chlorella sorokiniana en diferentes medios de cultivo en ...
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i
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
Tema:
________________________________________________________
“DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE LA MICROALGA
Chlorella EXTRAÍDA DE LAS AGUAS EMPOZADAS DE LAS ACEQUIAS DE
ATOCHA, TILULUM Y EL SOCAVÓN DEL CANTÓN AMBATO”
Trabajo de Investigación. Modalidad: Trabajo Estructurado de Manera
Independiente (TEMI). Presentado como Requisito Previo a la Obtención del Título
de Ingeniera Bioquímica.
AUTOR: Adriana Carolina Barona Altamirano
Tutor: Ing. Mg. Alex Valencia
Ambato – Ecuador
2014
ii
APROBACION DEL TUTOR
Siendo el tutor de trabajo de investigación realizado bajo el tema: “Determinación
del potencial antimicrobiano de la microalga Chlorella extraída de las aguas
empozadas de las acequias de Atocha, Tilulum y el Socavón del cantón Ambato",
por la egresada Adriana Carolina Barona Altamirano; tengo a bien afirmar que el
estudio es idóneo y reúne los requisitos de una tesis de grado de Ingeniería en
Bioquímica; y el graduando posee los méritos suficientes para ser sometido a la
evaluación del Jurado Examinador que sea designado por el H. Consejo Directivo
de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos.
Ambato, enero del 2014
Ing. Mg. Alex Valencia
TUTOR
iii
AUTORIA
Los criterios emitidos en el trabajo de investigación: “Determinación del potencial
antimicrobiano de la microalga Chlorella extraída de las aguas empozadas de las
acequias de Atocha, Tilulum y el Socavón del cantón Ambato", así también los
contenidos, ideas, análisis, conclusiones y recomendaciones, corresponden
exclusivamente a Adriana Carolina Barona Altamirano; e, Ing. Mg. Alex Valencia;
Tutor del Proyecto de Investigación.
…………………………………………….
Adriana Carolina Barona Altamirano
AUTOR
iv
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE GRADO
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
Los miembros del tribunal de grado aprueban el presente trabajo de graduación de
acuerdo a las disposiciones reglamentarias emitidas por la Universidad Técnica de
Ambato.
Ambato, Enero del 2014
Para constancia firman:
..............................
Presidenta Tribunal
Ing. Gladys Navas
................................. ................................
Miembro del tribunal Miembro del tribunal
Ing. Lander Pérez Mg. Dr. Carlos Rodríguez, PhD.
v
DEDICATORIA
Quiero dedicarle este trabajo a Dios que me ha dado la vida y fortaleza.
A mi padre por haberme apoyado y amado mientras estuvo a mi lado, por
cuidarme siempre desde el cielo.
A mi madre por su apoyo, consejos, comprensión, amor, ayuda en los momentos
difíciles, a mis hermanos Paola, María José y Alex por estar siempre presentes, a
mi esposo por su apoyo incondicional y a mi hijo Mateo quien es mi motivación,
inspiración y felicidad.
vi
AGRADECIMIENTO
A mi madre y hermanas quienes me han apoyado todo el tiempo brindándome su
mano amiga, dándome a cada instante una palabra de aliento para llegar a
culminar mi profesión.
Al Ingeniero Diego Salazar y Alex Valencia por su paciencia prestada y
colaboración en la elaboración de este proyecto.
vii
INDICE GENERAL DE CONTENIDOS
A. PAGINAS PRELIMINARES
TEMA DE LA INVESTIGACION….……………………………………..………………………..i
APROBACION DEL TUTOR ............................................................................................. ii
AUTORIA ......................................................................................................................... iii
DEDICATORIA .................................................................................................................. v
AGRADECIMIENTO ......................................................................................................... vi
INDICE GENERAL DE CONTENIDOS ............................................................................ vii
INDICE DE TABLAS ....................................................................................................... xii
ANEXO A. TABLAS ........................................................................................................ xii
ANEXO B. FOTOGRAFIAS ............................................................................................ xiii
RESUMEN ...................................................................................................................... xvi
SUMMARY .................................................................................................................... xvii
CAPITULO I ...................................................................................................................... 1
EL PROBLEMA DE INVESTIGACION .............................................................................. 1
1.1 Tema de investigación ......................................................................................... 1
1.2.1 Contextualización ......................................................................................... 1
1.2.2 Análisis Crítico .............................................................................................. 4
1.2.3 Prognosis ..................................................................................................... 5
1.2.4 Formulación del problema ............................................................................ 5
1.2.5 Preguntas Directrices ................................................................................... 5
1.2.6 Delimitación .................................................................................................. 6
1.3 Justificación ......................................................................................................... 6
1.4 Objetivos ............................................................................................................. 7
1.4.1 Objetivo general: ................................................................................................ 7
1.4.2 Objetivos específicos: ........................................................................................ 7
CAPITULO II ..................................................................................................................... 8
MARCO TEORICO ............................................................................................................ 8
2.1 Antecedentes investigativos ................................................................................ 8
2.2 Fundamentación Filosófica .................................................................................. 9
2.3 Fundamentación Legal ...................................................................................... 10
viii
2.4 Categorías fundamentales ................................................................................. 10
2.4.1 Microalgas .................................................................................................. 12
2.4.2 Importancia de las microalgas .................................................................... 12
2.4.3 Sistemas de cultivos ................................................................................... 13
2.4.4 Aspectos del crecimiento de microalgas ..................................................... 13
2.4.5 Clasificación ............................................................................................... 15
2.4.6 Chlorella ..................................................................................................... 16
2.4.7 Caracterización de la microalga Chlorella. .................................................. 16
2.4.8 Clasificación biológica ................................................................................ 17
2.4.9 Condiciones óptimas de crecimiento .......................................................... 17
2.4.10 Aislamiento y Purificación ........................................................................... 18
2.4.11 Biocaracterísticas ....................................................................................... 19
2.4.12 Compuestos bioactivos ............................................................................... 21
2.4.13 Actividad antimicrobiana ............................................................................. 21
2.4.14 Bactericida .................................................................................................. 22
2.4.15 Potencial antimicrobiano ............................................................................. 22
2.5 Hipotesis ............................................................................................................ 22
2.5.1 Hipótesis Nula ............................................................................................ 22
2.5.2 Hipótesis Alternativa ................................................................................... 23
2.6 Señalamiento de variables ................................................................................. 23
2.6.1 Variable Independiente ............................................................................... 23
2.6.2 Variable Dependiente ................................................................................. 23
CAPITULO III .................................................................................................................. 24
LA METODOLOGIA ........................................................................................................ 24
3.1 Enfoque ............................................................................................................. 24
3.2 Modalidad básica de la investigación. ................................................................ 24
3.3 Nivel o tipo de investigación .............................................................................. 24
3.3.1 Exploratorio ................................................................................................ 24
3.3.2 Descriptivo .................................................................................................. 25
3.4 Población y muestra .......................................................................................... 25
3.5 Operacionalización de variables ........................................................................ 25
3.6 Plan de Recolección de la Información .............................................................. 28
3.6.1 Recolección de muestras............................................................................ 28
ix
3.6.2 Observación en microscopio de las muestras recogidas ............................ 28
3.6.3 Identificación de la microalga Chlorella. ...................................................... 28
3.6.4 Asilamiento de la microalga Chlorella ......................................................... 29
3.6.5 Crecimiento microalgal ............................................................................... 29
3.6.6 Velocidad de crecimiento ............................................................................ 31
3.6.7 Obtención de Chlorellin .............................................................................. 31
3.6.8 Aislamiento de bacterias mediante el método de difusión en placa ............ 32
3.6.9 Identificación la bacteria gram-positiva ....................................................... 32
3.6.10 Aplicación de los discos .............................................................................. 33
3.6.11 Incubación .................................................................................................. 33
3.6.12 Medición de los halos de inhibición. ............................................................ 34
3.6.13 Control positivo ........................................................................................... 34
3.7 Plan de procesamiento de la información .......................................................... 34
3.7.1 Factores o niveles en estudio ..................................................................... 34
a. Tratamientos............................................................................................... 34
b. Diseño Experimental ................................................................................... 36
CAPÍTULO IV .................................................................................................................. 37
ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS ..................................................... 37
4.1 Análisis de los resultados .................................................................................. 37
4.1.1 Crecimiento Celular .................................................................................... 37
4.1.2 Velocidad de crecimiento ............................................................................ 38
4.1.3 Pruebas de identificación bacteriana .......................................................... 39
4.1.4 Identificación de la microalga Chlorella ....................................................... 40
4.1.5 Conteo Celular ............................................................................................ 41
4.1.6 Chlorellin .................................................................................................... 41
4.1.7 Medición de Halos de inhibición.................................................................. 42
4.1.8 Análisis de varianza .................................................................................... 43
4.1.9 Control positivo ........................................................................................... 46
4.2 Verificación de Hipótesis.................................................................................... 46
4.2.1 Hipótesis nula (H0) ..................................................................................... 46
4.2.2 Hipótesis Alternativa (H1) ............................................................................ 46
4.3 Discusión general del trabajo de investigación .................................................. 46
CAPITULO V ................................................................................................................... 48
x
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................... 48
5.1 Conclusiones ..................................................................................................... 48
5.2 Recomendaciones ............................................................................................. 48
CAPITULO VI .................................................................................................................. 50
PROPUESTA .................................................................................................................. 50
6.1 Datos Informativos ............................................................................................. 50
6.1.1 Título: ......................................................................................................... 50
6.1.2 Unidad Ejecutora: ....................................................................................... 50
6.1.3 Beneficiarios: .............................................................................................. 50
6.1.4 Ubicación .................................................................................................... 50
6.1.5 Director del Proyecto: ................................................................................. 50
6.1.6 Personal Operativo: .................................................................................... 50
6.2 Antecedentes de la Propuesta ........................................................................... 50
6.3 Justificación ....................................................................................................... 52
6.4 Objetivos ........................................................................................................... 52
6.4.1 Objetivo General. ........................................................................................ 52
6.4.2 Objetivos Específicos. ................................................................................ 52
6.5 Análisis de factibilidad ....................................................................................... 52
6.6 Fundamentación. .................................................................................................... 53
6.7 Metodología. Modelo Operativo ......................................................................... 53
6.7.1 Recolección de muestras............................................................................ 53
6.7.2 Observación en microscopio de las muestras recogidas ............................ 53
6.7.3 Identificación de la microalga Chlorella. ...................................................... 53
6.7.4 Asilamiento de la microalga Chlorella ......................................................... 54
6.7.5 Crecimiento microalgal ............................................................................... 55
6.7.6 Velocidad de crecimiento ............................................................................ 56
6.7.7 Obtención de Chlorellin .............................................................................. 56
6.7.8 Aislamiento de bacterias mediante el método de difusión en placa ............ 57
6.7.9 Identificación bacteriana ............................................................................. 57
6.7.10 Aplicación de los discos .............................................................................. 58
6.7.11 Incubación .................................................................................................. 59
6.7.12 Medición de los halos de inhibición. ............................................................ 59
6.7.13 Control positivo ........................................................................................... 59
xi
6.8 Administración. .................................................................................................. 61
6.8.1 Recursos humanos ..................................................................................... 61
6.8.2 Recursos físicos ......................................................................................... 61
6.8.3 Recursos materiales ................................................................................... 61
6.9 Previsión de la evaluación ................................................................................. 62
4.4 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 63
ANEXO ........................................................................................................................... 72
xii
INDICE DE TABLAS
ANEXO A. TABLAS
Tabla A1. Medio Basal de Bold
Tabla A2. Medio de cultivo Luria-Bertani para bacterias
Tabla A3. Medio Mueller-Hinton
Tabla A4. Estándares de interpretación de CIM para Staphylococcus spp.
Tabla A5. Valores de crecimiento celular de la muestra de Atocha
Tabla A6. Valores de crecimiento celular de la muestra de Tilulum
Tabla A7. Valores de crecimiento celular de la muestra del Socavón
Tabla A8. Valores de Ln de los promedios de concentración celular
Tabla A9. Resultados de inhibición antibacteriana
Tabla A10. Halos de inhibición promedio
xiii
ANEXO B. FOTOGRAFIAS
Fotografía 1: Microalga Chlorella observada microscópicamente
Fotografía 2. Sector Tilulum
Fotografía 3. Sector Atocha
Fotografía 4. Sector Socavón
Fotografía 5: Aislamiento
Fotografía 6: Resiembra
Fotografía 7: Agar sangre y Mac Conkey
Fotografía 8: Prueba catalasa
Fotografía 9: Prueba coagulasa
Fotografía 10. Prueba gram
Fotografía 11: Crecimiento 0-24 horas
Fotografía 12: Crecimiento celular 48-192 horas
Fotografía 13. Crecimiento celular 216-240 horas
Fotografía 14. Cultivo microalgal
Fotografía 15. Observación Chlorella (40x)
Fotografía 16. Chlorellin (Sobrenadante)
Fotografía 17. Chlorellin (Sedimento)
Fotografía 18. Molde para antibiograma
Fotografía 19. Alcohol Isopropílico- sedimento
Fotografía 20. Reverso
xiv
Fotografía 21. Etanol- Sedimento
Fotografía 22. Reverso
Fotografía 23. Agua- sobrenadante
Fotografía 24: Reverso
Fotografía 25.Alcohol Isopropílico- Sobrenadante
Fotografía 26. Reverso
Fotografía 27. Etanol- Sobrenadante
Fotografía 28. Reverso
Fotografía 29. Agua- sobrenadante
Fotografía 30: Reverso
Fotografía 31. Alcohol Isopropílico sedimento
Fotografía 32. Reverso
Fotografía 33. Etanol- Sedimento
Fotografía 34. Reverso
Fotografía 35. Agua- Sedimento
Fotografía 36. Reverso
Fotografía 37. Alcohol Isopropílico- Sobrenadante
Fotografía 38. Reverso
Fotografía 39. Etano- sobrenadante
Fotografía 40. Reverso
Fotografia 41. Agua- Sobrenadante
xv
Fotografía 42. Reverso
Fotografía 43. Alcohol Isopropílico- Sedimento
Fotografía 44. Reverso
Fotografía 45. Etanol- Sedimento
Fotografía 46. Reverso
Fotografía 47. Agua- Sedimento
Fotografía 48. Reverso
Fotografía 49. Alcohol Isopropílico-sobrenadante
Fotografía 50. Reverso
Fotografía 51. Etanol- sobrenadante
Fotografía 52. Reverso
Fotografía 53. Agua- Sobrenadante
Fotografía 54. Reverso
Fotografía 55: Antibiograma de bacteria gram-positiva en agar Mueller-Hinton
xvi
RESUMEN
Las microalgas son organismos unicelulares eucariotas fotosintéticos capaces de
transformar la energía luminosa en energía química; las condiciones óptimas de
crecimiento varían de una especie a otra, las investigaciones sobre el cultivo de
microalgas son de gran importancia dada su amplia aplicación biotecnológica y
comercial.
