Informe final joven investigador

Convenio Colciencias-Cenicaña

VARIABILIDAD DE LA ROYA (Puccinia melanocephala) PRESENTE EN CULTIVOS

DE CAÑA DE AZÚCAR POR MEDIO DE TÉCNICAS MOLECULARES

Autor:

Lina María Cardona Giraldo

Bióloga

Tutores:

Fernando Ángel Sánchez

Juan Carlos Ángel Sánchez

Programa de Variedades

Santiago de Cali, 13 de Febrero de 2008

Centro de Investigación de la Caña de Azúcar

de Colombia

Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología “Francisco José de Caldas”

1. INTRODUCCIÓN

La roya de la caña de azúcar en Colombia causada por el hongo Puccinia

melanocephala (Sydow), se registró por primera vez en 1978 en América, en

República Dominicana (Dean et al., 1979). En 1979 fue registrada en Colombia en la

zona fronteriza con Venezuela, pero solo en diciembre de 1981 se encontró en el

Valle del Cauca, afectando plantillas de la variedad CP 57-603 (Victoria et al., 1988).

Establecer evaluaciones de las perdidas generadas por el patógeno en la producción

de caña es difícil, sin embargo en 1988 se realizó en Florida una comparación entre

la variedad CP 78 -1247, una variedad particularmente susceptible a la roya, con

una variedad de igual rendimiento y se estimó que la perdida a causa del patógeno

era de aproximadamente el 40% (Raid, 2006). Adicionalmente Hoy y Hollier (2006)

encontraron que la roya disminuyó la producción de caña de azúcar de la variedad

LCP 85-384, en Louisiana en dos campos diferentes, encontrando perdidas de 17.3

y 21.7%, respectivamente.

El agente causal de la enfermedad de la roya de la caña pertenece al orden

Uredinales, familia Pucciniaceae del género Puccinia (Sandoval, 1988); esta es una

enfermedad que ataca el sistema foliar de la planta, en sus inicios los síntomas

consisten en la aparición de manchas amarillentas alargadas que son visibles por

ambas superficies de la hoja. Las manchas incrementan en longitud, se tornan color

café a café-naranja y desarrollan un ligero halo clorótico (Raid et al., 2006). Las

uredosporas rompen el tejido epidérmico por presión, liberando un gran número de

ellas color naranja. Cuando el ataque es severo se puede encontrar un número

considerable de lesiones que se unen para formar áreas necróticas extensas e

irregulares, lo que ocasiona el secamiento de la hoja. La intensa necrosis trae como

consecuencia el atizonamiento de la plantación, pudiéndose observar un color

ferrumbroso de las hojas debido a la presencia de gran cantidad de pústulas, que

dan la apariencia de un campo quemado (Sandoval, 1988). Puccinia melanocephala

H. Syd. & P. Syd., que es actualmente conocida como Roya café, ocasiona un

retraso en el desarrollo que se manifiesta como una reducción en la longitud de

tallos (Victoria et al., 1984), así como en el número de tallos por macolla (Purdy et

al., 1983). En algunos países, esta enfermedad se ha diseminado a gran velocidad.

En el valle del Cauca para el año 1981, el daño en el follaje era de 1.5% y ya en

1984 se registraba un 30% de daño (Victoria et al., 1984). En Brasil se han

determinado pérdidas de hasta 47% en la productividad, en la variedad SP 71-6163,

a causa de esta enfermedad (Sanguino y Nogueira, 1989) y en algunos países del

Caribe ha causado la sustitución de variedades altamente rendidoras.

1.2 Genes Ribosomales

Los análisis de secuencias nucleotídicas del ADN ribosomal para determinar

relaciones filogenéticas y variaciones genéticas en hongos son ampliamente

estudiadas (Hibbet 1992). La unidad del ADN ribosomal (ADNr) está organizada en

múltiples copias y cada una se compone de tres genes codificantes para la unidad

ribosomal (la subunidad pequeña -SSU, 18 S-, la subunidad grande -LSU, 25-28S- y

la región 5.8 S) y regiones no codificantes como los espacios internos transcritos

(ITS) y los espaciadores intergénicos (IGS) (Braithwaite et al., 2005; Virtudazo et al.,

2001c) (figura 1).

