Utilitat de la meta genòmica per NGS per la caracterització d’un brot de enterovirusDr C Launes

Grup de recerca en malalties infeccioses pediàtriques. CIBER Epidemiologia i Salut Pública (CIBERESP). CB15/00067Institut de recerca pediátrica Sant Joan de Déu, Barcelona.

• Generalitats dels EVs.

• El brot de 2016. Interrogants i respostes amb la

microbiologia convencional.

• La metagenòmica ens dona més respostes?

Pico-RNA-viridae

• Aphthovirus• Aquamavirus• Avihepatovirus• Avisivirus• Cardiovirus• Cosavirus• Dicipivirus

• Enterovirus• Erbovirus• Gallivirus

• Hepatovirus• Hunnivirus• Kobuvirus• Kunsagivirus• Megrivirus• Mischivirus• Mosavirus• Oscivirus

• Parechovirus• Pasivirus

• Passerivirus• Rosavirus• Sakobuvirus• Salivirus• Sapelovirus• Senecavirus• Sicinivirus• Teschovirus• Tremovirus

Familia

ENTERO-viridiae

• Coxsackie A

• Coxsackie B

• Polioviruses

• Echoviruses

Genus

Clasificación más reciente

• Enterovirus A• Enterovirus B• Enterovirus C• Enterovirus D• Enterovirus E• Enterovirus F• Enterovirus G• Enterovirus H• Enterovirus J

• Rhinovirus A• Rhinovirus B• Rhinovirus C

Genus

Àcid-sensibleTermosensible

Millor replicació en tracte respiratori

Transmisión

• Fecal-oral. Aguas contaminadas.• Incubación: 3-10 d.• Excreción sostenida en orofaringe (15 d) y, especialmente

heces (de 6 semanas hasta 3 meses) • J Microbiol Immunol Infect 2001; 34: 167–70.

• Resistente a alcohol, clorhexidina. • Agua y jabón. Fricción más efectiva que emulsificación

Med Microbiol Immunol. 1985;174(5):221-36.

• Sensible a derivados del Cloro.

EV-A EV-B EV-C EV-D

Cutánea Diversos Asociados a EBMP (CV-A6)Rash

Exantema Conjuntivitishemorrágica

Conjuntivitishemorràgica

Respiratoria víasaltas

HerpanginaC catarral

Faringoamigdalitis(exudados) CV-B

C catarral

Respiratoria víasbajas

- - - BronquiolitisBroncoespasmo

Neurológica MeningitisConvulsiones febrilesEncefalitis

Meningitis MeningitisPFA

-PFA

Cardíaca - Sepsis-likeMiocarditisSèpsia neonatal

-

Tiposdestacables

CV-A6CV-A16EV-71

E6 E-B5CV-A9CV-B4

CV-A24Poliovirus 1-3

EV-68EV-94

Clínica (50% asint; 95% benigna; < 6 a)

Brotes Elevada tasa de mutación

Errores en la polimerasa (J Virol. 1988; 62: 558–562). Recombinación (PLoS One. 2014; 9: e96051; Nucleic Acids Res. 2016;44:6883-95)

Aparición nuevos genotipos: Nuevos genotipos (A71 año 1969 en USA; C-117 en 2012,…) Nuevos subgenotipos (A71: C1, C2, C4…; D68…) Pequeños cambios o recombinaciones dentro de subgenotipos.

Comportamientos clínicos distintos Mayor tropismo SNC en determinadas mutaciones (J Virol. 2007;81:9386–9395)

Pérdida de tropismo cutáneo en A71 (N Engl J Med 1999;341:929–35).

Según nuevas mutaciones, escapan a sistema immune (Emerg Infect Dis. 2016; 22: 1562–1569) . Diversidad circulación tipos/subtipos según zona geográfica. Reto diagnóstico ante primeros casos de manifestaciones atípicas o

casos esporádicos!

• 1969. California (origen del virus Holanda en 1963)

• 1975. Bulgaria 705 casos (149 PFA, 44 muertes)

• 1978. Hungria.

• 1997-8. Malasia, Taiwan, Japón

• 1998, 2000-1. China.

• 1999-2000. Austràlia. Singapur.

• 2005. Vietnam.

• 2007-2012 China. 7 millones de HFMD. 500-900 èxitus.

• 2010-2011. Singapur. Vietnam.

• 2011. Notificación de casos en Marsella.

