22 al 25 agosto de 2017
72º Congreso Argentino de Bioquímica 2017
Asociación Bioquímica Argentina
La espectrometría de masas
en la identificación
bacteriana y su impacto clínico
Marisa Almuzara
Departamento de Bioquímica Clínica.
Laboratorio de Bacteriología.
Hospital de Clínicas.
Facultad de Farmacia y Bioquímica.
Universidad de Buenos Aires
Identificación bacteriana rápida y su impacto clínico
Streptococcus pneumoniae
Aislado de Hemocultivos en un paciente con
Diagnóstico clínico de NAC:
Agente etiológico de la Enfermedad Infecciosa.
Devela la naturaleza del agente etiológico
Streptococcus pyogenes
Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente con
celulitis de sus extremidades inferiores:
Bacteriemia con foco en piel y TCS
Staphylococcus epidermidis
Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente
pediátrico, con pielonefritis por E. coli:
Pseudobacteriemia por contaminación
Determina la importancia clínica
Con Enfermedad de Base:
Streptococcus agalactiae- Diabetes
Con Enfermedad Infecciosa:
Streptococcus pneumoniae
Neumonía-OMA-Meningitis
RELACIONA GENERO-ESPECIE CON ENFERMEDAD
Bacteriemia Primaria por Enterococcus
faecalis en paciente con neutropenia:
Traslocación colónica.
Bacteriemia secundaria por Escherichia coli:
Focos IU alta, infección intra- abdominal
PERMITE RECONOCER LA PUERTA DE ENTRADA
La identificación está estrechamente ligada a la
sensibilidad a los antibacterianos y define
muchas veces el tratamiento antimicrobiano
Sensibilidad constante a ciertos antibacterianos:
Streptococcus pyogenes- Streptococcus
agalactiae a penicilina
Resistencia de Enterobacter cloacae a
aminopenicilinas/+ inhibidores, cefalosporinas 1ra y
2da
Métodos para la identificación bacteriana
Convencionales
1-Pruebas bioquímicas
manuales
Esquema en tableros
Esquemas dicotómicos
(Algoritmos)
2- Identificación serológica
Comerciales
Manuales Automatizados
Fenotípicos
API Rapid ID
Vitek Phoenix
Microscan
Identificación fenotípica convencional
Características microscópicas: Coloraciones
Identificación fenotípica convencional
Características culturales
Tamaño de colonia
Hemólisis
Pigmento
Forma, Aspecto, Borde, Superficie
Identificación fenotípica convencional
Pruebas de identificación preliminar: (lectura inmediata): catalasa, oxidasa
Pruebas rápidas ( < 6h): hipurato, PYR, LAP, glicosidasas, ureasa,
indol, FAL, tributirina, tripsina, coagulasa
Pruebas lentas (24-h a 4-5 días): TSI (F/0), reducción de NO3, utilización de azúcares, Esculina, DNAsa, gelatinasa, CAMP, almidón, RM, VP, decarboxilasas, citrato, otras
Pruebas basadas en caracteres de resistencia: O129, Vancomicina, SPS, fosfomicina, desferrioxamina, colistina, bacitracina, optoquina
ID: 24 horas a 5-7 días
BNF
Algoritmos
GRUPO FLN-
GLUCOSA -
UREA + UREA-
NITRATO
+ ADH
- Cupriavidus pauculus
PYR +
+ Laribacter
-
Etilenglicol/ Etanol
+/+ Oligella
ureolytica
FALA+/GAS NO2+-/ DEF S
-/- Bordetella
bronchiseptica
FALA-+/GAS NO2 -/ DEF R
ACIDO DE XILOSA
+ Achromobacter xylosoxidans
(FRU -)
-
ACIDO DE FRUCTOSA
+ Pseudomonas pseudoalcaligenes
Xilosa -/+
- ESCULINA
-
TRIPSINA +
NITRATO
- MALTOSA/PYR
+ Cupriavidus
taiwanensis (CITRATO +)
+/-
Brevundimonas vesicularis
-/+
Inquilinus limosus
Fenotipo
Mucoso
-
PYR
+
DEF/COL
S/R Brevundimonas
diminuta
R/S
Pseudomonas alcaligenes FAL- PYR -
R/R
Inquilinus limosus
PYR +
Pigmento marrón
difusible. FAL+++
PYR
V(20%+)
+
CITRATO
-
COLISTINA
S NITRATO
R Pandoraea
DEF R
+
Comamonas SPP
-
CITRATO CITRATO
C. aquatica/ C kerstersii
-
Cupriavidus gilardi
DEF R
+ Advenella
incenata DEF V
+
NITRATO
N NITRATO
-
DEF DEF
R
Cupriavidus
respiraculii
S
Comamonas
terrigena
+
FENILACETATO/ ClNa
- Bordetella
hinzii
Figura 3, Grupo A: Llave para la identificación presuntiva de los bacilos gram-negativos no fermentadores FLN -, glucosa -
Pig.
