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Universidad Nacional de San Luis Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia Departamento de Bioquímica y Cs. Biológicas

Carrera: Licenciatura en Bioquímica Curso: Técnicas Moleculares aplicadas a Bioquímica Clínica

E-mail: [email protected] Blog: http://qbpatologica.wordpress.com

Año: 2013

G U I A D E T R A B A J O S P R A C T I C O S

Equipo del Curso:

� Dra. Silvia M. Varas

� Dra. María G. Lacoste

� Dra. Mariana L. Ferramola

� Bqco. José L. Arias

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CRONOGRAMA RESUMIDO: JUNIO: 24-28 Horario del curso: 8,30-12,30 hs 14- 18 hs 24 AM

- Extracción de sangre - Teórico 1: Genoma Humano.Proyecto Genoma Humano. Controversias Éticas. Mutaciones más comunes según Human Gene Mutation Database. Deleciones y Mutaciones puntuales. Estrategias de laboratorio. Material usado en un laboratorio de biología molecular -Teórico 2: PCR; bases. Componentes. Templado o sustrato. Enzimas. Primers o iniciadores: diseño y concentración. Magnesio y NTPs. Eficiencia de una PCR (especificidad, rendimiento y fidelidad). Variaciones. Puesta a punto de una PCR.

PM Extracción de ADN. Determinación de Pureza

25 AM

PCRI: Alelo Duarte - Teórico 3: Técnicas usadas para la determinación de deleciones e inserciones. Otras variantes de PCR: SSCP, RFLP-PCR, RT-PCR.

PM PCR II: Mutagénesis - Teórico 4: Diseño Oligos

26 AM

PCRI: Alelo Duarte – Corte Enzima Restricción- Corrida de Geles de Agarosa Seminario 1

PM PCRII: Preparación geles de PAGE y corrida. Análisis resultados. Seminario 2

27 AM

PCR III: MAS-PCR Seminario 3 Seminario 4

PM PCRIII: Armado de geles y corrida Teórico 5: Técnicas usadas para la determinación de mutaciones puntuales. MAS-PCR, ARMS, mutagénesis mediada por PCR y Dot blot. Seminario 5 Seminario 6

28 Teórico 5: Nuevas plataformas diagnósticas. Resumen gral. Discusión de Resultados e Informes

Evaluación final

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� I- EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO TOTAL A PARTIR DE MUESTRA SANGUINEAS

Introducción:

La extracción de ADN a partir de una muestra constituye la etapa previa de todo

análisis genético. Obtener ADN puro y amplificable resulta fundamental para

los posteriores usos a los que será destinado.

En general, los métodos de extracción de ADN tienen una serie de pasos

básicos:

1-disrupción celular con ruptura de la bicapa lipídica de las membranas

celulares por tratamiento con detergentes y agentes quelantes que secuestran

cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+.

2-eliminación de las proteínas que constituyen los principales

contaminantes del extracto,

3-concentración del ADN que un medio con alta concentración de sales

precipita con alcoholes,

4-lavado para eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la

Taq polimerasa y

5- resuspensión

Para las muestras de sangre en particular, se han descritos distintos protocolos.

En el siguiente práctico se aplicará un método que aprovecha el cambio de

solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a

modificaciones en la concentración salina del medio.

En resumen:

Triton X-100 y SDS: son detergentes.

EDTA: quelante de cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+, sobre todo de este

ultimo ya que existen en el medio enzimas que degradan los ácidos nucleicos

(nucleasas- magnesio dependientes), es decir que son enzimas que solo actúan

en presencia de este catión.

Perclorato de sodio (NaClO4): se utiliza para desproteinizar las preparaciones de

ADN. A altas concentraciones, el perclorato de sodio elimina el SDS y las

proteínas asociadas con él, además, previene la precipitación de las proteínas

con el ácido nucleico en el paso final de precipitación con etanol.

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Etanol 70%: solución de lavado para eliminar, primordialmente, restos de SDS

que es un inhibidor especifico de Taq polimerasa.

TRABAJO PRÁCTICO Nº 1

EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO TOTAL MEDIANTE LA TÉCNICA

DE SALTING OUT MEJORADO

Objetivos: 1-Conocer los fundamentos de los pasos químicos utilizados para lograr el

aislamiento de ADN a partir de una muestra biológica.

2-Determinar la eficiencia del proceso de purificación mediante el uso de índices de

pureza.

3-Cuantificar el ADN extraído y preparar la muestra para su utilización en las

técnicas posteriores.

Fundamento del método

En presencia de altas concentraciones de sales, la solubilidad de las proteínas

disminuye y terminan por precipitar (salting out). El perclorato de sodio se

utiliza para desproteinizar las preparaciones de ADN. A altas concentraciones,

el perclorato de sodio elimina el SDS y las proteínas asociadas con él, además,

previene la precipitación de las proteínas con el ácido nucleico en el paso final

con etanol.

Reactivos: 1) Buffer de Lisis I (lisis de glóbulos rojos) Concentración final: Sacarosa…………………...0.32 M Tris-HCl (pH 7.6) ……. 10 mM MgCl2 ………………………………… 5 mM Tritón X-100 .............. 1 % Almacenar a 4 ºC en oscuridad (mantener en frío hasta su uso) Preparación: Sacarosa �� 10,26 gr Tris-HCl 1 M (pH 7.6) �� 1 ml MgCl2 1M �� 0,5 ml H2O milliQ c.s.p �� 100 ml Esterilizar la solución por autoclavado Luego agregar 1 ml de Triton X-100

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Preparación de la solución madre de Tris-HCl 1 M (pH=7,6)

Disolver 12,11 g de Tris base en 80 ml de H2O. Ajustar el pH por el agregado de 6 ml HCl (c).

Ajustar el volumen a 100ml. Esterilizar por autoclavado.

