Caracteristicas Fisicas Quimicas y Microbiologicas de Los Productos Detivados de Cereales
UT 2 Tecnicas Microbiologicas Ba Sicas 09-10
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UT 2. TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS BÁSICAS A) NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Un laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden
manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena
técnica aséptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en
condiciones de esterilidad (en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas).
Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patógenos, todos los
cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución por su potencial
patogenicidad. Por lo que es necesario cumplir dos REQUISITOS BÁSICOS:
1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de
cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.)
contaminen nuestras muestras.
Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE
SEGURIDAD:
1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.
2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica , y al
terminar, es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales
para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).
4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama.
5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica
deben estar apartados del lugar de trabajo.
7. Todos los utensilios usados deben estar estériles antes de su utilización. Para reutilizar material en
el que existiera algún cultivo microbiano (tubos de ensayo) deberán introducirse en una bolsa de
esterilización y llevarse al autoclave antes de lavarlos, para evitar la contaminación del personal.
8. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán
esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la
basura común.
9. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
10. Antes de comenzar la práctica se debe comprobar que no falta ningún material, dado que ello
puede paralizar e invalidar el trabajo realizado.
11. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear
corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
12. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
13. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se
comunicará inmediatamente al profesor.
14. Todo el material sucio que quede después de realizar la práctica se llevará al fregadero para su
limpieza. No dejar nada en las mesas de trabajo.
15. Terminada la práctica cada alumno deberá anotar lo realizado, desde la preparación del material
hasta los resultados obtenidos.
B) LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO
En Microbiología es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del
material. Asimismo, es muy importante la recuperación del material reciclable y la eliminación del
material desechable. Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes
adecuados, provistos de tapa.
Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia
orgánica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes
físicos o químicos utilizados en la descontaminación de los mismos, no puede asegurarse la total
destrucción de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar
mayores concentraciones de desinfectante y tiempos más largos de tratamiento que para la
desinfección o la esterilización de material limpio.
En Microbiología se define esterilización como la destrucción o eliminación total de todos los
microorganismos vivos en un objeto o material, incluido las endosporas bacterianas. El material que
se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado:
- El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodón graso o
tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Además, cuando se
usa algodón, ha de cubrirse éste con un papel impermeabilizado. Una vez preparadas, se
introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelven individualmente en papel
satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con
calor seco, generalmente en un horno Pasteur.
- El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo,
las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de
etileno o radiaciones.
- Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan,
generalmente, en autoclave. Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de
esterilización y la elección de uno determinado viene condicionado por el tipo de material que
se quiere esterilizar.
Material
Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de aire caliente, autoclaves, equipos de filtración y
materiales a tratar.
Técnicas
El método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras
razones porque es el más económico y el más fácil de controlar. El calor utilizado con este fin puede
aplicarse en forma de calor seco o de calor húmedo.
El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se requieren
temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores,
ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno responsables de la estructura
terciaria de las proteínas, haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.
• La esterilización por calor seco puede hacerse por flameado o mediante estufas de aire caliente.
I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, espátulas, etc.
Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero Bunsen o un
mechero de alcohol los utensilios que se vayan a esterilizar. Este método es rápido y su
eficacia es altísima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolábiles (plásticos).
II) Esterilización por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en
colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se
contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se
utiliza para esterilizar material de vidrio (Pipetas, matraces, tubos) u otros materiales
SECO
HÚMEDO
•Flameado •Estufa
•Ebullición •Vapor fluente •Vapor saturado
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
FÍSICOS
QUÍMICOS
CALOR
IRRADIACIÓN
FILTRACIÓN
termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy
elevadas (160-180ºC durante cerca de 2 horas).
Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar líquidos (como medios de
cultivo), ya que al llegar a los 100ºC comenzarían a hervir y continuarían hirviendo sin
elevar su temperatura por encima del punto de ebullición del agua a presión atmosférica.
A 100ºC las esporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas, y además la
evaporación produciría cambios en la concentración de los componentes del medio.
• El calor húmedo también se utiliza para la destrucción de los microorganismos siendo, como ya
se ha comentado, a igual temperatura, mucho más eficaz que el calor seco; con este tratamiento
las enzimas se desnaturalizan rápidamente, al igual que las membranas celulares. Además, el
vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresión, es un eficaz transmisor de calor al
interior de la célula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios métodos: Ebullición, vapor
fluente y vapor saturado a presión.
I) Ebullición: El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10
minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las esporas
bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podría utilizar el
baño María o baño de agua hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio),
cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos
mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos) como para medios de cultivo que
no puedan esterilizarse en autoclave.
II) Vapor fluente: Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo
que no se puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que pierdan alguna de
sus propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presión
atmosférica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100ºC, y se realiza el
proceso durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los
intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100ºC) durante
30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero no las
endosporas termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan
después del calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en los siguientes
ciclos. Este método de esterilización se denomina también esterilización fraccionada o
tindalización.
III) Vapor saturado a presión: La esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua
saturado que se somete a una atmósfera extra de presión sobre la presión atmosférica
normal, elevándose con ello el punto de ebullición del agua de 100ºC a 121ºC y
consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos (salvo los termófilos
extremos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es también necesaria para la
destrucción de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica. El
vapor de agua difunde por ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando
su protoplasma, fenómeno que se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta
técnica de esterilización requiere el uso del autoclave.
El autoclave permite elevar la presión una o dos atmósferas sobre la presión atmosférica,
elevándose con ello la temperatura de ebullición del agua que se encuentra en su interior. Consta de
un recipiente metálico, generalmente de acero inoxidable, similar a una gran olla, en cuyo interior se
introduce el material a esterilizar que se coloca sobre una rejilla o placa agujereada. Después de cerrar
cuidadosamente la tapa, se conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la temperatura en su
interior. La salida continua del chorro de vapor a través de la válvula nos indica que el aire contenido
en el interior del autoclave ha sido eliminado. La eliminación de este aire es importante ya que la
difusión del calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se alcanzará la temperatura
esperada a la presión elegida y no se conseguirá la esterilización. La válvula se cierra cuando sólo sale
vapor de agua y, a partir de ese momento, comienza a elevarse la presión hasta una atmósfera sobre la
presión normal, elevándose como consecuencia la temperatura hasta 121ºC. Transcurridos 15-20
minutos, en estas condiciones, el material se ha esterilizado.
Es el incremento de temperatura por encima de los 100ºC y no la presión la que destruye los
microorganismos. Si se esterilizan volúmenes grandes de líquidos, es necesario mantener el material
en el autoclave durante períodos de tiempo más prolongados, pues se tarda más en alcanzar los 121ºC
en el centro de un gran volumen. Una vez transcurrido el tiempo necesario, se apaga el autoclave y
se deja descender la temperatura hasta que el indicador marque menos de 80ºC, que será cuando la
presión haya descendido hasta presión atmosférica. Se abre ligeramente la espita para comprobar que
no queda vapor a presión en el interior y ya se puede proceder a retirar todo el material esterilizado,
dejándolo enfriar a temperatura ambiente. El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo,
instrumentos, ropas, soluciones, jeringas, etc que puedan soportar altas temperaturas y una atmósfera
de sobrepresión.
• Para la esterilización de materiales líquidos sensibles al calor, como algunos medios de cultivo,
soluciones de antibióticos, enzimas, vacunas, etc. o también para gases, se utiliza la filtración. En
la esterilización por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la filtración
los retira de una forma mecánica, en lugar de destruirlos.
La filtración es el paso de un líquido o gas a través de un material filtrante, con poros lo
suficientemente pequeños como para retener células microbianas. Tanto los filtros de membrana
como los equipos de filtración con los que éstos se usan deben ser esterilizados por otros
métodos, generalmente vapor saturado a presión en el autoclave.
Los virus y algunas bacterias de tamaño muy pequeño como, por ejemplo, los micoplasmas, no
son retenidos por los filtros habituales.
C) MEDIOS DE CULTIVO
NECESIDADES NUTRITIVAS DE LAS BACTERIAS.
Los microorganismos para desarrollarse necesitan cierta cantidad de sustancias alimenticias
que artificialmente se les suministran en lo que se llaman medios de cultivo.
La mayoría de las bacterias son cultivables en medios artificiales, siempre que el medio de
cultivo les proporcione todos los elementos necesarios para su crecimiento y su multiplicación. En
este sentido, las necesidades de las bacterias son extremadamente variables. En general, todas las
bacterias patógenas para el hombre necesitan compuestos orgánicos para desarrollarse.
Además de unas determinadas condiciones físico-químicas, las necesidades nutritivas de las
bacterias podemos clasificarlas en:
a) NECESIDADES ELEMENTALES.
Constituyen las materias primas de los medios de cultivo:
- C, N, H, O, son necesarios en cantidades relativamente importantes.
- S, P, en cantidades un poco inferiores.
- K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Co, Cu, Mo, son también necesarios en pequeña cantidad
como componentes de enzimas, proteínas, etc.
b) NECESIDADES ENERGÉTICAS.
Son indispensables para cubrir los gastos del metabolismo. Según la fuente de energía que
utilicen las bacterias, se dividen en:
1) FOTOTROFAS O FOTOSINTÉTICAS: Energía luminosa.
1.1 fotoautótrofas o fotolitótrofas: c. inorgánicos.
1.2 fotoheterótrofas o fotoorganotrofas: c. orgánicos.
2) QUIMIOTROFAS O QUIMIOSINTÉTICAS: Oxidación de compuestos.
2.1 quimioautótrofas o quimiolitotrofas: c. inorgánicos.
2.2 quimioheterótrofas o quimioorganotrofas: c. orgánicos.
En el último grupo se incluyen la mayoría de las bacterias, tanto saprófitas como patógenas.
c) NECESIDADES ESPECÍFICAS DE CRECIMIENTO.
Teniendo en cuenta las necesidades elementales y energéticas se pueden preparar medios en
los cuales todas las bacterias no son capaces de crecer. Hace falta suministrarle un cierto número de
compuestos bien definidos, que no son sintetizados por las bacterias, y que son necesarios para su
desarrollo. Estos son los llamados FACTORES DE CRECIMIENTO, y que pueden ser: determinados
aminoácidos, bases púricas, pirimidínicas, vitaminas, determinados azúcares, los cuales dependen de
las necesidades de cada bacteria.
NECESIDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LAS BACTERIAS.
• Hidratación: Es esencial.
• Temperatura: Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento
clasificándose según esto en los siguientes grupos:
I.- Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima aprox 15° C.
II.- Mesófilas: crecen mejor entre 25 y 40° C.
