USO DO SODIS NA DESINFECÇÃO DE COLIFORMES E NA...
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i Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ MONICA HATSUE TOLEDO NASSU USO DO SODIS NA DESINFECÇÃO DE COLIFORMES E NA REDUÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DA MICROCISTINA-LR Rio de Janeiro 2018
Transcript of USO DO SODIS NA DESINFECÇÃO DE COLIFORMES E NA...
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Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
MONICA HATSUE TOLEDO NASSU
USO DO SODIS NA DESINFECÇÃO DE COLIFORMES E NA REDUÇÃO
DA CONCENTRAÇÃO DA MICROCISTINA-LR
Rio de Janeiro
2018
ii
MONICA HATSUE TOLEDO NASSU
USO DO SODIS NA DESINFECÇÃO DE COLIFORMES E NA REDUÇÃO
DA CONCENTRAÇÃO DA MICROCISTINA-LR
Orientação: Dra. Valéria Freitas de Magalhães
2018
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Biofisica),
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
NASSU, Monica Hatsue Toledo Uso do Sodis Na Desinfecção de Coliformes e na Redução da concentração da
Microcistina-LR
. / NASSU, Monica Hatsue Toledo. Rio de Janeiro: UFRJ/Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2018 59 p.: il.; cm Orientadora: Valéria Freitas de Magalhães Dissertação (mestrado) – UFRJ, IBCCF, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2018. Referências: f. 1. Microcistina- LR. 2.Coliformes. 3.SODIS. 4. Desinfecção. 5. Exército Brasileiro. I. Magalhães, Valéria Freitas de. II. UFRJ, IBCCF, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica). III Título
iv
“USO DO SODIS NA DESINFECÇÃO DE COLIFORMES E NA REDUÇÃO
DA CONCENTRAÇÃO DA MICROCISTINA-LR”
Monica Hatsue Toledo Nassu
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO
RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA).
APROVADA POR:
RIO DE JANEIRO, 28 DE NOVEMBRO DE 2018.
________________________________________________________________
DRA. SILVANA ALLODI
(COORDENADORA DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – BIOFÍSICA)
________________________________________________________________
DRA. . VALÉRIA FREITAS DE MAGALHÃES (DOUTOR – UFRJ) - ORIENTADOR
________________________________________________________________
DR JOÃO PAULO MACHADO TORRES (DOUTOR – UFRJ) - REVISOR
________________________________________________________________
DR. OLAF MALM (DOUTOR – UFRJ)
________________________________________________________________
DR.JEAN REMY DAVÉE GUIMARÃES (DOUTOR – UFRJ)
________________________________________________________________
DR.MARCELO MANZI MARINHO (DOUTOR – UERJ)
v
Agradecimentos
Primeiramente agradeço aos meus antepassados e aos meus pais.
Agradeço à minha orientadora Professora Valéria Freitas de Magalhães por
todo apoio, amizade, sugestões e paciência para atender minhas solicitações.
Agradeço à Professora Sandra Maria Feliciano de Oliveira e Azevedo por
todos os ensinamentos transmitidos nos momentos de conversa.
Agradeço a todos os amigos do laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de
Cianobactérias pelo constante apoio e conversas agradáveis durante todo o projeto.
Agradeço a todos os amigos do Instituto de Biologia do Exército (IBEx) pelo
apoio nesta empreitada.
Agradeço ao Dr. Jose Bento Pereira Lima e a Dra Cynara de Melo
Rodovalho, da FioCruz, pela ajuda em momentos difíceis desta minha jornada.
Agradeço aos Professores integrantes da banca por aceitarem fazer parte
desta, contribuindo com seus ensinamentos e críticas positivas.
Agradeço a Professor João Paulo Machado Torres por aceitar ser o revisor.
Agradeço ao Professor Gilberto Weissmuller e ao Professor Olavo Amaral
pelo auxílio nas análises estatísticas.
Gratidão!
vi
RESUMO
A qualidade de água utilizada para o consumo humano é uma preocupação mundial, pois
não só microrganismos patogênicos como também toxinas podem ser veiculadas por esse recurso
hídrico. Uma dessas toxinas é a microcistina, produzida por diversos gêneros de cianobactérias. Em
locais onde não se pode contar com o tratamento convencional de água existe a necessidade de uma
metodologia alternativa para o tratamento deste recurso hídrico, como por exemplo, o SODIS (Solar
Water Disinfection). A metodologia SODIS consiste de encher garrafas pets transparente com água
não tratada colocá-las a luz solar por 6 horas e deixá-las esfriar por uma noite. Após este período
esta água estará livre de patógenos e poderá ser consumida. Para melhorar esta técnica, podemos
acrescentar a água a ser tratada, aditivos. O presente estudo teve como objetivo avaliar se o SODIS
aditivado ou não com azul de metileno (AM) e peróxido de hidrogênio (H2O2), conseguiria reduzir a
concentração de microcistina-LR e inativar as cepas bacterianas, Escherichia coli (ATCC 25922) e
klebsiella pneumoniae (ATCC 13883). Os nossos resultados demonstraram que nenhuma das
concentrações testadas do AM, com o uso ou não da pastilha de cloro, exposta ou não a metodologia
SODIS, conseguiu degradar a microcistina-LR e a cor azul do corante permaneceu nas amostras, o
que dificultaria a utilização desta. Foi observado que a cepa de E. coli foi inativada com o uso da
metodologia SODIS,e com qualquer das concentrações de H2O2 testada, sendo o cloro usado ou não,
porém a cepa de K. pneumoniae só foi inativada quando a metodologia SODIS foi acrescida de 6 g/L
de H2O2, com o sem o uso da pastilha de cloro. Em relação à concentração de microcistina-LR, nos
experimentos com o SODIS aditivado com H2O2, foi observado que a concentração desta toxina
decresceu significativamente em relação ao controle, ficando estatisticamente igual entre todas as
concentrações testadas, e próximo ao limite máximo permitido pela Portaria de Consolidação nº 5
/2017 Ministério da Saúde. A concentração de clorofila-a diminuiu significativamente em todas as
amostras em relação ao controle, e com o uso SODIS, ficou abaixo do limite de detecção do método
em todas as amostras aditivadas ou não com H2O2. Os resultados deste estudo não são uma solução
final para a diminuição da concentração da microcistina-LR, na água para o consumo humano em
locais onde o tratamento convencional de água não existe, mas sim um estudo inicial, visando
conseguir reduzir a concentração desta cianotoxina, utilizando metodologias de fácil manuseio e mais
viável economicamente.
Palavras chave: Microcistina-LR, SODIS, Escherichia coli, klebsiella pneumoniae, peróxido de
hidrogênio, azul de metileno.
vii
ABSTRACT
The quality of water used for human consumption is a worldwide concern, as not only
pathogenic microorganisms but also toxins can be carried by this water resource. One of these toxins
is microcystin, produced by several genera of cyanobacteria. In places where conventional water
treatment is not available, there is a need for an alternative methodology for the treatment of this water
resource, such as SODIS (Solar Water Disinfection). The SODIS methodology consists of filling
transparent pet bottles with untreated water put them in the sunlight for 6 hours and let them cool for
one night. After this period this water will be free of pathogens and may be consumed. To improve this
technique, we can add the water to be treated, additives. The objective of the present study was to
evaluate whether SODIS added or not with methylene blue (MB) and hydrogen peroxide (H2O2), could
reduce the concentration of microcystin-LR and inactivate two bacterial strains, Escherichia coli
(ATCC 25922) and Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883). Our results demonstrated that none of the
tested concentrations of MB, with or without the use of the chlorine tablet, exposed the SODIS
methodology, were able to degrade the microcystin-LR and the blue color of the dye remained in the
samples, which would make it difficult to use people. It was observed that the E. coli strain was
inactivated using the SODIS methodology and with any of the H2O2 concentrations tested, whether
chlorine was used or not, but the K. pneumoniae strain was only inactivated when the SODIS
methodology was combined of 6 g/L of H2O2, with no use of the chlorine pellet. In relation to the
concentration of microcystin-LR, in the experiments with SODIS added with H2O2, it was observed that
the concentration of this toxin decreased significantly in relation to the control, being statistically equal
among all tested concentrations, and close to the maximum limit allowed by the consolidation number
5/2017 Ministry of Health of Brazil. The chlorophyll-a concentration decreased significantly in all
samples in relation to the control, and with SODIS use, this decrease was to below the limit of
detection of the method in all samples added or not with H2O2. The results of this study are not a final
solution for reducing the concentration of microcystin-LR in water for human consumption in places
where conventional water treatment does not exist, but rather an initial study aiming to reduce the
concentration of this cyanotoxin, using methodologies of easy handling and lower cost.
Key-words: Microcystin-LR, SODIS, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, hydrogen peroxide,
methylene blue.
viii
Lista de figuras
Figura 1: Fotografias de diferentes gêneros de cianobactérias...............
14
Figura 2: Floração de cianobactérias nas águas das lagoas de
Jacarepaguá (Rio de Janeiro/RJ)..............................................................
15
Figura 3: Estrutura química da microcistina...............................................
17
Figura 4: Dinâmica da microcistina no meio aquático..............................
19
Figura 5: Método SODIS............................................................................
21
Figura 6: Modelo de uma bolsa para utilização com a metodologia
SODIS.........................................................................................................
24
Figura 7: Modelo de um reator solar para utilização com a metodologia
SODIS......................................................................................................... 25
Figura 8: Garrafões de vidro e balões com cultivo de Microcystis
aeruginosa em meio ASM-1.......................................................................
28
Figura 9: Experimento com azul de metileno.............................................
30
Figura 10: Experimento com peróxido de hidrogênio.................................
32
Figura 11: Concentração de microcistina nos dois tratamentos (escuro e
SODIS) sem aditivo (0) e com as diferentes concentrações de azul de
metileno....................................................................................................
37
Figura 12: Concentração de Microcistina nos dois tratamentos (SODIS e
escuro) sem aditivo (0) e com as diferentes concentrações de H2O2........ 40
Figura 13: Concentração de clorofila-a nos dois tratamentos (Escuro e
SODIS) sem aditivo (0) e com as diferentes concentrações de H2O2.......
