,30b

Eficiencia de captación % (EC) 8,29±0,85a 2,44±0,41c 3,59±0,41b


144


145

1.6.2. Hierro

En la Tabla 23 se presentan los resultados obtenidos para la retención, transporte y

captación de hierro mediante el empleo de la línea celular Caco‐2, se muestra

igualmente la estimación de la disponibilidad a través de los valores de las eficiencias

de transporte y captación.

La leche materna mostró un contenido en hierro muy bajo (0,42 µg/ml) respecto a

las fórmulas infantiles (6,76‐7,32 µg/ml), en este sentido son muchos los estudios que

describen que la leche humana es deficiente en hierro. La concentración de hierro de

la leche materna de nuestro estudio (lactancia 2‐4 meses), se encontraron dentro del

rango publicado por Picciano (2001) para leche materna madura (0,3‐0,9 mg/L) y

además fue similar a la obtenida por Rodríguez‐Rodríguez, Sanz‐Alaejos y Díaz‐Romero

(1999). La solubilidad de este mineral no mostro diferencias estadísticamente

significativas entre los tres grupos estudiados (LM, FC y FS).

Los parámetros de disponibilidad mineral estudiados no pudieron ser evaluados en

el caso de la leche humana debido a su bajo contenido en hierro. Ya que la cantidad

final de hierro añadida a la cámara apical fue tan baja (0,23 µg) que los resultados

obtenidos a partir las células expuestas eran parecidos a los obtenidos en las

monocapas utilizadas como blanco (no expuestas).

De esta forma, sólo pudimos comparar las dos fórmulas infantiles estudiadas (FC y

FS), cuyo contenido en hierro y la solubilidad de dicho mineral fue similar en ambos

casos. No se encontraron diferencias significativas (p<0.05) en la retención, transporte

y captación del mineral, ni en la eficiencia de transporte y captación entre las dos

fórmulas infantiles estudiadas. Los resultados obtenidos en este estudio fueron en

todos los casos superiores a los obtenidos por Perales et al., (2007) en fórmulas

infantiles con la misma fuente hierro (sulfato de hierro). La metodología semejante en

ambos estudios, a excepción de los valores de pH gástrico (4 vs. 2).

Tabla 23. Retención, transporte y captación celular de hierro en los tres grupos de estudio.

nd: no detectado. a, b, c Diferentes letras en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).


Concentración hierro: (µg/ ml)

0,42 ± 0,03 7,32 ± 0,09 6,76 ± 0,18

Fracción soluble (µg/ ml) 0,41 ± 0,02 7,32 ± 0,55 6,90 ± 0,98 Solubilidad % 99,11 ± 4,70 99,93 ± 5,60 102,10 ± 5,40

Mineral añadido (µg) 0,23 5,15 4,7

Mineral retenido (µg) nd 0,47 ± 0,12 0,40 ± 0,08

Retención % nd 9,10 ± 2,30 8,54 ± 1,60

Mineral transportado (µg) nd 0,39 ± 0,11 0,37 ± 0,09

Transporte % nd 7,57 ± 2,16 7,79 ± 1,97

Mineral captado (µg) nd 0,86 ± 0,17 0,74 ± 0,08 Captación % nd 16,67 ± 3,35 15,62 ± 1,64

Eficiencia de transporte (ET)% nd 7,57 ± 2,16 7,94 ± 2,02

Eficiencia de captación (EC)% nd 16,65 ± 3,35 15,95 ± 1,66


146


147

1.6.3. Cinc

Los resultados de disponibilidad in vitro de cinc se resumen en la Tabla 24. En ella

podemos observar el bajo contenido de este mineral obtenido en la leche materna

(LM) respecto a las fórmulas infantiles (FC y FS). La concentración de cinc en la leche

materna de este estudio (1.51 µg/ml) resultó ser inferior a la encontrada por

Rodríguez, Sanz‐Alaejos y Díaz‐Romero (1999) y superior a la publicada por Bosscher et

al., (2001)

En este sentido, debemos destacar que aunque en la declaración nutricional del

fabricante sobre el contenido de cinc en las dos fórmulas era el mismo (FC y FS: 5,67

µg/ml), el análisis en nuestro laboratorio mostró valores inferiores de cinc en la

fórmula suplementada que en la fórmula control (FC: 6,04±0,07 vs FS: 3,86±0,09

µg/ml).

El porcentaje de solubilidad de cinc de la leche materna fue significativamente

superior (p<0.05) que el de las fórmulas infantiles. Aunque estos valores nos indican

accesibilidad del mineral y no disponibilidad y además, no siempre un aumento de

solubilidad va acompañado de un aumento de su disponibilidad. Si fue así en nuestro

estudio ya que observamos un aumento significativo de todos los parámetros de

disponibilidad mineral en la leche materna respecto a los otros dos grupos de estudio

(FC y FS).

Los resultados obtenidos en los porcentajes y eficiencias de transporte y captación

de cinc para la fórmula control se correspondieron con los obtenidos por Perales et al.,

(2006) en fórmulas infantiles de inicio. Sin embargo, la fórmula suplementada presentó

un aumento significativo en los porcentajes de retención (LM: 14,06±3,12 FC:

2,84±0,52, y FS: 9,81±1,67%) y de captación de cinc (LM: 35,16±2,76 FC: 13,59±2,47, y

FS: 20,73±1,14%) y además en los valores de la eficiencia de captación (LM: 35,16±2,76

FC: 13,59±2,47, y FS: 20,73±1,14), acercándose la disponibilidad de cinc de esta

fórmula infantil a la de la leche materna.

Tabla 24. Retención, transporte y captación de cinc en los tres grupos de estudio.

Diferentes letras en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).


Concentración de cinc (µg/ ml)

1,51±0,63 6,04±0,07 3,86±0,09

Fracción soluble (µg/ ml) 1,10±0,01 3,82±0,24 2,31±0,25

Solubilidad % 72,59±3,42a 63,19±3,29b 60,02±2,89b

Mineral añadido (µg) 0,64 2,68 1,58

Mineral retenido (µg) 0,09±0,02b 0,08±0,01b 0,15±0,02a

Retención % 14,06±3,12a 2,84±0,52c 9,81±1,67b

Mineral transportado (µg) 0,13±0,02b 0,28±0,07a 0,18±0,02b

Transporte % 21,09±3,87a 10,75±2,41b 11,31±1,54b

Mineral captado (µg) 0,22±0,02 a 0,36±0,07 b 0,33±0,02 b

Captación % 35,16±2,76a 13,59±2,47c 20,73±1,14b

Eficiencia de transporte % (ET) 15,31±2,81a 6,80±1,55b 6,79±0,93b

Eficiencia de captación % (EC) 25,52±2,00a 8,60±1,56c 12,44±0,69b


148


149

Para evaluar la interacción que pude existir entre los diferentes minerales

estudiados, se llevó a cabo un análisis de correlación de Pearson a partir del cuál

se obtuvieron algunas diferencias estadísticas que es importante mencionar. En

primer lugar, se observó una correlación negativa entre la cantidad de calcio

añadida y todos los parámetros de disponibilidad evaluados para este mineral

(ET; r=‐0,909, p= 0,000; EC r=‐0,933, p=0,000). Este hecho era previsible ya que,

como se ha mencionado anteriormente los mecanismos de transporte del calcio

a nivel intestinal, son saturables. También debemos señalar una relación

negativa de la cantidad de calcio añadida sobre los porcentajes de retención (r=‐

0,920, p=0,000), transporte (r=‐0,793, p=0,000) y captación (r=‐0,950, p=0,000)

celulares de cinc, y sobre las eficiencias de transporte y captación del mismo (r=‐

0,803, p=0,000 y r=‐0,950, p=0,000 respectivamente). Este hecho ha sido descrito

también por Perales et al., (2006) y Frontela et al., (2009a) en ensayos con

metodología y muestras similares, en el que encontraron que el calcio ejerce un

efecto negativo sobre la disponibilidad del cinc. Por otro lado, todos los

parámetros de disponibilidad de calcio, considerando también su porcentaje de

solubilidad, estuvieron negativamente correlacionados con la solubilidad de

hierr, así como con los parámetros celulares de disponibilidad calculados, esta

tendencia también fue observada por et al., (2009a) en un estudio de

disponibilidad mineral de papillas infantiles utilizando la línea Caco‐2.

Tanto la cantidad de hierro añadida a las células Caco‐2, como su

solubilidad resultaron ejercer un efecto negativo sobre todos parámetros de

disponibilidad del cinc (ET: r=‐0,914, p=0,000 y EC: r=‐0,973, p=0,000), lo cual

demuestra la interacción existente entre los diferentes minerales debido,

probablemente, a que comparten rutas y factores de absorción y transporte a

nivel intestinal (Lind et al., 2003)

Por otro lado, observamos una relación negativa entre la cantidad de cinc

añadida a la monocapa y todos los parámetros de medida de su disponibilidad

estudiados.Este hecho no se puede atribuir a una saturación en los


150

transportadores del mineral ya que la mayor disponibilidad de este mineral la

presentó la leche materna que a su vez mostró el contenido más bajo en cinc.

1.7. Evaluación de la morfología de las células Caco‐2 expuestas a dos

concentraciones de nucleótidos.

En la Figura 26 se presentan las imágenes obtenidas en el examen de la

monocapa celular con el microscopio electrónico de barrido tras exponer a

dichas células a diferentes concentraciones de un preparado de nucleótidos. La

Figura 26 a) corresponde al grupo control (C), el cual no fue expuesto a estos

compuestos, la 26 b) al grupo expuesto a 32 mg/L (Nuc32) y por último la 26 c) al

grupo expuesto a 72 mg/l (Nuc 72).

Figura 26. Imágenes de las células al microscopio electrónico de barrido a) sin exposición a nucleótidos, b) exposición 32 mg/L y c) 72 mg/L.

c)

b)

a)


151

Como se puede observar en dicha Figura los grupos a los que se les expuso

al preparado de nucleótidos presentaron mayor densidad de microvellosidades

respecto al grupo control. Estos resultados eran de esperar ya que son varios los

autores que afirman una mayor maduración de las células intestinales debida a la

suplementación con nucleótidos. En este sentido LeLeiko et al., (1995)

demostraron que la dieta suplementada con nucleótidos afectaba a la expresión

génica de la enzimas gastrointestinales.

Por otro lado, estudios realizados en animales observaron que una dieta

exenta de nucleótidos producía menor cantidad de proteína, DNA, RNA, y menor

actividad de disacaridasas en el intestino. Sin embargo, los animales que fueron

alimentados con una dieta suplementada con nucleótidos presentaron mayor

contenido proteico y de ácidos nucleicos en el intestino, así como mayor altura

de vellosidades y mayor actividad maltasa (Uauy et al., 1990; López‐Navarro et

al., 1996)


152

2. ESTUDIO II: Evaluación de la actividad funcional de una fórmula infantil

suplementada y de sus ingredientes.

2.1. Ensayo 1: Estudio preliminar. Crecimiento de diferentes especies

bacterianas intestinales expuestas a los ingredientes en el estudio.

El objetivo principal de este ensayo fue realizar un estudio preliminar del

efecto que ejercen los ingredientes en el estudio sobre diferentes bacterias

intestinales. Se realizaron las curvas de crecimiento de las siguientes especies

bacterianas, Lactobacillus gasseri, Bifidobacterium longum y Escherichia coli. Se

evaluaron dos concentrados proteicos de suero lácteo: uno rico en α‐

lactoalbúmina (SLα) y otro rico en β‐lactoglobulina y glicomacropéptidos (SLβ);

así como dos concentraciones de un preparado de nucleótidos (32 y 72 mg/L)

para añadirlo a fórmulas infantiles. Estos ingredientes también se evaluaron

después de haberlos sometido a una digestión gastrointestinal in vitro.

Todas las curvas de crecimiento se realizaron a partir de los recuentos

realizados en placa en cada punto de muestreo (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 24

horas) mediante el modelo matemático de Gomperzt con el programa DMfit,

por lo que las representaciones gráficas se refieren a los datos ajustados. A

partir del ajuste de estas curvas pudimos obtener tres parámetros que definen

el crecimiento bacteriano: i) La fase de adaptación (λ) que, como su propio

nombre indica, es el tiempo que tarda la bacteria en adaptarse al medio en el

que va a crecer. ii) La tasa de crecimiento especifico (µ), que es la velocidad con

la que se divide, y por último, iii) la concentración máxima (MR) que alcanza

dicha bacteria en las condiciones del estudio.


153

a) Curvas de crecimiento de los diferentes microorganismos expuestos a los

concentrados proteicos

En la Figura 27 se presentan los resultados ajustados en el crecimiento de

Lactobacillus gasseri, expuesto a los diferentes concentrados proteicos (SLα y

SLβ) antes y después de la digestión, así como los parámetros cinéticos

obtenidos a partir de las curvas crecimiento.

Figura 27. Curvas de crecimiento de L. gasseri expuesto a los diferentes concentrados proteicos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).

En esta Figura se puede apreciar que a partir de las 6 horas de crecimiento,

los grupos expuestos a los concentrados proteicos mostraron los valores más

altos y los mantuvieron durante toda la fase estacionaria. Concretamente, los

grupos SLα dig, SLβ y SLβ dig alcanzaron concentraciones del microorganismo

superiores a los otros dos grupos (Control y SLα). Respecto a los valores

obtenidos para los parámetros cinéticos, no se encontraron diferencias

Lactobacillus gasseri

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25

Log

ufc/

ml

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

Control SLα SLα dig SLβ SLβ digλ 3,07±0,46 2,77±0,14 2,84±0,13 3,16±0,44 2,56±0,32µ 0,50±0,09 0,59±0,03 0,48±0,01 0,60±0,12 0,52±0,01MR 9,16±0,02b 9,27±0,10b 9,5 ±0,04a 9,59±0,02a 9,55±0,02a

R2 0,988 0,997 0,998 0,990 0,992

Control SL α SL α dig SL β SL β dig


154

significativas en la fase de adaptación y tampoco en la tasa de crecimiento. Aún

así, pudimos apreciar menor tiempo de adaptación y mayor tasa de crecimiento

cuando expusimos al microorganismo a los dos concentrados proteicos sin

digerir (SLα y SLβ). Las tasas de crecimiento encontradas para este

microorganismo son similares a las descritas por Cardelle‐Cobas et al., (2011) y

Corzo‐Martínez et al., (2012) para Lactobacillus reuteri cultivado en MRS con

lactosa en el primer caso y con glucosa en el segundo caso.

Por otro lado, se observaron diferencias estadísticas entre los grupos

estudiados para los máximos recuentos encontrados. La concentración

bacteriana fue significativamente superior en los grupos SLα digerido, SLβ y SLβ

digerido respecto del grupo control y del SLα sin digerir

En la Figura 28 se representan las densidades ópticas para cada punto de

muestreo en los grupos de estudio. Cabe destacar la alta densidad óptica que

alcanzaron los grupos a los que se les añadió los concentrados proteicos

digeridos o sin digerir, respecto al grupo control. No obstante, este resultado no

se reflejó, en la misma medida, en el recuento de viables. En este sentido es

necesario tener en cuenta que la absorbancia es una medida de turbidez y no

sólo varía con el crecimiento microbiano en sí, sino también con los productos

del metabolismo bacteriano. Este hecho conduce a pensar que los concentrados

proteicos provocan que L. gasseri produzca alguna sustancia que es la

responsable de tan alta turbidez. Una hipótesis que nos planteamos es que esa

sustancia puede ser un exopolisácarido. De ser así, lo consideraríamos un buen

resultado puesto hay estudios recientes que muestran su influencia en la

capacidad de adhesión de bacterias probióticas y patógenas (Ruas‐Madiedo et

al., 2006) y también se ha demostrado, la actividad prebiótica de determinados

exopolisacaridos producidos por diferentes microorganismos (Salazar et al.,

2008). Otra hipótesis podría ser que el crecimiento de este lactobacilo, provoque

un descenso en el pH del medio provocando que las proteínas precipiten.

Debido a estos resultados, estimamos que no debíamos caracterizar el


155

crecimiento de esta bacteria con el parámetro de absorbancia por lo que no se

realizó tampoco un análisis estadístico de estos resultados.

Figura 28: Representación del incremento de densidad óptica para el crecimiento L. gasseri en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio.

Brück, Graverholt y Gibson (2003b) realizaron un estudio in vitro,

evaluando la evolución de la microbiota de un inóculo fecal expuesto a leche

materna, o a fórmula infantil suplementada, con α‐lactoalbúmina o

glicomacropéptidos, observando que dichas proteínas, sometidas a digestión in

vitro, producían un incremento en el crecimiento de lactobacilos.

Corzo‐Martínez et al., (2012) evaluaron el crecimiento de diferentes

bacterias lácticas expuestas a conjugados de proteínas e hidratos de carbono

previamente sometidos a digestión. Estos autores no observaron crecimiento en

ninguno de los microorganismos estudiados cuando la única fuente de carbono

fue la β‐lactoglobulina. Del mismo modo, observaron que los digeridos de

glicoconjugados con galactosa fueron fermentados de modo significativo por

Bifidobacterium y Lactobacillus.

El pH fue medido en cada punto de muestreo y en la Figura 29 se

representan las unidades de pH que descienden de un punto a otro de muestreo

(variación de pH como descenso). Todos los puntos de muestreo, excepto a las 4

2

4

6

8

10

12

14

24

Tiem

po (h

oras)

Control SLα SLα dig SLβ SLβ dig


156

horas, mostraron diferencias estadísticamente significativas repitiéndose la

misma tendencia. A partir de las 6 horas, el descenso de pH fue mayor en todos

casos para el cultivo con los concentrados proteicos sin digerir, encontrándose la

máxima diferencia a las 10 horas en el cultivo al que se le añadió suero lácteo

rico en β–lactoglobulina (2,10 ± 0,03) y suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina

(1,99 ± 0,03) respecto de los demás grupos (1,80‐1,90 ± 0,01‐0,02).

Figura 29. Variación de pH en el cultivo de L. gasseri sometido a diferentes sueros proteicos. * Indica diferencias signficativas (p<0,05) entre los diferentes grupos de estudio.

Este descenso de pH nos indica una actividad metabólica bacteriana

mayor y, posiblemente, un aumento en la producción de ácidos grasos de

cadena corta y ácido láctico.

En la Figura 30 se presentan las curvas de crecimiento y los parámetros

cinéticos calculados a partir del ajuste de los datos de recuentos de viables para

Bifidobacterium longum expuesto a los diferentes concentrados proteicos (SLα

y SLβ), digeridos y sin digerir. Respecto a los parámetros cinéticos, el tiempo de

adaptación al medio de cultivo fue inferior en aquellos medios a los que se les

añadió el ingrediente digerido, aunque no se obtuvieron diferencias

significativas (p<0,05). Bifidobacterium longum presentó tasas de crecimiento

superiores cuando el medio de cultivo se suplementó con los concentrados

proteicos digeridos o sin digerir, aunque tampoco esta vez se obtuvieron

0

0,5

1

1,5

2

2,5

2 4 6 8 10 12 14 24

Variación de pH

Tiempo (horas)


*

*

**

*

* *


157

diferencias significativas. Sin embargo, el suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina

(SLα) digerido mostró recuentos máximos significativamente (p<0,05) superiores

a los presentados por el grupo control o los grupos suplementados con suero

rico en β‐lactoglobulina (SLβ) digerido o sin digerir.

