Aflatoxina M1 | JAA2015 | Rafaela – Junio 2015
AFLATOXINA M1 Detección y cuantificación en leche y productos lácteos
Métodos manuales y automatizados
Dra. Cristina D‘Aiutolo R-Biopharm Latinoamérica [email protected]
R-Biopharm Group
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Alergenos Grupo R-Biopharm
• proveedores mundiales de soluciones para problemas analíticos
• ofrecemos kits para varias plataformas tecnológicas
Empresa joven, con sede central en Darmstad, Alemania, que cubre todos los mercados
de la Unión Europea, Australia, China y América con una extensa red de más de 80
Distribuidores en 70 países.
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Análisis de Alimentos y Piensos
Micotoxinas
Antibióticos
Alergenos Alimentarios / Adulteración
Hormonas / Anabólicos
PCR
Microbiología / Higiene
BSE / Risk Material /
Identificación de Especies Animales
Vitaminas
Productos para Control de Calidad
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Micotoxinas
Metabolitos secundarios producidos por ciertos hongos durante el crecimiento en
el campo, procesamiento, transporte o almacenamiento
Ocurrencia natural e inevitable
Tóxicas y/o carcinogénicas
Bajo peso molecular
Varían en su estabilidad al procesamiento
Número total de micotoxinas (miles?)
Efecto: micotoxina/s involucrada/s, nivel de contaminación, tpo. de exposición,
huésped
Principales: Aflatoxinas, Tricotecenos (Deoxinivalenol, Nivalenol, Toxina T2),
Zearalenona, Fumonisinas, Ocratoxina A, Citrinina, Patulina. Menos estudiadas:
alcaloides del ergot, Moniliformina,, Diacetoxiscirpenol, Ácido Ciclopiazónico,
Neosolaniol, Esterigmatocistina. Metabolitos intermedios
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Micotoxinas - Aflatoxinas
Difuranocumarinas. Relacionadas
Mas de 18 tipos
Más frecuentes: Aflatoxina B1, B2, G1, G2, M1 y M2
Aflatoxina M1 (AFM1) metabolito hidroxilado de la Aflatoxina B1 (AFB1)
secretada en leche de mamíferos (secreción proporcional a la ingesta).
Tasa de Conversión ~ 1,5% (0.4 – 3%)
Aparecen a las 12 hs, pico máximo a las 24 y desaparece a los 4 días del cese
de la ingesta
Aspergillus
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Necesidad de métodos
Cumplir con la legislación
Para llevar a cabo trabajos de control y monitoreo
Control de las etapas de producción de alimentos y piensos
Investigación: estudios toxicológicos, descontaminación, estudios
epidemiológicos
Valoración del riesgo
Metodologías analíticas deben conducir a respuestas exactas y precisas para
poder implementar medidas de control y hacer que el monitoreo de las micotoxinas sea
cada vez mas efectivo
Los métodos analíticos son instrumentos en la elaboración y ejecución de las
regulaciones internas de cada país y en las relaciones comerciales entre países
protegiendo así la salud de los consumidores
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Desafíos de los análisis de micotoxinas
Diversidad de estructuras química de las micotoxinas
Dificultad en la remoción de impureza
Eleva el costo de análisis
Aumenta el tiempo de análisis
Afecta el grado de recuperación
Distribución irregular de las micotoxinas en el sustrato
Diversidad de sustratos
AFLATOXINA M1:
Molécula pequeña
Matriz homogénea / Distribución homogénea
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Legislación
• Aflatoxina M1
CE < 0.05 ppb (leche y productos lácteos)
< 0.025 ppb (fórmulas infantiles)
USA, Mercosur,
Japón, China, Méjico, etc. < 0.5 ppb
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Métodos de Análisis para Aflatoxina M1
• Elección del método
Muchos métodos desarrollados se requiere de mucho juicio para
seleccionar el óptimo protocolo de análisis.
