UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE CHOTA

LINEA DE INVESTIGACION:

SALUD PÚBLICA Y PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES ENDÉMICAS

EQUIPO DE INVESTIGACIÓN:

RESPONSABLE: M. Sc. Joseph Obed Ricaldi Sarapura - UNACH

MIEMBROS: M. Sc. René Antonio Hinojosa Benavides

Dr. Alejandro Martínez Martínez – Universidad Antioquia - Colombia

Dra. Diana Margarita Márquez Fernández – U. Antioquia - Colombia FECHA DE REGISTRO : 23 de Junio del 2016 FECHA DE INICIO FECHA DE CULMINACIÓN

Junio – 2016

Creada por ( Ley Nº 29531)

PROYECTO DE INVESTIGACION:

EVALUACION DE BIOACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO ETANOLICO Y ACEITE

ESENCIAL DE Satureja incana FRENTE A BACTERIAS PATOGENAS DE INCIDENCIA ALIMENTARIA

:

:

01 Julio del 2016

30 de Junio de 2017

Capítulo I: Planteamiento del Problema

1.1. Descripción y formulación del Problema

Las plantas medicinales constituyen una fuente natural importante en la búsqueda de

nuevos compuestos con actividades farmacológicas de interés frente a patógenos en

especial de incidencia alimentaria. Las enfermedades infecciosas de transmisión

alimentaria son causadas por bacterias, hongos, parásitos y virus, los cuales son

transmitidos directa o indirectamente de persona a persona o por medio de vectores.

Adicionalmente, algunas enfermedades que se consideraban controladas están

emergiendo, incrementando el riesgo de epidemias, afectando la salud humana a través

de los alimentos.

Los extractos macerados en etanol, extraídos de materiales vegetales que reportan

actividad farmacológica empírica, contienen una gama compuestos bioactivos que

muestran actividad inhibitoria y/o letal frente a agentes bacterianos causantes de

enfermedades, este hecho abre un amplio interés de carácter farmacéutico orientada al

soporte científico que valide la aplicación de uso de material biológico de la flora local

frente a bacterias patógenas de incidencia alimentaria para la aplicación en la salud

pública.

En la actualidad existe un notable interés por el uso de compuestos antimicrobianos

derivados de las plantas como conservantes naturales de alimentos, en contraposición

acerca de la salubridad de los compuestos sintéticos usados con este fin. El diccionario

de la Real Academia Española define como ―natural‖ aquello ―perteneciente o relativo

a la naturaleza‖. Si bien esta definición engloba sustancias de distinta procedencia, es el

reino vegetal donde encontramos la mayor variedad de productos potencialmente útiles,

aplicables especialmente en afecciones causadas por microorganismos. Entre estos

productos se encuentran los extractos macerados en medio acuosos y los aceites

esenciales, los cuales reportan compuestos bioactivos de acción antimicrobiana según

varios autores, debida a la presencia de carvacrol, timol, pcimeno, compuestos fenólicos,

entre otros; cuyo posible uso por parte de la industria farmacéutica/alimentaria justifica

diversos estudios llevados a cabo para determinar las propiedades de bioactividad

antimicrobianas de las sustancias que componen el extracto acuoso (usualmente usado

en infusión) y aceites esenciales (fracción volatil).

El presente proyecto busca contribuir al conocimiento científico de la bioactividad

antimicrobiana del extracto acuoso y aceite esencial de Satureja incana frente a

microorganismos patógenos de incidencia alimentaria.

.Este retorno progresivo hacia el uso de los productos de origen natural y o nativo

procedente de la flora promisoria, a diferencia de los aditivos y fármacos sintéticos en las

distintas industrias alimentarias, farmacéuticas, tecnología de envases, aditivos y

conservantes ha sido estimulado, en parte, por el regreso hacia lo natural que se ha

producido en forma genérica en la sociedad basada en el conocimiento de las

implicancias a la salud pública, debido a los siguiente:

- El desarrollo de conocimiento científico validado de compuestos químicos bioactivos

que muestran acción antimicrobiana frente a patógenos de incidencia en la salud

pública, especialmente los que tienen incidencia alimentaria.

- Existe un interés creciente por instituciones internacionales, empresas privadas y

centros de investigación en realizar la valoración de especies con potencial de uso

farmacológico y uso como aditivo alimentario para la conservación.

Actualmente no se reportan estudios respecto a la evaluación de Bioactividad

antimicrobiana del extracto etanolico y aceite esencial de Satureja incana frente a

microorganismos patógenos de incidencia alimentaria en consulta de revistas científicas

indizadas, y repositorio de tesis, y trabajos institucionales de investigación.

De persistir este problema: Se estarían perdiendo la posibilidad de:

- Identificar y valorar la riqueza natural de compuestos químicos de la especie Satureja

incana contenido en extracto etanólico y sus aceites esenciales en el ámbito de la

provincia de Chota.

- Determinar la bioactividad antimicrobiana del extracto etanolico y aceite esencial del

aceite esencial de Satureja incana frente a bacteria patogenas de incidencia

alimentaria.

- Fortalecer la institución universitaria en unidades de investigación vinculadas al estudio

y valoración del potencial farmacológico/alimentario mediante investigaciones de

bioactividad antimicrobiana, propiciaria la formación de jóvenes investigadores en

concordancia a la Nueva Ley Universitaria, la ley marco de Acreditación Universitaria,

y al Licenciamiento Universitario exigido por la SUNEDU.

Considerando lo mencionado anteriormente, se plantea las siguientes preguntas que

regirán la investigación:

Pregunta central:

- ¿Cuál es la bioactividad antimicrobiana que muestran los extractos etanolicos y aceite

esencial de Satureja incana frente a bacterias patógenos de incidencia alimentaria?

Preguntas específicas:

- ¿Cuál es la concentración de compuestos químicos presentes en el extracto etanolico

y aceite esencial de Satureja incana?