Figura 30. Curvas de crecimiento de B. longum expuesto a los diferentes concentrados proteicos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).

En la Figura 31 se representan los incrementos de la densidad óptica en

cada punto de muestreo para el crecimiento de B. longum. En ella se puede

observar que este parámetro aumenta con el crecimiento de la bacteria, sin

embargo el incremento es mayor en los grupos suplementados con ambos

concentrados proteicos sometidos a digestión o no, hecho que se aprecia

especialmente a las 24 horas. Al igual que en el crecimiento de L. gasseri se

obtuvieron unos valores de densidad óptica muy altos y aunque se

correspondieron con pequeños aumentos en los recuentos de viables,

planteamos las mismas hipótesis que para el lactobacilo estudiado. La bacteria

Bifidobacterium longum

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25

Log

ufc/

ml

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

Control SLα SLα dig SLβ SLβdigλ 2,45±0,11 2,45±0,60 2,18±0,22 2,59±0,25 1,81±1,07µ 0,39±0,01 0,50±0,06 0,41±0,02 0,52±0,03 0,44±0,02MR 9,29±0,08b 9,42±0,03ab 9,47±0,01a 9,28±0,04b 9,11±0,01c

R2 0,958 0,989 0,982 0,983 0,984



158

puede estar produciendo alguna sustancia, un exopolisacárido por ejemplo, que

aumente la densidad óptica o el crecimiento microbiano produce un descenso

en el pH que a su vez hace que las proteínas precipiten.

Figura 31. Representación del incremento de densidad óptica para el crecimiento de B. longum en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio.

Son varios los estudios que evalúan el efecto de los concentrados

proteicos sobre la microbiota intestinal, sin embargo, ninguno de ellos observó

modificaciones en los recuentos de bifidobacterias. Este hecho se reflejó, en un

estudio in vitro realizado con inóculos fecales, llevado a cabo por Brück

Graverholt y Gibson (2002) y en el que evaluaron una fórmula infantil

suplementada con lactoalbúmina y otra con glicomacropeptidos. Este grupo de

investigación realizó in vivo otros dos estudios, uno en monos Rhesus (Brück et

al., 2003a) y otro en lactantes humanos (Brück et al., 2006a) y tampoco

pudieron observar modificaciones en la concentración de bifidobacterias

En relación a los resultados de la variación del descenso del pH mostrada

durante el crecimiento de este microorganismo (Figura 32), es importante

destacar que la mayor variación se atribuye al suero lácteo rico en β‐

lactoglobulina (SLβ) mientras que no se corresponde con los mayores recuentos

como sería previsible, ya que el descenso de pH se debe a la actividad

2

4

6

8

10

12

14

24

Tiem

po (h

oras)

control SLα SLα dig SLβ SLβ dig


159

metabólica del microorganismo, concretamente a la producción de ácidos

grasos de cadena corta. Se puede resumir, de una forma general, que el grupo

control y suplementado con suero lácteo, rico en α‐lactoalbúmina, digerido o sin

digerir, obtuvieron valores similares entre sí, e inferiores a los presentados por

el grupo suplementado con el suero lácteo β. Los dos muestreos con las

diferencias más marcadas fueron las 8 y 10 horas, el grupo control obtuvo los

siguientes valores: 1,33 ± 0,03 y 1,70 ± 0,02 respectivamente y el grupo SLβ 1,42

± 0,01 y 1,78±0,01 unidades de pH respectivamente.

Figura 32. Variación de pH en el cultivo de B. longum expuesto a los concentrados proteicos digeridos y sin digerir. * Indican diferencias estadísticas (p<0,05) en los resultados observados para cada muestreo

En la Figura 33 se pueden observar las diferentes curvas de crecimiento y los

parámetros cinéticos obtenidos para Escherichia coli expuesta a los dos

concentrados proteicos digeridos y sin digerir. Si se comparan las curvas de

crecimiento de E. coli con las obtenidas para L. gasseri y B. longum se aprecia

que estas dos últimas son de crecimiento más lento. De modo general, se

observa una menor fase de adaptación y que la fase estacionaria comienza antes

(a las 6‐8 horas). Se observa también como el grupo control y suero lácteo rico

0

0,5

1

1,5

2

2 4 6 8 10 12 14 24

Variación de

pH

Tiempo (horas)


*

*

** *

*


160

en α‐lactoalbúmina evolucionan a la vez y sus recuentos son superiores a los

otros tres grupos desde las 4‐6 horas de crecimiento.

Figura 33. Curvas de crecimiento de E. coli expuesto a los diferentes concentrados proteicos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).

Respecto a los parámetros cinéticos se debe destacar que los tres

resultaron ser diferentes significativamente entre los grupos de estudio. En

relación al tiempo de adaptación del microorganismo al medio de cultivo con o

sin ingrediente añadido, los dos concentrados proteicos digeridos mostraron los

valores menores aunque sólo presentó diferencias significativas el grupo SLβ

respecto del grupo SLβ digerido. E. coli tardó menos tiempo en adaptarse al

medio de cultivo con los péptidos resultantes de la digestión del suero rico en β‐

lactoglobulina. La tasa de crecimiento también fue menor en los grupos

expuestos a los sueros digeridos respecto de los grupos expuestos a

concentrados proteicos sin digerir. Además, los valores de recuentos máximos

resultaron menores significativamente (p<0,05) en el caso de los grupos

Escherichia coli

Tiempo(horas)

0 5 10 15 20 25

Log

ufc/

ml

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0


λ 1,49±0,12ab 1,51±0,07ab 1,10±0,24ab 1,56±0,14a 0,88±0,17b

µ 0,49±0,03abc 0,58±0,05a 0,44±0,01bc 0,52±0,02ab 0,37±0,02c

MR 8,88±0,01a 8,94±0,02a 8,73±0,04bc 8,74±0,01b 8,65±0,01c

R2 0,961 0,981 0,987 0,991 0,972



161

expuestos a los sueros lácteos digeridos y al suero lácteo rico en β‐lactoglobulina

(SLβ). Estos resultados confirman los obtenidos al realizar el análisis estadístico

de los recuentos obtenidos en cada muestreo y conducen a afirmar que los

péptidos resultantes de la digestión de ambos sueros poseen actividad

antimicrobiana frente a E.coli.

Según estos resultados podemos afirmar que los dos concentrados

proteicos digeridos (SLα dig y SLβ dig) tienen un ligero efecto inhibitorio del

crecimiento de E. coli. Es previsible que se produzca un efecto más claro si el

inóculo inicial hubiera sido más bajo, ya que partimos de aproximadamente 7

unidades logarítmicas.

En un ensayo in vitro llevado a cabo por Pihlanto‐Lappälä et al., (1999)

observaron que la hidrólisis de α‐lactoalbúmina producía péptidos con

propiedades bacteriostáticas. En este sentido, Brück, Graverholt y Gibson

(2003b) realizaron un ensayo in vitro, en el que expusieron un inóculo fecal a

leche materna, y fórmula infantil suplementada con α‐lactoalbúmina o

glicomacropéptidos y obtuvieron que dichas proteínas, sometidas a digestión

gastrointestinal in vitro, poseían efecto bactericida o bacteriostático contra E.

coli enteropatógena y contra Salmonella typhimurium. Estos autores ya habían

visto con anterioridad cierto efecto antimicrobiano contra E.coli intestinal

(Brück, Graverholt y Gibson, 2002). Sin embargo, al evaluar dicho efecto sobre

una cepa patógena de E. coli pudieron observar una actividad antimicrobiana

más evidente. En nuestro estudio, el efecto de dos concentrados proteicos, se

evaluó sobre una cepa de E. coli no patógena aislada de heces humanas y

pudimos observar sólo un ligero efecto antimicrobiano aunque estadísticamente

significativo.

En la Figura 34 se muestran los incrementos de densidad óptica durante

el crecimiento de la bacteria. En ella se puede observar como desde el primer

punto de muestreo, el grupo control y el suplementado con suero rico en α‐

lactoalbúmina (SLα) presentaron valores similares de absorbancia mientras que


162

los valores de los grupos SLα dig, SLβ, y SLβ dig fueron menores. Este hecho se

corresponde con los resultados obtenidos para el recuento de viables. En las dos

especies de bacterias lácticas estudiadas no se realizó el análisis estadístico de

los resultados de densidad óptica por los motivos explicados anteriormente, y

por esa razón tampoco se realizó para esta bacteria.

Figura 34. Representación del incremento de densidad óptica en el crecimiento de E. coli en los diferentes puntos de muestreo para cada grupo de estudio.

Los resultados obtenidos en el descenso de pH se presentan en la Figura

35, en ella se observa como en todos los puntos de muestreo, excepto a las 2

horas, aparecen diferencias estadísticas entre los grupos de estudio, es decir

dependiendo del ingrediente al que era expuesto el microorganismo. El grupo

control y al que se le añadió suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina,

proporcionaron los valores más altos en la variación de pH (valores menores de

pH) seguido por el grupo SLβ digerido.

La medida de este pH en el crecimiento de bacterias lácticas, nos indica la

actividad de su metabolismo fermentativo y que una mayor acidez puede inhibir

el crecimiento de determinados microorganismos como los potencialmente

patógenos. Sin embargo, en este caso que el descenso de pH es menor, lo único

que nos indica es crecimiento.

2

4

6

8

10

12

14

24

Tiem

po (h

oras)

Control SLα SLα dig SLβ SLα dig


163

Figura 35. Variación de pH en el cultivo de Escherichi coli sometido a dos concentrados proteicos digeridos y sin digerir.

b) Curvas de crecimiento de los diferentes microorganismos expuestos a dos

concentraciones diferentes de un preparado de nucleótidos sometido o no a

una digestión gastrointestinal.

En la Figura 36 se puede observar las curvas de crecimiento de L. gasseri, a

partir de los datos ajustados, y también los parámetros cinéticos calculados a

partir de dichas curvas. En ella se observa que todos los grupos de estudio

presentaron una evolución similar en el crecimiento. Hecho que queda probado

al analizar los parámetros cinéticos (fase de adaptación, tasa de crecimiento y

recuentos máximos) en el ajuste de las curvas de crecimiento con el programa

DMFIT. La exposición de Lactobacillus gasseri a dos concentraciones de la

mezcla de nucleótidos digerida y sin digerir no mostró cambios en ninguno de

los parámetros analizados.

0

0,5

1

1,5

2

2 4 6 8 10 12 14 24

Variación de

pH

Tiempo (horas)


*

* * * *


164

Figura 36. Curvas de crecimiento de L. gasseri expuesto a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).

Sauer et al., 2010 evaluaron el crecimiento de diferentes especies de

Lactobacillus en un estudio in vitro, sin encontrar diferencias significativas en su

crecimiento debidas a la adición de nucleótidos. Sin embargo en un estudio in

vivo, en lechones, llevado a cabo por Mateo, Dave y Stein (2004) si observaron

un incremento significativo en el recuento de lactobacilos.

La densidad óptica, presentada en la Figura 37, tampoco mostró

diferencia alguna entre los grupos de estudio. El incremento de densidad óptica

fue similar para los cinco grupos de estudio en cada punto de muestreo. Se

observó un aumento en el tiempo que indica el crecimiento bacteriano

Lactobacillus gasseri

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25

Log

ufc/

ml

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

Control Nuc32 Nuc32dig Nuc72 Nuc72digλ 3,10±0,07 3,00±0,14 2,85±0,25 2,68±0,53 2,87±0,15µ 0,654±0,09 0,63±0,06 0,60±0,06 0,56±0,10 0,62±0,07MR 9,09±0,01 9,15±0,05 9,08±0,01 9,11±0,01 9,07±0,05R2 0,991 0,986 0,993 0,989 0,986

Control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig


165

Figura 37. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de L. gasseri expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos

En cuanto al descenso de pH cuyos resultados se muestran en la Figura

38, no se encontraron diferencias significativas entre los grupos estudiados en

ninguno de los puntos de muestreo. No obstante, a las 8, 10, 12 y 24 h se pudo

observar que los grupos suplementados con nucleótidos mostraron los valores

más altos en el descenso de pH (p=0,077, 0,075, 0,074, y 0,089,

respectivamente)

Figura 38. Descenso de pH en el cultivo de L. gasseri sometido a dos concentraciones del preparado de nucleótidos digeridos y sin digerir.

2

4

6

8

10

12

14

24

Tiem

po (h

oras)


0

0,5

1

1,5

2

2 4 6 8 10 12 14 24

Variación de

pH

Tiempo (horas)



166

En la Figura 39 se muestran las curvas de crecimiento obtenidas de los

datos ajustados y los parámetros cinéticos calculados a partir de dichas curvas.

El grupo control y los dos grupos a los que se les suplementó con 32 mg/L del

preparado de nucleótidos mostraron curvas similares. Sin embargo, los

recuentos de los grupos suplementados con 72 mg/L sometidos o no a digestión

fueron superiores desde el punto de muestreo de las 8‐10 horas hasta el final

del crecimiento.

Figura 39. Curvas de crecimiento de B. longum expuesto a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos. Diferentes letras en la misma fila de la tabla indican diferencias estadísticas entre los diferentes grupos estudiados (p<0,05).

Respecto a los parámetros cinéticos calculados a partir de los datos

ajustados, los grupos suplementados con 32mg/L de nucleótidos digeridos y con

72 mg/L de nucleótidos sin digerir presentaron los mayores tiempos de

adaptación, aunque sus tasas de crecimiento fueron superiores a los otros

grupos, es importante destacar que ninguno de estos dos parámetros presentó

diferencias significativas. No ocurrió lo mismo con los recuentos máximos para

los que el grupo al que se le adicionó 72 mg /L mostró un incremento

Bifidobacterium longum

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25

log

ufc/

ml

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

Control Nuc32 Nuc32 dig Nuc72 Nuc72 digλ 2,23±0,13 2,09±014 2,62±0,10 2,54±0,01 2,01±0,46µ 0,32±0,02 0,34±0,01 0,35±0,01 0,36±0,01 0,32±0,01MR 9,37±0,01b 9,37±0,01cb 9,34±0,01cb 9,47±0,01a 9,41±0,01b

R2 0,997 0,990 0,991 0,989 0,995



167

significativo (9,41‐9,47 ±0,01 Log ufc/ml) respecto de los demás grupos de

estudio (9,34‐9,37 ± 0,01 Log ufc/ml).

En la Figura 40 se presentan los resultados obtenidos para la variación de

densidad óptica en los puntos de muestreo realizados durante el crecimiento de

Bifidobacterium longum. En ella se puede observar que la densidad óptica

mostró valores similares en todos los grupos de estudio.

Figura 40. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de B. longum expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos

La variación de pH (Figura 41) fue similar en los grupos estudiados,

aunque a las 8 y 10 horas presentaron diferencias significativas, los valores de

los diferentes grupos eran prácticamente iguales. En este sentido podemos

afirmar que la actividad metabólica del microorganismo estudiado expuesto a

diferentes concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir es similar.

2

4

6

8

10

12

14

24

Tiem

po (h

oras)

control Nuc 32 Nuc 32 dig Nuc 72 Nuc 72 dig


168

Figura 41. Variación de pH en el cultivo de B. longum sometido a dos concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.

La suplementación del medio de cultivo con 72 mg/L de nucleótidos

estimuló el crecimiento de Bifidobacterium longum. En este sentido, son varios

los estudios que obtuvieron resultados positivos relacionados con la

suplementación de fórmulas infantiles con estos compuestos, bien por un

aumento de Bifidobacterias (Gil et al., 1986), un descenso en la relación

Bacteroides/Bifidobacterias (Singhal et al., 2008) o una menor incidencia de

diarrea (Pickering et al., 1998, Merolla, 2000, Yau et al., 2003). No obstante, se

debe tener en cuenta que Balmer, Hanvey y Wharton (1994) observaron efectos

negativos sobre la microbiota intestinal tras la adición de nucleótidos a la

fórmula infantil mientras que Neri‐Almeida et al., (2009) no apreciaron una

menor incidencia de diarrea tras la suplementación de una fórmula infantil con

nucleótidos. Debido a estos resultados contradictorios es necesaria la realización

de investigaciones adicionales con el fin de dilucidar el verdadero efecto de la

suplementación de fórmulas infantiles con nucleótidos.

En la Figura 42 se presentan las curvas de crecimiento y los parámetros

cinéticos de Escherichia coli expuesta a diferentes concentraciones de

nucleótidos digeridos y sin digerir. En ella se puede observar cómo la evolución

de los 5 grupos de estudio es similar, excepto para el grupo expuesto a los

0

0,5

1

1,5

2

2 4 6 8 10 12 14 24

Variaciación

de pH

Tiempo (horas)


*

*


169

productos resultantes de la digestión de 72 mg/L de nucleótidos que parece

obtener mayores valores en los recuentos entre las 4 y 8 horas

Figura 42. Curvas de crecimiento de E. coli expuesta a los diferentes concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir.

En los parámetros cinéticos calculados a partir de las curvas de crecimiento

aunque no mostraron diferencias estadísticas, se pudo observar como el periodo

de adaptación, la tasa de crecimiento y los recuentos máximos obtuvieron sus

valores mayores en los grupos expuestos a los nucleótidos digeridos o sin

digerir, especialmente el grupo al que se le suplementó el medio de cultivo con

72 mg/L de nucleótidos digeridos.

En relación a los resultados obtenidos, debemos señalar que en un estudio

llevado a cabo por Sauer et al., (2010) en el que evaluaron diferentes

concentraciones de nucleótidos individuales (AMP, CMP, GMP, y UMP) sobre

diferentes bacterias intestinales (patógenas y no patógenas), observaron que

estos compuestos eran capaces de modificar el crecimiento de las bacterias

estudiadas dependiendo de la cepa y de la concentración ensayada. De este

Escherichia coli

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25

Log

ufc/

ml

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

Control Nuc32 Nuc32dig Nuc72 Nuc72digλ 1,16±0,15 1,40±0,07 1,30±0,11 1,33±0,02 1,55±0,10µ 0,53±0,05 0,61±0,01 0,60±0,01 0,60±0,03 0,72±0,12MR 8,97±0,03 8,98±0,02 9,02±0,01 9,01±0,04 9,03±0,07R2 0,995 0,991 0,997 0,996 0,997



170

modo, pudieron observar como el crecimiento de una de las cepas patógenas de

E. coli disminuía frente al cultivo control (sin nucleótidos) mientras que otras

cepas (una patógena y otra no) incrementaban su crecimiento cuando se

exponían a determinadas concentraciones de nucleótidos.

Los resultados obtenidos durante el crecimiento de E. coli para la densidad

óptica (600 nm) se muestran en la Figura 43. No se observaron diferencias entre

los grupos suplementados con nucleótidos, sometidos o no a digestión y el

grupo control. La densidad óptica aumento con el crecimiento del

microorganismo hasta el muestreo de las 6 horas, a partir del que se mantuvo

constante.

Figura 43. Representación de la densidad óptica en el crecimiento de E. coli expuesta a las diferentes concentraciones del preparado de nucleótidos.