Figura 1. Estructura del ADN ribosomal

Una de las razones por las que es común el uso de ADNr en los análisis

filogenéticos y en estudios de variabilidad genética es por su accesibilidad y

facilidad de ser amplificado por PCR debido a que se encuentra organizado en

unidades repetidas en tandem con cientos de copias por genoma (White et al.,

1990).

1.3. Antecedentes

La roya de la caña se encuentra distribuida en todos los países productores de caña

de azúcar, su dispersión ha generado un impacto económico considerable, tanto así

que la resistencia a la enfermedad ha formado parte integral de los programas de

mejoramiento. Sin embargo debido a la variabilidad genética de este patógeno la

resistencia a la enfermedad no ha sido estable (Raid et al., 2006). Hasta el momento

ha habido muchos argumentos sobre la existencia de razas del agente causal de la

roya café de la caña de azúcar (Puccinia melanocephala), un ejemplo de ello son las

observaciones realizadas por Dean y Purdy (1984) en diferentes variedades de caña

de azúcar en Florida. Ellos contemplaron la existencia de varias razas de roya en

caña de azúcar que afectaban las variedades CP 79-1243, CL 41-223 y CP 79-1580.

Por otro lado Raid et al., (2006) en la variedad CP 70-1133, que fue importante en

Florida durante varios años y no presentaba roya, actualmente se clasifica como

moderadamente susceptible. Según Liu (1980a) CR 64-700, una de las variedades

más importantes de Central Romana, considerada resistente, inesperadamente

comenzó a ser susceptible a roya. La variedad PR 1000, la cual era una variedad

resistente en Puerto Rico, fue encontrada altamente susceptible en Nicaragua. Liu

(1980), además, encontró cambios similares en las variedades: B 42-231, CP 65-

357, Q83, Q80, PR 1249, PR 61-532, PR 62-285, PR 62-258, H 49-5, Co 775, B 37-

161, PR 1048, B 47-258, B 51-415, CP 44-101 y BJ 65-89 y consideró que tales

variaciones podrían deberse a la ocurrencia de diferentes razas fisiológicas de roya

en los cultivos de caña de azúcar. Desde 1989 otras variedades consideradas

resistentes (CP 74-2005 y CL 73-239) han mostrado una reacción susceptible a la

enfermedad en áreas localizadas; las perdidas debido a la roya en plantas de una de

estas dos variedades (CL 73-239) fue estimada en un rango de 20-30% (Shine et al.,

2005).

Para evaluar la ocurrencia de razas del patógeno Puccinia melanocephala en el

Valle del Cauca se requiere una metodología efectiva que permita establecer

variabilidad genética entre diferentes poblaciones de roya. Los marcadores

moleculares proporcionan una herramienta útil para rastrear cambios en las

poblaciones de patógenos. Estos pueden ser usados para evaluar la diversidad

genética entre la roya presente en diferentes zonas de una región. Hasta el

momento Braithwaite et al., (2004, 2006) secuenciaron tres regiones de ADN

ribosomal para evaluar la diversidad genética de la roya naranja en Australia, Papua

Nueva Guinea, Indonesia y China. Ellos encontraron que las variaciones fueron

limitadas entre las poblaciones de Australia; sin embargo, se observó que los

aislados de Indonesia y PNG fueron genéticamente diversos, aunque no se

presentaron diferencias morfológicas. Virtudazo et al., (2001a) han hecho estudios

en roya de la caña de azúcar empleando metodologías moleculares para análisis

filogenético de Puccinia sp., Puccinia kuehnii y Puccinia melanocephala en aislados

de diferentes poblaciones.

Cenicaña, por medio del mejoramiento genético, ha generado variedades

resistentes, como una medida de control contra el patógeno. Actualmente existen

variedades generadas por Cenicaña como la variedad CC 84-75, CC 85-92, CC 93-

3895, CC 92-2804 y la CC 94-5827 que en los últimos años han presentado

incidencia de la enfermedad y con el transcurrir del tiempo esta incidencia ha

incrementado poco a poco. Es posible que este comportamiento se deba a una

variación del hongo o a cambios de las condiciones ambientales. Sin embargo, es

necesario realizar un estudio del patógeno donde se involucre el análisis con

marcadores moleculares para determinación de una posible variable genética como

una nueva raza del patógeno.