rosa
Ox -
-
+
Chryseobacteriumanthropi
+
Indol
-
Roseomonas / Asaia
Urea
+
Roseomonas
-
Asaia
-
Pig. Marrón
difusible
Colonia
pequeña-
Kerstersia
-
B. holmesii+
B. parapertussis
+
Sphingomonas spp(Esc + ONPG +
Mani - Lac +)
EO-5 (Esc -
Pig. Amarillo)
Granullibacterbethesdensis
(Lactosa -)
Urea
+
Bordetella holmesii
B. parapertussis
Kerstersia
-
Mov -
Pig. amarillo
+
Nitrato
V
B. malleiMac Conkey +
Lactosa V
+
rápida
Brucella canisMac Conkey V
Lactosa -
Urea
+
+
C. anthropi
-
Acinetobacter spp
Indol
-
-NO-1
(Fastidioso)
Pig.
rosa
Ox -
-
+
Chryseobacteriumanthropi
+
Indol
-
Roseomonas / Asaia
Urea
+
Roseomonas
-
Asaia
-
Pig. Marrón
difusible
Colonia
pequeña-
Kerstersia
-
B. holmesii+
B. parapertussis
+
Sphingomonas spp(Esc + ONPG +
Mani - Lac +)
EO-5 (Esc -
Pig. Amarillo)
Granullibacterbethesdensis
(Lactosa -)
Urea
+
Bordetella holmesii
B. parapertussis
Kerstersia
-
Mov -
Pig. amarillo
+
Nitrato
V
B. malleiMac Conkey +
Lactosa V
+
rápida
Brucella canisMac Conkey V
Lactosa -
Urea
+
+
C. anthropi
-
Acinetobacter spp
Indol
-
-NO-1
(Fastidioso)
BNF
Acinetobacter spp.
ID Presuntiva: 24 horas
4 pruebas
• TSI Sin cambio
• Oxidasa +
• Inmóvil
• Glucosa +
• Indol +
• Gelatina +
• Almidon +
• Esculina +
• Manitol -
• ONPG +
• Colistina R
• Vancomicina Halo
• Pigmento Amarillo intenso
Chryseobacterium gleum indologenes
12 Pruebas
Tiempo de ID: 4-5 días
Cardiobacterium hominis ID presuntiva: 4-5 días ID : 4-5 dias
HACEK
Métodos fenotípicos de identificación
Comerciales
Automatizados
VITEK PHOENIX Microscan
Manuales
API Rapid ID Remel
ID: 24-48 HS; Rapid: 4 hs ID: 2 a 18 hs
Paneles de identificación
Identificación fenotípica por galerías comerciales
N 178 91 % ID correcta (n 162) 24.7 % requirió de pruebas adicionales ( n 44)
API Coryne Versión (2.0)
Lectura: 24 horas
48-72 hs si pruebas adicionales
Identificación fenotípica por galerias comerciales
N 188 93,10 % ID correcta (n 175) 32.45 % (n 61): requirió de pruebas adicionales (Vay y col, 2004. RAM)
Tiempo de ID: 48 Horas
Si pruebas adicionales: 3 -4 días
Identificación por sistemas comerciales automatizados
ID : menos de 10 hs Base de datos: aprox 456 taxas BGN, 114 CGP; 26 NH; 16 BGP; 47 Anaerobios N: 445 (87 % ID correcta)
64 pocillos de ID
Métodos Genotípicos para la identificación bacteriana
Biología Molecular
PCR convencional: Seq r RNA ribosomal 16 s, otros genes (rpo B, gyr B, rec A, secA) MLSA (Análisis multilocus de secuencias) Hibridizacion DNA-DNA
Otros métodos de identificación:
Proteómica
Perfiles de componentes bacterianos
Espectrométricos
Espectrometría de masa Perfil electroforético de Proteínas totales
(SDS-PAGE)
MALDI TOF
CID 2009
MALDI TOF en Argentina
MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight
(Vaporización/ionización por láser asistida por matriz a través de la detección de masas acorde al tiempo de vuelo)
5495.0
5417.9
4470.0
6264.1
10835.4
7274.5
7122.5
4736.2
9589.7
7828.2
8021.2
8847.6
8369.5
10259.6
10051.3
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
4 x10
5000
6000 7000 8000 9000 10000 m/z
MALDI-TOF es una tecnología que ofrece un patrón de proteínas de un organismo desconocido y compara este patrón con una librería para finalmente presentar un score de esa comparación.
Bruker Daltonics Inc, USA (Base de datos propia) Shimadzu Corporation, Japón (Base de datos SARAMIS) Otra Base de datos: Andromas
MALDI-TOF Hospital de Clínicas José de San Martín. UBA
Preparación de la muestra
a. Extendido directo o extracción directa con fórmico
b. Extracción con etanol-ácido fórmico-acetonitrilo
10 min
H2Od Etanol
Etanol
FA,
Acetonitrile
Placa target
Analito
Matriz: HCCA(α-ciano-4-hidroxi ácido hidroxicinámico)
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
Corrida en MALDI Biotyper
Placa Target
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
Corrida en MALDI Biotyper
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
+ + +
+
Corrida en MALDI Biotyper
02/2009
Tubo: Drift region
Detector de iones
Corrida en MALDI Biotyper
Qué tipo de score aceptamos?
