Tema 12.3.1 Vectores virales.

Los vectores virales fueron los primeros en ser utilizados, dada su alta eficacia como vehículos de ácidos nucleicos. Los virus están compuestos por un ADN ó un ARN rodeado de una cápside proteica y, en algunos casos, una envuelta lipoproteica. El ciclo biológico de los virus pasa por la introducción del genoma viral en determinados tipos celulares, habitualmente por la presencia de receptores en la membrana de las células.

Para poder utilizar un virus como vector en terapia génica, es preciso insertar el ácido nucleico terapéutico en el genoma viral, y conseguir al mismo tiempo que el virus no se replique y por tanto no sea patogénico. Por esto,

los virus utilizados en terapia génica se denominan virus recombinantes y defectivos (carecen de alguna función necesaria para su propio ciclo replicativo). A continuación se repasan los principales vectores virales

utilizados actualmente en terapia génica.

a) Vectores retrovirales. La familia Retroviridae está compuesta por las subfamilias Spumaviridae, Lentiviridae y Oncoviridae. Los vectores retrovirales utilizados en terapia génica están derivados de los oncovirus murinos del tipo C, especialmente los que son anfitrópicos (que pueden infectar tanto células murinas como humanas).

Recientemente se han desarrollado vectores derivados de lentivirus, especialmente del HIV-1.

Los retrovirus son virus ARN que tienen una envuelta fosfolipídica, con glicoproteínas que determinan el tropismo del virus al ser reconocidas por receptores celulares específicos. Dentro de esta envuelta hay una cápside proteica de estructura icosaédrica que contiene 2 copias del genoma viral, la transcriptasa inversa

(RT), y la integrasa. El genoma de un retrovirus es una molécula de ARN de polaridad positiva en la que se distinguen 3 tipos de genes: genes gag (que codifican las proteínas de la cápside), genes pol (que codifican

las enzimas necesarias para el ciclo viral, como la proteasa y la integrasa) y genes env (que codifican las glicoproteínas de la envuelta). El genoma está flanqueado por dos repeticiones terminales largas (LTR, Long

Terminal Repeat), y contiene también una señal de empaquetamiento PSI mediante la cual las moléculas de ARN se unen a las proteínas de la cápside y son empaquetadas eficazmente. El LTR izquierdo contiene una

región (U3) para el comienzo de la transcripción, y un primer binding site (pbs) para el comienzo de la retrotranscripción. El LTR derecho contiene una secuencia de poli-purinas (ppt) para la replicación de la

segunda cadena.

El ciclo replicativo de los retrovirus comienza cuando el virus es reconocido por receptores celulares, lo que lleva a la fusión de la envuelta viral con la membrana celular y a la internalización del nucleoide. A

continuación tiene lugar la retrotranscripción del ARNm para formar un ADNc bicatenario (este proceso tiene lugar dentro de la nucleocápside, antes de su llegada al núcleo de la célula), y después se desensambla la

cápside al llegar a la membrana nuclear. El genoma viral se integra en el genoma de la célula huésped (integración mediada por la propia integrasa del virus), y entonces comienza la transcripción a partir del promotor U3 que está en el LTR izquierdo. Se producen distintos tipos de ARNm, fundamentalmente un

transcrito que contiene gag y pol y otros transcritos que codificarán las proteínas de la envuelta. Los ARNm son exportados al citoplasma y traducidos, dando lugar a poliproteínas gag-pol y a las proteínas de la envuelta.

Estas últimas viajan a la membrana celular, mientras que las poliproteínas gag-pol forman nuevas nucleocápsides al unirse a la señal de empaquetamiento de los ARNm positivos. Tras el empaquetamiento, que

tiene lugar en el citoplasma, las cápsides salen de la célula por gemación, quedando rodeadas de nuevo por una envuelta compuesta por la membrana celular y las glicoproteínas codificadas por el virus que habían

llegado anteriormente a la membrana. Las nuevas partículas retrovirales se activan cuando la proteasa rompe la poliproteína gag-pol dentro de la propia partícula viral y da lugar a moléculas independientes de proteasa,

integrasa y retrotranscriptasa.

La Figura 12.7. Muestra la estructura del genoma de un retrovirus.

Es importante señalar que el nucleoide de un oncovirus es incapaz de atravesar la membrana nuclear, por lo que es necesario que la célula sufra al menos una mitosis para que el genoma viral entre en contacto con el

genoma de la célula huésped. En cambio, los retrovirus de la familia de los lentivirus sí que pueden atravesar la membrana nuclear, por lo que pueden infectar células que no están en división. Esta es una propiedad muy

importante a la hora de valorar las posibles aplicaciones de estos tipos de vectores.