2) Buffer de Lisis II (lisis de glóbulos blancos) Concentración Final: EDTA pH=8,0 ……………………….. 25 mM NaCl ……………………………………... 75 mM Preparación: EDTA 0,5M pH=8 �� 5 ml NaCl 5M �� 4 ml H2O milliQ c.s.p �� 100 ml Esterilizar la solución por autoclavado. 3) SDS 10% Preparación: 0,5 g �� 5ml de H2O(d) 4) Perclorato de sodio (NaClO4) 5M Preparación: 1,4 g �� 2ml de H2O(d) 5) NaCl 5M Preparación: 29,22 g �� 100 ml de H2O(d) PROTOCOLO

1) Colocar 300 µl de la muestra de sangre total en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.

2) Agregar 1,2 ml de Buffer de Lisis I frío, mezclar y centrifugar 15 min a

2400 g (4°C).

3) Tirar el SN y agregar 350 µl de Buffer de Lisis I, mezclar y volver a centrifugar.

4) Tirar el SN y resuspender el pellet en: 135 µl de Buffer de Lisis II + 3,8 µl

de SDS 10% + 33 µl de Perclorato de sodio. Agitar vigorosamente 10

segundos a temperatura ambiente.

5) Agregar 60 µl de NaCl 5 M y agitar vigorosamente 15 segundos.

Centrifugar 10 minutos a 1500 g a temperatura ambiente.

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6) Pasar el SN a un tubo limpio y agregar 210 µl de isopropanol frío (-20°C).

Tapar y mezclar suavemente (se observa el ovillo).

7) Sacar el ADN con un tip (no aspirar) y colocarlo en 100 µl de etanol 70%.

CUIDADO: el ADN es muy pegajoso, fijarse que no quede pegado en el

tip.

8) Centrifugar 5 minutos a 1500 g. Descartar el etanol 70% y volver a lavar

con 100 µl una vez mas.

9) Dejar secar el etanol.

10) Disolver el ADN en 30-50 µl de H2O mQ.

11) Incubar a 55°C 10-20 min para disolver. Observar a contraluz la

disolución del ADN.

� Preparación de la dilución de las muestras de ADN En la preparación de la master mix se necesita que 400ng de ADN estén contenidos en 5µl de agua bidestilada estéril. A partir de la cuantificación de ADN. Complete esta tabla con sus datos, muestras 1-15:

Muestra A260 Acido Nucléico µµµµg/ml

(A260.50.100)

0,4 µµµµg están en… (n µµµµl)

µµµµl de H2O (5-n)

Ejemplo: 0,028 140 2,85 µl (5µl -2,85µl) = 2,15 1 µl 2 µl 3 µl 4 µl 5 µl 6 µl 7 µl 8 µl 9 µl 10 µl 11 µl 12 µl 13 µl 14 µl 15 µl

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� II-RFLP-PCR: DETERMINACION DEL ALELO DUARTE EN

GALACTOSEMICOS: MUTACIÓN N314D EN EL EXÓN 10 DEL

GEN GALT (GALACTOSA 1-FOSFATO URIDIL TRANSFERASA)

Introducción

Alelo Duarte: La variante Duarte, es un alelo polimorfico del gen GALT, que

da como resultado que la enzima presente una actividad alterada. Este

polimorfismo es común en la población y puede pasar clínicamente

desapercibido.

En la mutación N314D hay una sustitución (c.940 A>G), que genera un cambio

del aminoácido asparagina (Asn, N) por un ácido aspártico (Asp, D). El cambio

N314D está asociado con dos variantes de galactosemia que tienen actividad de

GALT alterada, pero con fenotipos subclínicos diferentes:

1- En la variante D1, además del polimorfismo N314D se encuentra la mutación

L218L (c.652C>T) que es una sustitución silenciosa. A los alelos que llevan

tanto N314D como L218L se los conoce como alelo Los Angeles (LA) o alelo

Duarte1 (D1). Estos alelos LA/D1 presentan actividad GALT normal o incluso

superior a la normal (110-130% de lo normal).

2- La variante D2 está asociada con una disminución de la actividad de GALT e

incluye N314D junto con tres cambios de nucleótidos dentro de los intrones.

Para los alelos D2, el polimorfismo N314D es un desequilibrio de ligamiento con

3 sustituciones intrónicas (IVS-4 nt-27g>c; IVS-5 nt-24g>a y IVS-5 nt+62g>a) y

una deleción de 4 pb en el promotor de GALT (las bases 116 a 119, corriente

arriba del codón de iniciación metionina). Se ha sugerido que esta deleción de

4pb (-119delGTCA) en la región promotora 5’ del gen de GALT esta

específicamente relacionada a una actividad reducida de la enzima.

La combinación de estas dos variantes distingue Duarte 1 (D1) con una actividad

relativamente normal de GALT, del genotipo Duarte 2 (D2) con actividad

reducida de GALT. Para la genotipificación, varios autores consideran como

genotipo D2 a los individuos con al menos una copia de N314D y al menos una

copia de la deleción de 4 pb y con el genotipo D1 al individuo que presente al

menos una copia de N314D y ausencia de la deleción de 4 pb.

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La frecuencia total (D1+D2) de la mutación N314D en todo el mundo es de

aproximadamente el 8-10%. Estudios realizados en gran escala (Suzuki y col.,

2001) para los alelos de GALT estimaron que las frecuencias de los alelos D1 es

de 2,7% y D2 es de 5,1%.

Como se mencionó previamente, el alelo N314D es una mutación puntual de

un cambio A por G, (cA940G) que determina un cambio de codón AAC por

GAC, que codifica un cambio del aminoácido Asparagina (N) por Acido

Aspártico (D) en el exón 10 del gen galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT).

Este polimorfismo genera un cambio de bases que determina un sitio de corte

para la enzima de restricción AvaII.

AvaII G�G (A/T) CC

Figura 1: Exón 10 del gen GALT humano. En negrita se detalla el exón 10 del gen GALT, la

flecha roja indica la mutación y la flecha negra pequeña, el sitio de corte con la enzima de

restricción. Con corchetes y subrayado se indica la zona de hibridación de los primers F y R.