41
ix
Lista de tabelas
Tabela 1: Condições do experimento realizado com azul de metileno . 29
Tabela 2: Condições do experimento realizado com peróxido de
hidrogênio................................................................................................ 31
Tabela 3: Resultado do reagente Colilert® ............................................ 38
x
Lista de quadros
Quadro 1: Temperatura do ambiente (º C) do dia do experimento com
azul de metileno.............................................................................. 35
Quadro 2: Intensidade luminosa (µmol s/1 m/2) do dia do
experimento com azul de metileno.................................................... 35
Quadro 3: Temperatura do ambiente (º C) do dia do experimento com
peróxido de hidrogênio....................................................................... 35
Quadro 4: Intensidade luminosa (µmol s/1 m/2) do dia do
experimento com peróxido de hidrogênio............................................ 35
xi
Lista de abreviaturas
ADDA: 3-amino-9-metoxi-10-fenil-2,6,8-trimetil-deca-4,6-ácido dienoico
AM: Azul de Metileno
ANOVA: Análise de variância
DEHA: adipato de di-(2-etil-hexila)
DEHP: (ftalato de di-2-etilhexila)
D-MeAsp: ácido D-erythro-ß-metilaspártico
EB: Exército Brasileiro
ERO: Espécie reativa de oxigênio
ETA: estações de tratamento de água
H2O2: Peróxido de Hidrogênio
HWTS: Household water treatment and safe storage
IV: Infravermelho
LETC: Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Cianobactérias
Mdha: N-metildeidroalanina
MS: Ministério da Saúde
OCDE: Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
OMS: Organização Mundial de Saúde
PET: Polietileno Tereftalato
Sb2O3: óxido de antimônio
SODIS: Solar Water Disinfection
SPE: Solid-phase extraction (extração em fase sólida)
TiO2: Dióxido de titânio
UNICEF: Fundo das Nações Unidas para a Infância
UV: Ultravioleta
VMP: valor máximo permitido
WASH: Water, Sanitation, Hygiene
WHO: World Health Organization
xii
Sumário
1. INTRODUÇÃO
1.1. Cianobactérias e Cianotoxinas ................................................................ 13
1.2. Desinfecção Solar (SODIS -Solar Water Disinfection)............................. 20
1.2.1. Efeito nos microrganismos........................................................ 20
1.2.2. Uso da garrafa PET................................................................... 22
1.2.3. Otimização na metodologia SODIS........................................... 24
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral.............................................................................. 27
2.2. Objetivos Específicos................................................................... 27
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Cultivo da Microcystis aeruginosas......................................................... 28
3.2. Cultivo de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae............................... 28
3.3. Experimento SODIS
3.3.1. Azul de Metileno ....................................................................... 29
3.3.2. Peróxido de Hidrogênio............................................................. 30
3.4. Extração e pré-purificação de microcistina-LR......................................... 32
3.5. Quantificação da concentração da microcistina-LR ............................... 33
3.6. Análise estatística..................................................................................... 34
4. RESULTADOS............................................................................................. 35
5. DISCUSSÃO................................................................................................ 43
6. CONCLUSÃO.............................................................................................. 50
7. RECOMENDAÇÕES................................................................................... 50
8. REFERÊNCIAS .......................................................................................... 51
Anexo 01 - Temperatura do líquido de dentro da garrafa PET...................... 59
Anexo 02 - Bolsa para coleta de água - modelo THIO-BAG........................... 61
Anexo 03 - Protocolo de uso do Colilert® (IDDEX)......................................... 62
Anexo 04 - Bolsas THIO-BAG com amostras de água e reagente Colilert®.. 63
Anexo 05 - Simulação de uma situação de combate....................................... 64
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 Cianobactérias e Cianotoxinas
Um problema mundial é a qualidade de água consumida, pois se esta não é
tratada corretamente, pode trazer sérios riscos à saúde da população, seja pela
presença de substâncias tóxicas, seja pela presença de patógenos como por
exemplo, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Salmonella typhi, Vibrio cholerae
ou de outros microrganismos que abundam na natureza.
Há muito que sabemos que existem vários microrganismos que produzem
toxinas, e um exemplo disso são as cianobactérias (WHO, 2011), seres procariontes,
fotoautotróficos, aeróbicos, que requerem água, dióxido de carbono, microelementos
e luz, para sobreviverem e se reproduzirem.
As cianobactérias estão entre as primeiras formas de vida a habitar o
Planeta Terra, com a sua origem estimada em cerca de 3,8 bilhões de anos. São
ainda os pioneiros na fotossíntese oxigênica (KULASOORIYA, 2011). O longo
processo evolutivo faz surgir algumas estratégias adaptativas eficientes, em face do
de estresse ambiental. Estes organismos habitam os mais diversos ecossistemas
como, por exemplo, em águas doces, salgadas, salobras, solos úmidos, fontes
termais, lagos frios, rochas nuas e também em corpos d'água poluídos, drenos e
lixões que são geralmente inóspitos para outros microrganismos (KULASOORIYA,
2011)
Também chamadas de cianofíceas ou algas verde-azuladas, possuem uma
ampla variabilidade morfológica, podendo ser unicelular como os gêneros
Aphanothece e Chroococcidiopsis (Figura 1.a), coloniais, como os gêneros
Gomphospheria e Microcystis (Figura 1.b) ou filamentosas como os gêneros
Dolichospermum (Figura 1.c), Cylindrospermopsis, Nostoc, Oscillatoria e
Planktothrix.
As florações de cianobactérias decorrem principalmente do aumento da
eutrofização dos ambientes aquáticos, por causa da grande quantidade de
nutrientes lançados nestes, especialmente nitrogênio e fósforo, cuja origem remonta
à agricultura e os esgotos não tratados no Brasil. Porém florações em ambiente
oligotróficos já foram descritas (NIMPTSCH et al., 2016)
14
a. b. c.
Figura 1: Fotografias de diferentes gêneros de cianobactérias. a - Chroococcidiopsis sp. (http://ccala.butbn.cas.cz/en/chroococcidiopsis-cubana-komarek-et-hindak-3) (05/11/2018). b -
Microcystis sp. (https://alchetron.com/Microcystis-aeruginosa) (05/11/2018). c – Dolichospermum sp. (http://galerie.sinicearasy.cz/galerie/cyanobacteria/heterocytozni-heterocytous/dolichospermum?image_id=14656) (05/11/2018).
Este fenômeno é atualmente um problema mundial (O’NEIL et al., 2012), por
causarem efeitos adversos ao ambiente, tais como a depleção do oxigênio
dissolvido, o que impossibilita a sua utilização por outras formas de vida aquática,
além de fisicamente diminuir a quantidade de luz solar para as regiões mais
profundas da coluna de água.
Além disso, muitas das cianobactérias têm por característica a produção de
metabólitos secundários que geram odor e sabor desagradáveis na água e podem
produzir potentes toxinas, chamadas de cianotoxinas, que causam sérios riscos
ambientais e/ou sanitários.
15
As florações tóxicas são uma ameaça para a saúde humana e ambiental
(Figura 2). Através do consumo de água contaminada ou do consumo de alimentos
proveniente deste corpo d’água contaminado, o homem pode estar exposto as
cianotoxinas. Por causa dessas toxinas, a Organização para a Cooperação e
Desenvolvimento Econômico (OCDE) considerou em 2005, as cianobactérias como
patógenos emergentes.
Figura 2 - Floração de cianobactérias nas águas das lagoas de Jacarepaguá (Rio de Janeiro/RJ) (Biólogo Mario Moscatelli). https://oglobo.globo.com/rio/poluidas-aguas-das-lagoas-de-jacarepagua-podem-provocar-doencas-em-banhistas-23129134 (05/10/2018)
As cianotoxinas podem ter efeito neurotóxico, hepatotóxico ou dermatotóxico
(TAKSER et al., 2016). Algumas dessas toxinas possuem efeito extremamente
rápido e podem levar à morte por parada respiratória pouco tempo após a ingestão.
Casos de animais como bois, cavalos e cães mortos após ingestão de água com
florações de cianobactérias são comuns na literatura e resultam do envenenamento
por cianotoxinas (CHORUS & BARTRAM, 1999; MEZ et al., 1997).
O primeiro caso confirmado de morte humana no mundo, ocorreu em
fevereiro de 1996 em uma clínica de hemodiálise na cidade de Caruaru, no Estado
16
de Pernambuco, onde até dezembro de 1996, 60 dos 131 pacientes com
insuficiência renal vieram a óbito por insuficiência hepática aguda. Após análise foi
constatada a presença de microcistina e cilindrospermopsina no sistema de filtração
da água da clínica e havia microcistina no sangue dos pacientes (CARMICHAEL et
al., 2001; AZEVEDO et al., 2002).
Após este incidente começaram as preocupações com a qualidade da água
dos reservatórios em relação à presença de cianobactérias. O Ministério da Saúde,
através da Portaria n°1469 de 29/12/2000, inseriu as cinobactérias e cianotoxinas
nas normas de qualidade da água para consumo humano. Esta portaria foi
posteriormente sendo modificada para Nº 2.914 de 2011 (atualmente portaria de
consolidação nº 5/2017), que estabeleceu a obrigatoriedade do monitoramento de
cianobactérias e cianotoxinas nas estações de tratamento de água (ETA). Também
foi fixado o valor máximo permitido (VMP) para equivalentes de microcistina-LR em
1,0 μg/L e de 3,0 µg/L para as saxitoxinas. Além disso, esta portaria passou a proibir
o uso de algicidas nas ETAs, pois as cianotoxinas são liberadas, na maioria das
vezes, após a lise das células, por serem endotoxinas.
A Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1999 editou um ”Guideline”
específico para cianobactérias e cianotoxinas e também estabeleceu o valor máximo
de 1 μg/L de microcistina em água potável (SAGIR, 2009).
Existem diferentes tipos de cianotoxinas, como por exemplo, as nodularinas,
as anatoxinas, as cilindrospermopsinas, e as saxitoxinas, porém nesse trabalho foi
estudado somente a variante LR das microcistinas, por ser a mais frequente e a uma
das mais tóxica (CHORUS & BARTRAM, 1999).
Diferentes gêneros de cianobactérias como Microcystis, Planktothrix e
Anabaena, podem produzir microcistinas. Porém a produção desta toxina pode
variar entre as diferentes espécies e até mesmo entre indivíduos da mesma espécie
(WHO, 1998), e alguns fatores do meio ambiente, como a luz e a temperatura
também podem interferir na produção das cianotoxinas (CARNEIRO et al 2009;
2013).
As microcistinas são classificadas como heptapeptídeos monocíclicos e com
peso molecular variando entre 900 e 1100 Daltons. A denominação das diferentes
variantes é dada pelos seus dois L-aminoácidos variáveis da sua estrutura peptídica,
17
exemplo a microcistina-LR é assim denominada por causa dos seus L-aminoácidos
leucina (L) e arginina (R).
A estrutura química da microcistina (Figura 3) tem na sua composição cinco
aminoácidos invariáveis, o D-alanina, o D-MeAsp (ácido D-erythro-ß-metilaspártico),
o ácido D-glutâmico, o Mdha (N-metildeidroalanina) e o Adda (ácido 3-amino-9-
metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienóico), além de dois L-aminoácidos
variáveis. A microcistina-LR é a variante mais comum (CHORUS & BARTRAM,
1999), existindo mais de 100 variantes desta (PUDDICK et al., 2014).
Figura 3-. Estrutura química da microcistina: Posição (1) é D-alanina; (2) é L-Leucina; (3) é ácido D-eritro-p-metilaspartico; (4) é L-arginina; (5) é Adda; (6) é ácido D-glutâmico; e (7) é N-metildehidroalanina. (CHORUS e BARTRAM, 1999).
As microcistinas são peptídeos cíclicos não voláteis, hidrofílicas, muito
estáveis em água, o que dificulta a sua remoção através de processos
convencionais de tratamento de água, resistentes a foto-oxidação pela e a luz solar.