Para generar un retrovirus recombinante defectivo, es necesario sustituir los genes de las proteínas virales por el gen terapéutico que se quiere utilizar. Lógicamente, para producir estos virus defectivos debemos usar

una línea célular (célula empaquetadora) que aporte los genes virales en trans. Estas células empaquetadoras tienen los genes virales insertados en el genoma celular, de modo que expresan

establemente las proteínas virales. Sin embargo, las copias de los genes virales que están integradas en el genoma celular carecen de la señal de empaquetamiento, por lo que sus transcritos no pueden empaquetarse

en las nuevas partículas virales. De este modo, una célula empaquetadora en condiciones normales no produce viriones completos, sino sólo partículas vacías. En cambio, cuando transfectamos estas células con

un plásmido recombinante que contenga el ADN terapéutico flanqueado por los LTR y por la señal de empaquetamiento (además de otros elementos necesarios en cis como el primer binding site, y el tracto

polipurínico necesario para la síntesis de la segunda cadena) se generarán partículas retrovirales recombinantes y defectivas, que pueden ser purificadas y concentradas a partir de los sobrenadantes del

cultivo celular. En este proceso es muy importante evitar la aparición de retrovirus con capacidad replicativa, que podrían generarse por recombinación homóloga entre las secuencias virales que están presentes en

nuestro plásmido con las secuencias virales presentes en el genoma de la célula empaquetadora. Por este motivo, se utilizan células empaquetadoras que tienen los genes virales separados entre sí, de modo que

serían necesarias varias recombinaciones independientes para generar un virus replicativo, algo altamente improbable.

Figura 12.8 En este video se explica el ciclo replicativo de un oncoretrovirus, así como el proceso de producción de retrovirus recombinantes defectivos.

Los retrovirus recombinantes defectivos han sido muy utilizados en terapia génica. Por las limitaciones propias del tamaño del genoma viral, el ADN terapéutico no puede ser mayor a 7-8 kb. Son vectores con buena

infectividad, un tropismo amplio, pero son bastante lábiles (lo que dificulta su purificación) y sólo transducen eficazmente células que están en división. Además, son inactivados en el torrente sanguíneo por el sistema del

complemento, por lo que su principal uso ha estado reservado a estrategias de terapia génica ex vivo. Su capacidad integrativa les permite alcanzar, en teoría, una duración muy larga de la expresión incluso en células que estén dividiéndose activamente. Sin embargo, los promotores virales suelen silenciarse por metilación, por lo que la expresión no es tan prolongada como cabría esperar. Se está investigando la posibilidad de modificar el tropismo de estos vectores, mediante la creación de proteínas de la envuelta quiméricas que incluyan algún

scFv (anticuerpo monocatenario) u otros ligandos de receptores celulares conocidos.

Como se ha mencionado, recientemente se han desarrollado vectores retrovirales basados en lentivirus,

aprovechando la circunstancia de que el HIV-1 es uno de los virus mejor estudiados. El genoma de este virus contiene algunos genes (tat y rev, por ejemplo) que no están presentes en los oncoretrovirus y que son

esenciales para la expresión de los genes virales. Algunas de las proteínas virales tienen señales de localización nuclear y facilitan la entrada del virus por los poros nucleares, de ahí la capacidad que tienen estos virus de infectar células que no están en división. Aunque los problemas de seguridad de los lentivirus están

prácticamente superados, todavía hay que mejorar los sistemas de producción para poder utilizarlos en pacientes con total seguridad. Su principal aplicación está en la transferencia de genes a células del sistema nervioso in vivo, y a progenitores hematopoyéticos ex vivo, siendo esta última una propiedad especialmente

interesante por su inmenso potencial terapéutico, y porque estas células son prácticamente intransfectables por otros medios.

b) Vectores adenovirales: Se conocen gran cantidad de serotipos de adenovirus humanos, pero los más utilizados en terapia génica han sido los serotipos 2 y 5. Los adenovirus son virus ADN sin envuelta,

responsables de las principales enfermedades de vías respiratorias altas (el “catarro” común), con muy buen tropismo por células humanas. La nucleocápside de un adenovirus consta de una cápside icosaédrica que está compuesta por 720 proteínas hexona y 60 proteínas pentona. De las pentonas parte la proteína de la fibra (una

proteína trimérica) que termina en una proteína “botón” (knob) mediante la cual el adenovirus se une a receptores celulares específicos.

Figura 12.9. Estructura de una partícula adenoviral, con las hexonas, pentonas y fibras. Tomada del sitio educativo de los premiso Nobel.