• 2012-13. Rusia.

• 2013. Australia.

Brotes

• 1962. California

• 2010. Holanda/Alemania.

Respiratorios graves.

• 2012-14. USA. Respiratorios graves.

D68. PFA (?).

EV71 D68

Rodà D, et al . Clinical characteristics and molecular epidemiologyof Enterovirus infection in infants < 3 months in a referral paediatric hospital of Barcelona. Eur J Pediatr. 2015;174:1549-53.

• Mayoritarios: E5 y E11. Primavera / verano. Buena evolución.

Laura Valero-Martín, et al. La estacionalidad en la circulación de tipos de EV condicionó una diferente expresión clínica en lactantes menores de 3 meses. doi:10.13140/RG.2.1.1089.2403

• > 60% infecciones por E5 y E9 van con meningitis.

• 2012 circula E-5 mayoritariamente Brote meningitis aséptica.

• 5 casos EV71 (2010, 2011, 3 2012). C clínico benigno, buena evolución.

Cabrerizo M, et al. Molecular epidemiology of enterovirus 71, coxsackievirus A16 and A6 associated with hand, foot and mouth disease in Spain. Clin Microbiol Infect. 2014;20:O150-6• EV-A71, muy minoritario < 2%. Todos del mismo subgenogrupo (C2).

Epidemiología molecular en nuestro entorno

D68: You don't see what you don't look for

Launes C, et al. Molecular epidemiology of severe respiratory disease by human rhinoviruses andenteroviruses at a tertiary paediatric hospital in Barcelona, Spain. Clin Microbiol Infect.2015;21:799.e5-7

2010-2012. 38 Severe LRTI with rhinovirus detection.

3 enterovirus D68 in 2010. (Simultaneous outbreak in the

Netherlands and Germany). J Clin Virol. 2011;52:103-6. Viruses. 2015;7:6043-50).

HRV and EV-D68, shared clinical manifestations (respiratory).

Asthmatic children.

¿ Qué pasó en 2016?

- Febrero, 1 PFA asociada a EV en HVH. Posteriormente, EV-D68- Marzo-Abril (informe AEPED-SEIP):

- Camp de Tarragona. Encefalitis “característica”. Detección EV en aspirado o en heces. NO EN MUESTRA LCR.

- 1 éxitus Reus con encefalitis de tronco por necropsia y edema pulmonar.

- 1a semana mayo: 1er caso encefalitis tronco en nuestro centro. Finales de semana, notificación “CLUSTER DE CASOS DE MALALTIA NEUROLÒGICA AGUDA” HVH (11 casos) CatSalut. Orientacions.

- 19 mayo. Anuncio Público del brote por el Conseller de Salut

24-48hMioclonías del sueño

ExageradasSOMNOLENCIA MARCADA

48-36hTemblor

generalizadoreposo

24-72hRombencefalitisAtaxia cordones posteriores y/o

Cerebelosa

Cuadro vírico(2-5 días)

(Fiebre, vómitos +/-exantema b-m-p)

Alta 3-11 días Asintomáticos

Leve Ataxia

ENFERMO TIPO

• Entorno a 2 años de vida.

• Por depression nivel de consciencia hasta 10-15% ingresaron en UCIP.

• 4 % con afectación disautonómica grave.

• 5 % con afectación motora (parálisis).

• Filiar correctamente etiología• Detectar EV en muestra no invasiva no es sinónimo de causalidad• EV: 0-5% dels casos detectados en literatura en LCR.

• Conocimiento de la enfermedad. • Problema: ausencia de manifestaciones dermatológicas en hasta el

80%.

• Organización respuesta assistencial. • Más de 100 afectados en 12 semanas.

RETOS

AGENTE ETIOLÓGICO

• Estudio EV muestras LCR, SANG, ANF/frotis, heces

• Niños con LCR negativo para PAN-EV. Estudio Filmarray ® Meningitis-encefalitis.

Launes C, Casas-Alba D, Fortuny C, Valero-Rello A, Cabrerizo M, Muñoz-Almagro C. Utility of FilmArray Meningitis/Encephalitis Panel during Outbreak of Brainstem Encephalitis Caused by Enterovirus in Catalonia in 2016. J Clin Microbiol. 2016;55:336-338.

Virological findings: • EV detection: stools 32/40 patients, nasopharyngeal aspirate 31/43 patients,

CSF 0/40 patients, plasma 0/31 patients.