- ¿Cuál es el bioactividad antimicrobiana que muestra el extracto etanólico y aceite

esencial de Satureja incana frente a Salmonella Typhi?

- ¿Cuál es el bioactividad antimicrobiana que muestra el extracto etanólico y aceite

esencial de Satureja incana frente a E. coli (E. coli resistente a amoxicilina y E.coli

sensible a amoxicilina)?

- ¿Cuál es el bioactividad antimicrobiana que muestra el extracto etanólico y aceite

esencial de Satureja incana frente a Staphylococcus aureus?

- ¿Cuál es el bioactividad antimicrobiana que muestra el extracto etanólico y aceite

esencial de Satureja incana frente a Shigela?

El presente proyecto busca contribuir proporcionando información científica experimental

sobre la bioactividad antimicrobiana de los compuestos fitobioactivos presentes en el extracto

etanolico y aceite esencial de Satureja incana

1.2. Objetivos: General y Específicos

Objetivo General

Evaluar la bioactividad antimicrobiana del extracto etanolico y aceite esencial de

Satureja incana frente a bacterias patógenas de incidencia alimentaria Salmonella

Thiphy, E Coli, Estafilococcus aureus, y Shigela

Objetivo especifico

Objetivo específico 1

Determinar la concentración de compuestos químicos activos presentes en el extracto

etanólico y aceite esencial de Satureja incana

Objetivo específico 2

Determinar la bioactividad antimicrobiana del extracto etanolico y aceite esencial de

Satureja incana frente a Salmonella Typhi.

Objetivo específico 3

Determinar la bioactividad antimicrobiana del extracto etanolico y aceite esencial de

Satureja incana frente a E Staphylococcus aureus

Objetivo específico 4

Determinar la bioactividad antimicrobiana del extracto etanolico y aceite esencial de

Satureja incana frente a Shigella.

Objetivo específico 5

Mejorar el desarrollo institucional mediante la investigación científica conducente a la

formación inductiva de jóvenes investigadores en evaluación de la bioactividad de

extractos etanólicos y aceites esenciales de la flora nativa local.

Capitulo II: Marco Teórico

2.1. Antecedentes

La acción farmacológica de las especies de Satureja tienen varios reportes de acción

etnomedicinales y etnofarmaceuticas (Jafari, Ghavidel, & Zarshenas, 2016) como:

anticonvulsionante (Zolfagharian, Margan, & Hosseinzadeh, 2016); antifúngico (Sadeghi,

Shiravi, Ghanbari, Alinegadi, & Zarrin, 2010), acción repelente (Pirmohammadi, y otros,

2016), actividad antioxidante (Hajdari, y otros, 2016), y actividad antimicrobiana frente a

S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa, E. cloacae, K. pneumoniae, E. coli, S. mutans,

S. viridans, C. tropicalis C. glabrata (Vagionas, Graihou, Ngassapa, Runyoro, & Chinou,

2007), Candida albicans (Mahboubi & Kazempour, 2016) , Helicobacter pylori (Falsafi,

Moradi, Mahboubi, Rahimi, Montaz, & Hamedi, 2015) , Clostridium perfringens (coutinho,

Soares, Mendes, Cardoso, Alves, & Hilsdorf, 2011) y bacterias fitopatogenas (Kotan, y

otros, 2013).

Ricaldi (2008), en su ponencia extracción y caracterización físico química de aceite

esencial de Satureja Incana obtenida por fluido de arrastre hidrotérmico presentada en el

Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos Lima-2010 menciona que la

configuración de: tejido (fresco y deshidratado), estadio vegetativo (antes de la floración

y en floración) así como la carga de material vegetal en una unidad de extracción por

fluido arrastre hidrotérmico guarda relación en el rendimiento de la extracción de aceite

esencial. En dicho trabajo reporta que los rendimientos óptimos: 0,30 – 0,33% en tejido

fresco y 0,36-0,38 en tejido deshidratado en estado vegetativo antes de floración y en

floración respectivamente, con una carga optima de 550g para un extractor de 18Lt de

capacidad. El aceite esencial de S. incana muestra la siguiente característica físico-

química: densidad relativa: 0,871-0,874, índice de refracción 1,4893-1,4923, índice de

acidez: 0,65-2,04 y índice de ester 25,98-32,85 (análisis de laboratorio según normas

técnicas peruanas).

Ricaldi & Martinez (2014) en su investigación Cromatografia de gases-espectrometria de

masas de compuestos fitobioactivos del aceite esencial de Satureja incana reporta

Rendimiento g/g del aceite esencial de S. incana por fluido de arrastre hidrotermico 0,49

base seca: composición fitoquímica predominante concentración sesquiterpenica 66,37

% y monoterpenos 30,07 %; siendo los compuestos mayoritarios: germacreno D 25,91

%, beta-cariofileno 22,10 %, alfa –ocimeno 12,62 %, 4(8)-p-mentona 6,73 %, humuleno

3,95 %, cariofileno oxido 3,08 %, limoneno 2,44 %; y minoritarios: beta bourbeneno 1,95

%, beta-ocimeno 1,78 %, espatulenol 1,66 %, beta -linalol 1,64 %, dlisopulegol 1,66 %,

alfa -cubebeno 1,51 %, Cadineno 0,89 %, alfa -pineno 0,45 %, beta -pineno 0,52 %.

Mihajilov et al (2009), en su investigacion titulado Chemical composition and antimicrobial

activity of Satureja hortensis L. essential oil.pubicado en Central European Journal of

Biology vol 4 No. 3: 411-416, reporta que el aceite esencial de S. hortensis tiene como

componentes principales carvacrol (67%), ϒ-Terpineno (15,3%) y p-cimeno (6.73%). El

aciete fue extraido en un aparato clevenger. El analisis de componentes quimicos fue

realizado mediante CG/EM con una columna HP-5MS (30m x 0,25mm), la temperatura

del horno fue programada linealmente de 40-260°C con un incremento de 4°C/min. Se

preparo un solucion etanolica de la muestra de aceite esencial al 1%, injectando 200nL

modo split, en el equipo Hewlwtt-Packard HP G1800C series IIGCD.

