Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Iztacala

Metodología Científica III

Cruz Olmos Sandra Llamas Franco Yago S. Maldonado González Gabriel M.Noriega Hidalgo Roberto D.Verdín Flores Jessica S.Villegas Macedo Angélica Y.

“Evaluación de la absorción de metales pesados por fitorremediación en aguas

residuales utilizando Amaranthus hybridus mediante un sistema de humedal”.

AGUAS RESIDUALES• Cuerpos de agua contaminados por heces fecales, orina y

subproductos de la actividad humana

ORGÁNICOS INORGÁNICOS

N, P, cloruros, carbonatos, sulfuros y

metales pesados (Fe, Cd, Cr, Cu, Hg o Zn)

99.9% de agua y un 0.1% de sólidos

• Tóxicos o venenosos• Componentes

Carcinógenos• Estrés oxidativo

ESTRÉS OXIDATIVO• Efecto tóxico por especies químicas altamente reactivas producidas durante la

reducción del oxígeno molecular en los organismos aerobios, que pueden ser o no radicales libres

Causa:•inactivación de enzimas

• blanqueo de pigmentos

• peroxidación de lípidos

•degradación de proteínas

USO DEL AGUA

• En México, una de las grandes problemáticas es la disponibilidad y contaminación y demanda en los usos del agua.

• Tratamiento de aguas residuales

• Los costos elevados, tratamiento y conducción al lugar de rehúso

• Alternativa factible:FITOREMEDIACIÓN

77%

14%5%

4%

Volúmenes porcentuales concesionados para usos

consuntivos. (INEGI 2009)

Agrícola

Abastecimiento público

Energía eléctrica

Idunstria au-toabastecida

Plantas como filtros biológicos

• Remover• Transferir• Estabilizar• Concentrar • Destruir los contaminantes

Fijándolos a

Raíces Tallos

Rizofiltración Fitoextracción

Hiperacumuladoras de MP

•Suelo

•Agua (utilizando humedales)

FITOREMEDIACIÓN

Actualmente se conocen 400 especies repartidas en 45 familias , siendo la familia Brassicaceae y Fabaceae las que cuentan con más especies hiperacumuladoras.

Helianthus annuus es capaz de absorber grandes cantidades de uranio del suelo.

Arabidopsis thaliana es capaz de acumular cobre y zinc en grandes cantidades.

Amaranthus retroflexus es capaz de acumular cesio 137, el cual es radiactivo y muy peligroso.

Amaranthus hybridus L.Es una especie de la familia de las Amaranthaceae, originaria de México la cual está considerada como una maleza de follaje comestible.

Esta planta es altamente competitiva, presentando como rasgo más llamativo el ser hiperacumuladora.

Humedales artificialesLos HA se definen como

sistemas que simulan una zona de transición entre el ambiente terrestre y el acuático, pero que

son específicamente construidos para el tratamiento

de aguas residuales bajo condiciones controladas de

ubicación, dimensionamiento y capacidad de tratamiento.

Autores Estudio Resultado

Fan y Zhou (2009) Estudiaron la capacidad hiperacumuladora de Amaranthus

mangostanus L.

Reportaron al Amaranthus mangostanus L. como planta hiperacumuladora de cadmio.

(Ortega, et. al., 2008)Se evaluó la capacidad de Amaranthus

retroflexus de absorber y acumular cesio 137 en comparación con otras

plantas del mismo género.

40 veces más efectiva que sus

competidoras en absorber cesio 137,

(Ortiz-Cano, et. al., 2009)

Estudiaron la capacidad extractora de Plomo (Pb) y Cadmio (Cd) de

Amaranthus hybridus L. al adicionarle una mezcla de micorrizas arbusculares

Se encontró que las concentraciones de estos metales se incrementaron

significativamente conforme la edad de la planta.

ANTECEDENTES

OBJETIVOS• GENERAL Evaluar la absorción de metales pesados en

Amaranthus hybridus.• PARTICULARES Cuantificar la absorción de plomo y

cadmio en raíz y parte aérea. Evaluar el estrés oxidativo causado por las

aguas residuales en Amaranthus hybridus. Evaluar la calidad del agua residual por

tratamiento con humedales

Se medirá la aptitud para transmitir la corriente eléctrica por medio de un conductímetro.

Se determinará el pH utilizando un pH-metro con soluciones buffer de pH 4.00 y 7.00 para calibrarlo.

El residuo seco se determinará mediante la evaporación de 100ml de agua residual en estufa a 105°C.

Los metales pesados se determinaran por espectrofotometría de absorción atómica.

Materiales y métodoAnálisis del agua

Determinación del oxígeno disuelto (OD) del agua.

Botella de 500 ml llena

Se añadirá 0.1 ml de solución

MnSO4 y 0.5 ml de solución azida-

iodo.

Se agitara, posteriormente se agregara 0.5 ml de

H2SO4 concentrado

Se valorará con tiosulfato 0.01M

(color paja pálido)

Se añadirá gotas de solución de almidón

(color azul)

DEMANDA BIOLÓGICA DE OXÍGENO

Se realizará por la técnica de DBO de 5 días, que consiste en llenar un frasco con muestra cerrado a temperatura establecida por 5 días. Al inicio y al final de la prueba se medirá el OD. La DBO se determina mediante la diferencia entre el OD inicial y el final.