En el presente estudio se evaluaron aislados colectados de diferentes lotes

comerciales por marcadores moleculares que hibridan con el ADN ribosomal y

determinan si existe una nueva raza del patógeno o variable genética que esté

afectando los cultivos de caña de azúcar ó si el aumento en la incidencia de la roya

se deba a factores regidos por el medio ambiente.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Recolección y procesamiento de muestras

2.1.1 Recolección de material

Se visitaron lotes de ingenios cultivados con caña de azúcar donde se encontraron

variedades infectadas con roya y se tomaron alrededor de 10 hojas con síntomas

(figura 2), por suerte, de la misma variedad; se depositaron en bolsas plásticas

marcadas y se conservaron en una nevera de icopor, antes de ser llevadas al

laboratorio para su procesamiento. Los muestreos se realizaron a lo largo del Valle

sobre el río Cauca (Figura 3); un muestreo de la variedad CC 93-3895 fue realizada

en el Ingenio Sicarare, ubicado en el Cesar, en la hacienda Tamacá (suerte 6). En

total se recolectó tejido infectado con roya de las variedades: CC 92-2804, CC 93-

3895, CC 85-92, CC 84-75, MEX 52-29, MZC 74-275, CP 57-603, CC 98-68 y CC

94-5827 en 23 suertes comerciales, la información de cada una de las variedades y

suertes comerciales de donde se tomaron las muestras se presentan en la Cuadro 1

y la distribución en la figura 3.

Figura 2 . Sintomatología de la roya de la caña de azúcar

Figura 3. Distribución de los lotes donde se tomaron fragmentos de hojas infectadas con roya.

Cuadro 1 . Información sobre las recolecciones de hojas de caña de azúcar infectadas con roya para la evaluación de variabilidad genética.

No. VARIEDAD HACIENDA INGENIO SUERTE REGIÓN Cant. De aislados

EDAD (meses)

1 CC 92 - 2804 PROVIDENCIA PROVIDENCIA 15 Valle del Cauca 10 7 2 CC 93 - 3895 SANTA ANITA MANUELITA 32 Valle del Cauca 3 4.9 3 CC 93 - 3895 AURORA PROVIDENCIA 106A Valle del Cauca 7 6.4 4 CC 93 - 3895 AURORA PROVIDENCIA 119D Valle del Cauca 10 6.5 5 CC 85-92 AURORA PROVIDENCIA 111B Valle del Cauca 7 4.9 6 CC 85-92 LA PAZ PROVIDENCIA 53C Valle del Cauca 2 6.7 7 CC 93 - 3895 SAN FDO SUR INCAUCA 032G Cauca 5 3.9 8 CC 85-92 SAN FDO NTE INCAUCA 12 y 12Y Cauca 10 3.5 9 CC 92-2804 SAJÓN RICO MANUEL INCAUCA 12T Cauca 4 5.8

10 CC 93 - 3895 RIOPAILA RIOPAILA 56 Valle del Cauca 5 6 11 CC 84-75 LA RANCHERA RIOPAILA 59 Valle del Cauca 4 6 12 CC 84-75 VENECIA RIOPAILA 27 Valle del Cauca 10 2.5 13 MEX 52-29 JULIA SAAVEDRA PROVIDENCIA 1, 2, 3 y 4 Valle del Cauca 11 3.5 14 CC 98-68 LA LORENA PICHICHÍ 57 Valle del Cauca 11 2.3 15 CP 57-603 DELIRIO RISARALDA 1 Risaralda 10 6.6 16 MZC 74-275 GALIA SOPINGA RISARALDA 32 y 33 Risaralda 10 2.2 17 MZC 74-275 GALIA OROBÍ RISARALDA 15 Risaralda 10 7.9 18 CC 93 - 3895 BOHIOS RISARALDA 24 Risaralda 5 8.8 19 MZC 74-275 ARGELIA SAN CARLOS 211A-2 Valle del Cauca 11 2 20 MZC 74-275 BALLESTEROS SAN CARLOS 34A Valle del Cauca 10 4.5 21 CC 93 - 3895 ESMERALDA SAN CARLOS 86 Valle del Cauca 4 7 22 CC 94-5827 ARGELIA 211A SAN CARLOS 211A-2 Valle del Cauca 9 2 23 CC 93-3895 TAMACÁ 7 SICARARE 6 Cesár 10 4

Nota: La recolecta No. 23 no se encuentra ubicada en la figura 3 por estar fuera del Valle Geográfico del río Cauca