Essas características fazem com que uma cianotoxina como esta persista durante
muito tempo em corpos d’água naturais (TSUJI et al., 1994; 1995; 1997). Também
são estáveis à temperatura de até 300 °C (WANNEMACHER R.W., 1989) e sua
remoção por microfiltração não é eficaz. (GIJSBERTSEN-ABRAHAMSE et al., 2006
e DIXON et al., 2011)
18
Apesar de os principais sintomas por intoxicação pela microcistinas serem
irritações da pele, reações alérgicas, gastrenterite e náuseas seguida de vômitos e
problemas respiratórios (STEWART et al., 2006), estas toxinas têm o fígado como o
primeiro órgão-alvo, por ser ativamente absorvida pelos hepatócitos sendo
classificada como uma hepatotoxina (SCHERER et al., 2017). Além de causar a
destruição das células hepáticas, que leva a uma hemorragia intra-hepática e é
causa de insuficiência deste órgão. O que pode afetar também o coração
(MILUTINOVIC et al.,2006), os rins (LOWE et al., 2012), os testículos e os ovários
(CHEN et al., 2016), dentre outros órgãos. O efeito desta toxina natural depende do
fator tempo e do fator concentração, ou seja, por quanto tempo o organismo ficou
exposto e a que concentração (CAMPOS & VASCONCELOS 2010).
Os mecanismos de ação da toxicidade da microcistina está relacionado a
inibição das proteínas fosfatases 1 e 2A (PP1 e PP2A) e causa uma perturbação do
equilíbrio da fosforilação celular. Este processo dinâmico de fosforilação/
desfosforilação é a via essencial para a regulação e integridade das proteínas. Os
efeitos de hiperfosforilação e de hepatotoxicidade são consequências desta inibição
(CAMPOS & VASCONCELOS, 2010).
As microcistinas são mutagênicas (SIEROSLAWSKA, 2013;WANG et al.,
2015) e induzem dano no DNA, assim podem ser carcinogênicas agindo não só
como promotoras, mas também como agentes iniciadores de tumores (CAMPOS &
VASCONCELOS, 2010).
As microcistinas bioacumulam em organismos aquáticos, como, por
exemplo, em Tilapia rendalli (MAGALHÃES; MORAES SOARES & AZEVEDO, 2001;
CHEN et al., 2016), rãs (PAPADIMITRIOU et al., 2012) e tartarugas (NASRI et al.,
2008) e são transferidas para níveis tróficos superiores. (Figura 4.)
Devido sua bioacumulação e o grande potencial tóxico das microcistinas,
vários autores se dedicam ao estudo de diferentes métodos de degradação destas
cianotoxinas, que podem ser usados em separado ou em associação com outras
metodologias, por exemplo: adição de oxidantes (PYO & YOO, 2010; FAN et al.,
2014), reação fóton-fenton (ZHONG et al., 2009), luz ultra violeta (UV) (HE et
al.,2012) e uso de dióxido de titânio (CORNISH; LAWTON; ROBERTSON, 2000;
FREITAS et al., 2013)
19
Figura 4–Dinâmica da microcistina no meio aquático. Mostrando que as cianobactérias competem com outras algas do fitoplâncton como também com plantas aquáticas, e quando a microcistina é libertada neste meio prejudica não só os animais aquáticos, mesmo os do zooplâncton,como também podem ser acumular nestes e ser transferida para níveis tróficos superiores através da cadeia alimentar. Podendo chegar ao homem. (CHEN et al.,2016), modificado.
Alimentação
Competição
Bebendo
20
A metodologia proposta neste trabalho já é conhecida mundialmente, porém
é normalmente usada para a desinfecção da água contaminada por patógenos - O
método SODIS.
1.2 Desinfecção Solar (SODIS -Solar (Water) Disinfection)
Este método de desinfecção de água foi descoberto pela primeira vez pelo
professor Aftim Acra na década de 80 (LUZI et al., 2016). Trata-se de uma
metodologia simples, de baixo custo e ecologicamente correta que tem a luz do sol
como agente desinfectante (LUZI et al., 2016). Basicamente o SODIS resume-se em
colocar a água em garrafas PET transparente, expostas à irradiação solar por seis
horas (Figura 5).
Tanto o programa Programa HWTS (Household Water Treatment and Safe
storage) da Organização Mundial da Saúde como o Programa WASH (Water,
Sanitation, Hygiene), da UNICEF sugerem o SODIS como um dos métodos de
desinfecção da água além da cloração, filtração e fervura da água (LUZI et al.,
2016).
1.2.1 Efeito nos microrganismos
Muitos trabalhos têm demonstrado a eficácia deste tratamento de água em
eliminar ou inativar diversos microrganismos patogênicos de veiculação hídrica,
como Shigella dysenteriae tipo I (KEHOE et al.,2004) e oocisto de Cryptosporidium
parvum (MENDEZ-HERMIDA et al., 2005; GÓMEZ-COUSO; FONTÁN-SAINZ &
ARES-MAZÁS, 2010). McGuigan et al.,(2006), demonstraram que estes oocistos e
os cistos de Giardia murisse tornaram não infecciosos após a exposição de 10 horas
ao método SODIS.
As bactérias entéricas como a Salmonella typhimurium e Shigella fleneri
(BOSSHARD et al.,2009) e Escherichia coli (BOSSHARD et al.,2010a; BOSSHARD
et al.,2010b) também são mortas quando expostas a esta metodologia. Heaselgrave
& Kilvington, (2012) demonstraram que o SODIS simulado em laboratório é eficaz
para a inativação dos vírus entéricos, poliovírus, vírus da hepatite A e
Coxsackievirus, todos de veiculação hídrica.
21
Figura 5 – Método SODIS 1) Usar garrafas lavadas água limpa e detergente. 2) completar a garrafa com a água que vai ser tratada. 3) expor essas garrafas com água a luz solar por 6 horas (deitar as garrafas para uma maior área de superfície de exposição e se certificar que, durante este período elas não ficaram na sombra em momento algum) 4) deixa-las esfriar por uma noite. 5) após esse peíodo a água estará apta para consumo. Modificada. https://en.wikiversity.org/wiki/Drinking_water/ Solar_disinfection
As bactérias entéricas como a Salmonella typhimurium e Shigella fleneri
(BOSSHARD et al.,2009) e Escherichia coli (BOSSHARD et al.,2010a; BOSSHARD
et al.,2010b) também são mortas quando expostas a esta metodologia. Heaselgrave
& Kilvington, (2012) demonstraram que o SODIS simulado em laboratório é eficaz
para a inativação dos vírus entéricos, poliovírus, vírus da hepatite A e
Coxsackievirus, todos de veiculação hídrica.
O manual do SODIS 2016 relata que esta desinfecção solar acontece pelo
efeito sinérgico das radiações infravermelha (IV) e ultravioleta (UV). A radiação IV
aumenta a temperatura da água durante a exposição à luz solar provocando uma
inativação térmica de alguns organismos patogênicos, por exemplo, Vibrio cholera,
Shigella flexneri, Escherichia coli e Salmonela typhimurium (BERNEY et al.,2006) e
de oocistos de protozoários Cryptosporidium parvum (GOMES-COUSO et al.,2010).
22
A luz solar é composta, não só pela luz visível, como também pela radiação
UVA (315-400 nm), UVB (280-351 nm), UVC (100-280 nm) e infravermelho, sendo a
radiação UVC totalmente absorvida pela camada de ozônio. E os raios UVA, por não
serem absorvidos pela camada de ozônio, têm maior incidência sobre o Planeta
Terra.
A radiação UVA age diretamente sobre os microrganismos, gerando
espécies reativas de oxigênio, que causam danos ao DNA, proteínas e lipídeos
(LEITÃO et al., 2005). Berney; Weilenmann & Egli (2006) demonstraram que este
comprimento de onda inativa rapidamente a síntese de ATP e confirmaram o efeito
letal do SODIS em E. coli.
1.2.2 Uso da garrafa PET
Rurr, (2015) relata que as garrafas PETs absorvem em torno de 14% da
radiação UVA e 75% da radiação UVB, demonstrando que a radiação UVA e a
radiação infravermelho são necessárias para que a metodologia SODIS
tenhaelimine os microrganismos.
Como esta metodologia recomenda a utilização de garrafa de polietileno
tereftalato (PET), surgiram dúvidas se a exposição deste material, a uma intensa
irradiação luminosa e ao aumento da temperatura poderia transferir para a água,
substâncias genotóxicas, proveniente do material do qual esta é feita, como por
exemplo: aldeídos, adipato de di-(2-etil hexila), ftalato de di-(2-etil-hexila) e antimônio
(Sb) e colocando em risco a saúde de quem consumisse esta água.
Schmid et al.,(2008) testaram dois plastificantes, que podem ser
encontrados quando ocorre a degradação de um polímero como a garrafa PET: o
DEHA adipato de di-(2-etil-hexila) e o DEHP (ftalato de di-2-etilhexila) e não
encontraram diferenças significativas da migração destes contaminantes das
embalagens para a água a ser consumida, quando as garrafas foram submetidas ao
SODIS, em comparação com as do grupo controle, mesmo que esta metodologia
seja usada por um longo período.
Um catalizador muito usado na fabricação das garrafas PET é o óxido de
antimônio (Sb2O3) e sua lixiviação para dentro do produto armazenado na PET
23
poderia causar risco à saúde (ROMÃO; SPINACÉ & PAOLI, 2009). Porém,
Keresztes et al.,(2009) relataram que a lixiviação deste produto só tem aumento
significativo a uma temperatura maior que 50ºC e Bach et al., (2014) descreveram
que a migração de aldeídos e Antimônio (Sb) para água nas garrafas PET aumentou
somente após 10 dias de exposição a luz solar, o que não é preconizado pelo
método SODIS, e mesmo assim não excedeu os limites estabelecidos pelo
regulamento europeu nº 10/2011.
Contudo Evandri; Tucci & Bolle (2000) detectaram citogenicidade em raiz de
Allium cepa, ao utilizarem água tratada pelo método SODIS, para cultivá-las. Porém
os próprios autores sugerem cautela na extrapolação dos resultados obtidos com
seus experimentos para seres humanos ou outros seres vivos.
Ubomba-Jaswa; Fernández-Ibáñez & Mcguigan, (2010) realizaram teste de
AMES com a água das garrafas PET expostas conforme o sistema SODIS, para
avaliar se compostos genotóxicos poderiam migrar da garrafa PET para a água
contida nela. Os autores não observaram genotoxicidade na cepa de Samonella
typhimurium TA 100, em um grupo em que a água foi trocada diariamente e exposta
ao SODIS. Porém, foi verificada a genotoxicidade no outro grupo, em que a água foi
a mesma durante todo o experimento. Estes autores sugerem que os compostos
genotóxicos poderiam ser voláteis, o que acabariam sendo liberados para o ar no
momento da abertura da garrafa e com isso não apresentariam risco para o
consumo desta água.