Sonboli, Fakhari, Kanami, & Yousefzadi (2004), en su investigacion Antimicrobial activity,

essential oil composition and micromorphorlogy of Tricomes of Satureja laxiflora C Koch

from Iran, publicado en Verlag der Zeitschriff fur Naturforschung: 777781, reporta que

mediante un analisis de cromatografia gaseosa y cromatografia de gas acoplada a

espectrometria de masa realizado al aceite esencial de S. laxiflora evidencia 33

componentes que representan el 99.1% del total del aceite esencial caracterizado. Los

componentes majores son: timol (63.9%) y ϒ-Terpineno (11.9%), seguido por carvacrol

(4.8%), p-cimeno (3.9%), geraniol (3.2%) y geranil acetato (3.1%). El aceite esencial fue

extraido en un aparato Clevenger usando tejido deshidratado (25g) por un espacio de 2

horas. El analisis CG/EM fue realizado en un equipo Thermoquest-Finnigan Trace GC-

MS equipado con columna DB-1 (60m x

0.25mm). la programacion de temperatura de 60°C a 250°C, con un incremento de

5°Cmin-1. Es utilizado gas Helio con un flujo de 1.1ml.min-1.

Kan et al (2006), en su investigacion GC-MS analisis and actividad antibacterial de

cultivated Satureja cuneifolia Ten. Essential oil, publicado en Turk J. Chem. 30:253259,

reporta que son 6 los componentes mayoritarios, en la cual el carvacrol es el compuesto

mayoritario con 59.28% del aceite esencial, timol 15.72%, p-cimeno 9.69, ϒ-Terpineno

4.16%, 1.7 linalool y borneol 1.25%. La muestra fue colectado durante la floracion en

Konya a 1200m de altitud, el aceite fue extraido en un aparto clevenger por espacio de

3horas obteniendo un rendimiento de 1.7%. Para el analisis cromatografico hicieron uso

de un equipo Varian-Chrompach 2000 MS con ionizacion de electrones de impacto 70eV.

El rango de scaner fue 30-200 unidades de masa atomica (Amu), con columna capilar

silica WCOT (30m x 0,25mm). Utilizando gas Helio a un flujo de 0.7ml.min-1. La

configuracion en sistema gradiente inicialmente a 100°C por 3min incrementandose hasta

150°C con 8°Cmin-1, conservando la temperatura de 150°C por 3min, finalmente es

incrementado hasta 250°C con 15°C.min-1. La identificacion fue en base a la librería de

masa espectral Wiley y Nist.

Dikbas, Kotan, Dadasoglu, Karagoz, & Cakmakci (2009) en la investigación Correlation

between major constituents and antibacterial activities of some plant essential oils against

some pathogenic bacteria, indica que el aceite esencial fue extraído usando 500g de

material usando aparato de clevenger por 4horas extractado con CHCl3, una zona de

inhibición de 21.0 a 42.33mm, para S.hortensis la zona actividad antibacterial en

milímetros según método de difusión en disco frente a E. coli 36,00, Pseudomona

aeroginosa 23,66, Staphylococcus aureus 34,00 y Salmonela enteritidis 26,66mm como

un rango de concentración inhibitoria mínima MIC 6.25 a 600ul/ml siendo. E.coli 100, P.

aeroginosa 100, S. aureus 100, y S. enteritidis, 25ul/ml el compuesto mayoritario del

aceite esencial de S. hortensis fue timol 67.5% y carvacrol 17.9% determinado por

cromatografia de gas usando Thermofinnigan Trace GC/A1300, (E.I) equipado con un

espectrometro de masaSGE-BPX5 columna capilar (30 m x 0.25 mm, 0.25 μm). Gas helio

flujo 1 mL/min. Programación de temperatura de 50-150 °C a 3°C/min, isoterma

10 minutos y 250 °C at 10 °C/min. Split 1.0 μL.

Vagionas, Graikou, Runyoro, & Chinou (2007) en su investigación Composition and

antimicrobial activity of the essential oils of three Satureja species growing in Tanzania,

reporta el estudio de la CMI del aceite de tres especies: S. biflora, S. masukensis y S.

Pseudomensis, extraídos por hidrodestilacion en un aparato clevenger modificado por

3Horas, determinando la concentracion Minima inhibitoria MIC mg/ml para

Staphylococus aureaus (0,75; 0,58; 0,80 mg/ml) y E. coli (1,77; 5,70; 6,14mg/ml)

respectivamente según especie.

Oke, Aslim, Ozturk, & Altundag (2009) en su investigacion Essential oil composition,

antimicrobial and antioxidant activities of Satureja cuneifolia Ten, publicada en la revista

Food Chemistry 112 (2009) 874–879, reporta que esta especie es consumida via infusión

de sus hojas y sumidades floridas, con una concentración de carvacrol 44,99% y P-

cimeno 21,61% mediante análisis de cromatografía de gas acoplado a espectrometría de

masa. Los análisis de bioensayos en bacterias muestran un rango de CMI de 600 –

1400ug/ml, determinando la CMI para E.coli y S.aureus 600ug/ml.

Amanlou, Fazeli, Arvin, Amin, & Farsan (2004) en su investigación Antimicrobial activity of

crude methanolic extract of Satureja khuzistanica publicado en revista científica

Fitoterapia 75 (2004) 768–770 reporta la aplicación de extracto metanolito 2,7mg/ml de

planta cultivada y planta silvestre en ensayos de bioactividad microbiana frente a: S.

aureus 19 y 23mm; E. coli 15 y 16mm; Salmonella typhi 12 y 14mm respectivamente en

relación a su zona de inhibición. Mostrando que tiene mayor efectividad antimicrobiana

plantas en estado silvestre.