Los valores de la variación de pH se muestran en la Figura 44 como se

aprecia, no encontramos diferencias significativas debidas a la concentración de

nucleótidos digeridos o sin digerir. Como se ha mencionado anteriormente la

medida de pH en este caso sólo nos indica actividad metabólica del

microorganismo y por lo tanto crecimiento. El descenso del pH fue mucho

menor que en el caso de las bacterias lácticas que producen ácidos grasos de

cadena corta y/o ácido láctico


171

Figura 44. Variación de pH en el cultivo de E. coli sometido a dos concentraciones de nucleótidos digeridos y sin digerir

2.2. Ensayo 2: Evolución de la microbiota fecal in vitro

Dentro del segundo ensayo, debemos diferenciar dos experiencias con

objetivos diferentes. Por un lado se estudió la evolución de la microbiota fecal

expuesta a los ingredientes objeto de estudio, digeridos y sin digerir y por otro

lado el comportamiento de diferentes grupos microbianos intestinales

expuestos a las fórmulas infantiles o leche materna sometidas o no a digestión.

A lo largo de este apartado los resultados numéricos que aparezcan en el

texto, se expresarán como medianas del Log nº cels/ml (referentes a la

composición de la microbiota intestinal) o como medianas de la concentración

(mM) en el caso de ácidos grasos de cadena corta, ya que los test estadísticos

aplicados fueron no paramétricos.

Los resultados de los límites de detección, los coeficientes de regresión (R2) de

las rectas de calibrado y las eficiencias de las PCR cuantitativas para cada grupo

microbiano analizado se presentan en la Tabla 25 observándose, una eficiencia

mayor del 90% en todos los grupos microbianos estudiados. En las muestras

analizadas que obtuvieron valores por debajo del límite de detección se les

asignó el límite de detección para realizar el análisis estadístico.

0

0,5

1

1,5

2

2 4 6 8 10 12 14 24

Variación

de pH

Tiempo(horas)



172


Limite detección

Eficiencia (%) R2 (cels /g)

Atopobium 8∙104 91,22±1,64 0,999

Bacteroides 1∙103 94,47±1,20 1

Clostridia XVa 3∙104 93,50±1,13 0,999

Clostridia IV 1∙104 95,15±2,68 0,999

Enterobacteriaceae 8∙104 96,93±3,15 0,994

Enterococcaceae 1∙105 95,50±1,64 0,999

Lactobacillus spp. 1∙104 94,12±1,48 0,998

Bifidobacterium spp. 1,5∙104 93,05±2,63 1

Bacterias Totales 2∙104 94,45±1,93 0,998

2.2.1. Evolución de la microbiota fecal expuesta a los ingredientes funcionales

digeridos y sin digerir.

Las bacterias en el lumen intestinal pueden clasificarse en tres grupos según

su grado de patogenicidad: bacterias beneficiosas (bifidobacterias y lactobacilos,

potencialmente patógenas (enterobacterias, enterococos, Escherichia coli,

Bacteroides spp y estreptococcos) y bacterias patógenas (Estafilococos,

Clostridios, Proteus spp y Klebsiella spp) que pueden ser peligrosas a bajas

concentraciones. Por otro lado las bacterias potencialmente patógenas son

bacterias que pertenecen a la microbiota intestinal habitual, pero que

comenzarán a producir efectos patógenos si se encuentran en altas

concentraciones Los efectos beneficiosos que pueden producir son inhibición del

crecimiento de patógenos, producción de vitaminas estimulación del sistema

inmune etc. Los efectos patógenos de las bacterias incluyen intolerancia a la

alimentación, inflamación e infección entre otros (Waaij, 1999). Si en la

composición de la microbiota intestinal predominan especies como

bifidobacterias y lactobacilos, favorecerán la protección, ya que evitan el

crecimiento de bacterias patógenas (Wold y Adlerberth, 2000).


173

En la Figura 45 se pueden observar los resultados obtenidos para cada unode

los grupos microbianos estudiados en este ensayo. Las concentraciones de los

grupos microbianos Bacteroides, Clostridia XVa y Clostridia IV no cambiaron

durante el ensayo, por lo que es probable que se partiera de concentraciones

bajas en las heces de los lactantes sanos. Por otro lado, se debe destacar el

elevado límite de detección obtenido para el grupo Atopobium, lo que nos

dificultó su cuantificación ya que varias muestras obtuvieron valores cercanos a

este valor (8∙104 cels/g).

Desde un punto de vista general, el grupo Lactobacillus solamente aumentó

una unidad logarítmica desde el primer muestreo (0 h) al último (48 h). Todos

los grupos estudiados aumentaron la concentración de Lactobacillus durante las

primeras 6 horas, sin embargo, a partir de ese momento cada grupo evolucionó

de una manera diferente aunque sin grandes diferencias. De este modo, el

grupo control mantuvo los valores alcanzados a las 6 h hasta el último muestreo

(5,55 Log cels/g y 5,67 Log cels/g) siendo las concentraciones más bajas

comparándolas con los otros grupos de estudio. Aún así, no se observaron

diferencias significativas en ningún punto de muestreo, hecho probablemente

debido a la alta variabilidad encontrada entre los tres inóculos fecales. Aunque

parten de concentraciones similares, a medida que estudiamos la evolución de

este grupo microbiano las desviaciones aumentan, lo que podría explicarse

porque probablemente las especies predominantes de lactobacilos en cada uno

de los tres donantes sean diferentes y por lo tanto respondan de manera

diferentes ante los ingredientes funcionales.

En el ensayo anterior de la presente tesis doctoral obtuvimos resultados

positivos en el crecimiento de L. gasseri cuando suplementámos el medio de

cultivo con los sueros lácteos sometidos o no a digestiónpero esto no significa

que el crecimiento de todas las especies de latobacilos se estimule con estos

ingredientes. Una hipótesis podría ser por tanto, que en alguno de los inóculos

fecales predominara esta especie y en los otros predominara otra diferente,

que no se viera afectada por los ingredientes estudiados.


174

Aun así se debe destacar que todos los ingredientes testados dieron lugar a

concentraciones más altas que el grupo control, especialmente los nucleótidos,

aunque a las 48 horas el grupo SLβ alcanzó valores similares que Nuc dig. En este

sentido, Mateo, Dave y Stein (2004) en un estudio in vivo, sobre la microbiota

intestinal de lechones a los que se les suplementó la dieta con nucleótidos,

encontraron un aumento significativo de Lactobacilos respecto al grupo

alimentado con la misma dieta sin suplementar.

Aunque el aumento de grupo Lactobacillus (por parte del preparado de

nucleótidos) sea pequeño, debemos tomarlo en cuenta, ya que otros estudios in

vitro en los que se adicionan prebióticos con efectos beneficiosos probados no

observan cambios en este grupo (Saulnier, Gibson y Kolida, 2008).

El grupo Bifidobacterium, como se puede observar en la figura 45 presentó

un crecimiento que comenzó con una fase exponencial hasta las 12 horas

aproximadamente y posteriormente una fase estacionaria. En dichas curvas se

observa una pendiente de la fase exponencial diferente dependiendo del

ingrediente añadido, siendo las más suaves para el grupo control y los

suplementados con nucleótidos y las más marcadas para aquellos grupos a los

que se les añadió sueros lácteos sometidos o no a digestión. En el segundo

punto de muestreo (6 horas), y los grupos suplementados con sueros lácteos

presentaron las concentraciones más altas (p=0,06). En este sentido se

obtuvieron diferencias significativas a las 12 h de crecimiento, siendo los valores

de las concentraciones más altos para los grupos suplementados con los sueros

sin digerir cuyas medianas oscilaron entre 8,40‐8,42 Log cels /ml, seguidos de los

sueros digeridos (8,05‐8,32 Log cels /ml) respecto de los demás (7,72‐7,87 Log

cels /ml).

El incremento significativo que se produjo en la concentración de

bifidobacterias por parte de los concentrados proteicos sin digerir, a las 12 h fue

similar al encontrado por Saulnier, Gibson y Kolida (2008) suplementando el

medio de cultivo base con fructooligosacaridos (FOS), fructooligosacaridos de


175

cadena corta (scFOS) y simbióticos. Por lo que nuestros sueros lácteos sin digerir

mostraron un efecto similar en este grupo microbiano al de prebióticos y

simbióticos con beneficios ya confirmados.

Estos resultados se corresponden con los obtenidos en el ensayo anterior en

el que observamos una estimulación del crecimiento de B. longum por parte de

los concentrados proteicos y los nucleótidos, aunque esta vez estos últimos no

ejercieron efecto alguno sobre el grupo Bifidobacterium. Este hecho, puede ser

debido a que la concentración de nucleótidos a la que fue expuesto el inóculo

fecal (32 mg/L) fue menor que con la que obtuvimos los resultados positivos en

el ensayo citado (72 mg/L).

Se puede afirmar que los concentrados proteicos en las dosis utilizadas en

este estudio incrementaron el crecimiento de bifidobacterias. Sin embargo

estudios similares, aunque con concentraciones diferentes no pudieron ver

efecto alguno sobre este grupo microbiano (Bruck et al., 2002; Brück, Graverholt

y Gibson 2003b). Por otro lado, debido a la existencia de estudios

contradictorios relacionados con el crecimiento de bifidobacterias ante la

presencia de nucleótidos (Gil et al., 1986; Uauy, 1989; Balmer, Hanvey y

Wharton, 1994) y a que nuestros resultados indican que depende de la

concentración de los mismos, son necesarios más estudios para obtener

conclusiones claras a este respecto.

El grupo microbiano Atopobium‐Collinsella presentó un incremento de hasta

una unidad logarítmica durante las 6 primeras horas de su crecimiento, después

mantuvo su concentración en todos los grupos de estudio hasta el muestreo de

las 36 horas en el que comenzó a descender según el ingrediente añadido. De

esta forma se observaron diferencias significativas a las 48 horas, mostrando el

grupo control (5,50 Log cels /ml) los valores más bajos respecto al medio

suplementado con suero lácteo rico en β‐lactoglobulina (5,88 Log cels/g.). La

concentración de este grupo bacteriano, depende del tipo de alimentación,

siendo mayores los recuentos en heces de niños alimentados artificialmente y


176

también depende de la edad, aumentando conforme el niño va creciendo

(Harmsen et al., 2000). En este estudio se observó que la suplementación con los

ingredientes, nucleótidos o sueros lácteos, mantuvo unas concentraciones

similares al grupo control excepto en el último muestreo en el que el grupo SLβ

obtuvo valores mayores.

El grupo microbiano Enterobacteriaceae presentó un rápido crecimiento en

todos los grupos de estudio entre el primer y segundo muestreo. Sin embargo, a

partir de este último el medio de cultivo sin suplementar y el suplementado con

nucleótidos sin digerir comenzaron un descenso lento. Por otro lado, el grupo al

que se le añadió suero lácteo rico en β‐lactoglobulina mantuvo sus valores

siendo estos los más altos en el último muestreo. Este resultado contrasta con el

obtenido en el ensayo anterior cuando se evaluó el crecimiento de E. coli,

expuesta a estos mismos concentrados digeridos y sin digerir, ya que inhibió su

crecimiento. Este hecho puede deberse a que el grupo analizado comprende

gran variabilidad de especies bacterianas y no sólo a E. coli, por lo que es

probable que algunas se vean afectadas por el ingrediente y otras manifiesten el

efecto contrario. Son diversos los estudios que observan un descenso en la

concentración de esa especie bacteriana y lo atribuyen a las proteínas del

lactosuero (α‐lactoalbúmina) (Brück et al., 2003a; Brück et al., 2006a)

Por otro lado se debe señalar que los grupos suplementados con nucleótidos

tanto digeridos como sin digerir no mostraron cambios respecto al grupo

control, como ocurrió en el ensayo con cultivos puros al estudiar el crecimiento

de E. coli. Sin embargo en un estudio llevado a cabo por Balmer, Hanvey y

Wharton (1994) observaron el efecto contrario en las heces de lactantes a los

que se les suplementó la fórmula infantil con nucleótidos, incrementando los

recuentos de E. coli.

En relación al grupo microbiano Enterococccaceae se debe destacar la alta

variabilidad encontrada entre los diferentes donantes, como ocurría con el

grupo Lactobacillus por lo que planteamos la misma hipótesis de que la especie


177

predominante dentro del mismo grupo sería diferente para cada lactante y

además, respondería de distinta manera ante los ingredientes objeto de estudio.

El grupo Enterococcaceae aumentó su concentración durante las primeras 6

horas de crecimiento de la misma forma para todos medios suplementados o no

con los ingredientes funcionales. A partir de las 12 horas la evolución es

diferente para cada muestra, siendo aquellos a los que se les añadió los

concentrados proteicos sometidos o no a digestión los que presentaron los

valores más altos. Los otros tres grupos (Control, Nuc y Nuc dig) evolucionaron

de una manera similar, excepto en el muestreo de las 48 h en el que el medio de

cultivo suplementado con los nucleótidos digeridos mostró concentraciones

mayores. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas debido a la

alta variabilidad citada anteriormente.

La concentración de bacterias totales llegó a 1010 cels/ml y siguió la misma

tendencia que los dos grupos anteriormente descritos (Enterobacteriaceae y

Enterococcaceae) que fueron los que presentaron mayores concentraciones

seguidos del grupo Bifidobacterium. En la Figura 45 se puede observar como las

bacterias totales tienen un crecimiento exponencial hasta las 6 h y

posteriormente entran en fase estacionaria, incluso en alguno de los grupos

acaba descendiendo su concentración. En este grupo no encontramos gran

variabilidad entre la microbiota de los donantes. Así se pudo observar

diferencias estadísticamente significativas en el último muestreo (48 h), siendo

los grupos a los que se añadió sueros lácteos con o si digestión los que

mostraron mayores valores (Control: 9,14 Nuc: 8,84, Nuc dig: 9,18, SLα: 9,49,

SLα dig: 9,45, SLβ: 9,61, SLβ dig: 9,40 Log cels/g).

Como se ha dicho al principio de este apartado, las concentraciones de los

grupos microbianos Bacteroides, Clostridia XVa y Clostridia IV se mantuvieron

prácticamente constantes a lo largo del estudio. El grupo Clostridia XVa fue el

único que pareció crecer en algún momento, pero no ocurrió en los tres

donantes por lo que se observaron altas desviaciones.


178

Tras la obtención de los resultados de la evolución de la microbiota fecal, se

puede afirmar que existió un efecto beneficioso por parte los concentrados

proteicos sobre el crecimiento de bifidobacterias y por parte del preparado de

nucleótidos sobre los lactobacilos. Además, una conclusión importante es que

ninguno de nuestros ingredientes dió lugar a un incremento en los grupos

microbianos Bacteroides y Clostridium leptum respecto al grupo control,

pertenecientes a la microbiota patógena (Waaij., 1999). Sin embargo como

hemos descrito anteriormente C. coccocoides y Atopobium mostraron mayor

crecimiento en el grupo suplementado con suero rico en β‐lactoglobulina. Estos

resultados también fueron encontraron por Langlands et al., (2004) y Saulnier,

Gibson y Kolida (2008) respectivamente al suplementar el medio con FOS, e

incluso en un estudio in vivo en humanos se observó un aumento de Collinsella

aerofaciens al consumir 2,5g FOS/día (Tannock et al., 2004)

Figura 45. Evolución de la microbiota intestinal expuesta a los diferentes ingredientes sometidos o no a digestión in vitro. * Indica

diferencias estadísticas entre los grupos de estudio

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Bacteroides

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Clostridia IV

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Bifidobacterium

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48Log cels/m

lTiempo (horas)

Enterococcaceae

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Lactobacillus

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

10,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Enterobacteriaceae

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Bacterias totales

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Clostridia XVa

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Atopobium

Control Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig

*

*

*


179


180

En la Figura 46 se presentan los resultados obtenidos al calcular la relación entre

los dos grupos microbianos Bacteroides y Bifidobacterium. En ella se puede observar

como esta relación disminuye entre las 0 y 12 horas, debido al crecimiento exponencial

de bifidobacterias, ya que la concentración de Bacteroides permanece constante

durante el ensayo.

Figura 46: Relación Bacteroides/Bifidobacterium para cada grupo de estudio en cada punto de muestreo.

Se observaron diferencias estadísticas (p<0,05) en la relación Bacteroides

/Bifidobacterium a las 12 horas entre los grupos de estudio, siendo los valores más altos

para el grupo control (0,45) y los suplementados con nucleótidos (0,46‐0,47) respecto

de los sueros lácteos sin digerir (0,41‐0,42) y digeridos (0,41‐0,43). No ocurrió lo mismo

en un estudio in vivo en el que los lactantes alimentados on una formula suplementada

con nucleótidos mostraron un descenso en esta relació (Signal et al., 2008)

Al realizar el análisis estadístico de la evolución de pH (resultados mostrados en

la Figura 47) se observarons diferencias estadísticas (p<0,05) a las 6, 12, 24 y 72 horas

de muestreo, pero como partimos de pH ligeramente diferentes en las tres

experiencias, decidimos trabajar con la variación de este parámetro que se presenta en

la Figura 45.

0,38

0,43

0,48

0,53

0,58

0,63

0,68

0,73

0,78

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Bacteroides/Bifid

obacterium

Tiempo (horas)


*


181

Una mayor variación en el pH significa un aumento de la acidez, debido a una

mayor producción de ácidos grasos de cadena corta por parte de la microbiota fecal,

hecho que se refleja al realizar el test de correlación de Spearman en el que se

obtuvieron relaciones significativas negativas entre el pH y el ácido acético o el total de

ácidos grasos de cadena corta en todos los puntos de muestreo, además debemos

destacar la significación obtenida en el muestreo de las 12 h (r=‐0,927 , p<0,01) que

además coincide el aument de Bifidobacterias.

En los primeros puntos de muestreo, 6 y 12 horas, los mayores valores de

variación los obtienen los dos concentrados proteicos sin digerir, especialmente el

suero rico en β‐lactoglobulina que presenta diferencias significativas a las 12 horas.

Estas variaciones de pH se corresponden con las diferencias encontradas en el grupo

Bifidobacterium en los mismos puntos de muestreo (6 y 12 h), por lo que, podríamos

atribuir ese descenso de pH a la acidificación del medio a metabolismo de este grupo

microbiano

Figura 47. Variación de pH en cada punto de muestreo para los diferentes grupos de estudio.*Indica diferencias estadísticas entre los grupos de estudio para cada punto de muestreo.

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

6h 12h 24h 36h 48h 72h

Variación de

PH


*


182

Los resultados obtenidos en el análisis de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) se

pueden observar en la Tabla 26 para los mayoritarios (acético, propiónico y butírico) y

en la Figura 46 para los minoritarios (isobutírico, isovalérico, valérico, isocaproico,

caproico y heptanoico). En lass muestras analizadas en este estudio, los ácidos valérico

y heptanoico no fueron detectados.

Los AGCC poseen un papel importante en la estimulación de la absorción de agua

y sodio, previenen la diarrea disminuyendo el pH luminal que evita el crecimiento y

proliferación de bacterias potencialmente patógenas, y protege contra la

carcinogénesis disminuyendo la biodisponibilidad de aminas tóxicas (Puccio et al.,

2007).