III.- Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C.
• Presión osmótica: No muy alta. Aunque las bacterias toleran bien los cambios de presión
osmótica, los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotonía. La mayoría de las
bacterias no toleran concentraciones salinas muy elevadas.
• pH: Es de gran importancia. Ha de estar cercano a la neutralidad: 7-7,6.
• tiempo de incubación necesario para que el germen adquiera vitalidad y se desarrolle.
Generalmente es de 24 a 48 horas.
• Concentración de oxígeno: Depende del tipo de bacterias:
o Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre. Para desarrollar
bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo
aire estéril en el medio.
o Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre. Los anaerobios
estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposición de estos
microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes
métodos:
A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato
sódico, para disminuir el contenido de O2.
B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2.
C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de
cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al
encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono.
o Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de
oxígeno libre.
o Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre.
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un compuesto constituido por elementos nutritivos y de soporte, capaz
de crear un ambiente adecuado para el crecimiento de microorganismos, con objeto de aislar las
diferentes especies bacterianas, proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios
complementarios.
CUALIDADES EXIGIBLES A UN MEDIO DE CULTIVO
1- COMPOSICIÓN: los medios de cultivo deben contener cualitativa y cuantitativamente las
sustancias exigidas para la supervivencia y crecimiento de los microorganismos. Básicamente pueden
contener:
o alimentos esenciales o nutrientes: son imprescindibles C, O, N, e H, en menores cantidades S
y P, y otros minerales como Mg, Ca, Fe, K etc.
o factores de crecimiento: son metabolitos que las bacterias no pueden sintetizar: aminoácidos,
vitaminas, azucares, etc.
o factores estimulantes: su presencia acelera el ritmo de la multiplicación bacteriana, o permite
la adaptación a un medio artificial de una bacteria aislada en un medio natural.
2- pH: en general las bacterias solo se desarrollan a un pH casi neutro (7-7,6). Existen sustancias
buffer o tampón para mantener un pH estable. Algunas bacterias exigen o soportan un pH particular
que se emplea para su aislamiento o su identificación.
3- HUMEDAD: se requiere una cantidad suficiente necesaria para el metabolismo bacteriano.
4- ESTERILIDAD: no es imprescindible para que el microorganismo crezca, pero si es necesaria esta
condición a la hora de llevar a cabo cualquier investigación bacteriana. Puede hacerse en:
- Autoclave: 110-120ºC, para la mayoría.
- Tyndalización o esterilización fraccionada: Varios calentamientos a 100ºC/3 días sucesivos.
Se deben de tener en cuenta, pero no son imprescindibles:
1- AUSENCIA DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS las cuales inhiban parcial o completamente la
vitalidad y multiplicación de los gérmenes que queremos estudiar. Ej: colorantes (verde brillante),
metales pesados (bismuto).
2- PRESENCIA DE SUSTANCIAS FACILITADORAS: que favorezcan el desarrollo de los
microorganismos. Ej: sangre, vitaminas, factores de coagulación, etc.
3- ISOTENIA: es la concentración de ClNa, que en la mayor parte de los medios corresponde a un
8,5%.
PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO. CLASIFICACIÓN:
Los medios de cultivo utilizados en Bacteriología son numerosísimos y pueden clasificarse
según distintos criterios, pero todos ellos compatibles.
a) POR SU COMPOSICIÓN:
- Medios simples (agua, ClNa, peptona).
- Medios complejos o enriquecidos (aa.,vitaminas, proteínas).
b) POR SU CONSISTENCIA:
- Líquidos: se denominan caldos, y no poseen sustancias gelificantes.
- Sólidos: la sustancia gelificante es agar. El contenido de agar > 1%.
- Semisólidos: " " " agar. El contenido de agar < 1%.
c) POR SU UTILIZACIÓN:
- Medios generales o nutritivos.- Es aquel que soporta el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos sin exigencias nutritivas especiales.
- Medios de mantenimiento y conservación.
- Medios de enriquecimiento.- Aquel que favorece más el crecimiento de un determinado
tipo de bacterias por encima de otros también presentes en el inoculo.
- Medios de aislamiento
- Medios Selectivos.- Aquel que sólo permite el crecimiento de un biotipo entre los que se
presentan en el inóculo.
- Medios diferenciales o Medios de identificación.- Aquel que permite la distinción entre
biotipos próximos y relativamente parecidos.
- Medios de transporte.
MEDIOS GENERALES O NUTRITIVOS.
Tienen gran cantidad de nutrientes, favoreciendo el crecimiento de gran cantidad de
microorganismos (tanto Gram + como -).
Por ej.: CALDO NUTRITIVO (líquido)
AGAR NUTRITIVO (sólido)
Dentro de los medios generales, están los ENRIQUECIDOS con alguna sustancia (sangre =
agar sangre).
MEDIOS DE MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN.
Son los medios utilizados cuando se quiere conservar una colonia durante un espacio mayor de
tiempo.
Los medios se envasan en tubos, que tienen menos superficie que las placas y evitan en parte la
desecación del medio. Los gérmenes son sembrados en profundidad, lejos del oxígeno ambiental, en
medio sólido, que evite la difusión de metabolitos tóxicos, y colocados los tubos en la nevera, a
temperaturas bajas para evitar al máximo su crecimiento y desarrollo.
Por ej.: AGAR NUTRITIVO.
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO.
Son medios líquidos empleados para favorecer el crecimiento y desarrollo de una determinada
especie bacteriana. Se utilizan cuando la bacteria que se quiere investigar se encuentra en pequeño
número en comparación con la carga bacteriana de la muestra. Se utilizan como medios de
revitalización, y de ahí se pasa ya a los medios de aislamiento. Por ej.:
AGUA DE PEPTONA (Enriquecimiento gral).
CALDO SELENITO (Salmonella).
CALDO LACTOSADO (coliformes).
MÜLLER-KAUFFMANN (Salmonella).
EE DE MOSSEL (Enterobacterias).
GIOLITTI CANTONI (Estafilococos).
ROTHE (Estreptococos).
MEDIOS DE AISLAMIENTO.
Se emplean para el aislamiento de bacterias. Son medios sólidos. Pueden ser de aislamiento
general o selectivo de un microorganismo o grupo de microorganismos determinados.
En los medios selectivos se incorporan sustancias inhibidoras del desarrollo de un grupo de
bacterias, pero permiten en cambio, el crecimiento de otras.
Medios de aislamiento general.- Se utilizan para recuento bacteriano. Por ej.:
PLATE COUNT AGAR
AGAR NUTRITIVO
Medios de aislamiento selectivo.- Por ej.:
SS (Salmonella-Shigella).
XLD (xilosa-lisina-descarboxilasa)(Shigella).
HEKTOEN (Shigella).
AGAR VERDE BRILLANTE (Salmonella).
MAC CONKEY ( Enterobacterias).
LEVINE (Escherichia coli).
BAIRD-PARKER (Estafilococos).
SABOURAUD (Hongos y levaduras).
SPS (Clostridium).
MEDIOS DE DIFERENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN.
Los medios de identificación son de varios tipos, y comprenden medios líquidos, sólidos y
semisólidos. Se caracterizan por poseer en su composición alguna/s sustancia/s (indicadores de pH,
fuentes nutritivas, etc) que ponen de manifiesto los caracteres bioquímicos o enzimáticos de las
bacterias, y así poderlas identificar o diferenciar. Por ej.:
CALDO LACTOSADO (Dif. de Coliformes).
CALDO EVA o LITSKY (Dif. de Enterococos).
KLIGLER (Ident. de Entrobacterias: Coliformes).
CITRATO DE SIMMONS (Ident. de Enterobacterias).
DNasa (Ident. de Estafilococos).
VRBG - VRBA (Dif. de Enterobacterias).
MEDIOS DE TRANSPORTE
Su finalidad es el transporte de las bacterias sin multiplicarse, pues no tienen nutrientes, y los
otros componentes favorecen la estabilización del pH. Por ej: COREY-BLAIR AMIES
STUART
MEDIOS DE CULTIVO MÁS IMPORTANTES
1.- AGAR NUTRITIVO: es un medio para fines generales:
- cultivar la mayoría de microorganismos poco exigentes.
- efectuar recuentos de colonias.
- transporte de cepas.
- aislar microorganismos en cultivos puros.
2.- AGAR SANGRE: es un medio general enriquecido, generalmente con sangre de carnero
desfibrinada. En su preparación la sangre se debe introducir tras la esterilización del medio y una vez
enfriado, pero antes de que solidifique, para evitar que la sangre se hemolice.
Es de gran utilidad para la detección de estreptococos, gracias a la aparición de hemólisis
alrededor de las colonias.
3.- AGAR CHOCOLATE: es un medio general enriquecido.
Su composición es similar a la anterior, salvo que la sangre se añade al medio antes de
esterilizarlo, produciéndose hemólisis. Es de gran utilidad para detectar cocos Gram - y Haemofilus.
4.- AGAR MAC-CONKEY: es un medio de cultivo diferencial:
- fomenta el desarrollo de las enterobacterias (Gram -).
- Inhibe el desarrollo de bacterias Gram + gracias a la presencia de sales biliares.
Según las bacterias sean capaces de fermentar la lactosa, las colonias adquirirán una coloración
rojo-rosado o colonias blancas, transparentes o negras si no son fermentadas.
Es muy importante que la superficie del medio esté completamente seca cuando se inocule.
5.- CALDO DE SELENITO: es un medio líquido de enriquecimiento.
Se utiliza para el cultivo de salmonella en muestras de heces, orina y aguas cloacales.
Normalmente tras la incubación durante unas horas en este medio se pasa a una placa SS.
6.- AGAR SALMONELLA-SHIGELA o SS: es un medio altamente selectivo, especialmente
adaptado para el aislamiento de salmonella o shigela, las cuales forman colonias opacas o traslucidas
incoloras que generalmente son lisas.
Inhiben la formación de colonias de tipo contaminante, pero no las destruye. Se recomienda
utilizar paralelamente enriquecimiento en selenito.
7.- MEDIO DE CHAPMAN: es un medio de aislamiento específico de Estafilococos patógenos. Se
recomienda la incubación durante 36 horas a 37ºC.
- Los estafilococos patógenos producen colonias con zonas amarillas.
- Los no patógenos producen colonias pequeñas con zonas rojas o púrpura a su alrededor.
8.- MEDIO DE MULLER HINTON: se utiliza para determinar la susceptibilidad de los
microorganismos (antibiograma), debido a sus posibilidades de reproducción.