Chlorella es una microalga verde unicelular de agua dulce, de forma esférica mide
cerca de 2-10 micrones de diámetro, tiene alta concentración de clorofila, se
reproduce rápidamente y de forma asexual, necesita carbono agua luz y pequeñas
cantidades de minerales.
Se recolecto diferentes muestras de aguas empozadas de Atocha, Tilulum y el
Socavón de la ciudad de Ambato, los cultivos de la microalga Chlorella se aislaron
utilizando el medio Basal de Bold debido a la cantidad de nutrientes que posee, las
células tardaron 240 horas en alcanzar la fase exponencial para su posterior
análisis.
Se determinó el potencial antimicrobiano de la microalga en base a los resultados
positivos en los ensayos en los que se utilizó el precipitado que resulta de la
extracción del chlorellin con los solventes etanol y alcohol isopropílico.
El análisis estadístico determinó que el mejor tratamiento fue Tilulum- Alcohol
isopropílico al tener mayor el tamaño del halo de inhibición, cuya media fue de
28mm, ante la bacteria coco grampositiva, mientras que el menor tratamiento fue
Socavón-etanol con una media de 0,11mm.
En la última etapa de la investigación se realizó las pruebas de control positivo
mediante la técnica del antibiograma utilizando la bacteria aislada y antibióticos
como penicilina, demostrando que fue sensible con un halo de inhibición de 5mm
ante la ampicilina y 1mm ante oxacilina, valores que están dentro del rango de
sensibilidad de acuerdo a las tabla CIM (Concentración Mínima Inhibitoria).
xvii
SUMMARY
Microalgae are photosynthetic unicellular eukaryotic organisms capable of
transforming luminous energy into chemical energy , the optimal growth conditions
change from one species to another , research on the cultivation of microalgae are
of great importance because of its extensive biotechnology and commercial
application.
Chlorella is a green single-cell microalga of sweet water, spherical measuring
about 2-10 microns of diameter, has a high concentration of chlorophyll, it
reproduces quickly and asexually, carbon water needs light and trace minerals.
Different samples stagnant water of Atocha, Tilulum and Socavón of Ambato city
was collected, the cultures of Chlorella microalgae were isolated using the Basal
Bold medium because of the amount of nutrients, the cells took 240 hours to reach
exponential phase for analysis.
The antimicrobial potential of microalgae according to the positive results in the
tests in which the precipitate which results from the extraction solvent chlorellin
with ethanol and isopropyl alcohol was used was determined.
Statistical analysis determined that the best treatment was Tilulum-isopropyl
alcohol have increased the size of the zone of inhibition, which averaged was
28mm, with Gram-positive bacteria, while the lowest was Socavón-ethanol
treatment with a mean of 11mm .
In the last stage of the research tests positive control was performed by using the
technique of susceptibility bacteria Gram- positive and antibiotics such as penicillin,
showing that was sensitive to an inhibition of 5mm to 1mm to ampicillin and
oxacillin, values that are within the range of sensitivity according to the MIC table
(Minimum Inhibitory Concentration).
1
CAPITULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACION
1.1 Tema de investigación
“DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE LA MICROALGA
Chlorella EXTRAIDA DE LAS AGUAS EMPOZADAS DE LAS ACEQUIAS DE
ATOCHA, TILULUM Y EL SOCAVÓN DEL CANTÓN AMBATO"
1.2 Planteamiento del problema
1.2.1 Contextualización
Macro
El trabajo de investigación se centra en la determinación del potencial
biotecnológico de microalgas, ya que constituyen un grupo muy diverso
considerado como maquinarias fotosintéticas generadoras de pigmentos con una
adaptación ecofisiológica y plasticidad bioquímica única, que les permite la
bioconversión directa de la energía solar en compuesto químicos, bajo una
variedad de condiciones medioambientales y a una velocidad mayor que cualquier
otra fuente vegetal (Paniagua, 1994). Tiene gran importancia económica ya que a
diferencia de las plantas superiores, contienen relativamente pequeñas cantidades
de material estructural y muchos de los componentes celulares son de reconocido
valor económico (Travieso & Benítez, 1998).
Son fáciles de cultivar, su cultivo se lo puede realizar en grandes volúmenes de
agua como lagunas, crecen sin fuertes restricciones climáticas o estacionarias,
2
muestran tener mayor actividad fotosintética y capacidad de fijación de dióxido de
carbono (Ferrero, 2011).
Las microalgas tienen varias aplicaciones, destacando actualmente la producción
de aceites y combustibles, además de su uso como suplemento alimenticio
humano y animal, fuente de ácidos grasos, producción de energía eléctrica, uso
como abono y fertilizante agrícola; se han observado también con extractos de
microalgas, una gama de actividades farmacológicas sin embargo, los principios
activos son todavía desconocidos en la mayoría de los casos (Olmedo, 2008).
Las principales especie de microalgas que se cultiva comercialmente son del
género Chlorella Beijerinck (Chlorophyceae) y Arthrospira Stizenberger
(Cyanophyceae) en adición a los alimentos naturales, Dunaliella
salina Teodoresco (Chlorophyceae) para obtener el beta-caroteno
y Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae) para la obtención de
astaxantina, Spirulina platensis, la Cianofícea que es la más utilizada en
acuicultura, Chlorella vulgaris utilizada para mejorar la función del sistema
inmunológico, como también para desintoxicación de metales pesados del
cuerpo (Martínez, 2010).
El Centro de Investigación de Cepsa (Compañía Española de Petróleos) y la
Cátedra Cepsa trabajan, desde 2010, en un proyecto de investigación destinado a
evaluar la viabilidad del uso de microalgas en la obtención de ácidos grasos útiles
para la producción de biodiesel (Pérez, 2012). En la Universidad de Córdova se
obtuvo harina a partir del cultivo de Chlorella vulgaris con su correspondiente
análisis proteico (Andrade, et. al., 2006).
Meso
En América Latina en países como Argentina, en la región de Chubut, hay un
cultivo en campo abierto que produce 10 toneladas diarias de biodiesel. El cultivo
consiste en varios estanques con forma de hipódromo, de 30 centímetros de
3
profundidad, se puede observar microalgas que absorben el CO2 del ambiente
para la producción del aceite (Botero, 2007).
En Brasil se estudió Bioprocesos para la eliminación de dióxido de carbono y
óxidos de nitrógeno con microalgas (Vieira & Greque, 2008). En Colombia uno de
los estudios de microalgas se realizó en lagos y ríos ubicados en la frontera
Colombo-Brasilera en ecosistemas de los ríos Amazonas y Putumayo obteniendo
alrededor de 206 taxones de 5 clases taxonómicas (Duque & Núñez, 2000). En
Venezuela se investigó el Crecimiento y producción de pigmentos de la microalga
nativa Chlorella sp. aislada de la Represa de Tulé (Mora et. al., 2005).
Micro
Existe documentación que demuestra investigaciones realizadas en el Ecuador
como la Evaluación del rendimiento de producción de aceite en cuatro microalgas
nativas de las Provincias ecuatorianas de Orellana, Esmeraldas, Imbabura y
Pichincha (Koch & Portilla, 2010), la obtención de un biofertilizante a partir del
residuo ultra fino de Spirulina platensis, mediante degradación anaerobia en fase
hidrolítica (Albuja et. al., 2011), compuestos con actividad antibacterial producidos
por las microalgas Nannochloropsis oculata y Porphyridium cruentum (Álvarez,
2007).
4
1.2.2 Análisis Crítico
Diagrama Causa-Efecto
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
Desconocimiento del potencial antimicroabiano de la microalga
Chlorella aislada de las aguas empozadas de las acequias de
Atocha, Tilulum y el Socavón del cantón Ambato.
Retraso en el avance
científico en el sector.
Limitada oferta de
productos
antibacteriales a base
de la microalga
Chlorella
Personal no
capacitado para la
extracción de
bioantimicrobianos.
Poca disponibilidad
de infraestructura y
recursos para
investigaciones.
Desarrollo
bioindustrial limitado
en el sector.
Insuficiente
investigación y
limitada innovación
en base a la
microalga Chorella
autóctona de la zona.
EFECTOS
PROBLEMA
CAUSAS
5
Se han realizado varias investigaciones con microalgas, sin embargo muy poco se
sabe de las propiedades de Chlorella, sobre todo de su potencial antimicrobiano
debido a la escasa información acerca de su metabolismo y de sus compuestos
bioactivos.
Insuficiente investigación y limitada innovación en base a la microalga Chlorella
autóctona de la zona limitando el desarrollo bioindustrial en el sector. Por la poca
disponibilidad de infraestructura y recursos para investigaciones con microalgas
hay retraso en el avance científico en el sector. Debido al escaso personal
capacitado para la extracción de bioantimicrobianos, existe limitada oferta de
productos antibacteriales a base de la microalga Chlorella.
En la investigación se trató de determinar el potencial antimicrobiano de la
microalga Chlorella extraída de las aguas empozadas de Atocha, Tilulum y el
Socavón del cantón Ambato, para lo cual se ensayó la actividad antimicrobiana
mediante el método del disco en solución de Chlorella, y se comparó su actividad
con alcoholes comunes.
1.2.3 Prognosis
Al no profundizar estudios en organismos marinos, se está limitando la búsqueda
de compuestos bioactivos como en las microalgas, la poca investigación de los
beneficios de Chlorella no permite avanzar en el conocimiento de su aplicabilidad.
Al desconocer sus beneficios antibacteriales no se podrá elaborar productos con
actividad antibacteriana.
1.2.4 Formulación del problema
¿La microalga Chlorella extraída de las aguas empozadas de las acequias de
Atocha, Tilulum y el Socavón del cantón Ambato posee potencial antibacteriano?
1.2.5 Preguntas Directrices
¿Cuál es el medio adecuado de crecimiento de Chlorella en el cantón Ambato?
6
¿Cómo se da el crecimiento Chlorella extraída de ambientes naturales en el
laboratorio?
¿La microalga Chlorella posee potencial antimicrobiano?
¿Chlorella tiene actividad antimicrobiana similar a los alcoholes empleados como
antibacteriales?
1.2.6 Delimitación
Delimitación Científica
Campo: Biotecnología.
Área: Microbiología
Sub- área: Evaluación del potencial antimicrobiano de Chlorella
Delimitación temporal
La investigación se efectuó entre los meses de mayo 2013– enero 2014
Delimitación Espacial- Geográfica
El proyecto de investigación se realizó en los laboratorios de la facultad de Ciencia
e Ingeniería en Alimentos, Carrera de Ingeniería Bioquímica en la Universidad
Técnica de Ambato, las muestras de la microalga en estudio se recogió de tres
diferentes sectores de la ciudad de Ambato: El Socavón, Tilulum, y Atocha.
1.3 Justificación
Chlorella es considerada una fuente potencial de compuestos con actividades
biológicas importantes que no han sido explotados ampliamente, los cuales tienen
un gran campo de aplicación en lo alimenticio, energético, agrícola y ambiental.
A pesar de ser capaces de crecer en un amplio rango de condiciones por la que se
les encuentra en cualquier lugar, se conoce muy poco de los beneficios de las
7
propiedades de las microalgas, destacando el desconocimiento de la actividad
antimicrobiana de Chlorella, en la investigación se pretendió evaluar su potencial
antibacterial a partir de la extracción, aislamiento, purificación e identificación de
Chlorella.
La investigación es factible ya que las muestras se tomó de lugares públicos
donde existió agua estancada que presentaron coloración verde lo que confirmó la
presencia de microalgas, el aislamiento y análisis correspondiente se realizó en
los laboratorios de la facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos, lo que facilitó
la adquisición de materiales, equipos y reactivos necesarios para la realización del
proyecto.
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo general:
Determinar el potencial antimicrobiano de la microalga Chlorella extraída de
las aguas empozadas de las acequias de Atocha, Tilulum y el Socavón del
cantón Ambato.
1.4.2 Objetivos específicos:
Establecer lugares de crecimiento de la microalga Chlorella en el sector
Ambato para su posterior extracción y aislamiento.
Construir la curva de crecimiento de Chlorella extraída del sector.
Determinar el potencial antimicrobiano de las moléculas extraídas de
Chlorella.
Determinar el potencial antimicrobiano de la microalga Chlorella ante
bacterias grampositivas.
8
CAPITULO II
MARCO TEORICO
2.1 Antecedentes investigativos
Revisado los archivos de trabajo que existen en la Universidad Técnica de
Ambato, principalmente en la facultad de Ingeniería en Alimentos no se
encontraron información concerniente al tema del trabajo de investigación, por lo
que la investigación tomará en condición artículos técnicos.
A lo largo de la historia se han realizado varios estudios con microalgas, las
primeras fueron realizadas en 1830 por el científico francés Dunal quien constató
la existencia de las microalgas; en 1890 el microbiólogo Beijerinck obtuvo por
primera vez cultivos puros con Chlorella vulgaris; Warburg trabajó en la obtención
de cultivos con alta densidad celular, seguido por Teodoresco que describió a lo
que actualmente se conoce como Dunaliella salina (Gómez L., 1997), a partir de
entonces, se han realizado un sinnúmero de investigaciones descubriendo nuevos
campos de aplicabilidad como en la industria farmacéutica, cosmética, acuicultura,
en el tratamiento de aguas residuales (Albarracín, 2007).
Dentro del campo de la investigación en microalgas es importante el aporte de
Pratt y Colaboradores (1945) al obtener una sustancia antibiótica contra bacterias
grampositivas y gramnegativas extraídas a partir de cultivos de Chlorella en
soluciones de nutrientes inorgánicos llamada Chlorellin.
Ghasemi y colaboradores (2007) estudiaron sesenta cepas de microalgas de las
cuales 21 demostraron actividad antibacteriana contra al menos una bacteria
grampositiva o gramnegativa, 9 cepas fueron especies de Chlorella; el principio
activo de las microalgas fue extraído con metanol y hexano: las especies de
Chlorella en extractos metanólicos presentaron mayores halos de inhibición contra
la bacteria Staphylococccus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa al
igual en el estudio de Kellam & Walker (2007), utilizaron 132 especies de
microalgas evaluando su actividad antibacteriana in vitro.
9
El solvente hexano produjo las zonas más grandes de inhibición tanto para la
bacteria Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis, Chlorella stigmatophora
presento halos de inhibición para las dos bacterias mientras que Chlorella sp. solo
presentó inhibición para Staphylococcus aureus, este estudio demostró que las
distintas especies de Chlorella en extractos metanólicos presentaron mayores
halos de inhibición contra la bacteria Staphylococcus aureus en comparación con
la microalga Nostocmuscorum, que no presentó inhibición contra dicha bacteria,
para la bacteria Staphylococcus epidermidis las cepas de Chroococcus dispersus
tuvieron mayores halos de inhibición seguido por una de las cepas de Chlorella
vulgaris; mientras que para la bacteria Escherichia coli las especies de Chlorella
tuvieron menores zonas de inhibición, para la bacteria Pseudomonas aeruginosa
Chlorella vulgaris no inhibió su crecimiento mientras que Chroococcus dispersus
tuvo mayores halos, y para Salmonella typhi las especies de Chlorella tuvieron
menos zonas de inhibición comparados con las otras microalgas destacando
Chlorella sp. quien tuvo mayor halo entre ellas (Kellam & Walker, 2007).