44 patients with BE or EM and EV

detection

40 EV-A71(no other types)

38 subgenotyped35 C1

(recombinant strainGermany 2015)

ResultsClin Microbiol Infect. 2017. pii: S1198-743X(17)30185-4.

0-24 h 1 mes 3 meses

Seqüenciació massiva mNGS

Què ens ofereix la seqüenciació?

1ª generació

2ª generació

3a generació

Dirigit PrecisióSeqüències llargues

No dirigitPrecís Seqüències curtesRàpida seqüenciació

No dirigitSeqüències llarguesRàpid

Dirigit…Lent

Gran treballbioinformàtic al darrere…

ErrorsTreball bioinformàtic

Punt fort Punt feble

Fins fa 1-2 anys: - Validació tècnica/concordància resultats.- Ús en casos excepcionals i en mostres amb poca “contaminació”.

Ens plantegem

Utilitat en el maneig d’un brot d’etiologia incerta

• Detectem noves co-infeccions inadvertides?

• Concordància amb diagnòstic p complementàries d’ús clinic

habitual?

• Concordància amb tècniques de tipatge mitjançant amplificació-

seqüenciació VP1?

• Rendiment diagnòstic en LCR? Sensibilitat / limit inf c viral.

• Estudi del virus complert

10 casos: encefalitis de tronc i encefalomielitis (definicions OMS).10 controls: meningitis asèptica.

• Tests convencionals.• NGS.• Totes les mostres disponibles: LCR/plasma/ANF/femtes.

Disseny

Resultats

- En totes les mostres on es detecta EV per PAN-EV RT-PCR, també es detecta per NGS.

- En 10 de 35 mostres negatives per PAN-EV PCR, es detecta patogen per NGS. Permet la detecció en 4 mostres ANF, 1 de femtes i 5 LCR!.

- LCR: Teníem patogen en 5 pacients amb tècniques microbiològiques convencionals (tots EV). NGS suma 5 casos més:

- 4 casos en LCR de EV-A71 (3/4 en meningitis asèptica)

- 1 cas en LCR de HHV-7 (?)

No falsos negatius

Incrementa detecció en tottipus de mostra:

Discrepància concordantamb clínica = Veritables

positius.

HHV-7: Virus amb latència a SNC? El cas no té capcaracterística especial…

Tipatge:

- Tipatge concordant amb tècniques de seq VP1.

- Permet tipar 10 casos més (no detectats per PCR convencional).

- Afegeix 5 co-deteccions de diferents genotips de EV. De A-71 en

ANF en 1 cas de meningitis per Echo-30 i viceversa.

Per què uns van fer afectació més lleu i altres més greu?

• No coinfecció... • Anàlisi d’SNVs:

55 inter-host SNVs únicament detectats als EV-A71s associats als encefalitis de tronc:- Només 2 dels SNVs eren compartits entre aquests EV-A71s neuroinvasors.- … però eren mutacions sinònimes.

• Concordància, però increment de sensibilitat, especialment

relevant en LCR (liquid normalment estèril).

• Demostra neuroinvasivitat (detecció en LCR) de EV-A71.

• Les dades generades per mNGS permeten una millor filiació

de l’origen dels brots –filogenètic i geogràfic - (especialment,

per soques recombinants).

Conclusions

Ombres

• Validació insuficient. Metodologia diversa.

• Dificultat per distingir colonitzador/contaminant de patògen.

• Software bioinformàtic no dirigit a interpretació clínica, dubtessobre la qualitat i exhasutivitat de les BBDD.

• Sensibilitat baixa en abundància de material genètic humà (inh).

• Diferents sensibilitats en CV baixes descrites.

NGS: Futur? Present?

Llums

• Casos “repte” (avantatge d’un test no dirigit).

• Estudis de validació clínica, per a la filiació etiològica

sindròmica. P ex. Infeccions LCR: DETECCIONS DE

PATÒGENS EN EL 80-90% (actualment 40%, especialment

encefalitis). Genome Res. 2019; 29: 831–842.

• Filiació de brots d’encefalitis/meningitis. Saha et al. 2019

Take-home message:

Nova tècnica amb grans avantatges i “limitacions”, nou

aprenentatge.

NGS segurament haurà de conviure amb tècniques convencionals

(inclosa la serologia,…)

Interpretació de resultats en “sessions” p laboratori -clínics.