Bukvicki et al (2014) en su investigación Satureja horvatii essential oil: In vitro

antimicrobial and antiradical properties and in situ control of Listeria monocytogenes in

pork meat publicado en la revista Meat Science 96 (2014) 1355–1360, reporta que el

aceite esencial fue extraido por hidrodestilacion en un aparato clevenger usando 200g de

muestra por un espcaio de 2 horas, el aceite obtenido fue analizado por cromatografía de

gas-espectrometria de masa CG-EM detectando como compuestos mayoritarios p-

cimeno 33,14% y timol 15.08%. en ensayo de bioactividad arroja una concentracion

minima inhibitoria MIC para S. aureus ATCC 6538 0,15±0.01, E.coli ATCC 35210

0.03±0,02 y S. Typhi 0,03±0,03 mg/ml.

2.2. Bases Teóricas

Extracto

Extracto es el término utilizado en química, para las fracciones de compuestos químicos

extraídos de un sistema. Los extractos son extracciones realizadas con solventes polares

como el agua, etanol, metanol, hexanico eterico. Estos extractos siempre deben ser

mencionados por el solvente utilizado. El extracto etanólico es realizado debido a que el

etanol no es toxico, a diferencia de metanol (carcinogénico), repercusor de contaminación

ambiental.

Aceite esencial

Los aceites esenciales son las fracciones liquidas volátiles, generalmente destilables por

arrastre de vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las

plantas (Sellar, 2000), dichas sustancias odoríferas de naturaleza oleosa están

ampliamente distribuidos en distintas partes del tejido vegetal (raíz, tallos, hojas, flores y

frutos), en los distintos géneros y especies de naturaleza vegetal (Gutierrez, 2008). Los

aceites esenciales son obtenidos por: fluido arrastre hidrotérmico. Microwave con uso de

aparato clevenger, fluido supercrítico de CO2.

Composición química

Los aceites esenciales generalmente son mezclas complejas de hasta más de 100

componentes (Mayer, 2001), heterogéneos, todos ellos separables ya sean por métodos

químicos o físicos como la destilación, refrigeración, centrifugación, separación

cromatográfica, etc. (Martínez M., 2003), como se puede apreciar en la siguiente tabla.

Tabla 2 Compuestos Terpénicos en aceites esenciales

Compuesto terpenico Principio activo Monoterpenos: α y β-pineno, canfeno, limoneno , mirceno, p-cimeno Sesquiterpenos β-cariofileno, α-farneseno, germacraneno, camazuleno Monoterpenoles α-terpineol, borneol, citronelol, geraniol, linalol, nerol Sesquiterpenoles espatulenol, fenchol, nerolidol

Ésteres terpénicos acetatos de nerilo, geranilo y bornilo, 1,8-cineol

(eucaliptol) Óxidos terpénicos óxido de cariofileno Cetonas terpénicas pulegona, tuyona Aldehídos citrales, fotocitrales Lactonas sesquiterpénicas crispolida Monoterpenonas alcanfor Hidrocarburos

sesquiterpénicos santanelos, curcumenos

Extracción de aceites esenciales

Existen varios métodos de extracción de aceites esenciales, en los cuales se hacen uso

de fluidos: fluido de arrastre hidrotérmico, fluidos supercríticos, fluido de solventes; y

solventes orgánicos, mediante: enflorado, extracción con solventes orgánicos como el

hexano, etanol pa., en los cuales al termino se realiza una concentración, son

procedimientos costosos a diferencia de los anteriores.

Extracción de aceites esenciales por fluido de arrastre hidrotérmico

Los aceites esenciales en glándulas especializadas en los vegetales obtenidos

típicamente por fluido de arrastre de hidrotérmico, siendo un proceso simple,

relativamente barato en el cual los aceites esenciales sean extraídos de la planta por una

corriente del vapor de agua (Elder, Monella, & Spekuljak., 2001) y entonces ambas fases

se separan fácilmente por la diferencia de densidades, esta metodología de extracción

es aplicado a escala industrial.

Así mismo el modelo de extracción por fluido de arrastre hidrotermico asistido por

microondas (microwave) en varios estudios en aceites esenciales muestra un mejor

rendimiento en cuanto a la cantidad de compuesto químico (mayor presencia de

metabolitos)

Aplicación farmacológica de Extractos etanolicos y Aceite esencial

Más de 1340 plantas son conocidas por ser fuente potencial de compuestos

antimicrobianos, pero pocas han sido estudiadas científicamente (Wilkins & Board,

1989). Varios aceites esenciales son biocidas contra un amplio rango de

microorganismos como bacterias, hongos, virus, protozoarios, insectos y plantas

(Kalemba & Kunika, 2003).

Identificación y cuantificación de compuestos químicos en aceites esenciales

Varios autores reportan que es uso del método de análisis instrumental para la

identificación y cuantificación de compuestos químicos presentes en aceites esenciales

extraídos de especies vegetales mediante el uso del equipo de cromatografía de gases

acoplado a espectrometría de masas y el HPLC para extractos en la identificación de

compuestos fenólicos.

Microorganismos de incidencia alimentaria en la salud pública

Para la bacteria, el cuerpo humano es un conjunto de nichos ambientales que le

proporcionan el calor, la humedad y el alimento necesarios para el crecimiento (Murray

et al, 2006). En Los animales de producción: cerdos, rumiantes, aves, entre otros, son

los principales hospederos para muchos de esos microorganismos, entre especies de

Campylobacter, de Bacillus, de Salmonella, de Staphylococcus y cepas de Escherichia

coli entre otros (Crump, Griffin, & Angulo, 2002). No todas las bacterias producen

enfermedad, pero algunas siempre causan enfermedad una vez que ocurre la infección.