Se recomienda la adición del 5% de sangre para comprobar la sensibilidad de organismos
exigentes que necesitan enriquecimiento o para la determinación de reacciones hemolíticas.
9.- MEDIO DE KLIGER: se utiliza para la identificación de enterobacterias: E. Coli, Salmonella,
Shigela.
Este medio de cultivo siempre se coloca en tubo en pico de flauta o agar inclinado y la siembra
se realiza en picadura en la parte profunda y en estría en la superficie.
En este medio se valoran 4 características de los microorganismos:
- utilización de la glucosa.
- " " " lactosa
- producción de gas
- " de ácido sulfídrico (SH2).
Según los cambios de color y la aparición de burbujas o gas podremos identificar las enterobacterias.
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
La preparación de los medios bacteriológicos ha sufrido un cambio espectacular debido a la
disponibilidad de medios comerciales deshidratados a punto para su utilización, con lo que se ahorra
tiempo y se disminuye la posibilidad de errores durante su preparación.
Aún así, existen algunos factores que pueden alterar la calidad del medio de cultivo:
• pesada incorrecta.
• uso de medios alterados por la exposición al calor y a la humedad.
• incorrecta medida del agua.
• uso del agua del grifo, etc.
El aspecto y la calidad del medio preparado depende con mucha frecuencia de la forma de
rehidratarlo y almacenarlo. Por ello es muy importante su correcta elaboración.
FUNDAMENTO: crear un ambiente adecuado para el crecimiento del microorganismo.
MATERIAL:
- matraces erlenmeyer
- vasos de precipitado
- mechero
- autoclave
- balanza
- pHmetro (opcional)
- placas de petri
- tubos
- algodón graso
- papel de aluminio o parafina
- pipetas, medidores o dosificadores
automáticos.
REACTIVOS:
- ingredientes para medios de cultivo o medios de cultivo deshidratados
- agua destilada o desionizada
- NaOH y ClH para ajustar el pH (si el medio es deshidratado no es necesario)
PREPARACIÓN.
Los medios que más se utilizan actualmente son los medios deshidratados. En la etiqueta de
todos los frascos se incluyen las instrucciones para reconstituir los medios deshidratados.
Para una buena preparación de los medios de cultivo es fundamental el empleo de instrumental
de vidrio y equipo limpio, exentos de sustancias detergentes.
La homogeneidad de la suspención debe ser total y la exposición al calor, si es precisa, será
mínima.
- PESADA: Tras calcular la cantidad de medio reconstituido que se va a utilizar, según la etiqueta
del mismo, determinaremos la cantidad necesaria de medio deshidratado. Pesar y reservar.
- HIDRATACIÓN: añadirle la cantidad adecuada de agua destilada o desionizada.
- Para la preparación del medio, se debe utilizar un matraz Erlenmeyer lo suficientemente
grande (2-3 veces el volumen total a preparar) para que se pueda remover bien con el fin de
disolver el medio.
- se calienta previamente el agua. (50-65ºC) (1/2 o 2/3 del agua necesario)
- se añaden los ingredientes o el medio preparado.
- se agita para homogeneizar la disolución, manteniendo la exposición al calor.
- La aplicación del calor debe ser directa y suave, con agitación constante
- Si el medio no contiene agar (líquido), se suelen disolver bien en agua precalentada,
no siendo necesario calentar después, aunque necesitan de una agitación vigorosa.
- Todos los medios que contienen agar (sólidos y semisólidos), requieren calor hasta
100ºC aprox., para que éste pueda fundirse. Es muy conveniente que antes de iniciar
el calentamiento se deje reposar el agar en el agua precalentada durante 5-10 minutos.
Una práctica aconsejable es retirar el medio del fuego cuando ha empezado a hervir y
volverlo a calentar hasta hierva de nuevo (2 o 3 veces) con agitación constante.
- Este calentamiento no debe hacerse nunca con una llama directa, para evitar quemar
el medio, y además se agita a intervalos frecuentes, por el mismo motivo, hasta que el
agar se haya fundido (que no se vean copos en las paredes del matraz).
- Hay que vigilar con frecuencia durante el calentamiento, porque el medio puede
hervir repentinamente y salirse del recipiente.
- Con el resto del agua se lavan las paredes del recipiente y se continua agitando y
calentando si es preciso
- ENFRIAR o ATEMPERAR
- AJUSTAR EL PH: es imprescindible cuando se parte de los ingredientes por separado. En
los medios deshidratados, excepto en circunstancias especiales, no es necesario ajustar el
pH. Si fuese necesario, se haría con Carbonato sódico 1N, Ácido fosfórico 0,01% NaOH o
ClH. El pH se comprobará con el phmetro o papel indicador.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
15
DISTRIBUCIÓN.
Depende del tipo de medio y de su finalidad. Si es posible, la distribución se hará en los
recipientes definitivos para realizar los cultivos; en su defecto en otros que permitan un buen
proceso de esterilización.
• Medios en tubo: Con una pipeta de boca ancha o dosificador se deposita en cada tubo la
cantidad de medio correspondiente (de 10 a 20 ml según la capacidad del tubo). Se tapa con
una torunda de algodón graso que se cubre, a su vez, con papel de aluminio, de filtro o
parafina, y se lleva a esterilizar. También se pueden usar tubos con tapones de rosca.
Para detectar la producción de gas de las bacterias, se puede colocar en el interior del tubo
el llamado tubo o campana de Durham.
• Medios en placa: el medio de cultivo estará en un matraz erlenmeyer (no ocupará mas de
2/3 de la capacidad del matraz, pues la ebullición en el autoclave, puede hacer que rebose).
Antes de esterilizarlo se tapa de igual forma que los tubos. Tras la esterilización y
ligeramente frío, se pasará a las placas.
ESTERILIZACIÓN
Generalmente se lleva a cabo en la autoclave:
- volúmenes de hasta 250 ml durante 15' a 1,2 atm (121ºC).
- volúmenes superiores a 250 ml se debe prolongar el tiempo de esterilización en
unos minutos.
Tener en cuenta no cargar demasiado el autoclave, para que pueda fluir libremente el
vapor.
Algunos medios de cultivo con ingredientes termolábiles se esterilizan por vapor fluente
o tindalización.
VERTIDO EN PLACAS
Tras la esterilización del medio se homogeneiza, moviéndolo en sentido rotatorio.
El vertido de las placas se debe realizar cuando el medio se encuentre en una temperatura
próxima a la gelificación (45 - 55 ºC) (se puede mantener la mano sobre el recipiente).
Para el llenado, se utilizarán pipetas estériles o un dosificador, o vertiendo directamente el
medio en la placa. Durante este procedimiento, extremar la técnica para mantener la esterilidad
del medio y de la placa, para ello:
- trabajar cerca del radio aséptico de acción de la llama del mechero (10 - 15 cm).
- tras quitar el algodón graso que tapa el matraz, pasar la boquilla de éste por la
llama.
- no abrir totalmente la placa de petri, solo lo imprescindible.
- sería ideal usar mascarilla.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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ENFRIAMIENTO
- Medios líquidos: tal y como se extraen del autoclave se dejan enfriar a temperatura
ambiente.
- Medios sólidos:
* Tubos: se dejan solidificar a temperatura ambiente en :
- posición vertical: agar horizontal
- posición inclinada: agar inclinado o en flauta o en bisel.
* Placas: asegurarse de que no hay burbujas mediante movimientos rotatorios
de la placa. Solidificará en una superficie horizontal.
Cuando estén a una tª inferior a 45ºC colocar las placas invertidas, para evitar
que las gotas de humedad por condensación caigan sobre el medio,
favoreciendo su contaminación.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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CONSERVACIÓN Y CONDICIONES DE USO DE INGREDIENTES Y MEDIO
- Ingredientes o medios de cultivo deshidratados:
* recipientes cerrados, protegidos de la luz y humedad.
* deben desecharse si apelotonan.
* algunos deben guardarse en la nevera.
* control de la fecha de caducidad.
- Medios hidratados y esterilizados:
* tiempo limitado de conservación: en nevera a 4ºC, de 4 a 6 semanas
a tª ambiente, de 1 a 2 semanas.
* no mantenerlos a tª inferior a 0ªC, ya que altera la estructura del gel.
* protegerlos de la luz.
* tubos o recipientes herméticos (mejor tapón de rosca que torundas de algodón).
* si no se va a usar inmediatamente, dejar el medio destinado a distribuir en placas, en
el recipiente inicial. Se aconseja refundir al baño maría o en autoclave a vapor fluente
durante 30', nunca aplicar calor directo.
* si el medio se coloca en las placas tener en cuenta:
- refrigeración inmediata, con precinto adhesivo en la placa.
- colocar boca a bajo (las gotas de condensación lo contaminan).
* si los medios están refrigerados, cuando se vayan a emplear, atemperarlos
previamente (en estufa o a tª ambiente), ya que la condensación de humedad
ambiental retrasa el crecimiento bacteriano.
CAUSAS DE ERROR EN LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
En la preparación de medios de cultivo bacteriano a partir de materiales deshidratados,
participan una serie de variables. Si no se controlan rígidamente, es probable, que el producto
final no de resultados satisfactorios. Algunos de los casos son:
- Pesada incorrecta del material seco por error humano o defectos en la balanza.
- Utilización del material seco obtenido de botes abiertos previamente, y que pueden
estar deteriorados por exposición a la humedad, calor, oxidación, etc.
- Medición incorrecta del agua o utilización de agua no destilada o desionizada.
- Empleo de recipientes no adecuados: metálicos no inoxidables, sucios, etc.
- Disolución incompleta, con lo que el medio será de consistencia no homogénea y
que por unas partes esté mas rígido que por otras.
- Calentamiento excesivo durante la esterilización y preparación, o por haberse
mantenido demasiado tiempo en estado de fusión, con lo que puede deshidratarse el
medio, disminuir el pH, formar precipitados, etc.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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- Determinación incorrecta del pH, con lo que se produce la adición incorrecta de
ácido o base. Este error se puede producir por hacer la determinación del pH con el
medio de cultivo muy caliente.
- Adición de sustancias enriquecedoras (sangre) en condiciones incorrectas
(contaminada).
- Fallos derivados de un deficiente control de calidad del laboratorio.
ELIMINACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Cualquier medio de cultivo, sobre todo si se ha sembrado, es un posible foco de
contaminación por lo que se debe descontaminar tras su utilización.
Se puede realizar mediante:
- Inundación con una solución desinfectante: dejarlo actuar como mínimo durante 6
horas (se recomienda de 12 a 24 horas).
- Esterilización en autoclave.