2.2 Fundamentación Filosófica
El paradigma positivista también denominado paradigma cuantitativo, empírico-
analítico, o racionalista, tiene como fundamento filosófico el positivismo; es
utilizado para estudiar los fenómenos en el campo de las ciencias naturales,
regido por leyes, las cuales permiten explicar, predecir y controlar los fenómenos
del mundo natural.
El paradigma positivista conduce a la formulación de hipótesis desde la lógica
formal en las cuales se interrelacionan variables, cuya medición cuantitativa,
permite aceptarlas o rechazarlas en el proceso de investigación; este paradigma
tiene como escenario de investigación el laboratorio a través de un diseño
preestructurado y esquematizado.
10
La presente investigación se basará en este paradigma porque se plantean
hipótesis acerca del potencial antimicrobiano que tiene la microalga Chlorella para
luego ser comprobado; todo fundamentado en el conocimiento cuantitativo.
2.3 Fundamentación Legal
Esta investigación se basa en el artículo 400 del capítulo segundo: Biodiversidad y
recursos naturales, sección segunda: Biodiversidad, del Régimen del Buen Vivir
de la Constitución del Ecuador, el cual se refiere a la soberanía que ejerce el
estado sobre la biodiversidad.
Declara de interés público la conservación de la biodiversidad y todos sus
componentes, en particular la biodiversidad agrícola y silvestre y el patrimonio
genético del país.
2.4 Categorías fundamentales
11
.
VARIABLE
DEPENDIENTE
VARIABLE
INDEPENDIENTE
Aislamiento y Purificación
Biocaracterísticas
Condiciones
óptimas de
crecimiento
Microalga
Chlorella sp
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
Actividad antimicrobiana
Bactericida
Potencial
Antimicrobiano
Compuestos
Bioactivos
12
2.4.1 Microalgas
Las microalgas son un conjunto heterogéneo de microorganismos fotosintéticos
unicelulares procariotas (cianobacterias) y eucariotas que utilizan la luz como
fuente de energía para fijar el dióxido de carbono; contienen clorofila y pigmentos
carotenoides siendo una parte importante en la producción primaria de la cadena
alimenticia acuática (Silva et. al., 2006).
Su tamaño varía del micrón a la centena de micrones, se encuentran en
abundancia en los medios acuáticos (océanos, ríos, lagos), crecen también en
hábitats diversos tales como aguas marinas, dulces, salobres, residuales o en el
suelo, bajo un amplio rango de temperaturas, pH y disponibilidad de nutrientes
(Monthieu, 2010).
La biodiversidad de las microalgas es sumamente amplia, se han identificado
alrededor de 40,000 especies aunque se estima que existen más de 100,000 de
las cuales se desconoce su composición bioquímica y metabolismo (Hernández,
et. al., 2009).
2.4.2 Importancia de las microalgas
Son organismos que contienen pequeñas cantidades de material estructural y
muchos de sus componentes celulares actualmente son de reconocido valor
económico (Quintero, 1981).
Según Travieso & Benítez (1998) las microalgas poseen un gran potencial como
fuente de productos químicos como vitaminas, minerales, carbohidratos, lípidos y
proteínas, por lo que son utilizadas en las industrias cosmética, textil, como fuente
directa de alimentos, medicamentos, forraje, fertilizantes y combustibles.
Las microalgas pueden ser cultivadas todo el año, y cosechadas continuamente,
siendo importantes también en la acuicultura como alimento para larvas, en la
biotecnología y biomedicina como complemento alimenticio para humanos (Silva,
et. al., 2006), en biorremediación, biocombustibles y biofertilizantes empleando
13
microalgas como abonos y acondicionadores de suelos controlando la erosión
(Bejarano, 2010).
2.4.3 Sistemas de cultivos
Para el cultivo de microalgas se han diseñado y empleado distintos sistemas de
cultivos como:
Sistema continuo: Su funcionamiento consiste en la entrada y salida de un
flujo de materia de forma continua durante todo el periodo de operación.
Cultivo discontinuo (feed-batch): consiste en adicionar los reactivos de una
vez en el interior del reactor, esperar el tiempo necesario para que se dé la
reacción y vaciar el contenido, durante el tiempo de operación no entra ni sale
ningún flujo de materia del reactor.
Sistema semicontinuo: consiste en introducir un reactivo de forma
discontinua (todo de una vez), y añadir el segundo reactivo de forma continua
durante el periodo de reacción, la masa total de la mezcla de reacción no se
mantiene constante (Grau, 1999).
Los fotobioreactores son idóneos para producir una gran cantidad de biomasa
algal, permiten el cultivo de una única especie de microalga durante un tiempo
prolongado (Gómez F., 2009)
2.4.4 Aspectos del crecimiento de microalgas
En el medio natural, así como en cultivos, el crecimiento de una población de
microalgas es el resultado de la interacción entre factores biológicos, físicos y
químicos (Martínez, 2010).
14
- Requerimientos Físicos
De manera general las microalgas requieren de ciertos factores específicos, como
los que se detallan en la tabla 1 y 2.
Tabla 1. Requerimientos físicos de los Cultivos de Microalgas
Parámetros Requerimientos Valores
Físicos
LUZ 2,000 – 4,000 lux
TEMPERATURA 15 – 22°C
SALINIDAD 0.37‰
Fuente: Acuña, 2011
Para el cultivo de microalgas se prefiere una fuente de luz artificial en lugar de la
exposición directa a la luz solar, porque la radiación ultra violeta puede ser nociva
para las células, además se debe tomar en cuenta la temperatura ya que la
mayoría de las especies de microalgas crece entre 10 y 35°C con un óptimo entre
16 y 24 °C, al inyectar aire a los cultivos se logra una difusión efectiva de los
nutrientes y un aporte parcial de CO2 además que ayuda a estabilizar el pH
(Acuña, 2011).
- Requerimientos Químicos
Tabla 2. Requerimientos químicos de los Cultivos de Microalgas
Parámetro Requerimientos Compuestos Químicos
Químicos
C CO2, CO3
O, H O2, H2O
N N2 NH4+ NO3
-
P PO4
S SO4
Na, K, Ca, Mg Sales
Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales
Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Al Sales
Fuente: Acuña, 2011
15
2.4.5 Clasificación
Se han estudiado los detalles morfológicos de microalgas con el uso del
microscopio electrónico, lo que ha permitido observar la fina estructura de la célula
a escala y sus constituyentes (Viramontes, 1991).
Tabla 3. Clasificación de microalgas
División Características Clase Características
Chlorophyta Reserva de carbono
almidón.
Chlorophyceae Tiene clorofila a y b
Cyanophyta Tienen clorofila a,
pigmentos accesorios.
Cyanophyceae Sus pigmentos
tienen clorofila a.
Rhodophyta Tienen clorofila a y d,
beta carotenos.
Rhodophyceae Contienen clorofila
a y d.
Charophyta Tienen clorofila a y b,
xantofilas y caroteno.
Charophyceae Tienen clorofila a y
b
Chromophyta
Posee clorofila a y c y
beta caroteno, xantofilas,
peridinina.
Euglenophyceae
(euglenoides)
Tiene clorofila a y b
Dinophyceae(dinoflagelados) Tiene clorofila a, y
c.
Cryptophyceae (Criptofitas) Tienen clorofila a, y
c.
Crysophyceae (alga dorada) Tiene clorofila a, c1
y c2
Prymnesiophyceae Tiene clorofila a, c1
y c2,
Rhaphidophyceae
(cloromonadas)
Los cloroplastos
contienen clorofila
a.
Xantophyceae Sus cloroplastos
tienen clorofila a y
β-carotenos
Eustigmatophyceae Posees
carotenoides
fucoxantina
Phaeophyceae Tienen clorofila a
c1 y c2
Fuente: Viramontes, 1991
A pesar de las diferencias estructurales y morfológicas entre los representantes de
cada división, son similares fisiológicamente y tienen un metabolismo análogo al
de las plantas (Viramontes, 1991).
16
2.4.6 Chlorella
El nombre Chlorella proviene del griego Chloros, que significa verde, y del latín
ella, que significa cosa pequeña; fue descubierta y nombrada por el holandés
Martinus Willem Beijerincken 1890 (Ríos, 2010).
Chlorella es un alga verde de forma elipsoidal, la cual crece en forma de células
simples. Pertenece a la división Chlorophyta y a la clase de las Chlorophyceae. Se
ha cultivado de forma intensiva con fines de alimentación y obtención de
metabolitos, es una de las primeras formas de vida; ha estado en la tierra desde el
periodo pre-Cámbrico por más de 2,5 millones de años. Su característico color
verde esmeralda y el olor de hierba agradable se deben a su alto contenido de
clorofila. Chlorella tiene un tamaño de 2 - 8 µm que hace posible que se observe
sólo bajo un microscopio; una sola célula es 6/1000 mm de ancho (Infante et. al.,
2011).
La reproducción asexual se representa por medio de autosporas y forman grupos
irregulares o colonias, esta especie se encuentra en diferentes biotopos, incluidos
en simbiosis con ciliados, esponjas, hidras y otros organismos (Jiménez &
Jiménez, 2012)
2.4.7 Caracterización de la microalga Chlorella.
Los primeros parámetros para distinguir a las microalgas se basan en la
pigmentación, morfología, ausencia o presencia de flagelos, características de
flagelos (numero, longitud), presencia o ausencia de pelos, composición de la
pared celular y tipo de producto fotosintético (Albarracín, 2007).
Existen diferentes tipos de microalgas entre ellas las Cyanophyceae (cianoficias)
cuya característica principal es su ausencia de núcleo definido, no presenta
membrana nuclear discreta o nucléolos, carece de flagelos pero muchas de ellas
tiene movimiento suave por la producción de mucilago, tienen color azul-verde por
la presencia de ficocianina, las Chlorophyceae (Cloroficeas) no tiene flagelos, no
móviles , tienen color verde por la presencia de clorofila a y b, de forma redonda,
17
unicelular; las Chrysophyceae (crisofíceas) son células móviles, biflageladas uno
de los flagelos es parecido a un cabello y el otro es terso y visualmente más corto,
de color pardo dorado tienen uno o dos cloroplastos; las Haptophyceae
(haptoficeas), son similares a las crisofíceas tanto en pigmento como flagelos y
modo de nutrición; las Bacillariophyceae (bacilarioficeas), aquí están las
diatomeas, son de color pardo dorado, de forma alargada, tiene generalmente dos
cloroplastos o bien un solo cloroplasto grande y vacuolas pequeñas en los
extremos de la celula; las Phyrrophyceae (pirroficeas) conocidas como
dinoflagelados, unicelulares móviles por la presencia de dos flagelos, tienen
nucleo, citoplasma del endosimbiote contiene cloroplastos mitocondrias y
ribosomas; las Cryptophyceae (criptofíceas) son células móviles por la presencia
de dos flagelos, tienen clorofila a y c, y finalmente las Euglenophyceae
(euglenoficeas) son células unicelulares móviles, generalmente de forma cilíndrica
o fusiforme, tiene flagelos (Cañavate, 2008).
2.4.8 Clasificación biológica
REINO: Protoctista
DIVISIÓN: Chlorophyta
CLASE: Chlorophyceae
ORDEN: Chlorococcales
FAMILIA: Oocystaceae
GÉNERO: Chlorella
ESPECIES: C. fusca, C. fusca var. Rubencens, C. homosfhaera, C. kessleri, C.
luteorividis, C. minutissima, C. prototheicoides, C. saccarophila, C. vulgaris
C. vulgarisfortertia, C. zofngiensis (Becerra & Monzoy, 1992).
2.4.9 Condiciones óptimas de crecimiento
El crecimiento de la microalga Chlorella requiere luz, dióxido de carbono, agua y
sales inorgánicas. Con respecto a la temperatura, su valor está dentro del intervalo
que toleran un gran número de especies, entre 16 y 27°C, aunque esto puede
variar de acuerdo a la composición del medio de cultivo. Temperaturas por debajo
18
de 16°C pueden retardar el crecimiento, mientras que aquellas por encima de los
35°C son letales, debe permanecer generalmente dentro de 18 a 30 °C.
El medio del crecimiento debe proporcionar los elementos inorgánicos que
constituyen la célula algácea. Los elementos esenciales incluyen el nitrógeno, el
fósforo, y el hierro (Alvear et. al., 2011).
2.4.10 Aislamiento y Purificación
Medio de cultivo
Un cultivo puede ser definido como un ambiente artificial en el que las microalgas
crecen, para lo cual es necesario que las condiciones del cultivo deben semejarse
al ambiente natural de la microalga (Cervera, 2011)
Para la microalga Chlorella se recomienda el “Medio Basal de Bold (BBM)”cuya
fórmula se describe a continuación:
Tabla 4. Medio Basal de Bold
REACTIVO CONCENTRACION (mg/L)
Nitrato de sodio 250
Cloruro de Calcio dihidratado 25
Sulfato de Magnesio heptahidratado 75
Fosfato de potasio 75
Cloruro de sodio 25
Ácido sulfúrico 0.001(ml/L)
Ácido Bórico 11.42
EDTA 50
Sulfato de zinc Heptahidratado 8.82
Cloruro de manganeso dihidratado 14.4
Oxido de Molibdeno 0.71
Sulfato de cobre pentahidratado 1.57
Nitrato de cobre hexahidratado 0.49
Fuente: Ramírez et. al., 2008
19
2.4.11 Biocaracterísticas
Chlorella es una especie con una alta concentración de nutrientes, lo que le
permite mantener vida independiente, contiene alrededor de 18 aminoácidos,
incluidos todos los aminoácidos esenciales, lo que la convierte en una fuente de
proteína completa y de alta calidad, tiene una amplia gama de vitaminas
(incluyendo vitamina A, C, E) que favorecen el valor nutricional de su biomasa
(Quintana et. al., 1999) beta carotenos (B1, B2, B6, B12) poderoso antioxidante,
minerales (calcio, fósforo, magnesio, hierro, zinc, yodo), los nutrientes (tales como,
proteínas, hidratos de carbono); es rica en ácidos grasos no saturados (Healey,
2010).
También contiene la mayor concentración de clorofila (5 a 10 veces mayor que
cualquier otra microalga) y ácidos nucleicos (RNA y DNA), ácidos nucleicos
esenciales para la producción de energía, estructura y función celular (Quintana
et. al., 1999).