El organismo humano se encuentra colonizado por numerosos microorganismos (flora

normal), muchos de los cuales desempeñan importantes funciones para sus anfitriones,

como ayudar en la digestión de la comida, producir vitaminas (p. ej., vitamina K) y proteger

al organismo anfitrión frente a la colonización con microorganismos patógenos. Aunque

muchas de estas bacterias endógenas pueden producir enfermedad, normalmente

residen en localizaciones como el aparato digestivo, la boca, la piel y el aparato

respiratorio superior, las cuales se encuentran teóricamente fuera del organismo (Murray

et al, 2006). Ingresando al organismo por algunas vías como se observa en el siguiente

cuadro:

Cuadro Vías de ingreso de microorganismos

Vía Microorganismos

Ingestión

Género Salmonella, género Shigella, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli enterotoxigenico, genero Vibrio spp, género Campylobacter, Clostridium botulinum,

Bacillus cereus, género Listeria, género Brucella

Inhalación

Género Mycobacteríum, género Nocardia, Mycoplasma pneumoniae, género

Legionella, Bordetella, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, género

Streptococcus

Traumatismo Clostridium tetani

Venopunción Staphylococcus aureus, género Pseudomonas

Picadura de artrópodos Rickettsia, Ehrlichia, Coxiella, Francisella, género Borrelia, Yersinia pestis

Transmisión sexual Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum Fuente: (Murray et al, 2006).

La familia Enterobacteriaceae es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos

gramnegativos con importancia clínica. Se han descrito 40 géneros con más de 150

especies. Estos géneros se han clasificado según sus propiedades bioquímicas,

estructura antigénica e hibridación y secuenciación de los ácidos nucleicos. A pesar de

la complejidad de esta familia, menos de 20 especies son las responsables de más del

95% de las infecciones (Murray et al, 2006).

Las enterobacteria son microorganismos ubicuos, se encuentran de forma universal en

el suelo, el agua y la vegetación y también en la flora intestinal normal de muchos

animales, incluido el ser humano. Producen una gran variedad de enfermedades en el

ser humano, como el 30% al 35% de las septicemias, más del 70% de las infecciones del

aparato urinario y muchas infecciones intestinales. Algunos microorganismos (p. ej.,

Salmonella typhi, Shigella, Yersinia pesüs) se asocian siempre a enfermedad, mientras

que otros (p. ej., Escherichia coli, Klebsieüa pneumoniae, Proteus mirabílis) forman parte

de la microflora comensal normal y pueden producir infecciones oportunistas. Existe un

tercer grupo de enterobacterias: normalmente son comensales, pero se pueden convertir

en patógenas cuando adquieren genes con factores de virulencia

GENERO ESCHERICHIA El género Escherichia se compone de cinco especies, de las que E. coli es la más

frecuente y la más relevante desde el punto de vista clínico. Este microorganismo se

asocia a una gran variedad de enfermedades, como septicemia, TAU, meningitis y

gastroenteritis (Murray et al, 2006).

Cuadro E coli y sus enfermedades

Microorganismo Lugar de

acción Enfermedad

E. coli enteropatogena (ECEP)

E. coli enterotoxigenica (ECET)

E. coli enterohemorragica (ECEH)

E- coli enteroinvasiva (ECEI)

E. coli enteroagregativa (ECEA)

Intestino delgado

Intestino delgado

Intestino grueso

Intestino grueso

Intestino delgado

Diarrea infantil en países subdesarrollados, diarrea acuosa

y vomitos, heces no sanguinolentas.

Diarrea del viajero; diarrea infantil en países sub

desarrollados, diarrea acuosa, vomitos, espasmos

abdominales, nauseas, febrícula

Inicialmente diarrea acuosa, seguída de diarrea

sanuginolenta (colitis hemorragica) con espasmos

abdominales; sin fiebre o con febrícula puede progresar a

síndrome hemolítico.

Enfermedad en los aises subdesarrollados; fiebre

espasmos, diarrea acuosa; puede progresar a disentería

con escasas heces sanguinolentas.

Diarrea infantil en países subdesarrollados; diarrea del

viajero; diarrea acuosa persistente con vomitos,

deshidratación y febrícula.

Fuente: (Murray et al, 2006)

Son bacterias intestinales Gram-positivos aerobios y facultativamente anaerobios que

forman colonias convexas y lisas con bordes definidos, indicador microbiológico patógeno

(Quispe et al, 2006) ―es un bacilo corto, gran negativo con muchas características

similares a la de las salmonellas‖ (Bourgeois & Mescie, 1994). Escherichia coli es una de

las bacterias que se encuentran de manera habitual en el tracto gastrointestinal de los

animales, generalmente no suelen producir enfermedades en los animales, pero algunas,

especialmente las cepas enterotoxigénicas y enterohemorrágicas son responsables de

brotes de enterotoxemias en humanos, la prevalencia de estas cepas en el sistema

gastrointestinal de los animales, puede permitir su paso a la cadena alimenticia después

del sacrificio o por consumo de alimentos o agua contaminadas por las heces de éstos.

La principal vía de infección de los animales es el agua, seguida del alimento, en los

animales muchas veces estas cepas no causan enfermedad visible, pero si en el humano.

E. coli produce también un espectro variado de exotoxinas. Estas incluyen las toxinas

Shiga (Stx-1, Stx-2), las toxinas termoestables (STa, STb) y las toxinas termolábiles (LT-

I y LT-II). Por otra parte, las hemolisinas (HlyA) se consideran importantes en la patogenia

de la enfermedad producida por E. coli uropatógeno. (Murray et al, 2006)

GENERO SALMONELLA

Una de las bacterias consideradas como de principal importancia en sanidad animal y en

salud pública es Salmonella spp, responsable de importantes brotes de salmonelosis en

humanos a lo largo de la historia. Esta bacteria puede ingresar en la cadena alimenticia

por infección de los animales, ya sea por el agua o el alimento, y luego diseminarse a los

demás animales del corral por las heces. Si se toman las medidas adecuadas para evitar

la presencia de animales portadores de la bacteria, se disminuye sin duda el riesgo de

que esta llegue al hombre en un producto final.