- Incineración: se utiliza para microorganismos muy patógenos.
D) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Debido a la carga microbiana que generalmente tienen los alimentos, es necesario hacer
diluciones de la muestra con objeto de poder obtener, en los medios de cultivo, colonias
perfectamente diferenciadas; de esta forma, podemos estudiarlas, contarlas y llegar al
aislamiento e identificación de los gérmenes existentes.
1. Tomar la muestra en condiciones asépticas. Para ello se pueden emplear cubiertos y botes
previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la toma de muestra y el análisis, se
mantendrá la muestra en refrigeración.
2. Homogeneización del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial de paletas
para que la distribución de los microorganismos en el medio sea homogénea (Stomacher).
Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plástico estéril (especial para el homogeneizador)
y se añaden 90 ml de caldo de peptona estéril (= 25 g muestra + 225 ml diluyente). El
triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos, aunque el tiempo depende de
la consistencia del alimento.
3. Realizar una serie de diluciones decimales seriadas:
a) Mezclar bien el total de la muestra. Tener en cuenta que al añadir 90 ml de caldo de
peptona a los 10 g de muestra, se está realizando la primera dilución decimal (los
10g de la muestra van a implicar aproximadamente 10 ml de volumen). dilución
1/10
b) Preparar varios tubos con 9 ml de diluyente estéril (caldo de peptona)
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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c) Tomar 1 ml de muestra con una pipeta esteril y añadirlo al primer tubo dilución
1/100
d) Con otra pipeta estéril se toma 1 ml de la dilución anterior y se añade al 2º tubo
1/1000
e) Repetir el procedimiento hasta obtener la dilución deseada: 1/10000, 1/100000,
1/1000000.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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E) TÉCN DE INOCULACIÓN-AISLAMIENTO
TÉCNICAS DE SIEMBRA
Siembra es la operación mediante la cual un microorganismo se deposita en un medio de
cultivo para su crecimiento.
Los objetivos de la siembra pueden ser:
- aislamiento de microorganismos.
- recuento.
- obtención de masa microbiana.
- identificación.
- mantener la viabilidad y vitabilidad de los microorganismos (resiembra).
Dependiendo de los objetivos se utilizarán distintas técnicas o métodos de siembra.
MANIPULACIÓN DE LAS MUESTRAS Y MATERIAL DE MICROBIOLOGÍA
En todas las técnicas de siembra se debe realizar una correcta manipulación, tanto de las
muestras como del material, para evitar la contaminación del cultivo por otros
microorganismos.
Se seguirán las siguientes normas:
- Trabajar en el radio de la llama del mechero (10 - 15 cm).
- Todo el material será estéril.
- El asa se flameará perpendicularmente a la llama del mechero, hasta el rojo vivo en
toda su longitud.
- Antes de usarla debe enfriarse, pues esterilizaría la muestra recogida.
- En las pipetas se flameará la punta y siempre estará dirigida hacia abajo.
- Los recipientes siempre estarán tapados; al abrirlos se hará oblicuamente dirigiendo
su apertura hacia la llama y flameando la boca al quitar y poner el tapón.
- Las placas de petri se manipularán semiabiertas y la abertura siempre orientada
hacia la llama. Otra forma sería mantener la placa orientada oblicuamente hacia la
llama y la tapa sobre la mesa orientada hacia abajo.
- Al sembrar tener cuidado, pues el agar se puede romper fácilmente.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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PREPARACIÓN DEL INÓCULO (Sustancia que se inocula)
Cuando las muestras son muy viscosas o concentradas, y para técnicas en las que se
pretende el aislamiento, es necesario preparar el inóculo de siembra para obtener resultados
fiables.
Se obtiene a partir de un cultivo joven y puro o de un producto patológico.
Se toma con un asa estéril varias colonias de un cultivo o una porción de la muestra
biológica y se suspende en unos 5 ml de solución diluyente, tras lo cual se homogeneiza.
Como solución diluyente se puede usar:
- caldo de cultivo
- solución salina estéril
- agua destilada estéril.
MÉTODOS DE SIEMBRA
Siembra en estría o zig-zag
Siembra en estría múltiple
Técnica de los cuatro cuadrantes Por agotamiento
Técnica de los tres giros
Método A
Método B: inoculación previa vertido en placa
Aislamiento
Por dilución
Dilución en masa
Inoculación previo vertido en placa Técnica de Barry
Técnica de Kirby-Bauer
Técnica de inundación En placa Inoculación sobre la superficie del medio solidificado
Técnica de estría
Recuento o
siembras
cuantitativas
En tubo Métodos indirectos Medida de turbidez
Siembra por estría en superficie inclinada
Siembra en picadura Otras técnicas
de siembra En tubo
Siembra en medio líquido
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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TÉCNICAS DE AISLAMIENTO
Se realizan en placas y su finalidad es la obtención de cepas puras.
Para poder llegar a la identificación de una bacteria es preciso separarla de otras que
puedan coexistir con ellas, para lo cual se realizan siembras de aislamiento, es decir, depositar el
inóculo o muestra en un medio apropiado para su desarrollo.
Al sembrar una bacteria en un medio sólido aparecen colonias admitiéndose que cada
colonia proviene de una sola bacteria. De este modo, una colonia puede ser resembrada en otro
medio, obteniéndose un cultivo puro, siendo muy importante que la muestra llegue sin
contaminación al medio.
1.- AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO
1.a.- Siembra en estria o en zig – zag
- Se deposita el inóculo en el extremo superior de la
placa.
- Se siembra con el asa, a partir del inóculo, con un
movimiento de zig - zag cada vez mas amplio (en la
línea media de la placa alcanza su máxima longitud).
Para ello el asa debe contactar suavemente con la
superficie del medio, no debiendo realizarse una
presión excesiva, pues se agrietaría.
- La siembra se efectúa (sin levantar el asa ni flamearla) hasta la zona distal del
comienzo, donde se obtendrán colonias aisladas.
1.b.- Siembra en estría múltiple
- Se deposita el inóculo en el extremo superior de la placa.
- Con el asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde de la placa. Entre cada tramo
se debe flamear el asa.
- Los segmentos seguidos describen un poliedro regular; el último tramo se efectúa hacía
el interior en el que se obtendrán las colonias aisladas.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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1.c.- Técnica de los cuatro cuadrantes
- Se divide la placa en cuatro cuadrantes.
- Se deposita el inóculo en el extremo superior de uno
de los cuadrantes y se siembra en estría. (Este
cuadrante se corresponderá con el nº 1).
- Sin flamear el asa, se realiza la misma operación
sucesivamente en los otros 3 cuadrantes. - En cada
uno de ellos se sembrará el inóculo que queda
adherido al asa tras la siembra del anterior.
- En el último de los cuadrantes se encontrarán las colonias aisladas.
1.d.- Técnica de los tres giros
- Se siembra en estría la mitad de la placa.
- Flamear el asa.
- Se gira la placa 90º y se siembra en estría la mitad superior de la misma.
- Se repite las operaciones anteriores (siembra, flameo y giro).
- Las colonias aisladas aparecerán en la zona sembrada en último lugar.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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2. AISLAMIENTO POR DILUCIÓN
Esta técnica se puede utilizar tanto para recuentos como para aislamiento de colonias. El
material que contiene las bacterias se diluye seriadamente. Se pueden utilizar varios métodos:
2.a.- Método A:
- En varios tubos disponemos de 9 ml de
caldo nutritivo o agua bidestilada estéril.
- Se toma 1 ml de la muestra, que se diluirá en
el primer tubo, obteniéndose la dilución 1/10
- Tras homogeneizar el tubo anterior, se
tomará 1 ml, que se deposita en el 2º tubo,
obteniéndose la dilución 1/100.
- Este proceso se realizará tantas veces se
desee, obteniéndose diluciones 1/1.000,
1/10.000.
- De cada dilución cogemos con pipetas estériles y distintas 0,1 ml, sembrándolo sobre
las placas con agar, por la técnica de inundación.
- En la última placa obtenemos colonias aisladas.
2.b.- Método B: Inoculación previa al vertido en placa
- Disponer tres tubos de medio de cultivo fundido a 45 - 50ºC, previamente marcados con
los numeros 1, 2 y 3.
- Tomar con el asa o con una pipeta, previamente esterilizadas, la muestra y sembrar en el
tubo nº 1.
- Homogeneizar por rotación entre las palmas de las manos y tomar un asa del mismo
resembrándolo al tubo nº 2. Dejar el primer tubo en el baño a 45ºC.
- Homogeneizar el tubo 2, tomar un asa y pasarla al 3. Dejar los dos tubos en el baño.
- Verter el contenido de cada uno de los tubos, homogeneizados de nuevo, en tres placas
estériles marcadas con los números 1, 2 y 3. Esperar a que solidifique el medio.
- En la placa 3 se obtendrán colonias aisladas.
- Si se utiliza para recuento, debemos saber el calibre del asa.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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Técnica de dilución en masa
- En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a
continuación se añade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado
aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma
los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo,
permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
- Otra variación de esta técnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y
atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La
homogeneización de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotación del tubo entre
las manos, antes de verterlo sobre la placa.
- En ambos casos, tras la homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique
el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición
invertida).
- Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para
determinar el número de microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son
anaerobios facultativos o microaerófilos.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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TÉCNICAS DE RECUENTO O SIEMBRAS CUANTITATIVAS
En este tipo de siembra nos interesa disponer del microorganismo uniformemente
distribuido en el medio. Este procedimiento es útil para el recuento de microorganismos. Se
utiliza para muestras de orina, cepillados alveolares, telescopaje, recuento de microorganismos
en alimentos, etc.
Se utiliza también para estudios de sensibilización a antibióticos.
1- RECUENTO EN PLACA
1.a.- inoculación previa al vertido en placa: TÉCNICA DE BARRY
- Se toman 0,1 ml del inóculo en un tubo y se añaden 25 ml del medio de cultivo
fundido (temperatura no superior a 45 - 55ºC, para no esterilizar el inóculo).
- Homogeneizar por rotación entre las palmas de las manos.
- Verter en la placa de petri.
1.b.- inoculación sobre la superficie del medio Solidificado:
TÉCNICA DE KIRBY-BAUER:
- Preparado el inóculo en un medio estéril, se introduce un hisopo o escobillón estéril
hasta que quede impregnado.
- Se elimina el exceso del inóculo presionando el hisopo, con un movimiento de rotación,
contra la pared del tubo.
- Se siembra la placa empleando la técnica de los 3 giros, pero pasando 2 o 3 veces el
hisopo por toda la superficie antes de efectuar cada giro, para distribuir uniformemente
el inóculo.