Material VegetalAmaranthus

spp se obtendrá de los invernaderos

de Xochimilco

Se trasplantarán

en un humedal de

flujo horizontal

Adaptación de 15 días

Se dividirán en 3 grupos

Grupo tratado con agua potable +

solución nutricional

Grupo tratado con aguas residuales

Grupo tratado con agua potable + altas

[ ] de Cd y Pb

Se digerirá con una mezcla HCl: HNO3:

HClO4 (5:3:2).

Se cuantificaran los metales pesados por la técnica de

Espectrofotometría de absorción atómica.

Parte subterráneaParte aérea

Determinación de Metales pesados en el material vegetal

Cuantificación de clorofilas y Carotenoides Homogeneizado 0,1 g de peso fresco de la

planta en 10 ml de acetona al 80% por 2 min en oscuridad.

Se centrifugara a 3000 rpm durante 15 minutos en tubos protegidos de la luz.

0,2 ml del sobrenadante + 2 ml de acetona al 80% y se agitara.

Medición absorbancia a 663 (Ch a), 646 (Ch b) y 470 nm (carotenoides),

empleándose como blanco la acetona al 80%

 La concentración de clorofilas : fórmulas de Lichtenthaler para acetona al 80%.

DETERMINACIÓN PERÓXIDO

500 mg de hoja Homogeneizar en frío TCA 0.1%

centrifugar

1000 rpm por 15 minyTomar 0.5

sobrenadante

añadirle

0.5 buffer fosfatos10mM pH 7.0 y

1mL de KI

posteriormente Medir absorbancia a 390 nm.

Por último

Realizar cálculos conCurva estándar

EXTRACCIÓN PEROXIDASA

Extracción enzimática Macerar 0.1 g

con

2mL de un buffer de fosfatos 50mM pH 7.8

0.1 mM de EDTA

y

1% de PVPPposteriormente Se centrifugará a

10,000 rpm por 20 min.

CUANTIFICACIÓN DE PEROXIDASA20 μL Extracto crudo y

200µL mezcla de reactivos (440µL guaiacol 0.05% y

10mM H2O2)

Se incubara durante 10 minutos

Temperatura ambiente

posteriormente

Se medirá absorbancia a 450

nm

ACTIVIDAD ENZIMATICA CATALASA

Extracción enzimática Utilizaran 0.5 g. de hojas

con

5 ml. de buffer fosfatos con pH7

y50mg. de polivinilpirridiona

luego

Macerar a 4°Cposteriormente Se centrifugará a 11,000

rpm por 11 min.

Por ultimo

Se tomará el sobrenadante

CUANTIFICACIÓN DE CATALASASe prepararan 5 ml. de la

mezcla de reacción que contiene300µM. De buffer fosfatos con

pH 6.8

100 µM H2O2

también

Se agregara 1 ml. de la enzima diluido 1:20 (v/v) Por ultimo

posteriormente

Se incubara a por 1min. A temperatura constante a

25°C para

Detener la reacción se agregara 10 ml de

H2SO4 al 2 % (v/v) paraTitular el

H2O2

Fue con

Una solución de KMnO4 (0.2 M)hasta

Obtener una coloración purpura que dure al

menos 15 s.

Cuantificación de carbohidratos

Preparación de las muestras:Se recolectarán muestras de los humedales antes de iniciar el tratamiento, durante la segunda semana, y al finalizar el tratamiento.

1g de hojas y 1g de raíz

10 ml de etanol al 80%

Ebullir por 10 minutos

Aforar a 10 ml

Azúcares reductores por el método de Nelson Somogy

1 2 3 4 5 6 7Patrón de glucosa 200µg/ml (ml) 0 0.25 0.50 0.75 1 0 0

Agua destilada (ml) 1 0.75 0.50 0.25 0 0 0

Reactivo de cobre (ml) 1 1 1 1 1 1 2

Se calentará en baño maría 20 minutos.Se dejará enfriar.

Arsenomolibdato (ml) 1 1 1 1 1 1 1

Se ajustara el volumen a 10 ml con agua destiladaSe mezclará por inversión

Absorbancia a 540 nm

Cuantificación de almidón por método de Antrona

1 2 3 4 5 6 7 8Patrón de almidón (10mg/100ml)

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0

Filtrado de Ácido perclórico

0 0 0 0 0 0 0.125 0.25

Agua destilada 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.375 0.25

Antrona 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Se agitará por inversión. Se calentará en baño maría por 11 minutos. Se enfriará en hielo y se leerá la absorbancia a 630 nm

Azucares totales por el método de Antrona

1 2 3 4 5 6 7Patrón de glucosa (200µg/ml)

0 0.062 0.125 0.25 0.375 0 0

Extracto problema 0 0 0 0 0 0.25 0.5

Agua destilada 1.25 1.187 1.125 1 0.875 1 0.75

Antrona 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Se agitará por inversiónSe calentará en baño maría por 110minutos

Se leerá la absorbancia a 630 nm.

Cuantificación de fitoquelatinas

5 g de la muestra se macerará y se lavará con

150ml solución EDTA/Pb en relación

molar 12.

Se cuantificarán las fitoquelatinas y

metalotioninas por la técnica de

espectrofotómetría de absorción atómica.

Posteriormente se digerirán a 150° C por 60 minutos hasta la desaparición de

vapores pardos.

Reposarán con 10 ml de HNO3

por una noche.

GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!