Bach et al.,(2014), relataram que a garrafa PET pode sofrer envelhecimento
fotoquímico ao ser exposto ao sol, por ser um polímero que absorve luz solar na
faixa entre 300 e 330 nm, comprimento dentro da faixa da radiação ultravioleta A
(UVA). Em seus experimentos eles concluíram que a água tratada pelo método
SODIS não induz quaisquer atividades citogenotóxicos para as células HepG2, nem
mutagênicas nas cepas de Samonella typhimurium TA 98 e TA 100 o que corrobora
os estudos de Ubomba-Jaswa; Fernández-Ibáñez & McGuigan (2010). Também não
detectaram atividade estrogênica em células de linhagem humana HepG2 ou
antiandrogênica em células de linhagem humana MDA-MB453-kb2, nas suas
condições experimentais.
24
1.2.3 Otimização na metodologia SODIS
Como todos os métodos, o SODIS também tem vantagens e desvantagens.
Como vantagens podemos citar, o baixo custo, fácil aplicabilidade e a alta eficácia
na eliminação de microrganismos patogênicos. Porém, como a técnica depende
exclusivamente da luz solar como fonte de energia, o tempo de tratamento alto, 6
horas de exposição direta à luz solar para que o tratamento seja eficaz, torna o
método não eficiente quando o dia está nublado ou chovendo (HAIDER et al., 2014).
Alguns autores, como por exemplo, Ubomba-Jaswa et al.,(2009), Fisher et
al., (2008) e KEANE, et al (2014) sugerem algumas modificações visando a melhoria
do método SODIS, no que se refere à inativação de microrganismos, tais como:
pintar o fundo das garrafas de preto, para ajudar no aumento da temperatura (Anexo
01), bem como o uso de bolsas de plástico (Figura 6) para um maior aproveitamento
da energia solar devido a camada plana de menor profundidade fazendo com que o
aquecimento desta água armazenada seja mais rápido (SOMMER et al., 1997) e o
uso de reatores ou refletores solares (Figura 7), que consegue desinfectar uma
maior quantidade de água, que as outras metodologias. O problema com as bolsas
são seus altos custos, valor médio de 25 dólares a unidade (https://
www.amazon.com/Puralytics-SolarBag-Water-Purifier-3-Litre/dp/B00OK5BDNE), e
com os refletores a sua disponibilidade no local.
Figura 6 – Modelo de bolsa para utilização com a metodologia SODIS (https://newatlas.com/sol-reservoirs-water-treatment/39063/)
25
Figura 7 – Modelo de um reator solar para utilização com a metodologia SODIS https://ceramics.org/ceramic-tech-today/photocatalysis-for-clean-water-putting-sunshine-to-work-for-health-and-safety.
Outro tipo de otimização desta metodologia e a colocação, na água a ser
tratada, de aditivos como riboflavina, que já foi testada em vírus entéricos
Coxsackievirus B3, B5 e Poliovirus (ALOTAIBI & HEASELGRAVE, 2011) e em cistos
de Entamoeba, Giardia e Naegleria (HEASELGRAVE & KILVINGTON, 2011).
O aditivo dióxido de titânio (TiO2), cujo emprego na inativação de oocisto de
Cryptosporidium parvum se mostrou promissor (MENDEZ-HERMIDA et al., 2007).
O peróxido de hidrogênio (H2O2) que já foi usado na desinfecção de E.coli
(FISHER et al., 2008) e o azul de metileno na desinfecção de Staphylococcus
epidermidis, Deinococcus radiodurans, Escherichia coli e Salmonella typhimurium
(RURR, J. 2015).
Além da utilização de mais de um aditivo ao mesmo tempo, como por
exemplo, o percarbonato de sódio e ácido cítrico verificados na inativação de
Enterococcus e Colifago MS2 (FISHER; IRIARTE & NELSON, 2012). O uso de
26
aditivos pode gerar uma maior eficiência na inativação de microrganismos, mesmo
em dias nublados.
O peróxido de hidrogênio (H2O2) é considerado, por alguns autores, um
algicida ecológico, devido sua composição simples com apenas átomos de oxigênio
e hidrogênio (LI, et al., 2016), decompondo-se em alguns dias (ZHOU et al., 2013) e
não deixando compostos secundários nocivos no meio ambiente (FAN et al., 2014).
Este produto foi testado, não só para inativação de patógenos, como
também para a degradação de microcistinas e para controle de florações.
Além da H2O2, o azul de metileno (AM) também é utilizado por ser solúvel
em água e inodoro. Este produto químico acelera a desinfecção por SODIS devido
sua ação fotodinâmica, ou seja, quando este corante absorve um determinado
comprimento de luz age como um catalisador gerando oxigênio singleto como
espécie reativa de oxigênio (EROs) (LEITÃO et al., 2005; RURR, 2015).
Possui uma toxicidade muito baixa e somente após uma ingestão de 2
mg/Kg é que começam a ocorrer sinais de toxidade em crianças (CLIFTON &
LEIKIN, 2003).
As desvantagens da aplicação do AM é que, apesar do baixo custo, em
muitos lugares é difícil a obtenção deste aditivo, além do problema em se remover o
azul de metileno da água antes do uso e de não se saber os seus efeitos a longo
prazo (FISHER et al., 2008).
Em virtude da necessidade do uso de recursos hídricos, não só para beber
como também na preparação da alimentação em locais sem acesso ao tratamento
convencional de água, por pesquisadores, missões humanitárias e pela própria
população local, existe a necessidade de achar um método eficaz, de baixo custo e
de fácil aplicação.
27
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o método alternativo SODIS (Solar Water Disinfection) para
tratamento de água.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Investigar o efeito do método SODIS aditivado com azul de metileno (AM)
e cloro na diminuição da densidade de Microcystis aeruginosa e redução da
concentração de microcistina-LR
2) Verificar o efeito do método SODIS aditivado com H2O2 e cloro na
inativação de Escherichia coli e Klebsiella Pneumoniae, na diminuição da
densidade de Microcystis aeruginosa e redução da concentração de microcistina-
LR;
28
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Cultivo da Microcystis aeruginosas
No presente estudo usamos uma cepa de cianobactéria do gênero
Microcystis aeruginosa (MIRS-4) produtora da cianotoxina microcistina-LR. Essa
cepa pertence ao banco de culturas do Laboratório de Ecologia e Toxicologia de
Cianobactérias (LETC) do Instituto de Biofísica da Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
Para ao cultivo de Microcystis aeruginosa foi utilizado o meio ASM-1
(GORHAM et al., 1964) com o ajuste do pH para 8,0. Esta cepa foi mantida em
balões de 4L com 3 litros de meio até serem transferidas para um garrafão de vidro
de 13 litros para serem posteriormente utilizadas. (Figura 8)
3.2 Cultivo de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae
Para o cultivo de Escherichia coli (ATCC 25922) e Klebsiella pneumoniae
(ATCC 13883) foi usado o meio CLED (Plastlabor), e as cepas foram repicadas a
cada sete dias para mantê-las viáveis até o dia do experimento.
Figura 8 - Garrafões de vidro e balões com cultivo de Microcistis aeruginosa em meio ASM-1.
29
3.3 Experimento SODIS
3.1.1 Azul de Metileno
Nas garrafas PET de Coca-Cola de 600 mL, reutilizadas e previamente
lavadas, foi colocado um inóculo inicial de 106cel/mL da cepa de Microcystis
aeruginosa, simulando uma floração densa.
Para determinar o seu inóculo inicial foi feito a contagem em microscópio
óptico (Olympus modelo BX51) utilizando uma câmera de contagem Fuchs-
Rosenthal.
Um volume de 250 mL desta floração simulada foi transferido para as
garrafas PET e acrescida do azul de metileno nas concentrações de 0,1 g/L, 0,2 g/L
e 0,4 g/L de azul de metileno (Merck).
As garrafas PET foram expostas diretamente ao sol, das 9 às 15 horas ou
ficaram no escuro, sem azul de metileno ou com as diferentes concentrações deste.
Após este período de 6 horas, permaneceram 15 horas em ambiente escuro,
perfazendo um total de 21 horas.
Após este período, as amostras foram separadas em dois grupos (Tabela 1).
Um sem adição da pastilha de cloro da marca Clor-in na proporção indicada (1
pastilha/L) e outro com adição desta, aguardando-se os 30 minutos recomendado
pelo fabricante (Acuapura).
Tabela 1 – Condições do experimento realizado com Azul de Metileno:
Tratamento sem pastilha de cloro Tratamento com pastilha de cloro
Floração simulada escuro Floração simulada escuro + Cl
Floração simulada + SODIS Floração simulada + SODIS + Cl
0,01 g A.M. escuro 0,01 g A.M. escuro + Cl
0,01 g A.M. + SODIS 0,01 g A.M. + SODIS + Cl
0,02 g A.M. escuro 0,02 g A.M. escuro + Cl
0,02 g A.M. escuro + SODIS 0,02 g A.M. escuro + SODIS + Cl
0,04 g A.M. escuro 0,04 g A.M. escuro + Cl
0,04 g A.M. + SODIS 0,04 g A.M. + SODIS + Cl
30
Decorrendo este período, o volume total das amostras foi congelado em
freezer -20ºC até o momento da extração da microcistina-LR.
Todo o experimento foi realizado em triplicata, na Latitude (22º53’37.399”S)
e Longitude (43º14’29.468”W), sobre plástico de cor preta (Figura 9).
A temperatura local foi medida com o termômetro digital da marca Incoterm
e a intensidade luminosa, medida com o fotômetro LI-250A da marca Li Cor ®.
Figura 9- Experimento com azul de metileno
3.3.2 Peróxido de Hidrogênio
Nas garrafas PET transparente de 600 mL, reutilizadas e previamente
lavadas, foi colocado um inóculo inicial de 108cel/mL de Escherichia coli ATCC
25922 e Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Para se obter este inóculo as colônias isoladas foram retiradas através de
uma alça plástica para inoculação estéril e descartável, inoculadas em 2,5 mL água
estéril e agitadas em um vortex. Para a determinação do inóculo inicial foi utilizada o
padrão 1 da escala de McFarland, o que nos dá aproximadamente 3 x 108 unidades
formadoras de colônias (UFC/mL) e esta turvação foi medida pelo densitômetro, do
fabricante Biomérieux.
Este volume, ao ser transferido para as garrafas PET experimentais, com
volume final de 250 mL, foi obtido uma concentração final de 106 cel/mL, dose
infectante de E. coli (FENG; WEAGANT. & JINNEMAN, 2017) e foi utilizada também
para K. pneumoniae uma vez que a dose infectante para esta bactéria em água é
desconhecida (HAZEN & TORANZOS, 1990)
31
A cepa de Microcystis aeruginosa foi também inoculada com 106cel/mL e
para determinar o seu inóculo inicial foi feito a contagem em microscópio óptico
(Olympus modelo BX51) utilizando uma câmera de contagem Fuchs-Rosenthal.
As garrafas PET foram expostas diretamente ao sol, das 9 às 15 horas ou
ficaram no escuro, sem H2O2 ou com as diferentes concentrações de H2O2 (1,2 g/L, 6
g/L e 12 g/L ), em seguida todas as amostras permaneceram 15 horas em ambiente
escuro, perfazendo um total de 21 horas como no experimento anterior.