- Se deja secar la placa durante 4 o 5 minutos en posición semiabierta e invertida,
quedando lista para ser cultivada.
- se emplea para estudios de sensibilidad o inoculación directa del producto patológico.
dibujo
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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TÉCNICA DE INUNDACIÓN:
- Se añade a la placa 0,5 ml del inóculo, inundando el medio con un movimiento de
rotación, para distribuirlo por toda la superficie de la placa.
- Antes de incubar, dejar secar 10 - 15 minutos a temperatura ambiente (la placa debe
estar tapada).
TÉCNICA DE ESTRÍA:
- Flamear el asa.
- Se deposita una gota de inóculo o muestra en el centro de la placa, extendíendola
hacía la derecha e izquierda.
- Diseminar el inóculo en ángulo recto con respecto a la estría primaria, comenzando
del centro hacía arriba.
- se gira la placa 180º y se termina de diseminar la muestra en la otra mitad (del centro
hacía arriba).
Este último método es el mas utilizado, sobre todo en orinas.
dibujo
2- EN TUBO: MÉTODOS INDIRECTOS.
Existen métodos indirectos para el recuento de colonias, que si bien no miden
directamente el tamaño de una población, permiten obtenerlo por otra medida.
Entre ellos el más utilizado es:
MEDIDA DE TURBIDEZ: las partículas en suspensión, al ser atravesadas por un rayo
de luz de una determinada longitud de onda, hacen que ese rayo sufra una difracción. Cuantos
más microorganismos se desarrollen, mayor turbidez tendrá la suspensión y será la difracción.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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C.- OTRAS TÉCNICAS DE SIEMBRA
SIEMBRA EN TUBO
1.a.- Siembra por estría en superficie inclinada
• Se toma la muestra con el asa y se introduce en
el tubo que contiene el medio.
• Deslizar el asa con movimientos de zig - zag
desde el fondo de la superficie y en progresión
ascendente.
• Se suele usar para obtener masa de
microorganismos, renovar cepas (resiembra) y
pruebas bioquímicas.
1.b.- Siembra en picadura
• Se siembra la muestra con la punta del hilo y se
punciona en el centro del medio (contenido en el
tubo) introduciendo la punta del hilo hasta 2 - 3
mm del fondo del tubo.
• Se extrae el hilo por la misma por la misma línea
que se introdujo.
• Si se trata de medio inclinado, se puede realizar
también una siembra en estría por la superficie
del medio.
• Cuando el agar es fluido, en lugar del hilo se puede utilizar el asa.
• Se suele emplear para técnicas de identificación (hidrólisis de principios inmediatos, Kliger,
motilidad, etc).
1.c.- Siembra en tubo en medio líquido
Una manera sencilla de obtener bacterias es hacerlas crecer en un medio líquido, en un
tubo de ensayo.
Formas de manifestarse el crecimiento bacteriano en un medio líquido:
- enturbiamiento: opacidad más o menos densa.
- formación de velo: pequeña masa de células que flotan en la parte superior del cultivo.
- sedimento: deposito de células que permanece en la parte inferior del cultivo, pero que
se pone nuevamente en suspensión si el tubo se sacude sucesivamente.
Formas de realizar la siembra en medio líquido
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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- con asa: se sumerge el asa cargada en el medio y se agita.
- con pipeta: se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se
homogeneiza.
- con escobillón o hisopo: de igual modo que con el asa.
Técnica:
- Tomar dos tubos de caldo común.
- Rotular un tubo "control" y dejar sin
inocular.
- Realizar la siembra en el otro tubo.
- Incubar el tubo sembrado en la
estufa a la tª y tiempo determinado.
- Examinar el cultivo para determinar
el crecimiento. No agitar el tubo
antes de hacer las primeras
observaciones, para determinar si ha
habido enturbiamiento, formación
de velo o sedimento.
NORMAS GENERALES TRAS LA SIEMBRA DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
• Inmediatamente hecha la siembra, tanto en tubo como en placa, deben taparse o cerrarse los
recipientes:
.- Los tubos se taparán con torundas de algodón graso, parafina o tapón hermético.
.- Frascos y botellas con tapón de cierre hermético.
.- Matraces: igual que los tubos.
.- Placas de petri, por su diseño quedan perfectamente cerradas.
• Los distintos recipientes, para su cultivo se colocarán de la siguiente manera:
.- Tubos: en posición vertical colocados en gradillas.
.- Frascos, botellas y matraces: apoyados en su propia base.
.- Placas de petri: salvo raras excepciones (cultivo de hongos) se colocaran de forma
invertida.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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CULTIVO O INCUBACIÓN DEL MEDIO
Tras la siembra de un medio de cultivo, este debe ser colocado en un ambiente
adecuado para el desarrollo de los microorganismos.
Los FACTORES que afectan al cultivo de microorganismos son:
1. Temperatura: generalmente se incuban a la tª fisiológica (35 - 37ºC), aunque determinados
microorganismos pueden requerir otra temperatura (psicotrofos: 22 ºC; coliformes fecales:
44ºC). Dichas temperaturas se consiguen en las estufas de cultivo que pueden ser:
2. Atmósfera: según sea aerobio, anaerobio o anaerobio facultativo. La anaerobiosis se
consigue a través de:
- Jarras de anaerobios: en las que se produce en su interior una reacción química
que genera CO2. Constan de un sobre generador de H y CO2, un indicador de
anaerobiosis y un catalizador.
- Cabinas de anaerobios: es una cámara que lleva incorporados unos guantes de
plástico para manipular el material que se encuentra en el interior. El ambiente
se mantiene anaeróbico mediante un catalizador (paladio e hidrógeno).
3. Protección ambiental: el microorganismo durante su incubación debe estar protegido de
agresiones externas y posibles contaminaciones, para garantizar los resultados.
El control de estos factores se puede llevar a cabo mediante estufas de cultivo.
- Estufas convencionales: en las que se incuban medios de cultivo con
microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Controlan la tª y la protección
ambiental.
- Estufas o incubadoras de CO2: son aquellas que además controlan el contenido de
CO2 y se utilizan en el cultivo de anaerobios.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
Para cultivar estas bacterias es necesario recurrir a distintos procedimientos para eliminar
el oxígeno o bien destruir el peróxido de hidrógeno formado. Para ello existen distintos
métodos:
1) Métodos físicos:
a- Ebullición: Se persigue eliminar el oxígeno haciendo hervir el tubo de ensayo con medio de
cultivo a baño María durante 20 minutos y enfriándolo bruscamente. Para evitar que el oxígeno
vuelva a incorporarse, se sellan los tubos con una sustancia inerte, como la mezcla “vaspar”,
(vaselina y parafina en partes iguales).
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
31
b- Eliminación del aire con bomba de vacío: Para esto se utilizan tubos especiales:
• Tubo Roux: Se realiza la siembra en estos dispositivos,
cargado con medio de cultivo. Se cierra a la llama el tubo a
la altura del estrangulamiento y por la rama lateral se hace
el vacío con una bomba, y se cierra también a la llama la
rama lateral (Fig.a).
• Tubo Fraenkel: Una vez sembrada la muestra dentro del
tubo, se hace pasar un gas inerte (nitrógeno, hidrógeno)
por la rama A, que burbujeará en el medio y efectuará un lavado; la mezcla de hidrógeno y
oxígeno saldrá por B, quedando al final una atmósfera de hidrógeno solamente. Ambas
ramas se cierran a la llama, luego se coloca en estufa de incubación (Fig.b).
2) Métodos químicos:
Hay ciertas sustancias químicas que tienen propiedades
reductoras, pero no pueden ser incorporadas al medio de cultivo
debido a que son tóxicas para las bacterias.
El pirogalato de sodio o potasio es lo más usado para este
fin, empleando tubos especiales o desecadores.
Se coloca el tubo de ensayo sembrado dentro de otro tubo
más grande que contiene ácido pirogálico e hidróxido de sodio o potasio. Se cierra con tapón de
goma y se sella con vaspar.
Hay sustancias reductoras que por ser no tóxicas se las puede agregar directamente al
medio de cultivo, por ejemplo: glucosa 2%, sulfito de sodio 0,1% y formiato de sodio 0,5%.
3) Métodos biológicos:
a- Medio de Tarozzi: Es un medio de cultivo común al que se le agrega trozos frescos de
órganos de animales (conejo, cobayo), ricos en catalasa (hígado, pulmón, cerebro).
b- Tejidos vegetales: Similar al caso anterior, se agregan tejidos vegetales ricos en catalasa, por
ejemplo: papa, zanahoria, granos de legumbres, etc.
c- Semillas: Colocando semillas de cereales en la base
de un desecador, estas actúan como reductoras durante el
proceso germinativo, tomando el oxígeno del medio y
desprendiendo dióxido de carbono, con lo cual se logra
el ambiente necesario para el desarrollo de los
microorganismos. En la parte superior del desecador se
colocan las cajas y tubos sembrados, se tapa y se coloca todo el dispositivo en estufa de cultivo.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
32
4) Además de los métodos anteriormente descriptos (físicos, químicos y biológicos), una forma
directa de realizar el aislamiento de anaerobios es mediante el uso de la Pipeta de Vignal, cuyo
procedimiento es el siguiente:
Al medio de cultivo agarificado se lo
mantiene licuado a 45ºC, se siembra la muestra y se
succiona con la pipeta, que tiene sinuosidades; una
vez rellenada toda la pipeta con la mezcla de medio
de cultivo y muestra microbiana, se cierran los
extremos a la llama y se coloca en estufa de cultivo.
Donde se observen colonias aisladas se procede a cortar la pipeta con una lima y con una aguja
se toma la colonia elegida para obtener el cultivo puro.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS MICROAEROBIOS:
a- Desecadores: Son dispositivos dentro de
los cuales van los tubos sembrados; se
realiza el vacío con una bomba y se inyecta
dióxido de carbono hasta lograr una presión
parcial de oxígeno inferior a la normal.