• Fabricante
• > 2 nivel de especie
• > 1,7 - < 2 nivel de género
• < 1,7 Identificación no confiable: No se acepta
Se puede modificar este score:
Mediante la validación de grupos
De Bel et al, propone criterio LAC > 1,8 (25% más de iD correcta) JMM, 2011
MALDI TOF
Semejante al método molecular
(Gold standard)
Impacto clínico de la identificación de patógenos
emergentes por MALDI TOF
Cultivo: 72 horas de incubación
Coloración de Gram del urocultivo Importancia de la identificación rápida en la jerarquización clínica
Paciente masculino. 22 años.
Síndrome nefrótico. HTA por
glomerulonefritis. Reagudización de
su IRC. Diálisis trisemanal. TTO
empírico. TMS
99 % identidad con Actinotignum (Actinobaculum) schaalii
Identificación molecular:
Secuenciación del 16S rRNA
Identificación por Espectrometría de masa:
MALDITOF
3 a 5 minutos
Algoritmo de identificación fenotípico
Llave 1
CAMP –
MRS /Vanco
Algoritmo de identificación
Esc -/urea- /NO3-
- Pyz /PYR / Hip /Trib
+ / V /-/nd
A. bernardiae
- / - /+/-
A. turicensis
v / v /+/+
Actinotignum schaalii
+++/ R
Lactobacillus (II III)
(+) / S
Lactobacillus (I)
Bifidobacterium Alloscardovia
- /S
No β
hemólisis
Gram
5 -6 días
15 pruebas
Actinobaculum schaalii: identificación
Vancomicina
MRS
Nitrato urea Esculina
Pyr Hipurato Tributirina
SPS
Identificación por MALDI-TOF. Impacto clínico
• Permitió modificar la conducta terapéutica:
• Se suspendió el tratamiento con TMS y el
paciente recibió penicilina 1.500.000 UI c/12h por 14 días
• Permite atribuir el verdadero significado clínico a estos microorganismos en casos de piuria crónica inexplicable
Total N=234
ID Correcta
Sin resultado
ID Incorrecta 204: 87%
22: 9% 8: 3%
Identificación por Maldi-tof de microorganismos a partir de subcultivo de 3-4 hs en de botellas de Hemocultivos positivos comparada con subcultivo de 24 hs de incubación.
BGN N=117
ID Correcta
Sin resultado
ID Incorrecta
108: 92,30%
4: 3,4% 5: 4,3%
GP N=117
ID Correcta
Sin resultado
ID Incorrecta
96: 83 %
18: 15 % 3: 2%
Identificación por MALDITOF. Impacto clínico
• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de bacteriemia asociada a catéter
• Tratamiento empirico: vanco + imipenem
• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram: CGP en racimos
• ID por Malditof a partir del frasco:
Frasco 1: Staphylococcus epidermidis
Frasco 2: Staphylococcus simulans
Retrocultivo: negativo
• Tiempo de informe: 30 minutos Hay modificación de la conducta terapéutica
Identificación por MALDITOF. Impacto clínico
• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de bacteriemia asociada a catéter
• Tratamiento empírico: vanco + imipenem
• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram: CGP en racimos
• ID por Malditof a partir del frasco:
Frasco 1: Staphylococcus epidermidis
Frasco 2: Staphylococcus epidemidis
Retrocultivo: Staphylococcus epidermidis
• Tiempo de informe: 30 minutos
Hay modificación de la conducta terapéutica
ESBL
AMPc
KPC
OXA
NDM
Impacto clínico de la identificación rápida
Descalar tratamientos ATB de amplio espectro
por tratamientos específicos
Adecuar la terapia empírica inicial
Reducir tiempos de internación
Evitar estudios adicionales
Descartar contaminaciones
Reduce Costos
Métodos de Identificación
Identificación convencional: 24 horas a 5-7 días.
Identificación por galerías comerciales: Lectura rápida: 4 horas Lectura habitual: 24 a 48 horas Identificación por sistemas automatizados:
2 a 18 Horas Maldi tof: 3 a 5 min!!! (96 muestras/hora)
Base de datos L imitada
Conclusiones MALDI TOF
Identificación rápida y precisa Base de datos para un amplio espectro de bacterias
Herramienta útil para identificar especies “raras” o
infrecuentes en infecciones humanas
La aplicación de MALDI TOF sobre muestra directa en particular los HC es una de las aplicaciones más prometedoras
MALDI TOF supera por la exactitud y rapidez a la
identificación fenotípica y molecular hasta ahora conocida
MUCHAS GRACIAS
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