El genoma adenoviral es un ADN de doble cadena de aproximadamente 35 kb de tamaño, flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100-140 nucleótidos y una señal de empaquetamiento (psi) cerca del ITR izquierdo. Contiene gran cantidad de genes, que se agrupan en regiones tempranas (early) y tardías (late), según el momento en que se transcriben después de la infección. Así, las regiones tardías se transcriben tras la replicación del genoma viral, y contienen los genes que codifican las proteínas estructurales del virus. En cambio, las regiones tempranas se transcriben antes de la síntesis del ADN viral, y cumplen varias funciones:

x las proteínas codificadas en E1 incluyen, por ejemplo, E1A (proteína necesaria para transactivar la transcripción de los demás genes virales) y E1B 55kd (que se une a E4). Además, estas proteínas interfieren con las funciones de la célula huésped: E1A es una oncoproteína, E1B 19kd inhibe la apoptosis mediada por p53 y E1B 55kd promueve la degradación de p53.

x la región E2 codifica proteínas necesarias para la replicación viral: ADN polimerasa, proteína terminal, etc.

x la región E3 codifica algunas proteínas que ayudan al adenovirus a escapar al sistema immune, como

la proteína gp19kd que inhibe la presentación de fragmentos antigénicos con moléculas de clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad.

x la region E4 codifica diversas proteínas que silencian genes endógenos, regulando el transporte de ARN mensajeros fuera del núcleo

Figura 12.10. Estructura del genoma de un adenovirus.

El ciclo replicativo de un adenovirus es más sencillo que el de los retrovirus. El adenovirus se une a un receptor de membrana específico denominado CAR (CoxackieAdenovirusReceptor) mediante el botón de la fibra, y a continuación la pentona se une por un motivo RGD (arginina-glicina-aspártico) a integrinas cercanas para después ser internalizado por endocitosis. La propia cápside adenoviral es capaz de desestabilizar el endosoma, que se rompe y libera las partículas virales al citoplasma. Las nucleocápsides llegan a la membrana nuclear y son capaces de introducir el genoma viral a través de los poros nucleares.

Para generar adenovirus recombinantes defectivos (es decir, que lleven el ADN terapéutico pero no puedan replicarse) se sigue una estrategia similar a la que veíamos para los retrovirus: substituir algún gen viral por el gen terapéutico. Lo más habitual es delecionar el genoma viral en la región E1, para lo que necesitaremos una célula empaquetadora que exprese de manera estable los genes contenidos en esa región. La línea celular más utilizada como célula empaquetadora para construir adenovirus recombinantes se denomina célula 293. Para conseguir el adenovirus recombinante, se cotransfectan células 293 con dos plásmidos distintos: un plásmido en el que el gen terapéutico está flanqueado por parte del gen E1, la señal de empaquetamiento y los ITR virales, y otro plásmido que contiene todo el genoma viral excepto la señal de empaquetamiento y la región de E1 que está presente en trans en el genoma de las células 293. Una vez dentro de la célula, los mecanismos de recombinación son capaces de generar un genoma viral recombinante que llevará el gen terapéutico dentro del genoma viral (al que le falta E1). Como el gen terapéutico va unido a la señal de empaquetamiento PSI, únicamente estos transcritos se empaquetarán correctamente en las nuevas cápsides virales, mientras que los genomas virales producidos endógenamente carecen de la señal PSI y por tanto no producen viriones infectivos. Los adenovirus delecionados en E1 permiten insertar genes terapéuticos con un tamaño máximo de 5 kb, por lo que posteriormente se han generado vectores que llevan además deleciones en E3 y E4, para conseguir llegar a una capacidad de 7-8 kb. La última generación de vectores adenovirales consiste en los llamados adenovirus gutless (vacíos), en los que todo el genoma viral ha sido delecionado y por tanto tienen una capacidad teórica en torno a las 30 kb de ADN exógeno. Para producirlos hay que aportar en trans todas las funciones adenovirales necesarias, mediante plásmidos helper ó por estrategias que utilizan el sistema Cre/loxP.

Figura 12.11 El proceso de producción de adenovirus recombinantes defectivos se muestra en este video.

Los adenovirus comenzaron a usarse en terapia génica más tarde que los retrovirus, pero rápidamente ganaron en popularidad y hoy en día son los vectores más utilizados para aplicaciones in vivo. Infectan gran variedad de células, son relativamente estables y fáciles de purificar y concentrar, y son eficaces tanto sobre células quiescentes como sobre células en división. Como el genoma del vector no se integra en el genoma de la célula huésped, la duración de la expresión en células en división es limitada. Su principal inconveniente es la toxicidad que producen a dosis altas, y la fuerte respuesta inmune celular y humoral que sigue a su administración, con la consiguiente disminución de eficacia terapéutica. Los nuevos vectores adenovirales

“vacíos” superan algunos de estos inconvenientes.

c) Vectores Virales Adenoasociados: Se trata de Parvovirus que infectan al hombre pero no son patógenos. Pertenecen al grupo de los Dependovirus, virus ADN sin envuelta que necesitan de funciones helper para completar su ciclo replicativo completo. Estas funciones helper las aporta un adenovirus o un herpesvirus que sobreinfecta las mismas células que previamente habían sido infectadas por un dependovirus. El genoma de un virus adenoasociado es un ADN monocatenario con un tamaño de 4,8 kb y una estructura muy simple, con dos regiones codificantes: cap, que codifica las tres proteínas de la cápside, y rep, que codifica 4 proteínas necesarias para la replicación viral. El genoma está flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR), que forman unas estructuras en horquilla y que son los únicos elementos necesarios en cis para poder llevar a cabo el ciclo vital del virus.