En la secuencia de reconocimiento de corte W indica A ó T.

Por PCR se obtiene un producto final de 166 pb y luego del corte con la enzima de

restricción Ava II, el alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 pb, mientras que el

alelo normal tiene un fragmento de 166pb (ausencia de corte).

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Figura 2: Análisis de la mutación N314D en el exón 10 del gen GALT humano. Línea 4: homocigota para el alelo mutado; líneas 1, 2, 5 y 6: heterocigotas y líneas 3 y 7 al 10: homocigotas para el alelo normal.


DETERMINACION DEL ALELO DUARTE (MUTACIÓN N134D) PARA

EL GEN GALT UTILIZANDO PCR Y POLIMORFISMOS DE

LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION (PCR-RFLP)

Fundamento del método: La mutación N314D genera un sitio de corte para la

enzima Ava II en el exón 10 del gen GALT. Se amplificará un fragmento de 166 pb y

luego se procederá a un corte con la enzima de restricción AvaII.

PROTOCOLO

1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR

será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5

µl a la muestra de ADN. Necesita 400 ng de ADN genómico para esta reacción

de PCR. Calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 0,4 µg.

2.- Rotular todos los tubos con el número de muestra que le corresponde.

3.-Identificar cuatro tubos de PCR M1, M2 y M3 y al restante con el signo (-),

ya que será su Control Negativo.

Objetivos: 1-Establecer los conceptos básicos de la técnica de RFLP-PCR.

2- Detectar por PCR seguida con digestión con enzima de restricción (AvaII) la

mutación N314D en el exón 10 del gen GALT.

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4.- El tubo Eppendorf más grande (de 1500 µl) es el que usted utilizará para

preparar la Master MIX. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el

número de tubos que procesará: n (en su caso, 4). Multiplique TODOS los

volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1

(para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix).

En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique

entonces, todo por cinco.

Composición de la Master Mix: 1. H2O (csp 20µl)................................ 14,75µl... .............57 µl 2. Buffer 10X.......................................... 2,5 µl... .....…... 12,5 µl 3. Mg Cl2 50 mM…..…..…....................... 1 µl ...... ............ 5 µl 4. dNTPs 2,5 mM............................... 2,0µl ...... x 5 ............ 10 µl 5. Primer Galt-10-S (25 pM/µl)....….......1 µl……... ..………... 5 µl 6. Primer Galt-10-AS (25 pM/µl)….…..1 µl……...... ….………..5 µl 7. Taq pol. (5 U/µl)………………………….0,25 µl ….. ………… 1,25 µl 8. ADN ...........................400ng/5µl

5.- Preparación de la master mix.

Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos reactivos en orden de volumen

decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La

Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo

fuera del freezer.

PRECAUCIONES: Trabajar SIEMPRE sobre hielo.

NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar

contaminaciones.

6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP anterior. En

el tubo de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un

spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.

Programa de ciclado: 92°C ..............1 minuto

59°C ..............1 minuto 40 ciclos

72°C ..............1 minuto

Extensión final: 72°C ................ 10 minutos

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7.- Digestión con la enzima de restricción AvaII:

En un tubo estéril agregar los siguientes reactivos en el orden indicado:

H2O (csp 20 µl) �� 16,3 µl

Buffer AvaII 10X �� 2 µl

BSA Acetilada (10 µg/µl) �� 0,2 µl

Producto de PCR �� 10 µl

Mezclar suavemente con la pipeta, centrifugar por unos pocos segundos y

agregar:

AvaII (10 U/µl) �� o,5 µl

Incubar a 37 ºC por 1 hora.

De los 20 µl del producto de PCR: 10 µl son el producto de PCR sin corte y 10µl

son usados para la digestión con la ER. Al sembrar en el gel de cada muestra se

sembrará por duplicado: sin corte y con corte.

Los fragmentos resultantes de la digestión se separarán en geles de agarosa al

2,5%.

Electroforesis en geles de agarosa: 1-Preparar 75 ml de agarosa al 2,5 %, (1,9 g en 75 ml de buffer TAE 1X). 2-Disolver la agarosa en el horno de microondas. 3-Dejar enfriar la solución a 50ºC y agregar 3 µl de una solución stock de GelRed 10.000X (Para una concentración final de 1X).

4-Volcar en la gelera preparada con el peine. 5-Dejar solidificar. 6- Extraer el peine. 7- Agregar buffer de corrida (TBE 0,5X) en la gelera. 8- Siembra: colocar en un tubo para sembrar:

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M sin corte (-) AvaII M con corte (+) AvaII Producto de PCR 10 µl 10 µl Buffer de siembra 3 µl 3µl 9-Realizar un spin en la centrifuga y sembrar los 13 µl por inmersión. En uno de los pocillos sembrar 5 µl de patrones de peso molecular. 10-Electroforesis: -Conectar los terminales eléctricos a la fuente de poder. -Aplicar un voltaje constante, a razón de 4V/ cm. -Dejar correr hasta ≅ unos 4-5 cm por lo menos desde el lugar de siembra. -Desconectar la fuente de poder. -Retirar el gel y llevarlo al cuarto oscuro para observar la fluorescencia emitida en el transiluminador. Reactivos utilizados: Buffer de corrida: TBE 0,5X Solución Madre de TBE 5X, pH=8: Solución Stock de GelRed: 10.000X en agua. Buffer de siembra 6 X: 30% glicerol ( v/v en H2O ). 0,25 % azul de bromo fenol.

Observación e interpretación de los Resultados

Bibliografía:

Chike Item, Brian P. Hagerty, Adolf Mühl, Susanne Greber-Platzer, Sylvia

Stöckler-Ipsiroglu, and Wolfgang Strobl. 2002. Mutations at the Galactose-1-P-

Uridyltransferase Gene in Infants with a Positive Galactosemia Newborn Screening Test.

Pediatric Research. Vol. 51, No. 4, 511-516.