Las salmonellas son bacterias gram-negativas, lo cual significa que no se tiñen de azul

con el colorante aplicado en la prueba diseñada por Gram. Esto se debe a que dicho

colorante tiñe la pared celular, que en estos casos está cubierta por una membrana

externa. Es así que estas bacterias están envueltas por varias capas: la membrana

externa, la pared celular (que es diez veces más delgada que en las bacterias

grampositivas), y la membrana interna. La membrana externa e interna delimita al

periplasma. La apariencia de las bacterias en el microscopio es de bacilos, o cilindros con

puntas redondeadas. La S. typhi es una bacteria anaeróbica facultativa, que puede en

ocasiones sobrevivir en bajas condiciones de oxígeno. S. typhi causa la fiebre tifoidea en

humanos, quienes son sus únicos hospedantes. (Calva, 2004).

GENERO SHIGELLA

La clasificación taxonómica de Shigella empleada en la actualidad es sencilla, pero

técnicamente incorrecta. Se han descrito cuatro especies con más de 45 serogrupos

basados en el antígeno O: S. dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydií y Shigella

sonnei. S. sonnei es la causa más frecuente de shigelosis en las naciones

industrializadas, y S. flexneri es la causa más común en los países en vías de desarrollo.

No obstante, los análisis de ADN han determinado que estas cuatro especies constituyen,

en realidad, biogrupos de E. coli que difieren a nivel serológico. Se han conservado sus

nombres históricos debido a que su designación como E. Coli puede traer confusión.

(Murray et al, 2006). Las bacterias del género Shigella, de la familia Enterobacteriaceae,

son bastones Gram negativos, de 0.3 a 1 μm de diámetro y de 1 a 6 μm de longitud, que

pueden estar solos, en cadenas o de a pares. Son no móviles, no esporulados,

anaerobios facultativos, oxidasa negativo, fermentan la glucosa y otros azúcares sin

producción de gas. La temperatura de crecimiento óptima es 37º C. (Terragno et al, 2007).

La shigellosis, infección causada por Shigella spp., está distribuida en todo el mundo,

pero es endémica en países tropicales y de clima templado con mayor incidencia en

verano. Es causa de infección intestinal aguda en niños pequeños (Terragno et al, 2007).

La enfermedad se transmite de persona a persona por la vía fecal-oral, por alimentos

contaminados donde el vector de transmisión son las moscas, o por el uso de aguas

contaminadas para la preparación de los mismos (Terragno et al, 2007).

El genero shigella inclue bacterias responsables de patologías intestinales serias

(disentería bacilar). La shigelosis también conocida como disentería bacilar, es una

enfermedad infecciosa aguda de las vías gastrointestinales inferiores causada por

microorganismos del género Shigella. Las cuatro especies del género: S dysenteriae, S.

flexneri, S. boydii y S. sonnei causan un gran espectro de infecciones que van desde una

diarrea acuosa a la disentería fulminante. La infección se caracteriza por diarrea

acompañada de fiebre, dolor abdominal agudo, tenesmo, vómitos y nauseas. La

patogénesis de Shigella es compleja, implica la interacción inicial del microorganismo con

la célula huésped, invasión, multiplicación celular, lisis de la célula infectada, producción

de enterotoxinas y diseminación de célula a célula (Bellorin, Urbina, Gonzales, Salinas,

Tomat, & Gonzales, 2008)

Además, se ha descrito que la distribución mundial de los serogrupos de Shigella no es

igual en las distintas regiones; S. flexneri es mas frecuente en los países en desarrollo,

mientras que en los países desarrollados predomina S. sonnei. (Kotloff et al, 1999)

GENERO STAPHYLOCOCCUS

Los cocos grampositivos son un grupo heterogéneo de bacterias. Las características que

tienen en común son su forma esférica, su reacción a la tinción de Gram y la ausencia de

endoesporas. La presencia o ausencia de actividad catalasa es una prueba sencilla que

se utiliza para subdividirlas en varios géneros. Las catalasas son enzimas que catabolizan

peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso.

El nombre del género Staphylococcus procede del griego staphylé, «racimo de uvas».

Por tanto, la designación Staphylococcus se refiere a que las células de estos cocos se

desarrollan en un patrón que recuerda a un racimo de uvas; sin embargo, los

microorganismos presentes en muestras clínicas aparecen como células aisladas, en

pares o en cadenas cortas. La mayor parte de los estafilococos tiene un diámetro de entre

0,5 y 1 mm y son anaerobios facultativos (es decir, crecen aerobia y anaerobiamente)

inmóviles capaces de crecer en un medio con una elevada concentración de sal (p. ej.,

cloruro sódico al 10%) y a temperaturas desde 18 hasta 40 °C. Estas bacterias están

presentes en la piel y las mucosas del ser humano. En la actualidad, el género comprende

35 especies y 17 subespecies.

Cuadro Especies de staphylococcus y sus enfermedades.

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus saprophyticus

Staphylococcus lugdunensis

Staphylococcus haemolyticus

Cutáneas (carbuncos, foliculitls, forúnculos, ¡mpétigo infección de

heridas); mediadas por toxinas (intoxicación alimentaria, síndrome de

la piel escaldada, síndrome del shock tóxico); otras (artritis séptica,

bacteriemia, empiema, endocarditis, osteomielitis, neumonía)

Bacteriemia; endocarditis; heridas quirúrgicas; infecciones del tracto

urinario; infecciones oportunistas de los catéteres, anastomosis,

prótesis y dispositivos de diálisis peritoneal

Infecciones del tracto urinario; infecciones oportunistas

Artritis, bacteriemia, endocarditis, infecciones del aparato genitourinario e infecciones oportunistas

Bacteriemia, endocarditis, infección de heridas, Infecciones óseas y

articulares, Infecciones oportunistas e infecciones del tracto urinario

Fuente: (Murray et al, 2006)