Las microalgas representan una fuente natural importante de principios activos de
gran valor en el desarrollo de nuevos productos y aplicaciones; además, pueden
ser usadas para la producción de componentes de alto valor añadido y como
biomasa propia para el inicio de procesos de bioproducción (Carvajal et. al., 2010).
Lípidos
Según Pérez y Fernández (2011), los lípidos son biomoléculas de gran interés
científico y biotecnológico por sus amplias aplicaciones; las microalgas constituyen
la materia prima para la síntesis de lípidos, particularmente Chlorella sp., que es
una de las microalgas más representativas por su elevado contenido de lípidos,
además, destacan que la producción de lípidos se encuentra influenciada por
varios factores físicos y químicos, esta modificación provoca una respuesta de
estrés que se manifiesta por variaciones en la composición de lípidos sintetizados,
que varía de una especie a otra.
Los lípidos de las microalgas son principalmente ésteres de glicerol formados por
ácidos grasos con cadenas constituidas de 14-20 átomos de carbono, pueden ser
20
saturados o insaturados como: ácido eicosapentaenoico, y ácido linoléico
(Albarracín, 2007).
Vitaminas
Los cultivos de Chlorella son utilizados como suplemento alimenticio sustituyendo
fuentes alimenticias comunes; su contenido vitamínico depende del genotipo,
estado del ciclo de crecimiento, estado nutricional, intensidad de la luz y otros
factores que pueden afectar el desarrollo y metabolismo de la microalga.
Chlorella tiene cantidades significativas de vitamina C, Vitamina B1( tiamina), B2
(Riboflavina), B3 (Niacina), B5 (Acidopantotenico), B6 (Piridoxina), B9 (Ácido
fólico) y B12 (Cianocobalamina), Vitaminas E, H (Biotina) (Quintana et. al., 1999).
Clorofila
Camacho y Colaboradores (1999) mencionan que Chlorella tiene la mayor
cantidad de clorofila en comparación con todas las algas verde y otras plantas, su
contenido de clorofila puede llegar tan alto como el 7% del total de sus de peso,
10 veces más que la Spirulina, y 10 veces más que la alfalfa.
Aminoácidos
Chlorella tiene una buena composición de aminoácidos, tiene 8 aminoácidos
esenciales, además contiene una gran cantidad de aminoácidos no esenciales,
por lo que puede compensar deficiencias en el cuerpo, siendo una proteína
completa (Quintana et. al., 1999).
Sales minerales
Los componentes minerales como el potasio, el calcio, el magnesio o aquellos
elementos como el hierro, el zinc y el selenio son indispensables para las
reacciones del metabolismo celular. Estos están presentes a su vez para reforzar
la formación de sustancias como los huesos, los dientes y uñas para favorecer
una formación de mejor calidad, resistentes. Chlorella además de contener dichos
21
minerales, es también una fuente de ácido lipoico, un factor de crecimiento
microbiano importante (Bertoldi et. al., 2006).
Fibra
Chlorella tiene un contenido alto en fibra, debido a su triple capa de celulosa en la
pared celular externa, también ayuda al sistema de defensa natural reforzando el
sistema inmunológico (Healey, 2010).
Ácidos nucleicos
La microalga Chlorella tiene el más alto contenido de ADN y ARN, los cuales
asisten al cuerpo humano en la reparación del material genético dañado de las
células haciendo más lento el proceso de envejecimiento, ayuda también a la
reparación de tejidos heridos como úlceras y heridas, y así promueve una rápida
recuperación de lesiones y enfermedades y la regeneración de la piel (Barajas et.
al., 2011).
2.4.12 Compuestos bioactivos
En los últimos años se ha incrementado el interés por la búsqueda de compuestos
bioactivos en organismos marinos, numerosas revisiones señalan a las microalgas
como uno de los principales productores de compuestos bioactivos, en algunos
casos con estructuras moleculares no encontradas en otros organismos con
posibles usos antibacterianos, anticancerígenos, cardiotónicos, antivirales,
antitumorales, antiinflamatorios y anticoagulantes, entre otros (Ríos, et. al. 2009)
2.4.13 Actividad antimicrobiana
La actividad antibacterial puede ser considerada como un indicador de la
capacidad de las microalgas para sintetizar compuestos bioactivos de interés
terapéutico, aunque esta actividad puede depender tanto de la especie como de la
extracción eficiente de los compuestos bioactivos.
Particularmente sobre la actividad antibacteriana y antifúngica se han desarrollado
en años recientes una importante cantidad de investigaciones con resultados que
22
reportan que los extractos crudos de algunas algas inhiben el crecimiento de
bacterias y hongos (Ríos, et. al. 2009).
2.4.14 Bactericida
La mayoría de las investigaciones realizadas con extractos crudos de microalgas
mencionan gran actividad contra bacterias Gram positivas. Entre ellas, el S.
aureus es considerada como una de las especies más susceptibles a los
exudados y extractos algales (Ríos, et. al. 2009).
2.4.15 Potencial antimicrobiano
Cada vez son más los compuestos capaces de inhibir el crecimiento microbiano
que se obtienen de fuentes naturales como plantas, algas y hongos. Estos
compuestos inactivan las cepas bacterianas por mecanismos diferentes a los
antibióticos actuales lo que favorece su empleo como tratamiento alternativo o
complementario.
El estudio de la antibiosis microalgal suele enmarcarse en cuatro perfiles
estrechamente relacionados: la búsqueda de especies con actividad
antimicrobiana, la separación, purificación y elucidación de la estructura química
de los compuestos responsables de la misma (Lara, et. al. 1999).
2.5 HIPOTESIS
La determinación del potencial antimicrobiano de Chlorella extraída de las aguas
empozadas de las acequias de Atocha, Tilulum y el Socavón permite conocer los
efectos antibacterianos en diferentes medios de elución.
2.5.1 Hipótesis Nula
La determinación del potencial antimicrobiano no se ve influenciada
significativamente del medio de elución y lugar de extracción.
23
2.5.2 Hipótesis Alternativa
La determinación del potencial antimicrobiano se ve influenciada
significativamente del medio de elución y lugar de extracción.
2.6 SEÑALAMIENTO DE VARIABLES
2.6.1 Variable Independiente
Microalga Chlorella
2.6.2 Variable Dependiente
Potencial antimicrobiano
24
CAPITULO III
LA METODOLOGIA
3.1 Enfoque
La investigación tuvo un enfoque cuantitativo, ya que para la comprobación de las
hipótesis establecidas previamente, se recogieron y analizarán datos, en base al
potencial antimicrobiano de Chlorella, utilizando un método estadístico que
permitió establecer el mejor tratamiento de estudio.
3.2 Modalidad básica de la investigación.
Se empleó la investigación de tipo documental-bibliográfica, ya que se estudió
conceptos y características de lo que son las microalgas, principalmente de
Chlorella, sus propiedades, aislamiento y beneficios, basándose en documentos
científicos, libros, revistas relacionados con este tema.
Investigación tipo experimental, ya que permitió manipular una o más variables
experimentales no comprobadas, en este caso los diferentes medios de elución y
los lugares de donde se recogieron las muestras a utilizar con el fin de determinar
si posee o no potencial antimicrobiano la microalga Chlorella.
3.3 Nivel o tipo de investigación
3.3.1 Exploratorio
La investigación empleada en el proyecto fue de tipo exploratorio porque se inició
el estudio de un fenómeno del cual se tiene mucha información, que debe ser
organizada para llegar a una debida comprensión del tema y del problema, en
este caso el estudio de Chlorella, sus beneficios y potenciales que pueden ser
aprovechados para la obtención de antibacteriales para bacterias comunes.
25
3.3.2 Descriptivo
El nivel de investigación fue descriptivo porque detalla las características más
importantes del tema de investigación, que permitió obtener datos confiables para
determinar las mejores condiciones de aislamiento de Chlorella para la obtención
de productos antibacterianos.
3.4 Población y muestra
Se tomaron muestras individuales de agua empozadas de distintos puntos en tres
lugares diferentes Atocha, Tilulum y el Socavón, con la ayuda de recipientes
estériles se recolectaron 100ml de agua, los cuales fueron almacenados a
temperatura ambiente en el laboratorio a trabajar.
3.5 Operacionalización de variables
26
ELABORADO POR: Adriana Barona, 2013
CONCEPTUALIZACION CATEGORIAS INDICADORES ITEM BASICO TECNICA E
INSTRUMENTOS
La determinación del
potencial
antimicrobiano de la
microalga Chlorella
extraída de las aguas
empozadas de las
acequias de Atocha,
Tilulum y el Socavón
permite conocer los
efectos
antibacterianos en
diferentes medios de
elución.
Potencial
antimicrobiano
Agua empozada
Medios de elución
Halos de
inhibición
Canal de agua
Agua estancada
Etanol
Alc. Isopropílico
Agua
Se determina el potencial
antimicrobiano mediante la
presencia de halos de inhibición
que limitan el crecimiento de la
bacteria
La microalga en estudio crece en
canales de agua, agua
estancada asegurando su
existencia por la coloración
verde que presenta el agua
Los diferentes medios de elución
como el etanol el alcohol
isopropìlico y el agua sirven para
la extracción de las moléculas
bioactivas de Chlorella.
Observación
Directa
Discos de
Inhibición
Observación
directa
Observación
Directa
TABLA 5: Variable dependiente: Potencial Antimicrobiano
27
ELABORADO POR: Adriana Barona, 2013
CONCEPTUALIZACION CATEGORIAS INDICADORES ITEM BASICO TECNICA E
INSTRUMENTOS
Chlorella es una
microalga verde de forma
elipsoidal, la cual crece
en forma de células
simples, pertenece a la
división Chlorophyta y a
la clase de las
Chlorophyceae.
Concentración de
Chlorella
Chlorophyta
Chlorophyceae
Morfología
Población celular
Clorofila a, b
Formas
unicelulares
morfología
ultraestructural
La microalga Chlorella se la
reconoce por su morfología
redonda y color verde mediante
el uso del hemocitómetro
La división Chlorophyta se las
distingue principalmente por ser
unicelulares o formar colonias
simples, todos los grupos de
esta división tienen clorofila a y b
La clase Chlorophyceae son
algas verdes que se distinguen
básicamente por su morfología
ultraestructural
Hemocitómetro
Microscopio
Microscopio
TABLA 6: Variable Independiente: Microalga Chlorella
28
3.6 Plan de Recolección de la Información
3.6.1 Recolección de muestras
Para la obtención de células de Chlorella se recogieron muestras de aguas
estancadas de distintos puntos en 3 lugares diferentes del cantón Ambato:
Atocha, Tilulum y El Socavón; 4 muestras en Atocha, 5 muestras en Tilulum y 4
muestras en el Socavón, (13 muestras) teniendo en cuenta su coloración verde
lo que indicó presencia de algas.
Se recogió 100 ml de agua estancada de cada uno de los puntos en recipientes
de plástico estériles, rotulando la fecha, y el lugar específico de donde fueron
recolectadas (Anexo B1).
Se conservó las muestras en las mismas botellas, para su posterior
observación, expuestas al ambiente sin taparlas.
3.6.2 Observación en microscopio de las muestras recogidas
Se colocó una gota de cada muestra en un portaobjetos y se observó en el
microscopio, identificando la presencia de numerosos microrganismos por lo
que se trató de reconocer células microalgas con el fin de seleccionar las
muestras útiles y descartar las muestras que no tuvieron la microalga.
3.6.3 Identificación de la microalga Chlorella.
Para la identificación de Chlorella se basó en su morfología esférica, cerca de
2-10 micrones de diámetro, por su ausencia de flagelos por lo que es inmóvil,
por su ausencia de pelos, por ser unicelular, y en su pigmentación, ya que al
contener altos niveles de clorofila a y b el medio en el que creció fue de color
verde; finalmente se comparó las células obtenidas con bibliografía con el fin
de corroborar que en las muestras analizadas crecía posiblemente la microalga
de interés.
En Atocha se identificó que 3 de las 4 muestras recolectadas tuvo células
microalgas, de Tilulum 3 de las 5 muestras y Socavón 2 de las 4 muestras, al
reconocer lo que posiblemente era Chlorella se las aisló varias veces con el fin
29
de obtener cultivos puros, en un medio nutriente para microalgas, en este caso
en medio Basal de Bold, proporcionando nutrientes necesarios para su
multiplicación (Armendáriz, 2011).
Las muestras se observaron diariamente eliminando aquellas que tenían
presencia de otros microorganismos, otras en las que no hubo crecimiento de
las células microalgas, otras en las que a más de crecimiento de lo que
posiblemente era Chlorella creció otro tipo de microalga de forma ovoide, o que
por su exposición a la luz solar había disminuido su volumen, al final se eligió
un cultivo puro por sector.
3.6.4 Asilamiento de la microalga Chlorella
Medio de cultivo líquido
Para la elaboración del medio se basó en la fórmula que se encuentra en la
tabla A1 reemplazando el micronutriente MnCl2 por NH4Cl, como adaptación
propia previo a pruebas realizadas demostrando ser útil en la masificación
microalgal.
Para su aislamiento se preparó 250ml de medio Basal de Bold con 30ml de las
muestras seleccionadas, se tomó este volumen de muestra para su pronta
identificación, se colocó en botellas previamente lavadas, con aireación cada
una de ellas y expuestas a la luz solar para ayudar a que las células se
adapten al medio, este procedimiento se repitió hasta obtener cultivos puros de
posiblemente Chlorella, basándose particularmente en su morfología redonda.
Cada botella contó con aireación continua debido a que las microalgas son
aeróbicas, evitando su sedimentación y permitiendo la homogenización de los
nutrientes mejorando significativamente la asimilación debido a que el
movimiento del agua disminuye la capa laminar alrededor de la microalga,
aumentando de esta forma la difusión de nutrientes (Gonzales, 2010).
3.6.5 Crecimiento microalgal
Se eligió un cultivo puro por sector los cuales se aislaron nuevamente en
recipientes plásticos de agua de 6 litros, los cuales fueron llenados con 2 litro
30
de medio de cultivo Basal de Bold y 240 ml de las muestras de los cultivos
puros, (se tomó como referencia el volumen utilizado en los anteriores
aislamientos, 30ml de muestra en 250ml de medio) se dejó reposar las
muestras por 7 días para su masificación microalgal.
Para el conteo celular se preparó 3 réplicas del cultivo puro de Atocha, 3
réplicas del cultivo de Tilulum y 3 réplicas del cultivo del Socavón, obteniendo 9
ensayos, utilizando recipientes plásticos de agua de 2 litros, los cuales fueron
llenados con 1 litro de medio de cultivo basal de bold y 10% de los cultivos
puros iniciales por litro.
Para el cálculo de concentración de la microalga se calculó por el método del
hemocitómetro, se aplicó la siguiente fórmula:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑐𝑒𝑙
𝑚𝑙) =
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝑚𝑙)
Se colocó una gota de cada muestra a observar en el hemocitómetro, se tapó
con un cubreobjetos evitando formar burbujas de aire que dificulten la
visualización.