Tris Base …….............54 g Ac. Bórico …….......…27,5g EDTA 0,5M pH=8 .... 20 ml H2O csp …..…......…. 1000 ml

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� III- MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR

Introducción

En esta técnica se basa en la inserción artificial de un sitio de corte para una

enzima de restricción introducida por una modificación de un nucleótido en un

cebador o primer. Específicamente, en esta técnica se utiliza un cebador

forward (F) con un cambio puntual (G�C) en la base 433 (�) del exón 10 del

gen del CFTR. Dicho cambio artificial es vecino al sitio de mutación dF508

(recordemos que en dicha mutación hay una pérdida del triplete CTT que

codifica para el aminoácido fenilalanina).

La enzima MboI reconoce la secuencia (↓GATC). El cambio introducido genera

un sitio de corte para la enzima MboI en el alelo sano, pero no aparece en el

alelo con la deleción dF508, ya que debido a la ausencia del triplete no se puede

completar la secuencia de reconocimiento para el corte de la enzima.

En el alelo normal hay corte con la ER (+) mientras que en el alelo mutado no

hay corte (-).

GEN: Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. ACCESSION GENEBANK: M55115 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=306520)

1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggc[[[[accat 421 taaagaaaat atcat]]]]ctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgacc[[[[ta 661 tgctttaaga agcttgca]]]]aa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t

Figura 3: Exón 10 del gen del CFTR humano, con gris se detalla la deleción de tres pares de

bases que codifica para el aminoácido fenilalanina y con flechas el sitio de corte con la

enzima de restricción. Con corchetes y subrayado se indica la zona de hibridación de los

primers F y R. El tamaño del producto de amplificación será 262 pb para el alelo normal y

de 259 pb para el mutado.

�

�

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Además, se eligió un cebador reverse (R) que permitiera la inclusión de un sitio

de corte constitutivo para la enzima MboI, a efectos de servir como control

interno de la actividad de la enzima de restricción (posición 634�). Ver figura3.

Luego del corte con la enzima, se observan los siguientes fragmentos para el

alelo normal (N): 17 pb, 201 pb y 44 pb y para el alelo mutado (M): 215 pb y 44

pb.

Sin corte con la enzima de restricción:

Figura 4a: Fragmentos obtenidos luego de la reacción de PCR. Línea 1, 3 y 8 heterocigotas,

7 marcador de peso molecular

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Con corte con la enzima de restricción:

Figura 4b: Fragmentos obtenidos luego de la reacción de PCR después del tratamiento con

la enzima MboI. Linea 1, 2, 5 y 6 heterocigotas, 3 homocigota normal y 4 homocigota

(df508/df 508)


DETERMINACION DE PORTADORES PARA LA MUTACION ∆∆∆∆F508

DEL GEN CFTR USANDO MUTAGENESIS MEDIADA POR PCR (MM-

PCR)

Fundamento del método: esta técnica se basa en la inserción artificial de un

sitio de corte para una enzima de restricción en un alelo específico, a través de la

modificación de un nucleótido en uno de los cebadores.

PROTOCOLO


será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos.

Conclusión: el ADN de la muestra debe estar contenido en 5 µl. A partir de los

Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la MM-PCR

2- Utilizar la técnica para determinar la mutación mas frecuente en pacientes

con fibrosis cística.

3- Determinar la frecuencia de portadores de la mutación dF508

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datos de concentración de su ADN muestra, obtenidos en el práctico anterior,

calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 1 µg. En el caso de que este

volumen sea menor a 5 µl, llevar a volumen con agua destilada estéril.

2.- Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde.

3.-Identificar cuatro de los tubos de PCR con una M1, M2 y M3 y al restante con

el signo (-), ya que será su Control Negativo.

4.- El tubo Eppendorf más grande (de 1500 µl) es el que usted utilizará para

preparar la Master MIX. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el

número de tubos que procesará: n (en su caso, 4). Multiplique TODOS los

volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1

(para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix).



Composición de la Master Mix: 1. H2O (csp 20µl)............ 11,25µl....... .............57 µl 2. Buffer 10X..................... 2,5 µl...... .......….. 12,5 µl 3. Mg Cl2 50 mM…..…..… 1 µl ......... ............ 5 µl 4. dNTPs 2,5 mM............. 2,0µl ....... x 5 ............ 10 µl 5. Primer S (25 pM/µl).... 1 µl……..... ……....... 5µl 6. Primer S (25 pM/µl)…. 1 µl……….. ….….…. 5 µl 7. Taq pol. (5 U/µl)………….0,25 µl ….. ..……….. 1,25 µl 8. ADN ...............................5µl

(ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para)

5.- Preparación de la master mix.




fuera del freezer.



contaminaciones.

6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP1. En el tubo

de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin

(centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.

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Programa de ciclado: Preciclo: 94°C ............. 3 minutos. 95°C ..............1 minutos 50°C ..............2 minutos 35 ciclos 72°C ..............1 minuto Extensión final: 72°C ................ 5 minutos.

� IV- ARMADO Y CORRIDA DE GELES DE POLIACRILAMIDA NO

DESNATURALIZANTES. TINCION DE GELES. OBSERVACION

DE RESULTADOS E INFORME.

Introducción

La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para la resolución de

secuencias de ADN de bajo peso molecular (entre 40 pb y 200 pb) cuya

observación se dificulta en geles de menor resolución, como por ejemplo, los

geles de agarosa.

La técnica consiste en la elaboración de una capa fina de gel de poliacrilamida

por la cual migra el ADN. Al igual que en los geles de agarosa, la migración

responde a la carga negativa neta de la molécula de ADN y a la concentración

del gel. Las secuencias de ADN más pequeñas migran a mayor velocidad

mientras que las más grandes quedan retrasadas.

En resumen, la migración del ADN a través de los geles de poliacrilamida

dependerá de: el tamaño molecular del ADN, la concentración de

poliacrilamida, la conformación espacial del ADN y la corriente aplicada.

