Vacunació vers Neisseria meningitidis · Neisseria meningitidis és el principal agent causant de...
1
Vacunació vers Neisseria meningidis Vacuna contra gènere Neisseria 1.Antecedents Neisseria meningitidis és el principal agent causant de la malaltia meningocòccica. En països desenvolupats, presenta una incidència lleu, però en altres països, suposa de fins a 800 casos per cada 100 000 habitants. Fins ara, totes les vacunes que s’han plantejat, proporcionen protecció vers un sol serogrup o bé, combinar diversos antígens per crear una vacuna d’ampli aspectre. 2.Objectius i Hipòtesis Inicialment, l’objectiu és desenvolupar una vacuna que ofereixi protecció cap a N. meningitidis. Trobant que existeixen antígens conservats entre diverses espècies del gènere Neisseria, l’objec- tiu principal és desenvolupar una vacuna a partir d’un d’aquests antígens, de manera que s’amplia els patógens contra els quals es generarà immunitat. El gen de la proteïna triada és nhba, present en 4 espècies del gènere (Fig1). Kevin Tarramera Lorenzo Grau Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona, Juny 2014 3.Pla de treball Primerament, obtenim la seqüència gènica de la proteïna NHBA d’una genoteca de la soca MC58 escollida per a la línia de treball. Seguidament, emprem enzims de restricció per obtenir la seqüència desitjada i l’amplifiquem amb una PCR. Llavors, tractem la seqüència amb enzims de restricció, de manera que es generi un extrem compatible amb la cua d’histidines i aquesta s’hi pugui unir. Per acabar aquesta estapa del procés, el gen nhba-His s’insertarà en el vector pMNB2132, el qual serà introduït a la soca d’E. coli mitjançant electroporació i es deixa crèixer en un medi enriquit líquid. Després, es realitza una sembra en placa. Un cop obtingudes les colònies, es resembren en forma de rèpliques i se seleccionen, amb una PCR de colònia, quines rèpliques han assimilat el nostre vector. Un cop seleccionades aquelles que contenen el vector, es tornen a fer crèixer en un medi líquid. Després d’un temps d’incubació d’unes 2-3 hores, es proce- deix a llisar les cèl·lules i es passa la mostra per una columna cromatogràfica d’afinititat, a la qual quedaran retenides les cues d’histidines unides a la proteïna. Després d’això eluïm les proteïnes amb la cua d’histidines i tornem a passar l’eluït per la columna. Durant el segon eluït, trenquem la unió de la proteïna a la cua d’histidines, de manera que la mostra final només conté la proteïna. Amb la proteïna ja obtinguda i purificada, es pot procedir als assajos experimentals per determinar l’adjuvant més òptim i l’eficàcia de la vacuna. N. gonorrhoeae DGI2 N. gonorrhoeae PID18 N. gonorrhoeae NCCP11945 N. gonorrhoeae 1291 N. gonorrhoeae FA19 N. gonorrhoeae PID332 N. gonorrhoeae SK 93 1035 * N. gonorrhoeae TCDC NG08107 N. gonorrhoeae 35 02 N. gonorrhoeae SK 92 679 N. gonorrhoeae PID1 * N. gonorrhoeae FA 1090 N. gonorrhoeae DGI18 N. gonorrhoeae F62 N. gonorrhoeae FA6140 N. gonorrhoeae MS11 N. meningitidis alpha14 N. lactamica Y92 1009 N. lactamica Y92 1009 § N. lactamica 09002S1 § N. lactamica 014-24 § N. polysaccharea CCUG24845 § N. meningitidis 8013 N. polysaccharea ATCC 43768 § N. polysaccharea ATCC 43768 N. polysaccharea CCUG18031 § N. meningitidis H44 76 N. meningitidis MC58 N. meningitidis CU385 N. meningitidis M01 240149 N. meningitidis NZ 05 33 N. meningitidis M0579 N. polysaccharea CCUG27182 §# N. meningitidis alpha710 N. polysaccharea CCUG24846 §# N. meningitidis M13399 N. meningitidis ATCC 13091 N. meningitidis 053442 N. meningitidis NS44 N. meningitidis M01 240355 N. meningitidis M01 240013 N. meningitidis M04 240196 N. meningitidis M6190 N. meningitidis G2136 N. meningitidis 961 5945 N. meningitidis ES14902 N. meningitidis K1207 N. meningitidis S0108 N. meningitidis N1568 N. polysaccharea NS342 N. lactamica 030-24 §# N. meningitidis FAM18 N. meningitidis Z2491 N. meningitidis OX99 30304 N. meningitidis WUE 2594 N. polysaccharea 15883 § N. lactamica ATCC 23970 N. lactamica ATCC 23970 § N. lactamica NS19 N. lactamica 8206 §# N. flavescens NRL30031 H210 # N. lactamica 020 06 N. lactamica 020 06 § 100 100 100 100 61 100 97 99 94 57 95 73 78 67 67 71 97 99 56 34 12 91 82 97 38 6 41 81 8 24 87 12 19 52 46 99 94 89 70 97 84 73 0.02 N. gonorrhoeae N. meningitidis N. polysaccharea N. flavescens N. lactamica Fig 1 . Aquest arbre mostra les diferents espècies del gènere Neisseria que contenen la proteïna NHBA conservada. 5.Bibliografia més important - Alessandro Muzzi, Marirosa Mora, Mariagrazia Pizza, Rino Rappuoli, Claudio Donati. Conservation of Meningococcal Antigens in the Genus Neisseria (2013). mBio.00163-13. - Hervé Tettelin et al. Complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science (2000). DOI: 10.1126/science.287.5459.1809. 4.Resultats esperats S’espera que la vacuna proporcioni protecció vers Neisseria meningitidis, així com una protecció extra contra Neisseria gonorrhoeae, ja que la proteïna que s’ha fet servir es troba conservada dins d’ambdós gèneres. També s’espera, per la mateixa raó, que generi memòria immunitària vers N. lactamica i N. polysaccharea. El fet de que una mateixa vacuna generi protecció contra més d’una malaltia (com és la malaltia meningocòccica i la gonorrea) desperta molt interés ja que suposa una protecció més àmplia amb tant sols una sola vacuna.
Transcript of Vacunació vers Neisseria meningitidis · Neisseria meningitidis és el principal agent causant de...
Vacunació vers Neisseria meningitidisVacuna contra gènere Neisseria
1.AntecedentsNeisseria meningitidis és el principal agent causant de la malaltia meningocòccica. En països desenvolupats, presenta una incidència lleu, però en altres països, suposa de fins a 800 casos per cada 100 000 habitants.Fins ara, totes les vacunes que s’han plantejat, proporcionen protecció vers un sol serogrup o bé, combinar diversos antígens per crear una vacuna d’ampli aspectre.
2.Objectius i HipòtesisInicialment, l’objectiu és desenvolupar una vacuna que ofereixi protecció cap a N. meningitidis. Trobant que existeixen antígens conservats entre diverses espècies del gènere Neisseria, l’objec-tiu principal és desenvolupar una vacuna a partir d’un d’aquests antígens, de manera que s’amplia els patógens contra els quals es generarà immunitat.El gen de la proteïna triada és nhba, present en 4 espècies del gènere (Fig1).