Además de la precisión y exactitud necesarias, los métodos analíticos están
caracterizados por tres criterios prácticos:
Velocidad de realización del ensayo
Nivel de conocimientos técnicos requerido para su desarrollo
Si el ensayo da un resultado cualitativo ó cuantitativo
El mejor método: RAPIDO, SIMPLE, PRECISO, SENSIBLE, CUANTITATIVO,
AUTOMATIZABLE, BARATO
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Métodos de Análisis para Aflatoxina M1
• Detección y/ó cuantificación
Tecnología que permite determinar si la micotoxina está presente
Métodos rápidos de rastreo (screening): detectan la presencia de AFM1
ELISA, LFD, Biosensores
Métodos de referencia (confirmatorios): detectan, identifican y cuantifican AFM1
Generalmente basados en técnicas cromatográficas: HPLC, LC-MS y LC-
MS/MS
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Métodos de Análisis para Aflatoxina M1
• Métodos rápidos de rastreo (screening)
El más utilizados ELISA
Adecuados para laboratorios en planta y a campo
Equipamiento simple y poco costoso
No se requiere personal altamente especializado
Poco tiempo para implementar los ensayos
Cuantitativos
Automatizables
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R1121 RIDASCREEN® Aflatoxin M1
ELISA competitivo
96 pocillos
Estándares: 0 / 5 / 10 / 20 / 40 / 80 ng/kg (ppt)
Sensible
• Límite de detección:
• Leche: < 5 ppt
• Leche en polvo: < 50 ppt
• Queso: < 50 ppt
Rápido: 1h 15min
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Cuantitativo
Pocillos sensibilizados con Ab anti-anticuerpo: menor interferencia y mayor
especificidad
Competencia en fase líquida
Formato de microplaca: ahorro de reactivos
12 x 8 Pocillos separables: se utiliza la cantidad de pocillos necesarios
No requieren pocillo de premezcla: menor descarte de reactivos
No requieren pipeta multicanal
Mayor repetitividad
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Ab anti IgG
Medición del producto
sustrato/cromógeno
SN stop
Ab esp. Y
Muestra
+
Conj.
(Ag + Perox.) +
Y Y
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Micropocillos sensibilizados con anticuerpos anti IgG
IgG anti IgG
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IgG anti IgG
IgG anti AFM1
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IgG anti IgG
Std ó Muestras
IgG anti AFM1
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IgG anti IgG
IgG anti AFM1
Std ó Muestras
AFM1 conjugado
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Competencia Mucha toxina
Competencia Mucha toxina
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Competencia Poca toxina
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Competencia Sin toxina
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Competencia Mucha toxina
Sustrato + cromógeno
SC P
Poco color
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Competencia Poca toxina
SC P
Sustrato + cromógeno
Color medio
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R1121 RIDASCREEN® Aflatoxin M1
Competencia Sin toxina
SC P
Sustrato + cromógeno
Mucho color
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• Lectura de los resultados: fotómetro de lectura vertical
Lector de tiras Lector de placa
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• Evalación de los resultados
RIDASOFT® WIN
Soft desarrollado por R-Biopharm
Se entrega sin cargo con los kits de ELISA
Se realiza entrenamiento
Se actualiza continuamente
Muy fácil utilización
Análisis por distintos métodos (Spline, Logit/log)
LOS RESULTADOS SE ARCHIVAN EN UNA BASE DE DATOS. PERMITE EL
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS.
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• Automatización del ensayo: AUTOANALIZADOR
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Automatización CHEMWELL 2910
Empresa Awareness
Compañía Norteamericana de distribución mundial
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Automatización Chemwell 2910
Autoanalizador: Chemwell 2910 - Awareness
Equipo dual que combina ensayos enzimáticos con ELISA mediante el uso de
micropocillos para ambas reacciones:
• Química y ELISA
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Automatización Chemwell 2910
Sistema abierto
Windows software
reactivos muestras reacción
Bombas: 2
jeringas
Sistema óptico
de precisión
dH2O
Probe con
sensor
Cabezal de
lavado
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Automatización Chemwell 2910
Chemwell selecciona
automáticamente una
de sus dos jeringas,
50uL ó 2.5mL para
pipetear ó diluir
• Punta de la probe detecta la
superficie de los líquidos
• ChemWell estima el volumen
restante
• Probe se lava automáticamente
luego de cada uso
• Se programan los protocolos de
lavado, por lo que no es necesario
el uso de tips descartables para
evitar carryover PROBE:
• Cuerpo corto, aguja larga
• Control de temperatura,
• Retraíble
• Fácil de cambiar
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Automatización Chemwell 2910
4 canales ópticos alineados con 4
micropocillos y lee cada pocillo a 8
longitudes de onda (340-750nm)
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Automatización Chemwell 2910
Cuando se analizan ensayos de ELISA el Chemwell trabaja cada ensayo en tiras y
programa el tiempo y el proceso
Se pueden colocar distintos ensayos en cada tira mientras ellos compartan un
soporte y temperatura comun. Máximo 12 ensayos por placa. Máximo 2 buffers de
lavado. Los tiempos de incubación de los ensayos pueden ser diferentes
ChemWell organiza el inicio de los ensayos para prevenir conflictos entre ensayos
ELISA’s
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Automatización Chemwell 2910
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R1121 RIDASCREEN® Aflatoxin M1
R-Biopharm Group
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R1121 RIDASCREEN® Aflatoxin M1
¡¡¡¡¡ UTILIZAR ENSAYOS VALIDADOS !!!!
• In-house
• Kits comerciales Validados por Organismos Oficiales
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Muchas gracias!!!!
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