Se utilizó esta fórmula porque se contó los cuatro cuadrado externos, el
volumen se calculó multiplicando la altura, ancho y longitud del hemocitómetro
(0,1cm*0,1cm*0,01cm).
Se realizó conteos diarios para la obtención de la curva de crecimiento con el
número de células de Chlorella que se determinaron en cada uno de los 9
ensayos (X) en el transcurso de los días (Y), se elaboró una gráfica de ln
Densidad celular vs. Tiempo, que correspondió a la curva de crecimiento en
escala logarítmica de la microalga.
Los datos obtenidos del conteo por 10 días de cada una de las réplicas se
reportan en las tablas 5, 6, y 7.
Al determinar que las réplicas de Tilulum tuvieron una población inicial mayor
se colocaron en un lugar con poca iluminación y sin aireación continua,
mientras que las réplicas de Atocha y el Socavón al tener una población inicial
y crecimiento parecido mantuvieron durante las 240 horas condiciones óptimas
31
de crecimiento, controlando de esta manera que la población final de cada
ensayo no tuvieran diferencias significativas.
3.6.6 Velocidad de crecimiento
La velocidad de crecimiento se calculó en base a la fórmula:
𝜇 =[ln(𝑁𝑡) − ln (𝑁0)]
𝑙𝑛2(𝑡 − 𝑡0)
Dónde:
t: tiempo transcurrido entre el inicio y fin de la prueba,
t0: tiempo inicial,
N0: densidad celular inicial,
Nt: densidad celular final.
El tiempo de generación se calculó con la fórmula:
𝑇𝑑 =𝐿𝑛2
𝜇
3.6.7 Obtención de Chlorellin
Cuando las células de los 9 ensayos se encontraron en estado exponencial,
tomando en cuenta que el crecimiento celular no vario significativamente por 3
días, se recogieron 10 ml de cada muestra en tubos de ensayo, los cuales se
centrifugaron a 5000 rpm durante 20 minutos.
Se utilizó los cultivos en fase exponencial ya que después de este período no
es aconsejable desde el punto de vista tecnológico ni económico (Barajas et.
al., 2011).
Para saber en qué parte existió potencial antimicrobiano se trabajó con el
sobrenadante acuoso y el sedimento de la microalga resultante, luego de la
centrifugación, colocándolos en tubos de ensayo con tapa rosca.
Este procedimiento se repitió 3 veces para obtener por cada ensayo 3 tubos de
sedimento y tres tubos de sobrenadante, posteriormente se colocó en cada uno
solventes distintos; 5 ml de etanol, 5 ml de Alcohol isopropílico y 5ml de agua,
32
se agitaron durante 20 minutos, resultando al final 54 tratamientos; se utilizó los
dos alcoholes por ser de mayor uso como desinfectantes, el etanol
desnaturaliza las proteínas y disuelve los lípidos destruyendo eficazmente
muchos tipos de células bacterianas y virales, y alcohol isopropílico por ser en
función y estructura similar al etanol, destruye las células bacterianas y virales
por el mismo mecanismo por lo que puede ser utilizado como sustituto para el
etanol (Arévalo et. al., 2010).
Los tubos previamente tapados se colocaron en refrigeración para su
almacenamiento, evitando contaminación.
3.6.8 Aislamiento de bacterias mediante el método de difusión en placa
Para comprobar el potencial antimicrobiano de Chlorella se aisló bacterias que
se encuentran en la palma de la mano, para lo cual se limpió y esterilizó el área
de trabajo, se prendió el mechero para evitar la rápida contaminación del lugar
donde se preparó las muestras, se sumergió el hisopo en agua salina estéril, y
se pasó por la mano, se hizo estrías simples con la cabeza del hisopo en el
medio ya preparado, detallado en la tabla A2, sin retirar completamente la tapa
del medio de cultivo para evitar que se contaminen. Se incubó a 37°C por
alrededor de 24-48 horas, se obtuvo dos tipos de bacterias con coloración
amarilla y naranja.
3.6.9 Identificación la bacteria gram-positiva
Para identificar el tipo de bacteria se realizó pruebas primarias y secundarias;
una vez obtenida una cepa pura de cada una de ellas se resembro en agar
sangre (Gram positivas) y en agar Mac Conkey (gram negativas), a las 24
horas se realizó la prueba de catalasa para lo cual se tomó una muestra de la
cepa en un palillo estéril se colocó en un porta objetos con una gota de H2O2;
seguido se hizo la prueba de tinción gram colocando una muestra de la
bacteria en un portaobjetos haciendo el extendido de la muestra, se dejó secar
a temperatura ambiente, fijándola con metanol durante 1 minuto, se agregó
unas gotas de cristal violeta por 1 minuto, se enjuago con agua, luego se
colocó acetona y se esperó 30 segundos, y se enjuago con agua, finalmente se
agregó gotas de safranina por 1 minuto, una vez lista la muestra se observó en
33
el microscopio óptico en el lente de 40x; al observar crecimiento en agar sangre
(medio común para Staphylococcus sp.) se hizo una prueba secundaria, la
prueba de la coagulasa que permite determinar la capacidad de coagular el
plasma por la acción de la enzima coagulasa, se colocó unas gotas de plasma
en la muestra (Gonzales, et al., 2009).
Las bacterias fueron almacenadas en refrigeración para posteriormente ser
aisladas nuevamente.
3.6.10 Aplicación de los discos
Una vez identificado la bacteria gram-positiva con la que se trabajó, se aisló en
54 cajas Petri mediante estrías compuestas, las estrías se realizaron en la
cámara de flujo laminar, desinfectando previamente para evitar contaminación
en las cajas.
Se colocaron 5 discos de papel filtro estéril, 4 en los extremos y uno en el
centro, con 300µl de cada una de las 54 soluciones de ensayos, ya que por
pruebas previas se demostró que con cantidades menores la inhibición
bacteriana es mínima dificultando su identificación, secándolos bajo un flujo de
aire laminar, no por más de 15 segundos, los discos se tomaron con pinza
estéril y se colocaron en el medio en un tiempo menor a 15 minutos después
de haber inoculado la placa, los discos se presionaron ligeramente para
asegurar un contacto con la superficie evitando ser removidos una vez que
tomaron contacto con la superficie del agar, para prevenir una sobreposición de
las zonas de inhibición; se distribuyó adecuadamente los discos con un límite
no menor de 15 mm de los bordes de la placa y una distancia de alrededor de
30 mm entre discos, para lo cual se diseñó un molde con dichas medidas para
evitar errores en la colocación de los discos (Anexo B5).
3.6.11 Incubación
Luego de 15 minutos de haber colocado los discos se invirtieron las cajas Petri
incubándolas a 37 ° C durante un período de 24 horas.
34
3.6.12 Medición de los halos de inhibición.
Para la medición de los halos de inhibición se midió con una regla por el fondo
de la caja iluminándola con luz sobre un fondo negro para facilitar la medición.
Se calculó el halo promedio por caja, ya que se colocó 5 discos.
3.6.13 Control positivo
Los antibiogramas son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de
los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, el diámetro
del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías
de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a tablas de los
parámetros establecidos de concentración mínima inhibitoria (CMI) (Faría et.
al., 1999)
A las colonias aisladas de la bacteria gram-positiva se les realizo antibiograma
en cajas Petri con agar Mueller-Hinton (específico para bacterias) (Tabla A3),
para determinar la sensibilidad o resistencia se ajustó el inoculo al patrón de
turbidez MacFarlan N°0.5 para luego sembrar en las cajas con un hisopo
estéril, se utilizó sensidiscos de antibióticos como ampicilina 10 µg, oxacilina
10 µg por tener un espectro predominando grampositivo incluyendo
Staphylococcus spp. productor de penicilinasas, los halos de inhibición se mido
a las 24 horas de incubación.
3.7 Plan de procesamiento de la información
3.7.1 Factores o niveles en estudio
a. Tratamientos
Se estudiaron 9 tratamientos (tabla 7) producto de la combinación de los dos
factores en estudio, los lugares de recolección de las muestras y medios de
elución (Tabla 8).
35
Tabla 7. Factores de estudio
FACTORES NIVELES
A
SECTORES DE
RECOLECCION DE
MUESTRA DE Chlorella
a0: Atocha
a1: Tilulum
a2: Socavón
B
MEDIO DE ELUCION
b0: Etanol
b1: Alcohol Isopropílico
b2: Agua
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
Tabla 8. Tratamientos de estudio
TRATAMIENTOS FACTORES DE ESTUDIO
Factor A Factor B
N° CODIFICACIÓN SECTORES DE
RECOLECCION
MEDIO DE ELUCIÓN
1 a0b0 Atocha Etanol
2 a1b0 Tilulum Etanol
3 a2b0 Socavón Etanol
4 a0b1 Atocha A. Isopropílico
5 a1b1 Tilulum A. Isopropílico
6 a2b1 Socavón A. Isopropílico
7 a0b2 Atocha Agua
8 a1b2 Tilulum Agua
9 a2b2 Socavón Agua
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
36
b. Diseño Experimental
Se aplicó el diseño experimental AxB, es decir dos factores con tres niveles
cada uno con dos replicas, además se realizó un análisis de varianza para los
halos de inhibición medidos en los ensayos. El esquema de varianza se
muestra en la tabla 9.
Tabla 9. Esquema de análisis de varianza
Fuente de variación Grados de libertad
Factor A (a-1)
Factor B (b-1)
AB (a-1) (b-1)
Error ab x (r-1)
Total (r x t) -1
Elaborado por: Adriana Barona
Las respuestas experimentales que se evaluaron en la parte operativa de la
investigación fueron la caracterización por su forma de la microalga Chlorella,
la concentración microalgal, curva de crecimiento de cada uno de los ensayos
mediante conteo celular, obtención de molécula bioactiva, identificación del
potencial antimicrobiano de Chlorella ante determinada bacteria aerobia,
medición de los halos de inhibición y comparación con testigos positivos como
la ampicilina.
37
CAPÍTULO IV
ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS
4.1 Análisis de los resultados
4.1.1 Crecimiento Celular
Gráfico 1: Curva de crecimiento
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
Se realizó el conteo celular diario por 240 horas (Tablas A5, A6, A7) con una
cámara de Neubauer en las tres muestras se observó una proporción directa,
mostrando una curva típica de crecimiento. El conteo se realizó hasta que los
cultivos alcanzaron la fase exponencial, los datos permitieron graficar la curva
de crecimiento poblacional correspondiente para cada uno de los tratamientos
tomando en cuenta el estudio realizado por Gonzales, (2010) donde determinó
las curvas de crecimiento de Chlorella vulgaris y Scenedesmus acutus para
identificar el momento en el cual las células se encontraban en fase
exponencial y de esta forma se estableció la duración de los experimentos en
diez días, las dos especies alcanzaron la fase estacionaria después de este
y = 0,009x + 13,508R² = 0,913
y = 0,0063x + 14,154R² = 0,9749
y = 0,0106x + 13,117R² = 0,8896
12
12,5
13
13,5
14
14,5
15
15,5
16
0 50 100 150 200 250 300
Ln d
en
sid
ad c
elu
lar
Tiempo (Horas)
Crecimiento Celular
Muestra A
Muestra B
Muestra C
Muestra A
Muestra B
Muestra C
38
tiempo, igual los resultados obtenidos por Wang et. al. (2010), quienes
cultivaron esta microalga en aguas residuales durante un periodo de nueve
días.
4.1.2 Velocidad de crecimiento
En la tabla 10 se muestran los valores de µ y Td de cada muestra para lo cual
se utilizó los promedios tanto de densidad celular inicial, como de densidad
final, calculando el logaritmo natural de cada uno.
Tabla 10. Velocidad de crecimiento y tiempo de generación
Muestras Velocidad de
crecimiento (d-1)
Tiempo de generación
(días)
Atocha 0,349 1.986
Tilulum 0,24 2,88
Socavón 0,42 1,65
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
El cultivo de la muestra del Socavón presento una mejor cinética de
crecimiento comparando con las otras muestras, mostrando una velocidad de
crecimiento de 0,42 d-1 y tiempo de duplicación de 1.65 días, seguido por la
muestra recolectada de Atocha con velocidad de crecimiento de 0,349 d-1 y
tiempo de 1.986 días y finalmente la de Tilulum con µ=0,24 d-1 y t=2.88 días;
con respecto a otros trabajos relaciones con el cultivo de Chlorella sp. se
observa que tanto la velocidad de crecimiento como el tiempo de duplicación
estuvieron dentro del rango de los valores obtenidos por Cervera (2011), cuyos
resultados fueron velocidad de crecimiento de 0,296d-1 y tiempo de generación
de 2,34 días, y el de Greque y Viera (2007), con 𝜇 = 0,31d-1 y Tg=2.27 días al
cultivar Chlorella vulgaris en un fotobiorreactor de 4 litros de capacidad.
Con estos datos se observó que la muestra de Tilulum tuvo mayor tiempo de
duplicación, y por ende, menor velocidad de crecimiento debido a las
condiciones de crecimiento a las que se expuso los ensayos, los cuales fueron
diferentes a los que se expuso las réplicas de Atocha y del Socavón con el fin
39
de alcanzar una población final similar en cada una de las réplicas de las 3
muestras.
Se observa la correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (µ) y
el tiempo de generación (tg), el incremento del logaritmo del número de células
aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ.
4.1.3 Pruebas de identificación bacteriana
Al realizar las pruebas para la identificación bacteriana a las 24 horas del
resembrado en agar sangre se observó crecimiento de colonias blanquecinas
de forma circular y superficie lisa y por su capacidad de producir pigmento
carotenoide tuvo color amarillo y otra naranja (Anexo B2); se realizó la prueba
de catalasa dando positivo al desdoblarse el peróxido en agua y oxigeno
gaseoso que se liberó en forma de burbujas en la muestra (Anexo B2)
descartando que posiblemente fue Enterococcus; la prueba de tinción de gram
dio positivo, identificación que eran bacterias gram positivos siendo
posiblemente Staphylococcus (Anexo B2) por ser bacterias comunes en las
superficies cutáneas y mucosas además que se obtuvo crecimiento bacterial en
agar sangre que es un medio común donde crecen Staphylococcus sp. en la
prueba de la coagulasa dio positivo (Anexo B2) indicando que posiblemente era
la bacteria Staphylococcus aureus ya que es la única especie que produce la
enzima coagulasa y pigmentación amarilla (Gonzales, et. al., 2009), sin
embargo para saber exactamente el tipo de bacteria utilizada es necesario
realizar una identificación molecular.