Una variante práctica de este método
es colocar una vela encendida dentro del
desecador o bajo una campana de vidrio,
cerrando herméticamente el dispositivo. La llama de la vela consume el oxígeno y libera
dióxido de carbono, logrando de esta forma un ambiente de microaerobiosis.
b- Estufas especiales: Una vez colocadas las cajas y tubos sembrados, estas estufas permiten
modificar la composición gaseosa interna, mediante el reemplazo de un gas por otro, brindando
de esta manera las condiciones microaerobias requeridas por los microorganismos en estudio.
c. Medios de cultivo semisólidos: Son medios cuya concentración de agar es de 0,5-0.8%, con
lo cual se logra una condición de microaerobiosis para el desarrollo subsuperficial de los
microorganismos, tales los casos de algunos fijadores de nitrógeno como Azospirillum y
Acetobacter.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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F) TÉCN DE RECUENTO
RECUENTO EN PLACA DE LAS COLONIAS
Para realizar dicho contaje se toman las placas que contengan de 30 a 300 colonias
aproximadamente y en un contador de colonias se procede al contaje; también se puede hacer
manualmente.
El recuento de las bacterias nos da idea del grado de contaminación que hay en una
muestra.
Suponiendo que cada colonia procede de un solo microorganismo y que se han sembrado
con un asa calibrada (con un volumen determinado), el nº total de gérmenes será el resultado de
multiplicar el nº de colonias por el volumen del asa calibrada.
Ejem:
Contamos 50 colonias y han sido sembradas con un asa de 1/100 (volumen=0,01 ml)
en un volumen de 0,01 ml-------------crecen 50 colonias
" " " 1 ml ----------- " X "
X = 5.000 colonias/ ml muestra
Si la siembra se ha hecho por dilución, el recuento será:
Ejem: si la dilución es de 10-2 y el nº de colonias es de 50 en 0,1 ml del medio, el nº de
microorganismos será:
10-2 = 1/100
si en una dilución 10-2 ---------------50 colonias
" " " 1 ------------- X
X = 5.000 colonias en 0,1 ml
si en 0,1 ml --------------- 5.000 colonias
" 1 ml --------------- X
X = 50.000 colonias/ ml muestra
CALCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
Se trata de una prueba presuntiva (se presupone que es un determinado microorganismo
porque tiene una determinada reacción positiva), por la cual se obtiene el número aproximado
de bacterias que había en la muestra. Para ello:
1. Se preparan 3 series de 3 tubos con medio de cultivo
2. Se realizan 3 diluciones seriadas de la muestra: 1/10, 1/100, 1/1000.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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3. Se realizan las siembras:
a. se siembran los 3 tubos de la primera serie con 1 ml de la muestra 1/10
b. se siembran los 3 tubos de la segunda serie con 1 ml de la muestra 1/100
c. se siembran los 3 tubos de la tercera serie con 1 ml de la muestra 1/1000
4. Se incuban las 3 series.
5. Se leen los resultados y se extrapolan a la siguiente tabla.
NMP de microorganismos por g o ml. Utilizando 3 tubos
sembrados c/u con 1 ml de diluciones 10-1, 10-2, 10-3
Número de tubos positivos NMP/ g o ml
0 0 0 < 3
0 0 1 3
0 1 0 3
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100
3 3 3 >2400
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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G) EL MICROSCOPIO
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño.
Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos.
Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto
microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño
original.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. En el
microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula
el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrónico utiliza un rayo
de electrones controlado por un campo magnético.
MICROSCOPIO OPTICO
Los microscopios ópticos suelen producir un aumento de 1000 veces el tamaño original.
Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular:
• La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el
condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y
así, puede elegirse una posición que consiga el foco preciso.
• El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del
objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza
el aumento final.
Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres
objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados
sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado
con el condensador.
• La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total
de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular.
El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores
que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se
usa principalmente como lupas y cristales de aumento.
Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder
resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos.
Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios
de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras.
El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda
utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
36
Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda está fijada y es
por lo que la resolución de un objeto es función de la apertura numérica; cuanto mayor sea la
apertura, el objeto resuelto será más pequeño.
Un factor que afecta a la apertura numérica, además de la construcción de la lente, es el
medio a través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del objeto por el aire,
su apertura numérica nunca será mayor de 1,0; para conseguir aperturas numéricas mayores que
ésta, el objetivo debe estar inmerso en un líquido de mayor índice de refracción que el aire.
A estos líquidos se les denomina aceites de inmersión que se utilizan con los objetivos de
inmersión obteniendo una apertura numérica entre 1,2 y 1,4. Aún así, al utilizarse la luz visible
(longitud de onda) estos microscopios llegan a tener un poder de resolución de
aproximadamente 0,25 µm, lo que significa que las partículas con un tamaño más pequeño de
0,25 µm no pueden distinguirse unas de otras.
PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO
- OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
- OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
- CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
- DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
- FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
- SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
- PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
- CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, …..
- REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
Partes de un microscopio óptico��
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
37
- TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que
consigue el enfoque correcto.
MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina
completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar
en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x
4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se
corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos
o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente
con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se
perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir
la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación
y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se
descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una
preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
6. Empleo del objetivo de inmersión:
a. Bajar totalmente la platina.
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la
zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el
de x40.
d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la
gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de
inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo
de accidente es muy grande.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
38
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a
usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea
enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el
objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la
preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición
de observación.
j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica.
Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de
observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la
misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para
evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe
guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente
con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el
objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable).
En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el
aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de
alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se
aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico,
platina, revólver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la
preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo
agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del
ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido,
secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al
acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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Tipos de microscopios ópticos:
• Microscopio de campo claro: usa una fuente de luz directa, bien una bombilla, o bien la
luz solar. Ya que los microorganismos son transparentes, es difícil distinguirlos con este
tipo de microscopía, por lo que se suelen teñir.
• Microscopio de campo oscuro: usa un microscopio óptico equipado con un condensador y
objetivo especial que iluminan los microorganismos en la muestra frente a un fondo oscuro.
Este método se utiliza para visualizar microorganismos vivos sin teñir.
• Microscopio de fluorescencia: la muestra se tiñe con una sustancia fluorescente que
absorbe la energía de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas
más largas (verde). En esta técnica una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo
específico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al
microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar.
• Microscopio de contraste de fases: es un microscopio óptico modificado que permite
contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. Mediante un condensador y un
objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que vaya en diferentes rutas a
través de las distintas partes de una célula. El resultado es una imagen con diferentes grados
de brillo y oscuridad. Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que las
partes de la célula que tienen una densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras.
Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar
microorganismos.
MICROSCOPIO ELECTRONICO
Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les
permite tener un poder de resolución muy elevado. Es posible con el microscopio electrónico
resolver objetos separados por una distancia de 0,003 µm, y los aumentos pueden llegar a ser de
un millón de veces.
Microscopía Electrónica de Transmisión (MET).- A causa de la naturaleza de este
instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es
demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el
microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Una sola célula
bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas.
Microscopía Electrónica de Barrido (MEB).- Si sólo tiene que observarse el contorno de un
organismo, no son necesarias secciones finas por lo que se montan células enteras que se
recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de electrones es dirigido sobre la
preparación y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de
observación produciendo una imagen.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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H) OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS: TINCIONES
Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante
microscopios ópticos, para que esta visualización sea óptima, deben cumplirse los siguientes
requisitos en cuanto a la preparación de la muestra:
- debe ser homogénea.
- si se usa colorante, la cantidad debe ser adecuada.
- técnica adecuada, en función al tipo de microorganismo a observar.
- ausencia de elementos contaminantes, bien en la propia muestra o en los
instrumentos de manipulación (asas, pipetas etc).
- los portas en los que se haga la extensión y los cubres estarán escrupulosamente
limpios.
Hemos señalado anteriormente la necesidad del empleo de una técnica adecuada en
función de lo que pretendamos estudiar, atendiendo a esto haremos una clasificación global,
según observemos gérmenes vivos o muertos (sometidos a determinadas tinciones). Ambas
técnicas tienen ventajas e inconvenientes, que veremos más detalladamente.
A continuación, vamos a describir las técnicas más comúnmente usadas para realizar
preparaciones para microscopios ópticos:
Método de la cámara húmeda Examen en fresco
Método de la gota pendiente Visualización
de gérmenes in vivo
Coloración Vital
T. Simple
T. de Gram T. Diferencial
T. AAR o de Ziehl-Neelsen
T. Negativa T. Especiales
T. Fluorescente
T. de cápsulas
T. de esporas
T. de flagelos
Tinciones bacterianas
T. Estructurales
T. de corpúsculos metacromáticos de Loëffler
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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VISUALIZACIÓN DE GÉRMENES "IN VIVO"
Consiste en observar los microorganismos vivos a través del microscopio con ayuda de
alguna sustancia que lo facilite, pero nunca interfiriendo. Dado que el microorganismo no está
muerto podemos observar su movilidad, morfología y agrupamiento.
Ventajas:
- apreciación más fiel de la realidad, de la morfología, agrupación y movilidad.
Desventajas:
- poco contraste entre la muestra y el fondo, así como entre las estructuras del
germen.
- manejo engorroso, pues es material vivo que puede contaminar.
- imposibilidad de almacenamiento de la preparación.
TÉCNICA PARA UNA BUENA OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
1- Adecuada utilización del microscopio:
- ideal verlos sobre fondo oscuro; en su defecto cerrar parcialmente el diafragma.
- para facilitar el enfoque, comenzar localizando el porta.
- comenzar con objetivos de menor aumento e ir aumentando hasta el de inmersión.
2- Crear un soporte adecuado para la visualización del microorganismo:
- a la muestra se le suele añadir un líquido o medio de montaje, generalmente suero
fisiológico.
- si la muestra se encuentra en estado líquido, depositar una gota de ésta sobre el
porta directamente.
3- Evitar la desecación (pues moriría el microorganismo), esto se consigue:
- sellando la cámara que hay entre el porta y el cubre, con vaselina o parafina
- reduciendo la intensidad de la luz.
TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN AL MICROSCOPIO
a) EXAMEN EN FRESCO
Objetivo: suspendiendo el microorganismo en un medio líquido transparente, es posible
observar al microscopio sus características morfológicas, movilidad y disposición.
a.1. MÉTODO DE LA CÁMARA HÚMEDA
Ventajas: - rapidez
- evita distorsiones ópticas por el efecto lupa de los portas excavados.
Desventajas:- la de toda determinación "in vivo": poco contraste
- la motilidad se observa con dificultad.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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Material: mechero, porta, cubreobjetos, cultivo reciente, parafina líquida o vaselina y asa de
cultivo.
Técnica:
- Depositar en el centro del portaobjetos, perfectamente limpio y desengrasado, una
gota de agua estéril o s. fisiológico.
- Tomar con el asa estéril una muestra y realizar una suspensión con la gota de agua.
- Si el medio es líquido, simplemente depositar una gota en el porta.