2.1.2. Conservación del patógeno en condiciones de laboratorio

Se tomaron fragmentos de hojas infectada, de aproximadamente 20 cm de longitud

con reacción tipo 4 (Purdy & Dean 1980) es decir con manchas individuales

cloróticas o rojas y pústulas sin abrir. Los fragmentos de hojas fueron lavados con

agua destilada abundante, desinfestadas con alcohol al 70% y de nuevo con agua

destilada; estos fragmentos fueron colocados en frascos de vidrio estériles con 50 ml

de solución de 12.5 mg/l de Benzimidazole (Asnaghi et al., 2001) y sellados con

papel parafilm (Álvarez et. al., 2001) (fig.4A). Se emplearon cilindros de PVC con

orificios cubiertos con tul como cámara de aislamiento del material (fig. 4B).

A. B.

Figura 4 . Montaje de hojas de caña de azúcar infectadas con roya. A) Hojas con la parte inferior embebida en solución de sacarosa al 0.01%, B) Cilindro protector de PVC.

Los cilindros de PVC con las hojas infectadas se dejaron una semana en un

invernadero cuyas condiciones de temperatura, humedad relativa y luminosidad

fueron las apropiadas para la esporulación de roya (aproximadamente 25°C de

temperatura y de 60-85 % de H.R).

2.1.3. Pruebas de inoculación de roya

Se realizaron pruebas de inoculación del patógeno en condiciones de invernadero

para aumentar la cantidad de esporas de cada uno de los aislamientos

monopustulares obtenidos en el campo, se probó la metodología planteada por Liu

(1980a), que consiste en espolvorear esporas sobre las hojas; la metodología de

Braitwaite (2005) que consiste en depositar esporas sin germinar en fragmentos de

hojas de caña y posteriormente dejarlas en sucrosa; la metodología Asnaghi et al.,

(2001) que consiste en depositar esporas en cuadritos de agar – agar y luego

pasarlos a fragmentos de hojas. Adicionalmente se hicieron variaciones entre las

metodologías como dejar primero germinar las esporas y posteriormente

depositarlas en las hojas de plantas sembradas en maceras o en fragmentos

foliares.

2.2. Evaluación molecular

2.2.1. Extracción de ADN

Se empleó la metodología de extracción de ADN, partiendo de esporas de roya,

sugerida por Virtudazo et al., (2001a). La metodología consistió en tomar alrededor

de 100 a 200 esporas de una sola pústula, para evitar la mezcla de razas, las

esporas fueron depositadas en una placa portaobjetos y presionadas con otra placa

para propiciar la disrupción mecánica de las células. Posteriormente se

suspendieron en alrededor de 20 µl de buffer de extracción que contenía 10 µM de

Tris-HCl (p.H 8.3), 1.5 mM MgCl2, 50mM KCl, 0.01% de Proteínasa K, 0.01% SDS.

Posteriormente la suspensión se incubó a 37 ºC por 60 minutos y luego fue llevada a

95 ºC por 10 minutos. Este extracto crudo se conservó a -20 ºC antes de ser

empleado para amplificación de fragmentos.

El esquema general del protocolo de extracción de ADN a partir de esporas se

observa en la Fig. 5.

Figura 5. Esquema general del protocolo de extracción de ADN partiendo de esporas de roya de la caña de azúcar sugerido por Virtudazo et al., (2001a).

2.2.2. Amplificación de fragmentos

Para la amplificación de los fragmentos de ADN se empleó 4 µl del ADN extraído y el

par de iniciadores ITS1F/ITS4, en volumen total de 50 µl. Cada iniciador se usó a

una concentración final de 0.4 µM, mas una unidad enzimática de Taq ADN

polimerasa, 0.2 mM de solución de dNTS (INVITROGEN), Tampón Taq ADN

polimerasa (Tris- HCl 10mM, 50 mM KCl; 0.1%Tritón X-100 y 2 mM de Mg 2+). El

programa de amplificación consistió de: 95 ºC durante 5 minutos; 35 ciclos de 95 ºC

por 30 segundos, 50 ºC por 30 segundos y 72 ºC por 1 minuto; y finalmente 72 ºC

durante 10 minutos (Virtudazo et al., 2001a).