El ácido acético aumentó su concentración rápidamente hasta las 24 h en todos

los grupos de estudio, posteriormente las concentraciones se mantuvieron en los

grupos a los que se les suplementó con nucleótidos digeridos o no, y siguió

aumentando en los demás grupos. Como se puede observar en la Tabla 27 se

obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en los muestreos

realizados a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas, siendo en todos los casos los sueros lácteos sin

digerir los que produjeron mayor concentración de ácido acético, seguidos de los

mismos sueros digeridos siendo los nucleótidos, digeridos o no, los que mostraron

menores concentraciones. Las diferencias más marcadas ocurrieron a las 12 y 72 horas

y de nuevo podemos decir que este hecho se corresponde con el aumento significativo

de Bifidobacterium y el mayor descenso de pH. Son diversos los estudios que añaden

compuestos funcionales (prebióticos) a fórmulas infantiles ya que está demostrado el

aumento que provocan en los recuentos de bifidobacterias, lactobacilos y como

consecuencia una mayor producción de ácido acético y AGCC totales (Ben et al., 2004,

Knol et al., 2005; Cai, Luo y Ben, 2008).

Además el ácido acético producido por bifidobacterias mejora la defensa

intestinal mediada por las células epiteliales y por lo tanto protege al hospedador

contra infecciones (Fukuda, 2011).


183

Respecto al ácido propiónico, su concentración aumentó hasta las 12‐24 horas

de forma general, aunque en algunos grupos se produce un aumento en muestreos

posteriores (control a las 48 h y en los grupos suplementados con nucleótidos a las 72

h). Este compuesto presentó diferencias significativas en todas las etapas desde las 12

horas. Se debe destacar que los grupos suplementados con el preparado de nucleótidos

digeridos y sin digerir mostraron las concentraciones más altas de ácido propiónico a las

24 y 72 horas respecto a los demás grupos, y a las 36 y 48 h junto con el grupo control.

Por lo tanto, a partir de las 12 h los grupos a los que se les adicionó concentrados

proteicos obtuvieron los valores más bajos, en especial si las proteínas no estaban

digeridas.

En el caso del ácido butírico se debe señalar la gran variabilidad encontrada en

los tres donantes, hecho que era de esperar ya que los ácidos grasos son producto del

metabolismo bacteriano y ya mencionamos alta variabilidad que presentaron algunos

de los grupos como Clostridia XVa ( productor de ácido butírico). Aun así se observaron

diferencias significativas a las 6 y 36 horas de incubación del inóculo fecal entre los

grupos de estudio. Aunque todos los grupos a los que se les añadió los concentrados

proteicos sometidos o no a digestión mostraron los valores de ácido butírico más altos,

los grupos SLα dig SLβ presentaron los máximos valores en la concentración de este

ácido orgánico respecto a los demás grupos.

En resumen los grupos a los que se es adicionaron nucleótidos mostraron

valores de acético y butírico similares al control y superiores de propiónico. Los dos

concentrados proteicos sin digerir mostraron un comportamiento similar en cuanto a la

producción de ácido acético, aunque con valores mayores respecto al control. Este

hecho también ocurrió con los concentrados proteicos digeridos pero en menor

medida. Sin embargo, desde un punto de vista general se observaron unas

concentraciones menores de propiónico en los grupos a los que se le adicionaron los

sueros lácteos (digeridos o no). El ácido butírico presentó mayores valores para los

concentrados proteicos pero en especial en el enriquecido con α‐lactoalbúmina

digerido o con β‐lactoglobulina sin digerir.

Tabla 26. Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC). Media ± deviación estándar (mediana). Acético Propiónico Butírico A/P TOTAL AGCC

0h

Control 4,69±0,24 (4,695) 0,26±0,02 (0,26) 0,16±0,00 (0,16) 17,86±0,42 (17,86) 5,52±0,30 (5,52) Nuc 4,22±0,15 (4,26) 0,25±0,01 (025) 0,17±0,02 (0,17) 17,15±0,66 (17,47) 5,02±0,17 (5,08)

Nuc dig 4,17±0,15 (4,23) 0,23±0,02 (0,22) 0,17±0,01 (0,17) 17,94±1,71 (18,55) 5,64±0,45 (5,05) SLα 4,79±0,91 (4,65) 0,23±0,01 (0,24) 0,16±0,00 (0,16) 20,93±5,15 (19,47) 5,59±0,87 (5,456)

SLα dig 4,81±0,45 (4,65) 0,24±0,02 (0,23) 0,19±0,00 (0,19) 20,34±1,75 (19,68) 5,64±045 (5,466) SLβ 4,84±1,04 (4,73) 0,23±0,03 (0,22) 0,17±0,00 (0,17) 21,20±4,85 (19,23) 5,60±1,07 (5,51)

SLβ dig 4,49±0,99 (4,39) 0,24±0,03 (0,23) 0,32±0,19 (0,32) 18,68±2,32 (18,26) 5,47±1,31 (5,37)

6h

Control 14,94±0,67 (14,787)* 0,77±0,30 (0,78) 0,36±0,18 (0,33)* 21,89±8,43 (20,10)* 16,68±0,39 (16,52)* Nuc 13,23±2,78 (13,13)* 0,76±0,20 (0,76) 0,19±0,02 (0,19)* 17,50±1,31 (17,17)* 14,49±2,78 (14,37)*

Nuc dig 12,80±2,33 (12,94)* 0,73±0,19 (0,72) 0,19±0,04 (0,18)* 17,72±2,05 (17,03)* 14,02±2,32 (14,17)* SLα 18,65±3,59 (18,50)* 1,01±0,16 (1,01) 0,80±0,06 (0,79)* 18,44±0,75 (18,22)* 21,08±3,28 (20,93)*

SLα dig 16,49±2,43 (16,21)* 1,05±0,11 (1,05) 0,55±0,16 (0,56)* 15,66±0,74 (15,63)* 18,54±2,09 (18,25)* SLβ 20,00±2,94 (19,79)* 0,93±0,14 (0,91) 1,35±0,13 (1,31)* 21,54±0,83 (21,57)* 22,93±2,62 (22,69)*

SLβ dig 17,08±3,08 (16,99)* 0,95±0,16 (0,94) 0,78±0,07 (0,80)* 18,01±0,28 (17,98)* 18,14±3,81 (17,10)*

12h

Control 22,95±1,41 (22,90)* 1,58±0,30 (1,52)* 0,81±0,72 (0,77) 15,02±3,56 (15,38)* 25,95±2,37 (25,90)* Nuc 16,80±4,26 (17,48)* 1,44±0,30 (1,49)* 0,45±0,50 (0,24) 11,59±0,78 (11,49)* 18,97±4,18 (19,97)*

Nuc dig 16,38±4,22 (16,06)* 1,43±0,29 (1,49)* 0,43±0,49 (0,24) 11,39±1,05 (11,00)* 18,53±4,17 (18,49)* SLα 32,24±1,09 (31,85)* 1,32±0,13 (1,29)* 1,01±0,42 (0,91) 24,52±1,83 (24,37)* 35,15±1,91(34,55)*

SLα dig 25,50±4,08 (24,05)* 1,70±027 (1,71)* 0,94±0,73 (0,88) 15,55±4,92 (14,23)* 28,47±3,30 (27,11)* SLβ 35,48±1,20 (35,34)* 1,10±0,03 (10,9)* 1,49±0,28 (1,43) 20,26±3,56 (19,84)* 38,68±1,73 (38,61)*

SLβ dig 28,91±2,67 (28,26)* 1,46±0,26 (1,45)* 1,27±0,78 (1,12) 20,26±3,56 (19,84)* 32,15±3,64 (31,14)*

24h

Control 29,50±6,77 (28,40)* 1,78±0,87 (1,42)* 0,57±0,57 (0,29) 18,15±5,28 (19,33)* 32,52±7,77 (31,31)* Nuc 28,05±3,84 (28,22)* 2,15±0,07 (2,13)* 0,84±0,94 (0,63) 13,09±2,03 (13,04)* 31,36±3,44 (31,80)*

Nuc dig 29,32±4,64 (30,10)* 2,18±0,12 (2,22)* 0,84±0,93 (0,65) 13,40±1,73 (14,01)* 32,65±3,91 (33,63)* SLα 44,55±3,29 (43,89)* 1,38±0,12 (1,43)* 0,75±0,67 (0,65) 32,38±1,96 (32,31)* 47,35±3,36 (47,12)*

SLα dig 37,46±1,44 (37,39)* 1,65±0,17 (1,65)* 0,96±0,83 (0,81) 22,83±2,44 (22,93)* 40,49±1,93 (40,58)* SLβ 43,75±4,83 (44,52)* 1,18±0,12 (1,13)* 1,20±0,49 (1,28) 36,97±3,00 (37,23)* 46,77±5,03 (48,36)*

SLβ dig 40,43±4,81 (38,65)* 1,53±0,30 (1,54)* 1,12±0,45 (1,21) 27,55±8,59 (25,62)* 43,56±4,40 (41,71)*


184

185

Tabla 26. (continuación) Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC). Media ± deviación estándar (mediana). Acético Propiónico Butírico A/P Total AGCC

36h

Control 38,35±5,04 (38,76) 1,90±0,25 (1,98)* 0,69±0,54 (0,66)* 20,55±4,68 (19,69)* 41,61±5,95 (42,02)Nuc 33,85±6,37 (33,19) 1,94±0,55 (2,02)* 0,21±0,05 (0,21)* 18,00±2,91 (17,69)* 36,28±6,76 (35,71)

Nuc dig 36,08±9,47 (34,46) 1,66±0,44 (1,60)* 0,38±0,28 (0,27)* 22,32±6,21 (21,99)* 38,40±9,76 (36,86)SLα 43,80±3,88 (42,79) 1,62±0,38 (1,58)* 0,62±0,22 (0,68)* 28,44±8,23 (29,02)* 46,41±3,63 (45,81)

SLα dig 41,18±8,45 (40,40) 1,90±0,15 (1,88)* 1,18±0,99 (1,13)* 22,03±5,89 (21,67)* 44,59±7,54 (43,77)SLβ 43,45±3,41 (43,03) 1,20±0,23 (1,08)* 1,20±0,33 (1,15)* 36,80±4,00 (38,36)* 46,46±3,56 (45,72)

SLβ dig 39,70±0,77 (39,70) 1,41±0,29 (1,31)* 0,78±0,52 (0,54)* 28,83±4,83 (30,12)* 42,29±1,67 (41,56)

48h

Control 38,30±4,83 (38,87)* 2,40±0,46 (2,23)* 0,72±0,59 (0,73) 16,65±4,72 (17,63)* 41,97±5,37 (42,35)* Nuc 31,76±2,96 (31,84)* 1,98±0,40 (2,12)* 0,83±0,85 (0,59) 16,42±2,70 (15,76)* 34,87±3,84 (35,40)*

Nuc dig 31,79±3,09 (31,13)* 1,95±0,38 (2,05)* 0,84±0,90 (0,59) 16,68±2,63(15,66)* 34,86±4,08 (34,56)* SLα 42,94±3,09 (43,08)* 1,25±0,04 (1,26)* 0,92±0,34 (0,86) 34,33±3,19 (34,92)* 45,67±2,97 (46,02)*

SLα dig 40,93±5,22 (39,98)* 1,55±0,35 (1,58)* 1,07±0,99 (0,84) 27,32±5,45 (28,57)* 43,95±4,46 (43,33)* SLβ 42,93±3,37 (42,40)* 1,29±0,32 (1,18)* 1,50±0,50 (1,32) 34,96±8,79 (36,86)* 46,31±2,37 (45,76)*

SLβ dig 40,88±3,79 (40,92)* 1,63±0,29 (1,65)* 1,02±0,71 (1,00) 26,10±7,19 (24,90)* 44,16±2,43 (44,43)*

72h

Control 40,46±2,88 (41,31)* 1,34±0,59 (1,36)* 0,68±0,53 (0,68) 34,89±14,24 (32,45)* 43,11±4,32 (43,92)* Nuc 34,46±4,21 (33,41)* 2,34±0,31 (2,29)* 0,75±0,74 (0,64) 14,75±1,24 (14,40)* 37,86±3,92 (36,56)*

Nuc dig 34,36±2,94 (34,87)* 2,37±0,70 (2,41)* 0,71±0,74 (0,61) 14,55±1,53 (14,13)* 37,75±2,24 (38,10)* SLα 51,47±5,76 (51,57)* 1,60±0,19 (1,60)* 0,72±0,39 (0,53) 32,24±1,51 (32,18)* 54,26±5,73 (54,65)*

SLα dig 45,48±9,55 (46,35)* 1,91±0,08 (1,88)* 0,98±0,89 (0,86) 23,93±5,85 (24,11)* 48,75±8,36 (49,53)* SLβ 45,97±5,65 (46,15)* 1,16±0,08 (1,15)* 1,29±0,29 (1,15) 39,47±2,81 (39,43)* 49,01±4,94 (49,14)*

SLβ dig 44,61±8,06 (43,25)* 1,70±0,15 (1,68)* 1,04±0,69 (0,96) 26,64±6,80 (25,06)* 47,83±6,99 (46,47)* * Indica diferencias estadísticas (p<0,05), en el test de Kruskal‐Wallis, para cada ácido graso mayoritario entre los grupos de estudio en cada punto de muestreo.


186

Figura 48: Concentraciones de los ácidos grasos minoritarios en cada punto de muestreo para los ingredientes estudiados

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 6 12 24 36 48 72

mM

IsobutíricoControl Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 6 12 24 36 48 72

mM

IsovaléricoControl Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 6 12 24 36 48 72

mM

CaproicoControl Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 6 12 24 36 48 72

mM

IsocaproicoControl Nuc Nuc dig SLα SLα dig SLβ SLβ dig


186


187

En las heces de los lactantes que reciben alimentación natural el ácido graso

predominante es el ácido acético y en menor medida el propiónico y el butírico, sin

embargo, en las heces de aquellos alimentados de manera artificial aumenta la

proporción de estos dos últimos ácidos grasos. Este hecho se debe a la utilización de

los ácidos butírico y propionico en el colon por parte e los lactantes alimentados con

leche materna (Edwards y Parret, 2002; Vasallo, 2010).

Se debe destacar que los grupos suplementados con nucleótidos digeridos y

sin digerir, dieron lugar a las mayores concentraciones de ácido propiónico. Los

muestreos llevados a cabo desde las 12 horas, mostraron diferencias

estadísticamente significativas (p<0,05) entre los grupos de estudio. A las 12 horas el

grupo control y el suplementado con suero rico en α‐lactoalbúmina digerida

mostraron las concentraciones más altas respecto al grupo splementado con el otro

suero lácteo.

Respecto a los ácidos grasos minoritarios que se presentan en la Figura 46, se

debe destacar la alta variabilidad encontrada. Atribuimos este hecho al predominio

de especies bacterianas diferentes en los tres inóculos fecales, ya que a las 0 h la

variabilidad es menor y por lo tanto a una diferente respuesta ante los mismos

ingredientes. No observamos diferencias estadísticas entre los ingredientes

estudiados (sometidos o no a digestión) para cada muestreo. El ácido isobutírico

presentó las concentraciones más altas en el grupo control y en los que se

adicionaron los lactosueros sin digerir, hecho que ocurrió también con el ácido

isocaproico y el ácido isovalérico pero en este último además se observaron elevadas

concentraciones en los grupos con concentrados proteicos digeridos. El ácido

caproico obtuvo sus valores máximos en el grupo al que se le adicionó suero lácteo

rico en β‐lactoglobulina, hecho que no debemos tener en cuenta ya que este elevado

valor, también se obtuvo a las 0 h. Todos los demás grupos mostraron valores

similares entre ellos y también en el tiempo.


188

2.2.2. Evolución de la microbiota fecal expuesta a las fórmulas del estudio

comparándolas con la leche materna

El objetivo de este ensayo fue evaluar el efecto de la fórmula suplementada

sobre la evolución de diferentes grupos microbianos de un inóculo fecal, y

compararla con una fórmula control y con leche materna. Los resultados obtenidos a

este respecto se presentan en la Figura 47.

En primer lugar se debe destacar las diferencias obtenidas en el muestreo de

las 36 h en el grupo microbiano Lactobacillus que mostró mayores concentraciones

(p<0,05) para el grupo en el que el inóculo fecal fue expuesto a la leche materna

(LM: 6,91, LM dig: 6,50 Log nºcels/ml) respecto a los otros grupos de estudio (FC:

5,60, FC dig: 5,12, FS: 5,12, FS dig: 5,44 Log nºcels/ml). Además los grupos expuestos

a la leche materna fueron los únicos que incrementaron la concentración con el

tiempo de incubación, ya que los expuestos a las fórmulas infantiles mantuvieron las

concentraciones de Lactobacillus a lo largo del tiempo.

En el último muestreo se observaron unos valores mayores (sin diferencias

estadísticas) en la concentración de Lactobacillus para el grupo expuesto a la fórmula

suplementada respecto de la fórmula control (FC: 5,66, FS: 6,07 Log nºcels/ml). Era

de esperar una diferencia incluso mayor, ya que la fórmula suplementada tiene

adicionada el mismo preparado de nucleótidos que se ha evaluado en el ensayo

anterior, donde se pudieron observar unas concentraciones mayores de

Lactobacillus debidas a este ingrediente.

En relación al grupo microbiano Bifidobacterium, todos los grupos de estudio

(FC, FS y LM) digeridos y sin digerir evolucionaron en el tiempo con un crecimiento

típico. Se pudieron observar diferencias significativas a las 24, 36 y 48 horas, siendo

los valores más altos para los grupos expuestos a las fórmulas infantiles sin digerir y

los expuestos a la leche materna, por lo que en este caso los productos resultantes

de la digestión de las fórmulas infantiles no demostraron efecto bifidogénico. Por

otro lado se debe señalar que aunque sin diferencias significativas (p=0,07), a las 12


189

h de crecimiento la fórmula suplementada obtuvo unos valores superiores (8,70 Log

nºcels/ml) a los demás grupos incluidos los expuestos a leche materna (8,12 Log

nºcels/ml). Este efecto positivo de la fórmula suplementada puede ser atribuido al

enriquecimiento de la misma con α‐lactoalbúmina, ya que en el ensayo anterior fue

este ingrediente sin digerir el que mostró efecto bifidogénico, y no ocurrió lo mismo

con el preparado de nucleótidos. No obstante, podría ser debido a que la

concentración de este suero lácteo es menor en la fórmula suplementada que la

utilizada en el ensayo con ingredientes.

Los resultados obtenidos en este trabajo para el grupo microbiano

Bifidobacterium contrastan con otras investigaciones similares. En este sentido, un

estudio in vitro realizado con inóculos fecales, llevado a cabo por Brück, Graverholt y

Gibson, 2002 y en el que evaluaron una fórmula infantil suplementada con

lactoalbúmina y otra con glicomacropeptidos, no observaron modificaciones en la

concentración de bifidobacterias pero si observaron cambios en los recuentos de E.

coli, siendo menores para el grupo suplementado con α‐lactoalbúmina. Este hecho

puede ser debido a la baja cantidad de fórmula añadida al medio de cultivo, ya que

estos autores añaden 1 % peso/volumen y nosotros reconstituimos la fórmula, según

las instrucciones del fabricante, aproximadamente a 14,5% peso volumen pero en

agua milli‐Q.