Após este período, as amostras foram separadas em dois grupos (Tabela 2),
como no experimento anterior um sem adição de cloro e outro com adição da
pastilha de cloro na proporção indicada (1 pastilha/L), aguardando-se os 30 min
recomendados pelo fabricante.
Tabela 2 – Condições do experimento realizado com peróxido de hidrogênio:
Tratamento sem pastilha de cloro Tratamento com pastilha de cloro
Floração simulada escuro Floração simulada escuro + Cl
Floração simulada + SODIS Floração simulada + SODIS + Cl
1,2 g/L H2O2 escuro 1,2 g/L H2O2 escuro + Cl
1,2 g/L H2O2 + SODIS 1,2 g/L H2O2 + SODIS + Cl
6 g/L H2O2 escuro 6 g/L H2O2 escuro + Cl
6 g/L H2O2 + SODIS 6 g/L H2O2 + SODIS + Cl
12 g/L H2O2 escuro 12 g/L H2O2 escuro + Cl
12 g/L H2O2 + SODIS 12 g/L H2O2 + SODIS + Cl
Decorrido este período, foi retirada uma alíquota de 1 mL para a
determinação de clorofila (μg/L) pelo fluorômetro Phyto-PAM (Heinz WalzGmbH),
equipado com a unidade de detecção PHYTO-EDF, este equipamento analisa a
fluorescência da amostra
Um volume de 100 mL de cada amostra, também foi retirado, e colocado em
sacos Thio-Bag® (Anexo 02) com o reagente Colilert® (Anexo 03) para análise das
bactérias, e incubados a 35°C±0.5°C por 24 horas (Anexo 04), seguindo a
recomendações do fabricante (IDEXX).
32
O volume restante foi congelado em freezer a -20oC até o momento da
extração da microcistina-LR.
A temperatura local foi medida com o termômetro digital da marca Incoterm
e a intensidade luminosidade, medida com o fotômetro LI-250A da L marca Li Cor ®.
Todo o experimento foi realizado em triplicata, sobre plástico de cor preta
(Figura 10).
Figura 10 - Experimento com Peróxido de Hidrogênio.
3.4 Extração e pré-purificação de microcistina-LR
Todas as amostras experimentais e controle sofreram congelamento duas
vezes, para o total rompimento celular, e foram filtradas em filtros de 0,45 µm
(Schleicher & Schuell).
As amostras então foram pré-purificadas em cartucho de fase sólida (SPE)
strata-x33 (Phenomenex). Após ativação do cartucho com 10 mL de metanol 100% e
10 mL de água ultra pura (Milli-Q®), o volume total da amostra foi eluida e em
seguida lavado com 10 mL de água ultra pura (Milli-Q®), 10 mL de metanol a 20% e
finalmente as amostras foram eluídas com 40 mL de metanol 100%.
Esta última fração foi recolhida e colocada no evaporador de nitrogênio com
chapa aquecedora para evaporação total. Após completa secura, a amostra foi
ressuspensa em 1 mL de metanol 100% grau HPLC (reconstituição para
microcistina-LR), filtrada em filtro com membrana de nylon diâmetro de 13 mm de
diâmetro de poro 0,22 µm, Marca Analítica e acondicionada em tubos de 2 mL tipo
eppendorf no freezer -20 ºC até o momento da análise.
33
2 Reagentes fornecidos pelo kit ELISA utilizado
3.5 Quantificação da concentração da microcistina-LR
A quantificação da concentração de microcistina-LR foi feita por ELISA,
utilizando o Kit do fabricante Beacon Analytical Systems Inc. (Estados Unidos),
segundo o protocolo do mesmo, o que foi feito da seguinte forma:.
Os reagentes do kit e as amostras firam estabilizados à temperatura
ambiente. A solução de lavagem2 foi preparada acrescentando 5 mL do concentrado
100X adicionado a 495 mL de água deionizada em um frasco com capacidade para
500 mL.
As tiras de poços foram retiradas da embalagem e colocadas no suporte de
microplacas apropriado e 50 µL de Conjugado Enzimático2 foram colocados em
cada poço, usando uma pipeta com ponteiras descartáveis. Após, foi acrescentado
50 µL dos Calibradores2, Controle Positivo2 e amostras nos seus respectivos poços
de ensaio. e 50 µL de Solução Anticorpo de Microcistina2, foi acrescentada em cada
poço, sendo a ponteira da pipeta trocada para cada elemento diferente que foi
pipetado.
A placa contendo as tiras foi agitada suavemente com movimentos para trás
e para frente por 30 segundos para homogeneizar a solução contida nos poços.
Após este procedimento, a placa foi incubada por 30 minutos à temperatura
ambiente.
Após a incubação, o conteúdo dos poços, foi desprezado, e os poços foram
lavados com a solução de lavagem2 por 5 vezes, após este procedimento, a placa foi
invertida sobre um papel absorvente, com a finalidade de se remover a maior
quantidade possível da solução de lavagem.
Após a lavagem, 100 µL de Substrato2 foram acrescidos em cada poço e a
placa, novamente agitada gentilmente por 30 segundos, incubada novamente por 30
minutos à temperatura ambiente.
Após este período 100 µL de Solução Stop2 foram colocados em cada poço
de teste, e a placa novamente agitada gentilmente por 30 segundos, para
34
homogeneizar o conteúdo dos poços. Em seguida a análise foi realizada na leitora
de placas da marca Hydex a 450 nm.
3.6 Análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada por teste ANOVA três fatores
(escuro x SODIS; concentrações dos aditivos e presença e ausência da pastilha de
cloro), post-test Tukey, p < 0,01 e n = 3. O programa utilizado foi o graphpad Prism
7.
35
4. RESULTADOS
Os dados da temperatura local, Latitude (22º53’37.399”S) e Longitude
(43º14’29.468”W), e da intensidade luminosidade nos dias dos experimentos com
azul de metileno estão demonstrados nos quadros 1, 2 e com peróxido de
hidrogênio nos quadros 3 e 4.
Quadro 1 – Temperatura do ambiente (º C) do dia do experimento com azul de
metileno.
9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h
25,7 26,5 30,3 37,0 36,4 36,0 35,3
Quadro 2 – Intensidade luminosa (µmol s/1 m/2) do dia do experimento com azul de
metileno.
9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h
1185,2 1218,9 1310,5 1762,2 1666,1 1429,8 1270,7
Quadro 3 – Temperatura do ambiente (º C) do dia do experimento com peróxido de
hidrogênio.
9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h
24,2 26,9 31,5 37,8 37 35,9 35,1
Quadro 4 – Intensidade luminosa (µmol s/1 m/2) do dia do experimento com
peróxido de hidrogênio.
9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h
914,7 1266,8 1270,7 1755,8 1690,8 1373,7 1241,3
36
Os experimentos com o azul de metileno na degradação de microcistina-LR
no escuro e com a metodologia SODIS separadamente não tiveram diferença
significativa entre eles, o mesmo ocorrendo com o uso ou não da pastilha de cloro.
(Figura 11).
Os resultados obtidos com reagente Colilert® (Tabela 3) demonstraram que
ambas as cepas não foram inativadas nas amostras que não foram expostas a
metodologia SODIS, nem receberam H2O2, na presença ou na ausência da pastilha
de cloro.
A cepa de E.coli se mostrou mais sensível, pois, exposta ao SODIS
acrescida ou não da pastilha de cloro ou das diferentes concentrações de peróxido
de hidrogênio, esta bactéria foi inativada.
A cepa K. pneumoniae, mostrou um resultado diferente (Tabela 3). Esta
bactéria só foi inativada no escuro somente na concentração de 12 g/L H2O2
acrescida da pastilha de cloro, e quando exposta a luz solar a partir da concentração
de 6 g/L H2O2 com e sem a presença do cloro.
37
0
0,0
1
0,0
2
0,0
4 0
0,0
1
0,0
2
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4
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
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5 0 0
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C
Figura 11 – Concentração de microcistina-LR nos dois tratamentos (Escuro e SODIS) sem aditivo (0) e com as diferentes concentrações de AM. As letras diferentes indicam diferenças significativas (ANOVA três fatores, Teste de Tukey, P<0,01, Os dados estão expressos em média e desvio padrão).
38
Tabela 3 – Resultado do teste Colilert® .
K. pneumoniae E.coli
Amostras Amostra
Tratamento 1 2 3 1 2 3
Floração simulada escuro + + + + + +
Floração simulada escuro + Cl + + + + + +
Floração simulada SODIS + + + - - -
Floração simulada SODIS + Cl + + + - - -
1,2 g/L H2O2 escuro + + + - - -
1,2 g/L H2O2 escuro + Cl + + + - - -
1,2 g/L H2O2 SODIS + + + - - -
1,2 g/L H2O2SODIS + Cl + + + - - -
6 g/L H2O2 escuro + + + - - -
6 g/L H2O2 escuro + Cl + + + - - -
6 g/L H2O2 SODIS - - - - - -
6 g/L H2O2 SODIS + Cl - - - - - -
12 g/L H2O2 escuro + + + - - -
12 g/L H2O2 escuro + Cl - - - - - -
12 g/L H2O2 SODIS - - - - - -
12 g/L H2O2 SODIS + Cl - - - - - -
Legenda: (+) Presença da cepa bacteriana (-) Ausência da cepa bacteriana.
39
A concentração de microcistina-LR decresceu significativamente em relação
ao controle em todos os experimentos aditivados com peróxido de hidrogênio.
Não foi verificada diferença significativa entre a concentração de
microcistina-LR dos controles no escuro, com ou sem adição de cloro e no SODIS
com e sem o cloro (Figura 12).
Ao se comparar somente os tratamentos de 1,2 g/L H2O2 das amostras que
ficaram no escuro, não existe diferença significativa da concentração de
microcistina-LR entre elas, e estas concentrações são iguais estatisticamente a
condição 6 g/L com o uso do cloro e os tratamentos realizados com as
concentrações do peróxido de hidrogênio acrescidos ou não da pastilha de cloro, na
metodologia SODIS (p < 0,01).
Na comparação dos tratamentos no escuro com H2O2 à 6 g/L, eles tiveram
uma diferença significativa entre si, sendo a condição sem cloro igual a condição 12
g/L (sem cloro) e a condição com cloro igual 1,2g/L (com cloro), como dito
anteriormente.
Em relação ao tratamento com 12 g/L de H2O2 não houve diferença
significativa entre as amostras que ficaram no escuro com ou sem o uso da pastilha
de cloro. A condição 12 g/L (sem cloro) ficou estatisticamente igual a concentração
de 6 g/L (sem cloro). Porém em relação aos outros tratamentos tiveram uma
diferença significativa (p<0,01).
Quando a metodologia SODIS foi aplicada, as amostras expostas ao sol e
sem o uso do peróxido de hidrogênio ficaram estatisticamente iguais ao controle no
escuro. Porém diferentes das amostras que receberam este aditivo (p< 0,01).