Adicionalmente, se probaron diferentes iniciadores que han sido importantes en

estudios de variabilidad genética como son: ITS1F/ITS 4B, ITS1/ITS4 (Gardes &

Bruns 1993) y LR12R / 5SRNA (Braithwaite et al., 2005), NL1/NL4 (Virtudazo et al.,

2001a y 2001b) y Rust1/ITS4 (Kropp et al., 1997).

2.2.3. Visualización de los fragmentos amplificados

El producto amplificado se visualizó por corrido electroforético utilizando tampón

TAE 1X en una cámara de electroforesis horizontal a través de geles de agarosa al

1.2% teñidos con bromuro de etidio. Para estimar el tamaño de los fragmentos se

utilizó el marcador de peso molecular Ladder 50 bp (INVITROGEN). Los geles se

observaron en un transiluminador de luz ultravioleta (FOTODYNE Inc., modelo 3-

Aislamiento de esporas en

placas Disrupción mecánica

Suspensión en Tampón

de extracción

Incubación a 37 y a 95ºC

4000) y fueron fotografiados con una cámara POLAROID MP4 utilizando una

película POLAROID 667 de 3¼ X4¼.

2.2.4. Digestión de los fragmentos amplificados

La digestión de los productos de PCR se realizó de acuerdo con los protocolos del

fabricante con las siguientes enzimas endonucleasas: Xba I, Kpn I y Dra I, Alu I y

Hinf I (INVITROGEN). La reacción de digestión se realizó bajo las siguientes

condiciones: 10 µl de ADN amplificado, 1X de tampón (enzima-específico), BSA 1X y

5 a 8 unidades de enzima de restricción. Posteriormente, se incubaron las muestras

a 37 ºC por 3 horas. Los fragmentos generados por la restricción se separaron

mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1.5 % de igual forma como se hizo

con los fragmentos amplificados.

2.3. Metodología para distinguir entre P. melanocephala y P. kuehnii por caracteres morfológicos

La revisión morfológica de P. melanocephala y P. kuehnii que existe fue realizada

por Virtudazo et al., (2001b), partiendo de este artículo se realizó un formato para

establecer comparaciones entre las dos royas que infectan caña de azúcar (Cuadro

2). Con base en este estudio se hicieron observaciones microscópicas de las

estructuras presentes en pústulas encontradas en las siguientes variedades de caña

de caña azúcar: CC 85-92 de dos lotes comerciales diferentes y CC 93-3895.

Se observó el tamaño y forma de paráfisis (largo, diámetro de la cabeza, grosor de

la pared de la cabeza, grosor de la pared del espítipe), urediniospora (ancho, largo,

color), disposición de espínulas en la urediniospora (densidad, distribución, forma),

teliosporas (forma, color, septos) y se compararon estos datos con los de el cuadro

2.

Cuadro 2. Formato para identificar morfológicamente P. melanocephala de P. kuehnii, basado en Virtudazo et al., (2001b)

Característica P. melanocephala P. kuehnii Lesión

• Color café a café oscuro con areas oscuras

necróticas alrededor

• Ligeramente café, a veces amarillo o amarillo

– naranja y con algunas áreas café necróticas.

Uredinia

• Café - canela a café oscuro principalmente

hipofilo y lineal. • Generalmente mayor de 4 mm de longitud.

• Amarilla a café – amarillo, algunas veces

café-canela. • Longitud lineal de 3-4 mm.

Paráfisis

• Abundantes, algunas veces más numerosas

que urediniosporas en el uredinio. • Forma capitada algunas veces espatulada

(32-98 µm de longitud, cabeza 12-25 µm de diámetro)

• Paráfisis escasas o ausentes. • Si se encuentran presentes, se localizan

basal o periféricamente en el uredinio y usualmente se pueden observar cuando las uredosporas son removidas del uredinio.

• Forma irregular usualmente piriforme a

• Incolora a café oro. • Pared mas gruesa en la cabeza (4-15 µm)

que en el espítipe (1.0-2.8 µm de grueso)

clavada • Pared extremadamente delgada y delicada

(>1 µm) • Hialina a color café claro. • Tamaño variable.