40
4.1.4 Identificación de la microalga Chlorella
Fotografía 1: Microalga Chlorella observada microscópicamente
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
Figura 1. Vista al microscopio de cepa de Chlorella
Fuente: Jiménez & Jiménez, 2012
Al observar al microscopio las muestras recogidas se observó la presencia de
la microalga que posiblemente fue Chlorella (Fotografía 1), identificándola por
ser células pequeñas, de alrededor de 2 a 10 micrones de diámetro, de color
verde por la presencia de clorofila, aisladas y otras formando colonias con
forma irregular conservando su forma esférica, se reproducen muy rápidamente
y de forma asexual, y principalmente no tiene flagelo, como fue reportado y
comparado por Gonzales, 2010 y Cervera, 2011.
41
4.1.5 Conteo Celular
El crecimiento de la microalga a las 0, y 24 horas las células se adaptaron al
nuevo entorno por lo que no existió replicación celular, el color del cultivo fue
casi transparente (Anexo B3), a partir de las 48 horas se observó crecimiento
exponencial en cada uno de los tratamientos hasta las 192 horas, el color de
los cultivos cambio a verde claro (Anexo B3), a partir de aquí la densidad
celular no cambio significativamente hasta las 240 horas, el color de los cultivos
fue verde oscuro (Anexo B3) observando que iniciaba la fase estacionaria al no
existir producción de células nuevas por lo que se extrajo la biomolécula de
cada una de las muestras.
Se calculó la población inicial promedio de cada muestra, para lo cual se
realizó el conteo celular de cada una de las réplicas de las muestras sacando el
promedio de las mismas; la muestra de Atocha tuvo una población inicial
promedio de 4,8𝑥105 cel/ml menor que la muestra de Tilulum, cuya población
inicial promedio fue de 13,60𝑥105cel/ml y mayor que la muestra de Socavón,
con población inicial promedio de 2,60𝑥105 cel/ml, durante las 72 horas
posteriores no hubo mayor crecimiento en la muestra de Atocha y el Socavón
por lo que fue factible el conteo celular mientras que en la muestra de Tilulum
su crecimiento fue mayor; la fase exponencial se alcanzó a las 192 horas hasta
las 240 horas que fue donde se extrajo el chlorellin, obteniendo una población
final promedio de 54,23𝑥105 cel/ml en la muestra de Tilulum seguida por la
muestra de Atocha con población final promedio 45,76𝑥105 cel/ml y finalmente
la muestra de Socavón con 42,86𝑥105cel/ml (Tablas A5, A6, A7)
4.1.6 Chlorellin
Se observó que los tubos con sedimento-solvente fueron de color verde oscuro
mientras que los tubos con sobrenadante-solvente fueron casi transparentes lo
que indico predominancia de microalgas en los tubos con sedimento (Anexo
B4).
Al realizar el antibiograma de los 54 ensayos, resultaron positivos los
tratamientos sedimento-etanol y sedimento-alcohol Isopropílico es decir 18
tratamientos positivos, mientras que los 36 restantes fueron negativos; no hubo
42
inhibición con el solvente agua-sedimento, tampoco en las cajas en las que se
colocó los discos con el sobrenadante, con los tres solventes, lo que indicó que
existe potencial antibacteriano en el sedimento que se obtiene al extraer el
chlorellin (Tabla A9).
4.1.7 Medición de Halos de inhibición
El antibiótico se difundió radialmente desde el disco a través del agar, la
concentración fue disminuyendo a medida que se alejó del disco hasta que en
un punto determinado la concentración del antibiótico en el medio fue incapaz
de inhibir el crecimiento bacterial.
En la tabla A10 se observa que en la muestra de Atocha en la réplica 1 el nivel
a0b1 (Atocha-alcohol isopropílico) tuvo un halo de inhibición promedio de 0.23
mm mayor a0b0 (Atocha- etanol) de 0.15mm, en la réplica 2 a0b1 (Atocha-
alcohol isopropílico) su halo promedio fue de 0.217 mm a0b0 (Atocha-etanol)
fue de 0.18 mm, en la réplica 3 a0b1 (Atocha- alcohol isopropílico) fue 0.205
mm y a0b0 (Atocha- etanol) fue 0.193mm.
En la muestra de Tilulum, en la réplica 1 el nivel a1b1 (Tilulum-alcohol
isopropílico) la inhibición promedio fue de 0.282mm y a1b0 (Tilulum- etanol) de
0.209mm, en la réplica 2 a1b1 (Tilulum- alcohol isopropílico) fue de 0.26mm y
a1b0 (Tilulum-etanol) 0.18mm, y en la réplica 3 a1b1 (Tilulum-alcohol
isopropílico) su halo promedio fue de 0.29mm y a1b0 (Tilulum-etanol)
0.192mm.
En la muestra del Socavón, el nivel a2b1de la réplica 1 (Socavón-Alcohol
isopropílico) tuvo un halo de inhibición promedio de 0.203mm, a2b0 (Socavón-
etanol) fue 0.117mm, en la réplica 2 a2b1 (Socavón- alcohol isopropílico) 0.188
en a2b0 (Socavón- etanol) fue 0.122mm y finalmente en la réplica 3 a2b1
(Socavón- alcohol isopropílico) fue de 0.207mm y a2b0 (Socavón- etano) fue
0.113mm.
En los tres tratamientos se observó que entre replicas los halos de inhibición
promedio no tuvieron diferencia significativa.
43
La muestras de Atocha, Tilulum y el Socavón con alcohol isopropílico tuvo
mayores valores de inhibición comparado con los tratamientos con etanol sin
embargo la diferencia no fue significativa lo que indicó que los dos solventes
con el extracto de Chlorella pueden inhibir el crecimiento bacterial con la misma
eficacia; las réplicas de la muestra de Tilulum tuvieron mayor inhibición
promedio seguido por la muestra de Atocha y finalmente las réplicas de la
muestra del Socavón.
Comparando con los resultados obtenidos por la investigación de Kellam y
Walker (2007), quienes obtuvieron zonas grandes de inhibición tanto para la
bacteria Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis se demuestra que las
distintas especies de Chlorella en solventes-alcohol presentan inhibición
bacteriana al igual que Ghasemi y colaboradores (2007) quienes también
identificaron actividad antibacteriana contra la bacteria Staphylococcus aureus
y Pseudomona aeruginosa utilizando el principio activo de Chlorella, se
comprueba de esta manera, que el extracto de la microalga Chlorella tiene
actividad contra bacterias gram positivas.
4.1.8 Análisis de varianza
La única variable evaluada fue el diámetro de la zona de inhibición, en
milímetros, la separación de medias fue realizada al encontrar diferencias
significativas entre los tratamientos, usando la prueba de Tukey al 5% de
significancia utilizando el programa Infostat.
Tabla 11: Análisis de Varianza para mm de inhibición.
FUENTE SUMA DE
CUADRADOS
GL CUADRADO
MEDIO
RAZÓN-F VALOR-P
EFECTOS PRINCIPALES
A:sector de recolección 0,0199301 2 0,00996506 49,58 0,0000
B:solvente 0,0239076 1 0,0239076 118,95 0,0000
C:replica 0,000536778 2 0,000268389 1,34 0,3062
INTERACCIONES
AB 0,00178678 2 0,000893389 4,44 0,0416
RESIDUOS 0,00200989 10 0,000200989
TOTAL (CORREGIDO) 0,0481711 17
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
44
En el análisis de varianza para los halos de inhibición los valores –P muestran
diferencias altamente significativas tanto en los efectos principales como en las
interacciones, es decir para el factor A (sitios de recolección), factor B
(solventes) e interacción AB (Sitio de recolección-solvente) ya que fueron
menores que 0,05 a un 95% nivel de confianza, lo que indica que el potencial
antimicrobiano de Chlorella se ve influenciada por el sector de recolección de
las muestras y el solvente utilizado.
Gráfico 2: Gráfico de Interacciones
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
En el gráfico de interacciones se observa que para el factor A el mejor sector
de recolección fue Tilulum, seguido por Atocha y finalmente el Socavón,
mientras que para el factor B el mejor solvente fue el Alcohol isopropílico
seguido por el etanol, el grafico muestra que el Factor A no depende del factor
B para el potencial antimicrobiano de la microalga Chlorella debido a que en
todos los tratamientos se produjo halos de inhibición.
Tabla 12: Prueba de Tukey para el solvente
SOLVENTE MEDIAS N E.E
Alc. Isopropilico 0,231667 9 0,004856 A
Etanol 0,158778 9 0,004856 B
Elaborado por Adriana Barona, 2014
Gráfico de Interacciones
sector de recoleccion
0,1
0,13
0,16
0,19
0,22
0,25
0,28
mm
de
in
hib
icio
n
Atocha Socavón Tilulum
solventeAlc. IsopropilicoEtanol
45
De acuerdo a la prueba de Tukey para el solvente se obtuvo que el mejor fue el
alcohol isopropílico al tener una media mayor a la del etanol, lo que se confirma
en la medición de los halos de inhibición los cuales fueron mayores en los
ensayos en los que se utilizó el alcohol isopropílico.
Tabla 13: Prueba de Tukey para el lugar de recolección.
SECTOR DE
RECOLECCION
MEDIAS N E.E
Tilulum 0,235667 6 0,005947 A
Atocha 0,195833 6 0,005947 B
Socavón 0,154167 6 0,005947 C
Elaborado por: Adriana Barona
El mejor sector de recolección fue Tilulum con una media de 0,235667, seguida
por el sector de Atocha con una media de 0,1958 y finalmente el Socavón con
media 0,154167.
Tabla 14: Prueba de Tukey
SECTOR DE
RECOLECCIÓN
SOLVENTE MEDIAS N E.E.
Tilulum Alc. Isopropílico 0,28 3 0,01 A
Atocha Alc. Isopropílico 0,22 3 0,01 B
Socavón Alc. Isopropílico 0,20 3 0,01 B C
Tilulum Etanol 0,19 3 0,01 B C
Atocha Etanol 0,17 3 0,01 C
Socavón Etanol 0,11 3 0,01 D
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
De acuerdo a la tabla de Tukey obtenida en el programa Infostat el mejor
tratamiento con α 0,05 fue a1b1 (Tilulum- Alcohol Isopropílico) ya que su media
fue mayor, lo que indicó que inhibe la bacteria gram-positiva con la que se
trabajó al producir mayor inhibición comparado con los demás tratamientos su
media fue de 0,28mm, seguido por el tratamiento a0b1 (Atocha-Alcohol
Isopropílico) con una media de 0,22mm, el tratamiento a2b1 (Socavón- Alcohol
Isopropílico) con media de 0,20mm, finalmente los tratamiento a1b0 (Tilulum-
46
etanol) media de 0,19mm, a0b0 (Atocha- Etanol) 0,17mm y a2b0 (Socavón-
etanol) con 0,11mm.
Se excluyó los datos obtenidos con agua ya que se obtuvo valores de cero, al
no presentar inhibición en el sedimento y en el sobrenadante.
4.1.9 Control positivo
En el control positivo se observó que la bacteria gram positiva fue sensible a la
ampicilina con un halo de inhibición de 5 mm y a la oxacilina con un halo de
1mm ya que los valores están dentro del rango de sensibilidad según la tabla
de Concentración Mínima Inhibitoria, (Tabla A4).
4.2 Verificación de Hipótesis
4.2.1 Hipótesis nula (H0)
La determinación del potencial antimicrobiano no se ve influenciada
significativamente del medio de elución y lugar de extracción.
4.2.2 Hipótesis Alternativa (H1)
La determinación del potencial antimicrobiano se ve influenciada
significativamente del medio de elución y lugar de extracción.
Después de realizar el análisis de inhibición de la microalga Chlorella, “se
acepta la hipótesis alternativa (H1) afirmando que el potencial antimicrobiano se
ve influenciado significativamente del medio de elución y lugar de extracción.”
4.3 Discusión general del trabajo de investigación
Las microalgas son organismos unicelulares eucariotas fotosintéticas, pueden
crecer bajo una variedad de condiciones medioambientales, lo que facilita su
accesibilidad; entre las microalgas de mayor importancia se encuentra Chlorella
por su valor económico y nutricional.
La presente investigación se desarrolló con el propósito de determinar si la
microalga aislada, posiblemente Chlorella, tiene poder antibacterial. De esta
47
manera, se aprovechará su potencial en varios ámbitos de la industria,
bioquímica y biotecnología.
Se aisló la microalga, hasta obtener un cultivo puro de cada uno de los
sectores a analizar; Atocha, Tilulum, y el Socavón; se determinó la cinética de
crecimiento lo que permitió identificar cuando las células se encontraron en
fase exponencial donde se tomó una muestra de cada uno de los cultivos
preparados para centrifugarlos con el fin de separar el sedimento del
sobrenadante, al desconocer en qué parte existió potencial antibacterial, se
utilizó los dos, los cuales fueron mezclados con tres solventes, etanol, alcohol
isopropílico y agua, para la extracción del chlorellin.
La bacteria una vez identificada se aisló mediante estrías compuestas; se
aplicó el método del antibiograma, obteniendo al final que el mejor tratamiento
fue el de las muestras de Tilulum con alcohol isopropílico sin embargo con
etanol los halos de inhibición no tuvieron diferencias significativas, mientras que
con el solvente agua no presento inhibición tanto con el sedimento como con el
sobrenadante.
Las cajas en las que se colocó los discos con las muestras tratadas con el
sobrenadante ninguna presento inhibición, sin embargo esto no afirma que el
sobrenadante no tiene efecto inhibitorio pero que si lo tuviera su concentración
microalgal es menor que la que tiene el sedimento lo que impide que tenga el
mismo efecto de inhibición, de esta manera para posteriores análisis se debe
trabajar con el sedimento para tener óptimos resultados de inhibición.
Para comprobar que la bacteria utilizada era sensible a antibióticos comunes
como la penicilina y oxacilina se hizo controles positivos demostrando que la
menor concentración de antibiótico fue capaz de inhibir in vitro el crecimiento
visible de la bacteria
Los resultados de la actividad antibacteriana de la microalga aislada, muestran
posibilidades prometedoras para la obtención de metabolitos secundarios, por
la notable capacidad de inhibición es necesario ampliar el estudio de este tipo
de organismos unicelulares que son parte de la composición de aguas
empozadas, siendo de interés significativo en el avance de la biotecnología.
48
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones
Se construyó la curva de crecimiento de la microalga Chlorella extraída
de cada uno de los sectores establecidos, obteniendo que la muestra del
Socavón tuvo mayor velocidad de crecimiento, mientras que la muestra
de Tilulum tuvo la menor velocidad de crecimiento.
Se indicó que el potencial antibacteriano de la microalga se encuentra
en el precipitado, el cual se utilizó para la extracción de chlorellin.
Se determinó el potencial antibacteriano de la microalga Chlorella
extraída de las aguas empozadas de las acequias de diferentes sectores
de la ciudad, mediante pruebas realizadas en el laboratorio se obtuvo
que la microalga encontrada en la muestra de Tilulum presentó
inhibición ante la bacteria gram-positiva aislada, con el solvente Alcohol
isopropílico al tener mayor promedio de halo de inhibición cuya media
fue de 0,28mm, mientras que Chlorella de la muestra del Socavón con
etanol tuvo la menor media, 0,11mm.