La visualización de las bandas puede hacerse directamente por tinción con un

colorante fluorescente, como por ejemplo, el GelRed. El GelRed fue diseñado

como un colorante de reemplazo del Bromuro de Etidio en la tinción de ADN

doble cadena (ds), ADN simple cadena (ss) o ARN. Este colorante posee las

ventajas de ser extremadamente estable en el tiempo, NO ES MUTAGENICO

NI CITOTOXICO y es seguro para el medio ambiente. Ver anexo

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ARMADO, CORRIDA E INTERPRETACION DE GELES DE

POLIACRILAMIDA PARA LA DETERMINACION DE PORTADORES

PARA LA MUTACION ∆∆∆∆F508 DEL GEN CFTR POR MM-PCR

PROTOCOLO

Los productos de amplificación obtenidos por MM-PCR se separarán por

corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 12%.

La preparación de los geles se llevará a cabo utilizando SIEMPRE guantes, ya

que la acrilamida es una sustancia neurotóxica que se absorbe por la piel.

1- Se utilizará una cuba vertical para el armado de los geles. Limpiar los vidrios

con detergente no iónico, enjuagar con agua común, etanol y finalmente con

agua destilada. Secar.

2- Armar la cuba vertical.

3- Preparación del gel poliacrilamida al 12%:

En un tubo Falcon de 15 ml medir los siguientes reactivos para la preparación

de un gel de poliacrilamida:

Reactivos ↓↓↓↓ / Concentración de poliacrilamida →→→→ 12 %

Acrilamida (30%) 4 ml

Agua 3,93 ml

TBE 5X 2 ml

Persulfato de amonio (25%) 70 µl

TEMED 3,5 µl

Rango de separación 40-200 pb

Objetivos: 1-Conocer el fundamento y las aplicaciones de los geles de poliacrilamida para la

separación de ADN.

2- Llevar a cabo los procedimientos de preparación, corrida y tinción de geles

de poliacrilamida

3- Aplicar la técnica para el análisis de productos obtenidos por MM-PCR

19

4- Cargar la solución del gel con una jeringa, colocar el peine y esperar

aproximadamente 40 minutos a que el mismo polimerice.

Buffer de corrida para electroforesis: TBE 0,5 X, pH 8.

Preparación de las muestras a sembrar:

1.- Enumerar tantos tubos como muestras haya (incluido el control negativo).

2.- Colocar en cada tubo 8 µl del amplificado + 2 µl de buffer de siembra. El

Buffer de Siembra contiene azul de bromofenol como marcador del frente de

corrida (en un gel de poliacrilamida al 12%, el colorante se ubica en la posición

de 20 pb).

3.- Realizar un spin.

4.- Sembrar en el gel con micropipeta, en forma vertical, tratando de no romper

los pocillos. En uno de los pocillos sembrar 2 µl de patrones de peso molecular.

5.- Correr a 100 V aproximadamente.

6.- Terminada la corrida, sacar el gel y teñir aproximadamente 10 minutos en

una solución 1X de GelRed

7.- Visualizar en el transiluminador las bandas amplificadas.

8.- Interpretación de los resultados.

20

� V- MAS-PCR

Introducción

La PCR Múltiple Alelo Especifica (MAS-PCR) es la amplificación, en un único

tubo, de múltiples fragmentos de una determinada secuencia. Esta estrategia

involucra la elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar a

fragmentos de diferente tamaño, que deberán ser fácilmente resueltos en una

única línea de corrida de un gel. Los primers usados son alelo-específicos. Esta

técnica se ha usado con éxito en el diagnostico de enfermedades como la

distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, beta talasemia y el screnning de

4 de las mutaciones más comunes para fibrosis cistica (dF508, G542X, G551D y

N1303K).


DETERMINACION DE LAS MUTACIONES dF508 y G542X POR PCR

MULTIPLE ALELO ESPECÍFICA (MAS-PCR)

Fundamento del método: En el TP se realizara el diagnóstico de las

mutaciones dF508 y G542X. Cada muestra se amplifica en dos tubos: en el

primer tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos normales

(cebadores F: CF-W1468-N y R: CF-508 RP para la mutación dF508 y

cebadores F: 5’IVS-11 y R: G542X-N para la mutación G542X). En el segundo

tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos mutados (cebadores F:

dF 508 y R: CF-508 RP para la mutación dF508 y cebadores F: 5’IVS-11 y R:

G542X-M para la mutación G542X).

Primers Secuencia Tipo CF-W1468-N 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’ F1 CF-508 RP 5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’ R1 ∆F 508 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’ F2 5’IVS-11 5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’ F3 G542X-N 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’ R3 G542X-M 5’-GTC TGA TTC CAC CTT CTC A-3’ R4

Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la técnica MAS-PCR.

2- Utilizar la técnica para la determinación de las mutaciones dF508 y G542X.

21

Figura 5: Exón 10 del gen CFTR humano, se detalla con corchetes y subrayado la zona de

hibridización de los primers F (alelos específicos) y R (común) para la detección de la

mutación dF508.

Figura 6: Exón 11 del gen CFTR humano, se detalla con corchetes y subrayado la zona de

hibridización del primers F (común) y R (alelos específicos) para la detección de la

mutación G542X.

Los tamaños de los productos de amplificación obtenidos serán de 139 pb para

el alelo normal de dF508, 136 pb para el alelo con la mutación dF508, 174 pb

para el alelo normal G542X y de 174 pb para el alelo mutado de G542X (Figura 5

y 6).

22

Figura 7: Análisis de las mutaciones dF508 y G542X en el gen CFTR humano. Pacientes P1 a P4: homocigotas para los alelos normales, P5: Homocigota para el alelo normal de G542X y homocigota para la mutación dF508 y P6: Homocigota para el alelo normal de G542X y heterocigota para la mutación dF508.

PROTOCOLO



µl a la muestra de ADN. A partir de los datos de concentración de su ADN

muestra, obtenidos en el primer práctico, calcule qué volumen de ADN debe

tomar para tener 0,1 µg.