El grupo microbiano Atopobium aumentó aproximadamente en una unidad

logarítmica a lo largo del tiempo e estudio (48 h). En los puntos de muestreo 0, 6 y

12 h las concentraciones de las fórmulas infantiles fueron similares entre sí y

también semejantes a las presentadas por los grupos expuestos a leche materna, sin

embrago cuando los grupos eran sometidos a digestión los resultados presentados

por la leche materna fueron ligeramente inferiores a los de las fórmulas infantiles. A

partir de este punto el grupo expuesto a la leche materna mantuvo los valores de

Atopobium más bajos que las fórmulas infantiles sin digerir, sin embargo para la

leche materna digerida ocurrió lo contrario. Este grupo microbiano se ha relacionado

con la atopia (Kirjavainen, Salminen y Isolauri, 2003) por lo que es deseable que se

mantenga en concentraciones bajas.


190

El crecimiento fue exponencial hasta las 6 horas para el grupo

Enterobacteriacea. A esta etapa le sucedió una fase estacionaria en la que no hubo

crecimiento. Este hecho fue similar para todos los grupos de estudio excepto para el

expuesto a leche materna sin digerir que apenas tuvo modificaciones en la

concentración enterobacterias desde el primer muestreo (0 h). Además debemos

destacar que algunos grupos de estudio presentaron un crecimiento mayor que se

reflejó en el último muestreo observándose diferencias significativas. A las 48 horas

los grupos expuesto a la leche materna presentaron direferencas siginificativas

Enterobacterias siendo sus valores de (LM: 8,61; LM dig: 9,12 Log nº cels/ml)

respecto de los demás grupos de estudio (FS: 7,90; FS dig: 8,08 Log nº cels/ml),

siendo la fórmula control sin digerir la que mostró los valores menores (FC: 7,61; FC

dig: 8,10 Log nº cels/ml). Según estos resultados podemos decir que la digestión a la

que fueron sometidas las fórmulas y la leche materna produce compuestos que

estimulan el crecimiento de Enterobacterias respecto de las leches sin digerir,

especialmente la leche materna.

Como se observa en la Figura 49 la variabilidad obtenida en el grupo

microbiano Enterococcaceae fue elevada, probablemente debido al predominio de

diferentes especies bacterianas pertenecientes a esta familia en los donantes de los

inóculos fecales. La alta variabilidad no permitió observar diferencias estadísticas

entre los grupos de estudió, sin embargo se debe señalar las altas concentraciones

alcanzadas por grupo expuesto a la fórmula suplementada a las 6 horas. Además

este grupo de estudio mostró una fase de crecimiento exponencial más marcada que

los demás. Este hecho se corresponde con el observado en el ensayo anterior, ya que

los concentrados proteicos estimularon el crecimiento de este grupo microbiano.

El crecimiento descrito por bacterias totales fue similar en todos los grupos

estudiados: primero aumentó una unidad logarítmica hasta las 6 h y después

disminuyó la concentración hasta las 12 h manteniéndose estos valores hasta las 48

h. Con excepción del grupo expuesto a la leche materna digerida, que no disminuyó

de las 6 a las 12 h y mantuvo sus valores más altos que los demás grupos de estudio.

Este hecho se refleja en el muestreo realizado a las 36 h de crecimiento, ya que se


191

obtuvieron diferencias estadísticas entre los grupos de estudio (FC: 9,23; FC dig:

9,07; FS: 9,19; FS dig: 9,04; LM: 8,89y LM dig: 9,67 Log nº cels/ml).

Los grupos microbianos Bacteroides y Clostridia XVa mantuvieron constantes

sus concentraciones a lo largo del estudio en 3,5 y 5 Log nº cels/ml respectivamente.

Por lo que es probable que, no hayan evolucionado por competición con los demás

grupos microbianos. Si los grupos microbianos Clostridia XVa y Bacteroides no han

aumentado, se podría afirmar que se ha obtenido un resultado positivo, ya que altas

concentraciones de las especies de estos dos grupos se han relacionado con niños

celiacos (Collado et al., 2007). Por otro lado el grupo microbiano Clostridia IV

presentó una variabilidad muy alta entre los diferentes donantes del inóculo fecal,

probablemente por la misma razón que en el grupo Enterococcaceae.

Figura 49. Evolución de la microbiota intestinal expuesta a las fórmulas infantiles, control y suplementada, y a leche materna. * Indica diferencias estadísticas entre los grupos de estudio en el test de Kuskar‐Wallis.

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Lactobacillus

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Bifidobacterium

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48Log cels/m

lTiempo (horas)

Enterococcaceae

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cles/m

l

Tiempo (horas)

Clostridia IV

1,01,52,02,53,03,54,04,55,05,56,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/ml

Tiempo (horas)

Bacteroides

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/ml

Tiempo (horas)

Clostridia XVa

3,03,54,04,55,05,56,06,57,07,58,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Atopobium

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

11,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/ml

Tiempo (horas)

Enterobacteriaceae

FC FC dig FS FS dig LM LM dig

* * * *

*

6,06,57,07,58,08,59,09,510,010,511,0

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Log cels/m

l

Tiempo (horas)

Bacterias totales

*


192


193

Además, se calculó la relación entre los dos grupos microbianos Bacteoroides

y Bifidobacterium (Figura 50) que presentaron diferencias significativas (p<0,05) en

todos los puntos de muestreo, excepto a las 0 h. Las diferencias observadas a las 6 y

12 h mostraron los valores más altos en los grupos sometidos a digestión respecto a

los no digeridos, sin embargo en estos dos puntos de muestreo se pudo observar

cómo la fórmula suplementada digerida obtuvo valores ligeramente inferiores a los

de la fórmula control digerida y similares a los de la leche materna digerida. En Los

tres últimos muestreos se observó un incremento significativo de la relación de estos

microorganismos en los grupos expuestos a las fórmulas infantiles digeridas respecto

de los demás grupos. En un estudio in vivo llevado a cabo por Singhal et al., (2008)

también observaron un descenso de esta relación cuando los lactantes fueron

alimentados con una fórmula suplementada con nucleótidos.

Figura 50: Relación Bacteroides/Bifidobacterium para cada grupo de estudio en cada punto de muestreo.

Según los resultados obtenidos podemos afirmar que tanto las fórmulas

como la leche materna sin digerir obtienen mejores resultados en la composición de

la microbiota intestinal, ya que presentaron mayores concentraciones de

lactobacilos y bifidobacterias. Realmente no podemos extrapolar estos resultados a

lo que ocurre in vivo, debido a que tras la digestión in vitro hubo que someter a un

tratamiento térmico (100ºC 4 min) a las fórmulas infantiles y la leche materna para

0,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,80

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Bacteroides/Bifid

obacterium

Tiempo (horas)


**

* * *


194

inactivar las enzimas utilizadas en dicha digestión, por lo que las proteínas enteras

fueron desnaturalizadas. De esta manera, podremos afirmar los efectos que

producen los péptidos resultantes de la digestión por un lado y las proteínas enteras

por otro. Sin embargo en el organismo de los lactantes tras la digestión

gastrointestinal llegarán al colon proteínas sin digerir y péptidos resultantes de la

digestión, de manera que la microbiota estará expuesta a estos dos productos.

En la Tabla 27 se pueden observar los resultados obtenidos para los ácidos

grasos mayoritarios y también la relación entre el ácido acético y propiónico y la

suma total todos los ácidos orgánicos. En primer lugar debemos señalar la alta

variabilidad encontrada a partir de las 24 horas para las fórmulas infantiles digeridas,

lo que nos indica que, como se ha dicho anteriormente, existen diferentes especies

bacterianas predominantes en cada uno de los tres inóculos fecales. Cada especie

bacteriana respondió de manera diferente ante los productos de digestión de dichas

fórmulas y por lo tanto el perfil de ácidos grasos fue diferente. Esta variabilidad ya ha

sido observada en diversos estudios similares al nuestro (Salazar et al., 2008,

Arboleya et al., 2012).

En el análisis de ácidos grasos solamente fueron detectados los ácidos grasos

de cadena corta mayoritarios (acético, propiónico y butírico) y ácido capróico como

ácido graso minoritario. La producción de ácido acético, propiónico y butírico es

característica de la fermentación de hidratos de carbono, sin embargo los ácidos

isobutírico e isovalérico provienen de la fermentación proteica (a partir de valina y

leucina respectivamente) (Midtvedt y Midtvedt, 1992). Según esta afirmación

nosotros deberíamos haber observado en el grupo expuesto a la fórmula infantil

suplementada mayores concentraciones o proporciones de los ácidos grasos

resultantes de la fermentación proteica.

A pesar de la alta variabilidad observada, se pudieron apreciar diferencias

significativas en todos los puntos de muestreo, para el ácido acético, propiónico, la

relación acético/propiónico y la suma total de ácidos grasos. Además el ácido


195

butírico también obtuvo diferencias significativas a las 12 horas de crecimiento

bacteriano.

En el punto de muestreo de las 6 h, las fórmulas infantiles y la leche materna

sin digerir presentaron valores significativamente más altos en las concentraciones

de ácido acético respecto a las mismas digeridas. Este hecho nos indica que la

actividad metabólica bacteriana fue mayor cuando el inóculo fecal fue expuesto a las

muestras sin digerir. Los grupos leche materna digerida y sin digerir, mostraron

valores más bajos que los de las fórmulas infantiles, comparando siembre las

digeridas por un lado y sin digerir por otro. En los siguientes muestreos la tendencia

es similar para este ácido graso, las fórmulas infantiles siguen obteniendo valores

similares entre ellas pero superiores a los de la leche materna, cuyos valores son

semejante digerida o no. Por lo tanto las diferencias estadísticas prestadas por el

ácido acético se deben por un lado a la digestión de las fórmulas y por otro a la

menor cantidad observada en los grupos expuestos a la leche materna sometida o

no a digestión.

En relación al ácido propiónico se obtuvieron diferencias significativas para

todos los puntos de muestreo incluido el comienzo del ensayo. Hasta las 24 h estas

diferencias se debieron la concentración tan alta en los grupos que fueron expuestos

a la leche materna sometida o no a digestión. Sin embargo, a partir de este muestreo

la fórmula suplementada digerida presentó una concentración similar a los grupos de

leche materna. Se ha descrito en varios estudios que el ácido propiónico afecta de

una manera positiva al metabolismo de los lípidos, aunque también se han

observado cantidades inferiores en las heces de lactantes alimentados de forma

natural respecto de los alimentados con fórmulas infantiles, debido a que estos

lactantes lo utilizan más eficentemente que los alimentados artificialmente e y por

esa razón la concentración de estos ácidos grasos es menor en sus heces (Edwards y

Parret, 2002). La relación acético/propiónico siguió una tendencia semejante, de

forma que a partir de las 12‐24 horas la fórmula suplementada digerida obtuvo

valores similares a los de la leche materna digerida e inferiores a los de la fórmula

control digerida.


196

El ácido butírico presentó concentraciones similares en los diferentes grupos

de estudio excepto en el muestreo de las 12 h, en el que la fórmula suplementada

(sometida o no a digestión) mostró un aumento significativo respecto a los otros

grupos de estudio. Aún así no debemos tener en cuenta esta diferencia ya que ese

aumento también se observó a las 0 h del estudio, por lo que este grupo partía de

concentraciones ya elevadas de ácido butírico. Se ha postulado, que el ácido butírico

es la principal fuente energética para los colonocitos (Edwards y Parret, 2002) pero

también hay autores que afirman que este ácido orgánico, producido por especies

bacterianas pertenecientes a los de clostridios o bacteroides, es perjudicial por

participar en la patogenia de la enterocolitis necrotizante (Waligora‐Dupriet, et al.,

2009)

Se ha descrito que individuos que padecen la enfermedad de Crohn, poseen

una reducción cuantitativa y cualitativa del grupo Firmicutes, especialmente en el

grupo de Clostridium leptum. Este grupo incluye diversas bacterias productoras de

butírico como puede ser Faecalibacterium prausnitzii (Sua et al., 1999)

De forma general la suma total de ácidos grasos de cadena corta fue superior

en el ensayo realizado con en las fórmulas infantiles sin digerir en relación a la leche

materna. Este hecho se ha descrito en numerosas ocasiones en heces de lactantes

alimentados con fórmulas respecto de los alimentados con leche materna (Vasallo,

2010).

Según los resultados obtenidos podemos afirmar que el perfil de ácidos

grasos de cadena corta evolucionó de forma similar en los inóculos fecales expuestos

a la fórmula suplementada y a la leche materna.

Tabla 27: Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC). Media ± deviación estándar (mediana).

Acético Propiónico Butírico A/P TOTAL AGCC

0h

FC 19,02±3,49 (18,78) 0,18±0,04 (0,17)* 0,21±0,01 (0,21)* 108,38±10,85 (107,06)* 19,78±3,53 (19,54)FC dig 19,02±1,88 (15,95) 0,12±0,00 (0,12)* 0,43±0,02 (0,43)* 127,85±8,52 (127,84)* 17,21±1,91 (17,20)FS 15,95±2,67 (18,78) 0,17±0,01 (0,17)* 0,22±0,04 (0,22)* 109,39±7,41 (109,15)* 19,71±2,75 (19,57)

Fs dig 18,91±4,26 (18,06) 0,14±0,02 (0,14)* 1,79±0,14 (1,78)* 126,43±11,46 (127,07)* 21,27±4,39 (20,94)LM 16,23±1,92 (16,22) 0,16±0,01 (0,16)* 0,32±0,01 (0,32)* 99,49±6,63 (99,49)* 17,21±1,95 (17,20)

LM dig 18,95±2,23 (18,95) 0,15±0,00 (0,15)* 0,48±0,02 (0,48)* 129,57±10,96 (129,57)* 20,10±2,28 (20,09)

6h

FC 34,57±1,80 (34,80)* 0,87±0,20 (0,84) 0,55±0,09 (0,54) 41,54±10,52 (42,28)* 36,16±1,77 (36,23)*FC dig 24,77±1,65 (25,53)* 0,73±0,04 (0,0,72) 0,33±0,12 (0,31) 33,83±1,87 (33,62)* 26,28±1,50 (26,91)*FS 36,62±0,16 (36,64)* 0,83±0,14 (0,13) 0,79±0,41 (0,81) 44,96±7,50 (43,98)* 38,50±0,25 (38,52)*

Fs dig 27,42±3,06 (26,51)* 0,60±0,22 (0,57) 1,1±0,89 (1,10) 48,87±12,59 (49,15)* 29,7±2,18 (28,74)*LM 31,24±5,35 (31,39) * 0,98±0,17 (0,95) 0,33±0,02 (0,33) 33,28±10,88 (33,79)* 32,90±5,25 ( 33,06)*

LM dig 22,86±1,23 (22,38)* 0,93±0,21 (0,87) 0,41±0,09 (0,42) 25,38±4,73 (27,16)* 24,59±1,13 (24,16)*

12h

FC 62,98±7,10 (62,80)* 1,01±0,08 (1,02)* 0,68±0,12 (0,69)* 63,03±10,79 (59,15)* 64,93±7,07 (64,84)*FC dig 27,00±0,86 (27,11)* 0,83±0,20 (0,81)* 0,39±0,16 (0,39)* 34,16±9,10 (34,67)* 28,64±1,04 (28,78)*FS 64,69±9,37 (63,05)* 1,13±0,22 (1,14)* 1,00±0,40 (0,98)* 58,05±4,74 (58,38)* 67,11±9,33 (65,44)*

Fs dig 31,55±4,83 (30,54)* 1,43±0,51 (1,42)* 1,14±0,89 (1,08)* 25,08±11,41 (25,09)* 34,65±5,63 (33,58)*LM 31,02±9,48 (29,58)* 1,34±0,07 (1,35)* 0,35±0,04 (0,36)* 23,51±8,40 (22,18)* 33,02±9,28 (31,60)*

LM dig 27,04±5,20 (24,66)* 1,97±0,43 (1,83)* 0,49±0,10 (0,52)* 13,80±1,19 (13,23)* 29,87±5,56 (27,18)*

24h

FC 92,22±13,36 (89,68)* 1,18±0,08 (1,19)* 0,65±0,17 (0,65) 78,44±11,30 (77,65)* 94,39±13,42 (91,78)*FC dig 45,46±9,74 (46,19)* 1,90±0,68 (1,93)* 0,45±0,08 (0,45) 28,00±15,41 (26,38)* 48,22±9,34 (49,06)*FS 88,82±11,31 (87,59)* 1,18±0,29 (1,15)* 0,83±0,57 (0,95) 77,24±9,80 (76,09)* 91,32±11,44 (90,19)*

Fs dig 53,30±17,72 (53,30)* 3,24±1,57 (3,18)* 1,08±0,70 (1,56)) 22,38±16,31 (22,41)* 57,90±16,95 (58,63)*LM 44,09±12,10 (42,36)* 3,53±1,45 (4,01)* 0,76±0,45 (0,77) 17,13±15,85 (9,61)* 48,78±10,71 (47,94)*

LM dig 56,78±2,45 (56,18)* 3,12±1,54 (3,18)* 0,38±0,04 (0,38) 22,63±12,00 (21,85)* 60,76±1,14 (60,42)*


197

198

Tabla 27. (continuación) Concentraciones de los ácidos grasos de cadena corta mayoritarios (mM), relación acético/propiónico (A/P) y suma de ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC). Media ± deviación estándar (mediana).