Figura 12.12. Estructura del genoma de un adenoasociado.

La infección por un virus adenoasociado comienza por la unión del virus a receptores celulares y su entrada en la célula. El genoma viral es capaz de entrar en el núcleo incluso en células que no se dividen, y una vez allí se convierte a doble hebra y se integra en un locus específico localizado en el brazo largo del cromosoma 19 humano (banda 19q13). Todas estas funciones están mediadas por proteínas de la célula huésped, pero además se ha comprobado que las proteínas virales Rep78/68 son necesarias para la integración específica del genoma viral en una secuencia llamada AAVS1 que está en 19q13. En ausencia de funciones helper, el genoma viral integrado permanecerá como un provirus, en forma latente. Ante una sobreinfección por adenovirus ó herpesvirus, el adenoasociado comienza su fase lítica con la transcripción de los genes virales, la replicación del genoma viral y el empaquetamiento en las cápsides para dar lugar a nuevos viriones. Para obtener virus adenoasociados recombinantes como vectores en terapia génica, se construye un plásmido recombinante que contiene el gen terapéutico flanqueado por los ITR virales. En el método clásico de producción de estos vectores, se cotransfectan células 293 con el plásmido recombinante y con otro plásmido que aporta en trans las funciones cap y rep, y después se infectan esas mismas células con un adenovirus. El problema de este procedimiento es que los preparados virales tienen una fuerte contaminación por adenovirus, por lo que es necesario inactivar este adenovirus contaminante mediante tratamiento con calor. Los métodos actuales de producción evitan este problema al aportar las funciones helper del adenovirus en un tercer plásmido que se cotransfecta con los otros dos, de forma que la generación de adenovirus maduros es prácticamente imposible.

Figura 12.13 El siguiente video muestra el ciclo replicativo de un AAV y la estrategia para la producción de AAV recombinantes defectivos.

Los vectores adenoasociados están ganando popularidad rápidamente por sus extraordinarias características: buena infectividad, integración en el genoma de la célula huésped, muy baja toxicidad y ausencia de respuesta inmune celular frente a las proteínas virales. Por desgracia, la especificidad de la integración en un locus concreto se pierde en los virus adenoasociados recombinantes, ya que no se produce Rep68/78 (que es absolutamente necesaria para que tenga lugar esta integración específica). En consecuencia, la integración se realiza al azar, como en el caso de los retrovirus. Los virus adenoasociados pueden transducir células mitóticas o células en división, y están especialmente indicados en aplicaciones in vivo en las que se requiere una expresión prolongada del gen terapéutico.

d) Otros vectores virales que actualmente están ganado en popularidad son los Herpesvirus, basados en el virus del herpes simplex (HSV), que tienen un marcado tropismo neuronal y por eso se emplean fundamentalmente para la transferencia de genes al sistema nervioso. Los HSV son virus envueltos con un genoma lineal de 152 kb de ADN bicatenario, en el que se han identificado más de 80 genes. El genoma está dividido en dos regiones únicas (Larga y Corta) que están flanqueadas por repeticiones terminales (TR) y repeticiones internas (IR). El virus se une a glicosamino-glucanos celulares y a receptores celulares específicos (por ejemplo, el receptor HveC, que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se expresa a alto nivel en el sistema nervioso). Tras la entrada en la célula, el virus avanza por transporte retrógrado y llega al

núcleo, penetrando por los poros nucleares. Después de entrar en el núcleo se expresan los genes inmediatos tempranos, que activan la expresión de los genes tempranos (necesarios para la síntesis de ADN viral) y de los genes tardíos (proteínas estructurales). Una característica importante es que uno de los genes inmediatos tempranos (ICP4) es absolutamente necesario para la replicación viral, por lo que basta eliminarlo del genoma para obtener virus defectivos. En los vectores actualmente en uso se han delecionado todos los genes inmediatos tempranos, por lo que son totalmente apatogénicos.

Otra característica importante de estos virus es que cuando no se replican entran en un periodo de latencia en el que se transcriben únicamente unos transcritos asociados a latencia (LATs), aunque no se expresen los genes inmediatos tempranos. Por tanto, incluyendo la unidad transcripcional en la región de latencia se pueden obtener virus defectivos que expresan de forma persistente un gen terapéutico. Además, se trata de vectores de gran capacidad porque permiten acomodar hasta 50 kb de ADN exógeno.

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