5.2 Recomendaciones
Realizar cultivos de la microalga recolectada las veces que sean
necesarias para eliminar cualquier otro tipo de microorganismo que
pudiera estar presente y que pueda influir en su crecimiento.
Llevar un registro de crecimiento de la microalga a estudiar, ya que la
duración de cada fase puede acortarse, alargarse dependiendo de
diversos factores y características propias de las microalgas.
49
El presente trabajo ha aportado con resultados precisos en desarrollo de
una metodología adecuada para la recolección, aislamiento y
determinación del potencial antibacteriano de la microalga Chlorella ante
la bacteria grampositiva con diferentes solventes, por esta razón es
necesario profundizar el estudio acerca de las microalgas y sus
propiedades con el fin de ampliar su campo de aplicación para su aporte
en el avance biotecnológico.
50
CAPITULO VI
PROPUESTA
6.1 Datos Informativos
6.1.1 Título:
“Determinación del potencial antimicrobiano de la microalga Chlorella en
bacterias grampositivas”
6.1.2 Unidad Ejecutora:
Universidad Técnica de Ambato, a través de la Facultad de Ciencia e Ingeniería
en Alimentos.
6.1.3 Beneficiarios:
Población de Ambato
6.1.4 Ubicación
Provincia: Tungurahua
Cantón: Ambato
6.1.5 Director del Proyecto:
Ing. Alex Valencia
6.1.6 Personal Operativo:
Adriana Barona
6.2 Antecedentes de la Propuesta
El término de “ALGA” comprende un grupo muy heterogéneo de organismos
vegetales marinos (50.000 aproximadamente) que se caracterizan por realizar
la fotosíntesis oxigénica (fotosíntesis que produce oxígeno). Aunque la mayoría
de las algas son unicelulares y microscópicas, algunas de 1 o 2 μm de diámetro
(Jaramillo, 2011).
51
Tiene gran importancia económica ya que a diferencia de las plantas
superiores, contienen relativamente pequeñas cantidades de material
estructural y muchos de los componentes celulares son de reconocido valor
económico (Travieso & Benítez, 1998), en los últimos años se ha incrementado
el interés por la búsqueda de compuestos bioactivos en organismos marinos
según numerosas revisiones señalan a las algas como uno de los principales
productores de compuestos bioactivos (Ríos et. al., 2009).
Chlorella es una microalga que tiene la capacidad de reproducirse
rápidamente, una sola célula puede dividirse y subdividirse en cuatro células
cada 16 a 20 horas (Healey, 2010), pueden crecer en medios artificiales para lo
cual es necesario que las condiciones del cultivo se asemejen al ambiente
natural de la microalga, para lo que se recomienda el “Medio Basal de Bold”
(Cervera, 2011).
La actividad antibacterial puede ser considerada como un indicador de la
capacidad de las microalgas para sintetizar compuestos bioactivos de interés
terapéutico, aunque esta actividad puede depender tanto de la especie como
de la extracción eficiente de los compuestos bioactivos, sobra la actividad
antibacteriana y antifúngica se han desarrollado en años recientes importantes
investigaciones con resultados que reportan que los extractos crudos de
algunas algas inhiben el crecimiento de bacterias y hongos (Ríos, et. al.,
2009)
Cada vez son más los compuestos capaces de inhibir el crecimiento
microbiano que se obtienen de fuentes naturales como plantas, algas y hongos.
Estos compuestos inactivan las cepas bacterianas por mecanismos diferentes
a los antibióticos actuales lo que favorece su empleo como tratamiento
alternativo o complementario.
El estudio de la antibiosis microalgal suele enmarcarse en cuatro perfiles
estrechamente relacionados: la búsqueda de especies con actividad
antimicrobiana, la separación, purificación y elucidación de la estructura
química de los compuestos responsables de la misma (Lara, et. al. 1999).
52
6.3 Justificación
Las microalgas son de interés industrial debido a la gran diversidad metabólica
de este grupo de organismos unicelulares que han colonizado una amplia
variedad de ecosistemas acuáticos, siendo de gran interés para muchas
aplicaciones medicinales, terapéuticas, entre otras,
La finalidad de esta investigación es determinar la capacidad de inhibición de la
microalga Chlorella ante la bacteria gram-positiva aislada de muestras tomadas
de las manos; lo que es de gran interés al ser una nueva metodología de
obtención de sustancia que inhiban el crecimiento de bacterias comunes, y por
ende un paso para la producción de geles antibacteriales al reducir costos de
materia prima
6.4 Objetivos
6.4.1 Objetivo General.
Proponer una metodología básica para determinar el potencial
antimicrobiano de la microalga Chlorella.
6.4.2 Objetivos Específicos.
Caracterizar fenotípicamente la microalga Chlorella
Establecer un estudio económico para la tecnología de obtención de
chlorellin como sustancia inhibitoria de crecimiento bacterial.
6.5 Análisis de factibilidad
Es factible determinar el potencial antibacterial de Chlorella, utilizando un
medio específico para su aislamiento y posterior búsqueda de compuestos
bioactivos, ya que de acuerdo a los análisis realizados se determinó que
efectivamente la microalga inhibe el crecimiento de la bacteria gram-positiva
aislada de muestras tomadas de las manos.
53
6.6 Fundamentación.
La investigación “DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE
LA MICROALGA Chlorella EXTRAIDA DE LAS AGUAS EMPOZADAS DE LAS
ACEQUIAS DE ATOCHA, TILULUM Y EL SOCAVON DEL CANTON AMBATO"
es la base científica que permite la formulación de la propuesta.
6.7 Metodología. Modelo Operativo
6.7.1 Recolección de muestras
Para la obtención de células de Chlorella se recogieron muestras de aguas
estancadas de distintos puntos en 3 lugares diferentes del cantón Ambato:
Atocha, Tilulum y El Socavón; 4 muestras en Atocha, 5 muestras en Tilulum y 4
muestras en el Socavón, (13 muestras) teniendo en cuenta su coloración verde
lo que indicó presencia de algas.
Se recogió 100 ml de agua estancada de cada uno de los puntos en recipientes
de plástico estériles, rotulando la fecha, y el lugar específico de donde fueron
recolectadas (Anexo B1).
Se conservó las muestras en las mismas botellas, para su posterior
observación expuestas al ambiente sin taparlas.
6.7.2 Observación en microscopio de las muestras recogidas
Se colocó una gota de cada muestra en un portaobjetos y se observó en el
microscopio, identificando la presencia de numerosos microrganismos por lo
que se trató de reconocer células microalgas con el fin de seleccionar las
muestras útiles y descartar las muestras que no tuvieron la microalga.
6.7.3 Identificación de la microalga Chlorella.
Para la identificación de Chlorella se basó en su morfología esférica, cerca de
2-10 micrones de diámetro, por su ausencia de flagelos por lo que es inmóvil,
por su ausencia de pelos, por ser unicelular, y en su pigmentación, ya que al
contener altos niveles de clorofila a y b el medio en el que creció fue de color
verde; finalmente se comparó las células obtenidas con bibliografía con el fin
54
de corroborar que en las muestras analizadas crecía posiblemente la microalga
de interés.
En Atocha se identificó que 3 de las 4 muestras recolectadas tuvo células
microalgas, de Tilulum 3 de las 5 muestras y Socavón 2 de las 4 muestras, al
reconocer lo que posiblemente era Chlorella se las aisló varias veces con el fin
de obtener cultivos puros, en un medio nutriente para microalgas, en este caso
en medio Basal de Bold, proporcionando nutrientes necesarios para su
multiplicación (Armendáriz, 2011).
Las muestras se observaron diariamente eliminando aquellas que tenían
presencia de otros microorganismos, otras en las que no hubo crecimiento de
las células microalgas, otras en las que a más de crecimiento de lo que
posiblemente era Chlorella creció otro tipo de microalga de forma ovoide, o que
por su exposición a la luz solar había disminuido su volumen, al final se eligió
un cultivo puro por sector.
6.7.4 Asilamiento de la microalga Chlorella
Medio de cultivo líquido
Para la elaboración del medio se basó en la fórmula que se encuentra en la
tabla A1 reemplazando el micronutriente MnCl2 por NH4Cl, como adaptación
propia previo a pruebas realizadas demostrando ser útil en la masificación
microalgal.
Para su aislamiento se preparó 250ml de medio Basal de Bold con 30ml de las
muestras seleccionadas, se tomó este volumen de muestra para su pronta
identificación, se colocó en botellas previamente lavadas, con aireación cada
una de ellas y expuestas a la luz solar para ayudar a que las células se
adapten al medio, este procedimiento se repitió hasta obtener cultivos puros de
posiblemente Chlorella, basándose particularmente en su morfología redonda.
Cada botella contó con aireación continua debido a que las microalgas son
aeróbicas, evitando su sedimentación y permitiendo la homogenización de los
nutrientes mejorando significativamente la asimilación debido a que el
55
movimiento del agua disminuye la capa laminar alrededor de la microalga,
aumentando de esta forma la difusión de nutrientes (Gonzales, 2010).
6.7.5 Crecimiento microalgal
Se eligió un cultivo puro por sector los cuales se aislaron nuevamente en
recipientes plásticos de agua de 6 litros, los cuales fueron llenados con 2 litro
de medio de cultivo Basal de Bold y 240 ml de las muestras de los cultivos
puros, (se tomó como referencia el volumen utilizado en los anteriores
aislamientos, 30ml de muestra en 250ml de medio) se dejó reposar las
muestras por 7 días para su masificación microalgal.
Para el conteo celular se preparó 3 réplicas del cultivo puro de Atocha, 3
réplicas del cultivo de Tilulum y 3 réplicas del cultivo del Socavón, obteniendo 9
ensayos, utilizando recipientes plásticos de agua de 2 litros, los cuales fueron
llenados con 1 litro de medio de cultivo basal de bold y 10% de los cultivos
puros iniciales por litro.
Para el cálculo de concentración de la microalga se calculó por el método del
hemocitómetro, se aplicó la siguiente fórmula:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑐𝑒𝑙
𝑚𝑙) =
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝑚𝑙)
Se colocó una gota de cada muestra a observar en el hemocitómetro, se tapó
con un cubreobjetos evitando formar burbujas de aire que dificulten la
visualización.
Se utilizó esta fórmula porque se contó los cuatro cuadrado externos, el
volumen se calculó multiplicando la altura, ancho y longitud del hemocitómetro
(0,1cm*0,1cm*0,01cm).
Se realizó conteos diarios para la obtención de la curva de crecimiento con el
número de células de Chlorella que se determinaron en cada uno de los 9
ensayos (X) en el transcurso de los días (Y), se elaboró una gráfica de ln
Densidad celular vs. Tiempo, que correspondió a la curva de crecimiento en
escala logarítmica de la microalga.
56
Los datos obtenidos del conteo por 10 días de cada una de las réplicas se
reportan en las tablas A5, A6, A7.
Al determinar que las réplicas de Tilulum tuvieron una población inicial mayor
se colocaron en un lugar con poca iluminación y sin aireación continua,
mientras que las réplicas de Atocha y el Socavón al tener una población inicial
y crecimiento parecido mantuvieron durante las 240 horas condiciones óptimas
de crecimiento, controlando de esta manera que la población final de cada
ensayo no tuvieran diferencias significativas.
6.7.6 Velocidad de crecimiento
La velocidad de crecimiento se calculó en base a la fórmula:
𝜇 =[ln(𝑁𝑡) − ln (𝑁0)]
𝑙𝑛2(𝑡 − 𝑡0)
Dónde:
t: tiempo transcurrido entre el inicio y fin de la prueba,
t0: tiempo inicial,
N0: densidad celular inicial,
Nt: densidad celular final.
El tiempo de generación se calculó con la fórmula:
𝑇𝑑 =𝐿𝑛2
𝜇
6.7.7 Obtención de Chlorellin
Cuando las células de las 9 ensayos se encontraron en estado exponencial,
tomando en cuenta que el crecimiento celular no vario significativamente por 3
días, se recogieron 10 ml de cada muestra en tubos de ensayo, los cuales se
centrifugaron a 5000 rpm durante 20 minutos.
Se utilizó los cultivos en fase exponencial ya que después de este período no
es aconsejable desde el punto de vista tecnológico ni económico (Barajas et.
al., 2011).
57
Para saber en qué parte existió potencial antimicrobiano se trabajó con el
sobrenadante acuoso y el sedimento de la microalga resultante, luego de la
centrifugación, colocándolos en tubos de ensayo con tapa rosca.
Este procedimiento se repitió 3 veces para obtener por cada ensayo 3 tubos de
sedimento y tres tubos de sobrenadante, posteriormente se colocó en cada uno
solventes distintos; 5 ml de etanol, 5 ml de Alcohol isopropílico y 5ml de agua,
se agitaron durante 20 minutos, resultando al final 54 tratamientos; se utilizó los
dos alcoholes por ser de mayor uso como desinfectantes, el etanol
desnaturaliza las proteínas y disuelve los lípidos destruyendo eficazmente
muchos tipos de células bacterianas y virales, y alcohol isopropílico por ser en
función y estructura similar al etanol, destruye las células bacterianas y virales
por el mismo mecanismo por lo que puede ser utilizado como sustituto para el
etanol (Arévalo et. al., 2010).
Los tubos previamente tapados se colocaron en refrigeración para su
almacenamiento, evitando contaminación.
6.7.8 Aislamiento de bacterias mediante el método de difusión en placa
Para comprobar el potencial antimicrobiano de Chlorella se aisló bacterias que
se encuentran en la palma de la mano, para lo cual se limpió y esterilizó el área
de trabajo, se prendió el mechero para evitar la rápida contaminación del lugar
donde se preparó las muestras, se sumergió el hisopo en agua salina estéril, y
se pasó por la mano, se hizo estrías simples con la cabeza del hisopo en el
medio ya preparado, detallado en la tabla A2, sin retirar completamente la tapa
del medio de cultivo para evitar que se contaminen. Se incubó a 37°C por
alrededor de 24-48 horas, se obtuvo dos tipos de bacterias con coloración
amarilla y naranja.
6.7.9 Identificación bacteriana
Para identificar el tipo de bacteria se realizó pruebas primarias y secundarias;
una vez obtenida una cepa pura de cada una de ellas se resembro en agar
sangre (Gram positivas) y en agar Mac Conkey (gram negativas), a las 24
horas se realizó la prueba de catalasa para lo cual se tomó una muestra de la
58
cepa en un palillo estéril se colocó en un porta objetos con una gota de H2O2;
seguido se hizo la prueba de tinción gram colocando una muestra de la
bacteria en un portaobjetos haciendo el extendido de la muestra, se dejó secar
a temperatura ambiente, fijándola con metanol durante 1 minuto, se agregó
unas gotas de cristal violeta por 1 minuto, se enjuago con agua, luego se
colocó acetona y se esperó 30 segundos, y se enjuago con agua, finalmente se
agregó gotas de safranina por 1 minuto, una vez lista la muestra se observó en
el microscopio óptico en el lente de 40x; al observar crecimiento en agar sangre
(medio común para Staphylococcus sp.) se hizo una prueba secundaria, la
prueba de la coagulasa que permite determinar la capacidad de coagular el
plasma por la acción de la enzima coagulasa, se colocó unas gotas de plasma
en la muestra (Gonzales, et al., 2009).