3.-Identificar ocho de los tubos más pequeños (de 500 µl) con una M1N, M1M,

M2N, M2M, M3N y M3M y a los dos restantes con el signo (-N) y (-M).

4.- Se utilizarán dos tubos Eppendorf (de 1500 µl) para preparar la Master MIX

A y la Master MIX B. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número

de tubos que procesará: n (en su caso, 4 para cada MIX). Multiplique TODOS

los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n +

1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix).



23

Entonces se hacen dos MIX:

Composición de la Master Mix NORMAL:

1. H2O (csp 20 µl).................................. 11,4 µl.......... ............. 57 µl

2. Buffer 10X...............................………….. 2,5 µl............ ……...… 12,5 µl

3. Mg Cl2 50 mM……………………………….. 1 µl ......... ........... 5 µl

4. dNTPs 2,5 mM..................................... 2 µl ......... x 5 ............. 10 µl

5. Primer CF-W1468-N (25 pM/µl) .......... 0,6 µl……….. ………... 3 µl

6. Primer CF-508-RP (25 pM/µl)............. 0,6 µl……….. …….…… 3 µl

7. Primer G-542-N (25 pM/µl)............... 0,8 µl……….. …….…….. 4 µl

8. Primer 5´IVS-11 (25 pM/µl) …...............0,8 µl ……….. ............... 4 µl

9. Taq pol. (5U/µl).............…………............0,3 µl …...… …...……… 1,5 µl

10. ADN ……...............................................5µl

Composición de la Master Mix MUTANTE:

11. H2O (csp 20 µl).................................. 11,4 µl......... ........... 57 µl

12. Buffer 10X...............................………….. 2,5 µl.......... ……...… 12,5 µl

13. Mg Cl2 50 mM……………………………….. 1 µl .............. ............. 5 µl

14. dNTPs 2,5 mM..................................... 2 µl ............. x 5 ............ 10 µl

15. Primer dF508 (25 pM/µl) .................... 0,6 µl……….. ….….... 3 µl

16. Primer CF-508-RP (25 pM/µl)............. 0,6 µl………. ….…… 3 µl

17. Primer G-542-M (25 pM/µl)...............…0,8 µl…… .…….. 4 µl

18. Primer 5´IVS-11 (25 pM/µl) …...............0,8 µl ……… ............. 4 µl

19. Taq pol. (5U/µl).............………….............0,3 µl …...… ………… 1,5 µl

20. ADN ……...............................................5µl

5.- Preparación de la master mix




fuera del freezer.



contaminaciones.

24




Programa de ciclado: Preciclo: 95°C ............. 5 minutos

95°C ..............1 minuto

60°C ............. 1 minuto 30 ciclos

72°C .............. 1 minuto


Los fragmentos resultantes de la digestión se separan en geles de agarosa al 3%.


� VI- ARMS-PCR: GENOTIPIFICACION DE APO E

Introducción

APOPROTEÍNA E: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN

Gen

El gen de la Apo E se localiza en el cromosoma 19 (19q13.2) y tiene una longitud

de 3,7 Kb. Esta agrupado con los genes de las apolipoproteínas CI, CII y CIV, y

comprende cuatro exones y tres intrones. Se trata de un gen polimórfico con

tres alelos codominantes (ε2, ε3, ε4), que dan lugar a seis posibles genotipos:

ε2ε2, ε2ε4, ε3ε2, ε3ε3, ε3ε4, ε4ε4. Las tres isoformas que se originan a partir de

los tres alelos se diferencian entre sí en 1 ó 2 aminoácidos. Los polimorfismos

del gen de la Apo E, que se localizan en el exón 4, consisten en diferencias de

una base en las posiciones 112 y/ó 158 (cambio de una citosina por una timina),

que supone un cambio de Arginina por Cisteína. La isoforma E2 tiene una

Cisteína en posición 112 y 158, E3 tiene Cisteína en posición 112 y Arginina en

posición 158 y E4 tiene una Arginina en ambas posiciones, 112 y 158.

25

El ARNm tiene 1164 nt, el transcripto primario tiene 317 aminoácidos con un

péptido señal de 18 aminoácidos sobre el extremo N-terminal. La apo E madura

es secretada como una proteína de 299 aminoácidos.

Proteína

Se ha encontrado expresión de Apo E en hígado, cerebro, bazo, pulmón,

glándula adrenal, ovario, riñón y músculo. La mayor producción es en hígado.

Modelo de la estructura de Apo E libre de lípidos: El dominio N-terminal

consiste de un manojo de 4 hélices (hélice 1, rojo; hélice 2, azul; hélice 3, verde;

hélice 4, amarillo). Ver figura 8. El dominio N-terminal contiene la región de

unión al receptor de LDL (R-LDL) en la hélice 4. La región de alta afinidad al R-

LDL requiere también la Arg172 en la región bisagra que conecta los dominios

N- y C terminal. El dominio N-terminal contiene 2 posiciones polimorficas en

posición 112 y 158 que distingue las 3 isoformas de Apo E. El dominio C-

terminal (gris) contiene los principales elementos de unión a lipoproteínas.

Figura 8: Estructura de la proteína de Apo E.

26

Tabla 1: Frecuencia de los alelos de Apo E humanas y sus diferencias

Alelo

Frecuencia

alélica (%)

Variación de aminoácido en

posición:

Afinidad

al RLDL

Preferencia de

unión a LP

Desordenes

Asociados

112 158

Apo E2 7 Cys Cys Baja HDL HLP tipo III

Apo E3 78 Cys Arg Alta HDL Desconocidos

Apo E4 15 Arg Arg Alta VLDL, LDL Alzheimer,

aterosclerosis

Figura 9: Secuencia del exón 4 del gen de Apo E. Se denota el codón 112 y 158 que genera los polimorfismos que determinan los distintos alelos de Apo E. Se denota con corchetes el primer reverse común para los 4 primers forward ARMS. ARMS-PCR (Amplification refractory mutation system-PCR)

El Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación (ARMS) por PCR usado

para detección de mutaciones ha demostrado ser una herramienta de gran

utilidad en la identificación de portadores y en el diagnostico prenatal de

enfermedades hereditarias, puesto que permite la detección de mutaciones

puntuales, deleciones, inserciones, polimorfismos y otras variaciones conocidas

del ADN.