Todas as amostras acrescidas de H2O2 (com ou sem cloro) e expostas ao
SODIS ficaram estatisticamente iguais entre si e também em relação às amostras
1,2 g/L no escuro (com ou sem cloro), o mesmo ocorrendo para as amostras da
concentração 6g/L no escuro (com cloro).
A concentração de clorofila-a diminuiu significativamente em todas as
amostras em relação ao controle que ficou no escuro sem adição de cloro e H2O2
(Figura 13).
40
01.2 6
12 0
1.2 6
12
0 .0
0 .2
0 .4
2
4
6
8
1 0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
P e ró x id o d e H id ro g ê n io
C o n c e n tra ç ã o d e H 2 O 2 (g /L )
Co
nc
en
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E s c u ro S O D IS
a a
b
b
b
c
c
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a
a
b
b bb b
b
C
Figura 12 – Concentração de microcistina-LR nos dois tratamentos (Escuro e SODIS) sem aditivo (0) e com as diferentes concentrações de H2O2. As letras diferentes indicam diferenças significativas (ANOVA três fatores, Teste de Tukey, P<0,01, Os dados estão expressos em média e desvio padrão).
41
01
,2 6 1
2 01
,2 6 1
2
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
C lo ro fila -a
C o n c e n tra ç ã o d e H 2 O 2 (g /L )
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µg
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a
b
bb
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c
c
d d
C
Figura 13 – Concentração de clorofila nos dois tratamentos (Escuro e SODIS) sem aditivo (0) e com as diferentes concentrações de H2O2. As letras diferentes indicam diferenças significativas (ANOVA três fatores, Teste de Tukey, P<0,01, Os dados estão expressos em média e desvio padrão ).
nd- não detectado
42
Em relação ao controle, as amostras que ficaram no escuro, aditivadas com
H2O2 e também naquela que foi acrescentada apenas o cloro, tiveram uma redução
na quantidade de clorofila (p< 0,01).
As amostras aditivadas apenas com cloro (escuro) ficaram estatisticamente
iguais a todas as outras que foram aditivadas de peróxido de hidrogênio (escuro) e
que foram igualmente acrescidas da pastilha de cloro, porém diferente das demais.
As concentrações de 1,2 g/L e 12 g/L (sem cloro) ficaram estatisticamente
iguais entre si , o mesmo ocorrendo quando foi acrescido o cloro. E as concentração
6 g/L e 12 g/L (sem cloro) ficaram diferentes das demais, porém estatisticamente
iguais entre si (p< 0,01).
Os tratamentos realizados com a metodologia SODIS, aditivados ou não
com peróxido de hidrogênio, não apresentaram diferença significativa entre eles.
Mas foi verificada uma diminuição na concentração de clorofila-a até o limite de
detecção do método.
43
5. DISCUSSÃO
A qualidade da água a ser consumida é de vital importância para o ser
humano, pois patógenos e algumas toxinas, como as microcistinas, podem ser
difundidas pela água. Vários autores demonstraram em seus trabalhos a toxicidade
da microcistina (CHORUS & BARTRAM, 1999; PUDDICK et al., 2014; STEWART et
aL., 2006), e Zhou (2013) a descreve como uma promotora de tumor de fígado,
portanto a necessidade do tratamento da água.
Para uma tropa acampada ou mesmo em um estacionamento temporário, a
água para consumo é coletada diretamente de uma fonte local, muitas das vezes
sem nenhum tipo de tratamento e sem a possibilidade de tratá-la adequadamente,
assim, tem-se a necessidade de uma otimização do tratamento deste recurso hídrico
que seja simples, barato e de fácil emprego, como o SODIS (Anexo 05).
A metodologia SODIS pode ser otimizada com o uso de aditivos.
Encontramos na literatura algumas modificações visando a melhor eficiência deste
método, por exemplo, com a utilização do azul de metileno e do peróxido de
hidrogênio (H2O2), este ultimo considerado por alguns autores como ecologicamente
correto pois ao se decompor gera apenas átomos de H e O (LI, et al., 2016), e já foi
testado tanto na inativação de microrganismos patogênicos (FISHER et al.,2008),
como degradação de microcistina (CORNISH; LAWTON; ROBERTSON, 2000),
como dito anteriormente.
A literatura descreve o AM como um agente antimicrobiano, eficiente na
inativação de Staphylococcus aureus (ZOLFAGHARI et al., 2009) vírus da hepatite C
e o vírus HIV-1 (MÜLLER-BREITKREUTZ; MOHR, 1998) entre outros
microorganismos como E. coli, S. typhimurium, S. epidermidis e D. radiodurans
(RUSS, 2015), por ser um agente fotossensibilizador, capaz de intensificar a
produção de ERO.
Rurr (2015) conseguiu inativar as bactérias gram positivas (S. epidermidis e
D. radiodurans) em menos de 30 minutos, e as gram negativas (E.coli e S.
typhimurium) em 30 minutos utilizando concentrações de 100 e 200 ng/mL,
demonstrando com isso que o AM associado à metodologia SODIS é eficiente para
44
eliminação de bactérias presentes na água, com redução do tempo de exposição
solar.
Partindo das concentrações de 100 e 200 ng/mL de azul de metileno, e
aumentando a concentração deste aditivo até as concentrações utilizadas neste
presente estudo, foi observado que, apesar do AM ser decomposto pela radiação
solar, passando do tom azulado característico, para o incolor (LIBERATTI et al.,
2014), não verificamos isso em nossos experimentos, pelo contrário a coloração azul
permaneceu. Isto tornaria esta água difícil de ser consumida pelas pessoas, devido
à rejeição por parte destes, uma vez que as características organolépticas da água
são as mais básicas para que haja o consumo da mesma.
Infelizmente não foi possível fazer a análise de clorofila-a neste experimento,
uma vez que a cor azul permaneceu inalterada e com isso não podemos definir se o
AM foi ou não capaz de romper as células, porém, mesmo que as células estejam
mortas, a quantificação da microcistina-LR de todos os tratamentos das três
concentrações de AM, com o uso ou não da pastilha de cloro, quando exposta a
metodologia SODIS ou não, não demonstraram nenhuma diferença significativa em
relação ao controle, ou seja, o AM não foi capaz de degradar a toxina (Figura 11). E
o SODIS sozinho não foi capaz de degradar esta toxina (CAREY, et al.,2011 ).
Como o azul de metileno não foi capaz de degradar a toxina, foi utilizado o
peróxido de hidrogênio (H2O2) como o aditivo a ser testado.
Com o peróxido de hidrogênio realizamos experimentos com as cepas de
Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae para avaliarmos se haveria inativação
destas empregando a metodologia SODIS, além da degradação da microcistina-LR.
Os resultados obtidos com reagente Colilert® (Tabela 3) demonstraram que
ambas as cepas que permaneceram no escuro não foram inativadas nas amostras
apenas com a pastilha de cloro, uma possibilidade para isto ter ocorrido é o fato de
estarmos utilizando floração simulada, e não água contaminada, é o meio de cultura
utilizado no cultivo de Microcystis aeruginosa ter garantido uma maior sobrevivência
das cepas pois é rico em nutrientes.
45
Em relação aos experimentos realizados com o peróxido de hidrogênio, a
menor concentração de H2O2 no escuro com ou sem o uso do cloro foi suficiente
para inativar a cepa de E. Coli testada, porem não foi suficiente para inativar a cepa
da K. pneumoniae, esta inativação só foi conseguida na maior concentração de H2O2
utilizada e acrescida da pastilha de cloro.
Em relação inativação de E. coli, verificamos que a metodologia SODIS não
aditivada com H2O2, foi suficiente para completa eliminação deste patógeno,
corroborando o descrito por Berney et al.,(2006) enfatizando a necessidade da luz
UV para esta inativação (Tabela 3).
Resultados semelhantes foram descritos por Berney; Weilenmann & Egli,
(2006) que confirmaram o efeito letal do SODIS, ao expor células de E. coli, tanto
sob a luz solar quanto sob lâmpada com radiação UVA por 6 h. Bosshard; et al.,
(2010), também com experimentos utilizando lâmpadas UVA, demonstraram que a
capacidade de regeneração da célula de E. coli fica danificada mesmo após a
radiação ter cessado e Bosshard; et al., (2010) demonstraram que a lâmpada UVA
utilizada corresponderia a 2 h de luz solar natural, sendo isto o suficiente para
inativar esta bactéria.
Quando utilizamos o H2O2 como aditivo, em qualquer das concentrações
utilizadas, e o Cl como desinfectante, também verificamos uma inativação da E. coli.
FISHER et al., (2008) utilizando garrafas PET e luz solar, demonstraram que esta
cepa foi mais rapidamente inativada quando o SODIS foi aditivado com H2O2.
Apesar da OMS através do Guidelines for drinking-water quality, WHO,
(2011) aceitar mundialmente a E. coli com indicadora de contaminação da água por
poluição fecal e que a maioria dos trabalhos científicos utilizam este microrganismo
em seus experimentos, de sensibilidade bacteriana à irradiação UV artificial ou
natural, talvez esta cepa possa não ser o bioindicador mais adequado para os testes
de eficácia com esta metodologia (BERNEY; WEILENMANN & EGLI, 2006), uma
vez que, neste estudo demonstramos que a cepa K. pneumoniae, se mostrou mais
resistente (Tabela 3), sendo inativada na metodologia SODIS, com 6 g/L de peróxido
de hidrogênio com ou sem a utilização do Cl. Esta diferença de sobrevivência
também ocorre no meio ambiente (BURTON, GUNNISON & LANZAL, 1987).
46
Em relação à degradação da microcistina-LR os controles no escuro com ou
sem cloro não demonstraram diferença significativa provando que a pastilha de cloro
comercial que foi usada, conforme a instrução do fabricante (1 mg/L, durante 30
minutos) não teve efeito sobre a degradação desta molécula.
Fan et al., (2014) usando cultura de M. aeruginosa, com concentração inicial
de 53 μg/L de MCs, verificaram um decréscimo na concentração desta molécula
para 4 μg/L após a adição de 5 mg/L de cloro por 30 min, uma concentração muito
acima da usada neste trabalho (1 mg/L) e não recomendada pelo fabricante.
Em relação ao uso de H2O2, Fan et al., (2014), demonstraram que com
concentrações de até 51 mg/L, 90% das células cultivadas de M. aeruginosa
(cepa338) perderam a integridade da membrana, ocorrendo uma degradação da
concentração inicial de microcistina total de 52 µg/L para 5 µg/L porém, com um
tempo maior de exposição (dois dias). No presente estudo conseguimos o mesmo
efeito de redução de microcistina-LR, porém, a concentração de H2O2 utilizada foi
muito maior (duas a três ordens de grandeza), a concentração inicial de MCs
também foi maior (partimos de 200 µg/L) e o tempo de exposição menor (6 h). He et
al., (2012), também relataram que a adição deste agente oxidante melhora a
eficiência de degradação de microcistinas e seu uso aconselhável, não só para
controlar cianobactérias, como também remover esta cianotoxina.