Urediniospora

• Forma ovoide, algunas veces elipsoidal • Pared de grosor uniforme (0.8 – 2.3 µm) • Color café – canela a café oscuro. • Esporas densamente equinuladas y espinas

uniformemente distribuidas (excepto las próximas al poro germinal y en la parte basal, que son más grandes y más desarrolladas)

• Esporas mas pequeñas que P. Kuehnni. • Usualmente 4 poros germinativos en posición

ecuatorial (a veces 5)

• Forma ovoide a piriforme, algunas veces elipsoidal.

• Algunas tienen un pronunciamiento de la pared en la parte apical (aprox 5 µm o mas) mientras otras tienen pared de grosor uniforme.

• Pared de grosor 1-2.3 µm a los lados, más pronunciada en la parte apical (10 µm o mas)

• Color amarillo oro a naranja a veces café-canela.

• Equinulación menos densa. Espínulas mas grandes, largas y puntiagudas y con una base más amplia que en P. melanocephala.

• Tamaño altamente variable • 4 a 5 poros germinativos en posición

ecuatorial

Telia

• Café-negrusco y surge de la uredia. • Hipofilo. • Parálisis presentes.

• Blancuzca y sin forma definida (debido al metabasidio formado in situ)

• Hipofilo. Teliosporas

• Café a café oscuro. • La mayoría clavadas. • Pared lisa, apicalmente gruesa en la célula

superior (2.5 – 8 µm), y se ve más oscura que en la célula inferior (2-3.5 µm) a los lados.

• Usualmente dos células con una leve

• Hialinas, obclavadas, con una leve

constricción en el septo. • Pared uniformemente delgada (0.5-1.2 µm). • Usualmente con tres células teliospóricas. • Teliosporas mas pequeñas que en P.

melanocephala.

constricción en el septo. • Pedicelo café oscuro (84.7-16.5 µm de

longitud)

• Se pueden ver basidiosporas (7-10 x 5-7 µm) en la capa metabasidial, sobre las teliosporas.

• Teliosporas inmaduras se pueden confundir con parálisis.

• A veces sésiles o con pedicelo hialino (12 µm de longitud).

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Patología y procesamiento de las muestras en la boratorio

Las hojas afectadas con roya que se colectaron de los lotes comerciales fueron

desinfestadas y dejadas en condiciones ideales para propiciar la emergencia de

esporas. Esta técnica de conservación del patógeno y esporulación fue

acondicionada con base en varias metodologías planteadas en la literatura

(Braithwaite et al., 2005; Álvarez et al., 2001; Asnaghi et al., 2001; Liu 1980b),

inicialmente se probó la inmersión de las hojas infectadas en sucrosa al 0.01%, pero

al compararlo con la acción del benzimidazol se obtuvo una mayor conservación del

material. Se ha encontrado que este componente retarda eficientemente la

senescencia de hojas separadas y reduce la contaminación bacteriana y fúngica en

la solución (Taylor, 1992). Estudios por microscopía electrónica han revelado que no

hay daño visible en la estructura fina de los cloroplastos en hojas bajo tratamiento

con benzimidazol, mientras que en los tratamientos en agua se observa alteraciones

en el color, forma y estructura como parte del proceso de senescencia (Yoshida,

1970).

Debido a que con la metodología de extracción empleada se obtiene muy baja

cantidad de ADN se realizaron ensayos de inoculaciones de cada aislamiento

(monopustular), y de esta forma incrementar la cantidad de un aislado y aumentar la

cantidad de ADN para análisis de la población de roya. Con las pruebas de

inoculación realizadas no se logró la infección del patógeno en plantas susceptibles

y sanas, posiblemente debido a la sensibilidad del hongo a las condiciones

ambientales como temperatura, humedad relativa y periodo de mojado o de rocío;

además a la poca cantidad de esporas que se podía emplear por cada inoculación.

Debido a esto se procedió a trabajar con la cantidad de ADN obtenida sin realizar la

inoculación.

3.2. Evaluación Molecular

3.2.1. Extracción de ADN de aislados colectados

Posterior a la esporulación se procedió a la extracción de ADN de esporas de

pústulas individuales (aislamientos monopustulares) para descartar la mezcla de

razas y asegurar que se trata de una raza pura. El número de extracciones

realizadas por localidad dependió de la cantidad de pústulas que esporularon. Se

empleó la metodología de extracción planteada por Virtudazo et al., (2001a). La

metodología funcionó bien con los marcadores moleculares empleados, pero se

obtiene muy bajas cantidades de ADN, alrededor de 20 µl de los cuales se emplean

4 µl en una reacción de PCR. En total se aislaron 178 muestras de ADN.