Acético Propiónico Butírico A/P TOTAL AGCC

36h

FC 84,72±7,44 (85,55)* 0,89±0,30 (0,88)* 0,67±0,08 (0,68) 102,44±27,82 (101,77)* 86,55±7,82 (87,34)*

FC dig 44,56±16,69 (44,64)* 2,28±1,46 (2,15)* 0,35±0,15 (0,36) 33,21±28,47 (33,54)* 47,59±15,59 (47,64)*

FS 87,96±8,67 (86,74)* 1,08±0,29 (1,07)* 1,01±0,35 (1,03) 84,34±15,60 (82,66)* 90,33±8,75 (89,15)*

Fs dig 56,34±21,45 (57,64)* 4,79±2,79 (4,87)* 1,13±0,89 (1,12) 18,54±15,57 (17,08)* 62,81±20,01 (64,06)*

LM 61,34±10,27 (59,81)* 2,23±0,60 (2,30)* 0,75±0,55 (0,75) 30,26±13,44 (27,62)* 64,64±9,09 (63,15)*

LM dig 53,66±6,72 (53,90)* 4,66±0,56 (4,58)* 0,43±0,13 (0,43) 11,77±2,84 (11,86)* 59,16±6,47 (59,44)*

48h

FC 98,13±9,61 (96,68)* 1,20±0,32 (1,12)* 0,63±0,10 (0,67) 84,85±19,30 (82,01)* 100,26±9,94 (98,50)*

FC dig 48,37±17,28 (49,06)* 2,87±0,99 (2,60)* 0,35±0,13 (0,36) 19,72±12,05 (20,21)* 52,01±16,74 (52,97)*

FS 95,80±3,33 (96,13)* 1,25±0,14 (1,23)* 0,99±0,48 (1,00) 77,23±10,09 (79,51)* 98,30±3,46 (98,43)*

Fs dig 58,31±20,83 (60,40)* 6,69±4,37 (6,42)* 1,10±0,79 (1,13) 14,96±12,82 (15,06)* 66,58±17,73 (68,97)*

LM 68,31±17,04 (66,20)* 2,28±0,29 (2,34)* 0,91±0,62 (091) 30,95±11,16 (30,80)* 71,83±16,04 (69,66)*

LM dig 56,76±1,64 (56,26)* 5,27±0,15 (5,29)* 0,46±0,09 (0,47) 10,78±0,51 (10,55)* 63,15±1,10 (63,14)*

72h

FC 102,42±13,25 (101,58)* 1,07±0,14 (1,07)* 0,56±0,07 (0,55) 96,12±9,33 (95,45)* 104,29±13,36 (103,44)*

FC dig 50,28±15 (50,56)* 2,01±0,16 (2,08)* 0,35±0,12 (0,36) 24,84±6,28 (25,73)* 53,06±15,44 (53,25)*

FS 99,72±5,92 (99,57)* 1,14±0,09 (1,12)* 0,82±0,29 (0,80) 87,32±2,97 (88,51)* 101,95±6,18 (101,76)*

Fs dig 58,58±20,29 (59,48)* 5,66±3,16 (5,59)* 1,09±0,80 (1,10) 15,47±12,22 (15,54)* 65,82±18,24 (66,79)*

LM 73,85±23,10 (73,52)* 2,31±0,25 (2,30)* 0,91±0,61 (0,91) 33,15±13,70 (32,97)* 77,43±22,13 (77,11)*

LM dig 60,81±7,12 (58,79)* 5,48±0,22 (5,45)* 0,47±0,07 (0,47) 11,07±0,84 (10,77)* 67,40±6,89 (65,34)*


198


199

En la Figura 51 se muestran los resultados de la variación de pH. No

obtuvimos diferencias significativas en ningún punto de muestreo, y sin embargo,

podemos diferencias tres tendencias, una en la que la variación de pH se encuentra

entre 1,5 y 2,5 unidades y corresponde a las fórmulas infantiles sin digerir, otra en la

que dicha variación es menor, 1‐1,5 unidades y la presentan las fórmulas infantiles

digeridas y la Leche materna sin digerir y por último la que mostró la leche materna

digerida que varió su pH sólo en 0,5‐1 unidades.

Figura 51. Variación de pH en cada punto de muestreo durante la evolución del inoculo fecal expuesto a las fórmulas infantiles y a la leche materna.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

6h 12h 24h 36h 48h 72h

Variación de

pH



200

3. ESTUDIO III: Comparación de la microbiota intestinal de lactantes, alimentados

con leche materna, procedentes de dos regiones españolas.

Los individuos de las dos regiones estudiadas, (Asturias y Murcia) cumplieron

los mismos criterios de inclusión no presentando diferencias iniciales en parámetros

como el peso al nacer o la edad gestacional. En la Figura 52, se muestra la evolución

de los grupos microbianos estudiados en los dos grupos de estudio, lactantes de

Asturias y lactantes de Murcia, alimentados con leche materna. Los resultados en

esta gráfica se expresan como media y desviación estándar, aunque el análisis

estadístico se realizó sobre la mediana de los datos aplicando test no paramétricos ya

que las variables no siguieron una distribución normal.

A pesar de la alta variabilidad interindividual encontrada, pudimos observar

algunas diferencias estadísticas (p<0,05) debidas a la región de nacimiento de los

lactantes. En este sentido, el grupo Bacteroides mostró concentraciones más altas

(p<0,05), en el primer punto de muestreo (8‐10 días) en los lactantes nácidos en

Murcia respecto a los nácidos en Asturias (8,30 ± 1,90 vs. 6,90 ± 1,86 Log nº cels/g). A

esta edad, los lactantes de Murcia también presentaron concentraciones

significativamente superiores a los de Asturias en el análisis de bacterias

pertenecientes al género Staphylococcus (6,64 ± 1,08 vs 5,62 ± 1,01 Log nº cels/g).

Del mismo modo, se observaron diferencias significativas en el último punto de

muestreo (90 días de edad) para la familia Enterobacteriaceae, apareciendo los

mayores recuentos, para este grupo microbiano, en los lactantes nácidos en Asturias

frente a los nácidos en Murcia (9,90 ± 0,65 vs 9,17 ± 0,84 Log nº cels/g).

La evolución de los grupos Enterococcaceae, Lactobacillus, Bifidobacterium,

Atopobium, Clostridia IV y Clostrida XVa fue similar en los dos grupos de estudio, no

presentando diferencias significativas entre ellos. Sin embargo, se pudo observar,

que en los últimos muestreos, algunos de estos grupos como Atopobium y C. leptum

se van diferenciando dependiendo de la región de nacimiento observándose mayores

concentraciones en los lactantes procedentes de Asturias para el primer grupo y en

los de Murcia para el segundo grupo. Estos resultados podrían indicar a que,


201

posiblemente, si se hubiera realizado un muestreo adicional hacia a los 4 meses de

vida, se podrían haber encontrado diferencias estadísticamente significativas en

estos grupos bacterianos.

Se realizó el test exacto de Fisher sobre los resultados obtenidos para

comparar los porcentajes de muestras positivas en los dos grupos de individuos. Tras

el análisis se observaron diferencias significativas (p<0,05) en el grupo C. leptum para

los tres puntos de muestreo (a los 8, 30 y 90 días de vida). Aunque las

concentraciones de este microorganismo fueron incrementándose con el tiempo en

los lactantes nácidos en Murcia, su frecuencia fue menor que en los lactantes nácidos

en Asturias (25 vs. 64% a los 8 días de edad, 55 vs 77% a los 30 días de edad y 65 vs

92% a los 90 días de edad). Para los demás grupos microbianos no se encontraron

diferencias estadísticas entre los porcentajes de muestras positivas.

Al analizar la correlación entre las poblaciones microbianas de los dos grupos

de estudio observamos correlaciones negativas significativas (p<0,05) entre la

concentración de Bacteroides y Enterococcaceae para los dos grupos de lactantes (R=

‐0,208 y ‐0,268 para lactantes de Asturias y Murcia, respectivamente). Sin embargo,

el grupo microbiano Bacteroides, se correlacionó positivamente y significativamente,

con las concentraciones de Bifidobacterias en los lactantes de Asturias y Murcia (R=

0,319 y 0,409, respectivamente). También encontramos correlaciones positivas

(p<0,05) en los dos grupos de estudio para los siguientes grupos microbianos:

Enteroccaceae y Enterobacteriaceae (Asturias; R= 0,473 y Murcia; R= 0,276), entre C.

leptum y C. coccoides (Asturias: 0,234 y Murcia: 0,360); Bifidobacterium y

Lactobacillus (Asturias; R= 0,368 y Murcia; R= 0,258); Bifidobacterium y Atopobium

(Asturias; R= 0,412 y Murcia R= 0,213). Por otro lado, se observó una correlación

positiva (p<0,05) dentro del grupo de lactantes de Murcia entre el grupo Atopobium y

C. coccoides (R= 0,467 y p<0,05) y en el grupo de Asturias entre Bacteroides y

Atopobium (R= 0,662 y p<0,05)

Figura 52: Evolución de las diferentes poblaciones bacterianas estudiadas en los dos grupos de lactantes procedentes de dos regiones geográficas diferentes ( Asturias, Murcia). *Indica diferencias estadísticas (U test, p<0,05)

34567891011

0 20 40 60 80 100

Log nº cels/g

Días de vida

Enterococcaceae

34567891011

0 20 40 60 80 100

Log nº cels/g

Días de vida

Bifidobacterium*

34567891011

0 20 40 60 80 100

Log nºcels/g

Días de vida

Enterobacteriaceae

*

34567891011

0 20 40 60 80 100

Log nº

cels/g

Días de vida

Bacteroides

34567891011

0 20 40 60 80 100

Log nº cels/g

Días de vida


34567891011

0 20 40 60 80 100

Log nº

cels/g

Días de vida

Clostridium leptum

*

34567891011

0 20 40 60 80 100

Log nº

cels/g

Días de vida

Staphylococcus

34567891011

0 20 40 60 80 100

Log nº

cels/g

Días de vida

Lactobacillus

3

4

5

6

7

8

9

10

11

0 20 40 60 80 100

Log nº

cels/g

Días de vida

Atopobium group


202


203

En la Figura 53 se presentan los resultados de las diferentes poblaciones

microbianas, observadossin tener en cuenta la edad de los lactantes. Tal y como se

aprecia, se detectaron concentraciones significativamente mayores en las heces de los

lactantes nácidos en Murcia respecto a las de los nácidos en Asturias para los grupos

microbianos Bacteroides (8,26 ± 2,17 vs 7,17 ± 1,94 Log nº cels/g) y Staphylococcus

(6,13 ± 1,21 vs 5,48 ± 1,41 Log nº cels/g).

Aunque sin diferencias estadísticas, debemos destacar que las concentraciones

de Clostridium leptum fueron ligeramente superiores en las heces de los lactantes de

Murcia respecto a las de los de Asturias (p=0,06) mientras que los niveles de

Lactobacillus fueron inferiores en los lactantes nácidos en Murcia (p=0,08). Este hecho

es interesante ya que todos los lactantes fueron alimentados con leche materna, de

este modo podemos considerar que existen otros factores, por determinar, que están

condicionando la composición de la microbiota intestinal. Estos factores deben estar

relacionados con el origen geográfico o con los hábitos alimentarios de la madre según

el del lugar de nacimiento.

Figura 53. Concentraciones de las diferentes poblaciones microbianas sin tener en cuenta la edad de los lactantes.


204

Diferencias en la microbiota intestinal por causas geográficas han sido

observadas en otros estudios, como en el llevado a cabo por Fallani et al., (2010), en el

que encontraron diferencias en la composición de la microbiota intestinal de lactantes,

alimentados exclusivamente con leche materna, de diferentes lugares europeos. Estos

autores, observaron altos niveles de Bacteroides en una de las localidades estudiadas

que se situaba en el sur de España, respecto de todas las demás que se encontraban

en el norte de Europa. Este hecho fue observado también en nuestro estudio en los

lactantes de nácidos en Murcia (sur de España) frentes a los nacidos en Asturias (norte

de España), por lo que podemos afirmar que altas concentraciones de Bacteroides en

las heces de lactantes alimentados con leche materna puede ser una característica

determinada por la zona geográfica de nacimiento.

En nuestro ensayo, las diferencias estadísticas observadas se limitan a unas

determinadas poblaciones bacterianas, de modo que la composición microbiana de las

heces fue similar en los dos grupos analizados. Este hecho, era previsible debido a la

homogeneidad de los grupos de estudio. Ésto también se confirma con el análisis de

correlaciones en el que se observó que prácticamente coinciden en los dos grupos de

lactantes. Los resultados nos indican entonces que, son pocas las diferencias

encontradas pero que éstas pueden ser debidas al origen geográfico. Los diferentes

hábitos dietéticos de las dos regiones estudiadas han sido mostrados en varios

estudios (Serra‐Majem et al., 2003; da Silva, 2010). Chocarro‐Egüaras (2003) según los

datos del Ministerio Español de Agricultura y Alimentación, relacionados con la comida

consumida en casa pueden ser la causa de las diferencias observadas en nuestro

estudio. En este sentido, Se han identificado, por dichos autores, tres regiones

diferentes, Islas Canarias, Sureste (en la que se encuentra Murcia) y Noroeste (en la

que se encuentra Asturias). La dieta murciana se caracteriza por el consumo de

vegetales frescos, olivas, ternera, arroz y cerveza mientras que la asturiana por

legumbres, ternera, cerdo, pescado, leche y vino.

La leche materna es considerada el alimento ideal para el lactante y como

consecuencia, la composición de la microbiota intestinal de estos individuos ha sido

considerada como microbiota saludable. Al encontrar diferencias entre dos cohortes


205

de individuos nácidos mediante parto vaginal, alimentados exclusivamente con leche

materna y que no han sido tratados con antibióticos nos debemos plantear ¿cuál es

entonces la composición saludable de la microbiota intestinal? No se puede afirmar

que uno de los dos grupos de estudio presentara una microbiota más saludable que el

otro. En este sentido, definimos microbiota saludable como la comunidad microbiana

intestinal que ayuda al hospedador a mantener un estado de salud bajo ciertas

condiciones ambientales. Así, la misma composición de microbiota intestinal puede

contribuir al estado de salud o a la enfermedad n función de las condiciones

ambientales (Ley, 2010).


206

4. Estudio IV: Evolución de la microbiota intestinal de lactantes alimentados con

fórmula infantil suplementada con α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA.

En este estudio, se ha evaluado si los ingredientes añadidos a la fórmula infantil

(suero rico en α‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA), ejercen efecto alguno sobre la

microbiota intestinal ya que, son muchos los estudios que demuestran los beneficios

que aportan estos ingredientes sobre la salud del niño (sistema inmune, perfil

aminoacídico…) (Hawkes et al., 2006; Davis et al., 2008; Singhal et al., 2010; Trabulsi et

al., 2011). Sin embargo su influencia sobre la microbiota intestinal ha sido poco

investigada hasta el momento. Se realizó un análisis cuantitativo, mediante técnicas

moleculares, sobre la composición de la microbiota intestinal en las heces de los

lactantes. Las muestras fueron obtenidas en las 4 visitas realizadas a la consulta de

pediatría, previamente programadas en el estudio.

En la Tabla 28 se muestran los límites de detección, coeficientes de regresión

(R2) de las rectas de calibrado y las eficiencias de las PCR cuantitativas para cada grupo

microbiano analizado. Se observó una eficiencia mayor del 90% en todos los grupos

microbianos estudiados excepto para Clostridia XVa cuya eficiencia fue del 81,12 ±

1,13 %.


Limite detección

(cels /g) Eficiencia (%) R2

Atopobium 1∙103 96,67 ± 3,03 0,999

Bacteroides 1∙103 98,8 ± 2,95 0,999

Clostridia XVa 5∙103 81,12 ±1,13 0,990

Clostridia IV 6∙103 93,15±4,77 0,999

Enterobacteriaceae 1∙105 98,47±2,16 0,995

Enterococcaceae 2∙105 100,88 ± 2,23 0,993

Lactobacillus spp. 1∙104 92,65 ± 1,82 0,999

Bifidobacterium spp. 1∙103 99,48 ± 1,68 0,997

Staphylococcus spp. 1∙104 93,92 ± 4,26 0,990


207

A las muestras analizadas que obtuvieron valores por debajo del límite de

detección, se les asignó como valor el límite de detección para poder, de este modo,

realizar el análisis estadístico. Los resultados cuantitativos obtenidos en el estudio de

la microbiota intestinal, para los cuatro muestreos realizados (2, 4, 7‐8 y 12 semanas

de vida) se presentan en las Figuras 51, 52, 53 y 54. Dichos resultados se expresan

como log cels/g de heces y se representan mediante diagramas de cajas.

Son varios los estudios que han investigado, in vitro, la acción antimicrobiana

de los péptidos obtenidos de la digestión de la proteína α‐lactoalbúmina (Brück,

Graverholt y Gibson 2002 y 2003b), mientras que, otros autores han observado un

efecto bifidogénico (Kee et al., 1998). Por esta razón, en nuestro estudio se hace

previsible encontrar una reducción en aquellas poblaciones microbianas

potencialmente patógenas y un aumento en las poblaciones beneficiosas por acción de

estos péptidos.

A las dos semanas de vida (Figura 54), las mayores concentraciones observadas

correspondieron a dos grupos microbianos anaerobios estrictos (Bacteroides y

Bifidobacterias) así como al grupo anaerobio facultativo Enterobacteriaceae. Este

hecho se corresponde con los datos descritos en la bibliografía ya que, en primer lugar,

el intestino del recién nácido es colonizado por los microorganismos anaerobios

facultativos que van consumiendo el oxígeno y que posteriormente son desplazados

por los anaerobios estrictos (Reinhardt et al., 2009).

En este primer punto de muestreo, se obtuvieron diferencias significativas

(p<0,05) en las concentraciones de Atopobium‐Colinsella y Clostridia IV entre los tres

grupos de estudio (LM, FC y FS). Dichas concentraciones en las heces de los lactantes

alimentados con leche materna: (4,39 (4,36‐4,41) y 4,63 (4,47‐5,09) log nº cels/g heces

respectivamente) en los alimentados con fórmula suplementada (4,43 (4.41‐4.51) y

4,43 (4,41‐4,51) log nº cels/g heces respectivamente), fueron similares. Mientras que

los lactantes alimentados con la fórmula control presentaron valores superiores. (6,13

(4.42‐7.97 7,49 (4,61‐8,43) log nº cels/g heces, respectivamente). Atopobium‐

Collinsella y Clostridia IV son dos grupos microbianos que comprenden especies


208

potencialmente patógenas (Waaij, 1999), y que por lo tanto, es deseable mantener en

concentraciones relativamente bajas. En este sentido, se ha comprobado que la

microbiota de los lactantes alimentados con leche materna, grupo que va a ser nuestra

referencia, mantiene un número más bajo de estos microorganismos (Bezirtzoglou,

Tsioysias y Welling, 2011). Una reducción en el grupo Clostridia no sólo confiere

beneficios para el hospedador por su potencial patógeno, sino que también,

concentraciones elevadas de estos microorganismos se asocian con la aparición de

enfermedad atópica (Kirjavainen, Salminen y Isolauri, 2003)

El grupo Bacteroides no presentó diferencias significativas (p<0,05) entre los

tres grupos de estudio, posiblemente por la alta variabilidad interindividual encontrada

en este grupo microbiano. Sin embargo, pudimos observar que las heces de los

lactantes alimentados con la fórmula objeto de estudio (FS), presentaron

concentraciones menores, de este grupo microbiano, que los de los otros dos grupos

(LM: 9,19 (7,06‐9,95), FC: 9,94 (9,16‐10,30) y FS: 6,30 (5,85‐10,04) log nº cels/g). En

base a estos resultados, la fórmula control se parece más a la leche materna, este

hecho podríamos considerarlo como un resultado positivo ya que el grupo del que

hablamos se clasifica como potencialmente patógeno (Waaij, 1999), y suele presentar

niveles más altos en lactantes alimentados con fórmula respecto de los alimentados

con leche materna. En el estudio comparativo de la microbiota fecal de lactantes

alimentados con leche materna de dos regiones diferentes de España observamos

como característica de los niños de Murcia que presentaban un elevado número de

Bacteroides siendo las concentraciones observadas parecidas a las presentadas por los

lactantes alimentados con una fórmula estándar (Peso‐Echarri et al., 2011).

Respecto al grupo microbiano Clostridia XVa, debemos destacar que los

lactantes pertenecientes al grupo LM y al grupo FS mostraron menor variabilidad que

los pertenecientes al grupo FC aunque las medianas obtenidas en los tres grupos

fueron similares.