Las enterotoxinas estafilococcicas son proteínas inmunológicamente diferentes, con

pesos moleculares que oscilan entre 28.000 y 35.000 dalton. Cada una de estas toxinas

es conocida por sus potentes efectos en células del sistema inmune, pero muchas de

Microorganismo

Enfermedades

ellas también tienen otros efectos biológicos, siendo reconocidas como superantígenos

pirogénicos (Dinges et al, 2000)

La contaminación de alimentos por S. aureus, está asociada con una forma de

gastroenteritis que se manifiesta clínicamente por un cuadro caracterizado por vómitos y

diarrea. El corto período de incubación de 1-6 horas orienta a la sospecha de enfermedad

producida por ingestión de una o mas enterotoxinas preformadas en el alimento que ha

sido contaminado con cepas de S. aureus productor de la misma (Dinges et al, 2000)

Bioactividad Antimicrobiana

Es el ensayo biologico que determina la accion de compuesto quimico frente a un

microorganismo, para validar la accion farmacogica de un agente quimico con accion

inhibitoria o bactericida. En estos ensayos se determina la Concentracion Minima

Inhibitoria y concentracion minima letal CML. Aplicando tecnicas de discos de

sensibilidad, posos, y en caldo.

2.3. Operacionalización de variables

Tabla 3 Definición operativa de variables e indicadores

Variable Definición operativa Unidad de

medición

Indicador

Tipo de extracto. (Extracto etanolico y aceite

esencial)

Medio utilizado para la

extracción de compuestos

activos.

Numero de compuestos químicos y concentración

en ppm

Registro de análisis

GCSM y HPLC

Bioactividad antimicrobiana del extracto etanolico y aceite

Es el valor de la

concentración mínima

inhibitoria CMI y

concentración mínima letal

CML.

Concentración µg/uL

Registro de extracción de

aceite esencial.

Capitulo III: Metodología de la Investigación

3.1. Ámbito de estudio

Provincia de Chota.

3.2. Materiales y Método de Investigación

Diseño de Investigación

La investigación es de naturaleza experimental realizándose lo siguiente: a)

Obtención de extracto etanolico y aceite esencial,

b) Identificación y cuantificación de compuestos fitobioactivos por GC-EM y HPLC

c) Determinación de la Bioactividad antimicrobiana en relación del extracto y acción frente

a Salmonella, Ecoli, Staphylococcus y Shigela

Población, Muestra, Muestreo

Población: Especies vegetales de la especie de Satureja del ámbito de la provincia de

Chota y microorganismos patógenos de incidencia alimentaria.

Muestra: Extracto etanólico y aceite esencial de Satureja incana

Muestra Biologica: cepas de Salmonella typhi, E. coli, Staphylococcus aureus y

Shigela

Muestreo: Muestreo al azar. Materiales y equipos a utilizarse

Materiales: Materiales de uso microbiológico, placas Petri, tubos de ensayo, cajas

para micro dilución, micro pipetas monocanal, micropipetas multicanal, sacabocado de

6mm con succionador. Insumos para cultivo microbiológico.

Material Biológico: Salmonella , E Coli resistente a la amoxicilina, E Coli sensible a

amoxicilina, Estafilococcus aureus, y Shigela.

Equipos: Incubadora, autoclave, contador de células, espectrofotómetro, turbidimetro,

cabina de flujo laminar, cabina de bioseguridad, refrigeradora, congeladora,

evaporador rotatorio, shaker agitador orbital termostizado. Técnicas e instrumentos

de Recolección de Datos

Tabla 4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos

Datos Técnica Instrumento

Compuesto fitoquimicos Instrumental HPLC y GCSM. HPLC y CG-SM

Bioactividad antimicrobiana Calculo concentración

mínima inhibitoria CMI

Reporte de análisis

de bioensayo

antimicrobiano.

Efectividad antimicrobiana Contador de celulas

de extracto acuoso y aceite Análisis estadístico esencial Software informático estadístico

Procedimiento de Recolección de Datos para la bioactividad antimicrobiana

Se seguirá el método para la evaluación de la bioactividad antimicrobiana según

(Ramirez & Aristizabal, 2012) para difusión en agar y dilución en poso.

Método de difusión en agar

Para la evaluación de los extractos y los aceites esenciales contra las cepas bacterianas

previamente descritas, los microorganismos se cultivaran en tripticasa soya caldo a 37

ºC hasta obtener una absorbancia de 0.1 a 540 nm, lo cual equivale a 1x106 células/ml.

Posteriormente en cajas de petri se adicionaran 100 µl de cada cepa bacteriana y 25 ml

de agar Mueller Hinton, se realizaran 5 pozos de 6 mm de diámetro cada uno, sellando

el fondo de cada pozo con 15 µl de agar.

En cada uno de los pozos se adicionara 10 µl de las sustancias a evaluar a

concentraciones de 50, 30, y 10µg/µl solubilizado en dimetilsulfóxido (DMSO) al 30%.

Como control positivo se usara amoxacilina 5 µg/µl para Salmonella . tiphymurium,

Escherichia coli B. Staphylococcus. Aureus y Shigela; y como control negativo DMSO.

Las cajas se colocaran en refrigeración por una hora para facilitar la pre-difusión de las

muestras verificando precipitación a causa de bajas temperaturas, luego incubar a 37

°C por 24 horas, se medirán los halos de inhibición y se calculara el porcentaje de

actividad inhibitoria. Todos los experimentos se realizaran por triplicado, y los resultados

seran expresados como el promedio de las 3 medidas.

Para verificar el crecimiento alrededor del halo se tomara una asada en esa zona, se

inoculara en una placa de agar Mueller Hinton y se incubara por 24 horas a 37 °C, y se

observara el crecimiento o no de microorganismos.

3.2) Método de dilución

Las pruebas de actividad antimicrobiana por el método de dilución se realizara sobre

cajas de 96 pozos, se prepararan diluciones de los extractos y aceites esenciales a 50,

30 y 10ug/ul solubilizado en DMSO. En cada pozo se adicionara 220 µl de caldo Mueller

Hinton, 10 µl del microorganismo a 0.1 de absorbancia a 540 nm, y 20 µl de la muestra.