Kevin Tarramera LorenzoGrau Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona, Juny 2014
3.Pla de treballPrimerament, obtenim la seqüència gènica de la proteïna NHBA d’una genoteca de la soca MC58 escollida per a la línia de treball. Seguidament, emprem enzims de restricció per obtenir la seqüència desitjada i l’amplifiquem amb una PCR.Llavors, tractem la seqüència amb enzims de restricció, de manera que es generi un extrem compatible amb la cua d’histidines i aquesta s’hi pugui unir.Per acabar aquesta estapa del procés, el gen nhba-His s’insertarà en el vector pMNB2132, el qual serà introduït a la soca d’E. coli mitjançant electroporació i es deixa crèixer en un medi enriquit líquid.Després, es realitza una sembra en placa. Un cop obtingudes les colònies, es resembren en forma de rèpliques i se seleccionen, amb una PCR de colònia, quines rèpliques han assimilat el nostre vector.Un cop seleccionades aquelles que contenen el vector, es tornen a fer crèixer en un medi líquid.Després d’un temps d’incubació d’unes 2-3 hores, es proce-deix a llisar les cèl·lules i es passa la mostra per una columna cromatogràfica d’afinititat, a la qual quedaran retenides les cues d’histidines unides a la proteïna. Després d’això eluïm les proteïnes amb la cua d’histidines i tornem a passar l’eluït per la columna. Durant el segon eluït, trenquem la unió de la proteïna a la cua d’histidines, de manera que la mostra final només conté la proteïna. Amb la proteïna ja obtinguda i purificada, es pot procedir als assajos experimentals per determinar l’adjuvant més òptim i l’eficàcia de la vacuna.
nerea and was introduced into N. meningitidis by a recombinationevent also involving the neighboring cbbA gene. Finally, sequence
analysis suggested that one more homologousrecombination event generated fHbp variant 2by inserting a variant 1 fragment into a variant 3background.
A distribution similar to that of fHbp wasfound for nhba, which was absent from N. ci-nerea, while it was present in N. lactamica. Also,the gene was present in all strains of N. gonor-rhoeae, and its sequences showed little variabil-ity within this species. This result was compati-ble with the overall low variability of thegenomes of N. gonorrhoeae and suggested a re-cent diversification of the gonococci fromN. meningitidis. The nhba gene showed low vari-ability within N. meningitidis (9, 16, 38), and seraof mice vaccinated with one variant were shown tobe bactericidal against heterologous strains (11).Interestingly, the heparin-binding motif was onlypartially conserved across all of the species wherethe gene was present. The site of cleavage of NHBAby NalP, situated upstream of the heparin-bindingregion, was not conserved, suggesting differentposttranslation protein processing.
The gene coding for NadA is part of an inde-pendent genetic unit (19) that consists of a pro-moter region, the coding sequence, and a termi-nator region. nadA was present in only a portionof the N. meningitidis strains and was neverfound in any other commensal or pathogenicneisseriae, with the exception of two strains ofN. cinerea. Analysis of the sequences immedi-ately adjacent to this genetic unit showed thatthe segment was always flanked by direct re-peats, indicating that a recombination mecha-nism could have determined its distributionamong the meningococcal lineages. Finally, ho-mologues of GNA1030 and GNA2091 werepresent and well conserved in most isolates ofthe genus Neisseria.
Taken together, these findings highlight thecomplex evolutionary history of the humanneisseriae. With the exception of N. gonor-rhoeae, the human neisseriae are carried asymp-tomatically in the nasopharynxes of healthy in-dividuals. It has long been known thathomologous recombination is the main processcontributing to the genomic evolution ofN. meningitidis and that some antigens can beexchanged between pathogenic and commensalspecies (45). We found that, when present, thesequences of fHbp, nhba, and nadA from otherspecies of the genus Neisseria do not introduceradically new variants compared to the variabil-ity already present in N. meningitidis.