En los niños alimentados con la fórmula suplementada, encontramos niveles

menores de los grupos Atopobium, Bacteroides y Clostridium. En este sentido, se hace


209

necesario destacar que en el caso de niños celíacos se han observado niveles altos de

Clostridium y Bacteroides, que se correspondieron con sobreproducción de citoquinas

inflamatorias que condujo a la alteración de la integridad de la barrera intestinal

(Collado et al., 2007). Por lo tanto, el bajo número encontrado de estos

microorganismos, podría sugerir que la fórmula suplementada puede inducir a una

menor incidencia en la aparición de procesos inflamatorios intestinales.

Los niveles de Enterobacterias y Enterococos fueron significativamente

superiores en las heces de los lactantes alimentados con fórmulas infantiles, respecto

de los de lactantes alimentados de forma natural. En este sentido, en base a la

composición de la fórmula suplementada, habrían sido previsibles unos niveles

inferiores de estos grupos en los lactantes alimentados con la misma ya que, son varios

los estudios que han observado cierta actividad antimicrobiana para la proteína

adicionada (Pihlanto‐Leppälä et al., 2000; van Hooijdonk, Kussendrager y Steijns, 2000;

Brück et al., 2003ab). Como se ha descrito, anteriormente, estos lactantes poseen

microbiota más diversa que los alimentados con leche materna. Por ejemplo, se han

observado concentraciones mayores de los grupos Bacteroides, Clostridium y

Enterobacterias en lactantes alimentados con fórmulas estándar respecto de los

alimentados con leche materna (Adlerberrth y Wold, 2009). Bezirtzoglou, Tsiotsias y

Wellin (2011) describen, en otro estudio más reciente, en el que compararon la

microbiota intestinal de lactantes alimentados con leche materna y fórmula infantil,

que, las concentraciones de los grupos Atopobium y Bacteroides se vieron

incrementadas en las heces de los niños alimentados artificialmente

Por otro lado los grupos Bifidobacterium spp y Lactobacillus spp mostraron

concentraciones similares para los tres grupos de estudio. Es ampliamente reconocido

que la principal diferencia entre la microbiota intestinal de lactantes alimentados con

fórmulas infantiles y leche materna son los recuentos superiores de bifidobacterias y

bactobacilos, observados en los niños alimentados de forma natural. Sin embargo, el

avance en el desarrollo de las fórmulas infantiles aproximándose, cada vez más a la

leche materna, ha hecho que el perfil de estas bacterias en los dos grupos de lactantes

difiera cada vez menos (Alderberth y Wold, 2009).


210

En la Tabla 29, se puede observar el porcentaje de muestras positivas en cada

grupo de estudio (LM, FC y FS) para los distintos grupos microbianos analizados. Para

los tres tratamientos, encontramos un 100% de muestras positivas en los grupos,

Bacteroides, Enterobacterias, Lactobacilos y Bifidobacterias.

Los valores de frecuencia de muestras positivas, no reflejaron los resultados

obtenidos en la cuantificación de los grupos microbianos. El grupo de lactantes

alimentados con fórmula suplementada, presentó un porcentaje de muestras positivas

para el grupo microbiano Atopobium similar al de los lactantes alimentados con leche

materna y, significativamente inferior a los alimentados con la fórmula control; lo

mismo ocurrió con el grupo Clostridia IV, aunque sin diferencias significativas

(p=0,099). Por otro lado, también obtuvimos diferencias significativas en los

porcentajes de muestras positivas para el género Staphylococcus spp y el grupo

Enterococcaceae. En este caso, las heces de los lactantes alimentados con fórmulas

obtuvieron valores similares entre sí, y diferentes a los alimentados con leche materna.

Los niños alimentados de forma natural obtuvieron menores porcentajes de muestras

positivas para el grupo Enterococcaceae.

Tabla 29. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el primer muestreo que corresponde con la edad de dos semanas.

Leche

materna Fórmula control

Fórmula suplementada

p

ATOPOBIUM (6/33) 18,20% (8/13) 61,50% (3/15) 20% 0,016

BACTEROIDES (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐

CLOSTRIDIA XIVa (13/33) 39,40% (6/13) 46,20% (8/15) 53,30% 0,697

CLOSTRIDIA IV (20/33) 60,60% (12/13) 92,30% (9/15) 60% 0,099

ENTEROBACTERIACEAE (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐

ENTEROCOCCACEAE (26/33) 78,80% (13/13) 100% (15/15) 100% 0,045

LACTOBACILLUS (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐

BIFIDOBACTERIUM (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐

STAPHYLOCOCCUS (32/33) 97% (10/13) 76,90% (9/15) 60% 0,002

p: significación obtenida al realizar el test de Fisher (p<0,05 diferencias significativas)

En este primer muestreo encontramos mayor porcentaje de muestras positivas

para el género Staphylococcus en los lactantes alimentados con leche materna. En este

sentido, se ha descrito en la bibliografía que las heces de los lactantes alimentados con


211

leche materna presentan mayor número de bacterias pertenecientes al género

Staphylococcus que los alimentados con fórmulas infantiles (Jiménez et al., 2008).

Dentro de este genero, sin embargo, la especie predominante es Staphylococcus

epidermidis (coagulasa negativa) y posiblemente su aparición en la leche y en las heces

de los lactantes sea debido al contacto con la piel de madre (Martín et al., 2012).

Los resultados del segundo muestreo, en el cual los niños contaban

aproximadamente con 4 semanas de vida, se pueden observar en la Figura 55. En este

muestreo, los grupos microbianos dominantes en los tres grupos de estudio fueron

Bacteroides, Bifidobacterium y Enterobacteriaceae, aunque debemos tener en cuenta

que, en general, las concentraciones de las otras poblaciones microbianas analizadas

fueron mayores en las heces de los lactantes alimentados con fórmulas infantiles

frentes a los alimentados con lehe materna.

Del mismo modo, como sucedió en el primer muestreo, se encontraron

concentraciones significativamente mayores (p<0,05) para Enterobacteriaceae y

Enterococcaceae en los grupos de lactantes alimentados con fórmulas infantiles (FC:

9,35 (9,05‐10,00) y 7,87 (7,31‐8,31), FS: 981 (9,29‐10,47) y 8,02 (7,64‐8,25) log nº

cels/g, respectivamente) respecto de los alimentados con leche materna (9,02 (8,64‐

9,75) y 6,66 (6,24‐7,60) log nº cels/g, respectivamente). Aunque, se debe destacar que

los niños alimentados con la fórmula suplementada mostró en los dos casos valores

ligeramente inferiores a los presentados por el grupo alimentado con la formula

control.

Es probable que el hecho de no encontrar diferencias significativas en los

grupos Atopobium y Clostridia XIVa haya sido debido a la alta variabilidad obtenida. Sin

embargo, se repite el patrón anterior, de modo que los valores de estos

microorganismos en el grupo de leche materna fueron similares a los presentados por

el grupo de fórmula suplementada, aunque difiriendo de los obtenidos en el grupo de

niños alimentado con la fórmula control.


212

En la Tabla 30 se presentan los resultados de los porcentajes de muestras

positivas en el segundo muestreo. Estos resultados no se correspondieron con los

cuantitativos ya que, para las frecuencias de dichas muestras, no se encontró ninguna

diferencia estadística. El género Staphylococcus spp mostró una significación de 0,06

con un porcentaje de muestras mayor en el grupo alimentado con leche materna que

en los otros dos grupos de estudio.

Tabla 30. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el segundo muestreo que corresponde con la edad de cuatro semanas.

Leche



p

ATOPOBIUM (15/33) 45,5% (9/13) 69,2% (10/15) 66,7% 0,243

BACTEROIDES (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐

CLOSTRIDIA XIVa (19/33) 57,6% (9/13) 69,2% (10/15) 66,7% 0,777

CLOSTRIDIA IV (22/33) 66,3% (10/13) 76,9% (10/15) 66,7% 0,869


ENTEROCOCCACEAE (28/33) 84,8% (13/13) 100% (15/15) 100% 0,150

LACTOBACILLUS (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐


STAPHYLOCOCCUS (25/33) 75,8% (8/13) 61,5% (4/15) 26,7% 0,06

p: significación obtenida al realizar el test de Fisher (p<0,05 diferencias significativas).

Entre las 7 y 8 semanas de edad de los lactantes, se realizó el tercer muestreo

de sus heces y se analizó la composición de la microbiota intestinal, cuyos resultados

se presentan en la Figura 56. De nuevo encontramos diferencias estadísticamente

significativas en el grupo Atopobium, sin embargo, las concentraciones de este

microorganismo en las heces de los lactantes alimentados con las dos fórmulas

infantiles fueron similares (FC: 6,94 (6,38‐8,10), FS: 6,74 (6,29‐7,16) log nº cels/g) y

superiores a los observados en las heces de los lactantes alimentados con leche

materna (LM: 4,40 (4,38‐6,70) log nº cels/g).

El efecto positivo de la fórmula suplementada sobre el grupo microbiano

Clostridia IV se mantuvo en valores semejantes que en los anteriores muestreos,

observándose concentraciones similares a las obtenidas por los lactantes

alimentados de forma natural. Las diferencias estadísticas (p<0,05) encontradas

para este grupo microbiano mostraron que, las heces de los lactantes alimentados


213

con la fórmula control presentaron valores superiores respecto de los otros dos

grupos (LM: 4,47 (4,46‐7,13), FC: 7,67 (4,60‐8,92), FS: 4,81 (4,51‐8,20) Log nº

cels/g). Según estos resultados se puede afirmar que el perfil de Clostridia IV en

heces de lactantes alimentados con fórmula suplementada es similar al de

aquellos alimentados con leche materna.

Debemos destacar las diferencias estadísticas encontradas en los grupos

microbianos Enterobacteriaceae y Enterococcaceae. En éstos, ya que los niveles

observados fueron superiores en las heces de neonatos pertenecientes a los grupos

alimentados con fórmulas infantiles respecto a los alimentados con leche materna.

Estos resultados se corresponden con los obtenidos al analizar la microbiota mediante

técnicas dependientes de cultivo. No observándose, en este caso, que la fórmula

suplementada ejerciera el efecto deseado ya que estos dos grupos se consideran

potencialmente patógenos (Waaij, 1999). En este sentido, en un estudio similar

realizado por Rochat et al., (2007) observaron que la fórmula infantil enriquecida con

suero lácteo (70% de la fuente de proteínas) mostró resultados superiores de estos dos

grupos microbianos en relación a la leche materna, aunque sin diferencias

significativas. Por otro lado un estudio in vitro llevado a cabo por Sauer et al., (2010)

observó un incremento en el crecimiento de ciertas cepas de E. coli al añadir

determinadas concentraciones de nucleótidos. Sin embargo, el crecimiento de

Enterococcus faecalis y Enterococus faecium no se vió estimulado tras la adición de

estos ingredientes. Mateo, Dave y Stein (2004) también obtuvieron una estimulación

del crecimiento de coliformes asociado con un descenso en los niveles de clostridios, al

suplementar con nucleótidos en un estudio in vivo realizado con lechones.

La presencia de diferencias tan marcadas en los niveles de enterococos entre

los grupos alimentados con leche materna y fórmulas infantiles, también fueron

descritas por otros autores como Euler et al., (2005) en fórmulas infantiles adicionadas

con prebióticos.

Los niveles de Lactobacilos, Estafilococos y Bifidobacterias en las heces de los

lactantes de 7‐8 semanas de edad, fueron similares en los tres grupos de estudio.


214

Respecto a las frecuencias de muestras positivas correspondiente a la edad de

7‐8 semanas sólo se observaron diferencias significativas en dos grupos microbianos

(Tabla 31): Atopobium y Staphylococcus spp que marcaron la diferencia entre la leche

materna y las fórmulas infantiles.

Tabla 31. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el tercer muestreo que corresponde con la edad de 7‐8 semanas.

Leche



p

ATOPOBIUM (15/33) 45,5% (12/13) 92,3% (12/15) 80,0% 0,005

BACTEROIDES (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐

CLOSTRIDIA XIVa (23/33) 69,7% (11/13) 84,6% (14/15) 93,3% 0,175

CLOSTRIDIA IV (15/33) 45,5% (10/13) 76,9% (8/15) 53,3% 0,173


ENTEROCOCCACEAE (26/33) 81,3% (13/13) 100% (14/15) 93,3% 0,204

LACTOBACILLUS (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐


STAPHYLOCOCCUS (22/33) 66,7% (5/13) 38,5% (4/15) 26,7% 0,027


Los resultados cuantitativos del cuarto muestreo (12 semanas de vida para

los neonatos) se representan en la Figura 57. En ella se pueden observar diferencias

estadísticas en los grupos Atopobium, Clostridia XVa, Enteboacteriaceae y

Enterococcceae pero todas ellas debidas a la leche materna, ya que los niveles

bacterianos de las heces de los niños alimentados con ambas fórmulas infantiles

fueron similares entre sí. No obstante, debemos destacar que los lactantes

alimentados artificialmente presentaron mayores concentraciones de los siguientes

grupos microbianos: Atopobium, Clostridium y Enterococcus, siendo menores para el

género Staphylococcus.


215

Tabla 32. Frecuencia de muestras positivas para los diferentes grupos microbianos analizados en el cuarto muestreo que corresponde con la edad de 12 semanas.

Leche



p

ATOPOBIUM (17/33) 51,5% (12/13) 92,3% (14/15) 93,3% 0,000

BACTEROIDES (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐

CLOSTRIDIA XIVa (25/33) 75,8% (13/13) 100% (15/15) 100% 0,035

CLOSTRIDIA IV (22/33) 66,7% (12/13) 92,3% (13/15) 92,9% 0,080


ENTEROCOCCACEAE (32/33) 97,0% (13/13) 100% (15/15) 100% 1

LACTOBACILLUS (33/33) 100% (13/13) 100% (15/15) 100% ‐


STAPHYLOCOCCUS (20/33) 60,6% (7/13) 53,8% (3/15) 21,4% 0,029


Por lo tanto, según los resultados obtenidos en el estudio, podemos afirmar

que existe efecto protector por parte de la fórmula suplementada manteniendo las

concentraciones de Atopobium y Clostridium leptum, similares a las de la leche

materna a las 2, 4 y 7‐8 semanas de vida, y que desaparece en este último muestreo,

en el cual los resultados cuantitativos se vieron reproducidos en los cualitativos,

encontrando diferencias significativas en los mismos grupos microbianos. Este hecho

puede ser debido a que la cantidad adicionada tanto de lactoalbúmina como de

nucleótidos, a la fórmula objeto de estudio (α‐lactoalbúmina: 2 g/L y nucleótidos: 32

mg/L) fue menor que en otras investigaciones realizadas al respecto por otros autores.

Por ejemplo, un estudio reciente sobre fórmulas infantiles enriquecidas con

lactoalbúmina adiciona 2,3 g /L (Trabulsi et al., 2011); y otro en el que enriquecen

fórmula infantil con nucleótidos, lo hacen con 72 mg/L (Yau et al., 2003).

En relación a las concentraciones de los dos grupos beneficiosos,

bifidobacterias y lacobacilos, (Waaij, 1999) presentadas por los lactantes alimentados

con ambas fórmulas infantiles (Fc y FS), se debe señalar que fueron superiores en el

primer muestreo y similares en el tercero, a las obtenidas por Salvini et al., (2011) en

las heces de lactantes alimentados con una formula suplementada con prebioticos

Figura 54. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 2 semanas de vida (primer muestreo) (o valores atípicos y ∗valores extremos). Ψ Indica diferencias estadísticas (p<0,05).

ΨΨ Ψ

Ψ


216

Figura 55. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 4 semanas de vida (segundo muestreo) (o valores atípicos y ∗valores extremos). Ψ Indica diferencias estadísticas (p<0,05).

ΨΨ Ψ


217

Figura 56. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 7‐8 semanas de vida (tercer muestreo) (o valores atípicos y ∗valores extremos). Ψ Indica diferencias estadísticas (p<0,05).

ΨΨ Ψ

Ψ


218

Tabla 57. Concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiados a las 12 semanas de vida (cuarto muestreo) (o valores atípicos y ∗valores extremos). Ψ Indica diferencias estadísticas (p<0,05).

Ψ

ΨΨ

ΨΨ


219


220

En un estudio llevado a cabo por Harmsen et al., (2000) en neonatos de 12

días de edad, no pudieron cuantificar debido a las concentraciones tan bajas para los

grupos microbianos Collinsella y Atopobium. No obstante, observaron un mayor

porcentaje de muestras positivas en los niños alimentados con fórmulas infantiles que

en los alimentados con leche materna. Además, analizaron muestras de individuos de

otras edades (niños, adultos y ancianos) que presentaron concentraciones de

aproximadamente 109 y 1010 cels/g de dichos grupos microbianos. Este hecho puede

hacernos afirmar que la abundancia de estos grupos microbianos se asocian con el tipo

de alimentación y la edad del niño.

En un ensayo in vitro llevado a cabo por Brück, Graverholt y Gibson (2002) se

observó que la proteína α‐lactoalbúmina produce un descenso en las concentraciones

de tres grupos microbianos clasificados como potencialmente patógenos (Bacteroides,

Clostridium y E. coli). Las técnicas utilizadas en dicho estudio fueron dependientes de

cultivo y aunque fueron diferentes a las nuestras, debemos tomar en consideración

que este trabajo mostró resultados similares en los grupos microbianos Bacteroides y

Clostridia ya que encontramos diferencias estadísticas en el grupo de Clostridia IV

durante los tres primeros muestreos con niveles inferiores en los grupos LM y FS

respecto de la FC. En relación al grupo Bacteroides, en el primer muestreo observamos

una concentración significativamente menor en los lactantes alimentados con fórmula

suplementada respecto a los otros dos grupos. Por otro lado, nosotros analizamos la

familia Enterobacteriaceae y las concentraciones fueron superiores, aunque no

siempre con diferencias significativas entre los grupos alimentados con fórmula infantil

y los alimentados con leche materna.

El grupo de investigación de Brück realizó dos ensayos in vivo con fórmulas

enriquecidas con α‐lactoalbúmina, en el primero (2003a), realizado en monos Rhesus,

observaron que la microbiota intestinal de los lactantes alimentados con la fórmula

suplementada era más parecida a la de los individuos alimentados con leche materna

que a la de los lactantes alimentados con fórmula estándar. En el segundo estudio

(2006a) realizado en niños, estos autores no obtuvieron conclusiones claras acerca del

papel de esta proteína sobre la población de Bifidobacterias, hecho que justifican por


221

partir de concentraciones muy altas de dichos microorganismos y por la alta

variabilidad individual encontrada. Aún así observaron también un descenso en las

poblaciones de Clostridios. Estos dos estudios utilizaron métodos moleculares

independientes de cultivo.

Son muy pocos los estudios que evalúan el efecto de los nucleótidos sobre la

microbiota intestinal, siendo además la mayoría de ellos in vitro. Es necesario señalar

también que algunos de estos estudios muestran resultados contradictorios (Gil et al.,

1986; Balmer, Hanvey y Wharton, 1994). Recientemente, se ha realizado un estudio in

vivo en el que se añadió a la fórmula infantil la misma cantidad de nucleótidos que la

empleada en este estudio (31 mg/L) y en el que se observó una menor proporción

Bacteroides/Bifidobacterium en las heces de los lactantes alimentados con la fórmula

suplementada respecto a los alimentados con la fórmula control (Singhal et al., 2008).