No tratamento realizado no escuro, em relação à concentração de 12 g/L
verificamos um nítido aumento da microcistina-LR em relação a duas outras
concentrações (figura 12), esta quantidade a mais pode ter inibido a degradação
desta toxina, pois alguns autores relatam que existe uma dose ótima de peróxido de
hidrogênio para remoção de microcistina-RR purificada, se esta dose fosse
ultrapassada, a H2O2 exibia um efeito inibitório.(LI, et al., 2009 e QIAO,et al., 2005)
Liu et al., (2017) relataram que nos experimentos que eles realizaram a
dosagem para eliminar colônias de Microcystis menores que 25 µm foi de 5 mg/L e
colônias maiores a dosagem foi de 20 mg/L de H2O2. Após o tratamento, as
concentrações extracelulares de MCs aumentaram enquanto a concentração de
MCs intracelulares diminuiram, principalmente em colônias maiores que 25 µm.
Sendo assim, as concentrações utilizadas foram capazes de matar as
cianobactérias, mas não foram suficientes para degradar as toxinas. Desta forma, os
47
autores sugerem a utilização do peróxido de hidrogênio onde as florações estejam
no início, com a presença de colônias menores.
Huo et al., (2015) ao expor M. aeruginosa (105 células/mL) à concentrações
até 60 mg/L de H2O2 por 3,5 h, sob luz solar simulada, conseguiram romper ou
danificar 99% das células em todos os tratamentos. Porém, as concentrações de
MCs totais, após esta exposição, ainda eram de 77% da concentração inicial,. No
presente estudo observamos a degradação das MCs, para os limites preconizados
pela OMS, mesmo com a densidade celular 10 vezes maior do que a utilizada por
Huo e colaboradores (2015), mas cabe ressaltar que também foi utilizada uma
elevada concentração de H2O2.
Matthijs et al., (2012) demonstraram um colapso de 99% da população de
cianobactérias em poucos dias com a aplicação de 2 mg/L H2O2 em um lago, porém
só conseguiu degradação da microcistina após 2 dias. Eles também relataram
poucos impactos negativos nas espécies de fitoplâncton eucariótico, zooplâncton e
macrofauna, ou seja, as cianobactérias são mais sensíveis e uma menor
concentração de H2O2 poderia eliminá-las.
Para verificar a eficiência da luz solar na degradação de MCs, Tsuji et
al.,(1994) realizaram experimentos com esta cianotoxina dissolvida em água
destilada, porém esta se mostrou estável por um período de 26 dias. E Carey et al
(2011), ao realizar experimentos com garrafas PET sem nenhum tipo de aditivo, não
conseguiram degradar esta toxina. No presente trabalho, a utilização do método
SODIS, neste caso trabalhando com cultivo de M. aeruginosa, também não foi capaz
de degradar MCs sem a presença de um aditivo (Figura 12),
Em 2000, Cornish; Lawton; Robertson, verificaram que a degradação
fotocatalítica de uma solução aquosa de microcistina-LR, sob lâmpada UV e
concentrações de 0,01, 0,1 e 0,6 % (v/v) de H2O2, foi maior após a adição deste
aditivo, sendo também eficaz na remoção de microcistina-RR de fontes de água
potável (QIAO et al.,2005). Nossos experimentos corroboraram estes dados, porém
utilizando concentrações um pouco maiores de H2O2 e sob a metodologia SODIS.
A qualidade da luz UV também influencia na degradação de microcistinas (LI
et al.,2009; 2016). He et al., (2012) usando luz artificial UV-C junto com H2O2
48
sugerem que uma combinação desta energia aliada a uma concentração acertada
de H2O2 representaria uma solução viável para a remoção de toxinas de algas da
água. Esta evidência foi corroborada por Freitas et al., (2013) que observaram a
eficiência na remoção da MC-LR com a utilização de luz artificial UV-C junto com
H2O2. Estes autores também sugeriram o uso da luz solar no lugar da radiação UV
artificial para reduzir os custos e por ser este um método ecologicamente correto.
Wang et al., (2015) relataram que o efeito de luz artificial UVC/H2O2 usados
concomitantes seria um método de controle de M. aeruginosa além da degradação
de microcistina. Além destes trabalhos, Zong; Sun & Sun, (2013) relatam que a
radiação de uma lâmpada de UV acrescida de H2O2 demonstrou ser eficiente na
degradação de 100 mg/L de microcistina-LR, porém vários subprodutos foram
formados com alguma toxidade biológica.
No presente trabalho, porém, não foi possível verificar se os prováveis
subprodutos existentes seriam tóxicos, mas é sempre importante ter em mente que
qualquer tratamento que se faça numa água para posterior consumo é necessário
verificar se houve a formação de subprodutos potencialmente tóxicos.
Em relação a clorofila-a, Zhou et al., (2013) em ensaios de bancada,
trataram culturas de Microcystis (106 células/mL) com 0,5 mM de H2O2 e após 96 h
de exposição demonstraram uma diminuição na concentração de desta, indicando a
morte celular. Liu et al.,(2017) usando concentrações de 5 e 20 mg/L de peróxido de
hidrogênio e partindo de uma concentração de 60 µg/L de clorofila-a conseguiram
uma redução significativa desta após 72 h, ressaltaram também que a quantidade de
H2O2 e o tamanho da colônia de Microcystis tiveram influencia no resultado.
Também verificamos em nossos experimentos uma diminuição significativa da
clorofila-a em relação ao controle após a adição de H2O2 em qualquer das três
concentrações testadas (Figura 13). Vale ressaltar que em nossos experimentos,
partimos de uma concentração bem maior de clorofila-a (1745,61 ug/L) e com isso,
maiores concentrações de H2O2 foram utilizadas para fazer esta degradação,
quando em experimentos sem a utilização de luz solar.
Qian et al.,(2010) em experimentos com cultura de M. aeruginosa tratada
com H2O2 (100µM) sob lâmpada UVA, com 72h de exposição demonstraram uma
49
sobrecarga do sistema antioxidante, pelo aumento do nível de EROs, resultando na
morte desta cianobacteria, além da diminuição de maneira dose-dependente da
clorofila-a. sugerindo assim o uso deste químico para controlar florações de M.
aeruginosa.
No controle SODIS, sem a adição de qualquer aditivo, não foi detectada
clorofila-a (Figura 13), o que pode ter ocorrido foi a foto-oxidação da clorofila-a, mas
as células ainda estarem vivas, pois não foi observada a redução da microcistina-LR
(Figura 12). No entanto, em qualquer das concentrações de H2O2 utilizadas no
presente estudo, além de não ser detectada a clorofila-a, as MCs também ficaram
dentro do limite preconizado pela OMS, após as 6 horas de exposição ao sol.
Confirmando a morte celular da cepa de M. aeruginosa utilizada e a degradação das
MCs. Portanto, a junção do método SODIS com H2O2 mesmo na menor
concentração testada foi suficiente para que as células morressem e que esta
degradação ocorresse.
Nosso estudo segue uma linha diferente dos outros trabalhos, pois estamos
falando de remoção de Microcystis aeruginosa e microcistina-LR em água para
consumo humano e não da remoção desta no meio ambiente, onde a existência de
metais como o ferro e manganês em concentrações maiores que no meio de cultura
utilizado, faz com que o processo de degradação e rompimento celular seja diferente
daquela que ocorre na metodologia usada neste estudo (MATHIJS et al, 2012).
É importante colocar que a concentração de H2O2 usada no presente estudo
foi muito acima do proposto por outros, uma vez que utilizamos uma concentração
celular muito elevada, encontrada em florações muito densas. Além disso, sabe-se
que linhagens produtoras de MCs são mais tolerantes ao H2O2 do que os genótipos
não produtores (DZIALLAS & GROSSART, 2011), assim, os altos valores de
peróxido de hidrogênio foram utilizados para chegar a níveis aceitáveis de
concentração de microcistina dentro do aceitável pela OMS para consumo humano.
As microcistinas liberadas, após o uso de H2O2, são degradadas pelo meio
ambiente, um processo que pode levar dias até mesmo semanas, o que pode
causar um risco na utilização desta água (BARRINGTON, REICHWALDT &
GHADOUANI, 2013).
50
6. CONCLUSÃO
- O AM não degradou a microcistina-LR e sua coloração azul repele o
consumo desta água pelas pessoas
- SODIS aditivado com 6 g/L de H2O2 com o uso da pastilha de cloro, foi o
melhor tratamento para eliminação dos bioindicadores e na degradação da
microcistina-LR.
- Nosso trabalho não é uma solução final para o problema de microcistina-
LR dissolvida em água para consumo humano, e sim um início do desenvolvimento
de uma metodologia pra garantir uma melhoria na degradação desta toxina na água
para consumo humano.
7. RECOMENDAÇÕES
- Verificar os subprodutos formados neste tratamento alternativo.
- Pesquisar se outras cepas bacterianas seriam inativadas pela mesma
metodologia.
- Investigar se cianobactérias e cianotoxinas, diferentes das avaliadas neste
estudo, teriam a mesma resposta com a mesma metodologia.
- Avaliar este tratamento alternativo usando produtos extraídos de plantas
como aditivo.
51
7. REFERENCIAS
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59
Anexo 01 – Temperatura do líquido de dentro da garrafa PET.
Como a metodologia usada relata que um aumento da temperatura da água
de dentro da garrafa pet melhora a desinfecção, foram testados dois métodos para
elevar esta temperatura do líquido de dentro da garrafa.
Primeiramente pintamos o fundo e uma das laterais da garrafa PET com
tinta preta, e foram realizados alguns testes para saber se a tinta ficaria lá por tempo
suficiente para uso e reuso destes recipientes. O que não ocorreu, pois, ao ser posto
em prática esta técnica vi-se que a tinta por qualquer arranhão saia, o simples
colocar e tirar de dentro da mochila do combatente foi suficiente para que a tinta
saísse o que poderia acarretar em não alcançar o efeito desejado de aumento da
temperatura interna da garrafa. E pelo fato de que numa batalha poderia não existir
tinta preta para pintar a garrafa. Como esta tentativa não se mostrou prática para o
reuso das garrafas PET optou-se por outra metodologia, que foi a colocação de um
saco preto foi embaixo das garrafas.
Este método se mostrou mais eficiente, pois não tivemos os problemas com
a saída da tinta, nem com a posição em que as garrafas eram colocadas, e a
possibilidade de se conseguir algum objeto de cor preta num confronto era mais
plausível.
Para se verificar se esta metodologia aumentaria a temperatura do líquido
dentro da garrafa, foram colocadas três garrafas pet em cima de um saco plástico de
cor preta e três garrafas pet no chão de cimento. A temperatura da água de dentro
das garrafas foram medidas de hora em hora das 9h da manhã até as três horas da
tarde. Perfazendo as seis horas preconizadas no manual do SODIS (Figura AN01.1).
60
Figura AN01.1 – Gráfico da temperatura do ambiente e das temperaturas da água dentro das garrafas
PET que estavam sobre o saco preto e as que não estavam.