- Colocar sobre la suspensión un cubreobjetos, evitando que se formen burbujas de
aire. Se puede sellar con vaselina o parafina para evitar la desecación.
- Observar al microscopio.
a.2.- MÉTODO DE LA GOTA PENDIENTE
Ventajas: - mejor observación de la motilidad debido al mayor grosor de la muestra.
- menor facilidad para la desecación.
Desventajas: - distorsión óptica.
- método lento y engorroso.
Material: porta-excavado, cubreobjetos, cultivo reciente, parafina líquida o vaselina y asa de
cultivo.
Técnica:
- Limpiar escrupulosamente un porta excavado y un cubre.
- Colocar en los bordes del cubre vaselina o un poco de agua.
- Poner una gota de suspensión microbiológica en el centro del cubre.
- Tomar el porta y colocarlo en la excavación justo encima de la gota, presionando para
que se unan.
- Invertirlos, procurando que quede suspendida la gota dentro de la excavación del porta,
sin que toque ningún borde, ya que se extendería.
- Observar al microscopio con objetivo de 40x.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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b) COLORACIÓN VITAL
Es un proceso intermedio entre el examen en fresco y las técnicas de tinción.
Objetivo: contrastar algunas estructuras celulares con mayor intensidad y sin que se produzca la
muerte del microorganismo. Se puede observar también la movilidad.
Ventajas: - más contraste que los métodos anteriores, lo que permite mejorar la visión
morfológica, sin que se altere la motilidad y agrupación.
Desventajas: - es relativamente lento.
- se obtiene mayor información morfológica con una tinción de
microorganismos muertos.
Colorantes utilizados: no tiñen, sino que se acumulan en ciertas partes del germen. Se
caracterizan por ser muy poco tóxicos, al estar muy diluidos (aunque siempre terminan
matando al germen).
Azul de metileno: en solución acuosa, a una dilución 1/500 o 1/1000.
Rojo neutro: " " " " " " 1/1000.
Verde Janus: " " fisiológica " " 1/500.
Técnica:
- limpiar perfectamente porta y cubre.
- colocar una gota de suspensión en el centro del porta.
- añadir una gota de colorante con un asa de siembra o una pipeta pasteur y mezclarla
bien ayudados del asa y la pipeta.
- colocar el cubre, procurando que no se formen burbujas.
- observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Interpretación: los microorganismos se observan coloreados de azul, rojo o verde (dependiendo
del colorante) en un medio acuoso del mismo color.
TINCIONES BACTERIANAS
En la mayoría de las ocasiones, para la observación de los microorganismos, estos son
teñidos, ya que de esta forma son más fáciles de visualizar y se pueden poner de manifiesto
características diferenciales.
TEÑIR es contrastar más un microorganismo y sus estructuras, mediante el empleo de un
colorante o varios que actúen de forma combinada.
Objetivo:
- hacer más visibles las bacterias
- distinguir las estructuras de los microorganismos por su comportamiento frente al
colorante.
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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Ventajas:
- mayor claridad en la observación de los microorganismos después de ser
coloreados.
- mayor contraste: se pueden demostrar mejor las diferencias entre células de
distintas especies e incluso de la misma.
- material de más fácil manipulación (no contaminante)
Desventajas:
- no se aprecia la morfología del microorganismo vivo, ya que el colorante lo mata.
- no se aprecia la movilidad.
TÉCNICA GENERAL DE TINCIÓN
La mayor parte de los métodos de tinción constan de los siguientes pasos:
1.- Rotulación: en un extremo del portaobjetos, para evitar errores.
2.- Extensión: sobre un portaobjetos, para obtener una película lo mas homogénea posible. Se
emplearán portaobjetos bien limpios, desengrasados y secos, desechando los rayados. La
extensión se realizará con:
o un asa de siembra
o un hisopo
o canto esmerilado de un portaobjetos.
o Si la muestra está en un medio líquido, depositar, con ayuda de un asa, una o varias
gotas sobre el porta.
o Si la muestra o el microorganismo están en un medio de cultivo sólido, se pone
previamente en el porta una gota de agua destilada o solución salina y se depositará una
colonia haciendo la extensión.
3- Desecación: tiene como finalidad eliminar el agua de la extensión para proceder a la fijación.
Se consigue dejando secar a tª ambiente, en estufa o al calor “suave” de la llama.
4- Fijación: consiste en la transformación de la composición físico-química del
microorganismo, manteniendo la morfología de sus estructuras lo más parecido a lo que tenía
"in vivo" (Por ej: coagula las proteínas, evitando que se alteren en las distintas fases de tinción).
Se produce la muerte del microorganismo, quedando la extensión adherida al portaobjetos.
La fijación se puede realizar por:
- calor: se consigue pasando 2 o 3 veces el porta, con la extensión hacia arriba, por la
llama del mechero, ayudados por las pinzas de madera. Cuando el porta está lo
suficientemente caliente para no aguantarlo con la mano, la fijación es completa.
- inmersión en soluciones fijadoras: metanol, alcohol etílico-acetona,etc.
5- Tinción: en la que el microorganismo capta el colorante. Este se dejará actuar durante un
tiempo determinado. Puede ser de varios tipos:
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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• Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando
de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante
(nigrosina).
• Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la
tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de
agrupación de las células.
• Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura.
El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero,
denominándose colorante de contraste.
Los colorantes son sustancias orgánicas capaces de teñir estructuras cuando se ponen en
contacto con ellas.
En ocasiones, los colorantes necesitan el concurso de mordientes, que son sustancias no
colorantes que refuerzan la acción de un colorante mediante el ataque a componentes celulares
que facilitan la acción de éste (lugol, fenol, etc.). Los mordientes pueden ir incorporados o no a
la solución del colorante.
6- Lavado: con agua destilada, para eliminar el exceso de colorante. El lavado se realizará entre
todos los pasos. El agua se vierte en el extremo del porta, nunca encima de la preparación.
7- Secado: con lo que mejora la visualización al microscopio. Se hará al aire o presionando
entre dos papeles de filtro.
8- Decoloración: a veces es interesante que determinadas bacterias pierdan el color que
tomaron, lo que permite diferenciarlas de las que no lo pierden. No se debe forzar la
decoloración, ya que pueden perder el color todas las bacterias.
9- Observación al microscopio: empezando con objetivo de poco aumento para ver si la
muestra está bien distribuida, suficientemente concentrada y si la morfología es buena. La
presencia de artefactos, como restos de colorante, polvo, hilos, etc, distorsionan la preparación y
pueden estropearla.
FACTORES QUE INFLUYEN EL LA TINCIÓN
- Pureza de colorantes y reactivos: deben ser lo mas puros posibles.
- Concentración del colorante: oscila entre 0,2 y 2 %, pudiendo variar.
- pH de la solución del colorante: los colorantes se dividen en:
azul de metileno fucsina fenicada safranina básicos
cristal violeta Rojo congo Eosina ácidos Nigrosina
anfóteros o neutros Sudán negro
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
46
- Temperatura: en general, temperaturas superiores a la ambiental, disminuyen el tiempo de
tinción.
- Sustancias adicionales: como sustancias tampones, decolorantes, etc.
- Tiempo de tinción: dependen del colorante, técnica de tinción, especie a teñir, etc. Suele
oscilar entre 1 y 10 minutos.
TIPOS DE TINCIONES Según la técnica aplicada, las tinciones se clasifican en:
1. Tinción simple: el teñido de los microorganismos se hará aplicando exclusivamente una
solución colorante. Nos proporciona información sobre la forma, agrupamiento y cantidad
de gérmenes.
2. Tinción diferencial: se utilizan dos colorantes de modo, que los gérmenes queden teñidos
con uno u otro, dependiendo del tipo que se trate. Pone de manifiesto las diferencias
existentes entre las distintas células bacterianas o entre las distintas partes de la misma
célula. Dentro de este tipo están:
- Tinción de Gram
- Tinción ácido alcohol resistente o de Ziehl- Neelsen.
3. Tinciones especiales:
- Tinción negativa
- Tinción fluorescente.
4- Tinciones estructurales: el colorante pone de manifiesto determinadas estructuras presentes
sólo en algunos gérmenes:
- Tinción de cápsulas
- " " Esporas
- " " Flagelos
- Tinción de corpúsculos metacromáticos de Loëffler
TINCIÓN SIMPLE:
Objetivo: observar la morfología, asociación y la cantidad de microorganismos mediante el uso
de un colorante. Se basa en la afinidad de éste, por los distintos componentes celulares, que
pueden ser de mayor o menor intensidad produciéndose un contraste diferenciador de las
estructuras celulares.
Colorantes más utilizados son: (1)⋅ Azul de metileno, (2) Violeta de Genciana, (3) Fucsina
Técnica:
- Rotular los datos oportunos
- Extender la muestra
- Secar
- Fijar
- Coloración durante 1 o 2 minutos.
- Lavar
- Dejar secar la preparación
- Observar al microscopio
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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Resultados e interpretación:
o si el colorante utilizado es azul de metileno o violeta de genciana, los
microorganismos aparecen teñidos de azul.
o Si es fucsina aparecerán teñidos de rojo.
TINCIONES DIFERENCIALES
TINCIÓN DE GRAM
Es la técnica de tinción diferencial más importante que se utiliza en bacterias. El primero
en describirla fue el danés Christian Gram.
Objetivo: es la clasificación de los gérmenes según la captación o no de los colorantes que
componen esta tinción.
Fundamento: los Gram + son aquellos que resisten la acción decolorante del disolvente alcohol
- acetona tras tratamiento con un colorante básico y lugol. Los Gram - son decolorados, siendo
posteriormente teñidos con un colorante de contraste como la fucsina diluida. Este hecho es
debido a la diferente composición de la pared celular de ambos grupos de microorganismos.
Reactivos:
⋅ 1er colorante: Violeta de Genciana o Cristal Violeta al 1%
⋅ Mordiente: Lugol (aumenta la afinidad entre el colorante y las células)
⋅ Decolorante: Alcohol-Acetona 1:1
⋅ Colorante de contraste: Fuchsina diluida o Safranina al 0,5%
Técnica:
- Rotular
- Extender
- Secar
- Fijar
- Cubrir con violeta de genciana (1’)
- Lavar con agua destilada
- Cubrir con lugol (1 min)
- Lavar con agua destilada
- Decolorar con alcohol-acetona, hasta que el disolvente salga exento de colorante
(aproximadamente 30 '')
- Lavar con agua destilada
- Cubrir con fucsina básica diluida (3') o safranina (1')
- Lavar con agua
- Secar
- Observar al microscopio
Isabel Rita Gutiérrez Vega UT 2: Técnicas microbiológicas básicas
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Mecanismo de acción o fundamento: Todas las bacterias toman el primer colorante (violeta de
genciana o cristal violeta) ayudadas por el mordiente (lugol), pero las Gram (-) lo pierden al
decolorar con alcohol-acetona, y pueden tomar el 2º colorante. Se cree que las Gram (-) pierden
el colorante por la gran cantidad de lípidos que tienen estas bacterias en la pared celular, que son
disueltos por el alcohol, de forma que quedan orificios por los que sale el colorante.