The distribution of the 4CMenB vaccine an-tigens in the commensal neisseriae suggests thatvaccination could have an impact on the com-position of the commensal flora. In particular,
since the variability of nhba across the different neisseriae (N. gon-orrhoeae, N. lactamica, and N. polysaccharea) was similar to the
N. gonorrhoeae DGI2N. gonorrhoeae PID18N. gonorrhoeae NCCP11945N. gonorrhoeae 1291N. gonorrhoeae FA19
N. gonorrhoeae PID332N. gonorrhoeae SK 93 1035 *N. gonorrhoeae TCDC NG08107N. gonorrhoeae 35 02N. gonorrhoeae SK 92 679
N. gonorrhoeae PID1 *N. gonorrhoeae FA 1090N. gonorrhoeae DGI18N. gonorrhoeae F62N. gonorrhoeae FA6140
N. gonorrhoeae MS11N. meningitidis alpha14
N. lactamica Y92 1009N. lactamica Y92 1009 §
N. lactamica 09002S1 §N. lactamica 014-24 §
N. polysaccharea CCUG24845 §N. meningitidis 8013
N. polysaccharea ATCC 43768 §N. polysaccharea ATCC 43768N. polysaccharea CCUG18031 §
N. meningitidis H44 76N. meningitidis MC58
N. meningitidis CU385N. meningitidis M01 240149N. meningitidis NZ 05 33N. meningitidis M0579
N. polysaccharea CCUG27182 §#N. meningitidis alpha710
N. polysaccharea CCUG24846 §#N. meningitidis M13399
N. meningitidis ATCC 13091N. meningitidis 053442N. meningitidis NS44
N. meningitidis M01 240355N. meningitidis M01 240013
N. meningitidis M04 240196N. meningitidis M6190N. meningitidis G2136N. meningitidis 961 5945N. meningitidis ES14902N. meningitidis K1207N. meningitidis S0108
N. meningitidis N1568N. polysaccharea NS342
N. lactamica 030-24 §#N. meningitidis FAM18N. meningitidis Z2491N. meningitidis OX99 30304N. meningitidis WUE 2594
N. polysaccharea 15883 §N. lactamica ATCC 23970N. lactamica ATCC 23970 §
N. lactamica NS19N. lactamica 8206 §#
N. flavescens NRL30031 H210 #N. lactamica 020 06N. lactamica 020 06 §
100
100
100
100
61
100
9799
94
57
95
73
78
67
67
71
97
99
56
34
12
91
82
97
38
6
41
81
8
24
87
12
19
52
4699
94
89 70
97
84
73
0.02
N. gonorrhoeaeN. meningitidisN. polysaccharea
N. flavescensN. lactamica
FIG 7 Maximum-likelihood phylogenetic tree of the nhba gene. The tree was obtained with theKimura two-parameter model with gamma correction. Bootstrap values are shown with redlebels. The average gene variability (Pi) was 0.084 (SE, 0.004). Gonococci formed a monophy-letic branch closely related to the rest of the isolates. The other species, N. polysaccharea, N. lac-tamica, and N. flavescens, were scattered throughout the entire tree. Colored circles and labelsindicate the different Neisseria species. The § symbol indicates sequences that were downloadedfrom the BigsDB database; the others were from GenBank. The # symbol indicates genes thatwere at the border of a contig. Asterisks indicate genes that were FS.
Conservation of Meningococcal Antigens
May/June 2013 Volume 4 Issue 3 e00163-13 ® mbio.asm.org 9
Fig 1 . Aquest arbre mostra les d i ferents espècies del gènere Neisser ia que contenen la proteïna
NHBA conservada.
5 .B ib l iograf ia més important- Alessandro Muzzi, Marirosa Mora, Mariagrazia Pizza, Rino Rappuoli, Claudio Donati. Conservation of Meningococcal Antigens in the Genus Neisseria (2013). mBio.00163-13.- Hervé Tettelin et al. Complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science (2000). DOI: 10.1126/science.287.5459.1809.
4.Resultats esperatsS’espera que la vacuna proporcioni protecció vers Neisseria meningitidis, així com una protecció extra contra Neisseria gonorrhoeae, ja que la proteïna que s’ha fet servir es troba conservada dins d’ambdós gèneres. També s’espera, per la mateixa raó, que generi memòria immunitària vers N. lactamica i N. polysaccharea.El fet de que una mateixa vacuna generi protecció contra més d’una malaltia (com és la malaltia meningocòccica i la gonorrea) desperta molt interés ja que suposa una protecció més àmplia amb tant sols una sola vacuna.