3.2.2. Amplificación de los fragmentos de ADN

Las royas presentan ciertas características que dificultan la escogencia de un

marcador molecular para su evaluación. Por un lado son organismos biotróficos, por

lo tanto no crecen en cultivos axénicos. Los estudios de huellas dactilares (DNA-

fingerprinting) en hongos, usualmente se realizan iniciando con un cultivo puro

originado de una espora (Braithwaite et al., 2005). Para mitigar este factor se trabajó

con ADN extraído de esporas de una sola pústula y se trabajó con marcadores que

hibridan en el ADN ribosomal, el cual por presentarse en múltiples copias en el

genoma son fáciles de amplificar y son considerablemente empleados en estudios

filogenéticos y de genética de poblaciones de hongos.

Se probaron diferentes iniciadores que han sido evaluados en trabajos de

variabilidad genética con roya. El par de iniciadores ITS1F / ITS4 (Virtudazo et al.,

2001a), los cuales amplifican las dos regiones internas espaciadoras (ITS1 e ITS2) y

la región 5.8S (ver figura 6), amplificaron perfectamente en las pruebas preliminares

a la evaluación de la población total, adicionalmente estos iniciadores no amplifican

con el genoma de la planta lo que favorece que el ADN evaluado corresponda al

patógeno objeto de este estudio. Las concentraciones de estos iniciadores en la

reacción y la temperatura de anillamiento se estandarizaron previamente en el

laboratorio.

El par de iniciadores NL1/NL4, planteados también por Virtudazo et al., (2001a) de la

región D1/D2 de la subunidad Larga (LSU) del ADN ribosomal (figura 6), también

amplificaron con los aislados evaluados, según el autor estos sirven para diferenciar

entre P. melanocephala y P. kuenhii, debido a que para cada una de las dos royas

se presenta un tamaño característico de 608 y 620 pb, respectivamente. Sin

embargo durante las pruebas realizadas en el laboratorio de Cenicaña, no se

encontraron resultados semejantes con el estudio de Virtudazo et al., (2001a).

Según Gardes & Bruns (1993) el par de iniciadores ITS1F/ITS4B son ideales para

evaluaciones de royas y micorrizas basidiomicetos, pues no amplifican con ADN de

otros hongos y raramente lo hacen con el de plantas. Pero al probar estos

iniciadores con las muestras de roya no se obtuvo amplificación durante ninguna de

las pruebas realizadas.

Figura 6. Ubicación de cada uno de los iniciadores en el ADN ribosomal, empleados durante el presente estudio.

En el periodo entre el año 2000 y 2002 se presentó una epidemia de roya naranja

(Puccinia kuehnii) en Australia, la cual ocasionó grandes pérdidas a la industria de la

caña de azúcar (Staier et al., 2003; Staier et al., 2004; Magarey et al., 2003). Esta

epidemia resultó de un cambio por una nueva raza del patógeno. Se recurrió al uso

de marcadores moleculares para evaluar la diversidad genética entre la roya

presente en Australia y la de Papua Nueva Guinea, Indonesia y en colecciones

históricas de herbarios de Australia. Para dicha evaluación se emplearon diferentes

iniciadores, entre ellos iniciadores que amplifican las regiones ITS’s y la región

D1/D2 del LSU; sin embargo entre los que se consideraron ideales para este tipo de

estudio son los que amplifican las regiones IGS (intergenic spacers), comprendidos

por el par LR12R/5SRNA, pues hibridan perfectamente con la región 5S, que

usualmente se encuentra en el grupo de los Basiodimicetos y algunos Ascomicetos,

como las levaduras, entre cada unidad de repetición (en otros hongos el gen 5S se

encuentra en otro cromosoma). Al emplear este par de iniciadores, durante este

estudio, no se obtuvo amplicones con las condiciones de PCR citadas por

Braithwaite et al., (2005).

Dado que el par que más favoreció la amplificación de fragmentos con las muestras

de ADN extraídas partiendo de esporas de roya fue ITS1F/ITS4, se evaluó la

población total con estos iniciadores (178 aislados). Los resultados encontrados

durante esta evaluación mostraron una banda monomórfica para todos los aislados

de aproximadamente 670 pb (figura 7).