Se incubara durante 4 horas a 37 °C, y se utilizara como solución indicadora para la

determinación de crecimiento bacteriano Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2ilo)-2,5-

difeniltetrazol (MTT).

3.3. Análisis de Datos

Para establecer relación de la bioactividad antibacteriana (inhibición) del extracto de hojas

de Satureja incana, en función a las diferentes variables tales como: extracto,

concentraciones, y bacterias patógenas de incidencia alimentaria, se realizara un ANOVA

multifactorial.

Factor1: Extracto Nivel 1.1 Extracto etanólico de S. incana, N 1.2. Aceite esencial.

Factor2: Concentración (µg/µl), N 2.1 50 µg/µl, N 2.1 30 µg/µl y N 2.1 10 µg/µl.

Factor3: Bacteria Patogena, N 3.1 S. tiphymurium, N 3.2 E. coli resistente N 3.3 E. coli

sensible N 3.4 Staphylococcus. Aureus y N 3.5 Shigela

Se realizaran pruebas para determinar qué factores tuvieron un efecto estadísticamente

significativo sobre inhibición. Se evaluara las interacciones entre los factores, que

permitan identificar los factores de mayor significancia.

Capitulo IV: Aspecto Administrativo

4.1. Cronograma de Actividades

Cuadro Cronograma de actividades

Actividades: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1.1.Recopilación de información etnofarmacobotanica en base de datos .

1.2.Obtension de extracto etanolico y

aceite esencial de S. incana 1.3.Analisis de bioactividad

antimicrobiana 1.4.Documentacion y analisis

estadistico 1.5.Publicación de artículos científicos 1.6.Redaccion de informes parciales 1.7.Presentacion de informe final

4.2. Presupuesto (Cadena de gasto mensualizado) Cuadro del Presupuesto general

COSTO SUB RUBRO UNID MONTO S/. % GASTO

UNITARIO TOTAL a) Equipamiento (70 % min) Cabina de bioseguridad clase A2II 3 20000.00 60000.00 Balanza Analitica S=0.0001g capacidad 220G-0.1MG 1 14000.00 14000.00 Microscopio con camara usb 1 12000.00 12000.00 Estufa esterilizadora 2 4000.00 8000.00 Microscopio optiico 2 2000.00 4000.00 Contador digital de celulas 1 8000.00 8000.00 Turbidimetro 1 8000.00 8000.00 Autoclave 3 1200.00 3600.00 Cabina de flujo laminar 1 10000.00 10000.00 Micropipeta graduable 5 625.00 3125.00 Cabina de incubacion con circulacion de aire 1 5000.00 5000.00 Campana de desecacion de vidrio 1 900.00 900.00 Desecador (silica gel ) 220V 4 200.00 800.00 222025.00 74.01 Congeladora de laboratorio 1 12000.00 12000.00 Refrigeradora de laboratorio 1 10000.00 10000.00 Refrigeradora convencional 1 1500.00 1500.00 Agitador orbital con regulacion termica 1 15000.00 15000.00 Stereoscopio/microscopio 1 3000.00 3000.00 Micropipeta graduable multicanal 2 800.00 1600.00 Cabina de incubacion cultivo facultativo CO2 1 5000.00 5000.00 Mixer 1 2000.00 2000.00 Equipo de microfiltracion 3 piezasy tijereta 1 1000.00 1000.00 Equipo Destilador de agua 2Lt 1 6000.00 6000.00 Equipo de ultrafiltraccion de agua 1 20000.00 20000.00 Purificador de agua libre de bacterias y virus 0,025

1 3500.00 3500.00 micrones Tablet con aplicaciones de ingenieria 2 2000.00 4000.00 b) Materiales e insumos 8% maximo Guardapolvo 10 32.00 320.00 Calzado de seguridad laboratorio 2 120.00 240.00 Cepas ATTCC patogenos 1 1000.00 1000.00 Materiales y medios de cultivo microbiologico 1 5000.00 5000.00 11975.00 3.99 Insumo quimico diverso 1 1015.00 1015.00 Materiales de escritorio diverso 1 2000.00 2000.00 Materiales de vidrio diverso

1 2000.00 2000.00 hormo microonda con regulador de watt 2 200.00 400.00 c) Publicación (2% max) Publicación en revista científica indexada de bajo impacto 4 500.00 2000.00

6000.00 2.00 Publicacion en revista cientifica indexada de alto impacto 1 1550.00 1550.00 Publicación de libro 2 1225.00 2450.00 d) Servicio para análisis altamente especializados

(5% max) Servicio de analisis de indentificacion de compuestos

1 2000.00 2000.00 quimicos en

Aceite esencial, Hidrosol y extractos 15000.00 5.00

Servicio de analisis antimicrobiano 1 12000.00 12000.00 Servicio de

envio de muestra 2 500.00 1000.00 e) Viajes (Viáticos y pasajes) (3%)

9000.00 3.00

Viaje y viatico a colombia 3 3000.00 9000.00 f) Servicios de capacitación y perfeccionamiento (8%) Perfeccionamiento internacional a nivel de doctorado 1 16000.00 16000.00

24000.00 8.00 Perfeccionamiento nacional a nivel de doctorado 1 4000.00 4000.00 Especializacion en bioensayos 1 4000.00 4000.00 g) Asistente de

investigación (2%) 6000.00 2.00

01 asistente 4 1500.00 6000.00 h) monitoreo (2%) 6000.00 2.00

Monitoreo 1 6000.00 6000.00 Total: 300000 100

4.3. Financiamiento

El proyecto será financiado con fondos del canon minero, a través del II Concurso de

financiamiento de trabajos de Investigación Científica y Tecnológica para docentes y

administrativos, con recursos de canon de la Universidad Nacional Autónoma de

Huancavelica a través de la Vicepresidencia de Investigación.

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