27

La PCR-ARMS se fundamenta en que la amplificación del ADN será ineficiente

o completamente refractaria si hay un error de apareamiento (mismatch) entre

el nucleótido del extremo terminal 3´ del cebador y su correspondiente

nucleótido en ADN molde. Debido a que la Taq ADN polimerasa carece de

actividad exonucleasa 3´ a 5´correctora, no puede corregir el error en el

extremo 3´del cebador. Por lo tanto, se requiere un apareamiento de bases

complementario en el extremo 3´del cebador para que la Taq ADN polimerasa

pueda amplificar eficientemente el fragmento de ADN deseado, permitiendo

mayor especificidad y discriminación por parte de la enzima.

De esta manera, el método ARMS permite la amplificación de alelos específicos

usando cebadores especiales que se hibridan completamente al alelo deseado y

no lo hacen al otro alelo debido al cambio de una base en el nucleótido 3’

terminal de los mismos. De este modo, el alelo deseado es amplificado

fácilmente mientras que el otro no es amplificado o lo es escasamente.

Un ensayo típico de ARMS comprende dos reacciones de PCR, donde se utilizan

el mismo ADN sustrato y tres cebadores. Ambas reacciones contienen un

cebador común, complementario para los dos alelos de interés, que se alinea

con una secuencia invariable del ADN próxima a la mutación que va a ser

detectada. El extremo 3’ del cebador común se orienta hacia la mutación. Los

otros dos cebadores restantes son alelo específicos, en una de las reacciones se

coloca el cebador específico para el alelo normal (WT) y en la otra se incluye el

cebador específico para el alelo mutado (M).

- Si solo se obtiene producto con la reacción que contiene el cebador para el

alelo WT��se trata de un paciente homocigoto normal.

- Si hay productos con los dos cebadores (tubo WT y tubo M) ��se trata de un

paciente heterocigoto.

- Si solo se obtiene producto con la reacción que contiene el cebador para el

alelo M��se trata de un paciente homocigoto para la mutación (Figura 10).

28

Figura 10: Fundamento de ARMS-PCR. Se preparan dos mezclas de reacción separadas para

PCR, una para cada mezcla de cebadores: Mezcla A: cebador para el alelo normal (color

amrillo) con el cebador común (color rosa) y Mezcla B: cebador para el alelo mutado (color

gris) con el cebador común (color rosa).

Para incrementar la especificidad propia de los cebadores por cada alelo,

además se introduce en ellos un cambio de una base adicional en el segundo al

cuarto (2º-4º) nucleótido del extremo 3’, de este modo se asegura que cada

cebador permita únicamente la amplificación del alelo para el que su nucleótido

3’ terminal es complementario (Figura 11).

Figura 11: Especificidad de los iniciadores o primers ARMS con un cambio de base adicional en el segundo a cuarto nucleótido de su extremo 3’. La doble cadena de ADN se representa con líneas azules; en una de las cadenas se hibrida el iniciador común (en rosa) y en la otra se alinea uno de los iniciadores ARMS (línea gris con el nucleótido de su extremo 3’ en verde) con o sin cambio de base adicional (letras rojas y negras), de lo que dependerá que se obtenga sólo el producto de amplificación deseado.

Si la prueba de ARMS se usa para detectar una deleción o inserción no se

requiere introducir ningún cambio de base adicional, ya que la mutación por si

misma provee diferencia suficiente entre un iniciador y el alelo no

29

correspondiente. Por otra parte, varios iniciadores ARMS pueden ser

combinados en los mismos tubos de reacción para detectar varias mutaciones o

polimorfismos simultáneamente; esta modificación del método ARMS se

denomina ARMS múltiple.

Ventajas del método: El procedimiento tiene la ventaja de no ser radiactivo y

requiere menos de 5 horas para su realización. Es una técnica sencilla, exacta,

rápida y reproducible. Una desventaja del método es que solo es posible detectar

mutaciones puntuales previamente conocidas para de esta manera poder

diseñar los cebadores correspondientes.


GENOTIPIFICACION DE APO E UTILIZANDO EL SISTEMA DE

MUTACIÓN REFRACTARIO A LA AMPLIFICACION POR PCR

(ARMS-PCR)

Fundamento del método: En el presente TP hemos aplicado el concepto de

ARMS-PCR para la genotipificación de Apo E. Para asegurar la especificidad de

los primers, se ha introducido deliberadamente un error de apareamiento

adyacente al nucleotido 3’ terminal, donde se han cambiado las G señalizadas

por T (Figura 12).

Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la técnica ARMS-PCR.

2- Utilizar la técnica para determinar cada uno de los alelos de apo E y el

genotipo de la muestras.

3- Determinar la frecuencia del alelo Apo E2, el cual está asociado a la

presencia de disbetaliproteinemia (hiperlipoproteinemia tipo III), en muestras

de la población universitaria.

30

Figura 12: Secuencia de los cebadores forward ARMS para la genotipificación de Apo E. El último nucleótido marcado en negrita denota los polimorfismos par el gen de Apo E; el penúltimo nucleótido (G) es el nucleótido que se cambia por T para aumentar la especificidad del método. El primer reverse es común a todos ellos.

En las reacciones de amplificación se incorporan dos cebadores de un gen que

actúa como CONTROL POSITIVO INTERNO, en nuestro caso es el gen α1-

antitripsina (AAT) que genera un fragmento de 360 pb. Este fragmento, que es

co-amplificado con los fragmentos correspondientes a los alelos específicos,

debe estar presente en todos los tubos con las muestras de pacientes.