En el presente estudio, también se obtuvo en los lactantes alimentados con fórmula

suplementada, menor proporción de la relación Bacteroides/Bifidobacterium en el

primer muestreo, ya que los niveles de Bacteroides fueron menores en las heces de los

lactantes alimentados con la fórmula suplementada.

Con estos datos, podemos afirmar que el efecto protector encontrado durante

los tres primeros muestreos podría ser debido a la combinación de ambos ingredientes

empleados en la fórmula infantil suplementada aunque, cuando realizamos el estudio

in vitro, la proteína α‐lactoalbúmina fue la que proporcionó mejores resultados sobre

la microbiota fecal.

En la Tabla 33 se presentan los resultados obtenidos al realizar el análisis

estadístico sin tener en cuenta la edad de los lactantes. Todos los grupos microbianos

con excepción de Lactobacillus mostraron diferencias significativas (p<0,05) entre los

grupos de estudio. Sin embargo, una vez más, atribuimos éstas a la leche materna, ya

que las concentraciones de los diferentes grupos microbianos estudiadas eran

parecidas en las fórmulas infantiles ensayadasy diferentes, a su vez, a las obtenidas en

el grupo de lactantes alimentados con leche materna. Sólo debemos destacar que, en

el caso de los grupos microbianos Clostridia IV y Bacteroides, la fórmula suplementada


222

dio lugar a valores semejantes a los presentados por que recibieron leche materna y

diferentes a los que recibieron fórmula control.

Tabla 33. Resultados cuantitativos para cada grupo microbiano estudiado sin tener en cuenta la edad de los lactantes.

p: significación obtenida al realizar el test de Kruskal‐Wallisr (p<0,05 diferencias significativas).

Nuestro grupo de investigación llevó a cabo también el análisis de ácidos grasos

de cadena corta en las heces de los lactantes y aunque se encontró alta variabilidad

interindividual se pudo concluir que, en el último muestreo, la fórmula suplementada

produjo un perfil de ácidos grasos similar al obtenido en lactantes alimentados con

leche materna (Vasallo, 2011). Realizamos entonces un análisis de correlación de

Spearman entre los diferentes grupos microbianos y los ácidos grasos analizados y las

correlaciones significativas (p<0,005) más destacadas fueron las siguientes: una

relación positiva para el grupo Bacteroides y la producción de propiónico, e isovalérico

en las heces de los grupos alimentados con leche materna (r= 0,495 y r=0,507) y con

fórmula suplementada (r= 0,741 y r=0,578). Sin embargo, este mismo grupo

microbiano fue correlacionado negativamente con el ácido caproico en el grupo

alimentado de forma natural (r=‐0,075) y positivamente en el alimentado con la

fórmula suplementada (r=0,602). Hecho que era de esperar ya que el acido caproico es

resultado de la fermentación de proteica y esta fórmula contiene proteínas

adicionadas.

Leche



mediana Q1‐Q3 mediana Q1‐Q3 mediana Q1‐Q3 p

ATOPOBIUM 4,40 4,38‐6,55 7,09 5,92‐7,92 6,63 4,43‐7,15 0,000

BACTEROIDES 9,78 6,66‐10,21 9,59 8,83‐10,10 9,14 6,01‐9,81 0,012

CLOSTRIDIA XVa 5,01 4,37‐7,03 6,84 4,45‐7,49 6,59 4,44‐7,55 0,004

CLOSTRIDIA IV 4,56 4,47‐7,14 8,10 4,87‐8,74 4,84 4,51‐8,15 0,000

ENTEROBACTERIACEAE 8,98 8,38‐9,43 9,54 8,93‐10,08 9,62 9,13‐10,19 0,000

ENTEROCOCCACEAE 6,75 6,28‐7,45 7,71 7,32‐8,20 8,02 7,45‐8,48 0,000

LACTOBACILLUS 7,18 5,80‐7,64 7,02 6,61‐7,21 6,81 6,54‐7,15 0,241

BIFIDOBACTERIUM 8,68 8,27‐9,00 8,50 7,94‐8,89 8,36 7,63‐8,69 0,003

STAPHYLOCOCCUS 5,80 4,71‐6,87 5,06 4,72‐6,43 4,73 4,71‐5,90 0,004


223

Para la fórmula suplementada sólo se encontró una correlación significativa,

entre el grupo Clostridia XVa y el ácido valérico.En general se debe destacar que las

correlaciones entre los grupos alimentados con leche materna y fórmula suplmentada

fueron similares y en parte diferentes a las obtenidas en el grupo alimentado con la

fórmula control.

VI. Conclusiones

225

VI. CONCLUSIONES

A partir de los resultados descritos en el presente trabajo se han obtenido las siguientes

conclusiones:

Estudio I

1.1. El preparado de nucleótidos, en la misma concentración que en la fórmula infantil,

mejoró el porcentaje de captación de calcio, aunque el efecto depende de la concentración

de mineral añadido. La adición de lactosuero rico en α‐lactoalbúmina, produjo un ligero

aumento en el porcentaje de captación de hierro independientemente de la dosis de mineral

añadida a la monocapa.

1.2. La disponibilidad del calcio y del cinc que contiene la leche materna es superior a la

de las fórmulas infantiles, aunque los ingredientes de la fórmula suplementada logran

mejorar el porcentaje y la eficiencia de captación de ambos minerales y el porcentaje de

transporte de calcio. Sin embargo, no producen modificaciones en la disponibilidad del

hierro.

Estudio II

2.1. La evaluación de cultivos puros de L. gasseri y B. longum expuestos a Los

concentrados proteicos (ricos en α‐lactoalbúmina y β‐lactoglobulina) muestra un estimulo

en el crecimiento del primer microorganismo, mientras que sólo el suero rico en α‐

lactoalbúmina incrementa los recuentos del segundo. Además, tras la digestión de ambos

sueros se produce un efecto inhibitorio sobre la cinética de E. coli. La adición del preparado

de nucleótidos a la concentración 72 mg/L presenta un ligero efecto bifidogenico.

2.2. Los ingredientes funcionales estudiados son capaces de modificar la microbiota

intestinal del inóculo fecal de manera beneficiosa. Los nucleótidos sometidos o no a

digestión dan lugar a las concentraciones más altas de Lactobacillus y a un aumento de la

producción de ácido propiónico a las 72h. Además, los dos sueros lácteos

VI. Conclusiones

226

independientemente de su tratamiento estimulan el crecimiento de Bifidobacterium y la

producción de ácido acético y butírico. Solamente el suero rico en β‐lactoglobulina produce

un aumento del grupo microbiano Atopobium al final del ensayo.

2.3. Tras la exposición de la leche materna al inóculo fecal se confirma un perfil

caracterizado por una mayor concentración de bacterias beneficiosas y un descenso en

grupos potencialmente patógenos (Clostridia IV) aunque tras su digestión se observan altos

recuentos de enterobacterias. Los recuentos de los grupos microbianos estudiados fueron

similares para las ambas fórmulas infantiles, aunque la fórmula suplementada da lugar a un

perfil de ácidos grasos semejante al obtenido en los grupos expuestos a la leche materna.

Estudio III

3.1. El estudio de la composición de la microbiota intestinal de dos poblaciones de

lactantes alimentados exclusivamente con leche materna y procedentes de dos regiones de

España diferentes (Asturias y Murcia) muestran diferencias en las concentraciones de

algunas poblaciones microbianas (Bacteroides, Staphylococcus, Clostridium leptum y

Enterobacteriaceae). Se puede afirmar que las poblaciones bacterianas intestinales se ven

influidas por el origen geográfico del hospedador, por lo que se define microbiota intestinal

saludable como aquella que ayuda a mantener un estado saludable bajo ciertas condiciones

medioambientales.

Estudio IV

4.1. Tras el ensayo clínico, se observa que La composición de la microbiota fecal de

lactantes alimentados con leche materna difiere de la de los lactantes alimentados con

fórmulas infantiles, obteniendo menores concentraciones de los grupos potencialmente

patógenos (Enterobacteriaceae, Enterococaceae, Clostridia IV, Clostridia XVa y Atopobium).

4.2. En contraste con los resultados obtenidos en los estudios in vitro, la adición de

ingredientes funcionales a la fórmula suplementada no produce un incremento en las

concentraciones de las bacterias beneficiosas durante los tres primeros meses de vida. Sin

VI. Conclusiones

227

embargo, produce una modificación en la composición de la microbiota intestinal de los

lactantes reduciendo algunos grupos microbianos con potencial patógeno (Clostria IV,

Atopobium y Bacteroides) respecto a los lactantes alimentados con la fórmula control.

Perspectivas futuras

Serían necesarios más ensayos para poder profundizar en los mecanismos a nivel celular por

los cuales se produce el efecto beneficioso de los ingredientes presentes en fórmula

suplementada, tanto en la disponibilidad mineral como en la microbiota intestinal así como

en las funciones fisiológicas en los lactantes.

VI. Conclusiones

228

VII. Resumen

229

VII. RESUMEN

La leche materna es el alimento ideal para el crecimiento y desarrollo de los

recién nácidos durante la primera etapa de su vida. Sin embargo, la alimentación con

leche materna no siempre es posible o deseable, por lo que se hace necesario

desarrollar fórmulas infantiles que sustituyan a la lactancia natural proporcionando un

crecimiento y desarrollo óptimos al lactante. α‐lactoalbúmina y nucleótidos son

compuestos presentes en la leche materna y que se encuentran en menor cantidad en

la leche vaca, por lo que actualmente son añadidos a las fórmulas infantiles

consiguiendo así un acercamiento a la composición de la leche materna. Se han

descrito números efectos beneficiosos relacionados con estos ingredientes, entre ellos

estimulación del sistema inmune, reparación y diferenciación del tracto

gastrointestinal. Sin embargo, todavía son escasos los estudios que evalúan su

influencia sobre la disponibilidad mineral o sobre la microbiota intestinal.

En la presente tesis doctoral se ha evaluado el efecto de estos dos ingredientes

funcionales (α‐lactoalbúmina y nucleótidos) sobre la disponibilidad mineral y sobre la

microbiota intestinal. Para ello, se ha modificado la composición de la fracción proteica

de una fórmula infantil aumentado su contenido en α‐lactoalbúmina, y añadiendo

nucleótidos y DHA.

El presente trabajo fue dividido en cuatro estudios, los dos primeros se

realizaron in vitro y los dos últimos in vivo. En el estudio I, se evaluó el efecto de los

ingredientes funcionales (α‐lactoalbúmina y nucleótidos) sobre la disponibilidad

mineral (calcio, hierro y cinc). Para ello, se llevaron a cabo dos ensayos, uno que se

realizó con los ingredientes puros y soluciones patrón de cada mineral y otro en el que

se evaluó una fórmula suplementada con los ingredientes funcionales comparándola

con una fórmula control y como referencia se utilizó la leche materna. Todos los

ensayos se realizaron con la línea celular Caco‐2 en un sistema bicameral que permite

medir el transporte mineral. La evaluación in vitro de la funcionalidad de los

ingredientes sobre la microbiota intestinal se determinó en el estudio II que también

VII. Resumen

230

se llevo a cabo en dos ensayos. El primero, se realizó sobre cultivos puros de tres

bacterias intestinales que fueron expuestas a dos concentrados proteicos, uno rico en

α‐lactoalbúmina y otro en β‐lactoglobulina y a dos concentraciones del preparado de

nucleótidos. Todos los ingredientes se evaluaron antes y después de una digestión in

vitro. En el segundo ensayo, se estudió la evolución de un inóculo fecal expuesto a los

mismos ingredientes que el ensayo anterior o a las fórmulas infantiles descritas para el

estudio de la disponibilidad mineral. Se analizaron diferentes grupos microbianos

mediante PCR a tiempo real y también los ácidos grasos de cadena corta. Por último,

en los estudios III y IV se investigó la influencia del lugar de nacimiento y la influencia

de los ingredientes añadidos a la fórmula suplementada sobre la composición de la

microbiota intestinal.

En los resultados obtenidos en el estudio I se observó un mayor porcentaje de

captación celular de una solución 10mM de calcio con la adición de nucleótidos. En

relación a los resultados de hierro, sólo se observaron diferencias estadísticamente

significativas en la retención celular con la adición de una concentración de 50 µM,

siendo los valores más altos para el grupo al que se le adicionó α‐lactoalbúmina. Se

pudo observar que aunque la disponibilidad de minerales de la leche humana es la más

alta, la adición de α‐lactoalbúmina y nucleótidos mejoró la disponibilidad de calcio y

cinc de las fórmulas infantiles evaluadas mediante la línea celular Caco‐2.

Respecto a los resultados del primer ensayo del estudio II, sobre la actividad

funcional de los ingredientes, los dos concentrados proteicos estimularon el

crecimiento de las bacterias bacterias lácticas (Lactobacillus gasseri y Bifidobacterium

longum) a si como sus digeridos ejercieron un efecto inhibitorio sobre la cinética de

Escherichia coli. Por otro lado, la adición del preparado de nucleótidos a la

concentración de 72 mg/L estimuló el crecimiento de B. longum.

En el ensayo 2 llevado a cabo con el inóculo fecal de lactantes expuesto a los

diferentes ingredientes (suero lácteo rico en α‐lactoalbúmina o β‐lactoglobulina y

nucleótidos), se observó que los concentrados proteicos en las dosis utilizadas en este

estudio incrementaron el crecimiento de bifidobacterias respecto del grupo control,

VII. Resumen

231

observandose también un aumento en la concentración de ácido acético. Aunque sin

diferencias estadísticas, el grupo microbiano Lactobacillus vio incrementada su

concentración con la adición de nucleótidos. Además, ninguno de nuestros

ingredientes dio lugar a un incremento en los grupos microbianos Bacteroides y

Clostridium leptum, a los que pertenecen especies patógenas. Estos resultados se

correspondieron con los obtenidos en el siguiente ensayo con las fórmulas infantiles y

la leche materna, ya que se encontró un aumento de los grupos beneficiosos en el

grupo expuesto a la fórmula suplementada, aunque sin diferencias significativas.

También se observó que las poblaciones microbianas de Bacteroides y Clostridia XVa

mantuvieron constantes sus concentraciones a lo largo del estudio. Por otro lado,

según los resultados obtenidos en relación a los ácidos grasos, podemos afirmar que

el perfil de ácidos grasos de cadena corta en la evolución de los inóculos fecales

expuestos a la fórmula suplementada fue similar al obtenido al trabajar con leche

materna.

En el estudio III en el que se comparó la composición de la microbiota intestinal

de dos poblaciones de lactantes, alimentados exclusivamente con leche materna, pero

procedentes de dos regiones diferentes de España (Murcia vs Asturias), se observaron

diferencias en algunas poblaciones microbianas.

Por otro lado, los resultados obtenidos en el estudio IV demostraron que la

fórmula infantil suplementada con α‐lactalbúmina y nucleótidos produce cambios

beneficiosos sobre la composición de la microbiota intestinal, reduciendo algunos de

los grupos microbianos potencialmente patógenos

VII. Resumen

232

VIII. Summary

233

VIII. SUMMARY

Breast milk is considered the best food for the newborn during the first months of

life; however, when breast‐feeding is not possible, infants depend either partially or totally

on infant formulas to satisfy their nutritional requirements during their first year of life.

Alpha‐lactalbumin and nucleotides are compounds naturally present in breast milk and

nowadays, are added to infant formulas as ingredients since have been reported to be

important for growth, repair and differentiation of gastrointestinal tract in infants. However,

there are little studies on its role on microbiota composition and mineral absorption.

The main objective of this doctoral thesis was to evaluate the effect of these two

functional ingredients (α‐lactalbumin and nucleotides) on both mineral availability and

intestinal microbiota. For this purpose, the composition of the protein fraction of infant

formula was modified by increasing its α‐lactalbumin content, and adding nucleotides and

DHA.

This work was divided in four studies. Studies I and II were performed in vitro and

studies III and IV in vivo. In study I, we evaluated the effect of functional ingredients (α‐

lactalbumin and nucleotides) on mineral availability (calcium, iron and zinc). Pure ingredients

and standard solutions of each mineral were assessed. Formula supplemented with

functional ingredients was compared with a control and human milk was used as reference

milk. All assays were performed with the Caco‐2 cell line seeded in a bicameral system. In

study II, the in vitro evaluation of the interaction of intestinal microbiota with ingredients

was determined. First, pure cultures of intestinal bacteria were exposed to two protein

concentrates, one rich in α‐lactalbumin and the other one rich in β‐lactoglobulin; moreover,

two concentrations of nucleotides were prepared. All ingredients were evaluated digested

and undigested. In the second experiment of this study, the evolution of a fecal inoculum

exposed to the same ingredients as the previous trial or infant formula, was studied.

Microbial groups were analyzed by RT‐ PCR and, short chain fatty acids were determined by

GC. Finally, in studies III and IV we assessed the influence of place of birth and the influence

of different ingredients on intestinal microbiota composition by p‐PCR.

VIII. Summary

234

Results on mineral availability showed that, the addition of nucleotides increased the

percentage of calcium cell uptake at 10 mM calcium. Regarding to iron, statistically

significant differences in cell retention were observed at 50 µM, the highest values were

observed for the group exposed to nucleotides. It was also observed that although the

availability of minerals was high in human milk, the addition of α‐lactalbumin and

nucleotides improved the availability of calcium and zinc from infant formulas by the Caco‐2

cell line.

Regarding the functional activity of ingredients, the two protein concentrates

stimulated the growth of lactic bacteria (Lactobacillus gasseri and Bifidobacterium longum);

meanwhile products from digestion exerted an inhibitory effect on the kinetics of

Escherichia coli. Furthermore, the addition of nucleotides at concentration 72 mg/L,

stimulated the growth of B. longum.

Experiments with the infant fecal inoculum exposed to the different ingredients

(whey‐lactalbumin‐rich α or β‐lactoglobulin and nucleotides), showed that protein

concentrates at the same concentration used in infant formula, increased the growth of

bifidobacteria respect to the control group; also an increase in acetic acid concentration was

observed. Despite no statistical differences were observed, Lactobacillus microbial

concentration increased with the addition of nucleotides. Furthermore, none of our

ingredients resulted in an increase in the potentially pathogenic microbial groups,

Bacteroides and Clostridium leptum. These results are consistent with those obtained

ininfant formula and breast milk, showing an increase of beneficial microbial populations in

the group exposed to supplemented formula; however, no significant differences were

observed. Microbial population concentrations of Bacteroides and Clostridia XVa remained

constant throughout the study. Furthermore, according the results obtained on fatty acids,

we can affirm that the profile of short chain fatty acids in the evolution of fecal inoculum

when exposed to the supplemented formula was similar to that reported in breast milk.

In study III, the intestinal microbiota composition of two breast‐fed infant’s

populations from two different locations of Spain, were compared. Some differences in

microbial populations were observed between the two different geographical location.

VIII. Summary

235

On the other hand, results obtained in the study IV showed that infant formula

supplemented with α‐lactalbumin and nucleotides showed beneficial changes on the

intestinal microbiota composition, reducing some of the potentially pathogenic microbial

groups.

VIII. Summary

236

IX. Bibliografía

237

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