Figura 7. Algunas de las muestras de ADN de aislados de roya colectados en lotes comerciales y amplificados con los iniciadores ITS1F/ITS4. Todos los aislados evaluados presentaron la misma banda observada. MP, Marcador de peso Ladder 50 pb.

3.2.3. Evaluación de los fragmentos de restricción

Debido a que no se encontraron polimorfismos entre los fragmentos amplificados se

evaluaron algunas enzimas de restricción para generar cortes entre la región

amplificada, descritas en la Cuadro 3.

~670 pb

MP

Cuadro 3. Enzimas de restricción probadas para cortar los fragmentos amplificadas con los iniciadores ITS1F/ITS4

Enzima de restricción Secuencia de reconocimiento

Resultado obtenido

Dra I TTTAAA ND Xba I TCTAGA ND Kpn I GGTACC ND Alu I AGCT D Hinf I GANTC D

D: digirió ND: No digirió

Dado que las enzimas Alu I y Hinf I presentaron sitios de reconocimiento con el

fragmento amplificado por los iniciadores ITS1F/ITS4, se evaluó un aislado por

muestreo de toda la población para determinar la presencia de polimorfismos entre

estos. Sin embargo no se encontraron polimorfismos entre las digestiones obtenidas

(Figura 8A y 8B).

A.

MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B.

Figura 8 . Gel de digestión de los productos amplificados. A, Digestión con enzima Alu I. B, Digestión con enzima Hinf I. MP: Marcador de peso Ladder 50 pb.

Nota: Se evaluó un aislado por colecta realizada; cada numero coincide con los referenciados en la Cuadro 1.

Los resultados obtenidos con ITS 1F / ITS 4 y las enzimas de restricción empleadas

no evidenciaron variabilidad genética entre cada uno de los aislados evaluados. De

acuerdo con lo anterior no se encontró presencia de razas o variables genéticas en

las poblaciones de roya. Sin embargo el estudio anterior se limitó a una sola región

genómica de la roya de la caña por lo cual es posible que el marcador empleado

presente un grado muy bajo de polimorfismo para el organismo de estudio. Se

recomienda continuar la evaluación de la población, y probar otros marcadores que

permitan corroborar los datos obtenidos anteriormente.

Un trabajo previo realizado por Braithwaite et al., (2005) con marcadores

moleculares que hibridan con genes de ADN ribosomal, mostraron bajos niveles de

variación entre estas regiones, en aislados de roya naranja de Australia, aunque si

se encontró variabilidad en aislados que infectan caña de azúcar silvestre de

diferentes países como Papua Nueva Guinea, China, Indonesia y colecciones

históricas de herbarios. Con este resultado se presume que existe un solo genotipo

dominante del patógeno, lo cual no se correlaciona suficientemente con los

comportamientos de virulencia del patógeno observados en campo. Es posible que

estas secuencias empleadas no estén reflejando las diferencias en virulencia de los

genes de roya y que la presencia de una nueva raza se deba a una mutación en un

solo gen, lo cual todavía no se observa a nivel de ADN ribosomal; o que el

MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

incremento de la incidencia de roya sobre las variedades comerciales se deba a

factores regidos por el medio ambiente.

3.3. Metodología para distinguir entre P. melanocep hala y P. kuehnii por caracteres morfológicos

Las mediciones de paráfisis y urediniosporas estuvieron dentro de los rangos

correspondientes a P. melanocephala según Virtudazo et al., (2001b). Se observó

abundantes paráfisis, las urediniosporas presentaron forma ovoide y se observaron

teliosporas color café. En general todas las características observadas coincidieron

con las descripciones de P. melanocephala (cuadro2).

RECOMENDACIONES

• Se debe evaluar otras regiones genéticas de la roya de la caña que permitan

determinar si hay presencia de una nueva raza, puesto que la región

amplificada no presentó la información suficiente para concluir en cuanto a la

presencia de una variable genética.

• Es necesario continuar las observaciones microscópicas en las otras

variedades que fueron evaluadas por la metodología molecular y en otros

lotes comerciales.

AGRADECIMIENTOS

La autora y los tutores de este trabajo expresan sus sinceros agradecimientos a las entidades

financiadoras de este proyecto de investigación: Colciencias y el Centro de Investigación de

la Caña de Azúcar de Colombia CENICAÑA.

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