Cada muestra será procesada por duplicado (Tubo A y Tubo B). En ambos tubos

se colocarán los cebadores F y R del gen control (F-AAT y R-AAT)) y el cebador

R común para todos los alelos de apo E (R-ApoE). Además, el tubo A contendrá

los 2 cebadores ARMS Cys: Cys 112 y Cys 158 y el tubo B contendrá los 2

cebadores ARMS Arg: Arg 112 y Arg 158.

- Para el Alelo Apo E2: habrá amplificación en el tubo A de un fragmento de 588

pb ARMSCys112 y uno de 451 pb ARMSCys158. No hay amplificación en el tubo B.

- Para el Alelo Apo E3: hay amplificación en el tubo A de un fragmento de 588

pb del ARMSCys112 y en el tubo B uno de 451pb del ARMSArg158.

- Para el Alelo Apo E4: hay amplificación en el tubo B de un fragmento de 588

pb del ARMSArg112 y uno de 451pb ARMSArg158. No hay amplificación en el tubo

A.

Ver Figura 13 y Tabla 2 para la interpretación de los distintos genotipos que

surjan de la combinación de estos 3 alelos.

31

Figura 13: Productos de amplificación correspondientes a los seis genotipos ApoE posibles obtenidos por ARMS-PCR. (A) y (B): es el producto de amplificación del tubo A y B, respectivamente.

Tabla Nº 2:

MASTER MIX A MASTER MIX B GENOTIPO��

Cys 112 Cys 158 Arg 112 Arg 158 Primer Forward

(ARMS) 588 pb 451pb 588 pb 451 pb Tamaño del

producto de

amplificación + + - - 2/2

+ - - + 3/3

- - + + 4/4

+ + + + 2/4

- - + + 3/4

+ + - + 2/3

R-Apo E común R-Apo E común Primer Reverse

32

Primers Secuencia (le cambiamos las G señaladas por T) nt

Cys 112 5’-CGC GGA CAT GGA GGA CGT GT-3’ 20

Cys 158 5’-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AGT-3’ 21

Arg 112 5’-CGC GGA CAT GGA GGA CGT GC-3’ 20

Arg 158 5’-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AGC-3’ 21

R-ApoE 5’-GTT CAG TGA TTG TCG CTG GGC A-3’ 22

F- AAT 5’-CCC ACC TTC CCC TCT CTC CAG GCA AAT GGG-3’ 30

R- AAT 5’-GGG CCT CAG TCC CAA CAT GGC TAA GAG GTG-3’ 30

PROTOCOLO



µl a la muestra de ADN. A partir de los datos de concentración de su ADN

muestra, obtenidos en el primer práctico, calcule qué volumen de ADN debe

tomar para tener 0,25 µg.


3.-Identificar ocho (tres chicos por comisión y dos tubos por cada uno más dos

negativo uno por cada mix) de los tubos más pequeños (de 500 µl) con una M1A,

M1B, M2A, M2B, M3A y M3B y a los dos restantes con el signo (-A) y (-B).

4.- Se utilizarán dos tubos Eppendorf (de 1500 µl) para preparar la Master MIX

A y la Master MIX B. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número

de tubos que procesará: n (en su caso, 4 para cada MIX). Multiplique TODOS

los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n +

1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix).



Entonces se hacen dos MIX

33

Composición de la Master Mix TUBO A:

1. H2O (csp 20 µl)........................ 12,45 µl........... ............. 62,25 µl

2. Buffer 10X....................………….. 2,5 µl............ ……...… 12,5 µl

3. Mg Cl2 50 mM…………………… 0,75 µl ........... ............... 3,75 µl

4. dNTPs 10 mM.......................... 0,5 µl ........... x 5 .............. 2,5 µl

5. Primer Cys 158 (50 pM/µl) ....... 0,4 µl……….. .....…........ 2 µl

6. Primer Cys 112 (50 pM/µl)........ 0,2 µl……….. . …….…… 1 µl

7. Primer R-Apo E (50 pM/µl)…. 0,4 µl……….... …….…….. 2 µl

8. Primer F-AAT (0,5 pM/µl) …....0,4 µl ………... ............... 2 µl

9. Primer R-AAT (0,5 pM/µl) ….....0,4 µl ……….. ............... 2 µl

10. DMSO……………………………….… 1,8 µl............. ................ 9 µl

11. Taq pol. (5U/µl).............…………...0,2 µl ……… ………… 1 µl

12. ADN .....................................5µl

Composición de la Master Mix TUBO B:

1. H2O (csp 20 µl)........................ 12,45 µl........... ............. 62,25 µl

2. Buffer 10X....................………….. 2,5 µl............ ……...… 12,5 µl

3. Mg Cl2 50 mM……………………....0,75 µl ........... ............... 3,75 µl

4. dNTPs 10 mM............................0,5 µl ........... x 5 .............. 2,5 µl

5. Primer Arg 158 (50 pM/µl) ....... 0,4 µl……….. …….…... 2 µl

6. Primer Arg 112 (50 pM/µl)........ 0,2 µl……….. …….…… 1 µl

7. Primer R-Apo E (50 pM/µl)….. 0,4 µl……….. …….…….. 2 µl

8. Primer F-AAT (0,5 pM/µl) …....0,4 µl ……….. ............... 2 µl

9. Primer R-AAT (0,5 pM/µl) ….....0,4 µl ……….. ............... 2 µl

10. DMSO……………………………….… 1,8 µl........... ................ 9 µl

11. Taq pol. (5U/µl).............………….0,2 µl …… …………… 1 µl

12. ADN ......................................5µl

5.- Preparación de la master mix: Idem a las anteriores




34

Programa de ciclado: Preciclo: 95°C ............. 4 minutos

96°C ..............45 segundos

66°C ..............45 segundos 35 ciclos

72°C ..............45 segundos


Los fragmentos resultantes de la digestión se separan en geles de agarosa al

2,5%.


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