Interpretación: En base a la explicación anterior es fácil deducir la interpretación, así,
denominamos bacterias Gram (+) a aquellas que vistas al microscopio presentan una
coloración azul o violeta. Las bacterias Gram (-) presentarán una coloración rojiza.
Existen bacterias que, en determinadas fases del crecimiento, son Gram variables y
aparecen en la misma preparación unas células teñidas de azul y otras de rojo; esto ocurre en
algunas especies del Género Bacillus.
TINCIÓN DE ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENCIA DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)
Objetivo: diferenciar las bacterias resistentes a la decoloración con ácido-alcohol de las
restantes. Las bacterias AAR pertencen al género Mycobacterium cuyas especies más
importantes son el bacilo de Koch y el de Hansen. (tuberculosis y lepra)
Reactivos:
⋅ Solución fenicada de fucsina (1er colorante)
⋅ Alcohol-clorhídrico (decolorante)
⋅ Azul de metileno (2º colorante)
Fundamento: Las bacterias AAR, como su nombre indica, son muy resistentes, tanto a la
coloración como a la decoloración. Se cree que las Micobacterias tienen en su pared gran
cantidad de lípidos, siendo los colorantes más soluble en éstos que en el líquido decolorante y,
por tanto no pierden el color, esto no ocurre con las bacterias no AAR. Para teñirlas hay que
forzar la coloración mediante calor.
Técnica:
- Rotular
- Extender
- Secar
- Fijar
- Cubrir la extensión con fuchsina fenicada y teñir en caliente de 5 a 10 min.; para
ello pasar una llama varias veces por debajo del porta hasta la emisión de vapores.
No dejar hervir. Añadir más colorante si es preciso, para evitar desecación. Esta
operación se realiza 3 veces a intervalos de 5 minutos. Podemos cubrir la extensión
con papel de filtro sobre el que se echa el colorante.
- Lavar con agua
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- Decolorar con el ácido-alcohol, hasta que adquiera un color rosa claro,
aproximadamente 5 minutos.
- Lavar con agua
- Cubrir con azul de metileno durante 2 '
- Lavar con agua
- Secar al aire
- Observar al microscopio.
INTERPRETACIÓN: apreciamos un fondo azul y los bacilos AAR de color rojo.
Las bacterias teñidas según esta técnica se clasifican en:
- Ácido - alcohol resistente cuando retienen la fuchsina y quedan teñidas de color
rojo. (micobacterias)
- No ácido - alcohol resistente: si se decoloran por el alcohol- clorídrico y toman el
color de contraste de azul de metileno.
MÉTODO DE TAN-THIAN-HOK
Es un método que utiliza los mismos componentes que el Ziehl-Neelsen, pero su
procesamiento es más rápido y menos engorroso.
Composición de los colorantes:
- Kinyoun: fuschina, fenol, etanol, agua destilada
- Gabett: azul de metileno, ácido sulfúrico, alcohol absoluto y agua destilada.
Técnica:
- Tras realizar la extensión de la muestra, fijar a la llama
- Cubrir con la solución de Kinyoun durante 3'.
- Lavar durante 30''
- Cubrir con la solución de Gabett, durante 1'
- Lavar y secar.
Interpretación: Las bacterias AAR se observan rojas tras la decoloración.
TINCIONES ESPECIALES
TINCIÓN NEGATIVA
Objetivo: colorear el fondo, resaltando los microorganismos que quedan sin colorear.
Ventajas: permite ver la morfología externa del microorganismo: forma, cápsulas, flagelos,
asociación, etc. Es por lo tanto un método indirecto de probar la movilidad.
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Desventajas: no permite apreciar la movilidad del microorganismo, pues lo mata.
Colorantes: - tinta china
- solución acuosa de nigrosina al 1/100.
Técnica:
- En un porta limpio y desengrasado colocar 1 gota de colorante
- Con un asa de suspensión bacteriana, se extiende al microorganismo sobre la gota
del colorante, que debe formar al final una capa fina, pero no transparente (no hace
falta fijación previa).
- Mezclar hasta homogeneizar, con el asa de siembra.
- Dejar secar a tª ambiente.
- visualizar al microscopio.
TINCIÓN FLUORESCENTE
Objetivo: detectar bacterias cuando se encuentran en muy poca cantidad o se enmascaran con
restos de células. Por ejem. en LCR, sangre, etc.
Desventajas: - se necesita microscopio de fluorescencia.
- con frecuencia se observan artefactos.
TINCIONES ESTRUCTURALES
TINCIÓN DE CÁPSULAS
La cápsula es una capa gelatinosa, de espesor variable, situada alrededor de la pared
bacteriana. Según el MÉTODO ANTONY se colorea la cápsula de distinto color que el resto de
la bacteria
Objetivo: hacer visible la estructura mucopolisacárida que poseen algunos tipos de bacterias,
recubriendo la pared bacteriana.
Reactivos: - cristal violeta al 1% o violeta de genciana
- sulfato de cobre al 20%
Técnica:
⋅ extender, secar y no fijar la muestra.
⋅ bañar con cristal violeta 2 minutos.
⋅ lavar con la solución de sulfato de cobre.
⋅ secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Interpretación: - las cápsulas se tiñen de color azul claro.
- las células " " " " azul oscuro.
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TINCIÓN DE ESPORAS de Wirtz
Las endosporas son formas de resistencia originadas por algunos grupos de bacterias
(Bacillus, Clostridium).
Objetivo: visualizar la espora.
Mecanismo de acción: consiste en introducir un colorante dentro de las esporas, haciendo que
luego lo pierda el resto de la célula y teñir luego esta con un colorante de contraste.
La espora ante las tinciones normales presenta resistencia a la coloración, por ello hay
que emplear técnicas específicas. Esto es debido a que la cápsula de las esporas, tienen distintas
características físico - químicas que las formas bacterianas normales.
Reactivos: - solución hidroalcohólica de verde de malaquita.
- solución acuosa de safranina.
- fucsina fenicada: solución fenicada diluida de fuscina básica.
Técnica:
- Hacer la extensión, secar y fijar a la llama.
- Cubrir con verde de malaquita en caliente, con emisión de vapores 3 minutos.
- Lavar con agua fría.
- Cubrir con safranina o fucsina 30 segundos.
- Lavar, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
Interpretación: - las esporas se tiñen de verde y las células bacterianas se tiñen de rojo.
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TINCIÓN DE FLAGELOS
La observación de flagelos en preparaciones teñidas es muy difícil, debido a que se
retraen con mucha facilidad y se adhieren a la pared celular.
El diámetro de los flagelos bacterianos está por debajo del límite de resolución del
microscopio óptico, por lo que no son visibles, siendo necesario usar técnicas especiales de
tinción, de modo que el colorante adecuado forme una capa alrededor de cada flagelo,
aumentando así su diámetro aparente.
Las tinciones de flagelos se utilizan de manera específica, para diferenciar los miembros
del género Pseudomonas que tienen flagelos polares, de los miembros de Enterobacterias que
tienen flagelos periféricos.
Objetivo: colorear los flagelos presentes en algunas bacterias o parásitos móviles.
Tipos de tinciones:
1.- utilizan una sal de plata que se deposita sobre los flagelos.
2.- " fucsina básica.
Técnica general:
- Emplear un cultivo fresco de 24 horas.
- Los tiempos y composición de colorantes y reactivos varia según los autores,
básicamente todos emplean:
o fucsina básica fenicada en solución alcohólica.
o ácido tánico, como mordiente.
o sales: ClNa, (SO4)2AlK, (SO4)2AlNH4.
o a veces se añade un colorante de contraste.
- Los flagelos se observan de color rojo.
MÉTODO DE LEFSON
- Preparar la extensión en un portaobjetos cubriéndola con solución de dicromato.
- Lavar con agua, enjuagar en alcohol y secar.
- Inundar los portas con la solución colorante que lleva fucsina básica.
- Dejar reposar 10 minutos a tª ambiente (si hace calor) o en incubadora (si hace frío).
- Lavar con abundante agua.
- Secar y examinar.
TÉCNICA QUE UTILIZA UNA SAL DE PLATA
Reactivos:
- oxido ósmico 1%
- formalina 0,5%
- mordiente de Rhodes
- nitrato de plata 5%
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Técnica:
- Realizar un cultivo en medio inclinado durante 18 horas.
- Tomar una muestra y extenderla en un porta.
- Fijar al calor con vapores de óxido ósmico durante 2 minutos.
- Suspender las bacterias en formalina hasta que aparezca turbidez.
- Colocar el porta inclinado y dejar resbalar una gota de la suspensión anterior.
- Desecar al aire sin calor.
- Cubrir con el mordiente de Rhodes durante 3-5 minutos.
- Lavar con agua mediante inmersión.
- Teñir con AgNO3 calentado a 95ºC, durante 3-5 minutos.
- Lavar, secar y observar.
- Los flagelos aparecen visibles debido al precipitado del nitrato de plata.
TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS DE LOËFFLER
Reactivo: azul de metileno
Método: - Extensión
- Desecación
- Fijación al calor y enfriar
- Azul de metileno durante 5 min
- Lavar con agua
- Secar
- Observación con objetivo de inmersión.
Algunos microorganismos presentan en su interior corpúsculos metacromáticos, que se
tiñen más intensamente que el resto de la célula, tal es el caso de Lactobacillus. En esta tinción
se tiñen de azul más oscuro que el resto de la célula.
BIBLIOGRAFIA
• Dr. Pedro F. Mateos. Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia.
Universidad de Salamanca. Cultivo de los microorganismos: medios de cultivo. En:
http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema02.html
• Casas Peláez, A. Apuntes de laboratorio de microbiología de aguas.
• Solano Goñi, C. Microbiología General. Guión de prácticas. Instituto de Agrobiotecnología
y Recursos Naturales. UPNA/CSIC. 2004.
• Pascual Anderson, MR; Calderón y Pascual, V. Microbiología alimentaria. Metodología
analítica para alimentos y bebidas. 2ª edición. Díaz de Santos. Madrid, 2000.