Las bacterias fueron almacenadas en refrigeración para posteriormente ser
aisladas nuevamente.
6.7.10 Aplicación de los discos
Una vez identificado la bacteria coco gram-positiva con la que se trabajó, se
aisló en 54 cajas Petri mediante estrías compuestas, las estrías se realizaron
en la cámara de flujo laminar, desinfectando previamente para evitar
contaminación en las cajas.
Se colocaron 5 discos de papel filtro estéril, 4 en los extremos y uno en el
centro, con 300µl de cada una de las 54 soluciones de ensayos, ya que por
pruebas previas se demostró que con cantidades menores la inhibición
bacteriana es mínima dificultando su identificación, secándolos bajo un flujo de
aire laminar, no por más de 15 segundos, los discos se tomaron con pinza
estéril y se colocaron en el medio en un tiempo menor a 15 minutos después
de haber inoculado la placa, los discos se presionaron ligeramente para
asegurar un contacto con la superficie evitando ser removidos una vez que
tomaron contacto con la superficie del agar, para prevenir una sobreposición de
las zonas de inhibición; se distribuyó adecuadamente los discos con un límite
no menor de 15 mm de los bordes de la placa y una distancia de alrededor de
30 mm entre discos, para lo cual se diseñó un molde con dichas medidas para
evitar errores en la colocación de los discos (Anexo B5).
59
6.7.11 Incubación
Luego de 15 minutos de haber colocado los discos se invirtieron las cajas Petri
incubándolas a 37 ° C durante un período de 24 horas.
6.7.12 Medición de los halos de inhibición.
Para la medición de los halos de inhibición se midió con una regla por el fondo
de la caja iluminándola con luz sobre un fondo negro para facilitar la medición.
Se calculó el halo promedio por caja, ya que se colocó 5 discos.
6.7.13 Control positivo
Los antibiogramas son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de
los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, el diámetro
del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías
de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a tablas de los
parámetros establecidos de concentración mínima inhibitoria (CMI) (Faría et.
al., 1999)
A las colonias aisladas de la bacteria gram-positiva se les realizo antibiograma
en cajas Petri con agar Mueller-Hinton (específico para bacterias) (Tabla A3),
para determinar la sensibilidad o resistencia se ajustó el inoculo al patrón de
turbidez MacFarlan N°0.5 para luego sembrar en las cajas con un hisopo
estéril, se utilizó sensidiscos de antibióticos como ampicilina 10 µg, oxacilina
10 µg por tener un espectro predominando grampositivo incluyendo
Staphylococcus spp. productor de penicilinasas, los halos de inhibición se mido
a las 24 horas de incubación.
60
Tabla 15.- Modelo operativo (plan de acción).
Fases Metas Actividades Responsable Recursos Presupuesto Tiempo
1.Formular la
propuesta
Determinación del
potencial antibacteriano
de Chlorella
Revisión
bibliográfica
Investigador Humano
Técnico
Económico
$25 20 días
2. Desarrollo
preliminar de la
propuesta
Elaborar metodología
para extracción de
chlorellin.
Extraer la
biomolecula de la
microalga.
Investigador Humano
Técnico
Económico
$150 14 días
3.
Implementación
de la propuesta
Ejecutar procedimientos y
fichas técnicas para la
determinación del
potencial antimicrobiano
de Chlorella
Elaboración fichas
técnicas y
redacción de
metodología.
Investigador Humano
Técnico
Económico
$50 60 días
4. Evaluación
de la propuesta
Proponer talleres de
socialización de
resultados y beneficios a
los interesados de la
propuesta.
Análisis con
investigadores de
algas.
Investigador Humano
Técnico
Económico
$100 30 días
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
61
6.8 Administración.
Para la ejecución de la propuesta se requerirá de los siguientes recursos:
6.8.1 Recursos humanos
Está conformando por él y los investigadores de organismos acuáticos.
6.8.2 Recursos físicos
Las actividades se desarrollaran en un ambiente adecuado con todas las
comodidades para el avance satisfactorio de las actividades planificadas.
6.8.3 Recursos materiales
• Computador y Proyector.
• Cuadernos y esferos.
• Impresiones.
• Fotocopias
• Resma de Papel Bond.
Tabla 16.- Administración.
Indicadores a
mejorar
Situación
actual
Resultados
esperados
Actividades Responsables
Aprovechamiento
del potencial
antibacteriano de
la microalga
Chlorella.
Falta de
conocimiento
acerca de las
propiedades
de las
microalgas.
Determinación del
potencial
antibacteriano de
Chlorella en
bacterias gram-
positivas.
Obtención
de la
molécula
bioactiva de
Chlorella.
Investigadora:
Adriana Barona
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
62
6.9 Previsión de la evaluación
A fin de garantizar y asegurar la ejecución de la propuesta de conformidad con lo
programado, para el cumplimiento de los objetivos planteados, se deberá realizar
el monitoreo del plan de acción, como un proceso de monitoreo y evaluación
permanente que nos permita anticipar contingencias que se pueden presentar en
el camino con la finalidad de implementar correctivos a través de acciones que nos
aseguren la consecución de las metas.
PREGUNTAS BÁSICAS EXPLICACIÓN
Quiénes solicitan evaluar? Docentes
Investigador
Por qué evaluar? Porque proporciona información sobre
nuevos compuestos bioactivos a partir
de la microalga Chlorella.
Para qué evaluar? Para determinar si la propuesta
contribuye en logro los objetivos
propuestos.
Qué evaluar? El impacto que genera la determinación
del potencial antimicrobiano de Chlorella
Quién evalúa? El investigador
Cuando evaluar? Durante el proceso e inmediatamente
luego de concluida la aplicación de la
propuesta.
Cómo evaluar? A través de ensayos en bacterias de
amplio espectro.
Con qué evaluar? Utilizando los instrumentos adecuados
según las técnicas aplicadas.
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
63
4.4 BIBLIOGRAFÍA
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73
ANEXO A1
El medio Basal de Bold tiene soluciones stock de macronutrientes y
Micronutrientes las cuales se citan a continuación:
Tabla A1. Medio Basal de Bold
MACRONUTRIENTES
COMPONENTE CONCENTRACIÓN FINAL EN EL
MEDIO (g/l)
NaNO3 1.5
K2HPO4 0.04
MgSO4*7H2O 0.036
CaCl2*2H2O 0.027
Ácido Cítrico 0.006
EDTA 0.001
NaCO3 0.02
Agua Destilada 1 L
MICRONUTRIENTES
COMPONENTE FINAL CONCENTRACIÓN FINAL EN EL
MEDIO (g/ml)
Agua Destilada 100ml
H3BO3 0.286
NH4Cl*4H2O 0.425
ZnSO4*7H2O 0.012
NaMoO4*2H2O 0.39
CuSO4*5H2O 0.005
Co(NO3)2*6H2O 0.003
Fuente: Armendáriz, 2011
74
ANEXO A2
Las bacterias, para poder desarrollarse, requieren de un medio con el alimento
adecuado. Existen muchas recetas para conseguir buenos medios de cultivo; uno
de los mejores es el medio Luria-Bertani (LB) (Dorado, 2005).
Tabla A2. Medio de cultivo Luria-Bertani para bacterias
MEDIO SOLIDO (g)
NaCl 10
Extracto de levadura 5
Peptona de caseína 10
Agar 15
Agua destilada 1 litro
Fuente: Dorado, 2005.
75
ANEXO A3
Tabla A3. Medio Mueller-Hinton
FORMULA( gramo por litro)
Infusión de carne 3
Peptona de caseína 17.5
Almidón 1.5
Agar 15.0
Fuente: (Ledezma, 2013)
Suspender 38 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación
suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en
autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una
temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas de Petri estériles (Ledezma, 2013).
76
ANEXO A4
Tabla A4. Estándares de interpretación de Concentración Mínima Inhibitoria para
Staphylococcus spp.
ANTIBIOTICOS SENSIBILIDAD INTERMEDIO
(µg/ml)
RESISTENTE
Penicilina ≤ 0,12 - ≥ 0,25
Oxacilina ≤ 2 - ≥ 4
Eritromicina ≤ 0,5 4-8 ≥ 16
Vancomicina ≤ 2 1-4 ≥ 8
Fuente: Leal et al., 2010
77
ANEXO A5
Tabla A5: Valores de crecimiento celular muestra Atocha
Tiempo (horas)
0 24 48 72 96 144 168 192 216 240
Densidad
celular(*10^5)
A1 7,4 11,2 13,8 19,93 24,31 38,94 43,79 46,7 48,94 49,39
A2 5,5 9,43 12,7 17,79 20,81 33,94 39,12 43,7 44,12 46,68
A3 1,5 6,32 9,7 14,18 17,64 29,92 36,3 40,53 40,92 41,23
Total 1,5 8,98 12,066 17,3 20,92 34,266 39,73 43,64 44,66 45,766
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
Tabla A6: Valores de crecimiento celular muestra Tilulum
Tiempo (horas)
0 24 48 72 96 144 168 192 216 240
Densidad
celular(*10^5)
B1 13,89 16,42 19,28 24,9 29,37 39,17 43,95 50,17 53,8 54,31
B2 11,96 12,91 16,38 19,81 26,22 35,81 41,11 48,94 50,81 52,23
B3 14,85 16,61 18,34 23,41 29,18 40,19 47,91 53,21 54,49 56,14
Total 13,6 15,31 18 22,71 28,26 38,39 44,32 50,77 53,03 54,23
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
78
Tabla A7: Valores de crecimiento celular muestra del Socavón
Tiempo (horas)
0 24 48 72 96 144 168 192 216 240
Densidad
celular(*10^5)
C1 1,65 5,8 7,79 10,4 14,6 29,02 34 38,24 39,15 41,5
C2 2,5 7,22 9,7 13,24 17,93 33,7 37,5 40,2 41,23 42,21
C3 3,65 8,78 10,8 14,24 19,6 34,6 39,5 41,4 42,7 44,87
Total 2,6 7,27 9,43 12,63 17,38 32,44 37 39,95 41,027 42,87
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
79
ANEXO A6
Tabla A8. Ln de los promedios de la concentración celular de las muestras
Ln
Días Muestra A Muestra B Muestra C
0 13,08 14,12 12,47
24 13,7 14,24 13,49
48 14 14,4 13,75
72 14,36 14,63 14,05
96 14,55 14,85 14,36
144 15,050 15,16 14,99
168 15,190 15,3 15,12
192 15,28 15,44 15,2
216 15,31 15,49 15,22
240 15,33 15,51 15,27 Elaborado por: Adriana Barona
80
ANEXO A7
Tabla A9. Tabla de inhibición antibacteriana
Etanol Alcohol Isopropílico Agua
A1 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
A2 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
A3 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
B1 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
B2 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
B3 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
C1 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
C2 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
C3 Sobrenadante Negativo Negativo Negativo
Sedimento Positivo Positivo Negativo
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
81
ANEXO A8
Tabla A10. Halos de inhibición promedio
Tratamientos Promedio
Atocha Etanol 0,150
Atocha Alcohol Isopropílico 0,233
Tilulum Etanol 0,209
Tilulum Alcohol Isopropílico 0,282
Socavón Etanol 0,117
Socavón Alcohol Isopropílico 0,203
Atocha Etanol 0,180
Atocha Alcohol Isopropílico 0,217
Tilulum Etanol 0,180
Tilulum Alcohol Isopropílico 0,260
Socavón Etanol 0,122
Socavón Alcohol Isopropílico 0,188
Atocha Etanol 0,193
Atocha Alcohol Isopropílico 0,205
Tilulum Etanol 0,192
Tilulum Alcohol Isopropílico 0,290
Socavón Etanol 0,113
Socavón Alcohol Isopropílico 0,207
Elaborado por: Adriana Barona, 2013
83
ANEXO B1. Lugares de recolección de muestras
Fotografía Tilulum
Fotografía 2. Tilulum
Fotografía 3. Atocha
Fotografía 4. Socavón
84
ANEXO B2. Identificación bacteriana
Fotografía 5. Aislamiento Fotografía 6. Resiembra
Fotografía 7. Agar sangre y mac Conkey Fotografía 8. Prueba catalasa
Fotografía 9. Prueba coagulasa Fotografía 10. Prueba gram
85
ANEXO B3. Cultivos Chlorella
Fotografía 11. Crecimiento 0-24 horas
Fotografía 12. Crecimiento celular 48-192 horas
Fotografía 13. Crecimiento celular 216-240 horas
86
ANEXO B4. Extracción Chlorellin
Fotografía 14. Cultivo microalgal Fotografía 15. Observación (40x)
Fotografía 16. Chlorellin (Sobrenadante) Fotografía 17. Chlorellin (Sedimento)
88
ANEXO B6. POTENCIAL ANTIBACTERIAL (Atocha)
Fotografía 19. Alcohol Isopropílico- sedimento Fotografía 20. Reverso
Fotografía 21. Etanol- Sedimento Fotografía 22. Reverso
Fotografía 23. Agua- sobrenadante Fotografía 24: Reverso
89
Fotografía 25.Alcohol Isopropílico- Sobrenadante Fotografía 26. Reverso
Fotografía 27. Etanol- Sobrenadante Fotografía 28. Reverso
Fotografía 29. Agua- sobrenadante Fotografía 30: Reverso
90
ANEXO B7. POTENCIAL ANTIBACTERIAL (Tilulum)
Fotografía 31. Alcohol Isopropílico sedimento Fotografía 32. Reverso
Fotografía 33. Etanol- Sedimento Fotografía 34. Reverso
Fotografía 35. Agua- Sedimento Fotografía 36. Reverso
91
Fotografía 37. Alcohol Isopropílico- Sobrenadante Fotografía 38. Reverso
Fotografía 39. Etano- sobrenadante Fotografía 40. Reverso
Fotografia 41. Agua- Sobrenadante Fotografía 42. Reverso
92
ANEXO B8. POTENCIAL ANTIBACTERIAL (Socavón)
Fotografía 43. Alcohol Isopropílico- Sedimento Fotografía 44. Reverso
Fotografía 45. Etanol- Sedimento Fotografía 46. Reverso
Fotografía 47. Agua- Sedimento Fotografía 48. Reverso
93
Fotografía 49. Alcohol Isopropílico-sobrenadante Fotografía 50. Reverso
Fotografía 51. Etanol- sobrenadante Fotografía 52. Reverso
Fotografía 53. Agua- Sobrenadante Fotografía 54. Reverso