9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h
Ambiente 25,7 26,5 33,1 38,1 38 37,8 37
Água acondicionada em garrafaPET sobre saco preto
23,7 24,7 38 45 53,1 54 54,8
Água acondicionada em garrafaPET sobre o solo
23,7 24,2 37,1 43,8 49,1 50 50
0
10
20
30
40
50
60
70
Temperaturas
Ambiente
Água acondicionada em garrafa PET sobre saco preto
Água acondicionada em garrafa PET sobre o solo
61
Anexo 02 – Bolsa para coleta de água - modelo THIO-BAG.
AN02.1 - Bolsa modelo THIO-BAG com o comprimido de tiossulfato de sódio. É uma embalagem plástica fabricado com polietileno transparente, estéril. Possui em seu interior um comprimido de 10 mg de Tiossulfato de Sódio (Na2S2O3) que age sobre o cloro, se este estiver presente na amostra, neutralizando. Evitando, com isso, que este composto químico desfavoreça o crescimento de bactérias presentes na água, o que poderia gerar resultados falsos negativos.
62
Anexo 03 – Protocolo de uso do Colilert® (IDDEX)
O teste é utilizado para detecção de coliformes totais e Escherichia coli em
águas, apresentando resultados em 24 horas e possui uma sensibilidade de
detecção de coliformes e E. coli até 1 organismo/100 mL. O teste utiliza dois
nutrientes indicadores, o o-nitrofenil-β- D-galactopiranosida (ONPG) que permite
quantificar coliformes totais, pois estas bactérias possuem a enzima β-galactosidase
que lhes dá a capacidade de metabolizar o ONPG, produzindo onitrofenol que e
altera a cor do meio de incolor para amarelo. E o 4-metil-umbeliferil-β-D-glucoronida
(MUG) que permitem quantificar E. coli, pois esta usa a enzima Beta-Glucoronidase
para metabolizar este indicador, e produzir fluorescência quando exposta a luz
ultravioleta.
Segundo o fabricante, a incidência de falso-positivos e falso-negativos é
baixa uma vez que a maioria dos não coliformes não possui as enzimas β-
galactosidase e Beta-Glucoronidase, e consequentemente não conseguem se
multiplicar neste meio de cultura e que a fórmula do Colilert® age seletivamente
sobre os outros, inibido o seu crescimento.
A leitura Positiva se dá quando há mudança de cor de incolor para amarelo,
confirmando a presença de coliformes totais, e se além de amarelo apresentar
fluorescência azul, sob a luz ultravioleta, indica a presença de Escherichia coli na
amostra.
Para fazer a análise da água é preciso somente colocar 100 mL da amostra
na bolsa THIO-BAG, despejar o conteúdo do reagente fornecido no kit e incubar a
35ºC por 24 hs.
63
Anexo 04 – Bolsas THIO-BAG com amostras de água e reagente Colilert®.
Figura AN04.1 Sacos THIO-BAG com amostras de água e reagente Colilert®, após a incubação a 35º C por 24h. Ambos submetidos a luz ultravioleta (UV). Positivo para E. coli a esquerda (cor azul emitida quando colocada sobre luz UV) e positivo apenas para coliformes totais a direita (coloração amarela).
64
1 Parte do teatro de guerra necessária à condução de operações militares de grande vulto, para o
cumprimento de determinada missão e para o conseqüente apoio logístico.
Anexo 05 – Simulação de uma situação de combate.
A guerra do golfo ocorrida entre agosto de 1990 e fevereiro de 1991,
patrocinada pela ONU, contou com o apoio de grandes potencias econômicas
mundiais, e mesmo assim tiveram problemas de logística para entrega de comida e
suprimentos de água.
A logística militar que deveria entregar a água acondicionadas em garrafas
PETs falhou e a solução encontrada pelas forças de ocupação, foi localizar fontes de
água., que são escassas nesta localização geográfica e as mantê-las fortemente
vigiadas, ou seja, perder homens na frente de batalha para algo, não considerado
como atividade militar, porém sem esta patrulha, perderiam seu suprimento deste
recurso hídrico. (HYAMS et al., 1995).
Como no exemplo acima, o Exército Brasileiro pode vir a atuar em situações
graves e excepcionais, como no caso de uma declaração de guerra, e este Teatro
de Operações1 poderia ocorrer em solo brasileiro.
Numa situação hipotética, em uma zona de combate modelar, teríamos o
Serviço de Intendência realizando a logística militar, como o transporte de pessoal e
de suprimentos (uniformes, equipamentos individuais, alimentação, etc.) seja por via
terrestre ou aérea e a Arma de Engenharia montando e mantendo postos de
suprimento de água (Figura AN05.1).
Estes postos são acoplados a um equipamento de purificação de água e
possuem dois tanques de pré-tratamento e um tanque de água tratada, porém
precisa ser desdobrado próximo a uma fonte de água natural para ser abastecido.
Após a água estar tratada o Serviço de Intendência fazer a distribuição desta para
as tropas em combate.
Esse cuidado com a água evita a incidência de doenças de veiculação
hídricas, que pode deixar muitos dos soldados enfermos, e combatentes doentes
perdem a sua capacidade operacional, por isso esta forte vigilância sobre a origem
da água quando uma tropa esta fora do seu quartel, principalmente num teatro de
guerra. (C 21-10- 1975).
65
2 Lado ou prolongamento do espaço lateral de um dispositivo tático
3 Ação militar violenta, caracterizada pelo choque entre combatentes opostos, na qual são
empregadas armas de fogo de variados tipos, arma branca e, até mesmo, a luta corpo-a-corpo, que ocorre na fase de assalto a uma posição, visando destruir, capturar, repelir ou expulsar o inimigo.
Figura AN05.1 – Posto de suprimento de água do Exército Brasileiro. http://www.eb.mil.br/web/resiscom sex/cms /-/asset_publisher/ 5GOiNizkxh97/content/3-divisao-de-exercito-operacao-ibicui-tratamento-de-agua-na-area-de-operacoes
Uma guerra pode durar poucas semanas, ou se estender por vários anos, o
que torna o campo de batalha algo dinâmico e diversos desdobramentos podem
ocorrer, como por exemplo, uma manobra de flanco2 e se está não for bem sucedida
e ocasionar um combate aproximado3, todos ou muitos combatentes podem ser
mortos.
Se existirem sobreviventes deste ataque inimigo, estes vão ter a
necessidade de se reagruparem para sobrevier, o que muitas vezes ocorrem em
locais inóspitos e muito provavelmente não vão poder mais com o apoio operacional
logístico militar oferecido até então.
66
4 Agrupamento de valor pelotão ou equivalente
5 Parada de uma tropa, em determinada região
Esta fração de tropa4 pode ter que montar um acampamento temporário
(mais de três dias) ou fazer um estacionamento5 temporário (de um a três dias) que
muitas vezes acontece em locais ermos, sem segurança física, sem recursos de
comida ou de água, e para sobreviver vão necessitar fazer uso dos meios de fortuna
existentes no local, para se protegerem e se abrigarem, além de utilizar os recursos
hídricos existentes por perto e sem um tratamento ideal para o suprimento seguro
desta água.
Nestes casos o manual C 21-74, no seu capítulo 5, Artigo I, item 5.3 letra d,
ao se referir à disciplina no consumo da água e sua obtenção e tratamento, cita que:
“água contaminada é uma das maiores ameaças para a saúde do homem em
campanha”.
Quando não se pode fazer uso da água tratada pela Arma de Engenharia,
este mesmo manual orienta que este recurso hídrico deve ser descontaminado com
as pastilhas individuais de purificação de água (Figura AN05.2), que vêm junto com
a ração operacional (Figura AN05.3) que o combatente carrega na sua mochila ou a
fervura desta por 15 minutos.
Figura AN05.2 – Pastilha de cloro para desinfecção da água usada pelo Exército Brasileiro. Item obrigatório na Ração Operacional de Combate (R2) e na Ração Operacional de Emergência (R3). Aprovadas pela Portaria Normativa n º 1.416/MD, de 16 de outubro de 2008.
Num cenário piorado deste teatro de operações, se a situação anteriormente
descrita ocorrer na área de caatinga, em uma época de estiagem prolongada onde a
67
escassez deste recurso hídrico é fator crucial, e as operações logísticas militares
têm que se atentar para este importante problema. (EB70-MC-10.223 2017)
Figura AN05.3 – Ração Operacional de Combate (R2) do Exército Brasileiro, aprovada pela Portaria Normativa n º 1.416/MD, de 16 de outubro de 2008.
Se esta fração de tropa sobrevivente vier a sofrer uma perseguição, na
caatinga, apenas vai poder contar com sua mochila, seu armamento e pela situação
de movimento as alternativas de tratamento de a água precisão ser portátil (pastilha
de cloro e/ou um frasco de peróxido de hidrogênio) e um cantil acondicionado em
sua mochila ou outro vasilhame improvisado, como por exemplo, uma garrafa PET
que sobrou da ultima vez que recebeu alimentação pelo apoio logístico militar.
Neste cenário de guerra, a necessidade de conseguir algum lugar para
abastecimento de água se torna a condição de manter os soldados vivos.
Provavelmente só se conseguirá algum recurso hídrico de poças, cacimbas ou de
olhos d’água, ou seja, uma água sem tratamento (Figura AN05.4). Porém além de
patógenos existentes nesta água, florações tóxicas de cianobacterias podem estar
presentes nestes locais de captação, sendo as microcistinas as cianotoxinsa mais
presente nos corpos d’água brasileiros, muito provavelmente a água vai estar
contaminada por esta toxina.
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Como a pastilha de cloro, apesar deste ter sua eficácia comprovada em
relação à inativação de patógenos, não teve efeito sobre esta toxina, como ficou
demonstrado neste trabalho, e a metodologia SODIS aditivada de 6 g/L H2O2,
acrescida posteriormente da pastilha de cloro se mostrou o melhor método para a
inativação de patógenos e da diminuição da concentração de microcistina-LR e
como o SODIS precisa de luz solar para se eficaz, isto não seria empecilho neste
cenário de guerra na caatinga.
Figura AN05.4 – Foto de uma poça de água num leito seco de um rio. http://sitionovornemfoco.blogspot. com.br
Esta metodologia poderia dar ao combatente uma água livre de patógenos e
com uma concentração de microcistina-LR inferior ao que preconiza a portaria de
consolidação nº 5 / 2017 MS, desta forma preservaria sua saúde e sua capacidade
de combate até que ele conseguisse chegar a alguma base de operações ou se
resgatado.
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O manual do Exercito Brasileiro C-21-74 (Instrução individual para o
combate) data de 1986, sem nenhuma modificação até os dias atuais, sobre o
tratamento de água pelo combatente, se limitando apenas ao tratamento dos
patógenos,com o uso da pastilha de cloro comercial ou a fervura da água , ambas as
técnicas utilizadas não degradam a microcistina-LR e que podem também causar
problemas de saúde no combatente. Porém para se propor uma revisão deste
manual, tem que se ter uma metodologia alternativa, senão para substituir a antiga,
ser acrescentada como outra solução possível.
